soms moeilijk onderscheid tussen allo

C asu ï s t i e k
Erytrocytenautoantistoffen; soms moeilijk
onderscheid tussen allo- of autoantistoffen.
Serologie en transfusiebeleid in 3 bijzondere casussen
Auteurs
P.C. Ligthart, C.C. Folman en M. de Haas
Trefwoorden
erytrocytenautoantistoffen, irregulaire erytrocytenantistofidentificatie
Samenvatting
Erytrocytenautoantistoffen die reactief zijn met
alle erytrocyten van het identificatiepanel en de
eigen erytrocyten van de patiënt, worden meestal benoemd als aspecifiek reagerende antistoffen. Soms maakt het uit om de specificiteit van
deze antistoffen verder te onderzoeken. Het betreft dan vaak erytrocytenautoantistoffen die
gericht zijn tegen een antigeen met een hoge tot
zeer hoge frequentie. Het kennen van de specificiteit van erytrocytenautoantistoffen kan in
Inleiding
De aanwezigheid van aspecifiek reagerende autoantistoffen in het serum van een patiënt wordt serologisch
gekenmerkt door een panreactief erytrocytenpanel en
door de positieve reactie van de eigen erytrocyten met
de in het serum aanwezige antistoffen. Ook de directe
antiglobulinetest is vaak positief met IgG en/of complement. Indien antistoffen reageren met alle testerytrocyten maar niet met de eigen erytrocyten van de
patiënt, is het waarschijnlijker dat het geen aspecifieke
erytrocytenautoantistoffen betreft maar alloantistoffen
gericht tegen een hoogfrequent antigeen dat de patiënt
zelf niet tot expressie brengt. In een aantal gevallen is
de scheidslijn tussen auto en allo en specifiek versus
aspecifiek echter niet zo helder.
Bekend is dat aspecifiek reagerende autoantistoffen
vaak wel degelijk specifiek binden aan een bepaald
bloedgroepantigeendragend membraaneiwit. Zo kunnen erytrocytenautoantistoffen gericht zijn tegen de
Rhesus-, Band 3- of Kellstructuren, zonder antigeenspecificiteit, of tegen antigenen die met een hoge frequentie voorkomen, zoals Kpb of I. In sommige gevallen kan de aanwezigheid van een autoantistof gepaard
130
vol .
2
nr .
4 - 2009
sommige gevallen namelijk helpen bij het serologisch onderzoek naar de aanwezigheid van erytrocytenalloantistoffen en bij het vaststellen van
het transfusieadvies. In dit artikel worden 3 patiënten beschreven met vermeende aspecifiek
reagerende erytrocytenautoantistoffen, waarbij
toch een specificiteit kon worden vastgesteld. De
serologische verschillen en de invloed op het
transfusieadvies worden besproken.
(Tijdschr Bloedtransfusie 2009;2:130-4)
gaan met een verlaagde expressie van het betreffende
antigeen waartegen de antistoffen gericht zijn, waardoor de eigen erytrocyten niet reactief zijn en de antistoffen alloantistoffen lijken te zijn. Door testerytrocyten te behandelen met enzymen (bromeline, papaïne,
ficine, trypsine of chymotrypsine) of chemische middelen (dithiothreitol (DTT) of 2-aminoethyl-isothiuroniumbromide (AET)) kunnen bloedgroepdragende
membraanstructuren verwijderd worden of juist beter
aantoonbaar worden. Veel membraanstructuren zoals
de Rhesuseiwitten, het Duffyglycoproteïne of het Kellglycoproteïne tonen een specifiek veranderd ‘eigen’ expressiepatroon na enzym- of chemische behandeling.
Deze behandelingen kunnen gebruikt worden om de
specificiteit van erytrocytenallo- of -autoantistoffen
vast te stellen. Daarnaast kunnen deze behandelingen
gebruikt worden om testerytrocyten te maken die gebruikt kunnen worden voor het uitsluiten van de aanwezigheid van alloantistoffen.
De hier beschreven 3 casussen illustreren de complexiteit van het serologisch onderzoek bij panreactieve erytrocytenpanels en het belang van het vaststellen van de
antistofspecificiteit voor het te voeren transfusiebeleid.
tijdschrift
voor
bloedtransfusie
Tabel 1. Overzicht van de serologische bevindingen bij de verschillende patiënten.
Serumreacties
PEG
Diamed LISS
auto- panel autocontrole
controle
Directe antiglobulinetest
IAT
met
BSA
2-staps poly- anti-IgG
enzym specifiek
serum
panel
casus 1
zw/1+
zw/1+
+/2+
zw
1+
hemolyse
zw
zw
casus 1,
6 maanden later
neg
zw
nv
nv
nv
nv
zw
casus 1,
24 maanden later
neg
neg
nv
nv
nv
nv
casus 2
3+
neg
2+/3+
neg
2+
casus 3
3+
3+
3+
3+
neg
Eluaat
anti-C3
PEG
panel
autocontrole
zw
zw/1+
neg
zw
neg
neg
zw
neg
neg
neg
neg
neg
2+
zw
zw
neg
zw
neg
nv
2+
2+
neg
3+
3+
PEG=polyethyleenglycol, IAT=indirecte antiglobulinetest, BSA=bovien serumalbumine, neg=negatief, zw=zwak
positief, 1+ tot 3+=positief tot sterk positief, nv=niet verricht.
Tabel 2. Reacties van de sera van de verschillende patiënten met testerytrocyten na enzymof chemische behandeling.
Voorbehandeling testerytrocyten
serum
onbehandeld
ficine
DTT/AET
trypsine
chymotrypsine
casus 1
1+
1+
1+
1+
1+
casus 2
2+
2+
neg
2+
2+
casus 3
1+
neg
2+
2+
3+
DTT= dithiothreitol, AET=2-aminoethyl-isothiuroniumbromide, neg=negatief.
Casus 1
Bij een 53-jarige man, gediagnosticeerd met een anemie (Hb 4,4 mmol/l) bij het syndroom van GuillainBarré en nierinsufficiëntie, werd de antistofscreening
voor het eerst positief bevonden. De anemie werd geduid als veroorzaakt door het nierlijden, en therapie
met erytropoëtine was al ingezet. Hemolyseparameters waren niet bekend. In de voorgaande 3 maanden
had geen transfusie plaatsgevonden. Het serum gaf
zwakke reacties met alle gebruikte testerytrocyten in
het screenings- en identificatiepanel in de indirecte
antiglobulinetest met toevoeging van polyethyleenglycol (PEG) en in de Diamed ‘low ionic strength
solution’ (LISS)-kolomtechniek, en was duidelijk
zwakker of niet reactief met de erytrocyten van de
patiënt zelf (zie Tabel 1). De directe antiglobulinetest
was zwak positief met anti-IgG en met anti-C3d. In
het serum bleken aspecifiek reagerende warmte hemolysinen aanwezig te zijn, die mogelijk een verklaring vormden voor de aanwezigheid van complement
op de erytrocyten van de patiënt. Een zuur eluaat dat
tijdschrift
voor
bloedtransfusie gemaakt was van de erytrocyten van de patiënt was
reactief met alle gebruikte testerytrocyten, maar niet
met de erytrocyten van de patiënt zelf. Op basis van
het reactiepatroon van het eluaat kon niet met zekerheid worden vastgesteld dat het hier uitsluitend autoantistoffen betrof. Na uitgebreid serologisch onderzoek naar de specificiteit van de antistoffen, onder
andere met enzym behandelde en chemisch gemodificeerde testerytrocyten, bleek dat de antistoffen gericht waren tegen het AnWj-antigeen (zie Tabel 2).1
Voor het bepalen van de mate van expressie van het
AnWj-antigeen waren voor deze patiënt geen geschikte testsera beschikbaar. De antistoffen in het
serum en in het eluaat waren niet reactief met AnWjnegatieve testerytrocyten en ook niet met testerytrocyten met een verzwakte expressie van het AnWj-antigeen. We concludeerden dat het hier autoantistoffen
betrof met de specificiteit anti-AnWj.
AnWj is een hoogfrequent antigeen waarvan niet duidelijk is tot welk bloedgroepsysteem het behoort, maar
vol .
2
nr .
4 - 2009
131
C asu ï s t i e k
CD44
Kell
Ina/Inb
vermoedelijke locatie
van het AnWj-antigeen
Kell
Kpa/Kpb
Jsa/Jsb
K/k
KxFiguur 1. Model van CD44 met de vermoedelijke locatie van
het AnWj-antigeen.
dat zeer waarschijnlijk gelegen is op CD44, de structuur waarop ook de antigenen van het Indian-systeem
tot expressie komen (zie Figuur 1). Er zijn slechts 2 patiënten beschreven met alloantistoffen tegen AnWj. In
de meeste gevallen waarbij AnWj-antistoffen worden
aangetoond, betreft het autoantistoffen bij personen
van wie de erytrocyten een tijdelijk verlies hebben van
expressie van het AnWj-antigeen. Daarom reageren
(zoals ook in deze casus) autoantistoffen met de specificiteit anti-AnWj vaak wel met testerytrocyten maar
niet of verminderd met de erytrocyten van de patiënt.
Dit verlies van antigene expressie wordt gezien bij gezonde personen en bij patiënten met verschillende aandoeningen, waarbij lymfomen (Hodgkin en nonHodgkin) een overrepresentatie hebben. Bij deze patient waren er geen aanwijzingen voor de aanwezigheid
van een lymfoom. De AnWj-autoantistoffen bij deze
personen kunnen wel voor ernstige transfusiereacties
zorgen.2 Er wordt dan ook geadviseerd om in geval van
AnWj-autoantistoffen eenheden te selecteren met een
verminderde expressie van het AnWj-antigeen.3 Personen met het In(Lu)-fenotype hebben een zeer zwakke
expressie van de antigenen van Lutheran-systeem, het
Indian-systeem en het AnWj-antigeen. In de ingevroren voorraad van de Sanquin Bank of Frozen Blood
(SBFB) is een zeer beperkt aantal eenheden met die
typering beschikbaar.
Bij transfusie is ervoor gekozen om eenheden te selecteren met het In(Lu)-fenotype. De patiënt heeft
naast continuering van therapie met erytropoëtine,
132
vol .
2
nr .
4 - 2009
Figuur 2. Structuur van het Kellglycoproteïne dat in complex met het Kx-eiwit tot expressie wordt gebracht, en de
mogelijke locaties van een aantal antigenen behorende tot
het Kellsysteem.
4 eenheden met het In(Lu)-fenotype gehad in een
periode van 3 maanden, met een goede opbrengst.
Voor deze patiënt zijn ook buitenlandse bloedtransfusiediensten (binnen en buiten Europa) benaderd
om eenheden met In(Lu)-fenotype te verzorgen.
Een half jaar nadat de AnWj-antistoffen waren aangetoond, waren deze in het serum niet meer aantoonbaar;
de directe antiglobulinetest was positief, maar een zuur
eluaat was niet reactief met de testerytrocyten. Anderhalf jaar later was zowel de erytrocytenantistofscreening
als de directe antiglobulinetest negatief. Op dat moment is het transfusieadvies gewijzigd; en is besloten
geen erytrocyten met het In(Lu)-fenotype meer te selecteren. Wel is besloten, omdat het serologisch onderzoek
bij deze patiënt in geval van terugkeer van de AnWjantistoffen complex is, eenheden te selecteren die compatibel zijn voor Rh-, K-, Duffy-, Kidd- en Ss-antigenen
ter preventie van de vorming van alloantistoffen.
Casus 2
Bij een 80-jarige patiënte, die een onderbeenamputatie
moest ondergaan, werden bij de antistofscreening en
identificatie antistoffen tegen erytrocyten aangetoond,
die sterk reactief waren met alle gebruikte testerytrocyten in de indirecte antiglobulinetest met toevoeging van
PEG en de Diamed LISS-kolomtechniek, en niet reactief waren met de erytrocyten van patiënte zelf. Het Hb
tijdschrift
voor
bloedtransfusie
was 5,4 mmol/l, de anemie werd verondersteld te
berusten op een ijzergebrekanemie. Hemolyseparameters waren niet afwijkend en het reticulocytenaantal was niet verhoogd. Preoperatief was transfusie wenselijk, gezien de algehele en met name de
cardiale toestand van de patiënte. De directe antiglobulinetest was zwak positief met anti-IgG. Er
werd gedacht aan antistoffen gericht tegen een hoogfrequent antigeen. Ook deze patiënte had de afgelopen periode geen bloedtransfusie gehad en antistofscreeningen die verricht zijn in het verleden waren
altijd negatief geweest. Uit het serologisch vervolgonderzoek bleek dat de antistoffen verminderd reactief
waren met testerytrocyten die behandeld waren met
bromeline of AET. Dit kan wijzen op antistoffen die
reageren tegen antigenen binnen het Kell-systeem. Op
de erytrocyten van de patiënt waren de hoogfrequente
Kellbloedgroepantigenen k en Kpb alleen aantoonbaar
met een zeer gevoelige techniek (absorptie/elutie). Het
serum van de patiënte was niet reactief met testerytrocyten waar alle antigenen van het Kellbloedgroepensysteem op ontbraken. In het eluaat gemaakt van de
erytrocyten van de patiënt waren geen antistoffen aantoonbaar. De specificiteit van de antistoffen werd vastgesteld als anti-K-totaal, dus gericht tegen alle vormen
van het Kellglycoproteïne (zie Figuur 2).
Moleculair biologisch onderzoek, verricht door het
‘International Blood Group Reference Laboratory’
(IBGRL) te Bristol, liet geen afwijkingen in het
KEL-gen zien van deze patiënt, waardoor normale expressie van het Kellglycoproteïne verondersteld mag
worden. Meest waarschijnlijk betrof het hier erytrocytenautoantistoffen die geen duidelijke hemolyse tot gevolg hadden. Antistoffen van het type anti-Kell-totaal
kunnen een ernstige transfusiereactie veroorzaken.
Volledig compatibele erytrocyteneenheden (zonder expressie van het Kellsysteem) waren niet beschikbaar.
Aangezien de klinische relevantie van de antistoffen
niet duidelijk was, werden eenheden geselecteerd die
naast Rh en K compatibel ook compatibel waren voor
antigenen binnen het Duffy-, Kidd- en MNSs-systeem.
De ingreep is verricht onder bloedleegte en transfusie
bleek niet noodzakelijk.
Casus 3
De derde casus betreft ook een 80-jarige patiënt, die
vanwege anemie (Hb 2,8 mmol/l) bij bloedverlies
vanuit de blaas als gevolg van een blaascarcinoom,
transfusiebehoeftig was. Alleen het lactaatdehydrogenase (LDH)-gehalte was bekend en niet afwijkend.
Een week daarvoor, het Hb was 4,7 mmol/l, waren er
tijdschrift
voor
bloedtransfusie GPA
M/N
knipplaats
trypsine
knipplaats
ficine
T
Ena
F
F
Figuur 3. De structuur van glycoforine A (GPA), drager van
de antigenen M, N en Ena. Binnen het Ena-antigeen kunnen door enzymatische digestie van GPA 3 verschillende
antigenen onderscheiden worden. EnaTS=trypsinegevoelig,
EnaFS=ficinegevoelig, EnaFR=ficineresistent.
geen serologische problemen bij het pretransfusieonderzoek en bedroeg het Hb na transfusie van 2
eenheden 5,7 mmol/l. Bij het antistoffenonderzoek
waren antistoffen aantoonbaar die sterk reactief waren met alle gebruikte testerytrocyten in de indirecte
antiglobulinetest, met toevoeging van PEG en de
Diamed LISS-kolomtechniek, en met de erytrocyten
van de patiënt. De directe antiglobulinetest was positief en in het eluaat waren ook sterk reactieve antistoffen aantoonbaar. Deze antistoffen reageerden niet
met enzymbehandelde testerytrocyten (bromeline en
papaïne). Na uitgebreid vervolgonderzoek kon de
specificiteit van de antistoffen worden vastgesteld als
anti-EnaFS.
Het Ena-antigeen is gelegen op het membraangekoppelde glycoproteïne glycoforine A (GPA), dat
de antigenen van het MN-bloedgroepsysteem draagt
(zie Figuur 3). Het Ena-antigeen bestaat uit 3 epitopen die zijn opgedeeld op grond van de enzymgevoeligheid: EnaFR (ficineresistent), EnaFS (ficinegevoelig) en EnaTS (trypsinegevoelig). De aanwezigheid
van de anti-genen M, N en EnaFS op de erytrocyten
van de patiënt kon worden bevestigd, waarmee kon
worden vastgesteld dat de aangetoonde antistoffen
autoantistoffen waren. Autoantistoffen tegen GPA
komen vaker voor en behoeven, buiten de selectie
vol .
2
nr .
4 - 2009
133
C asu ï s t i e k
Aanwijzingen voor de praktijk
1. Redenen voor vervolgonderzoek naar de specificiteit van de antistoffen bij patiënten met
vermoedelijke aspecifieke autoantistoffen:
- De antistoffen in het serum zijn minder sterk reactief met de erytrocyten van de patiënt
(autocontrole) dan met testerytrocyten.
- De antistoffen in het serum zijn minder sterk reactief met enzym- of chemisch behandelde
testerytrocyten.
2. Voordelen van de identificatie van de specificiteit van autoantistoffen:
- de mogelijkheid om een aanpassing te maken bij het selecteren van het meeste geschikte
donorbloed.
- de mogelijkheid om de aanwezigheid van andere klinisch belangrijke antistoffen in een
betrouwbare techniek uit te sluiten.
van Rh-compatibel en K-negatief bloed, geen apart
transfusieadvies. Aangezien alleen na enzymbehandeling uitgesloten kon worden, moest bij de selectie
van eenheden echter wel rekening gehouden worden
met de Duffy (Fy)-typering; in dit geval Fyb-negatief. Uiteindelijk is er geen transfusie toegediend en
is de patiënt overleden.
Conclusie
Bij de 3 beschreven patiënten was er primair sprake van
autoantistoffen gericht tegen een algemene bloedgroependragende structuur. Door afwijkende reactiepatronen is vervolgonderzoek verricht en de specificiteit van
de autoantistoffen vastgesteld. Bij casus 1 leidde dat tot
een aangepast transfusieadvies vanwege de in de literatuur beschreven transfusiereacties. Voor casus 2 en 3
was dit respectievelijk niet mogelijk of niet nodig. Voor
alle 3 de casussen gold dat het transfusieadvies uitgebreid werd door naast Rh en K ook antistofvorming
tegen Duffy (Fy), Kidd (Jk) en Ss te voorkomen.
Het vaststellen van de specificiteit van autoantistoffen kan ook helpen bij het uitsluiten van de aanwezigheid van klinisch belangrijke alloantistoffen en
voor de selectie van erytrocyten die negatief zijn
voor het antigeen waartegen de autoantistoffen gericht waren. Bij de aanwezigheid van autoantistoffen
adviseren wij in ieder geval Rhesusfenoytope en Kcompatibele eenheden te selecteren. Bij casus 2 was
het mogelijk om de aanwezigheid van een groot aantal klinisch belangrijke antistoffen uit te sluiten met
AET behandelde testerytrocyten, bij casus 3 was dat
mogelijk met papaïne behandelde testerytrocyten.
Dankwoord
De auteurs danken dhr. dr. W. van Gelder (Albert
Schweitzer Ziekenhuis), mw. drs. N.C.V. Péquériaux
134
vol .
2
nr .
4 - 2009
(Jeroen Bosch Ziekenhuis) en mw. dr. S. Kos (ten
tijde van casus ‘t Lange Land Ziekenhuis, nu St. Jans
Gasthuis) voor de prettige samenwerking en het aanleveren van de klinische gegevens betreffende deze 3
patiënten.
Referenties
1. Folman CC, Ligthart PC, Smid WM, De Vooght KM,
Adriaansen HJ. Een zwangere vrouw met antistoffen anti-CRAM,
gericht tegen een hoogfrequent antigeen: serologisch en
klinisch beloop. Tijdschr Bloedtransfusie 2008;1,73-7.
2. De Man AJ, Van Dijk BA. An example of anti-AnWj causing
haemolytic transfusion reaction. Vox Sang 1992;63,238.
3. Daniels G, Poole J, De Silva M, Callaghan T, MacLennan S,
Smith N. The clinical significance of blood group antibodies.
Transfusion Medicine 2002;12,287-95.
Ontvangen 28 september 2009, geaccepteerd 16 november 2009.
Correspondentieadres
Dhr. P.C. Ligthart, senior analist
Mw. dr. C.C. Folman, hoofd laboratorium
Mw. dr. M. de Haas, manager Immunohematologie
Diagnostiek
Sanquin Diagnostiek
Referentielaboratorium Erytrocytenserologie
Plesmanlaan 125
1066 CX Amsterdam
Tel.: 020 512 33 73
E-mailadres: [email protected]
Belangenconflict: geen gemeld.
Financiële ondersteuning: geen gemeld.
tijdschrift
voor
bloedtransfusie