Nieuwe biomedische lasertoepassingen

Return-Path: <[email protected]>
Date: Tue, 16 Dec 2003 19:41:58 +0100
From: Sarah Schols <[email protected]>
User-Agent: Mozilla/5.0 (Windows; U; Windows NT 5.1; en-US; rv:1.4)
Gecko/20030624
X-Accept-Language: en-us, en
To: [email protected]
Subject: Studieopdracht Sarah Schols en Sofie Put
X-Virus-Scanned: by KULeuven Antivirus Cluster
X-Spam-Status: No, hits=0.0 tagged_above=-9999.0 required=6.0
X-Spam-Level:
Beste,
In bijlage vindt u onze studieopdracht
Nieuwe biomedische
lasertoepassingen
Met vriendelijke groeten,
Sarah Schols
Sofie Put
Inhoudsopgave
1 De kracht van licht
2
2 Confocale Laser Scanning Microscopie
2.1 Principe fluorescentie microscopie . . .
2.2 Principe confocale microscopie . . . .
2.3 Voordelen . . . . . . . . . . . . . . . .
2.4 Beperkingen . . . . . . . . . . . . . . .
2.5 Keuze van de laser . . . . . . . . . . .
.
.
.
.
.
2
2
2
4
4
4
5
5
5
6
7
3 Multifoton Microscopie
3.1 Twee-foton excitatie .
3.2 Drie-foton excitatie . .
3.3 Voordelen . . . . . . .
3.4 Beperkingen . . . . . .
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
4 Ultrasnelle lasers voor chirurgische toepassingen
4.1 Inleiding . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.2 Fotodisruptie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.3 De Pulsbreedte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.3.1 Verband tussen fotodisruptie en de pulsbreedte
4.3.2 Verband tussen energie en pulsbreedte . . . . .
4.4 Voordelen tov conventionele medische lasers . . . . . .
4.5 Toepassingen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
8
. 8
. 8
. 9
. 9
. 9
. 10
. 11
Bibliografie
.
.
.
.
.
.
.
.
.
12
1
1
De kracht van licht
De laser is vandaag de dag een veel gebruikt hulpmiddel in de medische wereld.
De unieke karakteristieken van laserlicht bepalen hoe het licht gaat interageren met
menselijk weefsel. De golflengte, coherentie, polarisatie, intensiteit, richting en pulsbreedte kan immers veranderen door de interactie van het licht met weefsel. Hierdoor
wordt het licht een krachtig middel voor beeldvorming en chirurgische toepassingen.
[1]
Aangezien er heel veel biomedische toepassingen van lasers bestaan, zullen we ons
hier beperken tot 2 onderwerpen, nl. het gebruik van lasers voor medische beeldvorming en laser-toepassingen in de chirurgie. Hierbij hebben we gekozen voor het
uitwerken van respectievelijk confocale en multifoton microscopie en ultra snelle
lasers voor chirurgische toepassingen.
2
Confocale Laser Scanning Microscopie
2.1
Principe fluorescentie microscopie
Fluorescentie microscopie is gebaseerd op het fenomeen dat bepaalde materialen,
wanneer het bestraald wordt met licht van een bepaalde golflengte, energie uitzenden dat als zichtbaar licht detecteerbaar is. Het materiaal kan ofwel van nature
fluorescent zijn, ofwel behandeld zijn met fluorescente chemicaliën. [2]
Figuur 1: Principe van fluorescentie
1. Energie wordt geabsorbeerd door het atoom dat hierdoor geëxiciteerd wordt.
2. Het elektron springt naar een hoger energieniveau.
3. Wanneer het elektron terugvalt naar het grondniveau wordt er een foton uitgezonden. Het atoom is fluorescent.
2.2
Principe confocale microscopie
Bij confocale microscopie wordt het materiaal puntsgewijs verlicht door een gefocusseerde lichtstraal. [3] Het licht dat weerkaatst of uitgezonden wordt door het
fluorescente materiaal, wordt op een kleine detector gefocusseerd. Op die manier
kan men beelden van dunne lagen maken zonder in het materiaal te moeten snijden.
Door beelden van verschillende diepte te verzamelen kan men een driedimensionaal
beeld vormen.
2
Figuur 2: Opstelling
• De laserstraal komt in bovenstaande figuur langs beneden en valt in op een
”beamsplitter”, ook wel chromatische reflector genoemd. De chromatische reflector heeft als eigenschap dat licht met korte golflengten gereflecteerd wordt
en lange golflengten doorgelaten worden. [4] Door een goede keuze van de
golflengte van het invallend licht wordt de lichtstraal hier dus naar links gereflecteerd.
• De gereflecteerd laserstraal wordt gefocusseerd in een punt. Dit punt ligt in
het focaal vlak van het objectief.
• Het fluorescent of gereflecteerd licht plant zich voort door het objectief en wordt
doorgelaten door de chromatische reflector aangezien het dit licht een grotere
golflengte heeft.
• Lenzen focusseren het licht in de detector opening. Enkel het licht dat door de
opening gaat, valt in op de fotodetector.
De stippellijn op figuur 2 duidt de voortgang van een lichtstraal van een object
dat niet gefocusseerd is. Er wordt een grotere oppervlakte belicht met mindere
intensiteit als gevolg. Dit licht wordt niet in de detector opening gefocusseerd en
geeft dus een veel zwakkere contributie aan het signaal van de detector. In figuur
3 wordt het verschil aangegeven tussen beeldvorming zonder een detector opening
(niet-confocaal) en met een detector opening (confocaal). Meestal is de detector
opening aanpasbaar. Zo geeft een kleine opening een hogere resolutie, maar een
lager signaal. [5]
Figuur 3: Verschil tussen niet confocaal (links) en confocaal (rechts)
3
2.3
Voordelen
Confocale microscopie gaat, omwille van het verwerpen van de out-of-focus interferentie, altijd beter zijn dan de standaard epifluorescentie microscopie. [5]
De out-of-focus verwerping wordt op 2 manieren bereikt:
• Er wordt slechts een enkel punt belicht zodat de lichtintensiteit snel afneemt
boven en onder het brandvlak van de lens.
• Men maakt gebruik van een detector opening waardoor enkel het licht dat
afkomstig is van de focus de detector bereikt.
De resolutie die bekomen wordt met confocale microscopie is tot een factor 1.4 beter
dan de resolutie bekomen met conventionele microscopie.
2.4
Beperkingen
De fluorophore moleculen, dit is de stof die het sample fluorescent maakt, hebben in
geëxciteerde toestand een significante levensduur (in de orde van nsec). Bij gemiddelde exitatie, zal de hoeveelheid uitgezonden licht evenredig zijn met de invallende
excitatie. Bij hoge excitatieniveaus kan het echter gebeuren dat de grondtoestand
volledig gedepleteerd wordt. Alle moleculen bevinden zich dan in geëxciteerde toestand. Er treed saturatie op waardoor er geen extra signaal meer bekomen kan worden
als we de flux van de excitatiebron verhogen.
Meestal worden er bij confocale microscopie laser-excitatiebronnen gebruikt van
ongeveer 10mW. Wanneer de spectraallijn in de nabijheid van de excitatiepiek van
de fluorophore wordt gebruikt, leidt dit tot saturatie, waardoor beelddegradatie
ontstaat. Men bekomt betere beelden wanneer we het vermogen een factor 10 tot 100
verlagen. Dit gaat echter de snelheid waarmee we beelden kunnen maken, beperken
indien de signaalruisverhouding constant gehouden wordt. De reden hiervoor is de
beperkte hoeveelheid licht die we verkrijgen van de fluorophoren, gelegen ter hoogte
van de focus.
Een oplossing hiervoor is parallellisme. [5] Een reeks van stralen kan in parallel
gebruikt worden. Dit noemt men “multiple-beam confocale microscopie” en heeft
toepassingen in het in beeld brengen van hoge-snelheids intracellulaire veranderingen zoals de visualisatie van het transport van calcium ionen.
2.5
Keuze van de laser
Voor confocale microscopie gaat men typisch gebruik maken van de luchtgekoelde
argon-ion laser. Deze levert een multilijn output vermogen van een tiental milliwatt
in het blauw/groen golflengtegebied, nl. het gebied tussen 457 en 514 nm. [6] Een
multilijn output is noodzakelijk aangezien dit de mogelijkheid biedt om verschillende
fluorophoren te exciteren, wat nodig is voor het in beeld brengen van cellen.
Luchtgekoelde ionen lasers hebben deze flexibiliteit, samen met een hoge betrouwbaarheid en een uitstekende stabiliteit van de beam-focus, wat essentieel is voor
toepassingen zoals confocale microscopie. [7] Om de golflengte selectiviteit nog te
verhogen wordt vaak ook gebruik gemaakt van een additionele rode diode laser of
een HeNe laser. [6]
4
3
Multifoton Microscopie
Om wille van de grote verstrooiing van zichtbaar licht, kan confocale microscopie
slechts gebruikt worden voor kleine penetratiedieptes. Bovendien zal er altijd enige
out-of-focus emissie zijn die de detector bereikt en op die manier de signaalruisverhouding gaat reduceren. Deze beperkingen kunnen geëlimineerd worden door gebruik
te maken van multifoton microscopie.
Multifoton imaging is een techniek die gebaseerd is op het feit dat een ultrasnelle
(femtoseconden of picoseconden) laser met een gemiddeld vermogen van 2W een
piekvermogen kan leveren van enkele kilowatts. [6]
Karakteristiek voor multifoton microscopie is het gebruik van twee-foton of drie-foton
excitatie.
3.1
Twee-foton excitatie
Bij twee-foton excitatie wordt het materiaal belicht met een golflengte die twee keer
de golflengte is van de absorptiepiek van het gebruikte fluorophore. [8] Deze elektronen bezitten dus de helft van de energie van de fotonen gebruikt voor confocale
microscopie. Wanneer er nu een hoog piek-vermogen gepulste laser gebruikt wordt
gaan er zich twee-foton effecten voordoen ter hoogte van de focus. Op dit punt
is de fotondichtheid groot genoeg zodat twee fotonen tegelijk kunnen worden geabsorbeerd. [9] Dit is aangegeven op figuur 4. Op deze manier gaat fluorophore excitatie
enkel in de focus gebeuren en wordt de out-of-focus excitatie geëlimineerd.
Figuur 4: Enkel-foton excitatie (links) en multifoton excitatie (rechts)
3.2
Drie-foton excitatie
In dit geval worden drie fotonen tegelijk geabsorbeerd. Hierdoor kunnen fluorophoren
die normaal door UV-licht worden geëxciteerd in beeld gebracht worden met behulp
van IR-excitatie (langere golflengte). Omdat de excitatieniveaus afhankelijk zijn van
de derde macht van het vermogen, en dus de energie, wordt de resolutie verhoogd
in vergelijking met twee-foton excitatie waar er een kwadratische vermogenafhankelijkheid is.
5
3.3
Voordelen
Met behulp van multifoton microscopie is het mogelijk om optische beelden te verkrijgen van dieper gelegen delen binnen in het weefsel. Hiervoor zijn er drie hoofdredenen:
• de excitatiebron wordt niet afgezwakt doordat het fluorophore boven het brandvlak van de lens de fotonen niet absorbeert.
• langere excitatiegolflengten hebben minder last van verstrooiing.
• het fluorescent signaal wordt niet gedegradeerd door verstrooiing als het niet
in beeld wordt gebracht.
Wanneer beelden diep in een materiaal worden verkregen met behulp van confocale microscopie, wordt het fluorescent signaal afgezwakt door verstrooiing van het
licht. Ook zal licht dat afkomstig is van gebieden, die niet in de buurt van het punt
dat belicht wordt liggen, verstrooid worden. Op die manier is het mogelijk dat er
toch out-of-focus licht door de detector opening geraakt en zo zorgt voor extra ruis.
Multifoton microscopie is immuun voor deze effecten. Er wordt immers zeer weinig
fluorescent licht gegenereerd in gebieden die niet in de buurt van het belichte punt
liggen.
Op figuur 5is duidelijk te zien dat er bij confocale microscopie een toename is van
de achtergrondruis wat resulteert in een beeld met weinig contrast. Bij multifoton
microscopie behouden we het contrast, zelfs tot diep in het weefsel.
Figuur 5: Vergelijking confocaal en multi-foton op verschillende dieptes
6
Multifoton imaging heeft ook enkele andere voordelen ten opzichte van confocale
microscopie:
• Niet-radiatieve transities van de fluorophoren naar de grondtoestant kan leiden tot het vrijkomen van enkelvoudige zuurstof atomen, wat toxisch is. In
tegenstelling tot confocale microscopie worden bij multifoton imaging enkel fluorophoren in het focaal vlak geexciteerd en niet in de bulk van het materiaal.
Dit zorgt voor een sterke reductie van het vrijkomen van toxische producten.
• Alle geëexciteerde fotonen kunnen gebruikt worden om het beeld te vormen.
Er is dus geen extra systeem nodig om out-of-focus licht tegen te houden.
3.4
Beperkingen
Multifoton microscopie heeft echter ook een aantal nadelen:
• Een iets lagere resolutie in vergelijking met confocale microscopie. Dit verlies in
resolutie kan geëlimineerd worden door het gebruik van een confocale opening
net voor de detector met verlies van het signaal als gevolg.
• Multifoton imaging werkt enkel met fluorescentie microscopie.
• De techniek is momenteel vrij duur.
7
4
4.1
Ultrasnelle lasers voor chirurgische toepassingen
Inleiding
De toepassingen van ultra snelle lasers situeren zich van hoge-precisie industriële
micromachining tot medische beeldvorming. Maar ook chirurgische toepassingen
kunnen profiteren van de unieke licht-materie interactie van deze lasers. Zo kan
biologisch weefsel met minimale schade verwijdert worden.
4.2
Fotodisruptie
Chirurgie op basis deze ultra snelle technologie is gebaseerd op laser-induced opitical
breakdown (LIOB). [10] Indien het vermogen van de laser groot genoeg is, worden
atomen en moleculen ter hoogte van de focus van de laserstraal getransformeerd tot
een plasma. Dit plasma is een heet gas van ionen en elektronen en bevindt zich
dus op een heel hoge temperatuur en druk. Dergelijk plasma gaat afkoelen door te
expanderen, het omringende materiaal op te warmen of door licht uit te zenden.
Het grootste gedeelte van de energie in de optische puls gaat gewoon door het materiaal. Enkel een klein gedeelte van de invallende laserenergie van de laser wordt
geabsorbeerd om bovenstaand plasma te creëren. Hierdoor blijft de schade beperkt.
[11]
Figuur 6: Vorming van het plasma ter hoogte van de focus
De initieel hoge druk in het plasma veroorzaakt een schokgolf die gaat propageren.
[12]Hiermee moet rekening gehouden worden aangezien de druk lokaal groter kan
worden dan de sterkte van het weefsel en op die manier dus extra schade kan aanrichten. Door de temperatuur gaat het hete plasma ook gedeeltelijk verdampen
om zo een microbel te creëeren. Deze bel gaat een paar keer expanderen en terug
inkrimpen voor ze uiteindelijk in elkaar klapt. Er wordt dus materiaal verwijderd
door het ionisatie-proces van het plasma
LIOB en de geassocieerde secundaire effecten, zoals schokgolfpropagatie, worden fotodisruptie genoemd wanneer het zich voordoet in een vloeibaar of semi-vloeibaar
materiaal, zoals weefsel.
8
4.3
4.3.1
De Pulsbreedte
Verband tussen fotodisruptie en de pulsbreedte
Wanneer het elektrisch veld in de puls intens genoeg is gaat het de materie ioniseren.
Dit proces bestaat uit 2 delen: het genereren van vrije ladingsdragers (foto-ionisatie)
en lawine-ionisatie. [13]
Voor sterke velden is de foto-ionisatie hoofdzakelijk te wijten aan ionisatie door tunneling. Het elektrisch veld verandert de bandenstruktuur zodat de ladingsdragers in
de conductieband kunnen tunnelen. Voor lage velden domineert multifoton-ionisatie.
Bij dit proces gaan electronen pas in de conductieband terecht komen nadat ze voldoende fotonen geabsorbeerd hebben.
Eens de vrije ladingsdragers in de conductieband voldoende energie hebben, neemt
het lawineproces het over. De ladingsdragers absorberen energie van de puls en gebruiken dit om andere gebonden ladingsdragers los te slaan. Lawine-ionisatie domineert altijd, tenzij voor extreem korte pulsen(< 50 fs), want dan is er geen tijd
genoeg om het lawineproces op gang te brengen.
Het gevolg hiervan is dat voor korte pulsen fotodisruptie deterministisch (reproduceerbaar) is. De elektromagnetische golven zijn in dit geval hoog genoeg om vrije
ladingsdragers te genereren zonder afhankelijk te zijn van de intrinsieke ladingsdragers (in het materiaal dat belicht wordt).
Bij langere pulsen gaat het lawineproces een belangrijke rol spelen, waardoor de hoeveelheid vrije ladingsdragers gaat fluctueren. Dus bij langere pulsen is fotodisruptie
niet deterministisch.
In figuur 7 wordt het gevormde plasma vergeleken voor het geval van picoseconden en
femtoseconden laserpulsen. In de twee gevallen is de afstand tussen de verschillende
spots hetzelfde. We zien duidelijk dat bij ps-pulsen de vorming van het plasma niet
bij elke locatie gebeurt en als ze zich voordoet is het ongecontroleerd. In het geval
van fs-pulsen, wordt het plasma gevormd op een reproduceerbare manier.
Figuur 7: Vergelijking picoseconden en femtoseconden laserpulsen
4.3.2
Verband tussen energie en pulsbreedte
Een bepaalde minimale hoeveelheid energie is nodig in de puls om schade te veroorzaken. Als de energie lager is dan een bepaalde drempel, wordt het materiaal niet
beschadigd. In figuur 8 is deze drempelenergie uitgezet in functie van de pulsbreedte
9
in water. Wanneer de puls korter wordt, gaat de hoeveelheid energie die nodig is om
LIOB te veroorzaken dalen. Ook de onzekerheid in de drempelenergie gaat afnemen.
Bijgevolg gaan femtoseconden pulsen het meest reproduceerbaar zijn en de meest
nauwkeurige resultaten geven. [11][13]
Figuur 8: De LIOB drempelenergie in functie van de pulsbreedte
4.4
Voordelen tov conventionele medische lasers
Ultra snelle lasers hebben een aantal voordelen ten opzichte van de conventionele
medische lasers [14][11]:
• Minimale collaterale schade: LIOB komt enkel voor daar waar de laserstraal het
meest intens is, nl. de focus van de straal. Hierdoor blijft het grootste deel van
het weefsel onaangeroerd wanneer de laserstraal erdoor passeert. Bijgevolg is er
dus zeer weinig thermische en akoestische schade aan het omringende weefsel.
• Chirurgie onder het oppervlak: De intensiteit van de laserstraal kan zo ingesteld worden, dat fotodisrupie aan de focus van de straal voorkomt. Als er
dan onder het weefsel gefocusseerd wordt, kan er een plasma gevormd worden in
het inwendige van het weefsel zonder het bovenliggende weefsel te beschadigen.
Een onmiddellijke toepassing hiervan is chirurgie zonder snijden.
• Reproduceerbare microsneden: Hoe korter de pulsduur, des te minder energie
er nodig is om LIOB te veroorzaken. Ook de onzekerheid op de energie gaat
afnemen. Hierdoor kunnen kleinere, meer precieze microsneden gemaakt worden.
De ontwikkeling van ultra snelle lasers resulteert in biomedische instrumenten die
veiliger zijn, minder chirurgische complicaties veroorzaken en minder vaardigheden
van de chirurg vragen.
10
4.5
Toepassingen
Het behandelen van bijziendheid is één van de toepassingen van ultra snelle pulslasers. Door het gebruik van deze korte laser pulsen is het niet meer nodig om te
snijden in het hoornvlies. [12] De laserstraal wordt in dit geval gefocuseerd op een
bepaalde diepte binnen in het hoornvlies. Het plasma dat daar ontstaat zorgt voor
het verwijderen van kleine hoeveelheden weefsel door middel van verdamping. Het
gegenereerde gas kan dan diffunderen door het hoornvlies. Het grote voordeel is hier
dus dat er geen wonde ontstaat waardoor helingsproces dus sneller gaat.
Het los-snijden van een flap van het hoornvlies en het voor-snijden van kanalen
voor hoornvlies implantaten zijn andere voorbeelden die al gerealiseerd zijn. In de
toekomst zullen gehele nieuwe chirurgische procedures mogelijk zijn, zoals: transsclerale fotodisruptie voor de behandeling van glaucoma [15], voor-snijden voor het plaatsen van implantaten van presbyopie en fotodisruptie van de lens voor cataractchirugie.
Niet optische toepassingen zijn mogelijk in de dermatologie en de neurochirugie. [14]
11
Referenties
[1] Paula Noaker Powell. Shedding light on cancer diagnosis. Laser Focus World,
pages 166–172, May 2000.
[2] The Nobel Foundation.
http://www.nobel.se/physics/educational/
microscopes/fluorescence.
[3] Kjell Carlsson Anders Liljeborg.
[4] Stanford University Medical Center. http://taltos.stanford.edu/pages/
cocoa_techsup.html#clsm.
[5] Laboratory for Optical and Computational Instrumentation. Confocal imaging.
http://www.loci.wisc.edu/confocal/confocal.html.
[6] Arnd Krueger. Lasers play a bigger role in biomedical applications. Photonics
Spectra, pages 80–83, May 2003.
[7] Donna Z.Berns. Air-cooled ion lasers see strong biomedical demand. Laser
Focus World, pages 147–151, November 1999.
[8] Laboratory for Optical and Computational Instrumentation.
Multiplephoton excitation fluorescence microscopy.
http://www.loci.wisc.edu/
multiphoton/mp.html#3photon.
[9] Carl Zeiss. Origin of fluorescence. http://www.zeiss.de/C12567BE0045ACF1/
allBySubject/8569F633E0A8772BC1256AEA004D9021.
[10] Laser Zentrum Hannover e.V.
http://www.lasermedis.de/Femtolaser/
Femto_Optischer_Durchbruch/femto_optischer_durchbruch.html.
[11] Gabrielle Marre Ron M. Kurtza Tibor Juhasz Gerard Mourou Zachary S. Sacks,
Gregory Spooner. Subsurface photodisruption in scattering biological tissues.
http://optics.sgu.ru/SFM99/Sacks/.
[12] Frieder H. Loesel. Ultrafast surgical lasers provide vision correction. Laser Focus
World, pages 143–148, January 2001.
[13] University of Michigan Center for Ultrafast Optical Science. Principles
of ultrafast laser surgery.
http://www.eecs.umich.edu/CUOS/Medical/
Photodisruption.html.
[14] University of Michigan Center for Ultrafast Optical Science. http://www.eecs.
umich.edu/CUOS/index.html.
[15] Tibor Juhasz Gerard A. Mourou Zachary S.Sacks, Ron M. Kurtz. Femtosecond subsurface photodisruption in scattering human tissue using long infrared
wavelengths. http://optics.sgu.ru/SFM2000/report/Sacks/index.htm.
12