Importeren van de set-up werklijst in het RT-PCR

Automatisatie van variabele real time PCR
plaat set-up voor moleculaire diagnostiek
Karen Dierickx - 5 april 2016
Onze-Lieve-Vrouw Ziekenhuis in Aalst, België
• Eén van de grootste regionale niet-universitaire ziekenhuizen in Vlaanderen
met een internationale reputatie op talrijke domeinen
• OLV-Ziekenhuis: 3 campussen: Aalst, Asse, Ninove
• Aantal bedden: 844
• Aantal werknemers: 2554
Klinisch laboratorium
• Overzicht diensten binnen labo
–
–
–
–
–
Bloedafname-dispatching
Microbiologie: bacteriologie en serologie
Klinische chemie: biochemie, urgentie, toxicologie, hematologie
Moleculaire diagnostiek
Nucleaire geneeskunde
Moleculaire diagnostiek: DNA/RNA in patiënten stalen
–
–
–
–
Virale en bacteriële infecties
Opsporen van aangeboren/verworven aandoeningen
Identificatie van micro-organismen
Diagnose, follow-up
Technieken:
– PCR en Real-time PCR
– 16 S Sequencing
– Genotypering
Labo moleculaire biologie
• Moleculaire technieken
(+) zeer gevoelig: vroegtijdige diagnose
(+) snel
(-) kostenplaatje
(-) contaminatie gevaar: vals positieven
• Sinds 2008 BELAC accreditatie: ISO15189
– elk jaar strenge kwaliteitscontrole: testen, lokalen, administratie
– alle testen onderworpen aan strenge validatie
– nodig voor de ‘eventuele’ terugbetaling van het RIZIV
Labo moleculaire biologie
Moleculaire diagnostiek: +/- 10000 stalen per jaar
VIROLOGIE: CMV, EBV, enterovirus, HBV, HCV, HEV, HSV, VZV,
HPV, polyoma, RSV, hMPV, Influenza, PIV, Coronavirus, Rhinovirus,
Adenovirus, Bocavirus
BACTERIOLOGIE: Bordetella, Chlamydia trachomatis, Trichomonas
vaginalis, Neisseria gonnorhoeae, Chlamydia pneumoniae,
Mycoplasma pneumoniae, Legionella, Tropheryma whipplei,
Mycobacterium tuberculosis, MRSA, gisten, pneumocystis, 16S
sequencing
HEMATOLOGIE: BCR/ABL translocatie, Jak2, IGH en TCR genherschikking, Gilbert syndroom, HLA, factor II en factor V,
Hemochromatose
Workflow Labo Moleculaire
LIS: staal invoeren tot 11 uur
RT-PCR analyse: ABI
7500 Fast
RNA/DNA extractie: semi-automatisch
EasyMag extractie toestel van Biomerieux
PCR set-up: 96 well microtiterplaat Vt=25µl
• In-house RT-PCRs: zelfde tijdsprofiel
• Plaatverdeling opstellen
• Reactie mixen aanmaken en uitverdelen
• Stalen en controles toevoegen
• Plaatopstelling doorgeven aan het qPCR toestel
Validatie resultaten
LIS systeem: resultaat
zelfde dag rapporteren
Noodzaak automatisatie in het labo
moleculaire biologie
• Verhoogde werkdruk
– Toenemend aantal stalen/analyses per dag
– Dezelfde (of verlaagde) personeelsbezetting
– Verdere uitbreiding van diagnostiek
• Routine wordt steeds complexer
–
–
–
–
Uitbreiding van het aantal PCR testen
Verwerking wordt complexer door de verhoogde variatie aan technieken
Verhoogde foutenlast
…
Workflow Labo Moleculaire
LIS: staal invoeren tot 11 uur
RNA/DNA extractie: semi-automatisch
EasyMag extractie toestel van Biomerieux
RT-PCR analyse:
ABI 7500 Fast
PCR set-up:
•
•
•
•
•
Validatie resultaten
In-house RT-PCRs: zelfde tijdsprofiel
Plaatverdeling opstellen
Reactie mixen aanmaken en uitverdelen
Stalen en controles toevoegen
Plaatopstelling doorgeven aan het qPCR toestel
JANUS pipetteerstation, Perkin Elmer
LIS systeem
Labo moleculaire biologie
Moleculaire diagnostiek: +/- 10000 stalen per jaar
VIROLOGIE: CMV, EBV, enterovirus, HBV, HCV, HEV, HSV, VZV,
HPV, polyoma, RSV, hMPV, Influenza, PIV, Coronavirus,
Rhinovirus, Adenovirus, Bocavirus
BACTERIOLOGIE: Bordetella, Chlamydia trachomatis, Trichomonas
vaginalis, Neisseria gonnorhoeae, Chlamydia pneumoniae,
Mycoplasma pneumoniae, Legionella, Tropheryma whipplei,
Mycobacterium tuberculosis, MRSA, gisten, pneumocystis, 16S
sequencing
HEMATOLOGIE: BCR/ABL translocatie, Jak2, IGH en TCR genherschikking, Gilbert syndroom, HLA, factor II en factor V,
Hemochromatose
JANUS® pipetteer robot Perkin Elmer
• Varispan pipetteerarm: vier tip posities
 Vaste tip of wegwerptips
 Afzonderlijk bewegen van de tips
• Systeemvloeistof: demi water + Proclin 300
 Op en neer bewegen van de spuiten geeft een
vloeistofverplaatsing waardoor kleine volumes
exact opgezogen worden
• AccusensTM liquid level sense technology’: detecteert en volgt het vloeistofoppervlak
tijdens het uitverdelen en opzuigen van de vloeistof
 Verzekert het pipetteren van exact volume
 Minimaliseert de kans op contaminatie
• Geleidbare wegwerptips
 Het systeem detecteert de vloeistof heel nauwkeurig doordat het een verschil in
geleiding detecteert
 Elke tip heeft een liquid sensing systeem waardoor ze dus elk verschillende
volumes kunnen detecteren en opzuigen
Implementatie
toepassing
opop
het
pipetteerstation
Implementatie
toepassing
het
pipetteerstation:
Algemene
stappen
Algemene
stappen
1. Installatie/kalibratie van het toestel en toestelvalidatie:
– Accuraatheid: vergelijking manueel pipetteren/robot, absorbantie bepaling
met tartrazine kleurstof (gewenst volume met CV<5%)
– Precisie: reproduceerbaarheid van het pipetteren (CV<5%)
– Cross-contaminatie: dambordpatroon water/kleurstof
2. Ontwikkeling/Design van de toepassing
–
–
–
–
–
Optimale lay-out van het dek
Opbouw uitvoerende stappen in de software van de robot
Programmatie onderliggend script van de uitvoerende stappen
Bewerkstelling van de communicatie: GLIMS-robot-ABI7500 Fast RT-PCR toestel
Uittesten protocol en bijsturen waar nodig: met water en vervolgens met
reagentia/stalen (methodevalidatie)
Implementatie toepassing op het pipetteerstation
Algemene stappen
3. Methode validatie
– Vergelijking resultaten referentiemethode: ΔCt waarde en curves nakijken
– Reproduceerbaarheid: maximaal een interrun variatie van 3 Ct
– Traceerbaarheid nagaan
4. Opvolging
– Evolutie protocolwijzigingen bijhouden
– Externe kwaliteitscontrole stalen
– Accuraatheid toestel halfjaarlijks nakijken
Implementatie toepassing op het pipetteerstation
Toepassingen
• Aanmaak Primer Probe mixen voor RT-PCR analyses
– Primers/Probes/water samenvoegen
– Aliquoteren voor verder gebruik op de robot
• Vaste 96 well plaat set-up enkel voor respiratoir panel
– Per rij een multiplex RT-PCR (8 in totaal)
– Per kolom een staal of controle (max 12 in totaal)
– Enige variabele: aantal stalen ingeven in het begin van het protocol
• Variabele plaat set-up voor alle in-house RT-PCR analyses
– Input: barcode stalen / GLIMS werklijst
– Variabele: op elk staal verschillende analyse adhv de werklijst
Implementatie toepassing op het pipetteerstation
Tijdsbesteding
• Vaste 96 well plaat set-up enkel voor respiratoir panel
– START programmatie: Januari 2012
– START methode validatie: September 2012, duur: 3 maanden
– IN ROUTINE: December 2012
• Variabele plaat set-up voor alle in-house RT-PCR analyses
– START programmatie: Januari 2013
– START methode validatie: September 2013, duur: 1 maand
– IN ROUTINE: Oktober 2013
PCR Set-up Creator Interface
• Doel
– Gebruiksvriendelijke interface
– Gemakkelijk definiëren en aanpassen van klantgerichte eigenschappen
– Eenvoudiger om analyse toe te voegen aan het protocol met de ‘PCR Recipe
Administrator’ Tool
PCR set-up Creator Interface
Illustratie variabel plaat set-up protocol
•
•
•
•
•
Opstarten Winprep protocol
Ingeven van het aantal stalen en inscannen barcodes van extracten
In het LIS systeem wordt een werklijst gegenereerd met alle stalen en bijhorende
analyses
De PCR set-up Creator interface wordt geopend
Glims werklijst wordt geïmporteerd
PCR set-up Creator Interface
Illustratie variabel plaat set-up protocol
• Genereren van tabel adhv de werklijst
– Selectie van de uit te voeren analyses
– Visuele check van opvulling plaat
PCR set-up Creator Interface
Illustratie variabel plaat set-up protocol
• Barcode lezen van controles, PP mixen en enzyme mixen
2D barcode label, 9 cijfercode:
Vb: 101120115
Unieke 3 cijfercode
PCR set-up Creator Interface
Illustratie variabel plaat set-up protocol
• Uitvoeren Winprep protocol door pipetteerrobot




Aanmaken reactiemixen: PP mixen + enzyme
Uitverdelen van reactiemixen in de plaat
Toevoegen van stalen en controles
Genereren van werklijst voor het ABI toestel
PCR set-up Creator Interface
Illustratie variabel plaat set-up protocol
• Importeren van de set-up werklijst in het RT-PCR toestel:
•
ABI 7500 Fast van Thermo Fisher life technologies
PCR set-up Creator Interface
Resultaten methodevalidatie variabele set-up
•
•
•
226 klinische stalen geevalueerd
Vergelijking van Ct waarden: manueel versus geautomatiseerde plaat set-up
20 multiplex in-house Real time PCR assays



















1RSV-A/RSV-B/hMPV/IC (4-plex)
Infl-A/Infl-B (3-plex)
PIV1/PIV4/Rhino (3-plex)
PIV2/PIV3/entri (3-plex)
Coronavirussen (4-plex
Adeno/Boca/IC (3-plex)
M. pneumoniae/C. pneumoniae/IC (3-plex)
B. pertussis/B. parapertussis/B. holmesii/IC (4-plex)
CMV/IC (2-plex)
HSV/VZV/IC (3-plex)
HBV/IC (2-plex)
C. trachomatis/N. gonorrhoeae/ T. vaginalis/IC (6-plex)
Polyoma/IC (2-plex)
EBV/IC (2-plex)
Bof (2-plex)
L. pneumophila/IC (3-plex)
MRSA (3-plex)
JAK2 mutation (2x 1-plex)
HLAB27/Betaglobin (2-plex)
•
•
•
•
•
•
•
Resultaten
53 positieve stalen hebben
vergelijkbare Ct waarden met
een gemiddelde delta Ct waarde
van 0,04
Delta Ct waarde van de controles
is < 2
Sensitiviteit 96%
Specificiteit 100%
Accuraadheid 99%
Geen intra of interrun
contaminatie geobserveerd
Traject volledig traceerbaar
Voordelen van automatisatie
•
•
•
•
•
•
Verlagen van de werkdruk
Standaardisatie
Nauwkeurig
Digitalisering van het volledige verwerkingsproces waardoor alles traceerbaar is
(kwaliteitszorg)
Logfile van de run: gebruikte reagentia en pipetteerstappen nagaan
Verminderen van foutenlast
Nadelen van automatisatie
•
•
•
Opzetten van het proces neemt tijd in beslag (Trial and error)
Bij technisch defect steeds back-up nodig
Prijskaartje, consumables
Besluit
De geautomatiseerde plaat set-up met behulp van
het JANUS pipetteerstation werd succesvol
geïmplementeerd in het labo moleculaire biologie
en is een grote meerwaarde binnen het labo