de samenvatting

Evolution of Races within Fusarium oxysporum f.sp. Lycopersici
B.V. Chellappan
University of Amsterdam
Evolution of races within Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici
Biju Vadakkemukadiyil Chellappan
Samenvatting
Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici (Fol), een asexuele bodemschimmel, is de
veroorzaker van de Fusarium verwelkingsziekte van tomaat. Het pathogeen dringt de
plant via de wortels binnen en koloniseert vervolgens het xyleem. Drie fysiologisch
rassen van Fol worden onderscheiden op basis van het vermogen om cultivars van tomaat
met verschillende, monogene resistenties te infecteren. Resistentie (R) genen van tomaat
die zorg dragen voor ras-specifieke resistentie tegen Fol staan bekend als Immuniteit (I)
genen. Tot nu toe zijn er in wilde tomaat drie I genen geïdentificeerd, namelijk I (of I-1),
I-2 en I-3, en ingekruist in cultivars. Deze genen verschaffen resistentie tegen Fol isolaten
die de avirulentie (AVR) genen bevatten die met deze drie I genen corresponderen, te
weten AVR1, AVR2 en AVR3, respectievelijk. AVR1 is aanwezig in alle ras 1 isolaten,
maar afwezig in ras 2 en ras 3. De afwezigheid van AVR1 maakt het mogelijk dat ras 2 en
3 isolaten cultivars van tomaat infecteren die het I gen bevatten. AVR2 is aanwezig in alle
isolaten, zij het dat isolaten die I-2 planten kunnen infecteren (ras 3 isolaten) een
puntmutatie bevatten in AVR2 die een aminozuur verandering in het eiwit tot gevolg
heeft. Tot nu toe zijn er drie AVR2 allelen beschreven en wel met de volgende aminozuur
veranderingen; V41>M, R45>H en R46>P. Al deze drie veranderingen leiden tot het
verlies van de avirulentie functie van Avr2 (het product gecodeerd door AVR2), terwijl de
virulentie functie in takt blijft. Twee AVR3 allelen zijn er beschreven, één coderend voor
een eiwit met een glutaminezuur (E) residu op aminozuur positie 165 en één met een
lysine (K) op deze positie (E165<>K165). Beide eiwitten fungeren als avirulentie factor,
maar verschillen in de mate waarin zij bijdragen aan virulentie.
Behalve als avirulentie factor, fungeert Avr1 (het product van AVR1) ook als
suppressor van de I-2/Avr2 en I-3/Avr3 gemedieerde immuniteit. Het resistentieonderdrukkende vermogen van Avr1 maakt het mogelijk dat ras 1 isolaten cultivars van
tomaat die I-2 en I-3 bevatten, kunnen infecteren zonder deletie van of mutatie in de
avirulentie genen (Avr2 en Avr3) die corresponderen met deze resistentie genen. In
Hoofdstuk 2 wordt getoond dat niet alle ras 1 isolaten cultivars van tomaat met I-2 en I-3
kunnen infecteren ook al beschikken ze over een functioneel AVR1 gen. De
waargenomen verschillen in de resistentie-onderdrukkende aktiviteit kunnen niet
verklaard worden door één of meer mutaties in de Avr1 coderende sequentie of
flankerende gebieden, die wel de suppresserende aktiviteit zouden aantasten maar niet de
Avr1 avirulentie functie. Op basis van de resultaten uit deze studie wordt een model
voorgesteld voor de suppressie van de I-2/Avr2 en I-3/Avr3 gemedieerde resistentie door
Avr1.
In verschillende studies is gesuggereerd dat deletie van AVR1 uit ras 1
geresulteerd heeft in het ontstaan van ras 2 (avirulentie genotype: –, AVR2, AVR3), en dat
een puntmutatie in AVR2 van ras 2 vervolgens geleid heeft tot het ontstaan van ras 3 (–,
avr2, AVR3). Echter, het moleculaire mechanisme dat ten grondslag ligt aan het verlies
van AVR1 is nooit beschreven. In Hoofdstuk 3 wordt dit mechanisme onderzocht. Hiertoe
is de basenvolgorde bepaald van een AVR1 bevattend fragment van ongeveer 100 kb van
het genoom van een ras 1 isolaat en is de verkregen sequentie vergeleken met die van het
referentie genoom van een ras 2 isolaat waarin AVR1 niet aanwezig is. Het 100 kb
fragment bleek met een sequentie identiteit van meer dan 99,9% overeen te komen met
een deel van het referentie genoom, met uitzondering van een 31 kb gebied uit het
genoom van ras 1 dat niet terug gevonden werd in het referentie genoom. Verdere
analyses suggereerden dat ras 2 geëvolueerd is vanuit ras 1 door de deletie van dat AVR1
bevattend 31 kb fragment, hoogstwaarschijnlijk als gevolg van homologe recombinatie
tussen twee Helitron transposons. Een wereldwijde collectie van Fol isolaten is
vervolgens onderworpen aan een PCR analyse van het AVR1 locus met inbegrip van de
twee flankerende Helitrons. De verkregen resultaten toonden aan dat ras 2 geëvolueerd is
vanuit ras 1 door de deletie van óf een 31 kb óf een 102 kb AVR1 bevattend genoom
fragment als gevolg van homologe recombinatie tussen twee Helitrons die deze
fragmenten flankeren. Dit suggereert dat gebaseerd op de deletie gebeurtenis die
aanleiding geeft tot verlies van AVR1, Fol isolaten onderverdeeld kunnen worden in twee
afzonderlijke evolutionaire lijnen. Het geeft ook aan dat Helitron transposons een
belangrijke rol vervulden in de evolutie van rassen binnen Fol.
Helitrons vormen een nieuw type DNA transposon die gevonden zijn, en nog
steeds worden, in vele eukaryoten. Zij verschillen van andere transposons in de
structurele karakteristieken van hun uiteinden, het vermogen om DNA fragmenten op te
pikken en hun rolling-circle wijze van repliceren. In schimmels zijn de structurele
karakteristieken van Helitrons nog maar weinig bestudeerd. In Hoofdstuk 4 worden de
kenmerken van Helitron
uiteinden in Fusarium oxysporum (Fo) geïdentificeerd en
beschreven. Zes Helitron groepen worden onderscheiden in Fo, aangeduid met FoHeli1
tot FoHeli6. Hun terminale karakteristieken suggereren dat FoHeli’s een nieuwe groep
vormen binnen de Helitron familie. Voorts is er evidentie verkregen voor het bestaan van
een circulaire vorm van Helitrons. Op basis van alle verkregen data wordt er een
transpositie model voor Helitrons voorgesteld.
In Hoofdstuk 5 wordt de evolutie van rassen verder onderzocht via een uitbreiding
van het aantal isolaten betrokken bij de studie. Analyse van het AVR1 locus met inbegrip
van de flankerende Helitrons in de nieuwe isolaten bevestigt het idee dat in de meeste
gevallen ras 2 geëvolueerd is vanuit ras 1 via een homologe recombinatie gebeurtenis
tussen twee Helitrons. Daarnaast is er één ras 2 isolaat geïdentificeerd dat AVR1 kwijt
geraakt is waarschijnlijk als gevolg van een homologe recombinatie gebeurtenis tussen
twee NHT2-achtige retro-transposons met als resultaat een deletie van ongeveer 457 kb.
In twee andere ras 2 isolaten zijn geen duidelijke aanwijzingen gevonden ten aanzien van
de wijze waarop het AVR1 locus verloren is gegaan. In AVR2 zijn vier puntmutaties
gevonden die aanleiding geven tot het ontstaan van ras 3 vanuit ras 2. Eén van deze vier
betreft een nieuwe mutatie. Alle vier mutaties zorgen ervoor dat de I-2 gemedieerde
resistentie omzeild wordt in ras 3 isolaten. Op basis van fylogenetische analyses waarbij
gebruik gemaakt is van de sequentie van het EF-1 alpha gen, kunnen Fol isolaten
gegroepeerd worden in vijf evolutionaire lijnen. Vier van die lijnen correleren zeer goed
met bekende VCGs van Fol, terwijl er één geassocieerd kan worden met een onbekende
VCG van Fol. Alle verkregen resultaten in deze studie zijn gebruikt om een model voor
te stellen om de evolutie van rassen binnen Fol te verklaren.
In Hoofdstuk 6 wordt bediscussieerd hoe de nieuw verkregen kennis beschreven
in dit proefschrift bijdraagt aan een beter begrip van de co-evolutionaire wapenwedloop
tussen een pathogeen en zijn gastheer, met name onder agriculturele omstandigheden. Er
wordt benadrukt dat het inkruisen in gewas cultivars van een monogene resistentie tegen
een gegeven pathogeen én het wijdverbreide gebruik van deze cultivars, het pathogeen
selectief kunnen forceren tot een snelle evolutionaire ontwikkeling van de omzeiling van
die specifieke gastheer resistentie. Een model voor het ontstaan van formae speciales van
Fusarium oxysporum als ook de polyfyletisch aard van een forma specialis wordt
gepresenteerd. Nieuwe onderzoeksvragen worden geponeerd en richtingen voor verder
onderzoek worden voorgesteld, bedoeld om een beter begrip te krijgen van de evolutie
van gastheer-pathogeen relaties.