Practicum: vrijdag 23 april

Practicum: vrijdag 23 april
De dierenarts heeft
vaak hematologisch
bloedonderzoek
nodig om tot een
diagnose te komen.
Hierbij kan o.a.
gekeken
worden
naar de aanwezigheid van een ontsteking en/of bloedarmoede en mogelijke oorzaken
hiervan. Elk laboratorium dat in huisdieren gespecialiseerd is biedt uitgebreide mogelijkheden om onderzoek te doen aan bloedcellen, een deel hiervan kan al in
de praktijk plaatsvinden. Of het nu gaat om rode en
witte bloedcellen of om bloedplaatjes, het is belangrijk
dat er voldoende zijn en dat ze goed functioneren. Het
bepalen van een hematocriet en het handmatig tellen
van reticulocyten geeft veel informatie over het rode
bloedbeeld. Er zijn verschillende hematologie analyzers op de markt, die het automatisch tellen van cellen
mogelijk maken. Echter, het is vaak noodzakelijk om
daarnaast microscopisch onderzoek van een bloeduitstrijkje uit te voeren. Tijdens de workshop krijgt u uitleg
over het gebruik van een microscoop, maakt u kennis
met het beoordelen van een bloeduitstrijkje, waarbij u
let op alle cellijnen. Aan de hand van enkele praktijkgevallen voert u verschillende handelingen zelfstandig
uit.
Het belang van een bloeduitstrijkje
Wanneer de dierenarts hematologisch onderzoek van
een patiënt aanvraagt, is het belangrijk dat het laboratorium naast EDTA-bloed over een goed bloeduitstrijkje beschikt (Fig 1). Voor goed microscopisch onderzoek is een bloeduitstrijkje nodig, waarbij het bloed zo
is uitgestreken dat alle cellijnen individueel te
beoordelen zijn. In het laboratorium wordt weliswaar
van het opgestuurde bloed uitstrijkjes gemaakt, maar
dit bloed is al enige tijd onderweg, waardoor de
kwaliteit van de bloedcellen in min of (meestal) meerdere mate achteruit is gegaan. Dit bemoeilijkt de
beoordeling van de cellen sterk en u zult begrijpen dat
dit de betrouwbaarheid van de uitslag niet ten goede
Abstracts European Veterinary Conference Voorjaarsdagen 2010
komt. In de workshop leert u waar u op moet letten
tijdens het uitvoeren van een bloeduitstrijkje, ervaart u
wat mis kan gaan en leert u zelf beoordelen of de
kwaliteit goed is. Het is dan ook in ieders belang dat er
al in de praktijk van uw dierenarts een uitstrijkje
gemaakt wordt van vers afgenomen bloed. De kwaliteit
van het bloeduitstrijkje bepaalt de kwaliteit van de
uitslag.
Fig.1: Het uitvoeren van een bloeduitstrijkje.
De kleuring van het bloeduitstrijkje
Na het drogen wordt een bloeduitstrijkje gekleurd om
alle cellijnen zichtbaar te maken voor microscopisch
onderzoek. Hiervoor zijn verschillende kleuringen beschikbaar. De klassieke hematologische kleuringen voor
bloeduitstrijkjes zijn Romanowsky kleuringen, zoals
Wright’s en Giemsa. Deze kleuringen bestaan uit
eosinofiele en basofiele kleurstoffen opgelost in
alcohol. Een nadeel van deze kleuring is de tijdsduur
van kleuren (ongeveer 30 minuten). Snelkleuringen
zijn gemodificeerde Romanowsky kleuringen zoals
Diff-Quik® en Haemacolor®, die uit wateroplosbare
kleurstoffen bestaan. Met een snelkleuring kan een
droog (!) bloeduitstrijkje binnen een minuut gekleurd
worden. Daarom worden deze kleuringen in veel praktijken toegepast. Een nadeel is dat structuren in het
cytoplasma en de kernstructuur minder duidelijk
aankleuren dan met Romanowsky kleuringen. Voor de
beoordeling van een bloeduitstrijkje is deze kleuring
toereikend.
Het bekijken van het gekleurde bloeduitstrijkje
Tijdens de workshop bekijkt u verschillende gekleurde
uitstrijkjes van praktijkgevallen onder de microscoop
(Fig.2) en leert u hierbij de microscoop te gebruiken.
Algemeen geldt voor de instelling van de microscoop
bij hematologisch onderzoek dat de condensor helemaal omhoog wordt gedraaid, het diafragma helemaal
wordt opengezet en dat er geen blauwfilter wordt
gebruikt. U kijkt eerst met het 10x objectief globaal
naar het hele preparaat. Met de macroschroef probeert
u eerst beeld te krijgen om vervolgens met de microschroef scherp te stellen. Vervolgens wordt met het
1
CHAPTER 4
D A N S w o r k s h o p h e m ato lo g i e
Drs Marrit Prins
Veterinair Klinisch Patholoog i.o.
Universitair Veterinair Diagnostisch Laboratorium,
Universiteit Utrecht
Dr Christine J. Piek, specialist interne geneeskunde
gezelschapsdieren, ECVIM-CA
Departement Geneeskunde van Gezelschapsdieren,
Faculteit Diergeneeskunde, Universiteit Utrecht
40x objectief een gebied gezocht waar de rode bloedcellen zoveel mogelijk dicht naast elkaar, maar niet
óver elkaar heen liggen. In dit gebied zijn de cellen niet
vervormd en dus het beste te beoordelen. Met een
druppeltje immersieolie op het glaasje onder het
100x/olie objectief kan naar meer celdetail gekeken
worden.
Fig.4: Met een 10x objectief is een hartworm larve al duidelijk te zien.
Fig.2: Microscopisch onderzoek van een bloeduitstrijkje uitgevoerd
door een analist in het Universitair Veterinair Diagnostisch Laboratorium (UVDL).
Rode bloedcellen (erytrocyten)
Rode bloedcellen worden gemaakt in het beenmerg
en transporteren zuurstof door het lichaam door middel van hemoglobine. Het is belangrijk dat hiervan voldoende aanwezig is en dat er voldoende aantal normaal functionerende rode bloedcellen zijn. Rode
bloedcellen worden daarom beoordeeld op zowel hun
aantal als hun grootte, vorm en kleur, wat bepaald
wordt door de hoeveelheid hemoglobine. Bij een
gezond dier zullen de rode bloedcellen allemaal
ongeveer even groot zijn, hebben allemaal dezelfde
rood/roze kleur met slechts een kleine witte vlek in het
midden. Deze witte vlek wordt veroorzaakt door de
vorm van de cel: een platte schijf met een ingedrukt
centrum (Fig.5).
Rode bloedcellen
Tijdens het microscopisch onderzoek van een bloeduitstrijkje wordt gekeken naar alle cellijnen. De rode
bloedcellen, witte bloedcellen en bloedplaatjes
worden beoordeeld. Tevens wordt er in en tussen de
cellen gekeken naar afwijkende insluitsels en parasieten. Een voorbeeld van parasieten die u in een bloeduitstrijkje van de hond kan tegen komen is de Babesia
canis in de rode bloedcel (Fig.3), of een larve van hartworm tussen de cellen (Fig.4).
Het voorkomen van kleurstofneerslag, kapotte cellen
en andere artefacten kan het microscopisch onderzoek
bemoeilijken.
Fig.3: Babesia canis
2
Fig.5: Rode bloedcel
Tijdens de hematologie workshop van de DANS leert u
een aantal praktische handelingen: het bepalen van
een hematocriet, het uitvoeren van een reticulocyten
telling en het uitvoeren van microscopisch onderzoek
van het rode bloedbeeld in een aantal bloeduit­strijkjes.
Bloedarmoede (anemie)
Er is sprake van bloedarmoede, wanneer er te weinig
rode bloedcellen óf te weinig hemoglobine (Hb) in de
bloedcirculatie aanwezig is. Als gevolg hiervan is de
zuurstofopnamecapaciteit van de rode bloedcellen
verminderd. Een anemie kan het gevolg zijn van een
verstoring van de bloedaanmaak, versnelde afbraak
van de erytrocyten, bloedverlies of door een combinatie van deze oorzaken.
In geval van bloedarmoede kunnen we in het bloeduitstrijkje verschillende afwijkingen van de rode bloedcellen herkennen.
Abstracts European Veterinary Conference Voorjaarsdagen 2010
Practicum: vrijdag 23 april
Jonge rode bloedcellen (reticulocyten)
Reticulocyten zijn jonge rode bloedcellen die nog
kernmateriaal (RNA) bevatten. Wanneer een patiënt
bloedarmoede heeft is het om een beenmergprobleem als oorzaak uit te sluiten nodig om te weten of er
nog wel nieuwe rode bloedcellen gemaakt worden.
Het aantal reticulocyten in het bloed is dan een indicatie voor de activiteit van het beenmerg dat voor
nieuwe rode bloedcellen zorgt. Bij een versnelde aanmaak zullen er meer jonge ery’s in het bloed te vinden
zijn als normaal. In Romanowsky of gemodificeerde
Romanowsky kleuringen vallen reticulocyten op doordat ze wat blauwer (polychromasie) en groter (macrocyten) zijn door de aanwezigheid van RNA (Fig.6). Om
een reticulocytentelling uit te voeren dient een preparaat gemaakt te worden met Brillant Cresyl Blauw
kleuring (BCB) (Fig 7). Tijdens de workshop ziet u dat
hierbij het netwerk van RNA duidelijk zichtbaar
gemaakt wordt.
Abstracts European Veterinary Conference Voorjaarsdagen 2010
Fig.6: Reticulocyten van een hond zijn met een May-GrünwaldGiemsa kleuring zichtbaar als polychrome macrocyten.
Fig.7: Met een BCB kleuring zijn
reticulocyten van de hond van
Fig.6 duidelijk herkenbaar door
blauwe stippeling.
Witte bloedcellen (leukocyten).
Witte bloedcellen worden net als rode bloedcellen
gemaakt in het beenmerg. De meest voorkomende
leukocyt is de segmentkernige neutrofiele granulocyt
(Fig.8).
Fig.8: Een segmentkernige neutrofiele granulocyt bij een kat.
Daarnaast vinden we in volgorde van voorkomen (bij
hond en kat) de lymfocyt (Fig.9), de monocyt (Fig.!0),
de eosinofiele (Fig.11 en 12) en basofiele granulocyt.
Fig.9: Rechts een lymfocyt en
links een neutrofiele granulocyt.
3
CHAPTER 4
• Anisocytose betekent dat de erys verschillend van
grootte zijn, er zijn zowel kleine als grote erytrocyten
aanwezig. Deze worden respectievelijk microcyten
(micros = klein) en macrocyten (macros = groot)
genoemd. De macrocyten zijn meestal ook blauwer
(polychromasie) van kleur dan de rest van de rode
cellen.
• Polychromasie betekent dat deze rode bloedcellen
wat blauwer van kleur zijn als gebruikelijk. Deze
blauwe ery’s zijn jonge onrijpe cellen die nog kernmateriaal (R.N.A.) bevatten wat de blauwe kleur
veroorzaakt. Deze jonge rode bloedcellen zijn ook
met behulp van de Briljant Cresyl Blauw kleuring te
herkennen als z.g. “reticulocyten”. Het RNA zien we
in deze kleuring als blauwe stippeltjes in de rode
bloedcel.
Wanneer het aantal jonge rode bloedcellen in de
bloedbaan duidelijk is toegenomen, spreken we van
een “regeneratief rood bloedbeeld”.
• Hypochromasie betekent dat het randje hemoglobine dat zichtbaar is in de cel smaller is dan normaal.
• Normoblasten zijn kernhoudende rode bloedcellen
en komen normaal niet in de bloedbaan voor. Alleen
bij een sterk versnelde aanmaak van rode cellen, zullen wij normoblasten in het uitstrijkje tegenkomen.
• Sferocyten zijn kleine kogelronde geheel gevulde
rode bloedcellen. De witte vlek die is niet meer zichtbaar in de ery. Deze ery komt voor bij immuungemedieerde bloedafbraak.
Fig.10: Een monocyt bij de kat.
Fig.11: Rechtsboven een eosinofiele granulocyt en links een neutrofiele granulocyt van een kat.
Fig.13: Aantallen witte bloedcellen, rode bloedcellen en bloedplaatjes worden nauwkeurig
gemeten op het UVDL met de
Advia 120, een hematologie
analyzer.
Fig.14: “Scannen” van een bloeduitstrijkje volgens de kanteel
methode voor de leukocytendifferentiatie.
Fig.12: Eosinofiele granulocyt bij
de hond.
Het totaal aantal witte bloedcellen wordt geteld met
een hematologie analyzer (Fig.13). Daarbij vaak ook
een leukocytendifferentiatie uitgevoerd. Echter een
instrument kan niet zoals het menselijk oog alle cellen
onderscheiden. Daarom is het van belang ook een
handmatige leukocytendifferentiatie uit te voeren
(Fig.2). Hierbij wordt onder de microscoop bepaald
hoeveel procent van elk celtype aanwezig is én of er
afwijkende cellen voorkomen. Bij ontstekingen kunnen deze cellen sterk in aantal toenemen en zijn ook
jongere neutrofielen met een staafvormige kern in het
bloed te zien. Dit wordt een linksverschuiving
genoemd. Geen enkel type hematologie analyzer kan
de staafkernige neutrofielen granulocyten herkennen.
Het vaststellen van linksverschuiving moet altijd door
microscopisch onderzoek gebeuren.
Tijdens de workshop maakt u kennis met alle witte
bloedcellen en voert u zelf een leukocytendifferentiatie uit waarbij u 100 cellen classificeert terwijl u met
de kanteelmethode door het uitstrijkje beweegt
(Fig.14). Samen met de telling van het totaal aantal
witte bloedcellen kunnen we dan berekenen wat de
absolute waarde is van de verschillende witte
bloedcellen.
4
Bloedplaatjes (trombocyten)
Bloedplaatjes zijn kleine afgesnoerde celdelen afkomstig van de megakaryocyten in het beenmerg. Zij
spelen een belangrijke rol bij de bloedstolling en zijn
o.a. betrokken bij de eerste wond afdichting na een
beschadiging. Een tekort aan bloedplaatjes zal dan
ook leiden tot kleine bloedinkjes.
Bloedplaatjes (Fig.15) zijn, in een uitstrijkje dat gekleurd
is volgens de May-Grünwald Giemsa methode, te
herkennen als kleine blauw grijs gekleurde celfragmenten met rood violet gekleurde korrels. Normaal
gesproken zijn ze kleiner dan de rode bloedcellen. Bij
sommige ziekte beelden komen grotere bloedplaatjes
voor, we spreken dan van reuzenthrombo’s.
Soms worden lage bloedplaatjes gemeten omdat in
het bloedmonster kleine klontjes van bloedplaatjes in
het monster aanwezig zijn. Deze zogenaamde trombocytenaggregaten worden door het telapparaat niet
meegeteld. Als trombocytenaggregaten de oorzaak
zijn van een te laag aantal trombocyten kunnen ze in
het bloeduitstrijkje gezien worden. Daarom moet altijd
het gehele bloeduitstrijkje bekeken worden op de aanwezigheid van trombocytenaggregaten.
Fig.15: Meerdere bloedplaatjes
(trombocyten) zijn zichtbaar als
kleine roze/paarse fragmentjes
tussen de erytrocyten.
Abstracts European Veterinary Conference Voorjaarsdagen 2010