Environmental DNA

Environmental DNA
Ontwikkelingen en mogelijkheden
Jelger Herder
Nijmegen, 21 maart 2013
Veel soorten zijn lastig te vinden
Grote modderkruiper
•
Verlandende vegetaties
•
Verstopt zich bij gevaar in de modder
Knoflookpad
•
Roept zacht onderwater
•
Korte voortplantingsperiode
Exoten
•
•
2/34
Amerikaanse brulkikker
Invasiefront exotische grondels
Nieuwe methode: environmental DNA
(eDNA)
Dieren die in het water leven laten daarin DNA achter via
huidcellen, faeces en urine
eDNA
3/34
eDNA verzamelen met watermonsters
Oplossend vermogen van water
Snel en efficiënt
4/34
Monsters checken op eDNA in het lab
Polymerase chain reaction (PCR) en
primers
PCR vermeerdert alleen DNA dat aan
primers gebonden is
Primers zijn soortspecifiek
5/34
•
dna-code gelijk binnen alle
subpopulaties
•
dna-code uniek voor de doelsoort
Er wordt dus enkel DNA vermeerderd als
er DNA van de doelsoort aanwezig is in
het monster
M
4
1
2
500 bp
250 bp
Doelsoort
aanwezig
3
eDNA toont recente aanwezigheid
doelsoort
Experimenten tonen dat eDNA binnen 3 weken afbreekt in
water (Dejean et al., 2011)
Lab experiment
6/34
Veld experiment
Voorbeeld eDNA bij Amerikaanse
brulkikkers
Eerste toepassing van de methode (Ficetola et al., 2008)
Vervolg studie naar verspreiding (Dejean et al., 2012)
Traditionele
Environmental
methoden
DNA
•
•
7/34
In 38 van
Eitjes
zoeken,
de 49
larven
en roepende
wateren
brulkikker
dieren
gevonden (78
In 7 van de 49
procent)
wateren brulkikker
gevonden
(14
procent)
Samenwerking over de grens
Beide organisaties vullen elkaar aan
8/34
Uitvinder eDNA
25 professionals
Jarenlange
ervaring
2000 vrijwilligers
Speciaal lab
Kennis ecologie
en verspreiding
Speciale
protocollen
Ervaring met
grote projecten
Eerste studie in Nederland
In 2011 heeft RAVON i.s.m. Spygen een pilot uitgevoerd voor
het opsporen van grote modderkruipers met eDNA (Herder et
al., 2012)
•
Succesvol primers ontwikkeld
•
87,5% trefkans (7 van 8 wateren succesvol)
Vorig jaar zijn er in opdracht van waterschappen grote
inventarisaties uitgevoerd.
•
9/34
Nieuwe locaties ontdekt maar ook enkele controles
gemist!
Environmental DNA knoflookpad
In het kader van het NEM Verspreidingsonderzoek zijn er in
2012 eDNA monsters genomen voor de knoflookpad.
•
23 historische leefgebieden
•
4 controles waar de knoflookpad zeker aanwezig was
Resultaat
•6
historische vindplaatsen toch nog knoflookpad!
•3
van de 4 controles scoorden positief (75% trefkans)
•17%
10/34
toename bekende leefgebieden!
Pilotstudies libellen
Groene glazenmaker
Gevlekte witsnuitlibel
7/9 wateren (trefkans
78%)
6/8 wateren (trefkans
75%)
Gemiste locaties (laat
Gemiste locatie ook
bemonsterd)
niet met traditioneel
gevonden wateren
Biedt perspectieven voor snelle screening
Biedt mogelijkheden voor inventarisatie buiten de vliegtijd!
11/34
Pilotstudie waterspitsmuis
Waterspitsmuis bij uitstek een geschikte soort voor eDNA?
Maar ….
niet aangetroffen op 10 locaties
Mogelijke oorzaken:
12/34
•
Toch niet aanwezig op plek van monsteren
•
Klein dier, lage dichtheid
•
Levenswijze voornamelijk op land!
Pilotstudie noordse woelmuis
Noordse woelmuis die dan wel?
•
Hogere dichtheden, leeft langs oevers, zwemt soms.
Ja…. met eDNA aangetroffen op 5 van de 10 onderzochte
locaties
Niet zeker of 5 locaties “gemist” zijn met eDNA door niet
gelijktijdig vangen vervolgstudie 2013
13/34
Pilotstudie noordse woelmuis extra
Noordse woelmuis keutels zijn niet te onderscheiden van
aardmuis en veldmuis.
Keutelhoopjes zijn te vinden in het veld:
Geanalyseerd op DNA noordse woelmuis
5 van de 7 scoorde positief
14/34
2 negatieve onduidelijk welke soort
Dichtheden via eDNA – in het lab
In het lab
•
Significante relatie tussen aantal larven van
kamsalamander en knoflookpad en hoeveelheid eDNA
Thomsen et al., 2012
15/34
Dichtheden via eDNA – in het veld
Zwaluwbunders nabij Tilburg
•
9 wateren in het kader van ruimtelijke ontwikkeling
geïnventariseerd met eDNA, schepnet en fuiken.
Resultaten traditioneel
•In
2 poelen kamsalamander
Resultaten eDNA
•In
5 poelen kamsalamander
Sterkste eDNA signaal kwam uit
poelen met meeste larven!
16/34
Poel 1 - Zwaluwbunders
17/34
Dichtheden via eDNA – in het veld
Resultaten zijn niet eenduidig!
•
Voor grote modderkruiper verschillende malen
op zelfde locatie gemonsterd met wisselend
resultaat.
Factoren van invloed op hoeveelheid eDNA
•Activiteit
•Microbiele
activiteit
•Temperatuur
•pH
•Conductiviteit
18/34
•Organisch
materiaal
•Watertype
(stroming, verdunning etc.)
Onderzoek nodig per soort,
watertype, periode etc.
eDNA in verschillende habitats
Poelen & Vennen
Ficetola et al., 2008; Thomsen et al.,
2012
Herder et al., 2012
Stromend water
Goldberg et al., 2011
19/34
Sloten & Moerassen
Herder et al., 2011 & 2012
Rivieren en kanalen
Jerde et al., 2011
eDNA aangetoond voorbij barrière
93 dagen elektro voor bewijs
eDNA in verschillende habitats
Zee
Thomsen et al., 2012
Bodem
Andersen et al., 2012
20/34
Oevers
Herder et al., 2012 & 2013
Honing
Valentini et al., 2010
Primers voor groot aantal soorten
Naast reeds genoemde soorten ook
voor:
21/34
•
Amerikaanse rivierkreeft
•
Otter
•
Humus kieuwpootkreeft
•
Karper
•
Bunzing
•
Zwemmersjeuk
Meer primers ontwikkelen …
Niet voor makkelijk vindbare
soorten!
Bittervoorn
Kleine modderkruiper
22/34
Schepnet vissen
Meer primers ontwikkelen …
Niet voor makkelijk vindbare
soorten!
Rivierdonderpad
23/34
Zaklamp vissen!
Methodologisch onderzoek
NEM
Primers ontwikkelen …
Maar wel voor …
Zeldzaam / moeilijk vindbaar
24/34
Exoten
De volgende stap: multisequencing
Universele primer voor
soortgroep
Al het DNA van 1 soortgroep
vermeerdert in de PCR
Al het vermeerderde DNA
uitlezen met een multisequencer
Op de computer een match
maken met database
25/34
De volgende stap: multisequencing
Afkomst van nectar naar familie – in de Pyreneeën.
26/34
De volgende stap: multisequencing
Reeds succesvol getest door Spygen in Frankrijk
27/34
•
Amfibieën in poelen: met eDNA zelfde of
meer soorten dan traditioneel.
•
Vissen in de Rhône: met eDNA 23 soorten
tegen 19 soorten met elektrovissen.
De volgende stap: multisequencing
RAVON heeft onderzoek gedaan in Nederland
•
Vergelijking KRW bevissing met eDNA
•
Voorlopige resultaten (eDNA monsters nog
niet compleet geanalyseerd):
• eDNA 19 soorten, elektrovissen 20 soorten.
28/34
Uitdagingen
Data management
•
1 run 6 miljard codes
•
Stapel papier van 48 km!
Referentie databases
29/34
•
Genbank bevat veel fouten
•
Veel soorten nog geen codes
•
Eigen referentiedatabase
Risico’s en valkuilen
Valse positieven – Soort niet aanwezig, wel met
eDNA!
•
Onnauwkeurig werken
• In het veld
• In het lab
Veldprotocollen,
labprotocollen
Voor eDNA ingericht lab
Bioinformatica + pilot
30/34
•
Primers niet soortspecifiek
•
Theorie versleping door
eenden/uitwerpselen
Zeer kleine kans!
Risico’s en valkuilen
Valse negatieven – Soort wel aanwezig, niet met
eDNA!
•
Veldwerkers soortexperts
Monstername
• Locatie/methode
• Periode
•
Labwerk
• DNA Extractie
• Primers
31/34
Labprotocollen, ervaring.
Bioinformatica
Pilot
studies!
Voordelen environmental DNA
Hogere detectiekans
Kostenefficiënt
Soortspecifiek
Geen verstoring
Geen exoten / ziektes
Betere nulwaarnemingen
32/34
Voordelen traditionele methoden
Verzamelen info over lengte leeftijd, conditie
Feeling met de soorten , creeëren van draagvlak
Onschatbare hoeveelheid werk van vrijwilligers is niet te
vervangen
Ranavirus
33/34
Draagvlak
Vrijwilligers
Zijn er nog vragen?
?
?? ?
?
www.environmental-dna.nl
34/34