BONTE RIJ

Nummer
PRB43
BONTE RIJ
Datum
21-7-17
Versie
001
Opsteller
Kun
Bladzijde
1/7
ONDERWERP
Determineren van gram negatieve staven.
TOEPASSINGSGEBIED
Het voorschrift is van toepassing bij het practicum behorende bij blokboek 4 van de
laboratoriumopleiding.
INLEIDING
In de darmen van mens en dier komen grote aantallen bacteriën voor. Deze zijn
onder normale omstandigheden, in de darm, niet ziekteverwekkend en worden
daarom commensalen genoemd. Veel van deze darmbacteriën behoren tot de familie
van de Enterobacteriaceae, het zijn gram negatieve staven (gr-st)
Voor het determineren van deze Enterobacteriaceae worden een aantal
biochemische testen uitgevoerd, die samen de zgn. BONTE RIJ vormen. De
resultaten worden met een tabel vergeleken.
Het principe van deze techniek is gebaseerd op de aanwezigheid van verschillende
enzymen binnen diverse families van gram negatieve staven. Door de aanwezigheid
of afwezigheid van een enzym zal een bepaalde biochemische reactie al dan niet
verlopen.
De bonte rij bestaat uit de volgende buizen:
Fysiologisch zout: voor het maken van de bacteriesuspensie, om er andere
(vloeibare) buizen mee te beënten.
Ureum
Deze buis is bedoeld voor het onderzoek op de aan of afwezigheid van het enzym
urease.
Urease is het enzym dat ureum splits in ammoniak waarbij een alkalisch milieu
ontstaat. Hierdoor slaat de indicator fenolrood om van geel naar lila/rood
De optimale pH voor de urease-activiteit is 7,0.
NH2
C=O + 2 H2O
CO2 + H2O + 2 NH3
NH2
Beoordeling:
Roodpaarse kleur
Kleur onveranderd geel
Positief
negatief
(NH4)2CO3
Nummer
PRB43
Versie
001
BONTE RIJ
Datum
21-7-17
Opsteller
Kun
Bladzijde
2/7
Kligler-iron-agar
In deze buis kunnen drie reacties aangetoond worden. De omzetting van glucose en
de omzetting van lactose. De omzetting/reductie van zwavelhoudende moleculen
(eiwit , thiosulfaat) onder vorming van sulfide. Bij aanwezigheid van Fe 2+ ionen wordt
FeS gevormd, te zien als een zwarte neerslag in de buis.
De buis bevat de koolhydraten lactose en glucose in een verhouding van 10:1, zeer
veel pepton (eiwit) en andere nutriënten, zodat de meeste aërobe micro-organismen
er goed op kunnen groeien. Het medium bevat geen remmende stoffen. Voor het
ontdekken van H2S zijn ijzersulfaat en natriumthiosulfaat toegevoegd. Fenolrood
dient als indicator. Deze slaat om bij pH 6,8. Het geheel is gebufferd bij pH 7,4.
De voedingsbodem wordt in de buis gegoten en schuin gestold. Hierdoor ontstaan
als het ware twee afdelingen: de eerste is de schuine bovenzijde, die wordt
blootgesteld aan zuurstof uit de lucht en is aëroob; de tweede afdeling bestaat uit het
diep onderliggende gedeelte en is min of meer afgesloten van de lucht en dus
betrekkelijk anaëroob.
Bij het beoordelen van de buis kunnen de volgende mogelijkheden zich voordoen:
Gehele medium is rood
Diepe deel is geel, het
schuine deel is rood
Gehele medium is geel
Er zitten gasbelletjes of
scheurtjes in het medium
Er is zwarte neerslag
aanwezig
De suikers werden niet of zwak gefermenteerd, er werd
een onvoldoende hoeveelheid zuur gevormd. Door de
vorming van aminen op het schuine deel en de
alkalische buffers ontstaat in het medium een rode
kleur.
Dit betekend dat een micro-organisme alleen glucose
omzet en geen lactose, hierdoor ontstaat in het medium
slechts een kleine hoeveelheid zuur. Door de groei van
bacteriën op het schuin stuk en de aanwezigheid van
zuurstof komen op het schuine deel aminen vrij die de
pH doen stijgen, waardoor het schuine stuk rood wordt,
onderin de buis is de afbraak van eiwitten onvoldoende
om het zuur te neutraliseren en blijft het medium geel
De micro-organismen zetten lactose om. De hoge
concentratie aan lactose zorgt voor vrij veel zuur. De
hoeveelheid zuur is voldoende om de basische reactie
van het schuine deel te neutraliseren, zodat het medium
de hele buis geel kleurt.
Dit duidt op de vorming van gas bij de afbraak van de
koolhydraten in het medium
In de buis bevindt zich natriumthiosulfaat en ijzersulfaat.
Natriumthiosulfaat levert zwavel en ijzersulfaat levert
ijzer, dat met H2S reageert en het onoplosbare zware
neerslag, ijzersulfide vormt.
Nummer
PRB43
Versie
001
BONTE RIJ
Datum
21-7-17
Opsteller
Kun
Bladzijde
3/7
MI (motility/indol)
In deze buis wordt gecontroleerd of een micro-organisme tryptofanase heeft. Dit is
een enzym wat het aminozuur tryptofaan splitst waarbij indol ontstaat.
De voedingsbodem bevat tryptofaan of pepton. De volgende reactie vindt plaats:
L.tryptofaan
indol + pyruvaat + ammoniak.
De afbraak van pyruvaat levert de benodigde energie op voor de groeiende bacterie
via de citroenzuuryclus. Uit de vrijgekomen ammoniak kan de bacterie,
gebruikmakend van de vrijgekomen energie, nieuwe aminozuren opbouwen. Het
gevormde indol kan worden aangetoond met Kovac’s reagens dat met indol een rood
gekleurde verbinding vormt.
Beoordeling:
Na toevoegen Kovacs reagens een
rode ring
Na toevoegen Kovacs reagens geen
rode ring, medium neemt de gele
kleur van het reagens aan
Soms ontstaat een oranje kleur
Positief
Negatief
skatol aanwezig, voorloper van indol
Tevens wordt gekeken naar de motility (beweeglijkheid) van de bacterie.
Beoordeling:
Alleen entstreep zichtbaar
Bacterie bevindt rondom de
entstreep.
Bacterie bevindt zich door de gehele
buis.
Niet beweeglijk
Beweeglijk
Beweeglijk
Nummer
PRB43
BONTE RIJ
Datum
21-7-17
Versie
001
Opsteller
Kun
Bladzijde
4/7
Citraat
Deze test wordt gedaan om te kijken of een micro-organisme in staat is om citraat als
enige koolstofbron te gebruiken.
Het principe van de test is als volgt:
Citraat wordt gesplitst door de werking van het enzym citratase. Om actief te kunnen
zin heeft het enzym magnesium of mangaan nodig is hulpstof. De eindproducten die
bij het citraatmetabolisme ontstaan, hebben invloed op de pH van het medium.
De reactie verloopt als volgt:
Citraat
oxaalacetaat + acetaat
Pyruvaat + CO2
Het pyruvaat wordt verder afgebroken. De indicator in dit medium is
broomthymolblauw. Bij pH 6,0 is deze groen bij een pH van 7,6 wordt deze
diepblauw.
Beoordeling:
Diepblauwe kleur
Groene kleur
Positief
Negatief
Glucose/gasbuis
De afbraak van glucose gebeurt al of niet onder de vorming van gas (b.v. CO 2). Om
te kijken of er gasvorming plaats vindt wordt een Durhambuisje in de glucose buis
gedaan.
Verder worden er organische zuren gevormd. Deze organische zuren zorgen er voor
dat de indicator omslaat van groen naar geel.
Beoordeling:
Gele kleur
Groene kleur
Glucose positief
Glucose negatief
Luchtbel in Durhambuisje
Geen luchtbel in Durnhambuisje
Gas positief
Gas negatief
Nummer
PRB43
Versie
001
BONTE RIJ
Datum
21-7-17
Opsteller
Kun
Bladzijde
5/7
BENODIGDHEDEN
1.
Reagentia voor gramkleuring (zie PRB31)
2.
Buizen met fysiologisch zout
3.
Buizen met ureum-medium
4.
Buizen met Kligler-Fe-medium
5.
Buizen met MI-medium
6.
Buizen met citraat-medium
7.
Buizen met glucose-medium met een Durnhambuisje.
8.
Bloedplaat (indien afwezig gebruik bouillon-plaat)
9.
objectglaasjes
10.
dekglaasjes
11.
steriele pasteurse pipetten
12.
microscoop
MEDIA BEREIDING
De buizen met de verschillende media staan in de koelkast gereed voor gebruik.
VOORBEREIDENDE HANDELINGEN
1.
Beschrijf de verkregen plaat zoals is geleerd in bij blokboek 3 (voorschrift
PRB31)
2.
Zoek alle buizen voor een BONTE RIJ bij elkaar.
WERKWIJZE
1.
Zet de buizen in de volgende volgorde:
1. fysiologisch zout, 2.
ureum, 3. Kligler ,
4. MI, 5. citraat, 6. glucose
2.
Leg een bloedplaat gereed.
3.
Neem een uitgeflambeerde, afgekoelde öse (entnaald met oogje) en tip de
kolonie, die je wilt onderzoeken op de originele plaat, aan
4.
Ga met je “besmette” öse in de fysiologisch zout oplossing (werk steriel,
dus dop eraf, buis flamberen, met öse in de buis, buis flamberen, dop
erop).
5.
Ga nu met de besmette öse voorzichtig zigzag van onder af over de
schuine agar in de ureum buis.
6.
Ga vervolgens met de besmette öse zigzag van boven naar onder over de
schuine agar in de Kligler buis en steek de öse aan het eind door de agar
tot onder in de buis.
7.
Beënt nu de eerste sector van een bloedplaat, dit wordt de reinkweek van
de onderzochte bacterie.
8.
Flambeer de öse nu uit.
9.
Pak een steriele entnaald (rechte naald) en tip de originele kolonie
voorzichtig aan. Steek nu dwars door de MI buis naar de bodem, flambeer
de entnaald uit.
10.
Pak een steriele pasteurse pipet (werk steriel) en pipetteer hiermee in de
citraat en glucose buis 2 druppels uit de fysiologisch zout oplossing.
11.
Maak vanuit de fysiologisch zout oplossing een gram preparaat en
beoordeel deze na de kleuring.
Nummer
PRB43
Versie
001
BONTE RIJ
Datum
21-7-17
Opsteller
Kun
Bladzijde
6/7
SCHEMATISCHE OVERZICHT BONTE RIJ
Naam van
de buis
Kleur
dop
Fysiologisch zwart
Zout
Vast/
Kleur
Vloeibaar inhoud
Vloeibaar Kleurloos Met öse
vanaf
plaat
Vast
Geel
Met öse
Schuin
zigzag van
onder af
Vast
Rood
Met öse
Schuin
zigzag van
bovenaf,
dan
doorsteken
Ureum
Rood
Kligler
(H2S)
(glucose)
(lactose)
Zwart
MI
Motility
(beweging)
Indol
Rood
Citraat
Zilver Vast
Schuin
Groen Vloeibaar Groen
met Durnhambuisje
Glucose/
Gas
Wijze van
beënten
Halfvast
Recht
Aflezen:
Positief
als:
Niet
aflezen
Lila/rood
- H2S:
zwart
- Glucose:
boven rood,
onder geel
- Lactose:
totaal geel
Gelig/
Met rechte Kleurloos entnaald
beweeglijk:
doorsteken helemaal
troebel
- Kovacs
reagens
toevoegen:
rode ring
Groen
2 druppels Blauw/groei
2 druppels Glucose:
geel
Gas:
belletjes
in buisje
Streptococcus (Entrococcus faecalis: gram+coc, katalase
negatief
Aesculine
Bruin Vast
Bruin
Met öse
Zwart
Gal
Schuin
zigzag van onderin
bovenaf,
dan
doorsteken
Nummer
PRB43
Versie
001
BONTE RIJ
Datum
21-7-17
Opsteller
Kun
Bladzijde
7/7
INTERPRETATIE
G H U I C L G B
L 2 R N I A A E
U S E D T C S W
C
U O R T
E
O
M L A O
E
S
A S
G
E
T E
L.
Enteroococcus faecalis
Pseudomonas
Citrobacter freundii
Arizona
Salmonella
Serratia
Enterobacter
Klebsiella
Providencia stuartii
Providencia rettgeri
Morganella morganii
Proteus mirabilis
Proteus vulgaris
Shigella
Escherichia coli
#
=
*
+
:
:
:
:
:
20% pos.
20-40% pos
40-60 % pos
60-85% pos
> 85% pos
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
*
+
+
+
+
-
#
=
=
*
#
+
+
+
+
-
#
#
#
#
+
+
+
+
#
+
+
*
=
=
*
*
*
+
*
=
=
-
=
*
#
+
+
+
#
*
+
+
+
=
+
=
+
+
+
*
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
=
A OPM.
E
S
C
U
L
I
N
E
+ gr+coc
gr-st/P
gr-st/E