Samenvatting

Samenvatting
Een cel heeft alle spelers in de cel nodig om haar taken efficiënt uit te kunnen voeren. Hierbij zijn
eiwitten van cruciaal belang; ze zijn nodig voor vele biologische functies en hun taken zijn zeer
divers. Eiwitten zijn grote biomoleculen. Ze bestaan uit een keten van aminozuren die wordt
gevouwen tot een specifieke driedimensionale structuur. Eiwitten die betrokken zijn bij
redoxreacties hebben een extra atoom of klein molecuul nodig om specifieke redoxreacties uit te
kunnen voeren. Deze zogenoemde redoxeiwitten zijn het hoofdonderwerp van dit proefschrift.
Om de activiteit van een eiwit te kunnen bestuderen is een betrouwbare detectiemethode nodig.
Wij hebben voor fluorescentiespectroscopie gekozen. Omdat de karakteristieke eigenschappen
van de redoxcofactor afhankelijk zijn van de redox toestand van de prosthetische groep kan het
absorptiespectrum van een redoxeiwit in het algemeen worden gebruikt als een soort
vingerafdruk van het eiwit. Door een fluorescerend molecuul aan het eiwit te koppelen is het
gelukt om de bovengenoemde veranderingen in het absorptiespectrum van het eiwit te “vertalen”
naar de emissie van de gekoppelde fluorofoor via Förster Resonance Energy Transfer (FRET).
Hoofdstuk I geeft een kort overzicht van het fenomeen fluorescentie, inclusief een algemene
introductie van de processen die plaatsvinden tussen de absorptie en emissie van licht op basis
van het Jablonskidiagram. Tevens worden in de natuur voorkomende fluoroforen en
fluorescerende probes geïntroduceerd, tezamen met verschillende manieren om een
fluorescerend klein molecuul te laten reageren met een specifiek residue aan het oppervlak van
een eiwit. Verder wordt de theorie van FRET behandeld en tot slot worden de prosthetische
groepen die voor het experimentele werk in dit proefschrift gebruikt zijn, geïntroduceerd. Dit
hoofdstuk bevat bovendien ook de doelstellingen en een overzicht van het onderzoek.
Het bepalen van de redoxtoestand van een redoxeiwit kan informatie verschaffen over het
algemene functioneren van het eiwit. Als een eiwit een elektron afgeeft aan een ander molecuul
wordt het een electron transfer (ET) eiwit genoemd. Als er ook sprake is van omzetting van een
substraat, waneer het afgegeven elektron wordt gebruikt in een chemische reactie, spreekt men
van een redoxenzym. Het onderzoeken van dergelijke redoxreacties is van belang om de functie
en het mechanisme van het enzym/eiwit beter te kunnen begrijpen.
In hoofdstuk II wordt een nieuwe methode geïntroduceerd gebaseerd op fluorescentie; er wordt
gedemonstreerd dat deze methode toegepast kan worden op verschillende redoxeiwitten met
verschillende actieve centra. De methode is getest voor eiwitten met drie soorten van
prosthetische groepen: type-I kopercentra (azurine, amicyanine, plastocyanine en pseudoazurine),
heemgroepen (cytochrome c550) en flavine mononucleotiden (flavodoxine). Deze methode
1
maakt het betrouwbaar onderscheiden van gereduceerde en geoxideerde eiwitten mogelijk,
evenals potentiometrische titraties bij submicromolaire concentraties.
Een specifieke toepassing van de op FRET gebaseerde methode, de ‘sensitized fluorescence
approach’, wordt in hoofdstuk III beschreven. De methode maakt gebruik van zogenaamde
type-3 kopereiwitten (bijvoorbeeld tyrosinase en hemocyanine), die in staat zijn zuurstof te
transporteren. Aan het eiwit, in de meeste gevallen tyrosinase van de grondbacterie Streptomyces
antibioticus,
werden
verschillende
fluorescerende
kleurstofmoleculen
gekoppeld.
Deze
kleurstofmoleculen beslaan met hun emissiemaxima samen alle golflengten van het zichtbare
spectrum van licht. De methode maakt gebruik van de gevoeligheid van de endogene
fluorescentie van type-3 kopereiwitten voor de aanwezigheid van zuurstof, door de nabijeultravioletemissie van het eiwit te vertalen naar label fluorescentie in het zichtbare deel van het
spectrum middels een FRET-mechanisme. Het label contrast tussen O2-vrij en O2-gebonden
eiwit kan groter worden gemaakt dan het contrast dat te zien is bij de tryptofaan-fluorescentie.
Een ander voordeel is de mogelijkheid om meerdere constructen tegelijk te observeren, dat tot
zuurstofbepalingen met hogere nauwkeurigheid leidt. Een op fluorescentie gebaseerd
biocompatibel systeem om zuurstof in een oplossing te meten wordt beschreven.
Hoofdstuk IV kan worden gezien als een voortzetting van hoofdstuk III omdat hetzelfde
construct (een type-3 kopereiwit gelabeld met een fluorofoor) wordt gebruikt om zuurstof te
detecteren. In de hier beschreven metingen wordt hemocyanine van Octopus vulgaris, waar Cy5 aan
is gekoppeld, geïmmobiliseerd in twee verschillende optisch transparante silicamatrices. Daarmee
wordt een vastestof preparaat verkregen dat als basis kan dienen voor zuurstofdetectie in zowel
de gasfase als de vloeistoffase. De twee polymeren die hier zijn gebruikt om het eiwit in te
kapselen (tetramethoxysilicaat en waterglas), bleken in ons geval allebei even goed te werken. Als
zuurstofsensor werken beide preparaten snel, en ze zijn biocompatibel, herbruikbaar en bezitten
een uitstekende stabiliteit.
Een andere toepassing van het op FRET gebaseerde principe wordt in hoofdstuk V beschreven.
Dit hoofdstuk betreft de P450 familie van enzymen, welke van groot belang zijn vanwege hun
katalytische eigenschappen. Wij hebben P450cam van Pseudomonas putida gelabeld om het binden
van substraat in de actieve plaats van het eiwit te observeren. Twee verschillende substraten
werden gekozen om de affiniteit voor de actieve plaats van het enzym te onderzoeken via de
emissie van een gekoppeld fluorofoor. De dissociatieconstanten voor allebei de substraten
werden nauwkeurig bepaald en kwamen goed overeen met de waarden bepaald met
absorptiespectroscopie. Deze methode maakt het mogelijk om fluorescentietitraties bij
2
submicromolaire concentraties uit te voeren, wat van toepassing kan zijn op een breed scala van
P450s.
Alle bovengenoemde metingen hadden een ding gemeen: een ensemble van moleculen werd
bestudeerd. Er zijn echter ook gespecialiseerde instrumenten om individuele moleculen te volgen.
De uitdaging was om aan te tonen dat onze methode ook bruikbaar is op het niveau van
enkelvoudige moleculen. Dit hangt voornamelijk af van de fotostabiliteit van het aan het eiwit
gekoppelde fluorescerende kleurstoflabel. Een tweede belangrijke factor is om een
immobilisatieschema te vinden voor het gelabelde enzym dat de activiteit van het enzym niet
beïnvloedt. In hoofdstuk VI worden de eerste ‘single molecule’ experimenten met onze op
FRET gebaseerde methode gerapporteerd. Allereerst werd het koper bevattende nitrietreductase
van Alcaligenes faecalis S-6 geïmmobiliseerd op een glasoppervlak. Door de fluorescentie
‘timetraces’ van het enzym te bestuderen onder omstandigheden waarbij substraatomzet plaats
vond, konden de kinetische parameters worden bepaald en gerelateerd aan de macroscopische
kinetische constanten gemeten aan ensembles van moleculen. De hier beschreven aanpak geeft
de mogelijkheid tot het verkrijgen van nieuwe uitzichten op het gebied van ‘single-redox’
enzymstudies en het precieze onderzoek van de onderliggende kinetiek.
Ten slotte worden in hoofdstuk VII de belangrijkste resultaten van dit proefschrift beschreven.
De belangrijkste bevinding voor elk hoofdstuk wordt benadrukt en de voordelen van de op
FRET gebaseerde methode worden samengevat. Een kort vooruitzicht op het toekomstige
onderzoek wordt gegeven; experimenten om de nieuwe mogelijkheden te verkennen, die in dit
proefschrift naar voren zijn gebracht, worden op dit moment in ons laboratorium uitgevoert.
3