Resultaat onderzoek voorkomen vleermuizen in te

ONDERWERP
ONZE REFERENTIE
Vleermuizen DNA analyse boomholten Studentenhuisvesting 078975209 A
Selzerbeek Vaals
DATUM
7-6-2016
VAN
Martijn Stevens
AAN
AVH Projectmanagement
KOPIE AAN
Sandra Kemps
Resultaat onderzoek voorkomen vleermuizen in te kappen bomen Studentenhuisvestiging Vaals
Arcadis heeft in het kader van het reeds in uitvoering gebrachte project studentenhuisvesting Selzerbaak te Vaals
een aanvullend onderzoek verricht naar het mogelijk voorkomen van vleermuisverblijfplaatsen in de te rooien
bomen binnen het plangebied. dit onderzoek is verricht door middel van een DNA analyse van in de voor
vleermuizen als geschikt bevonden boomholten aangetroffen residu op bodem en wand van de holte.
Deze notitie betreft een aanvulling op de eerde en reeds in de ruimtelijke onderbouwing opgenomen ecologische
dossier. Ten aanzien van vleermuisverblijfplaatsen dient deze notitie als invulling van het aangekondigde
vervolgonderzoek vleermuizen.
Vleermuizen
Methode
De analyse is uitgevoerd door de firma Datura. De eDNA samples is geanalyseerd op de aanwezigheid van
eDNA van 1. vertebraten in het algemeen en 2. specifiek vleermuizen. Het analyseren van een eDNA sample
vindt plaats in drie stappen. Eerst wordt het eDNA uit de matrix (mulm, bodem, schors enz) geconcentreerd en
gezuiverd. Vervolgens wordt een controle analyse uitgevoerd om te testen of eDNA detectie in een sample
eventueel geïnhibeerd wordt door storende stoffen. Tenslotte wordt het eDNA gedetecteerd met behulp van
metabarcoding.
1. Het bodemmateriaal/ de materix is opgelost in een fosfaatbuffer. Vervolgens is er kort gecentrifugeerd om de
vaste delen neer te slaan en te verwijderen. Vervolgens is er natriumacetaat toegevoegd en is er langdurig
gecentrifugeerd om het eDNA neer te slaan. Er gevormde pellet is gelyseerd in een CTAB buffer. Het eDNA is
geëxtraheerd door middel van een phenol chloroform DNA extractie. Storende stoffen als humuszuren kunnen
detectie van het eDNA inhiberen wat kan leiden tot vals negatief resultaat. Gedurende de extractie worden
deze inhiberende stoffen zo veel mogelijk verwijderd.
2. Er is een controle uitgevoerd om na te gaan of eDNA detectie in een sample geïnhibeerd wordt. Dit wordt
gedaan door een bekende hoeveelheid van een fragment artificieel DNA toe te voegen. Vervolgens wordt de
concentratie gemeten van dit fragment artificieel DNA door middel van qPCR. Dit wordt zowel gedaan in een
reactie waar een hoeveelheid sample aan toegevoegd wordt, als in een reactie waar geen sample aan
toegevoegd wordt. Als DNA detectie in een sample geïnhibeerd wordt, dan is de gemeten concentratie
artificieel DNA in de reactie waarin sample toegevoegd wordt lager ten opzichte van de reactie waaraan geen
artificieel DNA aan toegevoegd is. Indien nodig kan er een extra zuivering stap uitgevoerd of wordt het sample
verdund. Vervolgens wordt opnieuw gekeken of de inhiberende stoffen voldoende verwijderd zijn. In dit geval
bleek het sample voldoende gezuiverd te zijn, en was een extra zuivering niet nodig.
3. Detectie van eDNA vindt plaats door middel van metabarcoding. Het principe achter deze techniek is dat een
specifiek fragment van het eDNA van vertebraten en/of vleermuizen zeer vaak vermenigvuldigd
(geamplificeerd) wordt met behulp van Polymerase Chain Reaction (PCR). Deze vermeerdering is zowel
uitgevoerd met primers die specifiek DNA van vleermuizen amplificeren, als met primers die DNA van in het
Arcadis Nederland B.V., Stationsplein 18D, Maastricht
T +31 (0)88 4261 261
www.arcadis.com
Arcadis Nederland B.V. - Registered office: Arnhem - Registered number: 09036504
algemeen amplificeren. Het vermeerderde DNA fragment is verschillend tussen soorten. Om te zien van welke
soorten er eDNA in het sample aanwezig is, wordt het vermenigvuldigde eDNA uitgelezen door middel van
DNA sequencing. De verkregen sequences worden vergeleken met een DNA referentie database. Zodoende
kan vastgesteld worden van welke kreeften er eDNA in het sample aanwezig is.
Stapsgewijs ziet de workflow van metabarcoding er als volgt uit:
a. PCR met behulp van primers die selectief vertebraten/vleermuizen eDNA vermeerderen;
b. Het vermeerderde eDNA wordt gevisualiseerd met behulp van elektroforese. Zo kan vastgesteld worden of er
eDNA gedetecteerd is;
c. Als DNA vermeerderd (gedetecteerd) is, dan wordt het vermeerderde DNA voor behandeld om gesequenced
te worden (de zogenaamde library preperation);
d. Vervolgens vindt de daadwerkelijke sequencing plaats op een Illumina Sequencer;
e. Tenslotte worden de verkregen output van de sequencer vergeleken met de referentie database om zodoende
vast te stellen van welke soorten er eDNA in het sample aanwezig was.
Resultaat:
Uit de elektroforese (stap 2 van metabarcoding workflow) bleek dat er wel eDNA gedetecteerd werd met de
primers die vertebraten in het algemeen amplificeren. Er werd echter geen eDNA gedetecteerd met de primers
die specifiek vleermuizen eDNA amplificeren. Het vertebraten eDNA dat gedetecteerd is betreft hoogst
waarschijnlijk menselijk DNA, of DNA van andere vertebraten die mogelijk van de boomholte gebruik gemaakt
hebben.
Uit de DNA analyse is gebleken dat er geen dna materiaal van vleermuizen is aangetroffen in de boomholte. Dit
terwijl er in een controle monster waarvan bekend is dat er vleermuizen hebben gezeten en wat ruim een jaar
geleden was verzameld wel onomstotelijk vleermuis dna aanwezig is.
Op dit moment wordt stap d uitgevoerd: DNA sequencing als extra handeling vanuit datura om meer zicht te
krijgen in het analyse monster wat nomraal gedaan zou worden om de exacte soort vast te kunnen stellen. Echter
op basis van de reeds verkregen resultaten in vergelijking met enkele controle monsters van samples uit
boomholten waarvan bekend is dat er vleermuizen in gezeten hebben kan met afdoende zekerheid worden
geconcludeerd dat er in de te verwijderen bomen met boomholten in Vaals geen vaste rust- en verblijfplaats
aanwezig is van een vleermuizensoort.
Advies;
Op basis van het voorgaande concluderen wij dat de betreffende boomholte niet in gebruik is als vaste rust- en
verblijfplaats van een vleermuissoort. Hierdoor is er geen vervolgonderzoek noodzakelijk en hoeft er ten aanzien
van vleermuisverblijfplaatsen geen Flora- en faunawet ontheffing te worden verkregen om de bomen te mogen
rooien.
Een incidenteel dier kan nooit worden uitgesloten (de boomholten zijn wel toegankelijk en geschikt voor
vleermuizen). Het is daarom wel noodzakelijk om direct voorafgaand aan de kap een inspectie uit te voeren met
een vrijgave (door deskundige ecoloog) dat er op dat moment geen vleermuis of ander dier in de boomholte
aanwezig is.
Datum: 7-6-2016
2 van 2