2016 Invloed van dieet en acclimatisatie op de koudetolerantie van d

Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen
Academiejaar 2015 – 2016
Invloed van dieet en acclimatisatie op de koudetolerantie van de
zwarte wapenvlieg, Hermetia illucens
Annelies Noyez
Promotor: Prof. dr. ir. P. De Clercq
Tutor: ir. T. Spranghers
Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van
Master in de bio-ingenieurswetenschappen: Landbouwkunde
‘De auteur en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en
delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik.
Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de
verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie.’
‘The author and the promotor give the permission to use this thesis for consultation and to copy parts of it
for personal use.
Every other use is subject to the copyright laws, more specifically the source must be extensively specified
when using the results from this thesis.’
Gent, juni 2016,
De promotor,
Prof. dr. ir. P. De Clercq
De auteur,
Annelies Noyez
WOORD VOORAF
Beste lezer,
Yes, het is gelukt. Met trots presenteer ik U mijn masterproef, het resultaat van maandenlang
hard werk. Vooraf zou ik graag enkele mensen willen bedanken, zonder wiens hulp mijn
masterproef er niet hetzelfde had uitgezien. In de eerste plaats denk ik hierbij aan mijn promotor,
Prof dr. Ir. Patrick De Clercq. U gaf me de mogelijkheid om dit mooie onderwerp verder te
onderzoeken. Bedankt voor uw begeleiding, advies en het nalezen en verbeteren van dit
eindwerk.
Een persoon die ik zeker niet mag vergeten is mijn persoonlijke begeleider, Thomas Spranghers.
Thomas, U was mijn rots in de branding. Het gehele jaar stond U aan mijn zijde met de nodige
hulp, uitleg, steun en veel meer. Zonder uw begeleiding was het realiseren van deze thesis niet
mogelijk geweest. Bedankt voor alle tijd die U voor mij vrijmaakte. Was het nu weekend, een
feestdag of middernacht ik kon altijd bij U terecht. Daarvoor: dikke merci!
Vervolgens zou ik mij graag richten tot mijn mede thesisstudenten en labogenoten (Fons, Sanne
en Tom). De vele uren in het labo waren veel aangenamer dankzij jullie, er werd gelachen,
gezongen, geëxperimenteerd en natuurlijk ook gewerkt. Ook buiten het labo kon ik op jullie steun
rekenen. Mijn oprechte excuses voor de verschrikkelijke geur dat mijn beestje veroorzaakte in het
labo. Maar geef toe ondanks de geur blijven het lieverdjes. Ook het labopersoneel verdient een
welverdiende merci. Wanneer ik iets nodig had, wist ik jullie steeds te vinden.
Een volgend woord van dank gaat uit naar het studentenrestaurant Campus Coupure, het AZ SintElisabeth en het bedrijf Trevi NV. Deze bedrijven maakte het mogelijk om op een korte tijd de
nodige hoeveelheid van de gebruikte substraten te verkrijgen.
Tot slot wil ik graag mijn familie en vriend bedanken. In eerste plaats een speciaal woordje voor
mijn ouders. Mama en papa, het heeft bloed zweet en tranen gekost van ons allemaal maar het is
eindelijk zover: ik studeer af als bio-ingenieur. De laatste 5 jaar heb ik een echt studentenleventje
geleid. Dit was nooit mogelijk geweest zonder jullie morele, materiële en financiële steun.
Vervolgens zou ik graag mijn vriendje willen bedanken. Simon, het laatste jaar had ik meer oog
voor mijn vliegjes dan voor jou. Maar toch was jij er altijd om mij te steunen. Ik kan niet wachten
om volgend jaar hetzelfde voor jou te doen.
Nu rest er mij enkel nog een boeiende en aangename lectuur toe te wensen.
Veel leesplezier!
Annelies Noyez
INHOUDSOPGAVE
INLEIDING .......................................................................................................................................... 1
DEEL I: LITERATUURSTUDIE ........................................................................ 2
1. De zwarte wapenvlieg, Hermetia illucens ................................................................................ 2
1.1 Biologie .............................................................................................................................. 2
1.2 Toepassingen ...................................................................................................................... 3
2. Voortplantingspotentieel van de zwarte wapenvlieg ............................................................... 4
2.1 Paring en ei-afleg (fecunditeit) ........................................................................................... 4
2.2 Invloed van het gewicht op de fecunditeit ........................................................................ 5
2.3 Andere factoren die de fecunditeit beïnvloeden ................................................................. 7
2.3.1 Ovipositieplaats …….. ............................................................................................ 7
2.3.2 Temperatuur ........................................................................................................... 8
2.3.3 Populatiedichtheid .................................................................................................. 8
3. Insecten bij lage temperatuur ................................................................................................... 9
3.1 Koudetolerantie .................................................................................................................. 9
3.1.1 Vriestolerante soorten .......................................................................................... 10
3.1.2 Vriesintolerante soorten ....................................................................................... 11
3.1.3 Koeltolerante soorten ........................................................................................... 12
3.1.4 Koelvatbare soorten .............................................................................................. 12
3.1.5 Soorten met een opportunistische overleving ...................................................... 13
3.2 Mechanismen van bevriezing bij insecten ....................................................................... 13
3.3 Regulatie van de onderkoelingscapaciteit ........................................................................ 14
3.3.1 Factoren die het onderkoelingspunt negatief beïnvloeden: inoculatieve bevriezing,
ijskernvormende eiwitten en ijskernvormende micro-organismen ...................... 14
3.3.2 Factoren die het onderkoelingspunt positief beïnvloeden: cryoprotectants
(glycerol) en antivrieseiwitten .............................................................................. 15
3.4 Koude-acclimatisatie en snelle koudehardheid ................................................................ 17
3.4.1 Koude-acclimatisatie ............................................................................................ 17
3.4.2 Snelle koude hardheid ................................................................................................... 18
3.5 Koudetolerantie van de zwarte wapenvlieg ............................................................................ 18
DEEL II: MATERIAAL & METHODEN ......................................................... 19
1. Algemene kweek van H. illucens ...........................................................................................
2. Koudetolerantie van H. illucens .............................................................................................
2.1 Bepaling onderkoelingspunt .............................................................................................
2.2 De letale tijd bij 5°C .........................................................................................................
2.3 Invloed van het dieet op de koudetolerantie .....................................................................
2.3.1 De gebruikte diëten .................................................................................................
2.3.2 Bepaling van het onderkoelingspunt en de letale tijd .............................................
2.3.3 Bepaling drogestof- en eiwitgehalte ........................................................................
2.4 Invloed van koude-acclimatisatie op de koudetolerante ..................................................
2.5 Invloed van het gewicht op de letale tijd
..................................................................
3. Invloed van het gewicht op de fecunditeit van H. illucens .....................................................
3.1 Bepaling van de fecunditeitskarakteristieken ...................................................................
19
19
19
20
21
22
22
23
23
23
24
24
3.2 Invloed van genetische factoren op het gewicht .............................................................. 26
4. Statistische data verwerking ........................................................................................................... 27
DEEL III: RESULTATEN ................................................................................... 28
1. Koudetolerantie van H. illucens .............................................................................................
1.1 Invloed van het diet ..........................................................................................................
1.1.1 Het onderkoelingspunt .........................................................................................
1.1.2 De letale tijd bij 5°C .............................................................................................
1.1.3 Het drogestof- en eiwitgehalte .............................................................................
1.2 Invloed van koude-acclimatisatie .....................................................................................
1.2.1 Het onderkoelingspunt .........................................................................................
1.2.2 De letale tijd bij 5°C .............................................................................................
1.3 Invloed van het gewicht op de letale tijd bij 5°C .............................................................
2. Invloed van het gewicht op de fecunditeite van H. illucens ...................................................
28
28
28
29
30
31
31
31
32
33
DEEL IV: DISCUSSIE ......................................................................................... 36
1. Koudetolerantie van H. illucens ............................................................................................. 36
1.1 Invloed van het dieet ........................................................................................................ 37
1.1.1 Het onderkoelingspunt ......................................................................................... 37
1.1.2 De letale tijd bij 5°C ............................................................................................. 38
1.2 Invloed van koude-acclimatisatie ..................................................................................... 40
1.2.1 Het onderkoelingspunt ......................................................................................... 40
1.2.2 De letale tijd bij 5°C ............................................................................................. 41
1.3 Invloed van het gewicht ................................................................................................... 42
1.4 Ecologische relevantie ...................................................................................................... 42
1.5 Conclusie .......................................................................................................................... 43
2. De fecunditeitskarakteristieken van H. illucens ..................................................................... 43
2.1 Conclusie ..................................................................................................................................... 46
SAMENVATTING ........................................................................................................................... 47
LITERATUURLIJST .................................................................................................................... 49
|1
INLEIDING
Insecten kunnen op verschillende manieren een koudetolerantie opbouwen. Sommige insecten
laten een gecontroleerde bevriezing van de lichaamsvloeistof toe, terwijl anderen juist een
bevriezing van hun lichaamsvloeistof voorkomen. De gevormde koudetolerantie speelt een
belangrijke rol tijdens de overleving bij lage temperaturen die voorkomen tijdens het
winterseizoen in gematigde klimaten. Deze lage temperaturen vormen vaak een barrière voor de
verspreiding van insecten uit tropische of subtropische gebieden. Er zijn echter ook tropische
soorten gekend die een koudetolerantie kunnen ontwikkelen. Deze soorten kunnen op dezelfde
manier reageren als gematigde soorten wanneer deze worden blootgesteld aan koude
temperaturen. Worden deze soorten geïntroduceerd in een gematigd gebied, dan bestaat de kans
dat ze zich vestigen in het geïntroduceerde gebied en de inheemse biodiversiteit nadelig
beïnvloeden (invasieve soorten). Het aantal invasieve soorten in Europa neemt jaarlijks toe. Om
dit te voorkomen werden standaard protocollen ontwikkeld betreffende risicoanalyses bij de
introductie van exotische soorten. Hierbij wordt er ook aandacht besteed aan de koudetolerantie
van de soort.
Deze thesis focust zich op de koudetolerantie van de zwarte wapenvlieg, Hermetia illucens. De
vlieg komt oorspronkelijk voor in de subtropische en tropische gebieden van Noord- en ZuidAmerika. Door haar vele waardevolle toepassingen heerst er een wereldwijde interesse voor deze
soort, ook in onze contreien. Een gekende toepassing is het gebruik van de vlieg om een
afvalstromen om te zetten in hoogwaardige eiwitten. Deze hoogwaardige eiwitten kunnen
geschikt zijn voor het gebruik in de veevoeding. Het insect is echter een exotische soort. Wanneer
deze gekweekt wordt voor commerciële doeleinden bestaat er een kans dat de vlieg ontsnapt en
geïntroduceerd wordt in het leefmilieu. Er werd reeds aangetoond dat het risico dat de vlieg kan
overleven in onze contreien zeer laag is. Uit labo-onderzoek is gebleken dat de koudetolerantie
van de vlieg niet sterk genoeg ontwikkeld is om de wintertemperaturen bij ons te overleven. Deze
labo-onderzoeken hielden echter geen rekening met enkele ecologische aspecten waarmee de
vlieg in haar natuurlijke habitat geconfronteerd wordt. In dit onderzoek wordt de invloed van
enkele ecologische aspecten (het dieet en een koude-acclimatisatie) op de koudetolerantie van H.
illucens onderzocht. Het dieet is een belangrijke factor aangezien de larven van de zwarte
wapenvlieg zich kunnen voeden op zeer uiteenlopende substraten. Dit kan de chemische
samenstelling en daaraan gelinkt de koudetolerantie van het insect beïnvloeden. Een koudeacclimatisatie zou de soort instaat kunnen stellen om zich over een lange periode aan te passen
aan de koude temperaturen.
Verder in deze thesis wordt er aandacht besteed aan de fecunditeitskarakteristieken van de zwarte
wapenvlieg. De fecunditeit is belangrijke parameter voor een massakweeksysteem. Men wil met
zo weinig mogelijk vliegen een zo groot mogelijk aantal nakomelingen bekomen op een zo kort
mogelijke tijd. Algemeen wordt gesteld dat bij insecten zwaardere wijfjes meer nakomelingen
produceren. Er wordt onderzocht of deze bewering ook van toepassing is op de zwarte
wapenvlieg.
|2
DEEL I: LITERATUURSTUDIE
1. De zwarte wapenvlieg, Hermetia illucens
1.1 Biologie
De zwarte wapenvlieg, Hermetia illucens (L.) (Diptera: Stratiomyidae), onderscheidt zich van
andere wapenvliegen door haar grote omvang (13 tot 20 mm) en het gevlekte patroon op het
lichaam (May, 1961). Het oorsprongsgebied van de vlieg strekt zich uit over de tropische en
subtropische gebieden van Noord- en Zuid-Amerika, van Argentinië tot midden Verenigde
Staten. De vlieg werd voornamelijk door zowel actief als passief transport wereldwijd verspreid
naar tropische, subtropische en gematigde gebieden tussen 45°NB en 40°ZB, inclusief Australië
en Nieuw-Zeeland. In haar oorsprongsgebied heeft de vlieg 3 generaties per jaar en wordt ze
gevonden van de late lente tot de vroege herfst (Sheppard et al., 1994). Een generatie duurt
gemiddeld 44 dagen. De duur is sterk afhankelijk van de omgevingsomstandigheden en het
beschikbare voedsel (Alvarez, 2012). Tijdens een levenscyclus worden er 4 verschillende stadia
doorlopen: ei, larve, pop en adult (Figuur 1). De wapenvlieg behoort tot de holometabole
insecten. Dit betekent dat er een volledige metamorfose plaatsvindt, waarbij er een verschil is in
uiterlijk tussen de larven en adulten en er een popstadium voorkomt (Bellman & Heitmans,
2001).
Figuur1: Verschillende stadia binnen een levenscyclus van H. illucens. Van links naar rechts: eitjes,
larven, prepoppen, adult.
De vlieg wordt niet beschouwd als een plaagorganisme aangezien ze niet of weinig voorkomt
rond woonplaatsen. Dit komt voornamelijk omdat de adulten zich niet moeten voeden en
overleven van vetreserves opgeslagen tijdens de larvale stadia (Alvarez, 2012). Eens deze
vetreserves zijn opgebruikt, sterft het insect (Myers et al., 2008). De larvale fase bestaan uit 6
vervellingsstadia. Ze overleven voornamelijk op organische afvalstromen zoals keukenafval,
rottend fruit, mest en vele andere (Newton et al., 2005). Het vochtgehalte van de voeding is
belangrijk aangezien het de ontwikkeling van de larven beïnvloedt (Alvarez, 2012). De optimale
vochtigheid varieert tussen de 60% en 90% en de optimale temperatuur tussen 27 en 33°C
(Sheppard et al., 2002). De larven scheiden enzymen af die hun voeding deels verteren alvorens
ze het innemen, waardoor de voedingsmassa vloeibaar wordt. Het 6de vervellingstadium wordt
het prepopstadium genoemd. Eens de larven zich in dit stadium bevinden, hebben ze voldoende
Literatuurstudie
|3
vetreserves gestockeerd en migreren ze weg van hun voedingsbron (Sheppard et al., 1994). De
prepoppen voeden zich niet, ze legen hun darminhoud en gaan op zoek naar een
verpoppingssubstraat. Het optimale verpoppingssubstraat is droog, ligt op een donkere locatie en
zorgt voor bescherming tegen mogelijke predators of ongunstige milieuomstandigheden
(Alvarez, 2012).
1.2 Toepassingen
Het gebruik van de zwarte wapenvlieg in mest management systemen is niet nieuw. De vlieg
voedt zich op de verse mest en zet de overgebleven nutriënten om in eigen biomassa (Newton et
al., 2005). In de eenvoudigste systemen wordt er gebruik gemaakt van wilde populaties. Dit is
enkel mogelijk in gebieden waar de vlieg heel het jaar rond te vinden is (Alvarez, 2012). Een
toepassing hiervan is het gebruik van prepoppen in een gelaagde kooien kippenstal. Dit werd
onderzocht door Sheppard et al. (1994), er werd gesteld dat de vliegen onder deze
omstandigheden jaarlijks 0,6 kg prepoppen per hen produceren. Het mestvolume wordt hierbij
met de helft gereduceerd en er is een reductie in de totale stikstofconcentratie van 24% (Sheppard
et al., 1994). De geoogste prepoppen hebben een eiwitgehalte van 42% en een vetgehalte van
35%. Dit maakt hen geschikt als voeding voor verschillende dieren zoals varkens, kippen en
vissen (Sheppard et al., 1994). Het gebruik van deze prepoppen in het dieet van meerval en
tilapia had geen effect op het lichaamsgewicht en de totale lengte van de vissen in vergelijking
met een conventioneel eiwitrijk dieet. Er werd ook geen invloed gevonden op de smaak en
textuur van de vis (Bondari & Sheppard, 1981). In onderzoek van Newton et al. (1977) werd geen
verschil vastgesteld in de groei en ontwikkeling van varkens indien deze gevoed werden met de
prepoppen van de zwarte wapenvlieg of met een op soja gebaseerd dieet. Er werd zelfs een
voorkeur van de varkens vastgesteld voor de prepoppen.
Een nutritionele analyse toont aan dat de prepoppen nutritioneel gelijkaardig zijn aan een soja
maaltijd toegediend aan varkens (Booram et al., 1977). De nutritionele samenstelling van het
insect is echter sterk afhankelijk van het dieet en het ontwikkelingsstadium. Uit een onderzoek
van St-Hilaire et al. (2007) blijkt het dieet een effect te hebben op het vetgehalte van de
prepoppen. Prepoppen die gevoed werden met 10% visafval bevatten ongeveer 43% meer vetten
dan wanneer de prepoppen gevoed werden met koemest zonder visafval. Ook het eiwitgehalte
wordt beïnvloed door het dieet (De Graeve et al., 2014).
Sheppard (1983) verklaart dat de aanwezigheid van de zwarte wapenvlieg de populatie van de
huisvlieg, Musca domestica (L.), met 94 tot 100% kan reduceren. De huisvlieg komt
voornamelijk voor in de buurt van veestallen en ontwikkelt zich op de mest. De vlieg wordt
beschouwd als een plaagorganisme aangezien ze ook woningen binnendringt en enkele dier- en
menspathogenen kan overdragen (Tomberlin, 2001).
Tot slot kunnen de larven van de zwarte soldatenvlieg gebruikt worden voor de aanmaak van
biodiesel. Het vet geëxtraheerd van restaurantafval wordt gezien als een potentiële grondstof voor
Literatuurstudie
|4
de productie van biodiesel. De lage prijs van het product kan de productiekost van biodiesel
reduceren. Er blijft na de vetextractie van het restaurantafval echter een grote hoeveelheid
restfractie over. Deze fractie is rijk aan zetmeel, vet, eiwitten, vezels en is geschikt als dieet voor
de larven van de zwarte wapenvlieg. Uit een onderzoek van Zheng et al. (2012) blijkt dat deze
biodieselopbrengst wordt verdubbeld wanneer ook de larven van de zwarte wapenvlieg, die zich
voeden op de restfractie van de vetextractie, gebruikt worden als grondstof voor
biodieselproductie.
2. Voortplantingspotentieel van de zwarte wapenvlieg
2.1 Paring en ei-afleg (fecunditeit)
Tomberlin (2001) beschrijft het paringsgedrag van de zwarte wapenvlieg. Zijn onderzoek vond
plaats rond een kippenboerderij in Georgia (VS) waar op twee plaatsen een groot aantal vliegen
werden teruggevonden: binnenin de kippenboerderij, waar de larven voorkomen, en aan een
bosrand 10 tot 15m verwijderd van de boerderij. De meerderheid (91%) van de verzamelde
adulten aan de bosrand waren mannetjes terwijl de vrouwtjes voornamelijk voorkwamen
binnenin de kippenboerderij (91% van geobserveerde vliegen). De mannetjes aan de bosrand
waren voornamelijk individuen zittend op het bladoppervlak. Het rustende mannetje werd actief
wanneer er soortgenoten aanwezig waren in zijn omgeving (vb indien ze landden op hetzelfde
blad). Is de indringer een ander mannetje dan beginnen de 2 mannetjes te worstelen (een
kronkelende verticale beweging 0,5 m boven het blad). Het winnende mannetje keert terug naar
het blad, terwijl de verliezer de omgeving verlaat.
Gelijkaardig gedrag werd teruggevonden bij andere
Stratiomyidae soorten. Dit fenomeen wordt
gedefinieerd als territoriaal of “lekking” gedrag
(Alcock, 1990). De plaatsen met hoge aantallen
mannetjes trekken paarrijpe wijfjes aan. Begeeft een
wijfje zich in de omgeving van een mannetje dan
Figuur 2: Paring van de zwarte wapenvlieg.
grijpt het mannetje haar vast in de lucht, daalt neer en
copuleert (Figuur 2). Dit gedrag werd niet waargenomen binnenin de boerderij.
De paring wordt beïnvloed door omgevingscondities, voornamelijk zonlicht, en vindt plaats 2
dagen na het uitkomen van de vliegen. Worden de vliegen gehouden in een kamer met artificieel
licht bij 22°C en 60-70% relatieve vochtigheid dan vindt er geen paring plaats, er worden
onbevruchte eitjes afgelegd. Eens de vliegen worden blootgesteld aan direct zonlicht bij dezelfde
condities worden er parende koppeltjes geobserveerd en bevruchte eitjes afgelegd (Tomberlin,
2001). De ogen van de mannetjes kunnen gevoelig zijn voor specifieke golflengten aanwezig in
zonlicht maar niet in artificieel licht. Dit is het geval bij de zwarte vlieg Cnephia dacotensis. De
ommatidia in hun ogen zijn gespecialiseerd in het detecteren van de ultraviolette golflengtes, die
overvloedig aanwezig zijn in zonlicht (Gates, 1980).
Literatuurstudie
|5
De zwarte wapenvlieg legt selectief haar eitjes af in droge spleten
dichtbij vochtige bronnen zodat de ontloken larven makkelijk en
snel hun weg kunnen vinden naar een voedingsbron (Figuur 3)
(Booth & Sheppard, 1984). Wijfjes paren eenmalig en leggen
eenmalig een ei-cluster af in de spleten. Een cluster bestaat uit
verschillende lagen eitjes en neemt de vorm aan van de spleet. De
clustervorm en -grootte wordt in grote mate bepaald door het
ovipositiesubstraat. Is er geen substraat, dan leggen de wijfjes
losse sferische ei-clusters af bestaand uit verschillende laagjes. Figuur 3: De ei-afleg in spleten
Het leggen van eitjes in clusters heeft het voordeel dat bij droogte de buitenste laag eitjes
uitdroogt en zo de binnenste eitjes beschermt (Holmes, 2010).
Volgens een onderzoek van Booth & Sheppard (1984) bevat een ei-cluster gemiddeld 998 eitjes
en weegt een cluster gemiddeld 29,1 mg. Het individueel ei-gewicht bedraagt gemiddeld 0,028
mg. Gonzalez et al. (1963) melden dat een ei-cluster tussen de 119 tot 502 eitjes bevat en volgens
een onderzoek van Stephens (1975) bestaat een cluster uit 205 tot 820 eitjes. Booth en Sheppard
(1984) verklaren deze verschillen in aantal eitjes per cluster door geografische en seizoenale
verschillen, de nutritionele conditie van het wijfje en het verschil in bemonsteringsmethode. Uit
een onderzoek van Tomberlin (2001) blijkt dat het aantal eitjes in een cluster afhankelijk is van
de grootte van de spleet waarin de cluster wordt afgelegd. In een smalle spleet (1 x 3mm) werden
gemiddeld 431 eitjes teruggevonden, terwijl in een grote spleet (2 x 5mm) gemiddeld 1157 eitjes
werden afgelegd. Het gemiddelde gewicht van de eitjes was niet significant verschillend tussen
de twee spleetgroottes. Meerdere wijfjes kunnen hun eitjes afleggen in dezelfde spleet, dit kan het
aantal eitjes per cluster verhogen. Uit dissecties 2 dagen na het paren concludeerde Tomberlin
(2001) dat het aantal eitjes per wijfje reikt van 323 tot 621.
2.2 Invloed van gewicht op de fecunditeit
Wijfjes van de meeste koudbloedige diersoorten hebben over het algemeen een grotere
lichaamsomvang (met daaraan gekoppeld een zwaarder gewicht) dan mannetjes, dit wordt
seksueel dimorfisme genoemd (Preziosi & Fairbairn, 1996). Darwin (1874) verklaart deze
evolutie naar grotere vrouwtjes, in het “fecunditeitvoordeel” model, aan de hand van de relatie
tussen lichaamsgrootte van de wijfjes en een verhoogde eiproductie. Het verschil in
lichaamsgrootte heeft voor sommige diergroepen nog andere voordelen. Bij insecten zorgt het
verschil in lichaamsgrootte ervoor dat de kleine mannetjes vroeger ontluiken dan de grotere
wijfjes. Dit stelt de mannetjes in staat om meteen te paren met de pas uitgekomen wijfjes
(Darwin, 1874). Het “fecunditeitvoordeel” model, de evolutie naar grotere wijfjes, vraagt één
voorwaarde: de fecunditeit (broedgrootte) moet vergroten met de lichaamsgrootte van de wijfjes.
Is deze voorwaarde vervuld, dan zorgen grotere wijfjes voor meer nakomelingen dan kleine
wijfjes, met andere woorden er worden meer genen doorgegeven die zorgen voor een grotere
|6
Literatuurstudie
lichaamsbouw. Dit resulteert in een stijging van het aandeel genen voor grotere lichaamsgrootte
in de populatie (Shine, 1988).
Voor de meeste invertebraten wordt de stijging van fecunditeit met toenemende lichaamsgrootte
aanvaard (Preziosi & Fairbairn, 1996; Shine, 1988). Honĕk (1993) onderzocht of er onder
constante omgevingscondities een algemene relatie bestaat tussen lichaamsgrootte en fecunditeit.
In Tabel 1 worden enkele voorbeelden van correlaties tussen fecunditeit en lichaamsgrootte
weergegeven die Honĕk (1993) gebruikt heeft om zo een algemene relatie op te stellen. Een
positieve hellingsgraad geeft weer dat er een positieve correlatie bestaat tussen het gewicht en de
fecunditeit. Met andere woorden, zwaardere wijfjes hebben de mogelijkheid om meer eitjes te
produceren. De algemene correlatie wordt gegeven door de vergelijking:
fecunditeit = 0,954 ∗ gewicht + 0,867
De algemene hellingsgraad benadert de waarde 1. Dit geeft weer dat er een lineaire correlatie
bestaat tussen het gewicht van de wijfjes en de fecunditeit. Er moet echter wel opgemerkt worden
dat Honĕk (1993) aanneemt dat de ei-grootte niet verschilt met de grootte van de wijfjes. Dit is
het geval voor sommige soorten maar zeker niet algemeen (Richards & Myers, 1980; Larsson,
1990; McLain, 1991)
Tabel 1: Lijst van insectensoorten gebruikt om de algemene correlatie tussen het
gewicht en fecunditeit te bepalen.
Orde
Soort
Helling
N
M
0,985
5
T
Diptera Aedes sierrensis
(Ludlow)
Aedes triseriatus
0,356
8
L
(Say)
Agromyza frontella 1,145
5
L
(Rondani)
Anopheles claviger 0,788
9
L
Meigen
Anopheles messae
1,031
8
L
Falleroni
Culicoides melleus 1,164
7
L
(Coquillett)
Culicoides
1,614
3
T
variipennis
Eucelatoria bryani 1,297
6
L+D
Sabrosky
Lucilia cuprina
0,759
6
D
(Wiedemann)
Metasyrphus
0,862
4
L
corollae (F.)
Thecodiplosis
1,004
6
L
japonsis Uchida
N: aantal intervallen waarin het lichaamsgewicht werd opgedeeld; M: de methode waarmee de
fecunditeit werd bepaald; D: dissectie; L: Levenslange fecunditeit bepaald onder standaard
condities; T: Fecunditeit bepaald voor slechts een periode van de ovipositie (Honĕk,1993).
Literatuurstudie
|7
De makkelijkste verklaring voor de positieve correlatie tussen fecunditeit en lichaamsgrootte is
dat grotere wijfjes meer plaats hebben in hun lichaam om eitjes te stockeren en meer middelen
hebben om deze eitjes te produceren (Preziosi & Fairbairn, 1996; Shine, 1988). Deze verklaring
gaat enkel op indien de wijfjes voldoende energie voorhanden hebben om de volledige ruimte op
te vullen met eitjes. Wat enkel mogelijk is als de energieopname stijgt met de grootte van de
wijfjes en als de energievoorraad niet gelimiteerd is. Is er een beperking aan energie of
nutriënten, dan staat het wijfje voor een keuze: ofwel energie investeren in groei ofwel in
reproductie. Hieruit kan besloten worden dat het “fecunditeitvoordeel” model enkel kan toegepast
worden op dieren die niet beperkt worden in hun energie-inname (Shine, 1988).
De positieve correlatie tussen lichaamslengte/gewicht en fecunditeit is goed gedocumenteerd,
(Tabel 1). Maar er zijn ook studies die aantonen dat er geen effect is of zelfs een negatieve
correlatie bestaat tussen de lichaamslengte en fecunditeit. Dit betekent dat de groter-hoe-betertheorie niet opgaat voor alle soorten (Jiménez-Pérez & Wang, 2004). Darwin (1874) beweert in
zijn “fecunditeitvoordeel” theorie dat er een evolutie is naar grotere wijfjes. Echter, organismen
kunnen niet blijven vergroten en er is waarschijnlijk een limiterende of optimale grote. Deze
“stabiliteits seksuele selectie” theorie voorspelt dat zwaardere individuen niet altijd een betere
reproductiviteit hebben ten opzicht van gemiddelde of lichtere organismen van dezelfde soort
(Jiménez-Pérez & Wang, 2004). Dit is het geval bij de grasmot Parapediasia teterella. De
reproductie is positief gecorreleerd met het gewicht bij wijfjes indien het gewicht onder het
populatiegemiddelde ligt. Eens boven dat gemiddelde is er een negatieve relatie (Marshall,1990).
Uit een onderzoek van Jiménez-Pérez & Wang (2004) blijkt dat de lichte wijfjes van de bladroller
Cnephasia jactatana een lagere fecunditeit behalen dan de gemiddelde en zware wijfjes. Wat
opvalt is dat de fecunditeit lineair stijgt binnen de groep van de lichte en gemiddelde wijfjes,
zoals Honĕk (1993) voorspelt, terwijl bij de zware wijfjes geen stijging van de fecunditeit wordt
vastgesteld binnen de groep. Dit suggereert dat het voordelig effect van de zwaardere wijfjes een
bovengrens heeft en er dus een optimaal gewicht is (Jiménez-Pérez & Wang, 2004).
2.3 Ander factoren die fecunditeit beïnvloeden
De fecunditeit van insecten wordt beïnvloed door zowel genetische als omgevingsfactoren. De
paring, de omgevingstemperatuur, de kwaliteit en kwantiteit van het larvaal dieet, de kwaliteit en
kwantiteit van het volwassen dieet, de populatiedensiteit, de leeftijd van het wijfje, het
ovipositiesubstraat en de fotoperiode zijn de voornaamste omgevingsfactoren die een invloed
hebben op de ei-afleg van een wijfje (Zvereva & Zhemchuzhina, 1988).
2.3.1 Ovipositieplaats
Wijfjes kunnen kieskeurig zijn in verband met hun keuze van ovipositieplaats (Ward et al., 1999).
Ovipositieplaats en -substraat moeten de optimale nutritionele en structurele condities voorzien
voor de ontwikkeling van de nakomelingen. De huisvlieg M. domestica legt het liefst haar eitjes
af in spleten en gaten dichtbij een substraat met een goed vochtgehalte en gelegen in de schaduw.
Literatuurstudie
|8
Ook de vlieg Scathophaga stercoraria heeft een voorkeur voor bepaalde structurele
oppervlakken. Zo zal ze haar eitjes voornamelijk afleggen op heuveltjes op de mest,
waarschijnlijk om bescherming te bieden tegen ongunstige condities zoals uitdroging en
overstroming (Ward et al., 1999).
2.3.2 Temperatuur
Carroll & Quiring (1993) onderzochten de invloed van temperatuur, en de interactie met de
lichaamsgrootte, op de fecunditeit van de mot Zeiraphera canadensis. Uit het onderzoek blijkt
dat de grootte-fecunditeit relatie verschilt voor verschillende temperatuurregimes. De fecunditeit
steeg lineair met de grootte, zoals beschreven door Honĕk (1993), indien het wijfje gehouden
werd bij een constant temperatuurregime van 10, 15 of 20°C. Indien de wijfjes werden
blootgesteld aan een constant regime van 25°C of een niet constant temperatuurregime, werd er
een daling in fecunditeit vastgesteld, voornamelijk bij de grotere wijfjes. Deze verlaagde
fecunditeit van de grotere wijfjes wordt toegeschreven aan de verlaagde levensverwachting bij
hoge temperaturen. Hoge temperaturen zorgen eveneens voor een verhoogde verhouding van niet
levensvatbare versus levensvatbare eitjes. Een verhoogde abdominale temperatuur zou de eitjes
kunnen beschadigen en een negatieve invloed hebben op de bevruchting (Caroll & Quiring,
1993). Deze stress bij hoge temperaturen geeft ook een verlaagde fecunditeit bij bladmineerder,
Liriomyza trifolii. De fecunditeit bij 35°C werd verlaagd tot de helft van de maximale fecunditeit
bij 25°C. Bij een lage temperatuur van 15°C werd de fecunditeit eveneens verlaagd, wat aangeeft
dat deze temperatuur dicht bij de onderste drempeltemperatuur voor de activiteit ligt (Leibee,
1984). Nunney & Cheung (1997) onderzochten de invloed van temperatuur op het drogestofgehalte van Drosophila melanogaster. Wijfjes gehouden bij 18°C hadden een 12% hoger
drogestofgehalte in vergelijking met de wijfjes gehouden bij 25°C. Ook Atwal (1955) noteerde
een daling van grootte van de wijfjes met de stijgende temperatuur bij de mot Plutella
maculipennis. Terwijl Nunney & Cheung (1997) geen verschil in fecunditeit opmerken is er
volgens Atwal (1955) wel een daling van fecunditeit met stijgende temperatuur, gelinkt aan een
lager gewicht.
2.3.3 Populatiedichtheid
Een hoge populatiedensiteit, typisch voor een massakweek, heeft een negatief effect op de
fecunditeit. Door de zeer hoge aantallen tijdens het larvale stadium is de toegang tot voedsel
gelimiteerd. De beperking in voeding heeft een negatief effect op de grootte van de volwassen
insecten, wat dan op zijn beurt de fecunditeit beïnvloedt. De invloed van hoge densiteit werd
zowel teruggevonden in het veld als in het labo (Čičková et al., 2011). Een verhoging in de
dichtheid van wollige beukluizen, Cryptococcus fagisuga, in het veld veroorzaakt een verlaging
van het aantal geproduceerde eitjes (Wardhaugh & Didham, 2005). Ook bij de huisvlieg, M.
domestica is er sprake van een negatief effect op de individuele ei-afleg bij een verhoogde
densiteit. In een kooi met 500 poppen worden er per wijfje 447 eitjes afgelegd terwijl in een kooi
Literatuurstudie
|9
met 2000 poppen er per wijfje slechts 264 eitjes worden afgelegd. Ondanks dit negatief effect
wordt er in massakweken toch met hoge densiteit gewerkt want de totale opbrengt aan eitjes ligt
hoger (Čičková et al., 2011).
3. Insecten bij lage temperaturen
3.1 Koudetolerantie
In gematigde gebieden is koude een van de grootste omgevingsobstakels die insecten moeten
overwinnen om te overleven. Insecten kunnen twee methoden gebruiken om schade door koude
te voorkomen. Migrerende insecten, zoals de monarchvlinder (Danaus plexippus) in NoordAmerika, migreren over een grote afstand om de koude temperaturen te vermijden. De meeste
soorten uit gematigde gebieden overwinteren door hun niveau in koudetolerantie te verhogen.
Ook tropische soorten, die van nature niet blootgesteld worden aan lage temperaturen, kunnen de
capaciteit hebben om hun koudetolerantie te verhogen (Fields et al., 1998).
Koudetolerantie wordt beschreven als de capaciteit van een organisme om zowel een chronische
als een acute blootstelling aan koude temperaturen te overleven. Deze capaciteit varieert en is
afhankelijk van het ontwikkelingsstadium, het seizoen, de nutriëntenstatus en de tijd van de
blootstelling (Lee, 1989).
Over het algemeen wordt aanvaard dat overwinterende insecten twee strategieën gebruiken om te
overleven bij vriestemperaturen: vriestolerantie en vriesontwijking (vriesintolerantie).
Vriesintolerante soorten kunnen de bevriezing van hun lichaamsvloeistof niet verdragen. Ze
moeten voorkomen dat er zich ijskristallen in hun lichaam vormen. Vriestolerante soorten
weerstaan de vorming van ijskristallen in hun lichaam (Lee & Denlinger, 1991). Het fenomeen
waarbij de lichaamsvloeistof in een vloeibare vorm blijft bij een temperatuur onder de
vries/smelttemperatuur wordt onderkoeling genoemd. Het onderkoelingspunt verwijst naar de
minimale temperatuur tot waar een insect kan gekoeld worden alvorens er spontane ijsvorming
optreedt (Lee et al., 1996). In theorie is het onderkoelingspunt voor vriesintolerante soorten de
limiterende temperatuur (Lee & Denlinger, 1985). Echter de 10 tot 110 dagen oude poppen in
diapauze van de vlieg Sarcophaga crassipalpis hebben een onderkoelingspunt van -23°C.
Ondanks het constante onderkoelingspunt van de poppen is het niveau van koudehardheid niet
constant tijdens de verpopping. Het blootstellen van 10 dagen oude poppen aan -17°C voor een
periode van 7 dagen geeft een mortaliteitspercentage van 75% terwijl de mortaliteit van 20-80
dagen oude poppen slechts 15% bedraagt (Lee & Denlinger, 1985). Het onderkoelingspunt is de
limiet van de fysische processen van superkoeling, niet noodzakelijk (maar mogelijk) de limiet
van overleving.
Bale (1993) bekritiseert het erkennen van slechts twee strategieën van koudehardheid. Door de
grote variabiliteit, in observaties van insecten bij lage temperaturen, is er nood aan een meer
specifieke definitie van de termen vriestolerantie en vriesintolerantie. Bale (1996) verdeelt
Literatuurstudie
| 10
koudehardheid op in 5 nieuwe groepen: vriestolerant, vries-ontwijkend (vriesintolerant),
koeltolerant, koelvatbaar en opportunistische overleving (Figuur 4). De opdeling wordt gemaakt
afhankelijk van de limieten van hun koudetolerantie. Met andere woorden de omstandigheden
waarbij ze sterven en niet aan de hand van de aanpassingen die nodig zijn om te overleven.
Figuur 4: Relatie tussen het onderkoelingspunt (OKP) en de lage letale temperatuur (LLT) voor de
verschillende categorieën van koudetolerantie (Sinclair, 1999).
3.1.1 Vriestolerante soorten
Vriestolerante insecten zijn de meest winterharde insecten en komen voor in delen van de wereld
met de strengste winters. Ze kunnen extracellulaire bevriezing verdragen. De meeste
vriestolerante soorten synthetiseren in de late herfst en vroege winter ijskernvormers (“ice
nucleating agents” (INA’s)). INA’s doen dienst als vriesplaatsen (Bale, 1996). De INA’s
promoten een veilige extracellulaire bevriezing bij hogere sub-zero temperaturen (-5° tot -10°C),
wat zorgt voor een vertraging in ijsvormingssnelheid. Dit laat het insect toe om zich aan te passen
aan osmotische en mechanische stress (Lee et al., 1996). Vriestolerante soorten bevatten ook nog
andere biochemische componenten zoals cryoprotectants en antivrieseiwitten deze worden
beschreven in DEEL I: 3.3.2 Factoren die het onderkoelingspunt positief beïnvloeden:
cryoprotectants (glycerol) en antivrieseiwiten.
| 11
Literatuurstudie
Sinclair (1999) deelt de vriestolerante soorten verder op in vier groepen aan de hand van hun
onderkoelingspunt (OKP) en hun lage letale temperatuur (LLT, temperatuur waarbij het insect
sterft bij acute blootstelling) (Tabel 2).
De eerste groep bestaat uit de partieel vriestolerante soorten. Partieel vriestolerante insecten
kunnen de vorming van enkele ijskristallen in hun lichaam overleven. Bereikt de vorming van
ijskristallen een evenwicht bij het onderkoelingspunt, dan sterven ze af. Partiële vriestolerante
soorten bevriezen aan relatief hoge temperaturen en sterven als hun lichaamstemperatuur in
evenwicht is met de omgevingstemperatuur. Enkel als ze halverwege het vriesproces terug
opgewarmd worden kunnen ze overleven.
Gematigde vriestolerante soorten bevriezen bij temperaturen relatief dicht bij 0°C en sterven bij
minder dan tien graden onder hun onderkoelingspunt. Eens bevroren kunnen ze lange perioden
overleven. Bij gematigde vriestolerante soorten zitten er geen grote temperatuurverschillen tussen
het onderkoelingspunt (temperatuur waarbij ze bevriezen) en hun lage letale temperatuur.
Dit is wel het geval bij sterk vriestolerante soorten. Deze bevriezen aan relatief hoge
temperaturen (-7,8°C) maar sterven pas bij temperaturen 30 graden lager dan hun
onderkoelingspunt.
De vierde groep bestaat uit de vriestolerante soorten met een laag onderkoelingspunt. Deze groep
bestaat uit soorten met extreem lage onderkoelingspunten (-25°C en lager) maar sterven reeds
enkele graden onder hun onderkoelingspunt.
Tabel 2: vriestolerante soorten van de orde Diptera
Orde
Familie
Soort
Ontwikkelingsstadium Habitat
Bibio
Larve
In bodem, Japan
Diptera Bibionidae
rufiventris
Sciaridae
Sciara sp.
Prepop
In stam, Japan
Syrphidae
Syrphus
Larve
In bladafval,
ribesii
Groot-Brittannië
Tephritidae
Eurosta
Larve
In gallen, Noord
solidaginis
Amerika
Tipulidae
Tipula excisa Larve
Middengebergte,
Noorwegen
Tipula
Larve
Gebergte,
montana
Groot-Brittannië
Mycetophilidae Mycetophila
Adult
Onder stronk
sp.
OKP LLT Groep
-3
-10
g
-4,2
-6,8
-15
-35
g
s
-6
-50
s
-4,8
-4,8
p
-4,7
-4,7
p
-33
-40
l
Groepen gedefinieerd als m= gematigd vriestolerant, s= sterk vriestolerant, p= partieel vriestolerant en l=
vriestolerante soort met laag onderkoelingspunt. OKP= onderkoelingspunt, LLT= lage letale temperatuur (Sinclair,
1999).
3.1.2 Vriesintolerante soorten
Vriesvermijdende soorten (of vriesintolerante soorten) overleven bij negatieve temperaturen
zolang er geen bevriezing van het lichaamsvloeistof optreedt (Bale, 1996). Overwinterende
larven van de galmot Epiblema scuderiana hebben een onderkoelingspunt van -35 tot -40°C. Bij
Literatuurstudie
| 12
een minimum temperatuur van -26°C in de winter bedraagt het overlevingspercentage 90%. Een
wintertemperatuur van minimum -18°C voor ongeveer 200 dagen leverde een
overlevingspercentage van 100% op (Rickards et al., 1987). De mechanismen gebruikt door
vriesvermijdende soorten worden beschreven in DEEL I: 3.3.2 Factoren die het
onderkoelingspunt positief beïnvloeden. Vaak gaat dit gepaard met het verlagen van het
onderkoelingspunt. In deze groep kan het onderkoelingspunt gebruikt worden als een definitie
voor de koudehardheid.
3.1.3 Koeltolerante soorten
De koeltolerante categorie bevat soorten met een uitgebreide onderkoelmogelijkheid en hoog
niveau van koudehardheid. Anders dan vriesvermijdende soorten is er bij koeltolerante soorten
wel een mogelijke sterfte boven het onderkoelingspunt. Deze sterfte vergroot met dalende
temperaturen en met langere periode van blootstelling (Bale, 1996). De mijt Alaskozetes
antarcticus is een polaire soort en heeft een onderkoelingspunt van -30°C. Er is een sterfte van
27% als de mijten worden blootgesteld aan -20°C voor een periode van 100 dagen (Cannon,
1987). Ook de kever Rhynchaenus fagi heeft een laag onderkoelingspunt van -25°C. Ondanks dit
lage onderkoelingspunt is er een sterfte van 75% indien de kever wordt blootgesteld aan -15°C
voor een periode van 50 dagen (Bale, 1991). Beide soorten hebben een tamelijke koudehardheid
maar verschillen in overleving bij temperaturen net boven het onderkoelingspunt. De mijt A.
antarcticus met een hoog overlevingspercentage bij temperaturen net boven het
onderkoelingspunt, behoort tot de hoge koeltolerante groep. Deze groep bevat soorten die
beschermd zijn tegen extreem lage luchttemperaturen door bijvoorbeeld sneeuwbedekking, maar
eveneens kunnen overleven bij temperaturen van -5° tot -15°C voor verscheidende maanden.
Soorten met een grote koudehardheid, maar met een hoog sterfpercentage bij temperaturen net
boven het onderkoelingspunt, zoals de kever R. fagi, worden gedefinieerd als matig koeltolerant
(Bale, 1996).
3.1.4 Koelvatbare soorten
De aseksuele klonen van verschillende bladluissoorten zijn de meest onderzochte soorten binnen
de koelvatbare categorie. Tot deze categorie behoren soorten, vaak uit gematigde klimaten,
waarvan de zomerpopulaties zeer sterk afhankelijk zijn van de strengheid van de voorgaande
winter. Dit suggereert dat de koudehardheid van de koelvatbare soorten minder goed ontwikkeld
is dan in de andere categorieën (Bale, 1996). Bladluizen kunnen overwinteren als actieve
aseksuele individuen, of als eieren van seksuele individuen. Overwinterende adulte bladluizen
zijn minder koudehard dan de overwinterende eitjes (Strathdee et al., 1995). Volwassen
nakomelingen van de aseksuele individuen (vb. Myzus persicae) hebben een onderkoelingspunt
van -24°C. Worden deze bladluizen gekoeld en blootgesteld aan sub-zero temperaturen boven het
onderkoelingspunt is er een snelle stijging in sterfte. De LT50-waarde (temperatuur nodig om
Literatuurstudie
| 13
50% van de populatie af te doden) bedraagt voor adulten van M. persicae -6,9°C. Er is dus een
groot verschil tussen het onderkoelingspunt en de letale temperatuur.
3.1.5 Soorten met een opportunistische overleving
De hoge en stabiele temperaturen in tropische en subtropische gebieden laten een continue
reproductie en ontwikkeling toe. Insecten afkomstig van deze klimaatzones hebben een
gebrekkige koudehardheid en zijn niet in staat te overleven bij temperaturen onder nul. Deze
soorten worden ingedeeld in de opportunistische overlevingscategorie, ze leiden aan koudeschade
en sterven bij te lage temperaturen die normale metabolische activiteit niet toe staan (Bale, 1996).
Worden de poppen van de huisvlieg M. domestica blootgesteld aan 0°C voor een periode van 4
dagen, dan is er een sterfpercentage van 90% (Coulson & Bale, 1990). De overleving daalt
drastisch tot 2,5% als men de poppen houdt bij 0°C voor een tijd van 8 dagen (Sømme, 1961).
Opportunistische overlevers kunnen enkel een winterseizoen overleven indien ze een warme
plaats vinden.
3.2 Mechanismen van bevriezing bij insecten
Bij bevriezing vindt de vorming van ijskristallen plaats. Hierbij is er nood aan een initiële kern
waarrond watermoleculen zich kunnen aggregeren tot er een kritische grootte is bereikt. Bestaat
deze kern enkel uit watermoleculen, wordt het proces “homogene ijsvorming” genoemd. De kans
dat een kern met een kritische grootte gevormd wordt, stijgt met dalende temperaturen (Lee &
Denlinger, 1991). In de meeste biologische systemen fungeert een ander bestanddeel dan water
(bijvoorbeeld stofdeeltjes) als kern waarrond watermoleculen zich kunnen aggregeren, wat
“heterogene ijsvorming” wordt genoemd. Heterogene ijsvorming treedt voornamelijk op bij
hogere temperaturen.
Vriesintolerante soorten hebben de mogelijkheid om pas te bevriezen bij lage temperaturen
dankzij hun hoge onderkoelingscapaciteit. Dit geeft aan dat ijsvormingskernen, “ice nucleating
agents” (INA’s), niet veelvuldig teruggevonden worden of hun werking verstoord wordt door de
aanmaak van antivrieseiwitten. Het legen van de maag is een mechanisme die veelvuldig
gebruikt wordt door vriesintolerante soorten om INA’s te verwijderen (Duman, 2001).
Bijvoorbeeld bij de behangersbij Megachile rotundata wordt de maag geledigd waardoor het
onderkoelingspunt met 20°C wordt verlaagd (Krunic & Radovic, 1974). Zoals eerder vermeld
worden INA’s wel teruggevonden bij de meeste vriestolerante soorten, waardoor een veilige
extracellulaire bevriezing kan plaatsvinden (Lee & Denlinger, 1991).
Het is algemeen geweten dat het overleven van bevriezing enkel mogelijk is als de ijsvorming
zich beperkt tot extracellulaire ruimten (Mazur, 1984) (Figuur 5). Is er ijsvorming in
extracellulaire vloeistoffen dan nemen enkel watermoleculen deel aan de ijsvorming. Dit zorgt
voor een stijging van de osmotische concentratie in de onbevroren waterfractie van het
extracellulair water. De gevormde hypertonische stress en verstoring van de osmotische balans,
resulteren in een graduele verwijdering van water uit de naburige cellen. Dit bevordert de
| 14
Literatuurstudie
onderkoeling van het cytoplasmatisch water, wat intercellulaire ijsvorming voorkomt. Als de
lichaamstemperatuur daalt, wordt er meer ijs gevormd en worden cellen meer gedehydrateerd
(Lee et al., 1996).
Figuur 5: Schematische weergave van de
biochemische componenten die een rol
spelen tijdens de bevriezing van een cel
(IVN, 2016).
3.3 Regulatie van de onderkoelingscapaciteit
Vriesintolerante soorten verhogen hun onderkoelingscapaciteit in de winter waardoor de kans op
bevriezing afneemt, terwijl het verlagen van de superkoelingscapaciteit de vriestolerante soorten
beschermt tegen koudeschade (Lee & Denlinger, 1991). Verschillende factoren spelen een rol in
de regulatie van de onderkoelingscapaciteit: ijskernvormende eiwitten, antivrieseiwitten,
ijskernvormende bacteriën, inoculatieve bevriezing en de opeenstapeling van antivriesmoleculen
met een laag moleculair gewicht (glycerol). Deze factoren kunnen de onderkoelingscapaciteit
positief of negatief beïnvloeden afhankelijk of het insect koudetolerant is of koude-intolerant.
3.3.1 Factoren die het onderkoelingspunt negatief beïnvloeden: inoculatieve
bevriezing, ijskernvormende eiwitten en ijskernvormende micro-organismen
De bevriezing van vriestolerante insecten kan worden geïnitieerd door 2 mechanismen:
inoculatieve bevriezing door extern ijs of heterogene ijsvorming van de extracellulaire
lichaamsvloeistof d.m.v. niet-water kernen zoals ijskernvormende eiwitten, kristallijne
verbindingen en ijskernvormende actieve micro-organismen (Lee et al., 1996).
Inoculatieve bevriezing is het proces waarbij contact met extern ijs de bevriezing van de
lichaamsvloeistof initieert. Een aantal insecten zoals de prepoppen van Sciara rouwmuggen, die
geen ijskernvormende eiwitten bevatten, hebben inoculatieve bevriezing nodig om interne
ijsvorming te overleven. Is er geen contact met extern ijs dan treedt er onderkoeling op en sterven
ze bij spontane ijsvorming (Tanno, 1977).
Literatuurstudie
| 15
Ijskernvormende eiwitten zorgen ervoor dat er bevriezing van het extracellulaire water optreedt
bij relatief hoge temperaturen (-6 tot -10°C) (Lee et al., 1996). De eiwitten treden op als kernen
bij de heterogene ijsvorming, hierdoor wordt intercellulaire ijsvorming voorkomen. Duman
(2001) geeft de samenstelling van enkele ijskernvormende eiwitten weer, maar de structuur ervan
is nog niet helemaal gekend.
Er zijn ook kristallijne verbindingen gekend die fungeren als een ijskern bij de heterogene
ijsvorming. In een onderzoek van Lee et al. (1996) werd vastgesteld dat de grote kristallijne
sferen aanwezig in de buizen van Malpighi van de boorvlieg Eurosta solidaginis functioneren als
ijskernvormers waardoor ze de onderkoeling beïnvloeden. Hun capaciteit om ijskernen te vormen
is echter kleiner dan die van ijsvormende eiwitten.
Verschillende onderzoeken geven aan dat er ijskernvormende bacteriën en fungi aanwezig zijn in
het darmkanaal van insecten. Deze ijskernvormende bacteriën beschikken over de capaciteit om
de ijsvorming te katalyseren bij een temperatuur van -2°C (Lee et al., 1996). Verschillende
stammen van de ijskernvormende bacteriën Enterobacter taylorae en Enterobacter agglomerans
werden geïsoleerd uit de kevers Hippodamia convergens en Cerotoma trifurcata (StrongGunderson et al., 1990; Lee & Denlinger, 1991). In een onderzoek van Kaneko et al. (1991)
werden larven van de koolmot Plutella xylostella gevoed met radijszaad al dan niet geïnfecteerd
met de bacterie Erwinia herbicola. Deze bacterie bevat de capaciteit om ijskernen te vormen bij
hoge temperaturen. De larven gekweekt op de niet geïnfecteerde zaden produceerden poppen met
een lager onderkoelingspunt in vergelijking met de larven gekweekt op geïnfecteerde zaden.
3.3.2 Factoren die het onderkoelingspunt positief beïnvloeden: cryoprotectants
(glycerol) en antivrieseiwitten
Glycerol is het cryoprotectant (meestal polyolen en suikers met een laag moleculair gewicht) dat
het meeste voorkomt bij overwinterende insecten. De overwinterende larve van de wesp Bracon
cephi kan tot 5M glycerol produceren. Dit komt overeen met 25% van haar lichaamsgewicht
(Salt, 1961). Deze hoge waarden zijn eerder uitzonderlijk, meestal ligt het cryoprotectantgehalte
tussen 0,2 en 3M. Sorbitol, mannitol, trehalose, glucose en fructose zijn enkele andere polyolen
en suikers die werden teruggevonden bij overwinterende insecten (Duman, 1982). Sommige
insecten kunnen 2 of meer cryoprotectants produceren. De galvlieg Eurosta solidaginis
accumuleert glycerol, sorbitol en trehalose (Baust & Lee, 1981).
Sømme (1963) onderzocht het effect van glycerol op het onderkoelingspunt bij verschillende
insecten. Hij stelde vast dat de hoogste glycerolgehaltes overeenstemden met de laagste
onderkoelingspunten. Zo steeg het glycerolgehalte van de mier Camponotus herculeans van 0,4%
naar 5,8% nadat het insect werd gehouden bij 0°C voor een periode van 12 weken. Hierdoor
daalde het onderkoelingspunt van de mieren van -19,7°C naar -28,7°C. Ook Miller (1982) en
Zachariassen (1979) rapporteren een verhoging van de koudhardheid bij een stijgend
glycerolgehalte.
De glycerolaccumulatie is onderhevig aan seizoenale veranderingen. Glycerol accumuleert zich
tijdens de herfst. Bij insecten met een diapauze is er geen verlies aan glycerol (tijdens de winter)
Literatuurstudie
| 16
tot de diapauze is doorbroken (in de lente). Eens de diapauze doorbroken is, is de daling van het
glycerolgehalte afhankelijk van de temperatuur. Bij soorten zonder een diapauze kan het
glycerolgehalte opbouwen en afnemen op elk moment van het seizoen, afhankelijk van de
temperatuur (Sømme, 1963). Niet enkel de temperatuur heeft een invloed op de accumulatie van
glycerol (Baust & Lee, 1983). Volgens Baust & Edward (1979) beïnvloedt het dieet,
voornamelijk de koolstofbron, zowel de kwantitatieve als de kwalitatieve samenstelling van
cryoprotectants. Dit werd bevestigd door het onderzoek van Baust & Lee (1983) waarbij
verschillende populaties van de mug Belgica antarctica kwantitatief verschillende
cryoprotectantgehaltes produceerden. De muggen ontwikkelden in een identieke thermische
omgeving maar hadden toegang tot verschillende nutritionele bronnen.
De werking van cryoprotectants wordt toegeschreven aan colligatieve (afhankelijk van het aantal
deeltjes) eigenschappen m.a.w. ze is afhankelijk van de concentratie. Het effect van de
accumulatie van cryprotectants is dubbel zo groot voor het onderkoelingspunt dan voor het
vries/smeltpunt. Een daling van 1°C van het vriespunt stemt overeen met een daling van 2°C van
het onderkoelingspunt (Zachariassen, 1985). Desondanks kunnen er zich hoge concentraties
cryoprotectant accumuleren. De hoge concentraties zorgen voor een verhoogde osmotische druk
in het lichaamsvloeistof. Dit kan toxisch zijn bij temperaturen boven de vriestemperatuur en bij
actieve insecten (Duman & Horwath, 1983).
De overwinterende larven van de kever Meracantha contracta synthetiseren geen polyolen in de
winter. Toch ligt hun onderkoelingspunt in de winter lager dan in de zomer (De Vries & Lin,
1977). De kever produceert antivrieseiwitten die een verschil tussen het vries- en smeltpunt van
waterachtige oplossingen veroorzaken wat gedefinieerd wordt als een thermische hysterese. Het
hemolymfe van de kever bevriest in de winter bij ongeveer -5°C terwijl het smeltpunt 4°C hoger
ligt. Dit zorgt voor een verlaging van het onderkoelingspunt in de winter in vergelijking met het
onderkoelingspunt in de zomer.
Antivrieseiwitten worden meestal teruggevonden tijdens de wintermaanden of in lage
concentraties in de zomer. Hun concentratie verhoogt in de herfst en neemt terug af in de lente.
Deze jaarlijkse cyclus geeft aan dat de productie van antivrieseiwitten gecontroleerd wordt door
omgevingsfactoren die seizoenale veranderingen aangeven. Acclimatisatie aan koude
temperaturen en/of korte fotoperioden induceren de productie van antivrieseiwitten (Horwath &
Duman, 1982). De temperatuur waarbij de productie van antivrieseiwitten geïnduceerd wordt bij
Dendroides ligt tussen 10 en 15°C en de kritische fotoperiode ligt tussen 10L/14D en 11/13D bij
20°C.
Het verlies aan antivrieseiwitten in de lente kan zowel beïnvloed worden door de temperatuur als
de fotoperiode. Temperaturen van 20-23°C induceren een verlies van antivrieseiwitten bij
Tenebrio molitor onafhankelijk van de fotoperiode. Terwijl bij Meracantha een combinatie van
hoge temperatuur en lange fotoperioden nodig is om het verlies in eiwitten te induceren. Dit zorgt
voor een veiligheidssysteem zodat er geen verlies is totdat het gevaar van bevriezing geweken is (
Duman, 1977).
Literatuurstudie
| 17
De werking van antivries eiwitten steunt, in tegenstelling tot deze van cryoprotectants, op het
niet-colligatieve mechanisme (onafhankelijk van de concentratie). Hun mogelijkheid om het
onderkoelingspunt te verlagen hangt af van het vermogen om zich te binden aan een oppervlak
van een potentiële kern van een ijskristal. Deze binding belemmert de groei van het kristal. De
groei wordt pas terug voortgezet bij een verlaagde temperatuur (Duman, 2001).
Alhoewel de meeste insecten waarin antivrieseiwitten zijn teruggevonden behoren tot de
vriesintolerante soorten zijn er ook vriestolerante insecten die antivries eiwitten produceren. Het
is niet volledig duidelijk wat het voordeel is van de productie van antivrieseiwitten door
vriestolerante soorten. Een mogelijke verklaring is dat de antivrieseiwitten een rol spelen tijdens
de lente en de herfst. Tijdens deze periode zijn de insecten nog niet volledig koudehard, nog niet
vriestolerant, waardoor er schade door bevriezing kan optreden (Duman, 2001).
3.4 Koude-acclimatisatie en snelle koudehardheid
Sinclair & Roberts (2005) definiëren acclimatisatie als een langetermijn blootstelling van
individuele insecten aan temperaturen lichtjes lager dan de kweektemperatuur. Gaat het meer om
een acute blootstelling aan koude temperaturen dan spreekt men van een snelle
koudehardheidreactie. Het onderscheid tussen deze twee begrippen is wazig, beide veroorzaken
veranderingen in de membraaneigenschappen of -samenstelling (Loeschcke & Sørensen, 2005).
Wanneer een insect een koude-acclimatisatie ondergaat, wordt er een opeenvolging van
moleculaire en fysiologische gebeurtenissen geïntroduceerd. De snelle koudehardheidsreactie kan
kortweg een meer acute versie zijn van deze gebeurtenissen. Er moet wel opgemerkt worden dat
temperaturen waarbij snelle koudehardheid geïntroduceerd wordt dodelijk zijn wanneer ze
toegepast worden over een langere termijn.
3.4.1 Koude-acclimatisatie
Acclimatisatie aan koude temperaturen kan in insecten en andere koudbloedige organismen twee
types van reacties te weeg brengen. Sommige insecten vertonen een verhoogde activiteit en
stofwisseling bij een lagere temperatuur (Sømme, 1968). Na acclimatisatie is de kakkerlak
Blattella germanica actiever bij een bepaalde lage temperatuur dan zonder deze acclimatisatie.
Met andere woorden de kakkerlak kan, na een koude-acclimatisatie, zijn activiteitsdrempel
verlagen (Colhoun, 1960). Bij anderen wordt de mogelijkheid om extreme, lage temperaturen te
tolereren verhoogd (Sømme, 1968).
De invloed van koude-acclimatisatie op het onderkoelingspunt is gering. Šlachta et al. (2002)
stelden vast dat het verschil in onderkoelingspunt tussen geacclimatiseerde adulten van de
vuurwants Phyrrhocoris apterus en niet geacclimatiseerde adulten, met een OKP van -9,4 °C,
slechts 1°C bedraagt. Dit terwijl koude-acclimatisatie een grote invloed heeft op de overleving
van insecten bij koude temperaturen. Niet geacclimatiseerde Sitophilus granarius kevers, hebben
een LT50 (aantal dagen waarbij 50% van de populatie sterft) van 12 dagen en LT90 (aantal dagen
waarbij 90% van de populatie sterft) van 22 dagen bij 0°C. Worden de kevers langzaam gekoeld
Literatuurstudie
| 18
van 30°C naar 5°C dan verhogen ze hun LT50 en LT90 bij 0°C naar respectievelijk 40 en 68
dagen. Dezelfde trend werd ook teruggevonden bij de kever Cryptolestes ferrugineus waar de
LT50 bij 0°C steeg van 1,4 dagen bij niet geacclimatiseerde kevers naar 24 dagen bij
geacclimatiseerde kevers. De insecten verloren hun voordeel door de koude-acclimatisatie
wanneer ze terug werden geplaatst bij 30°C (Fields et al., 1998).
3.4.2 Snelle koudehardheid
Een insect dat beschikt over een snelle koudehardheidsrespons verwerft, indien het wordt
blootgesteld aan lage temperaturen voor een korte periode (van enkele minuten tot enkele uren),
een verhoogde weerstand tegen de nadelige gevolgen van lage temperaturen. Hierdoor bekomt
het insect een hoger overlevingspercentage bij temperaturen onder nul. De koudeharheid
verdwijnt even snel als dat het insect deze heeft verkregen, wanneer het terugkeert naar de hogere
kweektemperaturen (Danks, 2005). De larven die niet in diapauze zitten van de vlieg Sarcophaga
bulatta overleven een blootstelling aan -10°C voor een tijd van 2 uur meestal niet. Het
overlevingspercentage van de larven verdubbelt indien ze eerst 30 minuten lang bij een
temperatuur van 0°C worden gehouden. Dit verviervoudigt wanneer de larven een uur bij 0°C
worden geplaatst (Lee et al., 1987). Dezelfde resultaten werden bekomen door Lee et al. (2006)
waarbij de larven een overlevingspercentage behaalden van 64,5% indien ze eerst blootgesteld
werden aan 0°C en vervolgens aan -8°C, in beide gevallen voor een periode van 2 uur, terwijl
geen van de larven die direct onderworpen werden aan -8°C overleefden.
3.5 Koudetolerantie van de zwarte wapenvlieg
Het overwinteringsvermogen van de zwarte wapenvlieg werd reeds onderzocht via experimenten
rond het onderkoelingsvermogen en letale tijd (de periode waarbij een bepaald percentage van de
populatie sterft na blootstelling aan een bepaalde temperatuur) (Schildermans, 2015). Hieruit kon
worden geconcludeerd dat alle ontwikkelingsstadia van de soort intolerant zijn voor bevriezing.
Verder werd vastgesteld dat de soort extreem vatbaar is voor schade veroorzaakt door koude
(‘chilling injury’), aangezien geen van de geteste individuen overleefde bij langdurige
blootstelling aan 5°C. In deze studie werd echter geponeerd dat verschillende factoren, welke
verder onderzocht dienen te worden, een invloed zouden kunnen hebben op de koudehardheid
van de zwarte wapenvlieg.
| 19
DEEL II: MATERIAAL EN METHODEN
1. Algemene kweek van H. illucens
Het kweken en onderhouden van de H. illucens kolonie gebeurde onder
laboratoriumomstandigheden. Adulte vliegen werden gehouden in kweekkooien (30 x 30 x 30
cm) (BugDorm-1 Insect Rearing Cage), gelokaliseerd nabij de ramen in het laboratorium (voor
voldoende zonlicht). In elke kweekkooi werd een dichtheid van ± 200 vliegen gehanteerd. De
omgevingstemperatuur in het labo schommelde rond de 25 ± 2°C. Dagelijks werd er water
verneveld op de wanden van de kooien, zodat de vliegen voldoende water konden opnemen.
Verzamelde legsels werden in een klimaatkast geplaatst bij 27°C en 65% RV. Het basisdieet voor
de ontluikende larven bestond uit een kippenvoermengsel: 1/3 gemalen kippenvoerkorrels
(Aveve Legkorrel TOTAL 77) + 2/3 gedestilleerd water. De ontwikkelende larven werden om de
6 à 7 dagen bijgevoederd, telkens met 1000 g basisdieet. Voedering werd stopgezet wanneer een
eerste prepop werd opgemerkt. Gedurende de hele ontwikkeling werden de larven in het donker
gehouden in de klimaatkast bij 27°C en 65% RV. Prepoppen die zich ontwikkelden werden
geïsoleerd uit de emmers door ze zelfstandig te laten migreren. Aangezien prepoppen een
geschikt substraat nodig hebben voor succesvolle verpopping werden de verzamelde prepoppen
in een met potgrond (Perspotgrond Groententeelt, STRUCTURAL Type 0) gevuld
kweekschaaltje (SPL Life Sciences, Type Insect Breeding Dish; 10 x 4 cm) geplaatst. Waarna ze
in het donker in de klimaatkast bij 27°C en 65% RV werden geplaatst. Onder deze
omstandigheden duurde het ongeveer 14 dagen alvorens de eerste adulten ontpopten. Wanneer
reeds een groot aantal volwassen vliegen waren uitgekomen, werden de kweekschaaltjes
overgeplaatst in de kweekkooien (5-6 per kweekkooi).
2. De koudetolerantie van H. illucens
2.1 Bepaling van het onderkoelingspunt
Het onderkoelingspunt verwijst naar de minimale temperatuur tot waar een insect gekoeld kan
worden alvorens er spontane bevriezing optreedt (Lee et al, 1996). In theorie is het
onderkoelingspunt voor vriesintolerante soorten de limiterende temperatuur (Lee & Denlinger,
1985). De waarde kan zeer eenvoudig gemeten worden door gebruik te maken van een
thermokoppel dat de vrijgekomen warmte van de kristallisatie detecteert (Figuur 6) (Lee, 1989).
| 20
Materiaal & Methoden
Figuur 6: Het verloop van de lichaamstemperatuur tijdens
het onderkoelingsproces (Lee, 1989).
De onderkoelingspunten van de prepoppen van H. illucens werden bepaald
met behulp van een thermokoppel datalogger (Picotech TC-08) en een
programmeerbaar alcoholbad (Haake Phoenix II CP30). Enkel de prepoppen
werden gebruikt voor de analyse aangezien Schildermans (2015) heeft
aangetoond dat het prepop- en popstadium van H. illucens de hoogste
koudetolerantie hebben. De prepoppen werden individueel in een 1,5 ml
Eppendorf buisje geplaatst. Een thermokoppel werd in de nabijheid van elk
individu gebracht en het Eppendorf buisje werd in een glazen reageerbuis
geplaatst. Deze buis werd afgesloten met een kurken dop en vervolgens
ondergedompeld in het alcoholbad (Figuur 7). De begintemperatuur werd
ingesteld op 25°C waarna de prepoppen werden gekoeld met een snelheid
van 0,5°C/min. De analyse werd gestopt eens een afgifte van exotherme
warmte, kristallisatiewarmte, werd geregistreerd voor alle prepoppen. Alle
prepoppen werden gewogen (Sartorius H110, tot op 0,0001 g nauwkeurig)
alvorens het onderkoelingspunt werd bepaald.
Figuur
7:
Glazen
buisje met daarin een
Eppendorf buisje met
een prepop en een
thermokoppel.
2.2 De letale tijd bij 5°C
De letale tijd (LT) is het gemiddelde tijdsinterval waarin een vastgelegd mortaliteitspercentage
bereikt wordt (50% bij LT50) ten gevolge van een blootstelling aan gedefinieerde omstandigheden
(Sinclair, 1999). De invloed van het dieet, het gewicht en koude-acclimatisatie op de letale tijd bij
een temperatuur van 5°C werden onderzocht.
Materiaal & Methoden
| 21
Opnieuw werden enkel de prepoppen van H. illucens getest. Kweekschaaltjes (SPL Life
Sciences, Type Insect Breeding Dish; 10 x 4 cm) werden gevuld met potgrond (Perspotgrond
Groententeelt, STRUCTURAL TYPE 0) hierin werden per schaaltje 10 prepoppen in
overgebracht. Alvorens de letale tijd werd bepaald, werden de schaaltjes in een klimaatkast bij
27°C en 65% RV geplaatst. Dit zodat de prepoppen voldoende tijd kregen om zich te nestelen in
de potgrond. Na één dag bij 27°C werden de potjes (aantal afhankelijk van wat onderzocht werd)
geplaatst in een incubator (Weiss Type ET 2028). De incubator werd ingesteld bij 19°C gevolgd
door 12°C, elk voor een periode van een half uur. Deze korte acclimatisatie werd uitgevoerd
zodat een mogelijke mortaliteit door een koude schok voorkomen kon worden. Na deze korte
acclimatisatie werd de incubator ingesteld bij 5,0 ± 0,3°C. De relatieve vochtigheid van de
incubator kon niet actief worden geregeld en er was ten allen tijde volledige duisternis. De
volgende weken werden er op verschillende tijdsintervallen 2 (indien de invloed van het gewicht
getest werd) of 3 schaaltjes per categorie (geacclimatiseerd/controle, vis/kip/digestaat) uit de
incubator gehaald. Opnieuw, om een warmte schok te voorkomen, werden de schaaltjes kort
geacclimatiseerd (half uur bij 12°C gevolgd door 19°C). Na deze acclimatisatie werden de potjes
in een klimaatkast geplaatst bij 27°C en 65% RV.
Vervolgens werd de overleving van de geteste individuen vastgesteld. Deze werden gevolgd van
het prepopstadium tot het volwassen stadium. De ontloken adulten werden verzameld en er werd
een geslachtsbepaling uitgevoerd. Er werd rekening gehouden met ontloken adulten die niet
levensvatbaar waren of bepaalde afwijkingen vertoonden. Sommige adulten hadden niet de
kracht om volledig te ontluiken uit hun pop (Figuur 8, rechts), andere toonden misvormingen
zoals verfrommelde vleugels (Figuur 8, links).
Figuur 8: Afwijkingen bij ontloken adulten. Links: misvormde vleugels.
Rechts: adult met onvoldoende kracht om volledig te ontluiken.
2.3 Invloed van het dieet op de koudetolerantie
In de bachelorproef van De Graeve et al. (2014) werd geconcludeerd dat het dieet een invloed
uitoefent op het eiwitgehalte van de prepoppen van H. illucens. Uit preliminaire proeven
(uitgevoerd door Noyez, ongepubliceerd) werd er eveneens een effect van het dieet op het
onderkoelingspunt vastgesteld. In deze proef werd onderzocht of het dieet een invloed heeft op de
koudetolerantie, het onderkoelingspunt en de letale tijd, van de prepoppen van H. illucens. Verder
werd er een eiwitbepaling van de prepoppen uitgevoerd.
| 22
Materiaal & Methoden
2.3.1 De gebruikte diëten
Er werd gewerkt met 3 verschillende diëten: een nutriëntenarm, een nutriënten gemiddeld en een
nutriëntenrijk dieet.
Het nutriëntenarm dieet bestond uit de dikke fractie van een digestaat. Het digestaat wordt
bekomen door een anaërobevergisting van vers groenten- en fruitafval voor de productie van
energie uitgevoerd door Trevi NV (België). Het groenten- en fruitafval is afkomstig van het
groenten en fruit verwerkend bedrijf Ardo gelegen te Ardooie (België). Het digestaat wordt
gecentrifugeerd in een vloeibare (dunne) en vaste (dikke) fractie. De vaste fractie werd gebruikt
in dit onderzoek.
Het nutriënten gemiddeld dieet (basisdieet) stemt overeen met
het dieet gebruikt voor de kweek van de zwarte wapenvlieg.
Het basisdieet bestaat uit een mengsel van 1/3
kippenvoerkorrels (Aveve Legkorrel TOTAL 77) en 2/3 water.
Het nutriëntenrijk dieet bestond uit restaurantafval. De helft
van dit dieet bestond uit een bereide vis fractie. Deze vis is
afkomstig van de visoverschotten uit het studentenrestaurant
Campus Coupure (Gent, België). De andere helft van het dieet
bestond uit een zetmeel fractie (aardappelen, frietjes en rijst)
en een groeten fractie. Deze fracties waren afkomstig van
etensresten en restaurantoverschotten verzameld door het AZ
Sint-Elisabeth Zottegem (Zottegem, België). De vis, de
groenten en het zetmeel werden met elkaar vermengd en
gemixt tot een egale voedingsbrij bekomen werd.
Figuur 9: De 3 gebruikte diëten
met elk 3 herhalingen.
Links: restaurantafval. Midden:
digestaat. Rechts: basisdieet.
2.3.2 Bepaling van het onderkoelingspunt en de letale tijd
Uit de kweek, beschreven door Schildermans (2015), werden 880 prepoppen verzameld. Om de
verpopping succesvol te laten verlopen, werden de prepoppen per 40 in een kweekschaaltje (SPL
Life Sciences, Type Insect Breeding Dish; 10 x 4 cm) gebracht. Deze schaaltjes werden gevuld
met een geschikt ontpoppingssubstraat, potgrond (Perspotgrond Groententeelt, STRUCTURAL
TYPE 0). Na twee weken bij 27°C en 65% RV, wanneer de vliegen ontloken waren, werden er 3
kweekkooien (BugDorm-1 Insect Rearing Cage; 30 x 30 x 30 cm) gemaakt met elk zeven
schaaltjes (280 prepoppen). Er werd succesvol gepaard en binnen de 48 uur nadat de eerste eitjes
werden afgelegd, werden er 30 legsels verzameld. De larven die ontloken uit de legsels werden
voor zeven dagen opgegroeid op een basisdieet. De één-week-oude larven werden gezeefd. Er
werden vijf maal 100 larven geteld en gewogen (Sartorius H110). Op basis van het gemiddelde
gewicht van 100 larven, werden er 9 maal 1000 larven afgewogen (Sartorius H110). Deze larven
werden verdeeld over de drie substraten (restaurantafval, basisdieet en digestaat) met elk drie
Materiaal & Methoden
| 23
herhalingen (Figuur 9). Elke week werden de larven twee maal gevoed met het toebehorende
substraat (1000 g) tot er prepoppen werden gevormd. Een deel van de gevormde prepoppen werd
gebruikt om het onderkoelingspunt (40 prepoppen per dieet) en de letale tijd te bepalen. Het
andere deel werd gebruikt voor de bepaling van het eiwitgehalte.
2.3.3 Bepaling drogestof- en eiwitgehalte
Het drogestofgehalte werd gravimetrisch bepaald door de insecten te ovendrogen bij 103°C
gedurende 8 uur. Het eiwitgehalte werd bepaald, op het droge materiaal, aan de hand van de
Kjehldahl procedure. Met deze procedure werd het N-gehalte bekomen waaruit het eiwitgehalte
werd afgeleid door vermenigvuldiging met 6,25 (16% N in eiwit). Als eerste werd het monster
vernietigd met zwavelzuur, waarbij de organisch gebonden stikstof werd omgezet in
ammoniumwaterstofsulfaat. Vervolgens werd het onderworpen aan een stoomdestillatie met
NaOH, waarbij ammoniak werd vrijgesteld en verzameld in een boorzuuroplossing. Tot slot werd
de ammoniumhydroxide concentratie, welke equivalent is met het N-gehalte, door middel van
een titratie met een HCl oplossing van gekende concentratie bepaald.
2.4 Invloed van koude-acclimatisatie op de koudetolerantie
Om de invloed van koude-acclimatisatie te bepalen, werden er uit de kweek 1280 prepoppen
verzameld. De prepoppen werden per 10 in een kweekschaaltje (SPL Life Sciences, Type Insect
Breeding Dish; 10 x 4 cm) (dus in totaal 128 schaaltjes) geplaatst, gevuld met potgrond
(Perspotgrond Groententeelt, STRUCTURAL TYPE 0). De potjes werden voor één dag in een
klimaatkast geplaatst bij 27°C en 65% RV zodat de prepoppen zich voldoende konden nestelen in
het substraat. De helft van de potjes (64) werden hierna bij 16°C (gemiddelde van 27 en 5°C) en
65% RV geplaatst gedurende een week. Deze groep werd zodoende geacclimatiseerd alvorens het
onderkoelingspunt en de letale tijd bij 5°C bepaald werden. De andere helft (de controle) werd,
na een korte acclimatisatie om een koude schok te voorkomen (een half uur bij 19°C en 12°C) bij
5°C ± 0.3°C geplaatst om de letale tijd te bepalen. Van deze helft werden echter 4 potjes, dus 40
prepoppen, aan de kant gehouden om het onderkoelingspunt te bepalen. Na een week bij 16°C
werden ook de geacclimatiseerde potjes bij 5°C geplaatst en werd het onderkoelingspunt van 40
geacclimatiseerde prepoppen bepaald.
2.5 Invloed van het gewicht op de letale tijd
Tijdens dit experiment werd nagegaan of het lichaamsgewicht een invloed heeft op de overleving
bij 5°C. Het gewicht van 280 prepoppen, verzameld uit de kweek volgens Schildermans (2015),
werd bepaald aan de hand van een Sartorius H110 balans (tot op 0,0001 g nauwkeurig). De 280
prepoppen werden opgedeeld in twee gewichtsklassen: de zware en lichte prepoppen. Van elke
gewichtsklasse werd de letale tijd bij 5°C bepaald.
Materiaal & Methoden
| 24
Om de geslachtsverdeling ten opzichte van de gewichten na te gaan, werd het geslacht van de
ontloken vliegen bepaald. De geslachtsbepaling gebeurde aan de hand van de morfologische
verschillen tussen het geslachtsapparaat van het wijfje en het mannetje (Figuur 10). Wanneer het
abdomen van de vlieg lichtjes werd ingedrukt kwam het geslachtsapparaat tevoorschijn, waarna
het geslacht kon worden bepaald. Indien er twijfel was, werd het geslacht bepaald onder een
stereomicroscoop (Leica MZ 8).
Figuur 10: De geslachtsapparaten van de zwarte wapenvlieg.
Links: adult wijfje. Rechts: adult mannetje.
3
Invloed van het gewicht op de fecunditeit van H. illucens
Uit de resultaten van het experiment beschreven in DEEL II: 2.5 Invloed van het gewicht op de
letale tijd, werd afgeleid dat de wijfjes van de zwarte wapenvlieg een groter gewicht behalen dan
mannetjes (DEEL IV: 1.3 Invloed van het gewicht). Deze evolutie naar grotere wijfjes wordt
door Darwin (1874) verklaart aan de hand van zijn “fecunditeitsvoordeel” model. Waarin hij stelt
dat grotere wijfjes meer nakomelingen kunnen produceren. Met andere woorden grotere wijfjes
hebben een hogere fecunditeit. Deze hypothese wordt door vele onderzoekers ondersteund
(Honĕk, 1993) In dit onderzoek wordt nagegaan of deze grootte-fecunditeitsrelatie ook terug te
vinden is bij de zwarte wapenvlieg.
Het gewicht, met daaraan verbonden de fecunditeit, van insecten is afhankelijk van genetische en
ecologische factoren. De ecologische aspecten die een invloed uitoefenen op het gewicht en de
fecunditeit van de zwarte wapenvlieg werden reeds onderzocht door Tomberlin (2001) en
Holmes (2010). In het tweede gedeelte van dit experiment wordt de genetische factor bekeken. Er
wordt onderzocht of het gewicht van het wijfje het gewicht van haar nakomelingen beïnvloedt.
3.1 Bepaling van de fecunditeitskarakteristieken
Fecunditeit wordt door vele onderzoekers verschillend geïnterpreteerd en gedefinieerd (Leather,
1988). In dit experiment wordt fecunditeit gedefinieerd als het gelegd aantal levensvatbare eitjes
per wijfje. Om dit te kunnen nagaan was het noodzakelijk om het gewicht van de individuele
legsels te bepalen. Een mogelijke methode werd voorgesteld door Booth (1984). Waarbij de
bepaling van het legselgewicht gebeurd door de legkartonnen (waarin de eitjes werden afgelegd)
voor en na de ei-afleg te wegen. Het bekomen legselgewicht is echter afhankelijk van de
Materiaal & Methoden
| 25
vochtigheid. Men is daar bovenop niet zeker dat het gewicht van slechts 1 legsel bepaald werd,
aangezien er meerdere legsels in 1 spleet kunnen afgelegd worden (Tomberlin, 2001). In deze
studie wordt een andere methode voorgesteld. De legkartonnen werden voorzichtig
opengescheurd waarna het legsel verwijderd kon worden. Door de samenhang van de eitjes is het
eenvoudig om alle eitjes te verwijderen en samen te wegen.
Uit de kweek werden er 400 prepoppen verzameld. Deze werden individueel gewogen en op
gewichtsbasis verdeeld in 3 klassen: de lichte, de medium en de zware prepoppen. Per klasse
werden 10 schaaltjes (SPL Life Sciences, Type Insect Breeding Dish; 10 x 4 cm) met elk 13 of
14 prepoppen gevuld met potgrond (Perspotgrond Groententeelt, STRUCTURAL TYPE 0). De
lichte prepoppen werden 14 dagen in een klimaatkast bij 25°C en 65% RV geplaatst. De medium
prepoppen werden een week bij 25°C en 65% RV gehouden waarna ze verplaatst werden naar
een klimaatkast bij 27°C en 65% RV. De zware prepoppen werden direct bij 27°C en 65% RV
geplaatst. Dit werd gedaan zodat de ontluiking van de vliegen plaats vond binnen dezelfde
tijdsspanne. Lichte individuen hebben namelijk een snellere ontwikkeling (ongeveer 2 tot 3 dagen
verschillend bij 27°C en 65% RV, eigen observatie). Uit preliminaire proeven is gebleken dat
indien men de lichte prepoppen bij een lagere temperatuur plaatst, hun ontwikkelingssnelheid
daalt waardoor ze ongeveer na dezelfde periode ontluiken als zwaardere individuen.
Na 15 dagen ontloken de eerste vliegen. Binnen de 48 uur werd er per gewichtsklasse een kooi
(BugDorm-1 Insect Rearing Cage; 30 x 30 x 30 cm) gemaakt met elk 28 wijfjes en 18
mannetjes, Om de invloed van het gewicht van de mannetjes uit te sluiten werden deze
willekeurig verdeeld over de drie kooien. Het aantal mannetjes in de kooi moet niet gelijk zijn
aan het aantal wijfjes aangezien uit preliminaire proeven is gebleken dat mannetjes met meerdere
wijfjes paren. De kooi met de zware vliegen werd blootgesteld aan onvoorziene condities. Door
een fijnere gaasopening van de kooi werd er een hogere temperatuur en relatieve vochtigheid
vastgesteld in de kooi. Dit leidde tot hittestress bij de vliegen waardoor er een grote mortaliteit
werd opgemerkt. Voordat de paring plaatsvond werden er slechts 8 levende vliegen
teruggevonden. Aangezien de overlevende vliegen allemaal wijfjes waren werden er opnieuw
enkele mannetjes aan de kooi toegevoegd. Er werd eveneens een nieuwe kooi aangemaakt met
daarin 10 zware wijfjes en 8 willekeurige mannetjes. Wat het totaal aantal zware wijfjes die
deelnemen aan de paring bracht op 18. Om de invloed van de onvoorziene condities te bepalen
werden de gemiddelde legselgewichten met elkaar vergeleken.
Na 2 dagen werden de kooien voorzien van een geschikt legsubstraat
(Figuur 11). Dit bestond uit een schaaltje (SPL Life Sciences, Type
Insect Breeding Dish; 10 x 4 cm) met een laagje compost (1-2 cm) en
bevochtigd met water. Hierop lag een gaas wat ervoor zorgde dat de
vliegen niet in direct contact kwamen met het water en bijgevolg
verdronken. Op het schaaltje werden tien kartonnen strips (10 x 3 cm)
met een spleetgrootte van 1 x 5 mm geplaatst. Hierin werden de ei-
Figuur 11: Legsubstraat
bestaand uit schaaltje
met compost en
kartonnen stripjes
Materiaal & Methoden
| 26
clusters afgelegd (Figuur 12, links). Deze clusters werden om de 48u verzameld.
Figuur 12: De ei-afleg. Links: ei-clusters afgelegd in
kartonnen spleten. Rechts: Het verzamelen van ei-clusters
Individuele ei-clusters (of legsels) werden ontdaan van het karton (Figuur 11, rechts) en gewogen
(Sartorius H110,tot op 0.0001 g nauwkeurig). Vervolgens werden er uit elke cluster 50 eitjes
geïsoleerd. Deze werden op dezelfde wijze gewogen zodat het individueel ei-gewicht bepaald
kon worden. Het aantal eitjes in een cluster werd bepaald met de gegevens van het gewicht van
de legsels en het individueel ei-gewicht. Op basis van het individueel ei-gewicht van elk legsel
werden er 50 eitjes per legsel afgewogen (niet geteld, om beschadiging zo minimaal mogelijk te
houden). Deze werden in een schaaltje in een klimaatkast op 27°C en 65% RV geplaatst. Aan de
hand van deze eitjes werd, doormiddel van het aantal ontloken larven onder een
stereomicroscoop (Leica MZ 8) te tellen, het percentage uitgekomen eitjes bepaald. Indien er
geen ontloken larven vastgesteld werden, werd het legsel als niet levensvatbaar beschouwd.
3.2 Invloed van genetische factoren op het gewicht
Aan de hand van het individuele ei-gewicht per legsel werd het gemiddeld ei-gewicht per
gewichtsklasse berekend. Hiermee werden er per legsel 200 eitjes afgewogen. Deze werden
geplaatst in een schaal (SPL Life Sciences, Type Insect Breeding Dish; 10 x 4 cm) met 50 g basis
voeding. De larven werden verder opgekweekt. Na een week werden deze larven gezeefd en
werden er 50 larven per legsel verzameld. Deze larven werden verder opgekweekt, zodanig dat
de opkweek van de larven gebeurde aan dezelfde densiteit. De larven kregen elke week 50 g
basisvoeding toegediend tot er zich prepoppen vormden. Het gewicht van de gevormde
prepoppen werd bepaald (Sartorius H110 tot op 0,0001 g nauwkeurig).
| 27
Materiaal & Methoden
3 Statistische dataverwerking
Alle gegevens werden statistisch verwerkt
dataverwerkingsprogramma SPSS statistic 23.
met
behulp
van
het
statistisch
Voordat de gemiddelden met elkaar konden vergeleken worden, werd de normaliteit en gelijkheid
van varianties nagegaan met de Kolmogorov-Smirnov test en de Levene test. Voldeden de data
aan deze voorwaarden dan werd een parametrische test uitgevoerd. Er werd gekozen voor een
enkelvoudige variantieanalyse (One-way-ANOVA). De gemiddelden werden gescheiden met
behulp van Tukey of Tamhane post hoc testen, naargelang de Levene test respectievelijk
homoscedasticiteit of heteroscedasticiteit aangaf.
Werd er geen normaliteit vastgesteld dan werd er een niet-parametrische test uitgevoerd. De
Kruskal-Wallis test werd gebruikt om meerdere gemiddelden met elkaar te vergelijken. Indien er
verschillen werden teruggevonden werd de Mann-Whitney U test gebruikt om de gemiddelden
twee aan twee te vergelijken. In de nulhypothese werd gesteld dat er geen verschil was tussen de
verschillende gemiddelden.
Resultaten van de letale tijd experimenten werden geanalyseerd met een probit analyse. Met
behulp van deze analyse werden, door middel van een regressie, de overlevingspercentages met
elkaar vergeleken. Er werd een schatting gemaakt van de tijd die nodig is om
mortaliteitspercentage van 10, 50 en 90% bij 5°C te bekomen. Significante verschillen werden
geïdentificeerd door niet-overlappende 95% betrouwbaarheidsgrenzen.
Wanneer de letale tijd bij 5°C getest werd, werd er eveneens een geslachtsbepaling uitgevoerd op
de ontloken adulten. Om na te gaan of er een verschil is tussen het aantal ontloken mannetjes en
wijfjes in functie van het gewicht, werd er een binaire logistische test uitgevoerd. In de
nulhypothese werd gesteld dat er geen verschil was in het aantal mannetjes tussen de
verschillende gewichtsklassen.
Bij elk van de testen werden P-waarden kleiner dan 0,05 als significant beschouwd.
| 28
DEEL III: RESULTATEN
1. De koudetolerantie van H. illucens
1.1 Invloed van het dieet
Er werden drie verschillende diëten getest. Een nutriëntenrijk dieet (restaurantafval), een
gemiddeld dieet (basisdieet) en een nutriëntenarm dieet (digestaat). De koudetolerantie van H.
illucens werd bepaald aan de hand van het onderkoelingspunt en de letale tijd bij 5°C. Verder
werd het drogestof- en eiwitgehalte van de prepoppen bepaald om een eventueel verband met het
onderkoelingspunt en letale tijd te onderzoeken.
1.1.1 Het onderkoelingspunt
Voordat het onderkoelingspunt van de prepoppen bepaald werd, werd het gewicht nagegaan. Er
werd geen significant verschil gevonden tussen de gewichten van de prepoppen gekweekt op
restaurantafval en op het basisdieet (P=0,925) (Tabel 3). Het gewicht van de prepoppen gekweekt
op het digestaat lag significant lager (P<0,05) dan deze gekweekt op de andere diëten, namelijk
gemiddeld 136,56 mg en 135,45 mg lager dan respectievelijk het basis- en restaurantafvaldieet.
Visueel werd eveneens vastgesteld dat de ontloken vliegen gekweekt op het digestaat een
kleinere lichaamsomvang hadden (Figuur 12)
.
Figuur 12: Verschil in grootte tussen wijfjes van H. illucens gevoed met 3 verschillende diëten.
Links: digestaat. Midden: restaurantafval. Rechts: basisdieet.
Het dieet heeft een significante invloed op het onderkoelingspunt van de prepoppen van H.
illucens (χ²= 21,728; df=2; P<0,05) (Tabel 3). De prepoppen gekweekt op het restaurantafval
hadden het laagste gemiddelde onderkoelingspunt (-14,08 ± 0,39°C). Het onderkoelingspunt van
de prepoppen gevoed met het basisdieet lag gemiddeld 1,72°C hoger. Terwijl het verschil tussen
de gemiddelde onderkoelingspunten van de prepoppen gekweekt op digestaat en restaurantafval
2,93°C bedroeg.
Resultaten
| 29
Tabel 3: Lichaamsgewicht en onderkoelingspunt van prepoppen van H. illucens gekweekt op
verschillende diëten.
Dieet
N
Lichaamsgewicht (g)
Onderkoelingspunt
(°C)
Bereik van het
onderkoelingspunt (°C)
Restaurantafval
Basisdieet
Digestaat
40
36
38
0,219 ± 0,004 a
0,220 ± 0,004 a
0,084 ± 0,003 b
-14,08 ± 0,39 a
-12,36 ± 0,49 b
-11,15 ± 0,43 c
-8,50 tot -17,48
-5,19 tot -16,81
-6,11 tot -16,22
Gemiddeld lichaamsgewicht en onderkoelingspunt ± standaardfout. Waarden in dezelfde kolom gevolgd
door een gelijke letter zijn niet significant verschillend (P>0,05; Kruskal Wallis test gevolgd door MannWhitney U test). N= aantal geteste prepoppen per dieet.
1.1.2 De letale tijd bij 5°C
De invloed van het dieet op de overleving van de prepoppen bij 5°C werd bepaald aan de hand
van de letale tijden voor 10, 50 en 90% mortaliteit (LT10, 50, 90 ) (Tabel 4). Significante verschillen
werden vastgesteld op basis van niet-overlappende 95% betrouwbaarheidsintervallen (Figuur 13).
Voor alle mortaliteitspercentages (10, 50 en 90%) werden er significante verschillen gevonden
tussen de drie diëten. De prepoppen gevoederd met digestaat vertoonden de hoogste overleving
bij 5°C. Na gemiddeld 14,09 dagen was er nog een overleving van 50%. Slechts 10% van de
prepoppen gevoederd met het basisdieet overleefden een blootstelling van 11,07 dagen aan 5°C.
De helft van deze populatie overleefde een periode van 5,83 dagen bij 5°C niet. De gemiddelde
LT50-waarde van de prepoppen gekweekt op restaurantafval bedroeg 9,56 dagen. Deze prepoppen
hadden een significant langere overleving bij 5°C ten opzichte van deze gekweekt op het
basisdieet met een LT90-waarde van respectievelijk 18,14 en 11,07 dagen. De prepoppen
gevoederd op het digestaat overleefden het langst bij 5°C met een LT90-waarde van 26,73 dagen.
Resultaten
| 30
35
a
Tijdsdurr (dagen)
30
25
b
20
a
15
b
a
10
c
5
c
c
b
0
10
50
LT (% mortaliteit) bij 5°C
Basisdieet Restaurant Digestaat
90
Figuur 13: Letale tijd10, 50, 90 (gemiddelden ± 95% betrouwbaarheidsintervallen) bij 5°C voor
de verschillende diëten. Staven binnen elke LT-groep met gelijke letters zijn niet significant
verschillend, gebaseerd op niet-overlappende 95% betrouwbaarheidsintervallen (Probit
analyse).
1.1.3 Het drogestof- en eiwitgehalte
De eiwitgehaltes, bepaald door middel van een Kjehldahl analyse, worden weergegeven in Tabel
5. Eveneens wordt het gemiddelde drogestofgehalte van prepoppen gekweekt op de verschillende
diëten vermeld. Er werden geen significante verschillen gevonden tussen het gemiddelde
drogestofgehalte (χ²= 5,956; df= 2; P= 0,051) en het eiwitgehalte uitgedrukt in g/100 g DS (χ²=
5,6; df= 2; P= 0,061). Dit was echter wel het geval indien het eiwitgehalte uitgedrukt werd in
g/100 g prepop (drogestofgehalte x eiwitgehalte (g/100 g DS)) (F= 78,615; df= 2, 6; P<0,001.
Hierbij bevatten prepoppen gevoederd met restaurantafval het hoogste eiwitgehalte (16,95 g/100
g prepop). De laagste waarde werd gevonden bij het digestaat (13,85 g/100 g prepop).
Tabel 5: Het eiwit- en drogestofgehalte voor 3 verschillende diëten
Dieet
Drogestofgehalte
(g/100 g prepop)
Eiwitgehalte
(g/100 g DS)
Eiwitgehalte
(g/100 g prepop)
Restaurantafval
Basisdieet
Digestaat
40,21 ± 0,26 a
40,87 ± 0,38 a
33,11 ± 0,01 a
42,14 ± 0,28 a
37,07 ± 0,20 a
41,83 ± 0,23 a
16,95 ± 0,17 a
15,15 ± 0,17 b
13,85 ± 0,07 c
Gemiddelde waarde ± standaardfout. Waarden binnen een kolom met gelijke letter zijn niet
significant verschillend (P>0,05; Indien normaal verdeeld (drogestofgehalte en eiwitgehalte
(g/100 g DS): One-way-ANOVA; gevolgd door Tukey-test; Anders (eiwitgehalte (g/100 g
prepop): Kruskal Wallis test gevolgd door Mann-Whitney U test). DS= drogestofgehalte.
Resultaten
| 31
1.2 Invloed van koude-acclimatisatie
De koude-acclimatisatie werd uitgevoerd door de prepoppen bloot te stellen aan 16°C
(gemiddelde van 27°C (kweektemperatuur) en 5°C) voor een periode van zeven dagen. De
controle prepoppen werden verzameld uit dezelfde kweekemmers maar werden niet onderworpen
aan een koude-acclimatisatie. Het onderkoelingspunt en de letale tijd van de geacclimatiseerde en
de controle prepoppen werd bepaald.
1.2.1 Het onderkoelingspunt
Er werd geen significant verschil vastgesteld tussen de onderkoelingspunten van de
geacclimatiseerde prepoppen en deze van de controlebehandeling (χ²= 1,190; df= 1; P=0,275)
(Tabel 6).
Tabel 6: Onderkoelingspunt van al dan niet geacclimatiseerde prepoppen van H.
illucens
N
Controle
Geacclimatiseerd
38
38
Onderkoelingspunt
Bereik van het
(°C)
onderkoelingspunt (°C)
-11,11 ± 0,46 a
-11,77 ± 0,44 a
-6,59 tot -16,37
-6,69 tot -17,69
Gemiddeld onderkoelingspunt ± standaardfout
Waarden binnen de een kolom met gelijke letter zijn niet significant verschillend (P>0,05;
Mann-Whitney U test).
N= aantal geteste prepoppen.
1.2.2 De letale tijd bij 5°C
De letale tijden voor 10, 50 en 90% mortaliteit (LT10, 50, 90) bij 5°C voor de geacclimatiseerde en
controle prepoppen worden weergegeven in Tabel 7. Op basis van niet overlappende 95%
betrouwbaarheidsintervallen werden er significante verschillen vastgesteld (Figuur 14). Na
gemiddeld 13,94 dagen bij 5°C werd de controle populatie gehalveerd. Na 13,98 dagen was er
echter nog maar een sterfte van 10% op te merken bij de geacclimatiseerde prepoppen. Pas na een
periode van 23,20 dagen werd de LT50-waarde bereikt.
Resultaten
| 32
40
a
Tijdsduur (dagen)
35
30
a
25
20
a
b
b
15
10
b
5
0
10
50
LT (% mortaliteit) bij 5°C
Controle
90
Geacclimatiseerd
Figuur 14: Letale tijd10, 50, 90 (gemiddelden ± 95% betrouwbaarheidsintervallen) bij
5°C voor geacclimatiseerde prepoppen en een controle. Staven binnen elke LT-groep
met gelijke letters zijn niet significant verschillend, gebaseerd op niet-overlappende
95% betrouwbaarheidsintervallen (Probit analyse).
LT= letale tijd.
1.3 Invloed van het gewicht op de letale tijd bij 5°C
Een verzamelde populatie prepoppen werd opgedeeld in twee gewichtsklassen: de zware en
lichte. De gemiddelde gewichten en het gewichtsbereik van de twee klassen worden weergegeven
in Tabel 8. Er werd een significant verschil (F= 462,551; df= 1, 278; P<0,001 vastgesteld tussen
de twee gewichtsklassen. De zware prepoppen wogen gemiddeld 51,28 mg meer dan lichte
prepoppen.
Tabel 10: Het gemiddeld lichaamsgewicht van de prepoppen van H. illucens
binnen hun gewichtsklasse
Gewichtsklasse
N
Gemiddeld gewicht
(g)
Gewichtsbereik
(g)
Licht
Zwaar
140
140
0,199 ± 0,0016 b
0,250 ± 0,0018 a
0,151 tot 0,225
0,226 tot 0,329
Gemiddeld lichaamsgewicht ± standaardfout van de prepoppen behorend tot twee
gewichtsklassen. Waarden binnen een kolom gevolgd door dezelfde letter zijn niet
significant verschillend (P>0,05; One-way-ANOVA, gevolgd door Tukey-test).
N= aantal geteste individuen.
Per gewichtsklasse werd het percentage mannetjes en wijfjes bepaald. Ongeveer 77,33% van de
vliegen die ontloken uit de lichte prepoppen waren mannetjes. Dit was significant verschillend
(χ²= 47,233; df=1; P<0,001) met het percentage mannetjes ontloken uit de zware prepoppen
(16%).
Resultaten
| 33
Er werden geen significante verschillen gevonden tussen de letale tijd van de prepoppen uit de
verschillende gewichtsklassen (Figuur 15).
Tijdsduur (dagen)
25
a
a
20
a
a
15
10
a
a
5
0
10
50
LT (% mortaliteit) bij 5°C
Licht Zwaar
90
Figuur 15: Letale tijd10, 50, 90 (gemiddelden ± 95% betrouwbaarheidsintervallen) bij
5°C van prepoppen behorend tot verschillende gewichtsklassen: licht [0,151- 0,225g]
en zwaar [0,226-0,329 g].
Staven binnen elke LT-groep met gelijke letters zijn niet significant verschillend,
gebaseerd op niet-overlappende 95% betrouwbaarheidsintervallen (Probit analyse).
LT= letale tijd.
2. Invloed van het gewicht op de fecunditeit van H. illucens
Om het effect van het gewicht op de fecunditeit te toetsen, werd er gebruik gemaakt van drie
gewichtsklassen: lichte, medium en zware prepoppen. Er was een significant verschil tussen het
lichaamsgewicht van de verschillende klassen (χ²=354,667; df=2; P=0) (Tabel 10). De zware
prepoppen wogen gemiddeld 47,66 mg en 84,99 mg meer dan respectievelijk de medium en
lichte prepoppen.
Tabel 10: Het gemiddeld lichaamsgewicht van de prepoppen van H. illucens binnen hun
gewichtsklasse.
Gewichtsklasse
N
Gemiddeld gewicht (g)
Gewichtsbereik (g)
Licht
133
0,164 ± 0,00014 c
0,111 tot 0,185
Medium
134
0,201 ± 0,00007 b
0,185 tot 0,219
Zwaar
134
0,249 ± 0,00018 a
0,219 tot 0,319
Gemiddeld lichaamsgewicht ± standaardfout van de prepoppen behorend tot drie gewichtsklassen.
Waarden binnen een kolom gevolgd door dezelfde letter zijn niet significant verschillend (P>0,05;
Kruskal Wallis test gevolgd door Mann-Whitney U test). N= aantal geteste individuen.
Resultaten
| 34
De fecunditeitskarakteristieken van H. illucens voor de drie verschillende gewichtsklassen worden weergegeven in Tabel 11. Slechts
46% van de lichte wijfjes waren in staat om levensvatbare ei-clusters af te leggen. Dit steeg naar 68% voor de medium en 88% voor de
zware wijfjes. Er werd geen significant verschil gevonden tussen het percentage ontloken eitjes per legsel voor de drie gewichtsklassen
(χ²= 1,374; df= 2; P= 0,503). De legselgewichten van de kooi getroffen door warmtestress en de nieuw aangemaakte kooi met zware
wijfjes vertoonden geen significante verschillen (F= 1,012; df= 1; P= 0,333).
Er werd geen statistisch significant verschil vastgesteld tussen de individuele ei-gewichten van de verschillende gewichtsklassen
(F=0,698; df=2, 46, P=0,503). Dit was wel het geval bij de gemiddelde gewichten van de legsels (F=3,615; df=2, 46; P=0,035) (Tabel
11). Er werd een significant verschil vastgesteld tussen de gemiddelde legselgewichten van wijfjes met een gemiddeld gewicht en de
lichte wijfjes (P=0,035). Het legselgewicht van de medium wijfjes lag gemiddeld 3,45 mg hoger dan het legselgewicht van de lichtere
wijfjes. Verder was er geen significant verschil tussen de legselgewichten van de zwaardere wijfjes en de andere twee gewichtsklassen
(P=0,903 en P=0,118).
Er werden eveneens significante verschillen gevonden tussen het gemiddeld aantal eitjes per legsel (F= 4,695; df= 2, 46; P= 0,014). De
wijfjes met gemiddeld gewicht legden het grootste aantal eitjes af per legsel (739 ± 47). Dit aantal was niet significant verschillend met
het aantal eitjes per legsel van de zware wijfjes (P= 0,623). De legsels van de lichte wijfjes bevatten slechts 523 ± 49 eitjes. Dit is een
significant verschil van 207 eitjes met het aantal eitjes per legsel van de medium wijfjes (P= 0,011). Tussen de zware en lichte wijfjes
werd er geen significant verschil gevonden wat betreft het aantal eitjes per legsel (P= 0,127).
Tabel 11: Fecunditeitskarakteristieken van H. illucens voor de verschillende gewichtsklassen.
Gewichts
klasse
N
Aantal
legsels
Aantal legsels
uitgekomen
Licht
Medium
Zwaar
28
28
18
19
26
16
13
19
15
Percentage eitjes
uitgekomen per legsel
(%)
59 a
45 a
56 a
Aantal eitjes
per legsel
532 ± 49 b
739 ± 47 a
669 ± 55 ab
Gewicht legsel (g)
0,0129 ± 0,0011 b
0,0171 ± 0,0012 a
0,0164 ± 0,0012 ab
Gewicht eitje (mg)
0,0243 ± 0,0007 a
0,0231 ± 0,0010 a
0,0245 ± 0,0010 a
Aantal legsels afgelegd, het gemiddeld aantal eitjes ± standaardfout, het gewicht van een legsel ± standaardfout en het individueel ei-gewicht±
standaardfout per gewichtsklassen (zwaar [0,219 tot 0,319g], medium [0,185 tot 0,219g] en licht [0,111 tot 0,185g]) en het aantal levensvatbare legsels.
Waarden binnen een kolom gevolgd door dezelfde letter zijn niet significant verschillend (P>0,05; Indien normaal verdeeld (aantal eitjes per legsel,
gewicht legsel en gewicht eitjes): One-way-ANOVA gevolgd door Tukey-test; Anders (percentage eitjes uitgekomen per legsel): Kruskal Wallis test
gevolgd door Mann-Whitney U test)
N= aantal wijfjes.
Resultaten
| 35
De legsels werden verder opgekweekt tot er prepoppen gevormd werden. Het gewicht van de
gevormde prepoppen per gewichtsklasse van de wijfjes wordt weergegeven in Tabel 12. Er
bestaan significante verschillen tussen de gewichten van de prepoppen geproduceerd door wijfjes
uit verschillende gewichtsklassen (χ²= 42,225; df= 2; P<0,001). De zwaarste vliegen
produceerden de zwaarste prepoppen met een gemiddeld gewicht van 0,206 ± 0,004 g. Het
gewicht van de prepoppen geproduceerd door de medium en lichte vliegen lag significant lager
(P<0,05) met een verschil van respectievelijk 17,41 mg en 44,34 mg. Ook de gewichten van de
prepoppen geproduceerd door lichte en medium wijfjes vertoonden significante verschillen
(P<0,001).
Tabel 12: Het gemiddeld lichaamsgewicht van de prepoppen van H. illucens
geproduceerd door wijfjes uit verschillende gewichtsklassen
Gewichtsklasse
N
Gewicht prepoppen (g)
Gewichtsbereik (g)
Wijfjes
Licht
75
0,162 ± 0,003 c
0,110 tot 0,210
Medium
75
0,189 ± 0,003 b
0,129 tot 0,288
Zwaar
75
0,206 ± 0,004 a
0,131 tot 0,295
Gemiddeld lichaamsgewicht ± standaardfout van de prepoppen geproduceerd door wijfjes
behorend tot drie gewichtsklassen: zwaar (0,219-0,319 g), medium (0,185-0,219 g) en licht
(0,111- 0,185 g) Waarden binnen een kolom gevolgd door dezelfde letter zijn niet significant
verschillend (P>0,05; Kruskal Wallis test gevolgd door Mann-Whitney U test). N= aantal
geteste individuen.
| 36
DEEL IV: DISCUSSIE
1. De koudetolerantie van H. illucens
In vele onderzoeken wordt de koudetolerantie van insecten beoordeeld op basis van het
onderkoelingspunt (OKP). In eerste instantie werden insecten, gebaseerd op deze onderzoeken,
opgedeeld in twee categorieën: vriestolerante en vriesintolerante soorten (Renault et al., 2002).
Voor deze laatste categorie werd het onderkoelingspunt aanzien als de laagste limiet van
overleving, waardoor het onderkoelingspunt gebruikt kon worden als indicator voor de
koudehardheid van een vriesintolerant individu (Bale, 1996). Schildermans (2015) onderzocht het
overwinteringspotentieel van de zwarte wapenvlieg. Het onderkoelingspunt en de letale tijd bij
5°C werden gebruikt om de koudetolerantie van de vlieg te bepalen. Er werd geen overleving
vastgesteld bij temperaturen onder het onderkoelingspunt, waaruit geconcludeerd werd dat de
soort intolerant is voor bevriezing.
Verder onderzoek toonde aan dat het OKP geen betrouwbare indicator is voor de bepaling van de
koudehardheid van een insect (Renault et al., 2002). De meerderheid van de vriesintolerante
insecten vertonen namelijk een mortaliteit bij temperaturen boven het OKP. Deze sterfte wordt
veroorzaakt door koude schade (“chilling injury”) en is afhankelijk van de tijdsduur (Salt, 1961).
Het zijn voornamelijk subtropische en tropische soorten die vatbaar zijn voor schade bij koude
temperaturen. Tropische insecten worden immers zelden blootgesteld aan lage temperaturen. Dit
zorgt ervoor dat hun koudetolerantie minder goed ontwikkeld is.
Deze bevindingen hebben reeds geleid tot vele discussies over het gebruik van het OKP als een
algemene indicator voor de mogelijkheid van een insect om te overleven bij lage temperaturen.
Dit resulteerde in een herhaaldelijke herclassificatie van de twee voornaamste strategieën in
koudehardheid (vriesintolerant en vriestolerant) (Bale, 1993; Sinclair, 1999). Een opdeling
opgesteld door Bale (1996) werd weergegeven in DEEL I: 3.1 Koudetolerantie.
Er zijn enkele tropische soorten gekend die hun koudetolerantie kunnen verhogen, vb. door
acclimatisatie (Renault, 2004). Deze soorten ervaren zelden koude temperaturen in hun
oorspronkelijke biotopen maar vertonen een gelijkaardige respons aan koude temperaturen als
gematigde soorten (Renault et al, 2002). Daarom wordt ook in deze studie het onderkoelingspunt
gebruikt als eerste indicatie voor de koudetolerantie van de zwarte wapenvlieg. Het OKP alleen is
echter geen goede indicator. Ook de zwarte wapenvlieg vertoont een mortaliteit bij temperaturen
boven het OKP. Ongeveer de helft van de geteste prepoppen overleefden een blootstelling aan
5°C voor een periode van 7 dagen niet (Schildermans, 2015). Om de mortaliteit door
koudeschade in rekening te brengen werd de letale tijd bij 5°C bepaald. Hierbij werd rekening
gehouden met de tijdsduur van de blootstelling.
In deze studie werden enkele eigenschappen getest die een potentiële invloed kunnen hebben op
de koudetolerantie van de zwarte wapenvlieg. Er werd enkel gewerkt met het prepopstadium van
Discussie
| 37
de vlieg, aangezien Schildermans (2015) heeft aangetoond dat de prepoppen en de poppen de
grootste koudehardheid bezitten.
1.1 Invloed van het dieet
Het dieet kan de chemische samenstelling van een insect sterk beïnvloeden. In deze proef werden
de larven van de zwarte wapenvlieg gevoederd met drie verschillende diëten: een nutritioneel rijk
(restaurantafval), een nutritioneel gemiddeld (basisdieet) en een nutritioneel arm dieet (digestaat).
De gemiddelde ruwe eiwitgehaltes van de resulterende prepoppen, uitgedrukt per 100 g drogestof
(DS), vertoonden geen significante verschillen. De bekomen waarden, van 37,07 g voor het
basisdieet tot 42,14 g voor het restaurantafval, stemmen overeen met de gehaltes gevonden door
(Bondari & Sheppard, 1980). In hun onderzoek behaalden de prepoppen gekweekt op kippenmest
een ruw eiwitgehalte van 38-40 g/100 g DS.
Het verschil in drogestofgehaltes van de prepoppen opgekweekt op de verschillenden diëten leidt
tot een significant verschil in het eiwitgehalte uitgedrukt in g/100 g prepop (nat gewicht). De
prepoppen gevoederd met het nutriëntenrijk substraat behaalden het hoogste eiwitgehalte (16,95
g/100 g prepop) gevolgd door, respectievelijk, de prepoppen gevoederd op het nutriënten
gemiddeld- en nutriëntenarm dieet. Dit verschil in eiwitgehalte kan van belang zijn wanneer de
prepoppen gebruikt worden als grondstof voor veevoeding. Men opteert dan voor een zo hoog
mogelijk eiwitgehalte, uitgedrukt in droge stof, zodat de beste voederconversie bekomen kan
worden.
1.1.1 Het onderkoelingspunt
Dat het dieet het OKP van insecten kan beïnvloeden werd onder andere reeds aangetoond voor de
roofwants Macrolophus pygmaeus (Maes, 2012) en het lieveheersbeestje Cryptolaemus
montrouzieri (Maes, 2015). De lichaamssamenstelling van een organisme bepaalt in grote mate
de onderkoelingscapaciteit van het individu. Hieraan gelinkt speelt de fysiologische staat
(voedingsstatus, ontwikkelingsstadium, etc.) van het individu een belangrijke rol (Renault et al.,
2002). Er werd reeds aangetoond dat het dieet de chemische samenstelling, o.a. het eiwitgehalte,
van de prepoppen beïnvloedt. In onze studie vertoonden prepoppen met verschillende chemische
samenstelling significante verschillen in hun onderkoelingspunt. De prepoppen met het hoogste
eiwitgehalte (16,95 g ruw eiwit/100 g prepop), gevoed op het nutriëntenrijk dieet, hadden het
laagste onderkoelingspunt (-14,08 °C). Wanneer de prepoppen gevoed werden op het basisdieet
lag het eiwitgehalte 1,8 g/100 g prepop lager, terwijl het onderkoelingspunt steeg met 1,72 °C.
Dit onderkoelingspunt stemt overeen met de waarde bekomen door Schildermans (2015), die
rapporteerde dat prepoppen gevoed met hetzelfde dieet een onderkoelingspunt hadden van -11,53
°C. Het eiwitgehalte van de prepoppen gevoed op het nutriëntenarm substraat lag 1,3 g lager dan
deze van het basisdieet, terwijl het onderkoelingspunt verhoogde met 1,21 °C. Indien men een
Discussie
| 38
regressie zou opstellen tussen het eiwitgehalte en het onderkoelingspunt dan bekomt men een
regressievergelijking waarbij de hellingsgraad ongeveer gelijk is aan -1 (-1,0572, R²=0,999). Dit
geeft aan dat er hypothetisch een omgekeerd lineair verband bestaat tussen het eiwitgehalte en het
onderkoelingspunt. Om dit te onderbouwen moet er echter verder onderzoek verricht worden,
zodat er meer punten bekomen worden om een correctere regressie op te stellen.
Het is gekend dat specifieke eiwitten een belangrijke rol spelen in de onderkoelingscapaciteit van
insecten. Antivrieseiwitten voorkomen de groei van gevormde ijskernen waardoor de kans op
bevriezen verlaagt (Duman, 2001). De eiwitbepaling uitgevoerd in deze proef, op basis van de
Kjeldahl stikstofbepaling, was echter een ruwe eiwitbepaling. Hierbij werd enkel het totale
eiwitgehalte bepaald. Er kunnen dus geen conclusies getrokken worden over het gehalte van
specifieke eiwitten aanwezig in de prepoppen. Er kan wel gesteld worden dat een nutriëntenrijk
dieet meer aminozuren aanlevert. Deze kunnen gebruikt worden als bouwsteen van nieuwe
verbindingen, zoals antivrieseiwitten, die de koudetolerantie kunnen verhogen. Er zijn ook enkele
aminozuren gekend die een vriesbeschermende eigenschap bevatten zoals proline en glycine,
twee niet-essentiële aminozuren. Hun vriesbeschermende eigenschappen werden al bewezen in
planten (Hellergren & Li, 1981). Ook in insecten zouden ze deze eigenschappen bezitten (Storey
et al., 1992). Ook cryoprotectants (polyolen zoals glycerol en bepaalde sachariden) kunnen het
onderkoelingspunt beïnvloeden. Baust & Edwards (1979) verklaren dat de aanmaak van
cryoprotectants beïnvloed wordt door het dieet, voornamelijk de koolstofbron. Een dieet rijk aan
vriesbeschermende verbindingen (aminozuren, cryoprotectants) kan het onderkoelingspunt
positief beïnvloeden.
De aanmaak van cryoprotectants en antivrieseiwitten wordt vaak pas geïnitieerd nadat een
bepaalde trigger zich voordoet. Glycerolaccumulatie is temperatuurafhankelijk, waarbij de
concentratie stijgt bij lage temperaturen (Sømme, 1963). Ook de fotoperiode en de diapauzeinitiatie (Wyatt & Kalf, 1957; Wyatt & Meyer, 1959) stimuleren de aanmaak van glycerol.
Aangezien de prepoppen tijdens deze proef niet werden blootgesteld aan een van deze triggers,
kan men concluderen dat de aanmaak van deze verbindingen beperkt was.
1.1.2 De letale tijd bij 5°C
Er werd getest of de chemische samenstelling van de prepop de mortaliteit door koudeschade
beïnvloedt. Verwacht werd dat de prepoppen gekweekt op het nutritioneel rijke dieet de hoogste
overleving zouden behalen en omgekeerd. Maar er werd echter een opmerkelijk resultaat
bekomen. De prepoppen gekweekt op het nutritioneel arme substraat en met het laagste
eiwitgehalte hadden de hoogste overleving bij 5°C. Na een blootstelling van 14,09 dagen aan 5°C
was de helft van de populatie nog in leven. Terwijl de prepoppen gevoederd met het basisdieet bij
een blootstelling van 11,07 dagen aan 5°C slechts een overlevingspercentage vertoonden van
10%. De helft van deze populatie overleefde een blootstelling van 5,8 dagen niet. De prepoppen
met het hoogste eiwitgehalte, gevoederd op het nutritioneel rijke dieet, vertoonden een
Discussie
| 39
gemiddelde overleving bij 5°C met een LT50-waarde van 9,56 dagen. Er kan voorzichtig gesteld
worden dat het eiwitgehalte geen of weinig invloed uitoefent op de overleving bij lage
temperaturen. Hoe schade bij lage temperaturen (“chilling injury”) sterfte bij insecten
veroorzaakt, is nog niet volledig begrepen.
Er spelen waarschijnlijk twee processen een belangrijke rol bij de overleving bij lage
temperaturen. Als eerste moet een gereguleerd metabolisme aangehouden worden (Hochachka,
1986). Zonder een correcte metabolische werking kunnen chemische componenten zich
opstapelen, wat tot toxische concentraties kan leiden. Het niet in standhouden van het
metabolisme kan veroorzaakt worden door een tekort aan reserve-energie, opgeslagen als vetten,
of door de temperatuurafhankelijke werking van verschillende metabolische pathways. De
temperatuurafhankelijke werking van sommige pathways kan het verschil in overleving tussen de
drie diëten niet verklaren, aangezien de prepoppen allemaal dezelfde pathways gebruiken in hun
metabolisme, welke aan dezelfde temperaturen werden blootgesteld. De invloed van het dieet op
het vetgehalte van de zwarte wapenvlieg werd reeds onderzocht door Spranghers et al. (2015).
Aangezien de prepoppen, getest in onze studie, die gekweekt werden op het digestaat de grootste
overleving behaalden wanneer deze werden blootgesteld aan 5°C, wordt er verwacht dat deze
prepoppen beschikken over de grootste vetreserves. Het tegengestelde is echter waar. Volgens
Spranghers et al. (2015) hadden prepoppen gekweekt op digestaat slechts een vetgehalte van 21,8
g/100 g DM. Dit lag respectievelijk 11,8 g/100 drogestof (DS) en 15,3 g/ 100 g DS lager dan de
vetgehaltes van de prepoppen gekweekt op het basis- en een restaurantafvaldieet (Spranghers et
al., 2015). Er kan gesteld worden dat dit suggereert dat ook de vetreserves de overleving van de
zwarte wapenvlieg bij koude niet beïnvloeden. Dit kan echter enkel hypothetisch gesteld worden
aangezien de vetgehaltes van de prepoppen gebruikt in dit onderzoek niet bepaald werden. Deze
kunnen afwijken van de vetgehaltes bekomen door Spranghers et al. (2015).
Een tweede proces dat een rol speelt bij de overleving bij lage temperaturen is het in stand
houden van de ionengradiënt. Hiervoor dient de integriteit van de membranen bewaard te blijven.
Membranen zijn vloeibare barrières, wanneer deze worden blootgesteld aan lage temperaturen
vindt er een faseovergang plaats. Deze faseovergang (van vloeibare fase naar een gelfase)
verhindert de werking van de membraanproteïnen (De Groef, 2009). Dit heeft als gevolg dat de
actieve pompwerking van ionen doorheen het celmembraan verstoord wordt (Hochachka, 1986).
Koštál et al. (2004) toonden aan dat bij een blootstelling aan koude temperaturen de
pompwerking van ionen bij de vuurwants Pyrrhocoris apterus verstoord werd. Wanneer de
adulten werden blootgesteld aan koude temperaturen daalde de concentratie van Na+ ionen in de
hemolymfe sterk (van 0,43 µmol naar 0,24 µmol). Tegelijkertijd steeg de concentratie van K+
ionen (van 0,26 µmol naar 0,46 µmol). Dit geeft aan dat de werking van het Na+/ K+-ATPase
onvoldoende was bij 5°C om de cel inwaartse beweging (volgens de concentratiegradiënt) van
Na+-ionen op te vangen.
Discussie
| 40
De membraanvloeibaarheid is afhankelijk van de verhouding verzadigde en onverzadigde
vetzuren, het cholesterolgehalte en de temperatuur. Een hoge onverzadigd/verzadigd vetzuur
verhouding zorgt voor een meer vloeibaar membraan. Stanley-Samuelson et al. (1988) geven aan
dat de samenstelling van vetzuren in een insect afhankelijk is van de kwaliteit van het dieet. Er
kan hypothetisch gesteld worden dat de hogere overleving van de prepoppen gekweekt op
digestaat te wijten is aan het hogere onverzadigd vetzuurgehalte van de prepoppen. Hierdoor
blijven de membranen meer vloeibaar wanneer ze worden blootgesteld aan koude temperaturen.
Dit is echter een hypothetische verklaring en kan niet bewezen worden met specifieke data van
onze studie. Er is nood aan meer onderzoek om de vetzuurgehaltes van de prepoppen te bepalen.
De prepoppen gevoederd met het nutriëntenarme substraat verschillen van de andere twee
categorieën door hun lage drogestofgehalte. Koštál et al. (2004) toonden aan dat wanneer de
adulten van vuurwantsen, P. apterus, werden blootgesteld aan lage temperaturen (-5°C) er een
verlies in watergehalte was van 12,7%. Echter het waterverlies van de vuurwantsen werd niet
aanzien als de doodsoorzaak bij lage temperaturen. Het grootste deel van het waterverlies was
afkomstig van de hemolymfe terwijl het watergehalte van de intracellulaire compartimenten
ongeveer constant bleef (Koštál et al., 2004). Deze hypothese wordt gesteund door Daultel &
Knülle (1997). Waarschijnlijk beïnvloedt het hoge vochtgehalte van de prepoppen gevoederd op
digestaat de overleving bij lage temperaturen niet.
1.2 Invloed van koude-acclimatisatie
Enkele tropische soorten vertonen een verhoogde koudetolerantie wanneer ze worden
geacclimatiseerd aan koude temperaturen (Renault, 2004). Acclimatisatie aan koude
temperaturen verhoogt het glycerol- (een cryoprotectant) en het antivrieseiwitgehalte. Deze
verbindingen voorkomen bevriezing van de lichaamsvloeistof waardoor het OKP daalt
(Zachariassen, 1985). In dit onderzoek gebeurde de acclimatisatie door de prepoppen een week te
houden bij 16°C. Deze temperatuur is het gemiddelde van de kweektemperatuur (27°C) en de
temperatuur waarbij de overleving bij koude getest werd (5°C).
1.2.1 Het onderkoelingspunt
De koude-acclimatisatie van de prepoppen had geen effect op het onderkoelingspunt. Bij zowel
de geacclimatiseerde als de controle prepoppen trad er gemiddeld een spontane bevriezing op
rond de -11°C. Deze waarde komt overeen met de bekomen onderkoelingspunten van
Schildermans (2015).
Er zijn meerdere onderzoeken die weergeven dat een koude-acclimatisatie het onderkoelingspunt
niet beïnvloedt (Hanson & Craig, 1995; Košťál & Šimek, 1995; Šlachta et al., 2013). Ondanks de
stijging van het trehalosegehalte (een disacharide met vriesbeschermende eigenschappen) na een
koude-acclimatisatie werd er geen verschil in onderkoelingspunt vastgesteld bij poppen van
Discussie
| 41
Hyphantria cunea (Li et al., 2001). Bij andere onderzoeken wordt het onderkoelingspunt echter
wel beïnvloed door een koude-acclimatisatie. In een onderzoek van Smith (1970) werd er een
verschil in onderkoelingspunt vastgesteld tussen de geacclimatiseerde en de niet
geacclimatiseerde Cryptolestes ferrugineus kevers. Dit was eveneens het geval voor het
lieveheersbeestje Cryptolaemus montrouzieri waarbij de adulten die gedurende een week
geacclimatiseerd werden een significant lager OKP hadden dan niet geacclimatiseerde
soortgenoten (Maes, 2015). Maes et al. (2012) toonden aan dat een vergelijkbare korte
acclimatisatie een significante invloed had op het OKP van de roofwants Macrolophus pygmaeus.
Er kunnen hypothetisch twee verklaringen gegeven worden voor deze resultaten. Tijdens een
koude-acclimatisatie synthetiseert de zwarte wapenvlieg helemaal geen cryoprotectants of
antivrieseiwitten. De prepoppen hebben in dit geval geen mogelijkheid om hun koudetolerantie te
verhogen. Ofwel synthetiseren ze wel enkele vriesbeschermende verbindingen maar in een
zodanig lage concentratie dat deze geen invloed uitoefenen op het onderkoelingspunt. Dit lage
gehalte kan te wijten zijn aan het gebruik van een niet-optimaal temperatuurregime voor
acclimatisatie of een te korte tijdsduur van de koude-acclimatisatie.
Deze verklaringen zijn hypothetisch aangezien er geen data beschikbaar zijn over de gehaltes van
de vriesbeschermende verbindingen aanwezig in de prepoppen van H. illucens. Om de
verklaringen te ondersteunen dient de koude-acclimatisatie van de zwarte wapenvlieg verder
onderzocht te worden, met voldoende aandacht voor de temperatuur- en tijdsregimes van de
koude-acclimatisatie.
1.2.2 De letale tijd bij 5°C
Een koude-acclimatisatie beïnvloedde het onderkoelingspunt van de zwarte wapenvlieg niet. Er
werd echter wel een verschil in letale tijd gevonden. De geacclimatiseerde prepoppen vertoonden
hogere LT50 waarden (23,2 dagen) ten opzichte van de controle prepoppen (LT50= 13,94 dagen).
Hypothetisch kan gesteld worden dat de accumulatie van cryoprotectants niet voldoende was om
het onderkoelingspunt te beïnvloeden maar wel een effect uitoefende op de overleving bij koude
temperaturen. Analoog toonden Li et al. (2001) aan dat trehalose-accumalatie het
onderkoelingspunt niet beïnvloedde. Er werd echter wel een verhoogde overleving gevonden bij
lage temperaturen.
Eerder werd vermeld (DEEL III: 1.1.2 letale tijd bij 5°C) dat schade bij koude temperaturen kan
veroorzaakt worden door het verlies van membraanintegriteit. Hierbij speelt de verhouding van
onverzadigde en verzadigde vetzuren een belangrijke rol. Het is gekend dat een acclimatisatie aan
koude temperaturen deze verhouding kan wijzigen (Hodková et al., 1999). Een stijging van het
gehalte onverzadigde vetzuren en daarmee overeenstemmend een daling van het verzadigd
vetzuurgehalte bij lage temperaturen werd waargenomen bij Culex tarsalis (Harwood & Takata,
1964), Periplaneta americana (Baldus & Mutchor, 1988), Drosophila species (Ohtsu et al.,
1993), Epiblema scudderiana, Eurosta solidaginis (Joanisse & Storey, 1996) en Cymbalophora
Discussie
| 42
pudica (Košťál & Simek, 1998). Dit behoud van membraanvloeibaarheid over verschillende
temperaturen wordt gedefinieerd als "homeoviscose adaptatie" (Hazel, 1995). Er zijn geen data
beschikbaar over de verandering in vetzuursamenstelling na een koude-acclimatisatie bij de
prepoppen van de zwarte wapenvlieg. Homeoviscose adaptatie kan enkel hypothetisch gesteld
worden als een verklaring voor het verschil in overleving tussen de geacclimatiseerde en de
controle prepoppen.
1.3 Invloed van het gewicht
In het onderzoek van Schildermans (2015) werd aangetoond dat er geen correlatie bestaat tussen
het gewicht van de prepoppen van de zwarte wapenvlieg en het onderkoelingspunt. Uit de
resultaten van dit onderzoek kan geconcludeerd worden dat het gewicht eveneens geen invloed
uitoefent op de overleving bij 5°C.
Opvallende verschillen werden gevonden tussen de geslachtsverdeling van de lichte en de zware
prepoppen. De vliegen die ontloken uit de lichte prepoppen waren voor 77,33% mannetjes,
terwijl slechts 16% mannetjes werden teruggevonden bij de vliegen die ontloken uit de zwaardere
prepoppen. Dit verschil in geslacht in functie van het gewicht wordt gedefinieerd als seksuele
grootte dimorfisme (“sexual size dimorphism”). De wijfjes van de zwarte wapenvlieg behalen
een grotere lichaamsomvang dan de mannetjes. Dit wordt gedefinieerd als “op wijfjes gebaseerde
seksuele grootte dimorfisme” en is een algemeen verschijnsel bij insecten. Darwin (1874)
verklaart dat het verschil in grootte tussen de geslachten verschillende voordelen met zich
meebrengt in insecten. Mannetjes hebben een kleinere omvang dan de wijfjes. Dit zorgt ervoor
dat ze een snellere ontwikkeling hebben, waardoor ze eerder ontluiken dan de wijfjes en paarrijp
zijn wanneer de wijfjes ontluiken.
1.4 Ecologische relevantie
In de natuur wordt de zwarte wapenvlieg aangetrokken door een grote variatie aan
voedingssubstraten (Newton et al., 2005). De chemische samenstelling van de prepoppen hangt af
van het voedingssubstraat beschikbaar op dat moment. Dit bemoeilijkt de voorspelling van de
koudetolerantie van wilde populaties van de zwarte wapenvlieg.
Insecten overwinteren vaak in een bepaald microklimaat dat de overwinteringstemperatuur
beïnvloedt. Hiermee moet rekening gehouden worden wanneer de overleving bij lage
temperaturen (letale tijd) bepaald wordt. De bepaling van de letale tijd in het laboratorium
gebeurt vaak bij een constant temperatuurregime. Dit komt echter in de natuur zelden voor.
Berkvens et al. (2010) halen aan dat onderzoek naar koudetolerantie louter gebaseerd op
laboratorium populaties niet altijd representatief is voor natuurlijke situaties. Conclusies uit deze
experimenten moeten bijgevolg met een grote voorzichtigheid getrokken worden.
Verschillende stadia van de zwarte wapenvlieg hebben een substraat nodig om te overleven. Het
is dan ook waarschijnlijk dat een groot deel van de levenscyclus (prepop- en popstadium) wordt
Discussie
| 43
doorgebracht in de bodem (microklimaat). De gemiddelde bodemtemperatuur in de winter in
België (op 10 cm diepte) van 1996 tot 2014 bedroeg 4 ± 1°C (Schildermans, 2015). Deze
bodemtemperatuur is minder onderhevig aan temperatuurfluctuaties. Dit geeft aan dat voor het
(pre)popstadium 5°C een geschikte temperatuur is om de overleving bij koude temperaturen te
bepalen.
In dit onderzoek werd een koude-acclimatisatie uitgevoerd. Dit gebeurde echter aan een constante
temperatuur terwijl in de natuur vaak fluctuerende temperaturen voorkomen. Fluctuerende
temperaturen kunnen de koudetolerantie beïnvloeden. Renault et al. (2004) toonden aan dat
fluctuerende temperaturen de overleving van de kever Alphitobius diaperinus bij koude
temperaturen sterk verbeteren. Conclusies uit dit experiment moeten dus met voorzichtigheid
getrokken worden.
1.5 Conclusie
Met maximale LT50-waarden (na een koude-acclimatisatie) van 23 dagen is er een laag tot
medium risico dat de zwarte wapenvlieg kan overleven bij lage temperaturen (Allen, 2009).
Gecombineerd met een gemiddeld onderkoelingspunt van -11°C zou de zwarte wapenvlieg
ingedeeld kunnen worden in de groep: opportunistische overleving (volgens de indeling van Bale,
1996). Volgens deze hypothetische indeling kan de vlieg enkel de winter overleven wanneer een
warme plaats gevonden wordt. Een mest- of composthoop kan dienst doen als een warme plaats.
Dit wordt gesteund door vindingen van Rohacek & Hora (2013) die het voorkomen van de zwarte
wapenvlieg tijdens de wintermaanden in het noordoosten van de Tsjechische republiek
vaststelden. Deze vliegen konden de koude winter in een mesthoop overleven dankzij de warmte
gegenereerd door bacteriële activiteit. Eveneens werd de mesthoop bedekt met een sneeuwlaag
waardoor deze afgeschermd werd voor de koudere luchttemperaturen.
Soorten met een opportunistische overleving hebben een gebrekkige koudetolerantie. Deze
koudetolerantie is echter afhankelijk van de chemische samenstelling van het insect. Er kan met
grote waarschijnlijkheid gesteld worden dat een hoger eiwitgehalte het onderkoelingspunt
positief beïnvloedt maar geen invloed uitoefent op de overleving bij koude temperaturen. Een
hoger verzadigd vetzuurgehalte of een hoger gehalte aan vriesbeschermende middelen (zoals
proline) kan hypothetisch zorgen voor een hogere overleving bij lage temperaturen. Deze
overleving bij lage temperaturen wordt mogelijks bevorderd door een voorafgaande koudeacclimatisatie.
2. Fecunditeitskarakteristieken van H. illucens
Er werden reeds vele onderzoeken uitgevoerd waarbij de invloed van het gewicht op de
fecunditeit van insecten onderzocht werd. Echter de methode waarop de fecunditeit bepaald werd
verschilt. Sommige auteurs bepalen de fecunditeit aan de hand van een dissectie waarbij de
gevormde oöcyten of eitjes in de ovaria geteld worden. Dit is echter voor soorten, waarbij de
Discussie
| 44
oögenese verder gaat tijdens het volwassenstadium, een beperkte bepaling van de fecunditeit.
Enkel een initiële reproductiemogelijkheid wordt bepaald en niet de totale fecunditeit. Voor deze
soorten is het vaak, maar niet altijd (Vandekerkhove et al, 2006), noodzakelijk om de levenslange
fecunditeit te bepalen (Leather, 1988). Hierbij wordt er gekeken naar de ei-afleg van de insecten
tijdens de volledige ovipositieperiode. Er zijn echter ook auteurs die maar een gedeelte van de
ovipositieperiode gebruiken voor de bepaling van de fecunditeit (Honĕk, 1993).
De zwarte wapenvlieg legt eenmalig haar eitjes af (tenzij de ei-afleg wordt verstoord) in droge
spleten. De fecunditeit kan bepaald worden aan de hand van een dissectie of door de bepaling van
de levenslange fecunditeit. Tomberlin (2001) voerde een dissectie uit 2 dagen nadat de paring
plaatsvond (op het moment dat de ei-afleg zou plaatsvinden) om de fecunditeit van de zwarte
wapenvlieg te bepalen. Er werden echter geen eitjes teruggevonden. Het kwantificeren van de
gevormde eitjes via een dissectie is niet vanzelfsprekend (eigen ervaring). Daarom werd er in dit
onderzoek geopteerd om de fecunditeit te bepalen aan de hand van de levenslange
fecunditeitsbepaling. De fecunditeit werd hierbij gedefinieerd als het aantal afgelegde eitjes per
wijfje.
Minder dan de helft (46%) van de lichte wijfjes waren in staat om levensvatbare ei-clusters af te
leggen. Hieruit kan afgeleid worden dat de lichtere wijfjes minder in staat zijn om een
succesvolle paring en ei-afleg te volbrengen. Ook is uit preliminaire proeven gebleken dat de
lichtere wijfjes een hoger mortaliteitspercentage vertonen in vergelijking met de andere
gewichtsklassen. De lichte wijfjes die wel in staat waren om levensvatbare ei-clusters af te
leggen, legden even goede eitjes af, in termen van uitkomingspercentage, in vergelijking met de
andere gewichtsklassen. Er werd geen significant verschil gevonden in het gemiddeld
ontluikingspercentage. Ook de gemiddelde individuele ei-gewichten waren niet significant
verschillend.
In tegenstelling tot het “fecunditeitsvoordeel” model van Darwin (1874), waarbij verwacht wordt
dat de zwaardere wijfjes het grootste aantal eitjes produceren, is er geen significant verschil te
vinden in het aantal eitjes geproduceerd door de medium en zware vliegen. Het zijn zelfs de
vliegen met een medium gewicht die gemiddeld het hoogste aantal eitjes produceren (739). Dit
aantal is echter wel significant verschillend met het gemiddeld aantal eitjes geproduceerd door de
lichte vliegen (532). Dit laat uitschijnen dat er waarschijnlijk een lineair verband kan gevonden
worden tussen het gewicht en de fecunditeit zoals beschreven door Honĕk (1993), maar dat dit
enkel opgaat tot een bepaald optimaal gewicht. Er kon echter geen regressie worden opgesteld
tijdens dit experiment aangezien niet geweten is welke ei-cluster door welk wijfje werd afgelegd.
Dezelfde resultaten werden gevonden bij een onderzoek van Jiménez-Pérez & Wang (2004)
waarin de fecunditeit van bladroller Cnephasia jactatana onderzocht werd. De fecunditeit van de
wijfjes steeg lineair binnen de klasse van lichte en de medium wijfjes. Bij de zwaardere wijfjes
toonde de fecunditeit echter een asymptotisch verloop.
Shine (1988) geeft weer dat het “voordeelfecunditeit” model van Darwin (1874) enkel van
toepassing is op insecten die niet gelimiteerd zijn in hun voedselopnames. Wanneer de opname
Discussie
| 45
van energie beperkt is moet het wijfje kiezen: investeren in eigen onderhoud of in de reproductie.
Met andere woorden alles wat geïnvesteerd wordt in het onderhoud van het wijfje kan niet meer
gebruikt worden voor de reproductie. Om de fecunditeit te maximaliseren moet het wijfje al haar
opgeslagen energie investeren in de reproductie. De fecunditeit stijgt enkel met het gewicht als de
energie-opname ook gewichtsafhankelijk is. De grotere wijfjes hebben meer opslagplaats voor
gevormde oöcyten. Maar als ze de energie niet hebben om deze ruimte volledig op te vullen
kunnen ze geen voordeel halen uit hun grotere omvang.
De zwarte wapenvlieg voedt zich niet meer eens het volwassen stadium bereikt is (Tomberlin,
2001). Dit wil zeggen dat alle energie voor de reproductie moet gehaald worden uit de
energiereserves opgeslagen tijdens de larvale stadia. Deze energie moet verdeeld worden tussen
eigen onderhoud en energie voor de reproductie. Dit betekent dat wijfjes die later paren minder
energie over hebben om te investeren in de reproductie, wat resulteert in een lagere fecunditeit.
Eens de ei-afleg gebeurd is, sterven de wijfjes binnen enkele dagen (eigen observatie), aangezien
hun vetreserves volledig opgebruikt zijn (Tomberlin et al. 2001). Hieruit kan geconcludeerd
worden dat de zwaardere wijfjes een grotere fecunditeit kunnen behalen indien ze grotere
vetreserves tot hun beschikking hebben. Data over de vetgehaltes van de prepoppen in de
verschillende gewichtsklassen zijn echter niet beschikbaar. Er kan enkel hypothetisch gesteld
worden dat de vetreserves van de vlieg positief gecorreleerd zijn met de grootte van de vlieg,
waarbij de zwaarste vliegen de grootste reserves hebben opgeslagen en de lichtste de minste.
Indien de hypothese waarbij zware vliegen de hoogste vetreserves hebben gevolgd wordt, zouden
de zware vliegen de hoogste fecunditeit moeten bekomen. De fecunditeit van de zware vliegen
verschilde echter niet significant van deze van de medium vliegen, deze lag zelfs lager.
Zwaardere wijfjes hebben echter meer energie nodig voor hun eigen onderhoud. Ze zijn eveneens
gevoeliger aan stress situaties zoals hoge temperaturen, grote densiteit of een tekort aan voeding
(Blackenhorn, 2000). Tijdens het uitvoeren van dit experiment werden een deel van de zware
vliegen kort blootgesteld aan onvoorziene warmtestress. Dit kan de fecunditeit van de vliegen
sterk beïnvloed hebben. Echter de gemiddelde gewichten van de ei-clusters gelegd in de getroffen
kooi verschilden niet significant van de ei-clusters gelegd in de nieuw aangemaakte kooi met
zware vliegen. Dit geeft aan dat de korte warmtestress geen of weinig invloed uitoefende op de
fecunditeit van de zware vliegen.
Een toepassing van de zwarte wapenvlieg is het gebruik van deze vlieg voor de reductie van
mest. Hiervoor is er nood aan een succesvol kweeksysteem. Het is belangrijk om een groot aantal
eitjes te bekomen in een zo kort mogelijke tijdspanne. Voor een optimale mestverwerking op een
leghennenboerderij met een gemiddelde grootte (25000 hennen) is er per week nood aan 13 liter
eitjes van de huisvlieg M. domestica (Čičková et al., 2011). Om dit aantal eitjes te kunnen
verzamelen, dient een hoge densiteit gehanteerd te worden tijdens de kweek. Optimaal wordt er
gewerkt met individuen van een medium gewichtsklasse. Deze zijn minder gevoelig aan stress
situaties maar kunnen voldoende vetreserves opslaan om voldoende eitjes te produceren.
Discussie
| 46
Uit ons onderzoek blijkt dat de zwarte wapenvlieg eenmalig een ei-cluster aflegt van gemiddeld
647 eitjes. Deze clusters wegen gemiddeld 0,016 g en het individuele ei-gewicht bedraagt
gemiddeld 0,024 mg. Deze fecunditeitskarakteristieken stemmen overeen met de resultaten
gepubliceerd door Tomberlin (2001). In het onderzoek van Tomberlin (2001) werden er geen
significante verschillen vastgesteld tussen de fecunditeitskarakteristieken van wijfjes gekweekt
op verschillende diëten. Zoals eerder vastgesteld in dit onderzoek (DEEL IV: 1.1 Invloed van het
dieet) bepaalt het dieet het gewicht van de prepoppen. Er wordt verwacht dat het dieet ook een
invloed uitoefent op de fecunditeit van de zwarte wapenvlieg. Dit werd reeds aangetoond door
Gobbi et al. (2013). De resultaten bekomen door Tomberlin (2001) kunnen verklaard worden aan
de hand van de nutritionele samenstelling van de gebruikte diëten. De diëten gebruikt door
Tomberlin (2001) hadden een gelijke nutritionele samenstelling waardoor de gewichten van de
prepoppen gevoed op deze diëten niet verschilden.
Ondanks het niet significant verschillende individuele ei-gewicht werden er significante
verschillen gevonden tussen de gewichten van de nakomelingen van de wijfjes behorend tot de
verschillende gewichtsklassen. De omgevingsfactoren (temperatuur, de voeding, de densiteit en
de relatieve vochtigheid) waren voor alle gewichtsklassen gelijk. Dit geeft aan dat het verschil in
gewicht enkel kan verklaard worden door een genetische factor.
2.1 Conclusie
Ecologische factoren, zoals de temperatuur, het larvale dieet en de populatiedensiteit tijdens de
larvale stadia, kunnen het gewicht van de wijfjes sterk beïnvloeden. De genetische factoren
mogen echter niet verwaarloosd worden. Zwaardere wijfjes produceren zwaardere nakomelingen.
Indien zwaardere nakomelingen een grotere fecunditeit behalen is er een evolutie naar een
zwaardere populatie.
Uit dit onderzoek kan er echter hypothetisch vastgesteld worden dat er een asymptotisch verband
bestaat tussen het gewicht en de fecunditeit van de zwarte wapenvlieg. Er zou een optimaal
gewicht bestaan waarbij de grootste fecunditeit wordt bekomen. Dit geeft aan dat de
“fecunditeitsvoordeel” theorie van Darwin (1847) niet opgaat voor de zwarte wapenvlieg maar
dat deze meer aanleunt bij de “stabiele seksuele selectie” theorie, beschreven door Thompson &
Fincke (2002), waarbij de zwaarste individuen niet altijd een reproductief voordeel hebben ten
opzichte van de andere gewichtsklassen.
| 47
SAMENVATTING
Insecten kunnen op verschillende manieren een koudetolerantie ontwikkelen. Deze
koudetolerantie hebben ze nodig om de koude temperaturen tijdens de wintermaanden te
overleven. Op basis hiervan worden ze opgedeeld in 5 categorieën: vriesontwijkende,
vriestolerante, koeltolerante, koelvatbare soorten en soorten met een opportunistische overleving.
Het voorkomen van koude temperaturen vormt vaak een barrière voor de verspreiding van
tropische en subtropische soorten. Er zijn echter ook tropische soorten gekend die een
koudetolerantie kunnen ontwikkelen. Wanneer deze soorten geïntroduceerd worden in een
gematigd gebied bestaat de kans dat ze zich vestigen in het leefmilieu en de inheemse
biodiversiteit negatief beïnvloeden (invasieve soorten).
De zwarte wapenvlieg is van oorsprong afkomstig uit de subtropische en tropische gebieden van
Noord- en Zuid-Amerika. Door haar vele waardevolle toepassingen (conversie van afvalstromen,
hoogwaardige eiwitbron) heerst er een wereldwijde interesse voor deze soort wat de verspreiding
van de soort bevordert. Ook in België is er interesse naar de soort en haar toepassingen.
De koudetolerantie van verschillende ontwikkelingsstadia van de vlieg werd reeds onderzocht.
Met een onderkoelingspunt van -11°C en een LT50-waarde van 7 dagen werd de kans klein geacht
dat de vlieg zich kan ontwikkelen in het gematigde klimaat van België. Tijdens de bepaling van
de koudetolerantie werd er echter geen rekening gehouden met enkele ecologische aspecten die
een invloed kunnen uitoefenen op de koudetolerantie. Het doel van deze thesis was om het effect
van enkele ecologische factoren (het dieet en koude-acclimatisatie) en het lichaamsgewicht op de
koudetolerantie van de zwarte wapenvlieg te onderzoeken.
De larven van de zwarte wapenvlieg kunnen zich voeden op zeer uiteenlopende substraten:
groenteafval, mest, compost, etc. De chemische samenstelling van het insect is afhankelijk van
welk substraat op dat moment beschikbaar is. Zo was er in onze studie een verschil van 3 g
eiwit/100 g prepop indien de prepoppen zich voedden op een nutriëntenrijk in vergelijking met
een nutriëntenarm substraat. Het eiwitgehalte van de prepoppen was positief gecorreleerd met
hun onderkoelingspunt, met een verschil van 3°C tussen het nutriëntenrijk en het nutriëntenarm
dieet.
Omdat het onderkoelingspunt alleen geen betrouwbare voorspeller is van de koudehardheid van
een insect werd de overleving bij koude temperaturen boven het vriespunt bepaald. Dit gebeurde
door een experimentele bepaling van de letale tijd bij 5°C. Ondanks het gegeven dat er wel een
verschil vastgesteld werd in overleving tussen de drie diëten, was dit niet gecorreleerd met het
eiwitgehalte van de prepoppen. De hoogste overleving werd vastgesteld bij het nutriëntenarm
dieet met een LT50-waarde van 14 dagen gevolgd door het nutriëntenrijk en nutriënten gemiddeld
dieet met LT50-waarden van respectievelijk 10 en 6 dagen.
Een koude-acclimatisatie is een tweede ecologisch aspect dat onderzocht werd. Een koudeacclimatisatie geeft het individuele insect de tijd om zich aan te passen aan de koude
temperaturen. Hierbij worden cryoprotectants en antivrieseiwitten geaccumuleerd. Dit proces was
Samenvatting
| 48
echter niet voldoende om het onderkoelingspunt van de prepoppen van H. illucens te
beïnvloeden. Een verschil in overleving bij 5°C werd echter wel vastgesteld, waarbij de helft van
de geacclimatiseerde prepoppen 10 dagen langer overleefden dan de controle prepoppen. Dit
verschil zou onder andere toe te schrijven kunnen zijn aan het verschil in de verhouding van het
onverzadigd en het verzadigd vetzuurgehalte.
Als derde factor werd de invloed van het gewicht op de letale tijd bepaald. Er was reeds geweten
dat het gewicht het onderkoelingspunt niet beïnvloedt. Uit dit onderzoek is gebleken dat ook de
overleving bij 5°C niet wordt beïnvloed door het gewicht van de prepoppen. Een tweede
opmerkelijk resultaat uit dit experiment werd bekomen door een geslachtsbepaling toe te passen
op de ontloken vliegen. Hierbij werd vastgesteld dat 77% van de lichte vliegen mannetjes waren
in vergelijking met 16% van de zware vliegen. Dit geeft aan dat de vlieg een seksuele grootte
dimorfisme kent.
Op basis van de bekomen resultaten kan er besloten worden dat de zwarte wapenvlieg behoort tot
de soorten met een opportunistische overleving bij koude. Waarbij de overwintering van de vlieg
enkel mogelijk is indien deze een warme plaats vindt. Een koude-acclimatisatie kan het
overwinteringspotentieel verhogen maar dit dient verder onderzocht te worden.
In het laatste aspect van de thesis werd de focus gelegd op de fecunditeitskarakteristieken van de
zwarte wapenvlieg. Een gemiddeld wijfje uit dit onderzoek legt eenmalig een ei-cluster af met
een gewicht van 0,016 g, bestaand uit 647 eitjes met een individueel ei-gewicht van 0,024 mg.
De fecunditeit is belangrijk in een massakweeksysteem, waar men met zo weinig mogelijk
vliegen een zo groot mogelijk aantal nakomelingen wil bekomen op een zo kort mogelijke tijd.
Het “fecunditeitsvoordeel” model stelt dat zwaardere wijfjes een groter fecunditeitspotentieel
hebben. Dit model lijkt echter niet van toepassing op de zwarte soldatenvlieg. De vliegen met de
grootste fecunditeit behoorden tot de wijfjes met een gemiddeld gewicht met 739 eitjes per legsel
gevolgd door respectievelijk de zware en de lichte wijfjes. Er wordt een asymptotisch verband
voorgesteld met een optimaal gewicht waarbij de fecunditeit het grootst is.
Tot slot werd waargenomen dat het lichaamsgewicht van de moeder de gewichten van haar
nakomelingen sterk beïnvloedt. De zware wijfjes produceren de zwaarste nakomelingen. Dit
werd onderzocht onder constante ecologische condities (temperatuur, densiteit, voeding) wat
aangeeft dat de correlatie te verklaren valt door een genetische factor.
| 49
LITERATUURLIJST
Alcock, J. (1990). A large competitive advantage in a lekking fly, Hermetia comstocki Williston
(Diptera: Stratiomyidae). Psyche, 9, 267-279.
Allen, C.M. (2009). Thermal biology and behavior of two predatory Phytoseiid mites: Amblyseius
swirskii (Athias-Henriot) (Acari:Phytoseiidae) and Phytoseiulus longipes (Evans) (Acari:Phytoseiidae).
Doctoraat, University of Georgia.
Alvarez, L. (2012). The role of black soldier fly, Hermetia illucens (L.) (Diptera: Stratiomyidae)
in sustainable waste management in Northern climates. Elektronische thesis, University of
Windsor.
Atwal, A.S. (1955). Influence of temperature, photoperiod, and food on the speed of
development, longevity, fecundity, and other qualities of the Diamond-Back moth Plutella
Maculipennis (Curtis)(Lepidoptera: Tineidae). Australian J. of Zool., 3, 185-221.
Baldus, T.J. & Mutchmor, J.A. (1988). The effects of temperature acclimation on the fatty acid
composition of the nerve cord and fat body of the American cockroach, Periplaneta
americana. Comp. Biochem. Physiol. Part A: Physiol., 89, 141-147.
Bale, J. S. (1996). Insect cold hardiness: A matter of life and death. Eur. J. Entomol, 93, 369-382.
Bale, J.S. (1991). Insects at low temperature: a predictable relationship? Funct. Ecol, 5, 291-298.
Bale, J.S. (1993). Classes of insect cold hardiness. Funct. Ecol., 7, 751-753.
Baust, J.G. & Edwards, J.S. (1979). Mechanisms of freezing tolerance in an Antarctic midge,
Belgica antartica. Physiol. Ent.,4, 1-5.
Baust, J.G. & Lee, R.E.Jr. (1981). Divergent mechanisms of frost-hardiness in two populations of
the gall fly, Eurosta solidaginis. J. Insect Physiol., 27, 485-490.
Baust, J.G. & Lee, R.E.Jr. (1983). Population differences in antifreeze/cryoprotectant
accumulation patterns in an Antarctic insect. Oikos,40, 120-124.
Bellman, H. & Heitmans, W. (2001). Insecten: wapenvliegen (Familie: Stratiomyidae)
Insectengids. Tirion, Baarn. http://www.soortenbank.nl (gelezen op 19 mei 2016).
Block, W. & Zettel, J. (1980). Cold hardiness of some alpine Collembola. Ecol. Entomol., 5, 1-9.
Berkvens, N., Bale, J.S., Berkvens, D., Tirry, L. & De Clercq, P. (2010). Cold tolerance of the
harlequin ladybird Harmonia axyridis in Europe. J. of Insect Physiol., 56, 438-444.
Blankenhorn, W.U. (2000). The evolution of body size: what keeps organisms small? Quart. Rev.
Biol. 75, 1-23.
Literatuurlijst
| 50
Bondari, K. & Sheppard, D.C. (1981). Soldier fly larvae as feed in commercial fish production.
Aquaculture, 24, 103-109.
Booram Jr, C. V., Newton, G. L., Hale, O. M., & Barker, R. W. (1977). Manure residue as a
substrate for protein production via Hermetia illucens larvae [for swine rations]. In 9. Cornell
Agricultural Waste Management Conference. Ann Arbor, Mich.(USA). 1977.
Booth, D.C. & Sheppard, C. (1984). Oviposition of the black soldier fly, Hermetia illucens
(Diptera: Stratiomyidae): Eggs, masses, timing and site characteristics. Environ. Entomol., 13,
421-423.
Cannon, R.J.C. (1987). Effects of low temperature acclimation on the survival and cold tolerance
of an Antarctic mite. J. Insect Physiol, 33, 509-521.
Carroll, A.L. & Quiring, D.T. (1993). Interactions between size and temperature influence
fecundity and longevity of a tortricid moth, Zeiraphera Canadensis. Oecologia, 93, 233-241.
Čičková, H., Kozánek, M., Martİnez-Sánchez, A., Pastor B., Rojo, S. & Takác P. (2011). Effect
of the size of the pupae, adult diet, oviposition substrate and adult population density on egg
production in Musca domestica (Diptera: Muscidae). Eur. J. Entomol., 108, 587-596.
Colhoun, E.H. (1960). Acclimatization to cold in insects. Ent. Exp. & appl., 3, 27-37.
Coulson, S.C. & Bale, J.S. (1990). Characterization and limitations of the rapid cold hardening
response in the housefly Musca domestica. J. Insect Physiol., 36, 207-211.
Danks, H.V. (2005). Key themes in the study of seasonal adaptations in insects. Patterns of cold
hardiness. Appl. Entomol, Zool., 40, 199-211.
Darwin, C. (1872). The descent of man, and selection in relation to sex (Vol. 2). New York: D.
Appleton.
Dautel, H. & Knülle, W. (1997). Cold hardiness, supercooling ability and causes of lowtemperature mortality in the soft tick, Argas reflexus, and the hard tick, Ixodes ricinus (Acari:
Ixodoidea) from Central Europe. Journal of Insect Physiology, 43, 843-854.
De Graeve, F., Medaer, F., Nicolaus, W. & Reybroeck, E. (2014). Kweek en toepassing van
insecten als duurzame eiwitbron. Bachelorproef, Universiteit Gent.
De Groef, B. (2009). De wetenschap van het leven. Over eenheid in biologische diversiteit. Acco.
De Vries, A.L. & Lin, Y. (1977). Structure of a peptide antifreeze and mechanism of adsorption
to ice. Biochim. Biophys. Acta, 495, 388-392.
Duman, J. & Horwath, K. (1983). The role of hemolymph proteins in the cold tolerance of
insects. Ann. Rev. Physoil., 45, 261-270.
Literatuurlijst
| 51
Duman, J.G. (1977). Environmental effects on antifreeze levels in larvae of the darkling beetle,
Meracantha contracta. J. Exp. Zool., 201, 333-337.
Duman, J.G. (1982). Insect antifreezes and ice-nucleating agents. Cryobiology, 19, pp.613-627.
Duman, J.G. (2001). Antifreeze and ice nucleator proteins in terrestrial arthropods. Annu. Rev.
Physiol., 63, 327-357.
Farrant, J. (1980). General observation on cell preservation. In “low temperature preservation in
biology and medicine”. Univ. Park Press.
Fields, P.G., Fleurat-Lessard, F., Lavenseau, L., Febvay, G., Peypelut, L. & Bonnot, G. (1998).
The effect of cold acclimation and deacclimation on cold tolerance, trehalose and free amino acid
levels in Sitophilus granaries and Cryptolestes ferrugineus (Coleoptera). J. of Insect Physiol, 44,
955-965.
Gates, D.M. (1980). Biophysical Ecology. Springer-Verlag, New York and Berlin.
Gobbi, P., Martínez-Sánchez, A. & Rojo, S. (2013). The effects of larval diet on adult life-history
traits of the black soldier fly, Hermetia illucens (Diptera: Stratiomyidae). European J.
Entomol., 110, 461.
Gonzalez, J.V., Young, W.R. & Genel, M.R. (1963). Reducción de la población de mosca
domestica en gallinaza por la mosca soldado en el trópico. Agric. Tec. Mex., 2, 53-57.
Hanson, S.M. & Craig, G.B.jr. (1995). Relationship between cold hardiness and supercooling
point in Aedes albopictus eggs. J. Am. Mosquito Contr., 11, 53-38
Harwood, R.F. & Takata, N. (1964). Effect of photoperiod and temperature on fatty acid
composition of the mosquito Culex tarsalis. J. Insect physiol, 11, 711-716.
Hazel, J.R. (1995). Thermal adaptation in biological membranes: Is homeoviscous adaptation the
explanation. Annu. Rev. Physiol, 57, 19-42.
Hellergren, J. & Li, P. H. (1981). Survival of Solanum tuberosum suspension cultures to–14° C:
The mode of action of proline. Physiol. Plantarum, 52, 449-453.
Hochachka, P.WP (1986). Defense strategies against hypoxia and hypothermia. Sci., 231, 234241.
Hodková, M., Šimek, P., Zahradnı́čková, H. & Nováková, O. (1999). Seasonal changes in the
phospholipid composition in thoracic muscles of a heteropteran, Pyrrhocoris apterus. Insect
Biochem. Mol. Biol., 29, 367-376.
Holmes, L. (2010). Role of abiotic factors on the development and life history of the black soldier
fly, Hermetia illucens (L.) (Diptera: Stratiomyidae). Thesis, University of Windsor.
Literatuurlijst
| 52
Honĕk, A. (1993). Intraspecific variation in body size and fecundity in insects: A general
relationship. Oikos, 66, 483-492.
Horwath, K.L. & Duman, J.G. (1982). Involvement of the circadian system in photoperiodic
regulation of insect antifreeze proteins. J. EXP. Zool., 219, 267-270.
IVN. (2016). Overwinteren. Geraadpleegd op 31 mei 2016. https://www.ivn.nl/afdeling/gooi-enomstreken/insecten/overwinteren.
Jiménez-Pérez, A. & Wang, Q. (2004). Effect of body weight on reproductive performance in
Cnephasia jactatana (Lepidoptera: Tortricidae). J. Insect Behav., 14, 511-522.
Joanisse, D.R. & Storey, K B. (1996). Fatty acid content and enzymes of fatty acid metabolism in
overwintering cold-hardy gall insects. Physiol. Zool., 69, 1079-1095.
Kaneko, J., Yoshida, T., Owada, T., Kita, K. & Tanno, K. (1991). Erwinia herbicola: Ice
nucleation active bacteria isolated from diamondback moth, Plutella xylostella L. pupae. Jap. J.
Appl. Entomol. Zool., 35, 247-251.
Košťál, V. & Šimek, P. (1995). Dynamics of cold hardiness, supercooling and cryoprotectants in
diapausing and non-diapausing pupae of the cabbage root fly, Delia radicum L. J. Insect
Physiol., 41, 627-634.
Košťál, V. & Šimek, P. (1998). Changes in fatty acid composition of phospholipids and
triacylglycerols after cold-acclimation of an aestivating insect prepupa. J. Comp. Physiol. B., 168,
453-460.
Koštál, V. Vambera, J. & Bastl, J. (2004). On the nature of pre-freeze mortality in insects: water
balance, ion homeostasis and energy charge in the adults of Pyrrhocoris apterus. J. Exp.
Biol., 207, 1509-1521.
Krunic, M. & Radovic, L. (1974). The effect of gut content evacuation on the increase in cold
hardiness in Megachile rotundata. Entomol., 17, 526-528.
Larsson, F.K. (1990). Female body size relationships with fecundity and egg size in two solitary
species of fossorial Hymenoptera (Colletidae and Sphecidae). Entomol. Gener., 15, 167-171.
Leather, S. R. (1988). Size, reproductive potential and fecundity in insects: things aren't as simple
as they seem. Oikos, 51, 386-389.
Lee, R.E.Jr. & Denlinger, D.L. (1985). Cold tolerance in diapausing and non-diapausing stages of
the flesh fly, Sarcophaga crassipalpis. Physoil. Entomol., 10, 309-315.
Lee, R.E.Jr. & Denlinger D.L. (1991). Insects at low temperature. New York: Chapman and hall
.
Lee, R.E.Jr. (1989). Insect cold-hardiness: To freeze or not to freeze. BioScience, 39, 308-313.
Literatuurlijst
| 53
Lee, R.E.Jr., Chen, C. & Denlinger, D.L. (1987). A rapid cold-hardening process in insects. Sci.,
238, 1415-1417.
Lee, R.E.Jr., Costanzo, J.P. & Mugnano, J.A. (1996). Regulation of supercooling and ice
nucleation in insects. Eur. J. Entomol., 93, 405-418.
Lee, R.E.Jr., Damodaran, K., Yi, S. & Lorigan, G.A. (2006). Rapid cold-hardening increases
membrane fluidity and cold tolerance of insect cell. Cryobiology, 52, 459-463.
Leibee, G.L. (1984). Influence of temperature on development and fecundity of Liriomyza trifolii
(Burges) (Diptera: Agromyzidae) on Celery. Envirom. Etnomol., 13, 497-501.
Li, Y. P., Goto, M., Ito, S., Sato, Y., Sasaki, K. & Goto, N. (2001). Physiology of diapause and
cold hardiness in the overwintering pupae of the fall webworm Hyphantria cunea (Lepidoptera:
Arctiidae) in Japan. J. Insect Physiol., 47, 1181-1187.
Loeschcke,V. & Sørensen, J.G. (2005). Acclimation, heat shock and hardening: a response from
evolutionary biology. J. Therm. Biol., 30, 255-257.
Maes, S., Machtelinckx, T., Moens, M., Gregoire, J.C. & De Clercq, P. (2012). The influence of
acclimation, endosymbionts and diet on the supercooling capacity of the predatory bug
Macrolophus pygmaeus. BioControl, 57, 643–651.
Maes, S., Grégoire, J.C. & De Clercq, P. (2015). Cold tolerance of the predatory ladybird
Cryptolaemus montrouzieri. BioControl, 60, 199–207.
Marshall, L.D. (1990). Intraspecific variation in reproductive effort by female Parapediasia
teterella (Lepidoptera: Pyralidae) and its relation to body size. Can. J. Zool., 68, 44–48
May, B.M. (1961). The occurrence in New Zealand and the life-history of the soldier fly
Hermetia illucens (L.) (Diptera: Stratiomyidae). N. Z. J. Sci., 4, 55-65.
Mazur, P. (1984). Freezing of living cells: mechanisms and implications. Am. J. Physiol., 247,
125-142.
McLain, D.K. (1991). Heritability of size: a positive correlate of multiple fitness components in
the southern green stink bug (Hemiptera: Pentatomidae). Ann. Entomol. Soc. Am., 84, 174-178.
Miller, L.K. (1982). Cold-hardiness strategies of some adult and immature insects overwintering
in interior Alaska. Comp. Biochem. Physiol., 73, 595-604.
Myers, H.M., Tomberlin, J K., Lambert, B.D. & Kattes, D. (2008). Development of black soldier
fly (Diptera: Stratiomyidae) larvae fed dairy manure. Environ. Entomol. Sci., 37, 11-15.
Literatuurlijst
| 54
Newton, G.L., Booram, C.V., Barker, W. & Hale, O.M. (1977). Dried Hermetia illucens larvae
meal as a supplement for swine. J. Anim. Sci., 44, 395-400.
Newton, G.L., Sheppard, D. Watson, D.W., Burtle, G.J., Dove, C.R., Tomberlin, J.K. & Thelen,
E.E. (2005). The black soldier fly, Hermetia illucens, as a manure management/resource recovery
tool. Symposium on the state of the science of Animal Manure and Waste Manegement, 5-7.
Nunney, L. & Cheung, W. (1997). The effect of temperature on body size and fecundity in
female Drosophila melanogaster: Evidence for Adaptive Plasticity. Evolution, 5, 1529-1535.
Ohtsu, T., Katagiri, C., Kimura, M. T. & Hori, S. H. (1993). Cold adaptations in Drosophila.
Qualitative changes of triacylglycerols with relation to overwintering. J. Biol. Chem., 268, 18301834.
Preziosi, R.F. & Fairbairn, D.J. (1996). Body size and fecundity in the waterstrider Aquarius
remiges: a test of Darwin’s fecundity advantage hypothesis. Oecologia, 108, 424-431.
Renault, D., Nedved, O., Hervant, F. & Vernon, P. (2004). The importance of fluctuating thermal
regimes for repairing chill injuries in the tropical beetle Alphitobius diaperinus (Coleoptera:
Tenebrionidae) during exposure to low temperature. Physiol. Entomol., 29, 139-145.
Renault, D., Salin, C., Vannier, G. & Vernon, P. (2002). Survival at low temperatures in insects:
what is the ecological significance of the supercooling point? Cryo-Lett., 23, 217-228.
Richards, M.J. & Myers, J.H. (1980). Maternal influence on size and emergence time of the
cinnabar moth. Can. J. Zool. 58, 1452-1457.
Rickards, J., Kelleher, M.J. & Storey, K.B. (1987). Strategies of freeze avoidance in larvae of the
goldenrod gall moth Epiblemma scudderiana: winter profiles of a natural population. J. Insect
Physio., 33, 443-450.
Rohácek, J. & Hora, M. (2013). A northernmost European record of the alien black soldier fly
Hermetia illucens (Linnaeus, 1758)(Diptera: Stratiomyidae). Casopis Slezského Zemského
Muzea, 62, pp. 101.
Salt, R.W. (1961). Principles of insect cold hardiness. Annu. Rev. Entomol., 6, 55-74.
Schildermans, K. (2015). Overwinteringsvermogen van de zwarte wapenvlieg, Hermetia illucens.
Thesis, Universiteit Gent.
Sheppard, C. (1983). House fly and lesser fly control utilizing the black soldier fly in manure
management systems for caged laying hens. Environ. Entomol., 12, 1439-1442.
Sheppard, D.C., Newton, G.L., Thompson, S.A. & Savage, S. (1994). A value added manure
management system using the black soldier fly. Biosource Technol., 50, 275-279.
Literatuurlijst
| 55
Sheppard, D.C., Tomberlin, J.K., Joyce, J.A., Kiser, B.C. & Sumner, S.M (2002). Rearing
methods for the black soldier fly (Diptera: Stratomyiadae) in a colony. J. Med. Entomol., 39, 695698.
Shine, R. (1988). The evolution of large body size in females: A critique of Darwin’s “fecundity
advantage” model. Am. Nat., 131, 124-131.
Sinclair, B.J. & Roberts, S. P. (2005). Acclimation, shock and hardening in the cold. J. Therm.
Boil., 30, 557-562.
Sinclair, B.J. (1999). Insect cold tolerance: How many kinds of frozen? Eur. J. Entomol.,96, 157164.
Šlachta, M., Berková, P., Vambera, J. & Košťál, V. (2002). Physiology of cold-acclimation in
non-diapausing adults of Pyrrhocoris apterus (Heteroptera). Eur. J. Entomol, 99, 181-187.
Šlachta, M., Berková, P., Vambera, J. & Košťál, V. (2013). Physiology of cold-acclimation in
non-diapausing adults of Pyrrhocoris apterus (Heteroptera). EJE, 99, 181-187.
Smith, L. B. (1970). Effects of cold-acclimation on supercooling and survival of the rusty grain
beetle, Cryptolestes ferrugineus (Stephens)(Coleoptera: Cucujidae), at subzero
temperatures. Can. J. Zool., 48, 853-858.
Sømme, L. (1961). On the overwintering of houseflies (Musca domestica L.) and stable flies
(Stomoxys calcitrans L.) in Norway. Norsk Entomol. Tidsskr, 11, 191-223.
Sømme, L. (1968). Acclimatization to low temperatures in Tribolium confusum Duval (Col.,
Tenebrionidae). Norsk Enomolt. Tidsskr, 15, 134-136.
Sømmee, L. (1963). Effects of glycerol on cold-hardiness in insects. Can. J. Zool., 42, 87-101.
Spranghers, T., Ottoboni, M., Eeckhout, M., Michiels, J., Deboosere, S., De Clercq, P. & De
Smet, S. (2015). Impact of growth substrate on the nutritional composition of black soldier fly
prepupae. 1st World Conference on Innovative Animal Nutrition and Feeding, WIANF2015, 15–
17 October, 2015, Boedapest, Hongarije.
Stanley-Samuelson D.W., Jurenka R.A., Cripps C., Blomquist G.J. & de Renobales M. (1988)
Fatty acids in insects: Composition, metabolism and biological significance. Arch. Insect
Biochem. Physiol. 9, 1-33
Stephens, C.S. (1975). Hermetia illucens (Diptera: Stratiomyidae) as a banana pest in Panama.
Trop. Argic (Trinedad), 52, 173-178.
Literatuurlijst
| 56
St-Hilaire, S., Cranfill, K., McGuire, M.A., Mosley, E.E., Tomberlin, J.K., Newton, L., Sealey,
W. Sheppard, C. & Irving, S. (2007). Fish offal recycling by the black soldier fly produces a
foodstuff high in omega-3 fatty acids. J. world aquacult. Soc., 38, 309-313.
Storey, K. B., Storey, J. M., Steponkus, P. L. & Press, J. A. I. (1992). Biochemical adaptations
for winter survival in insects. Advances in low temperature biology 1, 101-140.
Strathedee, A.T., Bale, J.S. & Howling, G.G. (1995). Cold hardiness of aphid eggs. J. Insect
Physiol., 41, 653-657.
Strong-Gunderson, J.M., Lee, R.E. & Lee, M.R. (1990). New species of ice-nucleating-active
bacteria isolated from insects. Cryobiology, 27, 691.
Tanno, K. (1977). Ecological observation and frost-resistance in overwintering prepupae, Sciara
sp. (Sciaridae). Low Temp. Sci., 35, 63-74.
Thompson, D. J. & Fincke, O. M. (2002). Body size and fitness in Odonata, stabilizing selection
and a meta‐analysis too far?. Ecol. Entomol.,27, 378-384.
Tomberlin, J.K. (2001). Biological, behavioral and toxicological studies on the black soldier fly
(Diptera: Stratiomyidae). Doctoraat, University of Georgia.
Vandekerkhove, B., Van Baal, E., Bolckmans, K. & De Clercq, P. (2006). Effect of diet and
mating status on ovarian development and oviposition in the polyphagous predator Macrolophus
caliginosus (Heteroptera: Miridae).Biol. control, 39, 532-538.
Ward, P.I., Foglia, M. & Blanckenhorn, W.U. (1999). Oviposition site choice in the yellow dung
fly Scatophaga stercoraria. Ethology, 105, 423-430.
Wardhaugh, C.W. & Didham, K.I. (2005). Density-dependent effects on the reproductive fitness
of the New Zealand beech scale insect (Ultracoelostoma assimile) across multiple spatial scales.
Ecol. Entomol, 30, 733-738.
Wyatt, G. R. & Kalf, G. F. (1957). The chemistry of insect hemolymph II. Trehalose and other
carbohydrates. J. gen. physiol., 40, 833-847.
Wyatt, G. R. & Meyer, W. L. (1959). The chemistry of insect hemolymph III. Glycerol. J. gen.
physiol., 42, 1005-1011.
Zachariassen, K.E. (1979). The mechanism of the cryoprotective effect of glycerol in beetles
tolerant to freezing. J. Insect Physiol., 25, 29-32.
Zachariassen, K.E. (1985). Physiology of cold tolerance in insects. Am. Physiol. Soc., 65, 799832.
Literatuurlijst
| 57
Zheng, L., Qing, L., Zhang, J. & Yu, Z. Double the biodiesel yield: Rearing black soldier fly
larvae, Hermetia illucens, on solid residual fraction of restaurant waste after grease extraction for
biodiesel production. (2012). Renew. Energ., 41, 75-79.
Zvereva, E.L. & Zhemchuzhina, A.A. (1988). On some factors influencing the Musca domestica
L. fecundity. Medskaya Parazitol, 58, 27-30.