UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE
advertisement
UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Geneesmiddelenleer Laboratorium voor Farmaceutische Biotechnologie Academiejaar 2009-2010 DETECTIE EN FENOTYPERING VAN FOETALE MICROCHIMERE CELLEN IN AUTO-IMMUNE SCHILDKLIERAANDOENINGEN Astrid FOUBERT Eerste Master in de Farmaceutische Zorg Promotor Prof. dr. Apr. Dieter Deforce Commissarissen Dr. F. Van Nieuwerburgh Dr. I. Vandecandelaere AUTEURSRECHT “ De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef.” 1 juni 2010 Promotor Prof. Dr. Apr. Dieter Deforce Auteur Astrid Foubert DANKWOORD Mijn dank gaat uit naar mijn promotor Prof. Dr. Apr. D. Deforce voor de mogelijkheid om mijn masterproef uit te voeren in het laboratorium voor Farmaceutische Biotechnologie. Ik ben hem enorm dankbaar voor deze leerrijke ervaring. In het bijzonder dank ik Trees Lepez voor de dagelijkse begeleiding in het laboratorium bij het uitvoeren van de experimenten en de analyse van de resultaten. Ik dank haar ook voor haar steun en het verbeteren van deze masterproef. Verder wens ik alle doctoraatstudenten van het laboratorium te bedanken voor de aangename werksfeer. Tenslotte gaat mijn dank uit naar mijn ouders voor hun steun tijdens de voorbije periode. . INHOUDSOPGAVE 1 INLEIDING ...................................................................................................................... 1 1.1 HET IMMUUNSYSTEEM.......................................................................................... 1 1.1.1 Het aangeboren immuunsysteem ......................................................................... 1 1.1.2 Het adaptief immuunsysteem ............................................................................... 1 1.2 AUTO-IMMUNITEIT ................................................................................................. 2 1.3 FOETALE MICROCHIMERE CELLEN ................................................................... 5 1.4 AUTO-IMMUNE SCHILDKLIERAANDOENINGEN ............................................. 6 1.4.1 De schildklier ......................................................................................................... 6 1.4.2 Pathogenese van de ziekte van Hashimoto/Graves ............................................ 7 1.4.3 Klinische manifestatie ........................................................................................... 9 1.4.4 Diagnose en behandeling....................................................................................... 9 1.4.5 De potentiële rol van foetale microchimerie in het ontstaan van de ziekte van Hashimoto/Graves ............................................................................................... 11 2 OBJECTIEVEN ............................................................................................................. 14 3 MATERIALEN EN METHODEN ............................................................................... 15 3.1 DENSITEITSCENTRIFUGATIE MET FICOLL-PAQUE® PLUS.......................... 15 3.1.1 Principe ................................................................................................................. 15 3.1.2 Materialen ............................................................................................................ 16 3.1.3 Methode ................................................................................................................ 16 3.2 HEMACYTOMETRIE .............................................................................................. 16 3.2.1 Principe ................................................................................................................. 16 3.2.2 Materialen ............................................................................................................ 17 3.2.3 Methode ................................................................................................................ 17 3.3 CYTOSPIN ................................................................................................................ 17 3.3.1 Principe ................................................................................................................. 17 3.3.2 Materialen ............................................................................................................ 18 3.3.3 Methode ................................................................................................................ 18 3.4 FLUORESCENTIE IN SITU HYBRIDISATIE ........................................................ 18 3.4.1 Principe ................................................................................................................. 18 3.4.2 Materialen ............................................................................................................ 19 3.4.3 Methode ................................................................................................................ 20 3.5 FLUORESCENTIEMICROSCOPIE ......................................................................... 21 3.5.1 Principe ................................................................................................................. 21 3.5.2 Materialen ............................................................................................................ 23 3.5.3 Methode ................................................................................................................ 24 3.6 LASER PRESSURE CATAPULTING (LPC) .......................................................... 27 3.6.1 Principe ................................................................................................................. 27 3.6.2 Materialen ............................................................................................................ 28 3.6.3 Methode ................................................................................................................ 28 3.7 DNA-EXTRACTIE.................................................................................................... 28 3.7.1 Principe ................................................................................................................. 28 3.7.2 Materialen ............................................................................................................ 28 3.7.3 Methode ................................................................................................................ 28 3.8 Y-STR MULTIPLEX PCR ........................................................................................ 29 3.8.1 Principe ................................................................................................................. 29 3.8.2 Materialen ............................................................................................................ 30 3.8.3 Methode ................................................................................................................ 31 3.9 CELSCHEIDING MET BEHULP VAN EASYSEP TER KARAKTERISTATIE VAN DE FOETALE CELLEN .................................................................................. 32 3.9.1 Principe ................................................................................................................. 32 3.9.2 Materialen ............................................................................................................ 33 3.9.3 Methode ................................................................................................................ 33 4 RESULTATEN EN DISCUSSIE .................................................................................. 34 4.1 FLUORESCENTIE IN SITU HYBRIDISATIE (FISH) ........................................... 34 4.2 LASER PRESSURE CATAPULTING (LPC), DNA-EXTRACTIE, AMPLIFICATIE EN STR-ANALYSE ..................................................................... 38 4.3 CELSCHEIDING MET BEHULP VAN EASYSEP TER KARAKTERISTATIE VAN DE FOETALE CELLEN .................................................................................. 41 5 CONCLUSIE .................................................................................................................. 43 6 LITERATUURLIJST .................................................................................................... 45 LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN AID Auto-Immune Disease AITD Auto-Immune Thyroid Disease APC Antigen Presenterende Cel CCD Charged Coupled Device CD Cluster of Differentiation CEP Chromosome Enumeration Probe CY Cyanine cGvHD chronic Graft versus Host Disease DAPI 4‟,6-diamidino-2-phenyl-indole DNA DeoxyriboNucleic Acid dNTP deoxyriboNucleotide TriPhosphate DYS DNA Y-chromosoom Segment EDTA EthyleneDiamineTetraacetic Acid FBS Fetal Bovine Serum FISH Fluorescentie In Situ Hybridisatie FITC Fluorescein IsoThioCyanate g relatieve centrifugal kracht GvHD Graft versus Host Disease GvHR Graft versus Host Reaction HLA Human Leukocyte Antigen IDDM Insulin-Dependent Diabetes Mellitus IS Interne Standaard LPC Laser Pressure Catapulting MG Moleculair Gewicht MHC Major Histocompatibility Complex NK-cel Natural Killer cel NP-40 Nonylphenylpolyethyleen glycerol PBS Phosphate Buffered Saline PCR Polymerase Chain Reaction PE PhycoErythrine pH zuurtegraad POP-4 Perfomance Optimized Polymeer PRL Prolactine rpm revolutions per minute RNA RiboNucleic Acid SSC Sodium chloride and Sodium Citrate STR Short Tandem Repeat TAC Tetrameer Antilichaam Complex Taq Thermus aquaticus Tc-cel cytotoxische T-cel TCR T-Cel Receptor Tg Thyroglobuline Th-cel T-helper cel Th1-cel T-helper 1 cel Th2-cel T-helper 2 cel TPO Thyroid Peroxidase TRH Thyroid Releasing Hormone TSH Thyroid Stimulating Hormone TSHR Thyroid Stimulating Hormone Receptor T4 Tetrajodothyronine T3 Trijodothyronine UV UltraViolet 1 INLEIDING 1.1 HET IMMUUNSYSTEEM 1.1.1 Het aangeboren immuunsysteem Het aangeboren immuunsysteem is van bij de geboorte al aanwezig en biedt bescherming tegen verschillende pathogenen en vreemde substanties. Het is een nietspecifieke weerstand waarbij de respons onafhankelijk is van het antigen. Het aangeboren immuunsysteem is de eerste lijnsverdediging en het bestaat uit externe chemische enanatomische barrières. Deze externe barrières zorgen ervoor dat micro-organismen niet kunnen binnendringen in het lichaam door het verhinderen van de aanhechting van microorganismen en door secretie van antimicrobiële enzymen en peptiden. Maar er bestaan ook interne niet-specifieke mechanismen zoals antimicrobiële proteïnen, natural killer-cellen (NKcellen) en fagocyten, inflammatie en koorts. Deze laatste treden op wanneer het microorganisme reeds door het epitheel is binnengedrongen en zich vermenigvuldigd heeft in de weefsels van de gastheer (Janeway et al., 2001; Tortora & Derrickson, 2006). De meeste micro-organismen worden gedetecteerd en vernietigd binnen enkele minuten tot uren. Het aangeboren immuunsysteem reageert onmiddellijk en zorgt voor een vroege respons maar induceert geen opbouw van immunologisch geheugen (Janeway et al., 2001; Tortora & Derrickson, 2006). 1.1.2 Het adaptief immuunsysteem Enkel als het aangeboren immuunsysteem omzeild of overweldigd wordt, is een adaptieve of geïnduceerde immuunrespons vereist. Men beschouwt het adaptief immuunsysteem als de tweede lijnsverdediging en het geeft bescherming bij herhaalde blootstelling. Dit immuunsysteem onderscheidt zich op vier vlakken van het aangeboren immuunsysteem. Het is niet vanaf de geboorte aanwezig en de respons antigenspecifiek. Er treedt geen onmiddellijke respons bij blootstelling aan het antigen op en deze blootstelling resulteert in een immunologisch geheugen (Janeway et al., 2001). De componenten van het adaptief immuunsysteem zijn de T-cellen en de antilichaamproducerende B-cellen. Door het adaptief immuunsysteem kan een bijna oneindige diversiteit 1 aan antigenen herkend worden, zodat elk verschillend pathogeen specifiek kan vernietigd worden. Het adaptief immuunsysteem kan onderverdeeld worden in de cellulaire -en de humorale immuniteit, welke nauw met elkaar verbonden zijn. De cellulaire immuniteit, ook wel T-cel gemedieerde immuniteit genoemd, wordt grotendeels gemedieerd door de T-cellen in samenwerking met antigen presenterende cellen (APCs) zoals de B-cellen, macrofagen en dendritische cellen (Janeway et al., 2001). De T-cellen worden geselecteerd in de thymus. Deze omvat een positieve en negatieve selectie. Tijdens de positieve selectie worden de T-cellen die met hun T-cel receptor (TCR) MHC klasse I of II kunnen binden, doorgelaten. Bij de negatieve selectie worden autoreactieve T-cellen verwijderd. De overblijvende lymfocyten verlaten de thymus en recirculeren in het bloed en de perifere lymfoïde organen tot ze in contact komen met een antigen waarbij de naïeve T-cellen worden geactiveerd. Vervolgens gaan ze prolifereren en differentiëren in effector T-cellen en T-geheugencellen. Er bestaan drie types effector Tcellen nl. de CD8+ cytotoxische T-cellen (Tc-cellen) en de CD4+ T-helper 1 of 2 cellen (Th1 of Th2-cellen). De CD8 + Tc-cellen en CD4+ Th-cellen herkennen antigenen die gepresenteerd worden door respectievelijk MHC I -en MHC II-moleculen. De MHC I-moleculen bevinden zich onder andere op viraal geïnfecteerde cellen en de MHC II-moleculen bevinden zich op APCs (Janeway et al., 2001; Ando & Davies, 2004). De humorale immuniteit wordt gemedieerd door de B-cellen en door B-cellen geproduceerde antilichamen. De B-celontwikkeling start in het beenmerg. B-cellen die geen autoreactiviteit vertonen na de negatieve selectie, verlaten het beenmerg. Van zodra ze in contact komen met een antigen, worden de B-cellen geactiveerd en gaan ze prolifereren en differentiëren in antilichaamsecreterende plasmacellen en B-geheugencellen (Jiang & Vacchio, 1998; Janeway et al., 2001). 1.2 AUTO-IMMUNITEIT Auto-immuun pathologieën zijn multifactoriële aandoeningen waarbij verschillende componenten van het immuunsysteem, zowel van het adaptieve als van het aangeboren immuunsysteem, betrokken zijn (Lang et al., 2007). 2 Auto-immuniteit wordt gekenmerkt door een immuunrespons tegen lichaamseigen antigenen. Dit kan leiden tot auto-immune aandoeningen (AID) die gekenmerkt worden door weefselschade. Wanneer een adaptieve immuunrespons ontstaat tegen lichaamseigen antigenen is het vaak onmogelijk om het antigen volledig te elimineren uit het lichaam. Hierdoor treedt er een chronische inflammatie van het weefsel op (Janeway et al., 2001). Auto-immuunreacties worden geïnitieerd door de activatie van antigen-specifieke Tcellen. De T-cel respons tegen de lichaamseigen antigenen kan directe of indirecte weefselschade veroorzaken. Cytotoxische T-celrepons, activatie van macrofagen door Th1cellen en de T-cel hulp aan de autoreactieve B-cellen kunnen ernstige weefselschade veroorzaken (Janeway et al., 2001). Er bestaan twee categorieën auto-immune aandoeningen (AIDs), namelijk de orgaanspecifieke en de veralgemeende of systemische aandoeningen. In het eerste geval wordt er slechts één specifiek orgaan aangetast en in het tweede geval worden er meerdere weefsels aangetast. De ziekte van Hashimoto en Graves zijn voorbeelden van orgaanspecifieke AIDs waarbij de schildklier aangetast wordt terwijl systemische lupus erythematosus een voorbeeld is van een systemische AID waarbij de huid, de nieren en de hersenen aangetast worden (Janeway et al., 2001). Zowel omgevingsfactoren als genetische factoren kunnen een rol spelen in het ontstaan van een AID. Betrokkenheid van bepaalde genen kan worden bepaald aan de hand van tweelingstudies (Janeway et al., 2001; Fairweather & Rose, 2004). Daarbij werd vooral een associatie gevonden met MHC-klasse II allelen. Een voorbeeld hiervan is type 1 insulinedependent diabetes mellitus (IDDM) en de associatie met HLA-DR3/DR4 (Janeway et al., 2001). Naast het MHC-genotype kan ook de aanwezige hoeveelheid lichaamseigen antigen in de thymus een rol spelen in de ontwikkeling van een auto-immune aandoening. Een voorbeeld hiervan is humaan insuline, dat een lichaamseigen antigen is in IDDM. Er bestaat een genetische variatie tussen individuen in de transcriptie van het gen insuline. Genvarianten die meer transcriptie ondergaan in de thymus zorgen voor bescherming tegen de ontwikkeling van diabetes. Terwijl varianten die minder transcriptie ondergaan geassocieerd worden met diabetes susceptibiliteit. Wanneer er veel insuline in de thymus tot expressie komt, zou dit deletie van insuline specifieke T-cellen kunnen veroorzaken (Janeway et al., 2001). 3 Tijdens de negatieve selectie kunnen niet alle lichaamseigen antigenen gepresenteerd worden. Hierdoor kunnen een aantal autoreactieve T-cellen ontsnappen aan de selectie in de thymus. Om zich tegen deze T-cellen te beschermen, bestaan er een aantal tolerantiemechanismen zoals klonale deletie, klonale anergie en downregulatie van de TCR. De specifieke herkenning van een antigen door een T-cel zal, in afwezigheid van costimulatoire signalen, resulteren in deletie of anergie van die T-cel. Het is nog onduidelijk welk tolerantiemechanisme zal optreden wanneer een autoreactieve T-cel een antigen in de periferie tegenkomt. Hoge antigen concentraties zouden klonale deletie kunnen induceren in tegenstelling tot zeldzame lichaamseigen antigenen. Er wordt ook gesuggereerd dat chronische blootstelling aan een antigen zou resulteren in downregulatie van coreceptoren, vooral in CD8+ T-cellen (Jiang & Vacchio, 1998). Een auto-specifieke T-cel kan ook falen om in contact te komen met het lichaamseigen antigen omdat het antigen in een te lage concentratie aanwezig is in het bloed, lymfe of lymfoïde organen. Dit gebrek aan activatie noemt men perifere onreactiviteit (Lang et al., 2007). Een abnormale immuunrespons tegen lichaamseigen antigenen wijst op een verlies van deze immuuntolerantie. Dit zou onder andere veroorzaakt kunnen worden door de ontoegankelijkheid van de antigenen. In geval van een weefselletsel bijvoorbeeld, worden er weefselantigenen vrijgesteld die normaal ontoegankelijk zijn. Hierbij treedt er een immuunrespons op tegen lichaamseigen antigenen die normaal niet in de circulatie voorkomen. Een tweede verklaring zou betrekking hebben tot een abnormale T-celfunctie. Enerzijds zou een daling van de regulatoire T-cellen de tolerantiemechanismen kunnen doorbreken. Anderzijds zou een versterkte functie van de Th-cel op 2 manieren autoimmuniteit kunnen veroorzaken. Ten eerste zou dit kunnen veroorzaakt worden door het veranderen van het antigen zodat de Th-cel geactiveerd wordt en de B-cel gaat stimuleren. Daarnaast zou een cross-reactie van antilichamen tegen lichaamsvreemde antigenen die dan gaan reageren tegen lichaamseigen antigenen eveneens een mogelijke verklaring kunnen zijn. Bovendien zou verlies van tolerantie ook veroorzaakt kunnen worden door polyklonale B-cel activatie waarbij B-cellen direct geactiveerd worden door complexsubstanties (vb. bacteriële celwand en virussen) die vele antigene plaatsen bevatten. Polyklonale B-cel activatie zou betrokken zijn in de vorming van auto-antilichamen (Kaal et al., 1999). Sommige AIDs komen meer frequent voor bij vrouwen dan bij mannen. Er werden verschillende hypotheses vooropgesteld om dit verschil te verklaren. Dit zou onder andere verklaard kunnen worden door een verschil in productie van cytokines bij vrouwen en 4 mannen. Th1-cellen secreteren pro-inflammatoire cytokines en promoten een cel-gemedieerde immuunrespons terwijl Th2-cellen cytokines secreteren die antilichaamproductie stimuleren. Vrouwen zouden eerder een Th1-respons ontwikkelen wanneer ze in contact komen met een antigen, behalve tijdens de zwangerschap wanneer er een Th2-omgeving heerst. Een andere mogelijke verklaring zou kunnen liggen in het feit dat vrouwen een sterkere immuunrespons vertonen dan mannen. Bovendien zou het verschil in de productie van verschillende geslachtshormonen, zoals oestrogeen, progesteron en testosteron, dit verschil in optreden kunnen verklaren. Oestrogenen zouden in een lage dosis een versterkend effect hebben en in een hoge dosis (bij de zwangerschap) een inhiberend effect hebben op het immuunsysteem. Progesteron stimuleert de ontwikkeling van Th2-cellen en voorkomt zo het optreden van de Th1-respons. Testosteron heeft anti-inflammatoire eigenschappen. Ook prolactine (PRL), groeihormoon en insuline-like growth factor-1, die ook bij vrouwen in grotere hoeveelheden voorkomen dan bij mannen, zouden een rol spelen in auto-immuniteit (Whitacre et al., 1999). Recente studies echter suggereren een rol voor foetale microchimere cellen die tijdens de zwangerschap in de maternale circulatie terechtkomen en daar tientallen jaren kunnen persisteren (Gleicher & Barad, 2007). 1.3 FOETALE MICROCHIMERE CELLEN Microchimerie wordt gedefinieerd als de aanwezigheid van een klein hoeveelheid circulerende cellen, bi-directioneel overgedragen van één genetisch verschillend individu naar een ander. Microchimerie kan het gevolg zijn van een iatrogene ingreep, zoals een bloedtransfusie of een transplantatie. Tijdens de zwangerschap kan het ook fysiologisch optreden door transfer van cellen van de foetus naar de moeder en vice versa. Bij tweelingen kan bovendien ook een transfer van cellen optreden (Ando & Davies, 2004; Lapaire et al., 2007; Daniel et al., 2009). Foetale cel microchimerie wordt omschreven als de aanwezigheid van foetale cellen in maternale organen en bloed, zonder optreden van een „graft versus host‟ reactie (GvHR). Deze foetale cellen initiëren bijgevolg geen immuunreactie tegen de maternale weefsels die zij als gedeeltelijk vreemd herkennen (Lapaire et al.,2007). De foetale cellen kunnen in de maternale circulatie gedetecteerd worden vanaf de eerste 4-6 weken van de zwangerschap (Ando & Davies, 2003). Vanaf de vierde week en het derde trimester worden respectievelijk 0,24 en 11,6 foetale cellen per ml maternaal bloed 5 gedetecteerd (Ariga et al., 2001). Zwangerschapsvergiftiging, vroegtijdig beëindigen van de zwangerschap en een aneuploïde foetus hebben echter een grote invloed op het aantal foetale cellen in de maternale circulatie (Bianchi et al., 2001; Khosrotehrani & Bianchi, 2003). Vandaar dat het belangrijk is om de medische voorgeschiedenis van deze vrouwen te kennen. Jaren na de bevalling worden nog steeds foetale respectievelijk maternale cellen gevonden in de moeder en het kind wat op de insufficiënte eliminatie van deze cellen wijst. Mannelijke foetale cellen werden nog steeds gedetecteerd in maternaal bloed tot 27 jaar postpartum (Bianchi et al., 1996). Sommige vrouwen echter ontwikkelen in de postpartum periode een auto-immune aandoening. Daarom werd al gauw een associatie gelegd tussen de foetale microchimerie en het ontstaan van auto-immune aandoeningen (Nelson, 1996). Veel onderzoekers hebben aangetoond dat er een associatie bestaat tussen foetale cellen in maternaal weefsel/bloed en maternale AID zoals sclerodermie (Khosrotehrani & Bianchi, 2003). Voor de ziekte van Hashimoto en Graves, twee auto-immune schildklieraandoeningen, werd reeds aangetoond dat er foetale cellen aanwezig zijn in de schildklier van deze patiëntes (Renné et al., 2004), maar naar onze kennis is er nog geen associatie aangetoond tussen foetale microchimere cellen in het bloed van deze patiëntes en een auto-immune schildklieraandoening. In deze thesis wordt daar verder op ingegaan. 1.4 AUTO-IMMUNE SCHILDKLIERAANDOENINGEN Auto-immune schildklieraandoeningen zijn de meest voorkomende orgaan-specifieke AIDs, die ongeveer 5% van de algemene populatie treffen (Klecha et al., 2008) en komen ongeveer voor 80% meer voor bij vrouwen dan bij mannen (Fairweather & Rose, 2004). Vandaar dat deze aandoeningen uitermate geschikt zijn om de rol van de foetale cellen in het ontstaan van deze aandoeningen op te helderen. 1.4.1 De schildklier De schildklier is een vlindervormig orgaan bestaande uit 2 laterale kwabben die zich aan weerszijden van de trachea bevinden. Deze kwabben zijn verbonden door de isthmus. Het grootste gedeelte van de schildklier bestaat uit thyroidfollikels. De wand van elke follikel bestaat uit folliculaire cellen. Elke follikel wordt omgeven door een basaal membraan. De folliculaire cellen produceren twee schildklierhormonen nl. thyroxine, ook wel tetrajodothyronine (T4) genoemd, en trijodothyronine (T3). De parafolliculaire cellen of C6 cellen, gelegen tussen de follikels, produceren het hormoon calcitonine (Tortora & Derrickson, 2006). Thyroid releasing hormone (TRH), geproduceerd door de hypothalamus, en thyroid stimulating hormone (TSH), geproduceerd door de hypofyse, stimuleren de synthese en de vrijstelling van de schildklierhormonen. Schildklierhormonen zorgen voor een stijging van het basaal metabolisme en voor meer synthese van Na+/K+ ATPase. Ze spelen een rol in het behoud van de lichaamstemperatuur en stimuleren de proteïnesynthese, de lipolyse en het verbruik van glucose en vetzuren. Samen met het humaan groei hormoon en insuline gaan ze de lichaamsgroei bevorderen (Tortora & Derrickson, 2006). Lage T3 en T4-niveaus stimuleren de hypothalamus tot de productie van TRH. Dit laatste bereikt de hypofyse en zet deze aan tot de productie van TSH. TSH zet op zijn beurt de folliculaire cellen aan tot groei, hogere productie en secretie van hormonen en meer jodium „trapping‟. De folliculaire cellen secreteren T3 en T4 in het bloed. Een verhoogd niveau van T3 inhibeert de vrijstelling van TRH en TSH (via een negatief feedback systeem) (Tortora & Derrickson, 2006). 1.4.2 Pathogenese van de ziekte van Hashimoto/Graves Er wordt verondersteld dat het ontstaan van AIDs start met de activatie van CD4+ Thlymfocyten die specifiek schildklierantigenen herkennen. Er worden twee hypotheses vooropgesteld om deze activatie te verklaren. De eerste hypothese veronderstelt dat er een bacteriële of virale infectie optreedt die een proteïne bevat dat sterk lijkt op eiwitten van de schildklier. Het immuunsysteem ziet deze eiwitten als vreemd en start een immuunreactie. Door de gelijkenissen zal vervolgens een activatie van schildklierspecifieke T-cellen optreden. Dit proces noemt men cross-reactie. De tweede hypothese stelt dat thyroid epitheliale cellen hun eigen intracellulaire eiwitten presenteren aan Th-cellen. Eenmaal de autoreactieve CD4+ T-cellen geactiveerd zijn, kunnen deze de B-cellen activeren die dan op hun beurt antilichamen tegen de schildklier gaan secreteren (Dayan & Daniels, 1996). De targetantigenen van de antilichamen tegen de schildklier zijn thyroglobuline (Tg), een glycoproteïne die zorgt voor de opslag van de schildklierhormonen; thyroid peroxidase (TPO), een enzym belangrijk in de schildklierhormoon biosynthese; en de thyroid stimulating hormone receptor (TSHR) (Dayan & Daniels, 1996). 7 Auto-immuniteit tegen de TSHR heeft tot gevolg dat de folliculaire cellen overgestimuleerd worden en een overmaat aan schildklierhormonen gaan produceren. Deze hyperthyroïdie is kenmerkend voor de ziekte van Graves. Auto-immuniteit tegen Tg en TPO wordt vooral gezien bij de ziekte van Hashimoto waarbij de folliculaire cellen worden vernietigd door voornamelijk CD8+ T-cellen die gerecruteerd worden door de geactiveerde CD4+ T-cellen. Door het verlies van de folliculaire cellen gaat de hormoonsynthese gradueel afnemen met hypothyroïdie tot gevolg (Dayan & Daniels, 1996; Davies, 1999; Klecha et al., 2008). Een vaak voorkomend fenomeen bij een auto-immune schildklieraandoening (AITD) is dat de aandoening tijdens de zwangerschap minder ernstig is, terwijl dit na de zwangerschap terug verergert. Hoe meer de paternale HLA klasse II allelen (DR en DQ) verschillen van de maternale allelen, hoe groter de kans dat het haplotype van de foetus ook zal verschillen van dat van de moeder waardoor de immuunsuppressie tijdens de zwangerschap sterker zal moeten zijn om geen afstoting van de foetus tot gevolg te hebben. Tijdens de zwangerschap zou het aantal specifieke T-cellen voor foetale antigenen dalen door perifere klonale deletie in het maternale immuunsysteem. De overblijvende klonale T-cellen zouden ongevoelig worden voor antigene stimulatie (anergie). Dit brengt op zijn beurt mee dat er ook een zwakkere immuunrespons tegen de schildklier zal optreden. Hoe sterker bovendien de immuunsuppressie tijdens de zwangerschap, hoe groter de terugval in immuunreactiviteit na de zwangerschap. In het artikel van Davies (1999) werden vier hypotheses vooropgesteld die de verergering van de AID na de zwangerschap zouden kunnen verklaren. De verergering zou ten eerste verklaard kunnen worden door het verlies van placentale MHC-peptide complexen die de T-cel anergie induceerden tijdens de zwangerschap. Tijdens de zwangerschap vinden er bovendien immunologische veranderingen plaats in de maternale doelorganen, zoals in de schildklier, die kunnen persisteren na de zwangerschap. Een derde verklaring zou de inductie van immunologische actieve PRL secretie zijn door borstvoeding. Een verlaging van het aantal foetale microchimere cellen, die aanleiding zouden kunnen geven tot een verlies van de maternale tolerantie t.o.v. de overblijvende microchimere cellen, zou ook een verklaring kunnen zijn (Jiang & Vacchio, 1998; Davies, 1999; Klintschar et al, 2001; Ando & Davies, 2003). 8 1.4.3 Klinische manifestatie De klinische manifestaties bij patiënten met de ziekte van Hashimoto zijn vaak niet specifiek en veel patiënten zijn asymptomatisch. Sommige patiënten met chronische AITD ontwikkelen hypothyroïdie, een goiter of beiden. De ziekte van Hashimoto komt tot 9 keer meer voor bij vrouwen in vergelijking tot mannen en een hoger aantal vrouwen hebben een goiter. De incidentie voor het ontwikkelen van hypothyroïdie stijgt met de leeftijd, en dan voornamelijk na 45 jaar (Dayan & Daniels, 1996; Takami et al., 2008). In de ziekte van Hashimoto (goitreuze AITD) is de schildklier vergroot. Compressie van de trachea en- oesofagus zijn zeldzaam (Dayan & Daniels, 1996). Door de hypothyroïdie hebben de patiënten last van vermoeidheid, lethargie, koude-intolerantie, gewichtstoename, droge en ruwe haren en huid, hese stem, constipatie, bradycardie, dementie en een toegenomen cholesterolgehalte. De ziekte van Graves komt 5 à 10 keer meer voor bij vrouwen in vergelijking tot mannen. De incidentie voor het ontwikkelen van hyperthyroïdie stijgt met de leeftijd en ontwikkelt zich vooral tussen de 40 en 60 jaar (Weetman, 2000). De ziekte van Graves wordt gekenmerkt door een hyperthyroïdie. De overproductie van T4 en T3 leidt tot gewichtsverlies, tachycardie, nervositeit, tremor, angsten, slapeloosheid, warmte-intolerantie, zweten, goiter en ophthalmopathie. 1.4.4 Diagnose en behandeling De diagnose voor de ziekte van Hashimoto berust op het bepalen van de aanwezigheid van anti-Tg-antilichamen, anti-TPO-antilichamen en de bepaling van de concentratie van Tg in het bloed. Ook lage schildklierhormoon- en hoge TSH waarden bevestigen de diagnose (Dayan & Daniels, 1996; Takami et al., 2008). Een tekort aan schildklierhormonen kan verklaard worden door vernietiging van de folliculaire cellen. Door dit tekort wordt de hypothalamus gestimuleerd tot de productie van TRH, dat op zijn beurt de hypofyse aanzet tot de productie van TSH. Door de vernietiging van de folliculaire cellen blijft, ondanks de stimulatie van de schildklier door TSH, het niveau van de schildklierhormonen laag waardoor er nog meer TSH geproduceerd zal worden. Dit resulteert echter in een teveel aan TSH en leidt uiteindelijk tot hyperplasie en hypertrofie van de schildklier waardoor een goiter ontstaat. 9 De diagnose van de ziekte van Graves berust op het bepalen van de aanwezigheid van anti-TSHR-antilichamen. Het bloedonderzoek toont hoge en respectievelijk lage schildklierhormoon -en TSH waarden. De antilichamen tegen de TSHR zorgen voor een overstimulatie van de folliculaire cellen met een teveel aan schildklierhormonen tot gevolg. T3 gaat op zijn beurt via een negatief feedback systeem de hypofyse remmen in de productie van TSH. Daarnaast kan ook de schildklier in beeld gebracht worden via scintigrafie of echografie. Een scintigrafie geeft informatie over de grootte, de vorm, de ligging en de activiteit van de schildklier. Bij een scintigrafie wordt de opname van radioactieve stof door de schildklier gemeten. Deze is verlaagd bij de ziekte van Hashimoto. Bij een late fase van de ziekte van Hashimoto is dikwijls geen schildklier meer zichtbaar. Bij de ziekte van Graves is de schildklier donker gekleurd door de overactiviteit van de schildkliercellen (Figuur 1.1.). Een echografie geeft informatie over de consistentie van het schildklierweefsel en toont in een aantal gevallen een vergrootte schildklier. FIGUUR 1.1.: SCHILDKLIERSCINTIGRAFIE. A: NORMALE SCHILDKLIER. B: HYPOTHYROÏDIE MET AANDUIDING VAN DE LIGGING VAN DE SCHILDKLIER. C: HYPERTHYROÏDIE (www.edumediasciences.com). Patiënten met hypothyroïdie worden levenslang behandeld met substitutiehormonen met als doel de euthyroïde toestand te herstellen en te behouden. Thyroxine wordt eveneens gegeven voor de behandeling van een goiter (Dayan & Daniels, 1996; Takami et al, 2008). De behandeling van hyperthyroïdie kan gebeuren met antithyroïd geneesmiddelen, gedeeltelijke resectie van de schildklier en radioactief jodium. 10 1.4.5 De potentiële rol van foetale microchimerie in het ontstaan van de ziekte van Hashimoto/Graves Foetale microchimerie komt significant meer voor in de schildklier van patiënten met de ziekte van Hashimoto in vergelijking met de schildklier van patiënten met een nodulaire goiter. Volgens de studie uitgevoerd door Klintschar et al. (2001) komt foetale microchimerie in ongeveer 50% van de patiënten met de ziekte van Hashimoto voor terwijl dit maar in 4% van de controlegroep met nodulaire goiter gedetecteerd werd. Hierdoor wordt de hypothese gesteld dat deze foetale cellen een rol zouden kunnen spelen in de ontwikkeling van de ziekte van Hashimoto. Er kan echter niet uitgesloten worden dat deze microchimere cellen louter onschuldige bystanders zijn die ten gevolge van de aandoening in de schildklier aanwezig zijn (Klintschar et al., 2001). Indien foetale microchimere cellen inderdaad verantwoordelijk zouden zijn voor het ontstaan van de ziekte van Hashimoto, dan zouden zij een immunologische reactie initiëren, gelijkaardig als in een cGvHD waardoor de hypothese gesteld wordt dat de ziekte van Hashimoto een vorm van GvHD is. Door de HLA klasse II compatibiliteit tussen moeder en foetus, zouden de foetale cellen tijdens de passage doorheen de placenta niet herkend worden door de moeder. Als de foetus homozygoot is voor de moeder haar allelen, dan worden ze al helemaal niet herkend door het maternale immuunsysteem en de moeder zal dus geen immuunrespons ontwikkelen. Bovendien is het maternale immuunsysteem gesuppresseerd tijdens de zwangerschap. Foetale cellen kunnen echter persisteren in de maternale circulatie tot tientallen jaren na de bevalling. Een bepaalde gebeurtenis, zoals een virale infectie, kan ervoor zorgen dat de foetale cellen geactiveerd worden waardoor een GvHR ontstaat. Deze geactiveerde immuuncellen zouden vervolgens cytokines kunnen produceren waardoor de autoreactieve T-cellen geactiveerd worden en een AITD veroorzaken (Figuur 1.2.) (Kaal et al., 1999; Lambert et al,.2001; Lapaire et al, 2007). 11 FIGUUR 1.2: HYPOTHESE WAARBIJ FOETALE CELLEN POSTPARTUM AITD ZOUDEN KUNNEN VEROORZAKEN. A: DOOR PLACENTALE IMMUUNSUPRESSIE KOMEN FOETALE CELLEN IN DE MATERNALE CIRCULATIE. B: DE IMMUNOLOGISCHE INTERACTIE TUSSEN MATERNALE EN FOETALE IMMUUNCELLEN ZOU DAARBIJ MINIMAAL EN/OF VERWAARLOOSBAAR ZIJN. C: PARTIËLE IMMUUNSUPRESSIEVE EFFECTEN POSTPARTUM VERGEMAKKELIJKEN HET OVERLEVEN VAN FOETALE CELLEN WAARNA ZIJ GEACTIVEERD KUNNEN WORDEN DOOR VERLIES VAN DE PLACENTALE IMMUUNSUPRESSIE. D: GEACTIVEERDE FOETALE IMMUUNCELLEN INITIËREN GVHR TEGEN DE MATERNALE ANTIGENEN DOOR HET SECRETEREN VAN IMMUNOMODULERENDE CYTOKINEN EN/OF DOOR EXPRESSIE VAN IMMUNOMODULERENDE MOLECULEN, DIE DE INTRATHYROÏDALE MATERNALE AUTOREACTIEVE T-CELLEN ACTIVEREN EN EVENTUEEL AITD INITIËREN (Ando & Davies, 2003). Volgens Nelson et al. zijn er verschillende mechanismen die ervoor zorgen dat microchimere cellen bijdragen tot de ontwikkeling van een AID. Foetale cellen zouden directe effectoren zijn die schade veroorzaken aan gastheerweefsel en een GvHD initiëren. De lage concentraties foetale cellen gedetecteerd in de maternale circulatie spreekt echter deze hypothese tegen. Een tweede verklaring zou zijn dat een kleine populatie van niet-gastheer cellen (of peptiden) een proces kunnen starten waarbij gastheercellen schade aan eigen weefsel zouden kunnen veroorzaken. Ten derde zou een kleine populatie van niet-gastheer cellen (vetocellen) de gastheer zijn immuunregulatoire cellen kunnen downreguleren, wat toelaat dat er schade aan eigen weefsel kan optreden door autoreactieve gastheercellen. 12 FIGUUR 1.3: MECHANISMEN WAARMEE MICROCHIMERE CELLEN ZOUDEN KUNNEN BIJDRAGEN TOT DE PATHOGENESE VAN AUTO-IMMUNE AANDOENINGEN. IN HET EERSTE MODEL HERKENNEN DE MATERNALE CD4+ EN CD8+ T-CELLEN DE INTACTE HLA-MOLECULE PLUS PEPTIDE OP HET OPPERVLAK VAN DE FOETALE APC. DIT WORDT VAAK DE DIRECTE PATHWAY VAN ALLOGEENHERKENNING GENOEMD. HET TWEEDE MODEL IS DE INDIRECTE PATHWAY. DE MATERNALE CD4+ T-CEL HERKENT FOETALE HLA PEPTIDEN DIE GEPRESENTEERD WORDEN DOOR HAAR EIGEN APCs. ACTIVATIE VAN T-CELLEN LEIDT TOT SECRETIE VAN CYTOKINES, DIE DE ACTIVATIE VAN CYTOTOXISCHE CD8+ CELLEN, B-CELLEN, NK-CELLEN EN MACROFAGEN FACILITEREN WAARDOOR SCHADE AAN DE WEEFSELS KAN BEROKKEND WORDEN (Nelson, 2002). Het maternaal immuunsysteem kan op verschillende manieren gestimuleerd worden door maternale -en foetale antigenen. Maternale antigenen kunnen opgenomen worden door foetale cellen en gepresenteerd worden aan maternale T-cellen (indirecte herkenning) waardoor deze laatste reageren tegen de eigen maternale weefsels en op die manier schade berokkenen. De moeder kan ook foetale peptiden herkennen die gepresenteerd worden door foetale APCs (directe herkenning, Figuur 1.3.) of maternale APCs (indirecte herkenning). Als deze peptiden homoloog zijn aan de maternale lichaamseigen antigenen zouden deze peptiden een maternale immuunrespons kunnen initiëren (cross-reactie) (Kaal et al, 1999). 13 2 OBJECTIEVEN De doelstelling van dit project is in eerste instantie de foetale microchimere cellen in het bloed van patiëntes met auto-immune schildklieraandoeningen te detecteren. In tweede instantie zullen de gedetecteerde foetale microchimere cellen geïsoleerd en gedetailleerd gekarakteriseerd worden. Deze detectie en eenduidige karakterisering zal mogelijks leiden tot een opheldering van hun mogelijke rol in het ontstaan van auto-immuun pathologieën. Omdat de meeste auto-immuun pathologieën frequenter voorkomen bij vrouwen, is de detectie van het Y-chromosoom een bruikbare methode om de aanwezigheid van mannelijke microchimere cellen, afkomstig van een zwangerschap met een mannelijke foetus, te bestuderen tegen een achtergrond van maternale cellen. Foetale cellen in het bloed van patiëntes met een auto-immune schildklieraandoening die zwanger geweest zijn van minstens één zoon, zullen gedetecteerd worden en vergeleken worden met de foetale cellen in het bloed van een cohorte gezonde vrouwen die eveneens één of meerdere zonen gebaard hebben. Omwille van het lage percentage foetale microchimere cellen is een aanrijkingsprocedure noodzakelijk. Dit zal gebeuren aan de hand van Ficoll densiteitscentrifugatie. De mannelijke foetale cellen zullen vervolgens op een automatische manier gedetecteerd worden aan de hand van Fluorescentie In Situ Hybridisatie (FISH) met fluorescent gelabelde X en Y-chromosoomspecifieke DNA-probes. Als extra controle zullen cellen met een Y-FISH signaal geïsoleerd worden door middel van Laser Pressure Catapulting (LPC) en zal, na de DNA extractie, een Polymerase Chain Reaction (PCR) van de Short Tandem Repeats (STRs) op het Y-chromosoom uitgevoerd worden (Y-STR). Na de detectie van de foetale cellen in het maternaal bloed, zullen deze cellen gekarakteriseerd worden. Verdeling in verschillende celtypes zal gebeuren met behulp van EasySep®. 14 3 MATERIALEN EN METHODEN 3.1 DENSITEITSCENTRIFUGATIE MET FICOLL-PAQUE® PLUS 3.1.1 Principe In samenwerking met het UZ Gent en UZ Brussel, werd bloed verkregen van patiëntes met de ziekte van Hashimoto en Graves. Mononucleaire cellen werden uit het bloed geïsoleerd door middel van densiteitscentrifugatie over Ficoll. Deze mononucleaire fractie, bestaande uit lymfocyten en monocyten, zou naast maternale ook foetale cellen bevatten (Bianchi et al., 1996). Ficoll-Paque® PLUS is een steriel gradiënt medium voor het isoleren van lymfocyten. Het bestaat uit Ficoll 400, natrium diatrizoaat (Na diatrizoaat) en calcium dinatrium ethyleendiaminetetra-azijnzuur (CaNa2EDTA). Ficoll 400 is een synthetisch sterk vertakt polymeer van sucrose en epichloorhydrine met een hoog moleculair gewicht (MG = 400 000 g/mol) en een lage intrinsieke viscositeit. De Na diatrizoaat zorgt voor een optimale densiteit en osmolariteit. De functie van CaNa2EDTA is het voorkomen van coagulatie (GE healthcare Amersham Biosciences AB, 2001; Munteanu & Dinu, 2004). FIGUUR 3.1.: CENTRIFUGATIE OVER EEN FICOLL DENSITEITSGRADIËNT (GE healthcare Amersham Biosciences AB, 2001). De dichtheid van de Ficoll-Paque® PLUS (1,077 g/ml) is groter dan deze van lymfocyten, monocyten en bloedplaatjes maar is kleiner dan deze van de erythrocyten en granulocyten. De granulocyten en erytrocyten diffunderen dus doorheen de Ficoll-laag en de lymfocyten, monocyten en bloedplaatjes zullen boven de Ficoll-laag teruggevonden worden. Wanneer de erythrocyten in contact komen met de Ficoll-laag gaan ze aggregeren waardoor hun sedimentatiesnelheid verhoogd. Er gebeurt dus een scheiding op basis van densiteit (GE healthcare Amersham Biosciences AB, 2001). 15 De laag van mononucleaire cellen kan vervolgens geïsoleerd worden met behulp van een pasteurpipet. De cellen worden vervolgens gewassen om de bloedplaatjes, de FicollPaque PLUS en het plasma te verwijderen. Het resultaat is een celsuspensie die sterk opgezuiverde lymfocyten en monocyten bevat (GE healthcare Amersham Biosciences AB, 2001). 3.1.2 Materialen Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x (Invitrogen, Paisley, VK ). Ficoll-Paque® PLUS (GE healthcare, Upssala, Zweden). Eppendorf Centrifuge 5810 R (Eppendorf North America, New York, VS). 3.1.3 Methode Maak een 1:1 verdunning van het met EDTA-behandeld bloed met PBS (1x). Breng 3 ml Ficoll-Paque PLUS in een falcon-tube van 15 ml. Breng voorzichtig en traag 7 ml verdund bloed op de Ficoll-Paque® PLUS. Centrifugeer 20 minuten bij 22°C aan 1100g met een versnelling 2 en rem 0. Neem de mononucleaire cellaag af met een pasteurpipet en breng over in een falcontube van 15 ml. Leng de celsuspensie aan tot 15 ml met PBS (1x) en centrifugeer 5 minuten aan 1500 rpm bij 22°C. Verwijder het supernatans en resuspendeer de celpellet in 10 ml PBS (1x). Centrifugeer de suspensie 5 minuten aan 1500 rpm bij 22°C. Verwijder het supernatans en resuspendeer de celpellet terug in 10 ml PBS (1x). Tel de cellen. 3.2 HEMACYTOMETRIE 3.2.1 Principe De hemacytometer wordt gebruikt voor het microscopisch tellen van cellen in een celsuspensie. De hemacytometer bestaat uit 2 telkamers waarin telkens 10 µl celsuspensie kan worden gebracht. De celsuspensie wordt 1:1 verdund door 10 µl van de celsuspensie te mengen met 10 µl trypaanblauw. Trypaanblauw is een blauwe kleurstof die de dode cellen aankleurt en die ervoor zorgt dat de dode cellen van de levende cellen kunnen onderscheiden 16 worden. De dode cellen worden niet meegeteld. Elk kwadrant (bestaande uit 16 vierkantjes) van de telkamer heeft een oppervlakte van 1 mm2 en een diepte van 0,1 mm, wat overeenkomt met 0,1 mm3 of 0,1 µl. Aangezien de celsuspensie 1:1 verdund is, moeten bijgevolg twee kwadranten geteld worden om het totaal aantal cellen per 0,1 µl te bepalen. Het aantal getelde cellen wordt vermenigvuldigd met 104 en dit levert het aantal cellen per milliliter celsuspensie op. FIGUUR 3.2.: HEMACYTOMETER (www.ruf.rice.edu). 3.2.2 Materialen Trypan Blue Solution (Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim, Duitsland). Bright-Line Hemacytometer met draagglaasje (Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim, Duitsland). 3.2.3 Methode Bevochtig de randen van de hemacytometer en plaats het dekglaasje erop. Meng in een epje 10 µl celsuspensie met 10 µl trypaanblauw. Breng van dit mengsel 10 µl aan de rand van het dekglaasje. Tel de cellen in 32 telhokjes. 3.3 CYTOSPIN Na de densiteitscentrifugatie met Ficoll-Paque® PLUS en het tellen van de cellen worden de cellen gecytospind. 3.3.1 Principe Cellen uit een suspensie kunnen met behulp van centrifugaalkrachten op een draagglaasje gespind worden. Hierdoor worden de cellen in hetzelfde focaal vlak gebracht. De 17 draagglaasjes worden eerst gecoat met poly-L-lysine, die voor een betere adhesie tussen de cellen en het draagglaasje zorgt waardoor het verlies van cellen tot een minimum beperkt wordt. 3.3.2 Materialen 0,17 mm draagglaasjes (Chem-Lab NV, Zedelgem, België). Poly-L-lysine 0,01% (Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim, Duitsland). Rotofix 32A (Hettich Zentrifugen, Tuttlingen, Duitsland). 3.3.3 Methode Coat de 0,17 mm draagglaasjes gedurende 30 minuten met poly-L-lysine. Verwijder de poly-L-lysine en breng een volume van de celsuspensie, overeenstemmend met het gewenste aantal cellen, op de 0,17 mm draagglaasjes. Centrifugeer 5 minuten aan 1500 rpm. Verwijder de bovenstaande vloeistof en laat de draagglaasjes drogen aan de lucht. 3.4 FLUORESCENTIE IN SITU HYBRIDISATIE 3.4.1 Principe Fluorescentie In Situ Hybridisatie (FISH) is een techniek die gebruikt wordt om de aanof afwezigheid van bepaalde chromosomen en/of sequenties van het genoom van een individu te detecteren. Hierbij gebruikt men fluorescente probes die ontwikkeld zijn om te binden aan geconserveerde DNA-sequenties. Deze probes kunnen vervolgens gevisualiseerd worden met een fluorescentiemicroscoop. Met deze techniek kunnen mannelijke en vrouwelijke cellen van elkaar onderscheiden worden door gebruik te maken van fluorescent gelabelde X- en Ychromosoomspecifieke DNA-probes. In dit onderzoek wordt gebruik gemaakt van een mix van SpectrumGreen gelabelde CEP-Y-probe, gericht tegen de satelliet III regio van het Ychromosoom, en van SpectrumOrange gelabelde X-chromosoom, gericht tegen de alfa satelliet centromere regio van het X-chromosoom (Moter & Göbel, 2000). FISH bestaat uit 5 fundamentele stappen. In de eerste stap worden de cellen gefixeerd. Vervolgens worden de cellen met pepsine behandeld waardoor de probes makkelijker het DNA kunnen bereiken. Achtergrondsignalen worden hierbij ook verminderd. Vervolgens worden de chromosomen gedenatureerd gevolgd door hybridisatie van het enkelstrengig DNA 18 met de probes. De denaturatie gebeurt op hoge temperatuur in aanwezigheid van formamide. Formamide is een organisch solvent dat de stabiliteit van de waterstofbindingen vermindert waardoor de denaturatie kan plaatsvinden bij een lagere temperatuur. De hybridisatie met de probes gebeurt overnacht. De achtereenvolgende wasstappen zijn nodig om de niet gebonden -en niet-specifiek gebonden probes te verwijderen. Van zodra de fluorescente probe op de cellen is aangebracht, wordt gewerkt in een verduisterde omgeving om het verlies van fluorescentie-intensiteit tot een minimum te beperken. In een laatste fase worden de probes gedetecteerd met behulp van de fluorescentiemicroscoop (Raff & Schwanitz, 2001). De celkernen worden zichtbaar gemaakt met behulp van 4‟,6-diamidino-2-phenyl-indole (DAPI). Het Vectashield mounting medium wordt gebruikt om het verlies van fluorescentie tijdens de evaluatie met de microscoop te beperken. FIGUUR 3.3.: PRINCIPE FLUORESCENTIE IN SITU HYBRIDISATIE (FISH). NA DE FIXATIE VAN DE CELLEN OP HET DRAAGGLAASJE WORDT HET DNA GEDENATUREERD. VERVOLGENS HYBRIDISEERT DE TOEGEVOEGDE PROBE MET ENKELSTRENGIG DNA (www.wardelab.com). 3.4.2 Materialen Coplin Jar (VWR, international, Pennsylvania, VS). Carnoy‟s fixatief (3:1 methanol: azijnzuur). Methanol (Fisher scientific, Leicestershire, VK). Azijnzuur 99-100% (Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim, Duitsland). Pepsine Porcine (Serva Electrophoresis, Heidelberg, Duitsland). Waterstofchloride (HCl) 37% (Sigma-Aldrich, Steinheim, Duitsland). Pepsine oplossing: 0,01% pepsine, 0,01 M HCl en Milli-Q water. 19 Magnesiumdichloride (MgCl2) (Sigma Chemical, Saint-Louis, VS). Postfixatie-oplossing: 10% PBS (10x), 10% 0,5 M MgCl2, Milli-Q water. Formaldehyde 37% (Acros Organics, Geel, België). 1% formaldehyde-oplossing: 10% PBS (10x), 10% 0,5 M MgCl2, 1% formaldehyde 37%, Milli-Q water. Ethanol absolute for analysis: verdunningen van 70%, 90% en 95% (Merck, Darmstadt, Duitsland). 20x natriumchloride en natriumcitraat (SSC): 66g (DNA Probe Kit, Abbott) per 250 ml Milli-Q water, pH 5,3. Formamide (Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim, Duitsland). Denaturatie-oplossing: 70% formamide, 10% 20x SSC, Milli-Q water, pH 7-8. CEP® X SpectrumOrangeTM/ Y SpectrumGreenTM Direct Labeled Fluorescent DNA probe Kit (Abbott, Wiesenbaden, Duitsland). Nonidet P40 Substitute (NP-40) (Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim, Duitsland). 0,4x SSC/0,1% NP-40 , pH 7-7,5. 2x SSC/0,1% NP-40, pH 7-7,5. 4‟,6-diamidino-2-Phenyl-Indole (DAPI) (Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim, Duitsland). Vectashield mounting medium (Vector Laboratories, Burlingame, VS). DAPI-concentratie/Vectashield: 500 ng/ml. Hybridiser (DAKO Belgium, Heverlee, België). 3.4.3 Methode Fixeer de draagglaasjes 5 minuten in Carnoy‟s fixatief. Spoel met Milli-Q water en laat ze drogen aan de lucht. Incubeer de draagglaasjes gedurende 30 minuten in de pepsine oplossing op 37°C. Spoel met PBS (1x) bij kamertemperatuur en breng ze gedurende 5 minuten in de postfixatie-oplossing. Incubeer gedurende 10 minuten in de 1% formaldehyde-oplossing. Breng ze nadien gedurende 5 minuten in PBS (1x). Incubeer in een 70%, 90%, 95% ethanol-oplossing gedurende telkens 3 minuten. Laat de draagglaasjes drogen aan de lucht. Denatureer gedurende 5 minuten bij 73°C in de denaturatie-oplossing. 20 Dehydrateer in 70%, 90% en 95% ethanol gedurende telkens 1 minuut. Verwarm de preparaten gedurende 2 minuten bij 47°C op de hybridiser. Breng 5µl probe aan, gevolgd door een dekglaasje. De hybridisatie gebeurt overnacht bij 42°C in het hybridisatietoestel. Was na de hybridisatie de dekglaasjes weg bij kamertemperatuur met 0,4x SSC/0,1% NP-40. Was de draagglaasjes gedurende 3 minuten in 0,4x SSC/0,1% NP-40 bij 73°C. Was ze hierna 3 maal 2 minuten met 2x SSC/0,1% NP-40 bij kamertemperatuur. Spoel na met Milli-Q water en laat drogen. Breng 10 µl DAPI/Vectashield aan op de cellen, gevolgd door een dekglaasje. 3.5 FLUORESCENTIEMICROSCOPIE 3.5.1 Principe Moleculen kunnen met behulp van de energie van een elektromagnetische straling in een geëxciteerde toestand gebracht worden. De excitatie gaat gepaard met een verhoging van de elektronenenergie en/of rotatie/vibratie-energie. Men noemt dit verschijnsel absorptie. Na de excitatie streeft de molecule terug naar een lagere energietoestand. Dit kan gebeuren door afgifte van de geabsorbeerde energie. Dit wordt relaxatie genoemd. Bij dit proces kan de geabsorbeerde energie op verschillende manieren „intern‟ of aan de omgeving afgegeven worden. In de meeste gevallen gaan moleculen terug naar hun grondtoestand door afgifte van de geabsorbeerde energie onder de vorm van warmte. Men spreekt dan van nietstralingsrelaxatie. Maar in sommige gevallen gebeurt de relaxatie met vrijstelling van een foton. Men spreekt dan over fotoluminiscentie, waarbij onderscheid gemaakt wordt tussen fluorescentie en fosforescentie. Over het algemeen verliest de molecule eerst „intern‟ een deel van haar geabsorbeerde energie en keert naar de eerste aangeslagen toestand terug. Is de eerste aangeslagen toestand een „singlet‟ toestand, dan noemt men dit proces fluorescentie. In het geval van fosforescentie is de eerste aangeslagen toestand een „triplet‟ toestand. 21 FIGUUR 3.4.: JABLONSKI DIAGRAM (Lakowicz, 2006). De energie van de uitgezonden straling is lager dan de energie van de geabsorbeerde straling waardoor de golflengte van de uitgezonden straling langer zal zijn dan de golflengte van de geabsorbeerde straling. Dit fenomeen noemt men de Stokes shift (Figuur 3.5.). Naarmate de Stokes shift groter is, wordt het gemakkelijker om de geabsorbeerde straling van de uitgezonden straling te scheiden met behulp van filters. FIGUUR 3.5.: STOKES SHIFT. Een standaard epifluorescentie microscoop bestaat uit 3 elementen: een excitatiefilter, een emissiefilter en een dichroïsche spiegel. De excitatiefilter zorgt ervoor dat licht, afkomstig van een lichtbron, met een specifieke golflengte nodig om het gebruikte fluorochroom te exciteren wordt doorgelaten. Na afbuigen van dit licht met behulp van een dichroïsche spiegel, wordt het licht gefocust op het preparaat doorheen een objectief. De geëxciteerde moleculen gaan vervolgens licht emitteren bij een welbepaalde golflengte. Een emissiefilter laat dan enkel de gewenste golflengtes, nodig voor de detectie, door. 22 FIGUUR 3.6.: EEN TYPISCHE FLUORESCENTIE FILTER SETUP (www.gonda.ucla.edu). De dichroïsche spiegel wordt in een hoek van 45° geplaatst en bevindt zich tussen de excitatie -en emissiefilter. De voornaamste functie van de dichroïsche spiegel is het oriënteren van de geselecteerde kortere absorptie golflengten door het objectief naar het preparaat. Hun tweede functie is het doorlaten van langere golflengten van uitgezonden fluorescentie in de richting van de emissiefilter. Tabel 3.1. illustreert de excitatie- en emissiegolflengten en filtersets van het SpectrumGreen, SpectrumOrange en DAPI. TABEL 3.1.: EXCITATIE- EN EMISSIEGOLFLENGTEN EN FILTERSETS VAN DE FLUORESCENTE LABELS. HET SYMBOOL "/" WIJST OP DE „BAND PASS‟ VAN HET GEBRUIKTE FLUOROCHROOM EN DE FILTERSET. IN HET GEVAL VAN HET FLUOROCHROOM SPECTRUM ORANGE WIL DIT ZEGGEN DAT HET GEËXCITEERD WORDT BIJ EEN GOLFLENGTE 538 nm ± 5 nm EN DAT DEZE EXCITATIE ZAL GEBEUREN WANNEER EEN BAND PASS FILTER MET EXCITATIEGOLFLENGTE 546 nm ± 6 nm WORDT GEBRUIKT. HET ZELFDE GELDT VOOR DE EMISSIEFILTER. Fluorescent label Filterset SpectrumOrange SpectrumGreen DAPI 20 38 49 Excitatie-en emissiegolflengte van fluorochroom (nm) Excitatie Emissie 538/10 575/15 480/15 535/15 358 463 Excitatie-en emissiegolflengte van gebruikte filterset (nm) Excitatie Emissie 546/12 575-640 470/40 525/50 365 445/50 3.5.2 Materialen Fluorescentielamp X-cite (Carl Zeiss, München, Duitsland). Fluorescentiemicroscoop Axiovert 200M® (Carl Zeiss, München, Duitsland). 23 3.5.3 Methode De detectie van de mannelijke cellen in een overmaat van maternale cellen aan de hand van SpectrumGreen CEP-Y-probe, is een arbeidsintensief en tijdrovend proces. Omwille van deze reden werd een script ontwikkeld voor de automatische detectie van het Y-chromosoom specifieke FISH-signaal. Dit kan aan de hand van de software bijgeleverd bij de fluoresentiemicroscoop (Zeiss AxioVision). De AxionVision bestaat uit verschillende modules voor beeldacquisitie en beeldanalyse. Met de module MosaiX kan automatische beeldacquisitie van een volledig draagglaasje uitgevoerd worden en met de module Commander kan een script ontwikkeld worden voor de automatische detectie van cellen met specifieke eigenschappen. Met de module Mark & Find kunnen draagglaasjes automatisch ingescand worden zodat de beeldacquisitie overnacht kan uitgevoerd worden. Bij het inscannen worden 558 beelden gemaakt (21 R x 28 K), waarbij de beelden automatisch opgeslagen worden in drie verschillende kanalen, namelijk het blauwe DAPI-kanaal voor de kernkleuring, het groene FITC- kanaal voor de Y-probe en het rode CY3-kanaal voor de Xprobe. De belichtingstijden bedragen respectievelijk 400 milliseconden, 1500 milliseconden en 800 milliseconden. De bedoeling van het automatisch script is de detectie van een groen FISH signaal in een blauwe kernkleuring. Daarom moeten de beelden, opgenomen in het groene kanaal, terug samengevoegd worden met de beelden opgenomen in het blauwe kanaal. Dit kan gebeuren door een voor ons ontwikkeld tiff-conversie programma. Deze samengestelde beelden worden vervolgens gebruikt voor de automatische detectie van mannelijke cellen. Hetzelfde wordt gedaan voor de beelden opgenomen in het rode en in het blauwe kanaal, wat nodig is voor visuele controle achteraf. Cellen met een groen signaal, afkomstig van de Y-probe, en een rood signaal, afkomstig van de X-probe, zullen zeer waarschijnlijk mannelijke cellen zijn. Cellen met 2 rode signalen zijn dan zeer waarschijnlijk vrouwelijke cellen. De automatische detectie stelt ons in staat om op een snelle en accurate manier cellen met een Y-FISH signaal te detecteren. De opbouw van het automatisch script wordt weergegeven in Figuur 3.7. 24 FIGUUR 3.7.: OPBOUW VAN HET SCRIPT VOOR DE AUTOMATISCHE DETECTIE VAN MANNELIJKE FOETALE CELLEN IN EEN POPULATIE MATERNALE CELLEN (vergroting 20x SD en oculair 10x). In de eerste stap wordt het groen-blauwe samengestelde beeld gesplitst (Figuur 3.7.A) met het commando „Create Image Subset‟ in twee beelden, een blauw voor de visualisatie van de celkernen (Figuur 3.7.B) en een groen beeld met de Y-FISH-signalen (Figuur 3.7.C). Dit is nodig zodat verschillende softwarematige beeldverwerkingstappen op de afzonderlijke beelden kunnen uitgevoerd worden. Op het blauwe beeld wordt een segmentatie uitgevoerd met het commando „Treshold Interactive‟. Deze segmentatie is gebaseerd op een gedefinieerde range van helderheid voor de te segmenteren regio‟s. Pixels binnen deze grijswaarde range worden op een maximale grijswaarde 1 (wit) gezet, terwijl pixels buiten deze range gelegen, op een grijswaarde 0 (zwart) worden gezet. Voor deze range zijn er geen wel gedefinieerde waarden omdat de DAPI-kleuringen niet altijd even intens zijn. De treshold wordt berekend aan de hand van een aantal willekeurige beelden. Meestal ligt de treshold tussen 30 en 60 grijswaarden. De range die dan vervolgens zal geselecteerd worden is tussen de 30/60 en 255 grijswaarden. Het resulterende beeld is een binair beeld dat de celkernen van individuele cellen toont (Figuur 3.7.D). In een volgende stap wordt het commando „Scrap‟ toegepast om signalen die niet afkomstig kunnen zijn van een intacte celkern te elimineren (Figuur 3.7.E). Op bovenstaande 25 figuur is dit echter niet te zien omdat in de geselecteerde regio enkel 4 cellen zichtbaar zijn van de hele cytospin. Regio‟s kleiner dan 175 pixels worden dan verwijderd. Het gaat hier bijvoorbeeld over celdebris of stofpartikeltjes. Vervolgens wordt het commando „Close‟ toegepast waarbij de originele grootte van de regio‟s behouden blijft en de regio binnen de celcontouren wordt opgevuld (Figuur 3.7.F). Omdat FISH-signalen vaak aan de rand van een cel gelegen zijn, worden de regio‟s van de celkernen met 1 pixel uitgebreid in alle richtingen met het commando „Dilate‟ (Figuur 3.7.G). Op het groene beeld wordt in eerste instantie het commando „Dynamic Treshold‟ toegepast waarbij eerst een „low pass filter‟ wordt toegepast om de achtergrondfluorescentie te selecteren. Het hieruit resulterende beeld wordt afgetrokken van het originele beeld, wat een vermindering van de achtergrond maar niet van het specifieke FISH-signaal tot gevolg heeft. Deze segmentatie resulteert eveneens in een binair beeld (Figuur 3.7.H). Vervolgens worden signalen die niet afkomstig kunnen zijn van een FISH-signaal verwijderd met het commando „Scrap‟ (Figuur 3.7.I). Regio‟s met een grootte tussen de 10 en de 65 pixels worden behouden. De resulterende binaire beelden met de posities van de celkernen (Figuur 3.7.G) en de posities van de groene fluorescente signalen (Figuur 3.7.I) worden vervolgens gemaskeerd en enkel de Y-FISH-signalen die gelegen zijn in een celkern worden behouden (Figuur 3.7.J). In een laatste stap worden regio‟s die voldoen aan bepaalde eisen met betrekking tot hun minimale en maximale pixeldensiteit, oppervlakte en standaarddeviatie van hun pixeldensiteit, omlijnd en genummerd (Figuur 3.7.K). De oppervlakte van het FISH-signaal moet hierbij tussen 0,52 µm2 en 13 µm2 gelegen zijn. Voor de minimum en maximum pixeldensiteit worden enkel de ondergrenzen vastgelegd. Regio‟s met een waarde hoger dan 5 en 6 pixels respectievelijk, blijven geselecteerd. De ondergrens voor de standaarddeviatie van de densiteit wordt ingesteld op 0,31. Na het runnen van het script op alle opgenomen beelden, worden de coördinaten van de gedetecteerde regio‟s weergegeven in een lijst zodat deze nadien gemakkelijk teruggevonden kunnen worden op het draagglaasje voor visuele controle (Figuur 3.7.L). Vervolgens kunnen deze cellen ook geïsoleerd worden en aangewend worden voor verdere karakterisatie. 26 3.6 LASER PRESSURE CATAPULTING (LPC) 3.6.1 Principe De PALM-microlaser bestaat uit een fluorescentie-unit en microlasertechnologie. Laser Pressure Catapulting (LPC) is een methode voor de isolatie van individuele cellen zonder gevaar op contaminatie. Licht, afkomstig van een stikstof UV-A laser (golflengte 355 nm) wordt gefocust op een spot van enkele nanometers waardoor een hoge fotondensiteit verkregen wordt. Deze fotonen gaan interageren met de interatomaire bindingen. Als de energie van de fotonen hoger is dan de energie van de interatomaire binding wordt de binding verbroken en ontstaat er debris en moleculen in de gasfase. De focus van de laser wordt echter geplaatst onder de cel waardoor de cel omhoog gekatapulteerd wordt door de daaronder ontstane gasfase (Burgemeister, 2005; Stich et al, 2003). FIGUUR 3.8.: PRINCIPE VAN LASER PRESSURE CATAPULTING (LPC) (www.zeiss.de). Er zijn verschillende voordelen aan deze techniek. De cellen worden niet beschadigd en er is geen mechanisch contact omdat enkel gefocusseerd licht wordt gebruikt voor het transporteren van het geselecteerde gebied. Bovendien ontstaat er geen warmte ter hoogte van de cellen omdat alles zeer snel gebeurt. Tenslotte ligt de golflengte van het laserlicht ver van de absorptiemaxima van DNA, RNA en proteïnen waardoor deze laatste niet beschadigd worden (Burgemeister, 2005; Stich et al, 2003). Door de cellen rechtstreeks te katapulteren in het deksel van een epje waar DNAextractiebuffer aanwezig is, kan DNA-extractie onmiddellijk na het collecteren worden uitgevoerd. 27 3.6.2 Materialen PALM MicroBeam System (Microlaser Technologies, Bernried, Duitsland). 0,2 ml microtube (Westburg, Leusden, Nederland). PicoPure DNA extraction kit (Arcturus, Mountain View, VS). 3.6.3 Methode Was het dekglaasje en het mounting medium weg met behulp van Milli-Q water. Breng 20 µl DNA-extractiebuffer in het deksel van een 0,2 ml microtube. Breng het deksel van de microtube op een kleine afstand (maximum 0,5 cm) boven het draagglaasje. Pas de parameters met betrekking tot energie en focus van de laser aan. Katapulteer de cellen. 3.7 DNA-EXTRACTIE 3.7.1 Principe De PicoPure® DNA extractie kit is een in situ methode die de extractie van DNA van cellen toelaat. De extractie kit bevat een extractiebuffer, die bestaat uit oxyethyleen sorbitan monolauraat (Tween® 20), proteïnase K en natriumchloride (NaCl). Tween 20 is een anionisch detergent dat gebruikt wordt voor cellyse door disruptie van de lipiden membranen. Het zorgt ook voor het oplossen van membraanproteïnen. Proteïnase K is een serine endopeptidase en het hydrolyseert zowel natieve en gedenatureerde proteïnen, glycoproteïnen, peptiden en aminozuuresters. Het inactiveert ook endogene nucleasen zoals DNasen en RNasen. Proteïnase K werkt optimaal bij 65°C. Denaturatie van het enzym vindt plaats bij temperaturen boven 65°C. 3.7.2 Materialen PicoPure DNA extraction kit (Arcturus, Mountain View, VS). 3.7.3 Methode Maak de DNA-extractiebuffer door 155 µl extractiebuffer toe te voegen aan een vial dat gelyofiliseerd proteïnase K bevat. 28 Katapulteer de cellen met behulp van LPC in een deksel van een 0,2 ml microtube dat gevuld is met 20 µl DNA-extractiebuffer. Centrifugeer de cellen en incubeer gedurende 3 uur bij 65°C. Inactiveer het proteïnase K gedurende 10 minuten op 95°C. 3.8 Y-STR MULTIPLEX PCR 3.8.1 Principe Door analyse van zeer heterozygote loci, zoals Short Tandem Repeats (STRs) van het Y-chromosoom krijgt men extra bevestiging dat de mannelijke cellen die gedetecteerd werden met FISH, werkelijk mannelijke cellen zijn. STRs zijn herhaalde, opeenvolgende, korte stukjes (2-6 basenparen) DNA, die verspreid voorkomen over het menselijk genoom. Ze zijn zeer polymorf, dit wil zeggen dat ze een sterke variabiliteit in een populatie vertonen. Het aantal repeats (en bijgevolg ook de totale lengte) verschilt van persoon tot persoon. Deze STRs zijn gelegen in het niet-coderend gedeelte van het DNA. Er kan dus geen enkel fenotypisch kenmerk gehaald worden uit de DNA-analyse. Y-STR zijn de STRs die gevonden worden op het Y-chromosoom. Omwille van het feit dat deze STRs korte fragmenten zijn, kan me deze amplificeren met behulp van PCR. PCR is een in vitro DNA-replicatie techniek waarbij een bepaald deel van het DNA exponentieel vermenigvuldigd wordt zodat er een voldoende grote hoeveelheid bekomen wordt om deze te kunnen detecteren. Het gebruikte reactiemengsel bestaat uit DNA, Taq polymerase, oligonucleotide primerparen (telkens een forward -en een backward primer) en de 4 deoxynucleotide precursoren (deoxyribonucleotide triphosphate (dNTPs)), MgCl2 en een PCR-buffer. PCR bestaat uit 3 stappen. In de eerste stap wordt het DNA gedenatureerd gedurende 5 minuten bij 95°C, waarbij door verbreken van de waterstofbruggen DNA enkelstrengig wordt. Deze enkelvoudige strengen fungeren als template voor de primers en het DNA-polymerase. Het mengsel wordt dan afgekoeld tot 58 °C zodat de oligonucleotide primers kunnen hybridiseren (annealing). Nadien wordt de temperatuur verhoogd tot ongeveer 72°C, wat de optimale temperatuur is voor het warmtestabiele Taq DNA-polymerase. Nadat de primer waterstofbruggen heeft gevormd met de template streng, kan het DNA-polymerase een kopij 29 maken van de template streng door het inbouwen van complementaire nucleotiden (elongatie). Deze temperatuur wordt gedurende 1-2 minuten aangehouden zodat de DNAsynthese kan doorgaan. Op het einde van deze stap wordt de temperatuur opnieuw verhoogd tot 95°C, maar nu enkel voor 20 seconden, zodat de korte stukjes dubbelstrengig DNA weer gedenatureerd worden, waarna het gehele proces opnieuw kan starten. Meestal worden in een PCR reactie 30 tot 60 cycli doorlopen. De detectie gebeurt aan de hand van capillaire gelelektroforese met laserfluorescente detectie. Het uitvoeren van een capillaire gelelektroforese gebeurt aan de hand van de ABI 3100 Genetic Analyzer. Met behulp van dit toestel kunnen de geamplificeerde Y-STR fragmenten gescheiden worden op basis van hun lengte en fluorescente merker. De geamplificeerde DNA-fragmenten, na voorafgaande denaturatie, worden elektrokinetisch geïnjecteerd. Hierdoor wordt het negatief geladen DNA in een zeer fijn capillair getrokken. Na deze injectie zal het DNA onder invloed van een potentiaalverschil migreren naar de anode (positief geladen) doorheen het capillair dat gevuld is met een denaturerend polymeer nl. Perfomance Optimized Polymeer (POP-4). Om het DNA gedenatureerd te houden, wordt het capillair gedurende de run op 60°C gehouden. Tijdens de passage doorheen het capillair gaan de kortere fragmenten minder weerstand ondervinden waardoor ze sneller migreren naar de anode dan de langere. Op het einde van het capillair is een venster aanwezig, waar de fluoroscente labels die aan de forward primers bevestigd zijn, worden geëxciteerd door de laser. Bij terugval naar hun grondtoestand zenden ze fluorescent licht uit welke na de passage door een prisma gedetecteerd kan worden op een CCD camera. Via multigolflengte detectie kunnen meerdere fluorescente labels tegelijkertijd gebruikt worden. Bij elk staal wordt een interne standaard meegenomen om de lengte van het geamplificeerde fragment te berekenen. Bij deze Y-STR multiplex PCR worden haplotypes gegenereert voor volgende Y-STR loci: DYS 19, DYS 385 a/b, DYS 389 I/II, DYS 390, DYS 391, DYS 392, DYS 393, DYS 437, DYS 438 en DYS 439. 3.8.2 Materialen PowerPlex® Y System bestaat uit Gold STAR 10x buffer en Powerplex® Y 10x Primer Pair Mix (Promega Corporation, Madison, WI, VS). Qiagen HotStar Taq DNA polymerase 1000 Units (Qiagen, Venlo, Nederland). 30 GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, Foster City, CA, VS). ABI 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, VS). 10 x Genescan buffer (Applied Biosystems, Foster City, CA, VS). Formamide (Sigma, St. Louis, VS). POP-4 (Applied Biosystems, Foster City, CA, VS). 3.8.3 Methode Bereid de PCR mix. TABEL 3.2.: PRODUCTEN VOOR MULTIPLEX PCR VOOR 15 STALEN. Hoeveelheid per staal (µl) Totale hoeveelheid (µl) voor 15 stalen GOLD STAR 10x buffer 2,5 37,5 PIMER PAIR MIX 2,5 37,5 HotStar Taq DNA polymerase 0,55 8,25 Reagens Vul elk epje van 0,5 ml met 5µl PCR mix en 20 µl DNA-extract. Plaats de PCR-epjes in het PCR-toestel. Laad het hieronder weergegeven programma: − Activatie HotStar Taq DNA polymerase gedurende 15 minuten bij 95°C. − 96°C voor 1 minuut. − 10 cycli: 94°C-30 seconden. 60°C-30 seconden. 70°C-45 seconden. − 22 cycli: 90°C-30 seconden. 58°C-30 seconden. 70°C-45 seconden. − 60°C voor 30 minuten. − Bij eindigen van de cycli wordt de temperatuur op 4°C gehouden. Bewaar de PCR producten bij -20°C indien ze niet onmiddellijk worden geanalyseerd. Maak een mix van formamide en de interne standaard (IS). Deze mix bestaat uit 9 µl IS en 216 µl formamide. Pipetteer in elke well 12 µl van de formamide/IS mix en 1 µl PCR product. Denatureer gedurende 10 seconden in kokend water. Voer de analyse uit met behulp van de ABI 3100 Genetic Analyzer. 31 3.9 CELSCHEIDING MET BEHULP VAN EASYSEP TER KARAKTERISTATIE VAN DE FOETALE CELLEN 3.9.1 Principe EasySep® is een kolom vrije immunomagnetische cel selectie methode die gebruik maakt van specifieke antilichamen (tetrameer antilichaam complex (TAC)) en kleine magnetische nanopartikels in een kolomvrij magnetisch systeem. Deze bispecifieke TACs herkennen zowel dextraan op het magnetisch nanopartikel als het specifieke celoppervlakte antigen en zorgen voor de selectie of depletie van cellen. De gelabelde cellen worden dan gecrosslinkt aan de EasySep® magnetische nanopartikels in een standaard flow tube. De tube wordt vervolgens in de EasySep® magneet geplaatst. De magneet genereert een hoog gradiënt magnetisch veld dat sterk genoeg is om de cellen die gebonden zijn met de specifieke TACnanopartikel complexen te scheiden van de niet-gelabelde cellen. FIGUUR 3.9.: MAGNETISCHE LABELING VAN CELLEN (www.stemcell.com). Aangezien gewerkt wordt met negatieve selectie, worden de gewenste cellen niet gebonden door de magnetische nanopartikels en worden ze, terwijl de tube zich nog in de magneet bevindt, overgebracht in een nieuwe flow tube. Zowel B- als T-cellen kunnen via negatieve selectie geïsoleerd worden uit het mengsel met behulp van de “EasySep negative solution Human B/T cell environment cocktail” en de nanopartikels. 32 3.9.2 Materialen Fetal Bovine Serum (FBS) (Invitrogen, Paisley, VK ). EasySep® Human T Cell Enrichment Kit (Stemcell Technologies, Vancouver, BC, Canada). EasySep® Human B Cell Enrichment Kit (Stemcell Technologies, Vancouver, BC, Canada). 3.9.3 Methode Voeg 50 µl cocktail per 1 ml celsuspensie toe en resuspendeer. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Voeg de nanopartikels (50 µl/ml celsuspensie) toe door krachtig te resuspenderen. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Leng aan tot 2,5 ml met behulp van PBS/ 2% FBS. Plaats de tube in de magneet voor ongeveer 5 minuten. Draai de tube om in een vloeiende beweging en vang het supernatans op in een nieuwe tube. Plaats de nieuwe tube opnieuw 5 minuten in de magneet om een hogere zuiverheid te bekomen. 33 4 RESULTATEN EN DISCUSSIE 4.1 FLUORESCENTIE IN SITU HYBRIDISATIE (FISH) De opgezuiverde mononucleaire cellen worden gecentrifugeerd op een draagglaasje waarop vervolgens FISH wordt uitgevoerd met fluorescent gelabeld X- en Y- chromosoom specifieke DNA probes. Na het uitvoeren van het FISH protocol kunnen de mannelijke cellen automatisch gedetecteerd worden met de fluorescentiemicroscoop. Mannelijke cellen zijn herkenbaar aan de gekleurde spots in de kern die blauw aangekleurd is door DAPI. Het groene signaal is afkomstig van de SpectrumGreen-fluorescent gelabelde Y-probe en het rode signaal is afkomstig van de SpectrumOrange-fluorescent gelabelde X-probe. Figuur 4.1. geeft het beeld weer na het uitvoeren van het FISH protocol (puntje 3.4.3) op een bloedstaal van een patiënte met de ziekte van Hashimoto waarbij rechts bovenaan hoogstwaarschijnlijk een mannelijke cel te zien is. FIGUUR 4.1.: RESULTAAT NA FISH OP EEN BLOEDSTAAL VAN EEN PATIËNTE MET HASHIMOTO. (Alle beelden werden met dezelfde vergroting, 20x SD en oculair 10x, opgenomen). Als het Y-chromosoom gebruikt wordt als parameter voor foetale microchimerie, is kennis betreffende de zwangerschaphistoriek belangrijk. Omdat bloedtransfusies of orgaantransplantaties een alternatieve bron voor chimerisme kunnen zijn, is het ook belangrijk de voorgeschiedenis in verband met transfusies of transplantaties te kennen (Tabel 4.1. en Tabel 4.2.). Bloed van patiëntes met de ziekte van Hashimoto en de ziekte van Graves, die zwanger geweest zijn van minstens één zoon, werden geselecteerd en vergeleken met een cohorte gezonde vrouwen die eveneens één of meerdere zonen gebaard hebben. 34 TABEL 4.1.: ZWANGERSCHAPGESCHIEDENIS VAN DE PATIËNTES. * DATA VAN DE MISKRAMEN ZIJN NIET GEKEND. Patiënt Interval tussen Aantal Datum laatste Aantal Bloedtransfusie/ staalafname en laatste Miskraam zwangerschappen bevalling zoon zonen transplantatie bevalling zoon 1 1 04/02/2009 1 10 maanden 0 x 2 2 27/12/2007 2 2 jaar 2001 x 3 2 03/01/2006 1 4 jaar en 4 maanden Juni 2005 x 4 2 08/08/2008 1 1 jaar en 5 maanden 3* x 5 6 1 1 dec/2007 28/08/2009 1 1 2 jaar en 2 maanden 8 maanden 0 0 1 x Diagnose Hashimoto of postpartum thyroiditis Graves of hyperthyoïdie Hashimoto Silentieuze thyroïditis Graves Hashimoto Schildklieraandoening/ AID in de familie x Tante: versnelde werking schildklier Schildklieraandoening, niet gekend Tante met schildklierprobleem x x TABEL 4.2.: ZWANGERSCHAPGESCHIEDENIS VAN DE CONTROLES MET ZOON. * HUIDIGE ZWANGERSCHAP WAARBIJ GESLACHT NOG NIET GEKEND WAS OP MOMENT VAN BLOEDAFNAME. Controle Aantal Datum laatste met zoon zwangerschappen bevalling zoon 35 Aantal zonen Interval tussen staalafname en laatste bevalling zoon Miskraam Bloedtransfusie/ transplantatie Schildklieraandoening/AID in de familie x 1 1* 26/06/2007 1* 2 jaar en 8 maanden Augustus 2009 x 2 2 18/02/2005 2 5 jaar 0 x 3 4 5 2 2 1 30/07/2008 10/06/2007 31/10/2005 2 2 1 1 jaar en 7 maanden 2 jaar en 9 maanden 4 jaar en 4 maanden x 1 x 6 2 26/06/2007 1 2 jaar en 9 maanden 7 2 09/08/2007 1 2 jaar en 7 maanden 0 0 0 November 2008 0 x x Zelf: vergrote schildklier Grootvader: verwijdering schildklier wegens goedaardige gezwellen x Zus: waarschijnlijk Graves x Grootvader: auto-immuun longaandoening x Na het automatisch screenen van de slides op de aanwezigheid van mannelijke cellen kunnen de positieve signalen, na relocatie, gemakkelijk visueel gecontroleerd worden op vals positieve signalen. Cellen waarbij, naast een groen signaal, eveneens twee rode signalen gezien werden, werden uitgesloten als zijnde mannelijke cellen. In dat geval was het groene signaal hoogst waarschijnlijk afkomstig van celdebris of stof. Omdat er bij de visuele controle dikwijls cellen gezien werden waarover twijfels bestonden of het al dan niet mannelijke cellen waren, werden eveneens controles meegenomen die nooit zwanger zijn geweest. Bij beide controles werd er op de 1 miljoen vrouwelijke cellen één artefact aangetroffen waarbij 1 groen signaal en 1 rood signaal in de cel aanwezig waren. Op het eerste gezicht zouden deze als mannelijke cellen gequoteerd worden. Een mogelijke verklaring zou kunnen zijn dat beide X-chromosomen op elkaar lagen en dus niet van elkaar te onderscheiden zijn. Het groene signaal kan dan afkomstig zijn van celdebris of stof. Bovendien wordt in afwezigheid van een groen signaal ook vaak een cel gezien met maar één duidelijk rood signaal en een heel zwak tweede rode signaal, waaruit kan afgeleid worden dat de hybridisatie voor dit chromosoom heel zwak was. Dit in rekening houdende, kunnen we er van uit gaan dat we rekening moeten houden met één mogelijk artefact per 1 000 000 cellen. TABEL 4.3.: PATIËNTEN EN CONTROLES EN HET AANTAL MANNELIJKE CELLEN PER ÉÉN MILJOEN MATERNALE CELLEN. Patiëntes 1 2 3 4 5 6 Controles met zoon 1 2 3 4 5 6 7 Controles zonder zoon 1 2 Aantal mannelijke cellen per 1 miljoen maternale cellen 27 44 26 16 35 10 7 7 5 8 2 4 12 1 1 36 Mannelijke cellen werden zowel gevonden in patiëntes met de ziekte van Hashimoto en Graves als in gezonde vrouwen die ten minste één zoon gebaard hebben (Tabel 4.3.). In de onderstaande tabel worden de gemiddelden, standaarddeviaties, mediaan, interkwartielafstanden, minimum en maximumwaarden weergegeven voor zowel de patiëntes als de controles. TABEL 4.4.: BESCHRIJVENDE TABEL. SD = STANDAARDDEVIATIE, IQR = INTERKWARTIELAFSTAND Groep Aantal Gemiddelde SD Mediaan IQR Minimum Maximum Patiëntes 6 26,33 12,34 26,5 23 10 44 Controles met zoon 7 6,43 3,206 7 4 2 12 FIGUUR 4.2.: BOXPLOTS VAN HET AANTAL MANNELIJKE CELLEN PER MILJOEN MATERNALE CELLEN GEDETECTEERD WAARBIJ VOOR DE PATIËNTES EN DE CONTROLES MET ZOON DE SPREIDING EN DE MEDIAAN TE BEOORDELEN IS. Uit tabel 4.4. en de boxplots (Figuur 4.2.) kunnen we vaststellen dat er meer mannelijke cellen werden gedetecteerd bij de patiëntes dan bij de controles met zoon. De boxplots suggereren dat de verdeling van het aantal mannelijke cellen vrij symmetrisch is in beide groepen en dat de controles met zoon minder spreiding vertonen dan de patiëntes. Omwille van de kleine aantallen per groep kunnen we niet zomaar op het zicht vaststellen of deze verschillen beduidend zijn, dan wel toevaltreffers. Er kan een niet-parametrische test uitgevoerd worden om dit na te gaan. Hiervoor wordt de Mann-Whitney test gebruikt waarbij de nulhypothese stelt dat er geen verschil is tussen de mediaan van de patiëntes en de mediaan van de controles zonder zoon en waarbij de alternatieve hypothese stelt dat hierbij wel een 37 verschil is. Uit deze test blijkt dat er een statistisch significant verschil is in aantal mannelijke cellen tussen de patiëntes met een auto-immune schildklieraandoening en de gezonde vrouwen op het 5% significantieniveau (p= 0,002) (Tabel 4.5.). TABEL 4.5.: MANN-WHITNEY TEST TUSSEN HET AANTAL MANNELIJKE CELLEN PER MILJOEN MATERNALE CELLEN GEDETECTEERD BIJ DE PATIËNTES EN DE CONTROLES MET ZOON. b Test Statistics cellen Mann-Whitney U 1,000 Wilcoxon W 29,000 Z -2,861 Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] ,004 ,002 a a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: groep Patiëntes 2 en 5 hebben meer mannelijke cellen in vergelijking tot de rest van de patiëntes. Dit zou verklaard kunnen worden door het feit dat patiënte 2 een miskraam gehad heeft en patiënte 5 een bloedtransfusie ontvangen heeft tijdens een operatie wat ook, zoals reeds vermeld, een bron van microchimerie kan zijn. Bij patiënte 4 zouden we echter een groter aantal mannelijke cellen verwachten omdat deze patiënte reeds 3 miskramen gehad heeft. Aangezien het geslacht van de foetussen niet gekend was is er sterk vermoeden dat het om vrouwelijke foetussen ging en dat dus de vrouwelijke foetale cellen niet gedetecteerd werden. Vermoedelijk is dit aantal zeer hoog, maar omwille van het feit dat er nog geen unieke foetale merker gekend is, kunnen we deze hypothese nog niet testen. Na het vergelijken van het aantal mannelijke cellen met de zwangerschaphistoriek van de patiëntes kan er vastgesteld worden dat het aantal mannelijke cellen onafhankelijk is van het aantal zwangerschappen (vrouwelijke en mannelijke). Dit werd reeds aangetoond door Klintschar et al. (2001 & 2006). 4.2 LASER PRESSURE CATAPULTING (LPC), DNA-EXTRACTIE, AMPLIFICATIE EN STR-ANALYSE De mannelijke cellen die gedetecteerd werden aan de hand van FISH kunnen ter bevestiging onderworpen worden aan Y-STR-analyse. Hierbij worden de mannelijke cellen 38 geïsoleerd met behulp van LPC waarna DNA-extractie volgt. Aan de hand van Y-STR PCR kan de mannelijke oorsprong van de automatisch gedetecteerde cellen bevestigd worden. Van een 1% mannelijk staal werden 10 mannelijke cellen geïsoleerd met behulp van LPC. Op deze geïsoleerde cellen werd DNA-extractie, amplificatie van Y-STRs en analyse van deze Y-STRs, uitgevoerd. De amplificatie van een bepaalde locus levert een piek op in het profiel. Het gebruik van multiplex PCR voor 12 loci levert maximaal 12 allelen op voor mannelijke cellen van één persoon. Onderstaande figuur (Figuur 4.3.) illustreert het DNA-profiel na analyse van de 10 mannelijke geïsoleerde cellen. FIGUUR 4.3.: Y-STR VAN 10 CELLEN NA FISH ZONDER KLEURING. Als je kijkt naar de piekhoogtes van het bovenstaande DNA-profiel is er slechts een zwakke amplificatie van de allelen gebeurt. Doordat tijdens het FISH protocol gefixeerd werd met Carnoy en verschillende ethanolreeksen werden aangewend, konden deze cellen heel moeilijk verwijderd worden van het draagglaasje. Daardoor werden de cellen in kleine stukjes gekatapulteerd in het epje, waardoor ook het DNA kan gefragmenteerd worden en de gewenste loci niet geamplificeerd kunnen worden. Er is echter geen amplificatie te zien wanneer slechts één mannelijke cel geïsoleerd werd (figuur niet weergegeven). Aangezien het de bedoeling is om van elke individuele gedetecteerde cel de mannelijke oorsprong na te gaan, is het belangrijk om op „single cell‟ niveau te kunnen werken. Daarom werd naar een manier gezocht om de cellen gemakkelijker van het draagglaasje te katapulteren, zodanig dat de cel met één enkele laserpuls kan verwijderd worden. Kleuring met Cresyl Violet verhoogt de laser efficiëntie waardoor de cellen makkelijker van het draagglaasje kunnen verwijderd worden. In Figuur 4.4 wordt het DNA-profiel weergegeven na LPC van 10 mannelijke cellen die gekleurd zijn met Cresyl Violet. 39 FIGUUR 4.4.: Y-STR VAN 10 CELLEN NA FISH MET KLEURING. Er is echter geen amplificatie van de allelen. Hieruit kan besloten worden dat Cresyl Violet een negatief effect heeft op het DNA. Ook kleuring met Methyleenblauw en Hematoxyline vertoonden hetzelfde probleem (data niet weergegeven). Aangezien het verifiëren van de mannelijke identiteit bij de patiëntenstalen telkens op één cel zal gebeuren, kan deze methode niet gebruikt worden om de identiteit van ieder automatisch gedetecteerde mannelijke cel na te gaan. Omwille van deze problemen werd er gezocht naar een andere methode om toch bevestiging te krijgen voor de gedetecteerde mannelijke cellen. Deze methode bestaat uit het toepassen van FISH met een extra probe. Hierbij werd een FISH-protocol opgesteld dat gebruik maakt van een mix van SpectrumGreen gelabelde CEP-Y-probe, gericht tegen de satelliet III regio van het Y-chromosoom, van SpectrumOrange gelabelde X-chromosoom, gericht tegen de alfa satelliet centromere regio van het X-chromosoom en van het Spectrum Aqua CEP-Y-probe, eveneens gericht tegen de satelliet III regio van het Y-chromosoom. Tabel 4.6. illustreert de excitatie -en emissiegolflengte en filterset van het SpectrumAqua. In het verdere onderzoek zal er een script ontwikkeld worden zodat enkel de cellen die een groen en licht blauw fluorescent signaal bevatten, afkomstig van respectievelijk de SpectrumGreen en SpectrumAqua gelabelde Y-probes, liggende in een celkern gedetecteerd worden. TABEL 4.6.: EXCITATIE- EN EMISSIEGOLFLENGTEN EN FILTERSETS VAN DE FLUORESCENTE LABELS. Fluorescent label Filterset SpectrumAqua 47 Excitatie-en emissiegolflengte van fluorochroom (nm) Excitatie Emissie 433 480 Excitatie-en emissiegolflengte van gebruikte filterset (nm) Excitatie Emissie 436/20 480/40 40 4.3 CELSCHEIDING MET BEHULP VAN EASYSEP TER KARAKTERISTATIE VAN DE FOETALE CELLEN Omdat er een verschil gezien wordt in het aantal foetale cellen tussen patiëntes en controles, is het ook belangrijk om te bepalen tot welk(e) celtype(s) deze foetale cellen behoren om hun mogelijke rol in het ontstaan van een auto-immune schildklieraandoening op te helderen. Daarvoor moeten deze cellen gekarakteriseerd worden. Dit zou kunnen gebeuren aan de hand van fluorescent gelabelde monoklonale antilichamen. Om deze karakterisatie echter te vereenvoudigen, wordt de totale mononucleaire celfractie eerst gesplitst in een aantal celtypes. Ter optimalisatie van de methode, werden eerst de T- en de B-celfracties beoordeeld op de aanwezigheid van foetale cellen omwille van het feit dat in de literatuur aanwijzingen te vinden zijn dat in andere auto-immune aandoeningen, zoals sclerodermie, de foetale cellen tot deze celtypes behoren (Evans et al., 1999). Deze celfracties kunnen bekomen worden met EasySep®. De mononucleaire celfractie bestaat uit lymfocyten en monocyten. De lymfocyten bestaan uit ongeveer 75% T-cellen en 25% B -en NK-cellen. Als de foetale cellen tot 1 van deze celtypes zouden behoren, dan zou men verwachten dat het totaal aantal foetale cellen teruggevonden in de mononucleaire fractie, teruggevonden wordt in één van deze populaties. Omwille van de verdeling van de T- en B-cellen in de mononucleaire cellen, werden 250 000 B-cellen (25% van 1 000 000 cellen) en 750 000 T-cellen (75% van 1 000 000 cellen) onderworpen aan FISH. Op het bloedstaal van patiënte 6 werd Ficoll densiteitscentrifugatie toegepast gevolgd door B- en T-celscheiding van de mononucleaire fractie aan de hand van EasySep®. Een deel van de B- en T-celfractie werd gebruikt om de zuiverheid van de B- en T-cellen na te gaan. Hierbij werden de B- en T-cellen gelabeld met phycoerythrine (PE)-gelabeld anti-CD19 respectievelijk anti-CD3 antilichaam. Vervolgens werd de zuiverheid nagegaan aan de hand van flowcytometrie. De zuiverheid blijkt respectievelijk 98,7 % en 94,9% te zijn voor de Ten B-cellen (Figuur 4.5.). 41 FIGUUR 4.5.: HISTOGRAMMEN MET HET PERCENTAGE AANGEKLEURDE CELLEN IN DE RESPECTIEVELIJKE T- (CD3) EN B-CELFRACTIES (CD19). Vervolgens werd op 250 000 B-cellen en 750 000 T-cellen het FISH protocol (puntje 3.4.3) toegepast. Bij evaluatie onder de microscoop werd er geen enkele mannelijke cel gedetecteerd per 250 000 B-cellen en werden er in totaal 7 mannelijke cellen waargenomen per 750 000 T-cellen. Bij deze patiënte werden er 10 mannelijke cellen gedetecteerd per 1 miljoen maternale cellen in de totale mononucleaire celfractie. Er werd al eerder aangetoond dat in andere auto-immune aandoeningen, zoals sclerodermie, de foetale cellen konden teruggevonden worden in de T-celfractie en B-celfractie (Evans et al., 1999), waardoor wij ook de hypothese kunnen stellen dat de foetale cellen bij patiënten met een auto-immune schildklieraandoening van het T-celtype zijn en dus een rol kunnen spelen in het ontstaan van de aandoening. Deze resultaten moeten nog geconfirmeerd worden met data van meerdere personen. Bovendien werden er bij sclerodermiepatiëntes significant meer CD4+ T-cellen teruggevonden dan bij de controlegroep. In de CD8+ T-cel populatie waren er ook meer microchimere cellen aanwezig maar deze verschillen waren niet significant (Artlett et al,. 2002). In verdere experimenten zal bijgevolg nagegaan worden tot welk subtype T-cellen deze foetale cellen behoren. 42 5 CONCLUSIE Een eerste doelstelling van deze masterproef was de detectie van foetale microchimere cellen in het bloed van patiëntes met auto-immune schildklieraandoening. Omwille van hun specifieke kenmerken, zoals geslachtsgebonden voorkomen en frequenter optreden postpartum, zijn auto-immune schildklieraandoeningen zeer geschikt om de rol van de foetale microchimere cellen te bestuderen. De detectie van het Y-chromosoom is een bruikbare methode om de aanwezigheid van mannelijke microchimere cellen, afkomstig van een zwangerschap met een mannelijke foetus, te bestuderen. Foetale cellen in het bloed van patiëntes met auto-immune schildklieraandoeningen, die zwanger geweest zijn van minstens één zoon, werden gedetecteerd en werden vergeleken met de foetale cellen in het bloed van een cohorte gezonde vrouwen die eveneens één of meerdere zonen gebaard hebben. Omwille van het lage percentage foetale microchimere cellen werd gebruik gemaakt van een aanrijkingsprocedure, namelijk Ficoll densiteitscentrifugatie. Onderscheid tussen maternale cellen en mannelijke cellen kan gemaakt worden aan de aan de hand van Fluorescentie In Situ Hybridisatie (FISH) met fluorescent gelabelde X- en Ychromosoomspecifieke DNA-probes. Vervolgens konden deze op automatische manier gedetecteerd worden aan de hand van een script. Na het uitvoeren van het FISH-protocol werden er mannelijke cellen gevonden bij zowel de patiëntes als de controles. Er werden significant meer mannelijke cellen aangetroffen bij de patiëntes dan bij de controles (p = 0,002). Als extra controle werden cellen met een Y-FISH signaal geïsoleerd door middel van Laser Pressure Catapulting (LPC) en werd, na DNA extractie, een Polymerase Chain Reaction (PCR) van het Short Tandem Repeat (STRs) op het Y-chromosoom uitgevoerd. Doordat de cellen moeilijk werden geïsoleerd na FISH en kleuring een negatief effect op het DNA bleek te hebben, blijkt deze methode echter niet ideaal om de mannelijke identiteit van de geïsoleerde cellen te bevestigen. In plaats daarvan kan een extra probe, namelijk het Spectrum Aqua gelabelde CEP-Yprobe, aangewend worden in het FISH-protocol. Hierbij zal een script ontwikkeld worden 43 waarbij enkel de cellen met een lichtblauwe en een groene spot, beiden afkomstig na hybridisatie met het Y-chromosoom, als mannelijke cellen beschouwd worden. Een tweede doelstelling van deze thesis was de karakteristatie van de foetale microchimere cellen. Ter karakterisatie werden de cellen, afkomstig uit de opgezuiverde mononucleaire fracties, gescheiden met behulp van EasySep®. Ter optimalisatie van het proces werd de eerste focus gelegd op B- en T-cellen. Op deze cellen werd het FISH-protocol uitgevoerd met fluorescent gelabelde X- en Y-chromosoom specifieke DNA probes. Na de evaluatie onder de microscoop werden 7 mannelijke cellen gedetecteerd per 750 000 T-cellen en werd er geen enkele mannelijke cel waargenomen per 250 000 B-cellen. In de totale mononucleaire fractie werden 10 mannelijke cellen per 1 miljoen maternale cellen gedetecteerd. Hieruit kan de hypothese gesteld worden dat de foetale cellen tot de T-celfractie behoren en dus een rol kunnen hebben in het ontstaan van een auto-immune schildklieraandoening. Deze resultaten moeten nog geconfirmeerd worden met data van meerdere personen. Een uitgebreide karakterisatie zal bepalen welke rol deze cellen juist hebben in het ontstaan ervan. 44 6 LITERATUURLIJST Ando, T.; Davies, T. F. (2003). Postpartum autoimmune thyroid disease: the potential role of fetal microchimerism. J. Clin. Endocr. Metab., 88, 2965-2971. Ando, T.; Davies, T. F. (2004). Self-recognition and the role of fetal microchimerism. Best Pract. Res. Cl. En., 18, 197-211. Ariga, H.; Ohto, H.; Busch, M. P.; Imamura, S.; Watson, R.; Reed, W.; Lee, T. H. (2001). Kinetics of fetal cellular and cell-free DNA in the maternal circulation during and after pregnancy: implications for noninvasive prenatal diagnosis. Transfusion Med., 41, 1524-1529. Bianchi, D. W.; Zickwolf, G. K.; Weil, G. J.; Sylvester, S.; DeMaria, M. A. (1996). Male fetal progenitor cells persist in maternal blood for as long as 27 years postpartum. Proc. Natl. Acad. Sci., 93, 705-708. Bianchi, D. W.; Farina, A.; Weber, W.; Delli-Bovi, L. C.; DeRiso, M.; Williams; J. M.; Klinger, K. W. (2001), Significant fetal-maternal hemorrhage after termination of pregnancy: implications for development of fetal cell microchimerism. Am. J. Obstet. Gynecol., 184, 703706. Burgemeister, R. (2005). New aspects of laser microdissection in research and routine. J. Histochem. Cytochem., 53, 409-412. Davies, T. F. (1999). The thyroid immunology of the postpartum period. Thyroid, 9, 675-684. Dayan, C. M.; Daniels, G. H. (1996). Chronic autoimmune thyroiditis. New Engl. J. Med., 335, 99-107. Fairweather, D.; Rose, N. R. (2004). Women and autoimmune diseases. Emerg. Infect. Dis., 10, 2005-2011. GE Healthcare Bio-sciences AB (2007). Ficoll-Paque PLUS. GE Healthcare Bio-sciences AB, Uppsala, Zweden. GE Healthcare Amersham Biosciences AB (2001). Ficoll-Paque PLUS: For in vitro isolation of lymphocytes. Amersham Biosciences AB, Uppsala, Zweden. 45 Gleicher, N.; Barad, D. H. (2007). Gender as risk for autoimmune diseases. J. Automimmun., 28, 1-6. Imaizumi, M.; Pritsker, A.; Unger, P.; Davies, T.F. (2002). Intrathyroidal fetal microchimerism in pregnancy and postpartum. Endocrinology, 143, 247-253. Janeway, C. A.; Travers, P.; Walport, M.; Shlomchik, M. (2001). Immunobiology. Garland Publishing, New York, VS. Jiang, S. P.; Vacchio, M. S. (1998). Cutting edge: multiple mechanism of peripheral T cell tolerance to the fetal “allograft”. J. Imunnol., 160, 3086-3090. Kaal, S. E. J.; Van Den Hoogen, F. H. J.; De Jong, E. M. G. J.; Viëtor, H. E. (1999). Systemic sclerosis: new insights in autoimmunity. P.S.E.B.M., 222, 1-8. Khosrotehrani, K.; Bianchi, D. W. (2003). Fetal cell microchimerism: helpful or harmful to the parous woman?. Curr. Opin. Obstet. Gyn., 15, 195-199. Klecha, A. J.; Arcos, M. L. B.; Frick, L.; Genaro, A. M.; Cremaschi, G. (2008). Immuneendocrine interactions in autoimmune thyroiditis diseases. Neuroimmunomodulat., 15, 68-75. Klintschar, M.; Schwaiger, P.; Mannweiler, S.; Regauer, S.; Kleiber, M. (2001). Evidence of fetal microchimerism in Hashimoto‟s thyroiditis. J. Clin. Endocr. Metab., 86, 2494-2498. Klintschar, M.; Immel, U.D.; Kehlen, A.; Schwaiger, P.; Mustafa, T.; Mannweiler, S.; Regauer, S.; Kleiber, M.; Hoang-Vu, C. (2006). Fetal microchimerism in Hashimoto‟s thyroiditis: a quantitative approach. Eu. J. Endocrinol., 154, 237-241. Lakowicz, J. R. (2006). Principles of fluorescence spectroscopy. Springer Science + Business Media, New York, VS, Hoofdstuk 1. Lambert, N. C.; Stevens, A. M.; Tylee, T. S.; Erickson, T. D.; Furst, D. E.; Nelson, J. L. (2001). From the simple detection of microchimerism in patients with autoimmune diseases to its implication in pathogenesis. Ann. NY. Acad. Sci., 945, 164-171. Lang, K. S.; Burow, A.; Kurrer, M.; Lang, P. A.; Recher, M. (2007). The role of the innate immune response in autoimmune disease. J. Autoimmun., 29, 206-212. 46 Lapaire, O.; Hösli, I.; Anetti-Daellenbach, R.; Huang, D.; Jaeggi, C.; Gatfield-Mergenthaler, S.; Hahn, S.; Holzgreve, W. (2007). Impact of fetal-maternal microchimerism on women‟s health-a review. J. Matern.-Fetal Neo. M., 20, 1-5. Mathews, C. K.; Van Holde, K. E.; Ahern, K. G. (2000). Biochemistry. Addidon-Wesley Publishing Company, San Francisco, VS. Moter, A.; Göbel, U. B. (2000). Fluorescence in situ hybridization (FISH) for direct visualization of microorganisms. J. Microbiol. Meth., 41, 85-112. Munteanu, L. S.; Dinu, A. (2004). Fractionation of granulocytes from whole human blood by centrifugation. Practical hints. Romanian J. Biophys., 14, 53-58. Nelson, J. L. (1996). Maternal-fetal immunology and autoimmune disease. Is some autoimmune disease auto-alloimmune or allo-autoimmune? Arthretis Reum., 39, 191-194. Nelson, J. L. (2002). Microchimerism: incidental byproduct of pregnancy or active participant in human health? Trends Mol. Med., 8, 109-113. Prummel, M. F.; Strieder, T.; Wiersinga, W. M. (2004). The environment and autoimmune thyroid diseases. Eu. J. Endocrinol., 150, 605-618. Raff, R.; Schwanitz, G. (2001). Fluorescence in situ hybridization general principles and clinical application with special emphasis to interphase diagnostics. Int. J. Hum. Genet., 1, 6575. Renné, C; Lopez, E. R.; Steimle-Grauer, S. A.; Ziolkowski, P.; Pani, M. A.; Luther, C.; Holzer, K.; Encke, A.; Wahl, R. A.; Bechstein, W.O.; Usadel, K. H.; Hansmann, M. L.; Badenhoop, K. (2004). Thyroid fetal male microchimerisms in mothers with thyroid disorders: presence of Y-chromosomal immunofluorescence in thyroid-infiltrating lymphocytes is more prevalent in Hashimoto‟s thyroiditis and Graves‟ disease than in follicular adenomas. J. Clin. Endocrinol. Metab., 89, 5810-5814. Rinkevich, B. (2001). Human natural chimerism: an acquired character or a vestige of evolution? Hum. Immunol., 62, 651-657. Rust, D. W.; Bianchi, D. W. (2009). Microchimerism in endocrine pathology. Endocr. Pathol., 20, 11-16. 47 Speicher, M. R.; Nigel, P. C. (2005). The new cytogenetics: blurring the boundaries with molecular biology. Nat. Rev. Genet., 6, 782-792. Srivatsa, B.; Srivatsa, S.; Johnson, K. L.; Samura, O.; Lee, S. L.; Bianchi, D. W. (2001). Lancet, 358, 2034-2038. Stich, M.; Thalhammer, S.; Burgemeister, R.; Friedemann, G.; Ehnle, S.; Lüthy, C.; Schütze K. (2003). Live cell catapulting and recultivation. Pathol. Res. Pract., 199, 405-409. Takami, H. E.; Miyabe, R.; Kameyama, K. (2008). Hashimoto‟s thyroiditis. World J. Surg., 32, 688-692. Tortora, G. J.; Derrickson, B. (2006). Principles of anatomy and physiology. John Wiley & Sons, VS. Vandewoestyne, M.; Van Hoofstat, D.; Van Nieuwerburgh, F.; Deforce, D. (2009). Suspension fluorescence in situ hybridization (S-FISH) combined with automatic detection and laser microdissection for STR profiling of male cells in male/female mixtures. Int. J. Legal Med., 123, 441-447. Weetman, A. P. (2000). Graves‟ disease. N. Engl. J. Med., 343, 1236-1248. Whitacre, C. C.; Reingold, S. C.; O‟Looney, P. A. (1999). A gender gap in autoimmunity. Science, 283, 1277-1278. http://www.abbottmolecular.com/CEPXSpectrumOrangeYSpectrumGreenDirectLabeledFluor escentDNAProbeKit_5572.aspx (11-02-2010) http://www.dako.be/prod_productrelatedinformation?url=g_hybridizer_index.htm (10-02- 2010) http://www.edumedia-sciences.com/nl/a518-scintigrafie-van-de-schildklier (10-02-2010) http://www.endocrineweb.com (10-02-2010) http://www.files.chem.vt.edu/chem-ed/sep/electrop/cap-el.html (31-03-2010) http://www.genedetect.com/insitu.htm (10-02-2010) http://www.gonda.ucla.edu/bri_core/fluoresc.htm (21-03-2010) 48 http://www.med.upenn.edu/bmcrc/immune/Ficcoll_info.pdf (22-02-2010) http://www.zeiss.de/microdissection (20-03-2010) http://www.nature.com/scitable/topicpage/Fluorescence-In-Situ-Hybridization-FISH-327 (1902-2010) http://www.nikon.com (19-03-2010) http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/microscopy/cellcounting.html (6-03-2010) http://www.stemcell.com/product_catalog/easysep.aspx (23-03-2010) http://www.vectorlabs.com/search.aspx (17-03-2010) http://www.wardelab.com/10-3.html (21-03-2010) 49
