SAMENVATTING

SAMENVATTING
S
233
Samenvatting
Virussen zijn buiten hun gastheercel voornamelijk inerte deeltjes, nauwelijks meer dan
fragmenten genetisch materiaal, ingesloten in een eiwitmantel die soms is verpakt in een
lipide envelop. Na infectie van een geschikte gastheercel echter verschaft de expressie
van hun genoom virussen het opmerkelijke vermogen om de moleculaire machinerie
van de cel in the schakelen bij het produceren van nieuwe virussen. Het effect van virale
replicatie op het metabolisme van de gastheercel kan enorm zijn en leidt vaak tot de dood
van de cel. De volgorde van de voornaamste stappen in de replicatiecyclus van virussen
wordt in de eerste plaats bepaald door het type van het virale genoom. De meerderheid
van de thans bekende virussen bezit een RNA-genoom, dat enkel- of dubbelstrengs kan
zijn en van ‘messenger RNA’ (mRNA) polariteit (plusstrengs) of complementair daaraan
(minstrengs). Plusstrengs RNA-virus genomen worden na hun binnenkomst in het cytoplasma van de geïnfecteerde cel direct vertaald in virale eiwitten. De meeste van deze
eiwitten assembleren tot een membraangebonden RNA-synthetiserend enzymcomplex
dat de virale replicatie aanstuurt. Sleutelfactor in dit proces is een virus-gecodeerd RNAafhankelijk RNA-polymerase (RaRp), waarvan de activiteit vaak wordt ondersteund en
gereguleerd door virusgecodeerde eiwitfactoren. RaRp en accessoire eiwitten worden
gezamenlijk doorgaans “het virale replicase” genoemd. De replicase-onderdelen van
RNA-virussen hebben enzymatische activiteiten en/of niet-enzymatische, regulerende
taken, en zijn vaak ook multifunctioneel, een eigenschap die waarschijnlijk zijn oorsprong vindt in de beperkte coderende capaciteit van RNA-virusgenomen.
Eén van de meest ingewikkelde, tot op heden bekende, RNA-virus replicases behoort
toe aan de virussen in de orde Nidovirales. Deze groep omvat drie ver verwante families
van envelop-bevattende, plusstrengs RNA-virussen – Coronaviridae (subfamilies Coronavirinae en Torovirinae), Arteriviridae, en Roniviridae, die gezamenlijk een scala aan gastheren kunnen infecteren, van ongewervelde dieren tot zoogdieren, inclusief de mens. De
evolutionaire relatie tussen nidovirussen uit zich in vergelijkbare genoomorganisaties en
genexpressie-strategieën, en de veronderstelde gemeenschappelijke afkomst van hun
belangrijkste replicatieve enzymen. De grootte van het nidovirusgenoom varieert van
13 – 16 kb voor Arteriviridae tot 25 – 32 kb voor Coronaviridae en Roniviridae, en daarmee
bezitten de laatstgenoemde twee families de grootste RNA-genomen die momenteel
bekend zijn. Het multidomein replicase is gecodeerd in de twee grote, 5’-gelegen open
leesramen in het nidovirusgenoom, terwijl het 3’-gelegen genoomdeel de genen voor
de virale structurele eiwitten bevat. Vertaling van het 5’-cap-dragende en 3’-gepolyadenyleerde nidovirusgenoom resulteert in twee grote replicase polyproteïnen, pp1a
en pp1ab, waarvan de laatste vertaald wordt na een -1 ribosomale ‘frameshift’. Dankzij
klieving van de replicase polyproteïnen door virusgecodeerde proteases worden in
nidovirus-geïnfecteerde cellen tussen de 13 en 16 individuele virale niet-structurele
eiwitten (‘nonstructural proteins’; nsps) geproduceerd. Naast genoomreplicatie verzorgt
de replicatiemachinerie van nidovirussen ook de synthese van een set van twee tot tien
subgenome (sg) mRNAs. De productie van deze moleculen verzekert de expressie van de
S
234
genen die de structurele eiwitten coderen. De sg mRNAs van alle nidovirussen zijn 3’-coterminaal met het virale genoom, en die van arterivirussen en coronavirussen bevatten
aan het 5’-uiteinde tevens een gemeenschappelijke ‘leader’ sequentie, die identiek is aan
het 5’-uiteinde van het genoom-RNA. Aangenomen wordt dat de unieke mozaïekstructuur van arterivirale en coronavirale sg mRNAs voortkomt uit een proces van discontinue
RNA-synthese, dat plaatsvindt tijdens de productie van de subgenome min-strengen die
gebruikt worden als matrijs voor sg mRNA-synthese.
De functionele karakterisering van replicase-onderdelen is essentieel voor het in
kaart brengen van de regulerende mechanismen die de diverse activiteiten van het
RNA-synthetiserende enzymcomplex van nidovirussen controleren. Het begrijpen van
de fundamentele aspecten van virale replicatie is van doorslaggevend belang voor het
ontwikkelen van strategieën ter voorkoming en behandeling van ziekten, veroorzaakt
door zowel bekende als onverwacht opduikende nidovirussen. Het werk beschreven
in dit proefschrift concentreert zich op de functies die specifieke replicase-onderdelen
hebben in het koppelen van verschillende processen tijdens de vermeerderingscyclus
van het equine arteritis virus (EAV). Dit virus, het prototype van de Arteriviridae familie,
heeft het kleinste genoom onder de nidovirussen en wordt gezien als één van de best
bestudeerde nidovirus-modellen in termen van moleculaire biologie. De huidige kennis
van de talrijke enzymatische activiteiten die aanwezig zijn in het nidovirus-replicase is
voornamelijk verkregen door de biochemische en genetische karakterisering van virale
nsps en wordt samengevat in hoofdstuk 1. Hoofdstuk 2 bevat een literatuuroverzicht van
de strategieën die eukaryote plusstrengs RNA-virussen gebruiken om hun vermenigvuldigingscyclus te reguleren in ruimte en tijd. Er is daarbij speciale aandacht voor de intrinsieke multifunctionaliteit van plusstrengs RNA-virusgenomen als matrijs in tenminste
drie verschillende processen: translatie, synthese van minstrengs RNAs, en de productie
van nieuwe virusdeeltjes. Het belang van de gemeenschappelijke thema’s die zichtbaar
worden voor ons huidige begrip van en toekomstig onderzoek aan regulerende stappen
in de vermeerderingscyclus van nidovirussen worden samengevat.
In de volgende 6 hoofdstukken van dit proefschrift wordt het experimentele werk,
uitgevoerd in dit promotieonderzoek, gepresenteerd en besproken. Twee verschillende
EAV replicase-onderdelen werden onderzocht: nsp11, dat een enzymfunctie bevat die
geconserveerd is in een breed spectrum van nidovirussen (NendoU), en nsp1, een eiwit
specifiek voor arterivirussen met een doorslaggevende functie in sg RNA-productie.
De beschikbaarheid van een ‘full-length’ cDNA kloon voor EAV bevordert functionele
studies aan de uitgebreide replicatiemachinerie van dit virus in belangrijke mate,
gebruikmakend van zogenaamde ‘forward’ en ‘reverse’ genetica. In hoofdstuk 3 en 4
wordt een experimentele aanpak gebruikt die plaatsgerichte mutagenese van het virus
combineert met de in vitro biochemische karakterisering van een recombinant eiwitproduct om onze kennis te vergroten van de rol van nsp11 in de EAV replicatiecyclus.
Een nidovirus-specifiek, geconserveerd domein, gelegen in het C-terminale deel van
arterivirus nsp11 en coronavirus nsp15, was reeds eerder geïdentificeerd door vergelijkende sequentieanalyse. Vervolgens onthulde bio-informatica een verre verwantschap
S
235
Samenvatiing
tussen dit domein en een familie van cellulaire endoribonucleases, en suggereerde dat
nidovirus nsps die dit domein bevatten in staat zouden kunnen zijn RNA-moleculen te
hydrolyseren. Het biologische belang van deze voorspelde enzymatische activiteit (nu
NendoU genaamd) voor de vermeerderingscyclus van EAV is onderzocht en bevestigd
in hoofdstuk 3. Het verwijderen van het NendoU-coderende gebied uit het virale genoom maakte EAV RNA-accumulatie ondetecteerbaar. Gelijksoortige virale phenotypen
werden verkregen wanneer een aantal specifieke aminozuren werden vervangen. Mutagenese van geconserveerde aminozuren die verondersteld werden essentieel te zijn
voor de endoribonuclease activiteit leverde echter levensvatbare mutanten op, hoewel
deze wel ernstige defecten vertoonden op het gebied van de productie van infectieus
nageslacht en een zogenaamd ‘small-plaque’ fenotype hadden. Verdere analyse van deze
veronderstelde NendoU ‘active site’-mutanten bewees het belang van deze functie voor
optimale EAV RNA-synthese en onthulde een potentiële connectie tussen NendoU en de
virale sg mRNA-productie.
De in vitro endoribonuclease activiteit van het arterivirus NendoU-bevattende replicase-eiwit werd in detail onderzocht (hoofdstuk 4). Bacterieel geëxpresseerd nsp11 van
EAV en een ver verwant arterivirus, het ‘porcine respiratory and reproductive syndrome
virus’ (PRRSV), bleken in in vitro activiteitstesten RNA substraten efficiënt te klieven aan
de 3’ zijde van pyrimidines. Beide enzymen vertoonden een bescheiden voorkeur voor
klieving na uridines, een activiteit die in belangrijke mate kon worden verminderd door
mutagenese van aminozuren waarvan al eerder werd aangenomen dat ze van belang
zijn voor enzymactiviteit. Vergelijkende analyse van de ver verwante NendoU activiteit
van arterivirus nsp11 en coronavirus nsp15, gezuiverd en onderzocht onder dezelfde
omstandigheden, toonde zowel gemeenschappelijke eigenschappen als verschillen aan.
Gezamenlijk laten de data gepresenteerd in hoofdstuk 3 en 4 zien dat deze opmerkelijke
‘RNA-processing’ activiteit een gemeenschappelijke eigenschap is van arteri- en coronavirussen, en vormen zij een solide basis voor toekomstig onderzoek gericht op het begrijpen van de moleculaire details van de NendoU functie in de replicatie van nidovirussen.
De regulerende functies van EAV nsp1, het enige tot nu toe bekende nidovirus-eiwit
met een aangetoonde specifieke functie in sg mRNA-productie, zijn onderzocht in hoofdstuk 5 en 6, gebruikmakend van ‘forward’ en ‘reverse’ genetica. De autoproteolytische
klieving van nsp1 van de replicase polyproteïnen wordt uitgevoerd door een C-terminaal
papaine-achtig cysteine proteinase domein (PCPβ), en klieving tussen nsp1 en nsp2 is
een voorwaarde voor virale RNA-synthese (hoofdstuk 5). Twee andere domeinen van
nsp1 zijn eerder geïdentificeerd door vergelijkende sequentie-analyse – een ‘zinc finger’ (ZF) domein in het N-terminale deel van nsp1, en een tweede cysteine proteinase
domein (PCPα) dat proteolytisch inactief is. Mutagenese van de veronderstelde zinkcoördinerende aminozuren bleek te resulteren in een selectieve blokkade van EAV sg
mRNA accumulatie, of in een sterke reductie van de productie van infectieus nageslacht
zonder dat de RNA accumulatie was veranderd. Deze data identificeren nsp1 als een
multifunctioneel onderdeel van het replicase met kritische functies in tenminste drie op-
S
236
eenvolgende sleutelprocessen in de EAV vermeerderingscyclus: replicase polyproteïne
klieving, sg mRNA-productie, en virion biogenese.
In hoofdstuk 6 werden EAV mutanten getest waarin niet-geconserveerde groepjes
polaire aminozuren in nsp1 waren vervangen door alanine, dit in een poging de collectie
levensvatbare nsp1 mutanten met defecten in de regulerende functies van het eiwit uit
te breiden. Gedetailleerde analyse van mutanten en pseudorevertanten maakte duidelijk
dat de relatieve hoeveelheden van de EAV mRNAs strikt worden gereguleerd door een
ingewikkeld netwerk van interacties waarbij alle subdomeinen van nsp1 betrokken
zijn. Verder bleek de kwantitatieve balans tussen de virale mRNAs kritisch te zijn voor
efficiënte productie van nieuwe virusdeeltjes. Er werd een protocol ontwikkeld voor de
kwantitatieve detectie van virale minstrengs RNA-moleculen en dit maakte het mogelijk
om aan te tonen dat nsp1 waarschijnlijk de accumulatie moduleert van de ‘full-length’
en subgenome minstrengs RNAs die als matrijs gebruikt worden om de EAV mRNAs
te maken. Gezamenlijk identificeren de data in hoofdstuk 5 en 6 nsp1 als een centrale
coördinator van genoomvermeerdering, sg mRNA-synthese en virusproductie.
Om de moleculaire details van de nsp1-functies te kunnen ontrafelen, zullen de
ontwikkeling van in vitro test systemen en het bepalen van de drie-dimensionale
structuur van het eiwit van groot belang zijn. De verschillende benaderingen die zijn
getest voor de productie en zuivering van oplosbaar recombinant nsp1 in Escherichia
coli zijn beschreven in hoofdstuk 7. Er deden zich problemen voor bij de zuivering van
GST-gelabeld nsp1, en de daaropvolgende proteolytische klieving van het GST-gedeelte,
die grotendeels te wijten waren aan de slechte oplosbaarheid van recombinant nsp1.
Er wordt echter ook een succesvolle aanpak voor nsp1 expressie beschreven, waarbij
gebruik werd gemaakt van een construct dat autoproteolytische klieving van nsp1 vanaf
een groter expressieproduct mogelijk maakt. Deze aanpak resulteerde in de zuivering
van oplosbaar, stabiel recombinant nsp1 dat in toekomstig onderzoek gebruikt kan
worden.
In hoofdstuk 8 worden de conclusies van onze analyse van EAV nsp1 en nsp11 in detail
besproken tegen de achtergrond van relevante, door anderen verkregen resultaten.
Mogelijke richtingen voor toekomstig onderzoek worden besproken, onderzoek gericht
op de identificatie van de biologische substraten en de betekenis van NendoU activiteit
voor nidovirusreplicatie, en op het ontrafelen van de moleculaire mechanismen achter
de diverse regulerende functies van nsp1.