microlabblad-januari

MICROLL A B BLAD
informatiebulletin van het laboratorium microbiologie twente achterhoek
Het Laboratorium Microbiologie Twente Achterhoek wenst alle lezers een heel
goed en gezond 2006 toe!
Om het jaar goed in te zetten vindt u twee artikelen over nieuwe detectiemethoden. De eerste is beschreven door Ron Hendrix. Zijn artikel gaat over de
moleculaire diagnostiek van virale en atypische luchtwegpathogenen. Dit
onderzoek is per direct aan te vragen.
Vervolgens vindt u een uitleg over de real-time PCR.
Bert Mulder geeft u informatie over uitbreiding van het fecesonderzoek op
darmpathogenen met Cryptosporidium. Dit zal met ingang van februari 2006
doorgevoerd worden.
In 2005 is veel werk verzet om elke keer een goed MicroLabBlad uit te geven.
Voor 2006 is deze inzet niet anders. U kunt uw vragen, opmerkingen en suggesties aan ons mailen: [email protected].
inhoudsopgave
“State of the art” moleculaire diagnostiek van virale
en atypische luchtwegpathogenen
216
Uitleg real-time PCR
222
Fecesonderzoek darmpathogenen wordt
uitgebreid met Cryptosporidium
225
colofon
Micro Lab Blad is een uitgave van:
Redactie:
S.D. Meijer
E. Roelofsen
Laboratorium Microbiologie Twente Achterhoek
Burgemeester Edo Bergsmalaan 1
7512 AD Enschede
Telefoon: (053) 8526300, Telefax: (053) 8526301
E-mail: [email protected], Website: www.labmicta.nl
Openingstijden:
ma. t/m vr. 08:00 - 17:00 uur, za. en zo. 10:00 - 11:00 uur
Zesde jaargang • Nummer 1 • Januari 2006
“STATE OF THE ART” MOLECULAIRE DIAGNOSTIEK VAN VIRALE EN
ATYPISCHE LUCHTWEGPATHOGENEN
RON HENDRIX
Samenvatting
Broncho-pneumonieën kunnen door diverse organismen veroorzaakt worden waaronder virussen
en andere intracellulair verblijvende organismen. Vooral bij kinderen is de oorzaak meestal viraal,
maar ook bij volwassenen blijkt dat in 15-20% van de broncho-pneumonieën een virale verwekker
aangetoond kan worden. Ook aan het andere einde van het spectrum, de al dan niet
immuungecompromitteerde oudere patiënt, blijken virale verwekkers een steeds grotere rol te
gaan spelen (tabel 1 en 2).
Frequent
Kinderen
Volwassenen
Ouderen (*1)
Immuundisfunctie (*2)
Adenovirus
Influenza A virus
Influenza A virus
Rhinovirussen
Influenza A virus
Influenza B virus
Influenza B virus
Respiratoir Syncytieel Virus
Influenza B virus
Para-influenzavirus
Respiratoir Syncytieel Virus
Herpesviridae
Respiratoir Syncytieel Virus
Adenovirus
Para-influenzavirus
(Epstein-Barr Virus,
Rhinovirussen
Cytomegalovirus ,
Para-influenzavirus
Varicella-zoster virus,
Mycoplasma pneumoniae
Herpes Simplex virus)
Zeldzaam
Coronavirussen
Coronavirussen
Enterovirussen
Enterovirussen
Rhinovirussen
Rhinovirussen
Herpes Simplex Virus
Herpes Simplex Virus
Chlamydia pneumoniae
Chlamydia pneumoniae
Coronavirussen
Mycoplasma pneumoniae
Tabel 1: virale verwekkers pneumonie
*1 Hieronder vallen vooral ouderen met diabetes mellitus, nierfunctiestoornissen en COPD
*2 Hieronder vallen transplantatiepatiënten en oncologische patiënten
Diagnostiek van deze verwekkers blijft echter een moeizame zaak. Hoewel er in het medisch
microbiologisch laboratorium diverse onderzoekstechnieken beschikbaar zijn (virale kweek, antigeendetectie, serologie) blijft een diagnose vaak uit, of komt veel te laat om binnen het behandelplan nog van nut te kunnen zijn. Vanaf januari 2006 biedt het Laboratorium Microbiologie een
nieuwe moleculaire detectiemethode aan: een real-time PCR. Deze is in nauwe samenwerking met
dr. Rob Schuurman, moleculair bioloog werkzaam binnen ons laboratorium maar vooral ook
binnen de vakgroep medische microbiologie van het Universitair Medisch Centrum Utrecht, opgezet. Deze moleculaire detectiemethode maakt het mogelijk binnen twee werkdagen, de aan- of
afwezigheid van Influenza A virus, Influenza B virus, Respiratoir Syncytieel Virus, Rhinovirus, Parainfluenzavirus, Humaan Metapneumovirus, Adenovirus, Chlamydia pneumonia en Mycoplasma
pneumonia te bepalen in respiratoire materialen.
216
Syndroom
Frequente oorzaak
Zeldzame oorzaak
Verkoudheid
Rhinovirus
Coronavirus
Adenovirus
Para-influenzavirus
Influenza A virus
Influenza B virus
Respiratoir Syncytieel Virus
Enterovirus
Pharyngitis
Adenovirus
Herpes Simplex Virus
Enterovirus
Epstein-Barr Virus
Influenza A virus
Influenza B virus
Respiratoir Syncytieel Virus
Para-influenzavirus
Rhinovirus
Coronavirus
Kroep
Para-influenzavirus
Influenza A virus
Respiratoir Syncytieel Virus
Coronavirus
Bronchiolitis
Para-influenzavirus
Respiratoir Syncytieel Virus
Adenovirus
Para-influenzavirus
Influenza A virus
Influenza B virus
Rhinovirus
Pneumonie
Influenza A virus
Respiratoir Syncytieel Virus
Para-influenzavirus
Adenovirus
Rhinovirus
Epstein-Barr Virus
Influenza B virus
Tabel 2: virale verwekkers pneumonie naar klinisch syndroom
Virale diagnostiek
Binnen de virologie zijn er van oudsher 3 standaardtechnieken beschikbaar: antigeendetectie in
klinische materialen, virale kweek en serologie. Vooral de laatste 15 jaar zijn deze technieken fors
aangevuld met een vierde lijn: de moleculaire diagnostiek. De oudste techniek is de viruskweek in
cellijnen waarbij klinisch materiaal op een cellaag wordt gebracht die vervolgens dagen tot weken
wordt geïncubeerd. Om de dag worden deze cellen bekeken op het ontstaan van een virus specifiek cytopathogeen effect (CPE). Vaak duurt het echter meer dan een week voordat er iets zichtbaar is. Dit probleem is gedeeltelijk opgelost met de komst van de monoklonale antilichamen
waarbij vaak al na 2 à 3 dagen gekeken kan worden naar de mogelijke aanwezigheid van een specifiek virus, de zogenaamde versnelde virale kweek (figuur 1, 2 en 3):
Figuur 1:
Herpes Simplex in weefselkweek
Figuur 2:
Cytomegalovirus in weefselkweek
Figuur 3:
Rhinovirus directe fluorescentie
MICROLL A B BLAD
217
Een aantal virussen, waaronder Herpes Simplex Virus (HSV), Varicella Zoster Virus (VZV) en
Cytomegalovirus (CMV), is hiermee goed aantoonbaar. Het blijft echter een technisch moeilijk
proces dat ook veel eisen stelt aan de afname en transport van het klinisch materiaal. Tevens is de
opbrengst van deze techniek voor met name de respiratoire virussen nog steeds teleurstellend.
Een alternatief is ontwikkeld in de vorm van de directe virusdetectie in klinische materialen met
behulp van monoklonale antilichamen. Vooral het Respiratoir Syncytieel Virus (RSV) kan hiermee
snel en betrouwbaar worden aangetoond. De techniek heeft een zeer goede positief voorspellende
waarde, echter de negatief voorspellende waarde is slecht. Dit komt omdat de hoeveelheid virus
die in klinisch materiaal aanwezig is erg laag kan zijn waardoor het virus met deze technieken niet
aantoonbaar is, terwijl het wel duidelijk symptomen veroorzaakt. De laatste standaardtechniek, de
serologie, is uiterst krachtig in het aantonen van doorgemaakte infecties, maar laat je ook weer in
de steek bij het aantonen van een acute respiratoire infectie. De meest gebruikte techniek hiervoor
is de complement binding reactie (CBR). Het probleem bij deze techniek is dat er 2 serummonsters noodzakelijk zijn. Eén tijdens de acute fase van de ziekte, en één 10 tot 14 dagen later. Het
spreekt voor zich dat de uitkomst nog maar weinig toevoegt aan het acute klinische probleem,
hooguit aan het begrip achteraf. De moleculaire technieken hebben inmiddels bewezen een uiterst
krachtig alternatief te zijn voor het aantonen van acute infecties vooral bij die aandoeningen waar
kweek en/of serologie erg lang op zich laat wachten. Zo kan de diagnose Chlamydia trachomatis
en tuberculose met hoge betrouwbaarheid met een PCR binnen 2 werkdagen worden aangetoond
of verworpen. Het ligt dan ook voor de hand deze technieken ook op het gebied van de virale respiratoire infecties toe te passen. Dit is echter door de grote diversiteit aan betreffende virussen
niet zo gemakkelijk.
Moleculaire detectie respiratoire virussen
Zoals uit tabel 1 en 2 valt op te maken, speelt een behoorlijk aantal virussen een rol bij de frequent voorkomende respiratoire infecties. Tevens zijn er nog 2 andere organismen die ook nog
een rol kunnen spelen bij deze infecties namelijk Chlamydia pneumoniae en Mycoplasma pneumoniae. Het moleculair aantonen van al deze verwekkers met een standaard PCR met alle erbij
horende controles zou zeer veel werk kosten en vrijwel onbetaalbaar zijn. De komst van de realtime PCR heeft daar veel verandering in gebracht. Toch is het nog een moeilijke taak omdat voor
iedere verwekker apart een detectiemethode opgezet moet worden. Haalbaar is de detectie van de
organismen uit tabel 3:
Organisme
Taxonomische groep
Target
Influenza A virus
Influenza B virus
Para-influenzavirus 1 t/m 4
Respiratoir Syncytieel Virus A en B
Humaan Metapneumovirus
Rhinovirus
Adenovirus
Chlamydia pneumoniae
Mycoplasma pneumoniae
Orthomyxoviridae
Orthomyxoviridae
Paramyxoviridae
Paramyxoviridae
Paramyxoviridae
Picornaviridae
Adenoviridae
RNA
RNA
RNA
RNA
RNA
RNA
DNA
DNA
DNA
Tabel 3: voor genoemde micro-organismen is detectie door middel van real-time PCR mogelijk
218
Geschikte respiratoire materialen (zie verder) dienen zo spoedig mogelijk na afname op het
Laboratorium Microbiologie afgeleverd te worden. Eenmaal binnengekomen, wordt direct RNA en
DNA uit deze materialen geïsoleerd. Dit gebeurt volledig geautomatiseerd en gestandaardiseerd
met behulp van de Magna-pure® (Roche Diagnostics) (figuur 4):
Figuur 4: Magna-pure®(Roche Diagnostics)
Daarna wordt het virale RNA omgezet in DNA zodat het in de real-time PCR verwerkbaar is. Het
real-time platform waarop wij werken is de ABI-prism® (Applied Biosystems) (figuur 5):
Figuur 5: ABI-prism ®(Applied Biosystems)
Afhankelijk van het moment van binnenkomst van de klinische materialen duurt dit hele proces 1
of 2 werkdagen. Komen de materialen ’s morgens vroeg binnen dan kan het proces dezelfde dag
afgerond worden, anders duurt het tot de volgende middag.
MICROLL A B BLAD
219
Resultaten tot nu toe
Binnen het Universitair Medisch Centrum Utrecht loopt deze aanpak al een jaar en de behaalde
resultaten zijn zeer goed. Hoewel de data nog verder geanalyseerd en gepubliceerd moeten worden, was Rob Schuurman bereid een tipje van de sluier op te lichten. Let wel: het betreft nog premature data en iedere detaillering ontbreekt! Het resultaat is echter indrukwekkend. Zowel binnen
een patiëntenpopulatie van het Academisch Ziekenhuis Utrecht (AZU) als het Wilhelmina
Kinderziekenhuis (WKZ), beiden onderdeel van het Universitair Medisch Centrum Utrecht, zijn
respiratoire materialen met behulp van een virale kweek en met behulp van de nieuwe real-time
PCR geanalyseerd (tabel 4):
Techniek
Aantal materialen
Kweek positief
Real-time PCR positief
Dubbelinfecties
AZU
WKZ
88
4 ( 5%)
51 (58%)
10 ( 9%)
191
34 (18%)
133 (70%)
57 (24%)
Tabel 4: resultaten vergelijking kweek en real-time PCR binnen het Universitair Medisch Centrum
Utrecht (AZU = Academisch Ziekenhuis Utrecht, WKZ = Wilhelmina Kinderziekenhuis Utrecht)
Uit beide populaties blijkt de gevoeligheid van de real-time PCR vele malen hoger dan de gevoeligheid van de kweek. Tevens valt op dat er bij diverse patiënten sprake is van dubbelinfecties. De
gevonden virussen staan weergegeven in tabel 5:
Type verwekker
Rhinovirus
Influenza A virus
Respiratoir Syncytieel Virus
Coronavirus
Para-influenzavirus
Humaan Metapneumovirus
Adenovirus
Chlamydia pneumoniae
Mycoplasma pneumoniae
AZU
20 %
18 %
11 %
8%
5%
3%
1%
1%
WKZ
28 %
10 %
31 %
13 %
6%
7%
9%
3%
Tabel 5: verdeling verwekkers respiratoire beelden
Het Laboratorium Microbiologie Twente Achterhoek is de mening toegedaan dat deze resultaten
zo goed zijn, dat deze test nu standaard aangeboden moet worden.
Indicatiegebieden
Zoals al uit de tabellen blijkt, komen virale infecties vooral bij kinderen maar zeker ook redelijk frequent bij volwassenen voor. Deze real-time PCR kan dan ook aangevraagd worden bij patiënten
met een niet-“typisch” beloop van een luchtweginfectie. Dus afwijkend van het typische beloop
van een bacteriële pneumonie, die voornamelijk gekenmerkt wordt door een febriele temperatuur,
een duidelijke lobaire pneumonie op de X-thorax en een duidelijke leucocytose met vooral granulocyten in de differentiatie.
220
Aanleveren respiratoire materialen
Lang niet alle respiratoire materialen zijn even geschikt voor deze techniek. Zo heeft bij een volwassene een broncho-alveolaire lavage (BAL) de voorkeur. Bij kleine kinderen is een neusspoelsel,
zoals nu reeds afgenomen wordt bij verdenking op een RSV-infectie, uitstekend materiaal.
Echter alle andere respiratoire materialen (sputum, bronchiaalsecreet en indien niet anders
mogelijk een nasopharynx-wat) zijn met deze techniek te analyseren. Voorwaarde is wel een snel
transport naar ons laboratorium. Het huidige aanvraagformulier voorziet nog niet in de mogelijkheid dit moleculair respiratoir panel direct aan te kruisen. Wilt u het echter aanvragen, schrijf dan
duidelijk bij de klinische gegevens: moleculair respiratoir panel. Tevens is het verstandig de dienstdoende arts-microbioloog van de aanvraag op de hoogte te brengen. Als aan bovenstaande voorwaarden is voldaan, kan de uitslag binnen 2 werkdagen bekend zijn. Uiteraard worden positieve
bevindingen direct doorgebeld naar de aanvrager. U kunt dit panel vanaf nu aanvragen!
MICROLL A B BLAD
221
UITLEG REAL-TIME PCR
RON HENDRIX
Zoals u weet, vormt de PCR (polymerase chain reaction) de kerntechniek binnen de moleculaire
detectie van infectieziekten. Met deze techniek (figuur 1.) kunnen relatief simpel kleine hoeveelheden DNA in vitro vermeerderd worden tot een hoeveelheid die met diverse andere technieken aantoonbaar is. Juist in deze andere technieken zit het probleem. Ze zijn per definitie noodzakelijk om
de specificiteit van de PCR te borgen en kosten extra veel tijd en dus geld. DNA-DNA hybridisatie
(figuur 2) is de sleutel voor deze specificiteit. Een oplossing hiervoor is de hybridisatiestap niet
meer na de PCR te doen, maar tijdens de PCR zodat gedurende de reactie in “real-time” een eventueel
positief signaal gemeten kan worden. Hierdoor combineer je de specificiteit van een hybridisatie
achteraf met de snelheid van het “in real-time” meten. Een gemiddelde real-time PCR is in de regel
binnen 2 uur klaar.
Figuur 1: standaard PCR
222
Bij een PCR binden (hybridiseren) 2 virus specifieke primers aan complementaire stukken DNA,
dus van de target afkomstige stukken DNA. Door het target-DNA enkelstrengs te maken (denatureren) kunnen de primers op deze heel specifieke plaatsen binden. Deze primers vormen het
startpunt van de DNA-synthese waardoor nieuw van het virus afgeleid DNA gevormd wordt. Door
dit proces 40 maal te herhalen (amplificatie) ontstaan onder ideale omstandigheden 240 stukjes
nieuw materiaal die gemakkelijk met vervolgtechnieken aantoonbaar zijn.
Figuur 2: nucleinezuur hybridisatie
DNA en RNA zijn opgebouwd uit 5 bouwstenen. DNA uit de bouwstenen A C G en T en RNA uit
de bouwstenen U A G en C waarbij er altijd 2 bouwstenen ernaar “streven” aan elkaar te binden.
Dit zijn A aan U en/of T en G aan C. Dus hele ketens DNA en/of RNA zullen ernaar streven altijd
aan een totaal identieke maar complementaire DNA-keten te binden oftewel te hybridiseren.
Als de DNA-volgorde van een organisme bekend is, kan altijd een stukje DNA gekozen worden
dat uniek is voor dat organisme. Dit stukje DNA kan in het laboratorium gemaakt worden. Als dat
toegevoegd wordt aan de PCR-reactie na amplificatie zal het er altijd naar streven te binden aan
een stuk target-DNA van dat specifieke organisme, indien dit natuurlijk aanwezig is. Is dit niet
aanwezig dan zal het ook niet binden. De bindingsreactie kan zichtbaar gemaakt worden door het
nagemaakte stukje DNA te voorzien van een “vlaggetje”.
MICROLL A B BLAD
223
Door naast de primers nog een specifiek stukje DNA met een slim vlaggetje aan de PCR-reactie
toe te voegen, blijkt het mogelijk de reactie in real-time te volgen. Dit specifieke stukje DNA bevat
naast het slimme vlaggetje, in moleculaire termen een fluorescerend label, ook nog een ander
vlaggetje dat voorkomt dat het fluorescerend label licht gaat uitzenden. Dit andere vlaggetje heet
in moleculaire termen een quencher.
Echter, wanneer een organisme waarnaar gezocht wordt in het materiaal aanwezig is, zal dit
gevlagde stukje DNA binden aan het specifieke DNA en later uit elkaar vallen, waarbij de quencher
los komt van het fluorescerende label, zodat er licht uitgestraald kan worden. Dit uitstralen van
licht is een maat voor het positief worden van de PCR.
Figuur 3: real-time PCR
224
F E C E S O N D E R Z O E K D A R M P AT H O G E N E N W O R D T
UITGEBREID MET CRYPTOSPORIDIUM
BERT MULDER
Ondanks de aanwezigheid van Cryptosporidium wordt deze diagnose veelal niet gesteld tijdens het bacteriologisch fecesonderzoek op darmpathogenen. Door het systematisch toevoegen van dit onderzoek
kan de diagnose cryptosporidiosis veel vaker worden gesteld.
In de zomer van 2005 is binnen het Laboratorium Microbiologie Twente Achterhoek een onderzoek verricht naar de diagnostiek van Cryptosporidium in feces. In dit onderzoek werden verschillende diagnostische methoden vergeleken en de resultaten zullen in 2006 worden gepresenteerd
op (internationale) congressen en gepubliceerd in de literatuur. De onderzoeksresultaten hebben
echter ook directe consequenties voor de fecesdiagnostiek op darmpathogenen binnen het laboratorium. Van de 515 onderzochte fecesmonsters waren er namelijk 37 positief voor
Cryptosporidium. Dit percentage van boven de 7% is veel hoger dan gebruikelijk voor fecesonderzoek dat gericht is op verwekkers als bijvoorbeeld Shigella en Yersinia en kan wedijveren met het
percentage positieve onderzoeksresultaten voor veel voorkomende pathogene verwekkers als
Campylobacter en Salmonella. De conclusie van het onderzoek luidt dat cryptosporidiose tegenwoordig beschouwd moet worden als een protozoaire darmpathogeen bij de mens, ook indien het
immuunsysteem volledig intact is.
Figuur 1. Cryptosporidium
Opvallend was dat veel van de positieve monsters alleen voor fecesonderzoek binnen het laboratorium bacteriologie waren ingezonden en niet voor onderzoek op darmparasieten. Toch hoeft dit
geen verwondering te wekken, aangezien de incubatietijd van een Cryptosporidium-infectie tussen
MICROLL A B BLAD
225
de 2 en 10 dagen ligt en derhalve de infectie eerder tot het klinische beeld van een (sub)acute
gastro-enteritis leidt dan tot het beeld van een chronische parasitaire infectie. Voeg daarbij het
epidemiologische feit dat Cryptosporidium-infecties in Nederland niet alleen in de maanden
augustus en september een piek laten zien, en dat daarnaast een tweede jaarlijks terugkerende
piek in incidentie gezien wordt in de maanden maart en april, en tussen beide pieken ook patiënten met Cryptosporidium-infecties worden gezien, en het zal geen verbazing wekken dat het
Laboratorium Microbiologie Twente Achterhoek heeft besloten met ingang van februari 2006 een
onderzoek op Cryptosporidium toe te voegen aan het routine fecesonderzoek op darmpathogenen. Vooralsnog zal onderzoek op Cryptosporidium alleen worden uitgevoerd op ingezonden
(water)dunne en brijige fecesmonsters. De opbrengst en resultaten van de toevoeging van deze
vorm van diagnostiek aan het onderzoek op darmpathogenen zal na een jaar worden geëvalueerd
en (opnieuw) met de aanvragers worden gecommuniceerd.
Bij personen met een goed werkend immuunsysteem is het beloop van de Cryptosporidiuminfectie vergelijkbaar met bijvoorbeeld de gastro-enteritis veroorzaakt door Campylobacter,
namelijk self-limiting. In de praktijk behoeven derhalve lang niet alle patiënten medicamenteus te
worden behandeld. Indien eventueel toch medicamenteuze behandeling geïndiceerd is, kan het
beste gekozen worden voor therapie met paromomycine 3 dd 10 mg/kg po, gedurende 1 - 4
weken.