Immunohistochemische detectie van lmp1 in

IMMUNOHISTOCHEMISCHE DETECTIE VAN
LMP1 IN LYMFOPROLIFERATIEVE
AANDOENINGEN
NIELS VELGHE
Dienst Pathologische anatomie UZ Gent
Begeleiders:
Laura Vermeulen
Prof. Dr. Louis Libbrecht
INHOUD

Doelstelling

Inleiding



Epstein-barr virus
Wat is LMP1?
EBV-geassocieerde aandoeningen
Materiaal en methoden
 Resultaten
 Besluit

2
DOELSTELLING
Op punt stellen van een immunohistochemische
kleuring
 Aanwezigheid Epstein-Barr virus geïnfecteerde
cellen aantonen
 Vergelijken met de resultaten van de chromogeen
in situ hybridisatie (CISH)

3
EPSTEIN-BARR-VIRUS (EBV)
Gammaretrovirus (HHV-4) herpesvirus
 Torus-vormig kerneiwit
 Lineair dubbelstrengig
 172Kb  codeert > 85 genen
 Latent aanwezig = 3 types

4
LATENTIETYPES LYMFOPROLIFERATIEVE AANDOENINGEN
Type 1
Burkitt
Latentie
Type 3
PTLD
Type 2
Hodgkin
5
LMP 1
Latent membraan proteïne 1
 Integraal membraan eiwit van het EBV
 Oncogeen eiwit
 Induceert expressie van verschillende merkers
 In B-lymfo’s  cellulaire genen(Bcl2, IL-10) reguleren
 Transformerende effecten + expressie in HRS
 belangrijk in Hodgkin diagnose
 Infectieuze mononucleosis

6
EBV-GEASSOCIEERDE AANDOENINGEN
Hodgkin
Benigne
reactieve
infecties
EBV
Carcinomen
NonHodgkin
7
MATERIAAL
Benchmark XT
(ventana –Roche)
Gebruikte toestellen
Tissue Teck
(Sakura)
MATERIAAL

Reagentia
 EZ prep concentraat (10x)
 LCS (Liquid coverslip)
 2 x SSC (Sodium Chloride Sodium citraat)
 Reactiebuffer (10X)
 CC1 (Cell Conditioning solution 1)  EDTA
 CC2 (Cell Conditioning solution 2)  Citraat
9
MATERIAAL

Reagentia carrousel
 Hematoxyline I en II (tegenkleuring)
 Bluing reagens ( tegenkleuring 2)
 Protease I
 Amplificatiekit
 Ultraview Universal DAB detection Kit
 Uv DAB inhibitor
 Uv HRP multimeer
 Uv DAB chromogeen
 Uv DAB H2O2
 Uv copper
10
MATERIAAL

Primair antilichaam
 Cocktail (Clones CS1-4) Dako
 Monoclonale muis ‘anti-EBV’ LMP1 antilichamen
 Wordt verdund met Antibody diluent

 manuele stap
11
METHODEN
CISH
LMP1
Pathways
EBV positief
Chromogeen In Situ
Immunohistochemisch
Hybridisatie
LMP1 detectie in
cytoplasma en in
oppervlaktemembraan
EBER detectie
gelokaliseerd in de kern
(blauwe kern)
Methode op punt stellen
Ter controle
12
PRINCIPE VAN DE MULTIMEER DETECTIE
13
OP PUNT STELLEN VAN METHODE
Immunohistochemische kleuring
Hitte
geïnduceerd
voorbehandeling
Cel conditioner 1
EDTA-buffer
(Ph>7)
Cel conditioner 2
Citraatbuffer
(Ph<7)
Enzymatische
voorbehandeling
Protease 1
14
METHODEN / OVERZICHT
RESULTAAT
Cel conditioner 1
EDTA-buffer
16
BETROUWBAARHEID

Hodgkindiagnose = EBER +
en LMP 1 + (in HRS cellen)
Morfologie
CISH

Bij zwak signaal  ↑ kans
op foute interpretatie
LMP1
Betrouwbare diagnose
17
OORZAKEN VAN VALSE RESULTATEN
Degradatie van het RNA
 ‘Hit en Run’ hypothese
 Interferentie
 Zwakke expressie van LMP1
 Slechtere kwaliteit van het weefsel
 Slechte fixatie van het weefsel

18
BESLUIT
De basisvaardigheden zijn verworven
 Mogelijk om IHC-kleuring te optimaliseren 
detecteren van LMP1
 Voorbehandelingstappen van groot belang  ↑↑↑
invloed op kleuring
 Hoe ↑ de kennis van mogelijke problemen  hoe ↑
de interpretatie van het beeld.

19
IMMUNOHISTOCHEMISCHE DETECTIE VAN
LMP1 IN LYMFOPROLIFERATIEVE
AANDOENINGEN
NIELS VELGHE
Dienst Pathologische anatomie UZ Gent
Begeleiders:
Laura Vermeulen
Prof. Dr. Louis Libbrecht