Development of RNA Profiling Tools and the Implementation in

Development of RNA Profiling Tools and the Implementation in Forensic
Casework
P.A. Lindenbergh
Nederlandse Samenvatting
Binnen het huidige forensische onderzoek wordt genetische informatie in toenemende mate
gebruikt om een veelzijdigheid aan donorkarakteristieken te achterhalen. Naast informatie omtrent
de donor van een spoor, waar DNA een hoofdrol in speelt, kan informatie over de biologische origine
van hetzelfde spoor van belang zijn om bijvoorbeeld een reconstructie te kunnen maken van de
activiteiten die op het plaats delict hebben plaatsgevonden. De methoden die momenteel gebruikt
worden om informatie over de biologische oorsprong van forensische monsters te verkrijgen zijn
veelal gebaseerd op histologische en/of immunologische principes. Het grote voordeel is dat deze
methoden snel en eenvoudig zijn toe te passen. Echter, deze hebben ook een beperkte gevoeligheid
en zijn presumptief, wat inhoudt dat absolute uitspraken over de biologische oorsprong van een
betreffend spoor niet gemaakt kunnen worden. In 1999 werd voor het eerst de toepassing van het
boodschapper-RNA (mRNA) molecuul als mogelijk alternatief voor de identificatie van
lichaamsvloeistoffen beschreven. Deze moleculen vormen de schakel tussen de genetische
informatie in het DNA, aanwezig in de celkern, en de eiwitten die de biologische functies vervullen.
Per celtype komen verschillende van deze mRNA-moleculen specifiek tot expressie. De analyse van
een combinatie van deze mRNA-markers zou daarom in theorie gebruikt kunnen worden om de
biologische origine van forensische monsters te kunnen bepalen.
Dit proefschrift beschrijft het onderzoek naar de toepassing van mRNA-profilering als techniek om op
een plaats delict gevonden humane lichaamsvloeistoffen en orgaanweefsels te kunnen
onderscheiden en identificeren. De hoofdstukken zetten de ontwikkelingsprocessen en validatieaspecten uiteen van twee verschillende RT-PCR multiplex analysemethoden; één gericht op de
identificatie van lichaamsvloeistoffen en huidcellen, en een tweede voor orgaanweefsels. Daarnaast
wordt in detail ingegaan op de analyse van RNA-mengselprofielen, worden richtlijnen geschetst voor
de onbevooroordeelde uitvoering van RNA-profilering en interpretatie van RNA-profielen en is de
prevalentie van specifieke celtypen aanwezig op enkele objecten in openbare locaties onderzocht.
Gedurende de laatste veertien jaar zijn er voor enkele lichaamsvloeistoffen die veelvuldig voorkomen
in forensische monsters op een plaats delict (waaronder bloed, speeksel en sperma), specifieke
mRNA-merkers geïdentificeerd. Een systeem waarin simultaan deze mRNA-merkers forensische
monsters kunnen onderzoeken was echter bij aanvang van dit promotieonderzoek nog niet
beschikbaar. Hoofdstuk 1 beschrijft de ontwikkeling en validatie van een multiplex RT-PCRanalysemethode met detectie door middel van capillaire elektroforese. Hiermee kunnen bloed,
speeksel, sperma, menstruele secretie, vaginale mucosa en huid gelijktijdig worden aangetoond. Om
zowel DNA als mRNA uit hetzelfde monster te kunnen profileren, moeten beide moleculen eerst
efficiënt geëxtraheerd worden. Hiervoor zijn een aparte DNA- en RNA-isolatiemethode met elkaar
gecombineerd tot een nieuwe co-isolatiemethode die een vergelijkbare DNA opbrengst oplevert in
vergelijking met de standaard DNA-isolatiemethode die momenteel op het NFI in gebruik is. Voor de
analyse van bovengenoemde lichaamsvloeistoffen en huid werden vervolgens negentien merkers
geselecteerd op basis van literatuuronderzoek en gecombineerd in een multiplex analysemethode.
Deze omvatte drie merkers die als positieve controle dienen, drie bloedmerkers, twee
speekselmerkers, twee spermamerkers, twee menstruele secretiemerkers, twee vaginale
mucosamerkers, drie algemene mucosamerkers en twee huidmerkers. De analyse van vijftien
verschillende lichaamsvloeistof- en huidmonsters (acht personen elk) toonde aan dat de combinatie
van de merkers specifieke RNA-profielen opleverden voor elk van de onderzochte weefseltypes.
Hoewel er tussen de merkers die gebruikt werden voor de analyse verschillen in hoogte van de
pieken aanwezig in een electroferogram zichtbaar waren, bleek dit geen negatieve invloed te hebben
op de resultaten en de kwaliteit van de RNA-profilering. De gevoeligheid van de analysemethode
werd bepaald door middel van de analyse van een verdunningsreeks van verschillende hoeveelheden
bloed, speeksel en sperma. Waar voor DNA-profilering volledige profielen werden verkregen bij een
minimale hoeveelheid 0.1 µL van alle drie de lichaamsvloeistoffen, bleek voor volledige RNA-
profilering 0.05 µL afdoende. Naast de technische aspecten van de analysemethode, is ook
onderzocht of het mogelijk was om mRNA aan te tonen in (tot 28 jaar) oude objecten waarbij het
biologisch materiaal mogelijk is gedegradeerd. RNA-profielen konden succesvol gegenereerd worden
voor onder andere speeksel aanwezig op een zes jaar geleden gebruikte speen en een tien jaar oude
bemonstering met wangslijmvliescellen. Huid aanwezig op sieraden en muziekinstrumenten die tot
twaalf jaar lang waren opgeslagen, alsmede menstruele secretie op een 4 jaar oude matrasovertrek
konden ook worden geïdentificeerd. Ook is onderzocht of RNA geanalyseerd kon worden in
opgeslagen DNA-extracten. Hiertoe werden DNA-extracten van tien testzaken en 24 doorloopfracties
verzameld, allen van bekend biologische origine. Positieve profileringsresultaten werden verkregen
in slechts vijf monsters waaruit geconcludeerd kan worden dat met de huidige forensische DNAisolatiemethoden het aanwezige RNA degradeert en niet kan worden geanalyseerd. Van februari
2010 tot en met september 2013 is RNA-onderzoek toegepast in 57 verschillende criminele zaken
met 340 bemonsteringen.
Afgezien van de technische aspecten van de nieuwe mRNA-profileringstechniek, zijn de
profileringsstrategie en een goed onderbouwende wijze van de interpretatie van RNA-profielen
eveneens van wezenlijk belang. Hoofdstuk 2 behandelt de ontwikkeling van een stapsgewijze
strategie met als doel om het meest optimale RNA-profileringsresultaat te verkrijgen, vrij van elke
vorm van beïnvloeding, die toegepast kan worden op elke RT-PCR multiplex analysemethode. Deze
strategie omvat voornamelijk de herhaalde analyse van verschillende hoeveelheden cDNA. Voor de
beoordeling van de RNA-profielen zijn scoringsregels ontwikkeld gebaseerd op de x=n/2 regel (die
ook bij de analyse van low template DNA middels consensus profilering in het huidige forensische
onderzoek gebruikt wordt), voor elk weefseltype vertegenwoordigd in de multiplex. Na beoordeling
worden de profileringsresultaten samengevat weergegeven in een tabel, waarbij elk weefseltype
gescoord kan worden in één van zes ontwikkelde scoringscategorieën. Om deze procedure te
evalueren, zijn monsters van zeven testzaken onderzocht waarvoor RNA profilering interessant zou
zijn. Voor alle monsters werd de biologische origine bepaald door middel van zes conventioneel
presumptieve methoden en met de nieuw ontwikkelde RNA/DNA-profileringstechniek. Bij alle
onderzochte testzaken kwamen de resultaten van de presumptieve methoden overeen met de RNAprofileringsresultaten. Ook op DNA-niveau werden concordante resultaten verkregen. In vergelijking
met de presumptieve testresultaten bleek de RNA-profileringstechniek vooral informatief voor
monsters die vaginale mucosa, menstruele secretie of huidcellen bevatten: aangezien er voor deze
weefsels geen presumptieve tests op markt beschikbaar zijn, voegt RNA-profilering hier nieuwe
informatie toe. Aansluitend is overwogen op welke wijze de gecombineerde DNA- en RNAprofileringsresultaten gerapporteerd konden worden aan de rechterlijke macht of andere
aanvragers. Aan de hand van de resultaten van een van de testzaken, waarin geknipte vingernagels
met daarop vaginale mucosa bemonsterd en geanalyseerd waren, laten we zien welke
voorbeeldconclusies op grond van het DNA- en RNA-onderzoek gemaakt kunnen worden. Daarbij
hebben we ook afgeleid dat het formuleren en toetsen van hypotheses door zowel de officier van
justitie als de verdediging aangaande de biologische origine van de monsters nuttig kan zijn voor de
beoordeling van het bewijs in een zaak. Tevens zijn hierbij hypothesen op activiteitsniveau
beschouwd die zich richten op de mogelijke handeling of activiteit waarop een gevonden spoor op de
plaats delict terecht is gekomen. Het gebruik van een verbale schaal om de sterkte van het de
geformuleerde conclusies uit te drukken leek hierbij relevant.
Veel forensische sporen die zijn veiliggesteld op een plaats delict kunnen celmateriaal
bevatten van meer individuen. De analyse van het aanwezige DNA en RNA in deze sporen leidt in
deze gevallen vaak tot mengprofielen. In vergelijking met enkelvoudige profielen zijn mengprofielen
vaak lastiger te interpreteren tenzij verschillende donoren genetisch materiaal in een zeer
verschillende ratio hebben bijgedragen. Om een goede reconstructie te kunnen maken van de
omstandigheden die zich hebben afgespeeld tijdens een misdrijf, kan het informatief zijn om de
donoren van een gevonden spoor te kunnen associëren met een gevonden celtype. In hoofdstuk 3 is
onderzocht of deze associaties gemaakt konden worden door de piekhoogtes van DNA- en RNAprofielen van eenvoudige tweecomponentmengsels met elkaar te vergelijken. Hiertoe werden 34
twee-componenten mengsels geanalyseerd welke bestonden uit twee (van in totaal zes)
verschillende celtypes van verschillende donoren. Deze mengsels werden bereid in drie verschillende
ratio’s (1:1, 1:5 en 5:1) aan de hand van DNA-mengverhoudingen en onderworpen aan DNA- en RNAprofilering. De RNA-profilering werd uitgevoerd voor 14 van de merkers beschreven in hoofdstuk 1
en de DNA-profilering door middel van de NGM kit. Van alle 34 mengsels werden de theoretische
ratio’s vergeleken met de experimentele ratio’s, berekend uit de corresponderende piekhoogte van
de DNA- en RNA-profielen. Bij deze vergelijking werden afwijkende ratio’s waargenomen. Voor
sommige mengsels die bestonden uit sperma met bloed, speeksel met bloed en speeksel met sperma
bleken de ratio’s tussen de DNA- en RNA-piekhoogtes te corresponderen met de theoretische ratio’s.
Van het merendeel van de overige mengsels kwam de hoofdcomponent in het DNA-profiel niet
overeen met de hogere pieken in het bijbehorende RNA-profiel. Er kunnen meer factoren zijn die een
bijdrage hebben kunnen leveren aan deze afwijkende resultaten. Daarom zijn vervolgens de invloed
van verschillende donoren, replicatie en afbraak op de mengselratio’s onderzocht in negen
onderzoeksets bestaande uit mengsels van speeksel met bloed. Na analyse van zowel de set met
verschillende donoren alsmede een viervoudige replicatie-analyse werden grote verschillen
gevonden met betrekking tot piekhoogtes en experimenteel bevonden mengselratio’s. Dit betekent
dat deze variabelen een uiteindelijk resultaat sterk kunnen beïnvloeden. Een specifieke reden voor
het ontstaan van deze grote verschillen zijn niet gevonden. Om het effect van afbraak op zowel DNA
als RNA op de mengselratio’s te onderzoeken zijn de mengsels onderworpen aan verschillende
temperaturen, hoge vochtigheid en UV-licht. Uit de resultaten van de DNA-profilering en de
bijbehorende celtypebepaling, konden we afleiden dat elke degradatie-inducerende methode de
associatie van donor en celtype op een andere en specifieke manier beïnvloedde. We eindigen het
hoofdstuk met het ontmoedigen van het gebruik van piekhoogtes in DNA- en RNA-profielen om
donor en celtype met elkaar te associëren. Een uitzondering kan echter gemaakt worden voor een
mengsel dat sekse-specifieke celtypen en twee donoren van een verschillend geslacht bevat.
Net als de resultaten van DNA-profilering, moeten ook de resultaten van RNA-profilering in
context van een zaak beschouwd worden en kan in de rechtszaal de criminalistieke waarde van het
RNA-onderzoek aan de orde komen. Naast celmateriaal dat tijdens een misdaad op een object kan
worden achtergelaten, kan hierop reeds celmateriaal aanwezig zijn dat is achtergelaten op enig
ander moment door individuen die niets met de zaak van doen hebben, wat de interpretatie van de
resultaten van een onderzoek kan bemoeilijken. In hoofdstuk 4 hebben we door middel van DNA- en
RNA-analyses onderzocht hoeveel en welk type celmateriaal kan voorkomen op publieke objecten
waarvan verondersteld kan worden dat deze vaak en door veel verschillende personen zijn
aangeraakt. Deze analyses zijn uitgevoerd op 60 bemonsteringen welke bestonden uit zes
onafhankelijke monsters voor tien verschillende objecten. De monsters werden verzameld door
middel van DNA-vrije tape. Voor de RNA-analyses is de multiplex analysemethode zoals beschreven
in hoofdstuk 1 gebruikt, aangevuld met een gevoelige nieuwe huidmerker. Voor 54 van de 60
bemonsteringen, kon met een zeer gevoelige kwantificeringsmethode die tot 0,5 picogram humaan
DNA per microliter kan meten, een meetbare hoeveelheid DNA gedetecteerd worden. Uit NGM-DNAprofilering bleek dat het bemonsterde celmateriaal van het merendeel van de objecten van minimaal
twee donoren afkomstig was. Het merendeel van deze DNA-profielen bevatte allelen met
piekhoogtes onder de stochastische grenswaarde. Verder bleken de monsters waar meer dan twee
donoren een bijdrage aan hadden geleverd een hogere DNA-opbrengst te hebben dan de monsters
waarbij het celmateriaal van één enkele donor afkomstig was. RNA-celtyperingsresultaten
(geanalyseerd in viervoud volgens de in hoofdstuk 2 beschreven analysemethode) werden verkregen
voor bijna alle monsters. In deze monsters werden huidcellen in 93% van de gevallen waargenomen.
Naast huidcellen werd een tweede celtype (vaginale mucosa óf speeksel) gevonden in 13% van de
monsters. Signalen voor bloed, menstruele secretie en sperma werden in deze monsters niet
gedetecteerd. Onderzoek naar de relatie tussen het waargenomen celtype en de DNA-opbrengst
toonde aan dat de monsters die speeksel of vaginale mucosa bevatten de hoogste DNA-opbrengst
leverden. Hoge DNA-opbrengsten werden echter ook gedetecteerd bij de monsters die alleen maar
huidcellen bevatten. Sommige objecten, zoals (papier)geld, lijken stelselmatig meer DNA dan andere
publieke objecten te bevatten.
De sporen die gevonden worden op een plaats delict kunnen naast lichaamsvloeistoffen en
huid ook orgaanmateriaal bevatten, wat met name aangetroffen kan worden bij gewelddadige
misdrijven. In hoofdstuk 5 onderzochten we of de toepassing van de DNA/RNA co-extractie en
multiplex analyse, zoals beschreven in hoofdstuk 1 voor lichaamsvloeistoffen, ook toegepast kon
worden op orgaanweefsels. Voor de identificatie van hersen-, long-, lever-, spier-, hart- en
nierweefsel en van huid werden, middels de BIOGPS expressie database, 41 potentiële mRNAmerkers geselecteerd. De geschiktheid van deze merkers voor orgaantypering werd bepaald door
middel van vijf selectieronden waarin een grote set aan testsamples werd geanalyseerd. Deze set
bestond uit 36 uitgesneden autopsiemonsters, 49 bevroren weefselsecties en commercieel
verkrijgbaar RNA afkomstig van 20 humane organen. Na selectie bleken uiteindelijk 14 merkers
weefselspecifiek voor de geselecteerde organen en werden deze samen met referentiemerkers
samengevoegd tot een 17-plex analysemethode geschikt voor eindpunt RT-PCR detectie. Additionele
weefselanalyses met de 17-plex toonde aan dat de aanwezige merkers specifiek waren voor het
juiste orgaanweefsel en gevoelig genoeg om picogram-hoeveelheden orgaanweefsel te kunnen
detecteren. Bovendien bleek het mogelijk om aanwezig weefsel van bemonsteringen van een blinde
studie (20 zuivere en gemixte orgaanweefsels verkregen door autopsie) en van een mes na een
geïmiteerde steek in de buikregio, succesvol te kunnen analyseren. Ook uit afgebroken
autopsieweefsel (geconcludeerd op basis van DNA-profileringsdata) werden volledige RNA-profielen
verkregen, wat inhoudt dat de multiplex ook gebruikt worden voor gedegradeerde bemonsteringen.
De resultaten die verkregen worden uit de RNA-orgaantypering kunnen, net als de analysemethode
voor lichaamsvloeistoffen en huid, ook geïnterpreteerd worden met behulp van de methode
beschreven in hoofdstuk 2. Van november 2012 tot september 2013 is deze multiplex
analysemethode gebruikt in 15 zaken (33 samples).
In dit proefschrift is een nieuwe betrouwbare methode gepresenteerd om de biologische
oorsprong van forensische sporen te onderzoeken en te rapporteren. Deze studie biedt een
gedetailleerd inzicht in de belangrijkste technische aspecten van deze methode en laat zien dat RNAprofilering geschikt is voor deze doelstelling.