RNA DNA - EuroStaete

DNA onderzoek
DNA onderzoek in het WFG
• Doel:
• de vier laboratoria
–
–
–
–
Medisch Microbiologisch Laboratorium
Pathologisch Anatomisch Laboratorium
Klinische Farmacie
Klinisch Chemisch Laboratorium
ondersteunen alle specialismen in hun DNA
onderzoek
Welk type DNA
onderzoek?
• Is er DNA of RNA aanwezig?
• Is de DNA volgorde wel goed?
• Welk DNA is nu actief?
Welk type DNA
onderzoek?
• Is er DNA of RNA aanwezig?
• Is de DNA volgorde wel goed?
• Welk DNA is nu actief?
Welk type DNA
onderzoek?
• Is er DNA of RNA aanwezig?
• Is de DNA volgorde wel goed?
• Welk DNA is nu actief?
Is er DNA of RNA aanwezig?
• Principe:
• Van RNA eerst cDNA maken (RNA virus)
• DNA vermenigvuldigen tot een bepaalde
hoeveelheid kleur wordt gemeten.
• Geen kleur geen RNA / DNA,
• Veel kleur veel RNA of DNA
– (concentratie DNA/RNA is hier mee te meten)
RNA DNA
CH3
Thymidine
Is er DNA aanwezig en ja hoeveel?
?
PCR
PCR
PCR
TaqMan PCR
Excitation
FRET
Amplicon
ANNEALING
EXTENSION
Amplicon
5’-3’ exonuclease
Emission
Reporter
Quencher
Hardware
PCR quantitation
Microbial Load Testing
2.5
NEG
F2/F1
Threshold
Cycle
10
100
1.5
1000
10.000
100.000
1.000.000
0.5
0
10
20
30
40
Cycles
50
60
70
Threshold Cycle = 35 Load = 103.8 copies/ml
2.5
50
Test Sample
30
F2/F1
Threshold Cycle
40
20
Threshold
1.5
10
0
1
2
3
4
Concentration
5
Threshold Cycle
6
log 10
0.5
0
10
20
30
40
Cycles
50
60
70
HPV-DNA wel of niet aanwezig?
• HPV is dubbelstrengs DNA Virus
•Nodig?
•Automatisch extractie apparaat
•Real time PCR
Positieve uitslag HPV typeren door specifieke RT-PCRs in te zetten
Activiteit van HPV bepalen via RNA onderzoek
Is er RNA of DNA aanwezig?
•
•
•
•
•
•
•
•
•
S. aureus
S. pyogenes
S. pneumoniae
S. viridans groep
N gonorrhoeae en meningitidis
H. influenzae
E. coli, Salmonella
TOP 13 maken?
Pseudomonas
MRSA
Infectie ja of nee?
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
C
N
P
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
C
N
P
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
C
N
P
1
2
3
4
5
6
7
8
Pat. 1
Pat. 2
Pat. 3
Pat. 4
Uitslagen binnen 4 uur bekend
Welk type DNA
onderzoek?
• Is er DNA of RNA aanwezig?
• Is de DNA volgorde wel goed?
Cytochroom P450 onderzoek
• Welk DNA is nu actief?
Meerdere Genen tegelijk!
een droom-experiment
• in één enkel experiment bij een
cel vaststellen welke genen wel
en welke genen niet aan staan
– mens: 30.000 genen
• het is mogelijk...!
• DNA micro-arrays
– DNA chips
Gen activiteiten bij tumoren
hoe meet je de activiteit van
een gen?
RNA van gen 1
RNA van
gen 2
RNA van
gen 3
• alleen genen die aan staan
produceren RNA
• hoe meer RNA hoe groter
de aktiviteit van een gen
genexpressie meten aan de hand
van RNA concentratie in de cel
celtype 2
celtype 1
 vier mogelijkheden
•
•
•
•
genen
genen
genen
genen
even actief in beide celtypen
aktiever in één van de celtypes
actief in slechts één celtype
inactief in beide celtypen
componenten van de DNA
microarray technologie
1
2
3
4
5
6
ABCDEF
• duizenden spotjes op
aan glaasje
• elk spotje heeft
stukjes DNA van een
specifiek gen
• 30.000 spotjes
genoeg voor alle
menselijke genen
– in principe...
microarray technologie
referentie cellen
*
**
* * * * *
isoleer RNA en maak
het fluorescerend GROEN
1
2
3
4
5
6
ABCDEF
te analyseren cellen
* *
* **
*
isoleer RNA en maak
het fluorescerend ROOD
microarray technologie
referentie cellen
**
te analyseren cellen
* *
*
* *
*
specifieke binding van alleen de juiste
nucleotiden volgorde via dubbelstrengs
DNA: A-T en G-C...!
1
2
3
4
5
6
ABCDEF
* *
* *
* **
*
microarray technologie
referentie cellen
**
1
2
3
4
5
6
*
*
ABCDEF
te analyseren cellen
* *
* *
* **
*
alleen RNA van
referentie
cellen:
dus spot is
GROEN
microarray technologie
referentie cellen
**
1
2
3
4
5
6
*
*
ABCDEF
te analyseren cellen
* *
* *
* **
*
microarray technologie
referentie cellen
**
te analyseren cellen
* *
*
* *
*
*
1
2
3
4
5
6
ABCDEF
**
*
microarray technologie
referentie cellen
**
1
2
3
4
5
6
*
*
ABCDEF
te analyseren cellen
* *
* *
alleen RNA van
te analyseren
cellen:
dus spot is
ROOD
microarray technologie
referentie cellen
te analyseren cellen
* *
**
*
*
1
2
3
4
5
6
ABCDEF
* *
microarray technologie
referentie cellen
te analyseren cellen
* *
**
*
1
2
3
4
5
6
ABCDEF
*
* *
microarray technologie
referentie cellen
**
1
2
3
4
5
6
ABCDEF
te analyseren cellen
* *
RNA van
referentie
cellen en van
te analyseren
cellen:
GROEN plus
ROOD is GEEL
verband genexpressie en
fluorescentiesignaal
A B C D E F G
1
2
3
4
5
6
gen 1F
gen 3E
gen 5C
gen 5B
Genexpressie
celtype 1
celtype 2
-
++++
++
++++
++++
++
-
++++
-
-
-
microarray met DNA spots
van 7.500 genen van de muis
microarray met DNA spots
van 7.500 genen van de muis
DNA microarray om genen te
vinden in relatie tot een ziekte
gezond
ziek
isolatie
en
labelling
isolatie
en
labelling
microarray
binden aan microarray
spotjes meten
data extractie + analyse
identificatie van genen met andere activiteit bij ziekte
70 genen geïdentificeerd die verloop van het
ziekte goed kunnen voorspellen
78 tumoren
70 geselecteerde genen
goede prognose
slechte prognose
toepassing microarray diagnostiek
van borstkanker
traditionele diagnostiek
overlevenden
~30% patiënten overlijdt
aan borstkanker binnen 10 jaar
~70% overleeft 10 jaar of meer
tijd (jaren)
iedereen krijgt
chemotherapie...!
identificatie van genen waarvan de
activiteit verandert bij borstkanker
overlevenden
• analyse van
78 humane
borsttumoren
• 34 metastase-positief
binnen
5 jaar
– slechte prognose
tijd (jaren)
• 44 metastase-negatief
gedurende 5 jaar
– goede prognose
microarray classificatie
vs. NIH classificatie
5 % laag risico
95 % hoog risico
39 % laag risico
61 % hoog profiel
96%
74%
59%
klassieke NIH
classificatie
50%
classificatie op
basis van microarray
 classificatie van
158
borstkankertumoren
 minder onnodige
chemo-therapie
 identificatie van
genen die een
rol spelen bij
borstkanker
DNA onderzoek
Is er RNA of DNA aanwezig
Is het DNA wel goed
MML
Welk DNA is actief
PAL
KF
KCL