Studie van de interactie tussen Nictaba en O-GlcNAc
advertisement
Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar 2012 – 2013 Studie van de interactie tussen Nictaba en O-GlcNAc gemodificeerde histonen in tabak Jeroen De Zaeytijd Promotor: Prof. dr. Els Van Damme Tutor: ir. Annelies Delporte Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de bio-ingenieurswetenschappen: cel- en genbiotechnologie De auteur en promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit dit proefschrift, en kan ook beperkt worden door andere intellectuele eigendomsrechten zoals octrooien. The author and promoter give permission to use this thesis for consultation and to copy parts of it for personal use. Every other use is subject to the copyright laws, which means above all that the source must be explicitly specified when using parts from this thesis. Every other use may be also limited by other intellectual property rights such as patents. Gent, juni 2013 Promotor Tutor Auteur Prof. dr. Els Van Damme ir. Annelies Delporte Jeroen De Zaeytijd i Dankwoord Eindelijk! Met trots kan ik mijn thesis vasthouden! Maandenlang werk dat uiteindelijk een tastbare vorm heeft aangenomen. Dit was echter niet gelukt zonder de hulp en steun van vele mensen. In de eerste plaats wil ik mijn promotor Prof. dr. Els Van Damme bedanken voor het begeleiden van mijn thesis. Ik ben zeer tevreden over de goede opvolging van mijn werkzaamheden en de raad die ik kreeg. Daarnaast wil ik haar ook bedanken voor het nakijken en verbeteren van mijn teksten: dit gebeurde niet alleen zeer grondig, maar ook zeer snel, wat toch niet altijd even evident is voor een drukbezette professor en wat ik dan ook ten zeerste op prijs stel. Ook wil ik Prof. Van Damme nogmaals bedanken voor het helpen bij het indienen van mijn BOF aanvraag. In tweede instantie wil ik mijn tutor ir. Annelies Delporte bedanken. Zij maakte mij wegwijs in het labo, verbeterde mijn teksten en ik kon altijd met praktische vragen bij haar terecht. Ik vergeet ook zeker onze drie lange dagen in het labo voor de celsynchronisatie experimenten niet waarbij we van 7.00 uur tot 23.00 uur met elkaar opgescheept waren. Dankzij het toffe gezelschap ging de tijd toch nog vlug voorbij. Verder wil ik de rest van de vakgroep Moleculaire Biotechnologie bedanken voor de toffe werksfeer en voor de hulp in het labo. Ook wil ik zeker mijn ouders bedanken. Het is dankzij hen dat ik de mogelijkheid heb om te studeren en ze zijn doorheen mijn studies een grote steun geweest. Zo kon ik tijdens examenperiodes (en daarbuiten natuurlijk ook) steeds terecht in het warme thuisnest om mij volop op het studeren te concentreren. Verder apprecieer ik ook alle kleine dingen, die te vaak als vanzelfsprekend beschouwd worden, die mijn ouders voor mij gedaan hebben doorheen mijn studies: als ik van mijn kot naar Oudenaarde afzakte voor de vele basketbaltrainingen brachten zij mij van het station naar de sporthal, zondagavond kreeg ik lekker eten mee voor op kot,… Tenslotte wil ik nog een woordje richten tot een heel bijzonder persoon in mijn leven: mijn vriendin Tine. Mijn thesis verliep niet altijd zoals ik zou willen. Meer dan eens was ik wat teleurgesteld over een bekomen resultaat, of was ik wat gestresst. Jij was er echter altijd voor mij en hielp me bij het relativeren en het verzetten van mijn gedachten. Ik besef ook maar al te goed dat ik in de laatste drukke thesismaanden niet altijd de gemakkelijkste persoon was en niet altijd evenveel tijd voor je had. Ik zal dit dan ook ruimschoots goedmaken. ii “Let als je naar een doel reist goed op de weg. Want de weg verrijkt ons terwijl we hem bewandelen.” - Paulo Coelho iii Samenvatting Het Nicotiana tabacum agglutinine, of kortweg Nictaba, is een induceerbaar lectine dat opgezuiverd werd uit de gewone tabaksplant (Nicotiana tabacum). Het komt tot expressie in tabaksplanten die onderhevig zijn aan insectenvraat of die behandeld werden met jasmijnzuur en sommige jasmonaat derivaten. Deze laatste zijn planthormonen welke een belangrijke rol spelen in de regulatie van de verdedigingsrespons in planten. Nictaba zou dan ook een rol spelen bij plantafweer en andere fysiologische processen. Het lectine vertoont affiniteit tegenover mannose-rijke en complexe N-glycanen, maar vooral tegenover oligomeren van N-acetylglucosamine (GlcNAc). Histonen, de eiwitcomponenten van chromatine die een belangrijke rol spelen bij epigenetische genregulatie, kunnen gemodificeerd zijn met O-GlcNAc residuen, wat interactie tussen histonen en Nictaba theoretisch mogelijk maakt. Dit kan wijzen op een eventueel epigenetisch genregulatie mechanisme voor het sturen van plantafweer en andere fysiologische processen. De interactie tussen Nictaba en histonen werd ook reeds aangetoond. Een eerste bewijs kwam van een pull down assay waarbij een extract van tabak cv Xanthi cellen over een Nictabakolom werd gestuurd. Vooral histonen bleken te interageren met de Nictabakolom. Vervolgens werd de specificiteit van de interactie verder onderzocht met behulp van lectine affiniteitschromatografie, echter gebruik makend van commercieel verkrijgbare kalfhistonen. Aangezien het biologisch meer relevant is om interactie na te gaan tussen het lectine en de histonen van hetzelfde organisme, werd in deze thesis een protocol opgesteld voor het opzuiveren van tabakhistonen uit BY-2 cellen. De identiteit van de opgezuiverde histonen werd bevestigd met behulp van SDS-PAGE, western blot analyse en massa spectrometrie. Er werd ook door middel van western blotting aangetoond dat de opgezuiverde histonen over O-GlcNAc modificaties beschikten. Vervolgens werd aan de hand van far western blotting en lectine affiniteitschromatografie de interactie tussen Nictaba en de opgezuiverde tabakhistonen nagegaan en bevestigd. Tenslotte werd gekeken of histonexpressie en het O-GlcNAc modificatieniveau van de opgezuiverde histonen celcyclus afhankelijk was. Hiervoor werden BY-2 cellen gesynchroniseerd door middel van een aphidicoline behandeling en werden western blot analyses met H3 -en O-GlcNAc antilichamen uitgevoerd op de histonen opgezuiverd uit deze cellen op verschillende tijdspunten doorheen de celcyclus. Verschillen in histonexpressieniveau waren moeilijk te zien op basis van de western blot analyse met H3 antilichaam. De western blot analyse met O-GlcNAc lichaam was duidelijker: histonen lijken minder O-GlcNAc modificaties te dragen in de S- en vroege G2 fase. Het O-GlcNAc modificatieniveau stijgt vervolgens in de late G2 fase en blijft behouden doorheen de mitose. Histonen lijken het meest extensief gemodificeerd te zijn in de G1 fase. RT-PCR en relatieve qPCR analyses werden uitgevoerd om de celcyclus afhankelijkheid van de expressie van O-GlcNAc transferase te controleren. Deze resultaten waren echter minder duidelijk. Verder onderzoek naar de kwantitatieve en kinetische aspecten van histon-Nictaba interactie, alsook naar het O-GlcNAc transferase expressieprofiel zijn aangewezen. iv Summary The Nicotiana tabacum agglutinin, or Nictaba, is a lectin which has been purified from the leaves of tobacco (Nicotiana tabacum). The lectin is induced in tobacco plants subjected to insect herbivory or tobacco plants that are treated with jasmonic acid or some of its derivatives which are hormones that play an important role in the regulation of the defense response in plants. As a result Nictaba is suggested to play a role in the plant defense response and other physiological processes. Nictaba interacts with high-mannose and complex N-glycans, but mainly with oligomers of Nacetylglucosamine. Histones, the protein components of chromatin that play an important role in epigenetic gene regulation, can be modified with O-GlcNAc moieties, which makes interaction between Nictaba and histone proteins theoretically possible. This may indicate a possible epigenetic regulation system for regulation plant defense response and other physiological processes. The interaction between Nictaba and histones was already proven. A first evidence came from a pull down assay where an extract of tobacco cv Xanthi cells was brought onto a Nictaba column. Histones appeared to be the major interacting proteins. The specificity of the interaction between Nictaba and histones was further investigated using commercially available calf histones. It is obvious that the proof of interaction between Nictaba and histone proteins of the same species is of much greater biological significance. For that reason a protocol for the purification of histone proteins from BY-2 cells was elaborated. The identity of the purified proteins was confirmed by means of SDS-PAGE, western blot analysis and mass spectrometry. Using western blot analysis with a specific antibody directed against O-GlcNAc it was also shown that the purified histones were modified with O-GlcNAc. Subsequently the interaction between Nictaba and tobacco histones was investigated and confirmed using far western blot analysis and lectin affinity chromatography. Finally it was also examined whether histone gene expression and the level of O-GlcNAcylation of histones was cell cycle dependent. BY-2 cells were synchronized by aphidicolin treatment and samples were collected at regular intervals. Western blot analysis with H3 and O-GlcNAc specific antibodies were conducted on histones, purified from cells in different phases of the cell cycle. Based on the western blot analysis, differences in H3 gene expression were hard to see. The western blot analysis with the O-GlcNAc antibody was more obvious: histones seem to be less modified with OGlcNAc residues in the S-phase and early G2 phase. Histone O-GlcNAcylation levels increase in late G2 phase and are maintained during mitosis. Histones seem to be most extensively modified with OGlcNAc during the G1 phase. To check whether the expression of O-GlcNAc transferase is cell cycle dependent, RT-PCR and relative qPCR experiments were carried out, but these results were less clear. Further studies on the quantitative and kinetic aspects of Nictaba-histone interaction and further studies on the expression profile of O-GlcNAc transferase should be carried out. v Inhoud Lijst met afkortingen 1 Literatuurstudie................................................................................................................................ 1 1.1 Nicotiana tabacum ................................................................................................................... 1 1.2 BY-2 cellen ................................................................................................................................ 1 1.3 Lectinen .................................................................................................................................... 1 1.3.1 Definitie ............................................................................................................................ 1 1.3.2 Klassieke lectinen ............................................................................................................. 2 1.3.3 Induceerbare (nucleocytoplasmatische) lectinen ........................................................... 2 1.4 1.3.3.1 ABA homologen............................................................................................................ 2 1.3.3.2 Amaranthines ............................................................................................................... 3 1.3.3.3 Lectinen met een EUL domein ..................................................................................... 3 1.3.3.4 GNA homologen ........................................................................................................... 3 1.3.3.5 Jacaline homologen ...................................................................................................... 3 1.3.3.6 Nictaba homologen ...................................................................................................... 4 1.3.3.7 Functie van nucleocytoplasmatische lectinen ............................................................. 5 Histonen ................................................................................................................................... 6 1.4.1 Het nucleosoom ............................................................................................................... 6 1.4.2 Histon modificaties........................................................................................................... 8 1.4.2.1 Acetylatie en methylatie .............................................................................................. 8 1.4.2.2 O-GlcNAcylatie ........................................................................................................... 10 1.5 Interactie tussen histonen en Nictaba ................................................................................... 12 1.6 Enkele technieken voor lectine–glycoproteïne interactieonderzoek .................................... 12 1.6.1 Lectine affiniteitschromatografie................................................................................... 12 1.6.2 Pull Down Assay ............................................................................................................. 13 1.6.3 Far Western Blotting ...................................................................................................... 14 1.6.4 Biosensoren gebaseerd op Surface Plasmon Resonance (SPR) ..................................... 14 2 Doelstelling ..................................................................................................................................... 16 3 Materiaal en methoden ................................................................................................................. 18 3.1 Werken met celculturen ........................................................................................................ 18 3.1.1 Opgroeien van BY-2 cellen ............................................................................................. 18 3.1.2 Synchronisatie van BY-2 cellen ...................................................................................... 18 3.2 3.1.2.1 Synchronisatie van cellen met behulp van de drug aphidicoline .............................. 18 3.1.2.2 Controle van synchronisatie....................................................................................... 19 Histonopzuivering .................................................................................................................. 21 vi 3.2.1 Protocol 1 voor histonopzuivering ................................................................................. 21 3.2.2 Protocol 2 voor histonopzuivering ................................................................................ 21 3.2.3 Eigen samengesteld protocol voor histonopzuivering................................................... 22 3.3 Microscopie ............................................................................................................................ 23 3.4 Algemene moleculaire technieken ........................................................................................ 23 3.4.1 RNA extractie.................................................................................................................. 23 3.4.2 cDNA synthese en reverse transcription PCR (RT-PCR) ................................................. 24 3.4.3 Polymerase Chain Reaction (PCR) .................................................................................. 24 3.4.4 Real-time Polymerase chain reaction (qPCR) ................................................................ 25 3.4.5 Agarose gelelektroforese ............................................................................................... 27 3.4.6 DNA en RNA concentratiebepaling ................................................................................ 27 3.5 Eiwit analysetechnieken ......................................................................................................... 27 3.5.1 3.5.1.1 Concentratiebepaling met behulp van de Nanodrop 2000 ....................................... 27 3.5.1.2 Bradford proteïne assay ............................................................................................. 28 3.5.1.3 Pierce 660 nm proteïne assay .................................................................................... 28 3.5.2 SDS-PAGE ........................................................................................................................ 28 3.5.3 Western blot analyse ..................................................................................................... 30 3.6 4 Concentratiebepaling ..................................................................................................... 27 Technieken om de interactie tussen histonen en Nictaba na te gaan .................................. 31 3.6.1 Lectine affiniteitschromatografie................................................................................... 31 3.6.2 Far western blot analyse ................................................................................................ 32 3.6.3 Pull down assay .............................................................................................................. 32 Resultaten ...................................................................................................................................... 33 4.1 Opzuivering van histonen....................................................................................................... 33 4.1.1 Protocol 1 voor histonopzuivering ................................................................................. 33 4.1.2 Protocol 2 voor histonopzuivering ................................................................................. 34 4.1.3 Eigen samengesteld protocol voor histonopzuivering................................................... 35 4.2 4.1.3.1 Protoplast vorming ..................................................................................................... 36 4.1.3.2 Opzuivering van kernen ............................................................................................. 36 4.1.3.3 Kernextractie .............................................................................................................. 37 4.1.3.4 Schematisch overzicht samengesteld protocol voor histonopzuivering ................... 37 4.1.3.5 Effectiviteit van het samengestelde protocol ............................................................ 37 Celsynchronisatie ................................................................................................................... 42 4.2.1 Controle van celsynchronisatie ...................................................................................... 42 4.2.1.1 Flow cytometrische analyse ....................................................................................... 42 4.2.1.2 Bepalen van de mitotische index (MI) ....................................................................... 43 4.2.2 qPCR en RT-PCR .............................................................................................................. 45 4.2.3 Western blot analyse ..................................................................................................... 48 vii 4.3 Aantonen van interactie tussen Nictaba en tabakhistonen .................................................. 49 4.3.1 Far western blot ............................................................................................................. 49 4.3.2 Lectine affiniteitschromatografie................................................................................... 50 4.3.2.1 Testen van de kolom met kalfhistonen ...................................................................... 50 4.3.2.2 Lectine affiniteitschromatografie met opgezuiverde tabakhistonen ........................ 52 4.3.3 5 6 Pull down assay .............................................................................................................. 53 Discussie ......................................................................................................................................... 56 5.1 Opzuiveren van histonen uit BY-2 cellen ............................................................................... 56 5.2 Celsynchronisatie ................................................................................................................... 57 5.3 Interactieonderzoek ............................................................................................................... 58 5.4 Verder onderzoek................................................................................................................... 59 5.5 Conclusie ................................................................................................................................ 60 Referenties ..................................................................................................................................... 61 6.1 Artikels en boeken.................................................................................................................. 61 6.2 Websites ................................................................................................................................. 66 viii Lijst met afkortingen ABA Agaricus bisporus agglutinine ABA abscisinezuur APS ammoniumpersulfaat ATP adenosinetrifosfaat Bidest dubbel gedestilleerd water bp baseparen BSA Bovine Serum Albumine BY-2 Bright Yellow 2 CCD charge-coupled device cDNA complement DNA CT cycle threshold cv cultivar DAP diaminopropanol DAPI 4,6-diamidino-2-phenylindool DMSO dimethylsulfoxide DNA desoxyribonucleïnezuur DNMT DNA methyltransferases dNTP’s deoxynucleotiden DTT dithiothreitol ECL enhanced chemiluminiscence detection EDTA ethyleendiaminetetra-azijnzuur EEA Euonymus europaeus agglutinine ER endoplasmatisch reticulum ERAD Endoplasmic-reticulum-associated protein degradation EUL Euonymus europaeus lectine GA gibberelline GAR goat anti rabbit GCC Glycine-cysteîne-cysteïne GFP green fluorescent protein GI GIGANTEA GlcNAc N-acetylglucosamine GNA Galanthus nivalis agglutinine GUS β-glucuronidase HAT histon acetyl transferase HBP hexosamine biosynthese pathway HDAC histon deacetylase HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-ethaansulfonzuur ix HI histonisolatiebuffer HP1 heterochromatine proteïne 1 HRP horseradish peroxidase HSH helix-strand-helix JAME jasmonaat methyl ester K lysine kD kilodalton LC-MS/MS Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry Me methyl MES 2-(N-morpholino) ethaansulfonzuur MI mitotische index mRNA messenger ribonucleïnezuur MS massaspectrometrie NCAPS non-cell autonomous proteins NIB nuclei isolatiebuffer Nictaba Nicotiana tabacum agglutinine NLS nucleair lokolisatie signaal O-GlcNAc O-gelinkt N-acetylglucosamine OGT O-GlcNAc transferase Orysata Oryza sativa agglutinine PBS phosphate buffered saline PCR polymerase chain reaction PI propidium iodide PMSF fenylmethaansulfonylfluoride PP2 proteïnen Cucurbitaceae floeemlectinen PVDF polyvinylideenfluoride qPCR real time PCR of kwantitatieve PCR RAM rabbit anti mouse RNA ribonucleïnezuur RNAi RNA interference RT-PCR reverse transcription PCR RU resonantie units SDS natriumdodecylsulfaat SDS-PAGE natriumdodecylsulfaat polyacrylamide gelelektroforese SEC OGT secret agent OGT Ser serine SPR surface plasmon resonance SPRi surface Plasmon resonance imaging SPY OGT spindly OGT t.p.m. toeren per minuut x TAE Tris- azijnzuur -EDTA TCA trichloorazijnzuur TEMED tetramethylethyleendiamine Thr threonine TPR tetratricopeptide herhalingen UDP uridinedifosfaat UDP-GlcNAc uridinidifosfaat N-acetylglucosamine WGA wheat germ agglutinin β-ME β-mercaptoethanol xi 1 Literatuurstudie 1.1 Nicotiana tabacum Nicotiana tabacum, of de gewone tabaksplant, is een kruidachtige, eenjarige of kortlevende meerjarige plant, behorend tot de familie Solanaceae. De plant is oorspronkelijk van de tropische of subtropische streken van westelijk Zuid-Amerika, maar wordt wereldwijd commercieel geteeld voor de tabaksindustrie. Het is de meest geteelde soort van het Nicotiana genus. Nicotiana tabacum bevat het verslavende alkaloïd nicotine (www.botanical.com; www.jlhudsonseeds.net/SeedlistN.htm; www.ehow.com). 1.2 BY-2 cellen BY-2 is de naam van een plantencellijn, afkomstig van callus van een Nicotiana tabacum cultivar ‘Bright Yellow 2’ zaailing (Nagata, et al. 1992). De cellen worden gekweekt als suspensieculturen en worden gebruikt als modelsysteem voor de plantencel. BY-2 cellen worden onder andere gebruikt voor studies van het cytoskelet, de regulatie van de celcyclus en intracellulaire lokalisatiestudies. BY2 celculturen hebben enkele belangrijke voordelen ten opzichte van Arabidopsis celculturen. Deze cellen worden gekenmerkt door een hoge graad van homogeniteit en hoge groeisnelheid, en zijn makkelijker te synchroniseren dan Arabidopsis culturen. De tabakcellen zijn ook groter, waardoor intracellulaire lokalisatiestudies makkelijker uitvoerbaar zijn (Geelen and Inze, 2001). 1.3 Lectinen 1.3.1 Definitie Proteïnen die specifiek en reversibel binden met welbepaalde suikers worden lectinen genoemd of agglutininen. Deze laatste benaming komt van het feit dat vele lectinen in staat zijn om erytrocyten en/of andere dierlijke cellen te doen klonteren of ‘agglutineren’. Agglutinatie wordt echter niet meer beschouwd als een cruciale eigenschap om een eiwit als lectine te classificeren. Plantenlectinen worden gedefinieerd als proteïnen die ten minste één niet-katalytisch domein bevatten dat reversibel bindt aan een specifiek mono- of oligosaccharide. Dit betekent dus dat lectinen naast een suikerbindend domein, ook andere domeinen met een andere functie kunnen bevatten. Dit laat toe dat lectinen verschillende uiteenlopende biologische functies vervullen (Peumans and Van Damme, 1995). 1 Er werden reeds 12 verschillende suikerbindende domeinen geïdentificeerd in de wereld van de plantenlectinen. Om die reden worden plantenlectinen ingedeeld in 12 verschillende families (Van Damme, et al., 2008). Afhankelijk van het feit of de lectinen constitutief tot expressie komen of geïnduceerd worden, spreekt men respectievelijk van ‘klassieke’ of ‘ induceerbare’ lectinen. 1.3.2 Klassieke lectinen Klassieke lectinen komen constitutief tot expressie. Ze worden gesynthetiseerd in het endoplasmatisch reticulum en volgen de secretorische pathway. Via een signaalpeptide komen ze voornamelijk terecht in de vacuole, maar ze kunnen ook uit de cel gesecreteerd worden. Klassieke lectinen zijn in aanzienlijke concentraties aanwezig, voornamelijk in zaden of gespecialiseerde vegetatieve organen zoals opslagorganen. Samen met het feit dat deze lectinen vooral plantvreemde glycoconjugaten zoals complexe dierlijke N – en O- gelinkte glycanen herkennen, doet dit alles vermoeden dat klassieke lectinen vooral een rol spelen in aspecifieke defensiemechanismen van de plant of dienst doen als opslagproteïnes (Peumans and Van Damme, 1995; Peumans, et al., 2000). 1.3.3 Induceerbare (nucleocytoplasmatische) lectinen Naast de klassieke lectinen, die constitutief tot expressie komen, bestaan er ook lectinen die in normale planten niet aanwezig zijn, maar enkel in fysiologisch relevante concentraties voorkomen in planten onderworpen aan welbepaalde stresscondities. Deze lectinen komen voor in de nucleus en het cytoplasma van de plantencel, waar ze voornamelijk interageren met endogene glycanen. Deze nucleocytoplasmatische lectinen kunnen via specifieke proteïne-koolhydraat interacties bepaalde fysiologische processen sturen en dus een belangrijke rol spelen in de cel. Zo kunnen ze bijvoorbeeld een regulatorische functie hebben bij signaaltransductie. De induceerbare lectinen zouden evolutionair gezien eerst onstaan zijn. Hieruit zijn dan de klassieke lectinen ontstaan door verschillende veranderingen in het gen. Zo zou het mogelijk zijn dat een gen coderend voor een induceerbaar lectine terecht gekomen is achter een constitutieve promoter. Vervolgens zou het lectine specificiteit voor vreemde glycanen kunnen verworven hebben (Van Damme, et al., 2003). Van de 12 lectinefamilies zijn er zes families waarin nucleocytoplasmatische lectinen werden geïdentificeerd (Van Damme, et al., 2008). 1.3.3.1 ABA homologen Het Agaricus bisporus agglutinine (ABA) is een lectine dat werd ontdekt in de schimmel A. bisporus. Het lectine is een homotetrameer en bevat twee suikerbindende domeinen. Een ervan is specifiek voor galactose-O-gelinkte (zoals het T-antigen) en het andere voor GlcNAc–N-gelinkte glycanen. 2 ABA- homologen in planten blijken ook over deze tweevoudige bindingsspecificiteiten te beschikken (Peumans, et al., 2007). 1.3.3.2 Amaranthines Amaranthines zijn nucleocytoplasmatische lectinen met specificiteit voor het T-antigen (Galβ13GalNAc) die voorkomen in de plantenfamilie Amaranthaceae (Van Damme, et al., 2008). Het lectine is een homodimeer en de specifieke oriëntatie van de twee domeinen zorgt voor het ontstaan van een suikerbindende site (Lannoo and Van Damme, 2010). 1.3.3.3 Lectinen met een EUL domein De eerste vertegenwoordiger van de familie van lectinen met een EUL domein werd gevonden in de kardinaalsmuts (Euonymus europaeus): het E. europaeus agglutinine (EEA). Het EEA is een homodimeer met specificiteit voor Galα1-3Gal en Galα1-3Galβ1-4GlcNAc epitopen. Het bindt ook met enkele glycosfingolipiden en bloedgroep B- en O - epitopen. Verder vertoont het lectine ook specificiteit ten opzichte van N-gelinkte glycanen met vele mannose residuen. Tot deze familie behoren alle lectinen met één of meerdere EUL domeinen (Lannoo and Van Damme, 2010). 1.3.3.4 GNA homologen GNA (Galanthus nivalis agglutinine) is een lectine geïsoleerd uit de bollen van het sneeuwklokje. Het is een homotetrameer met specificiteit voor mannose. GNA homologen werden ook in vele andere planten ontdekt. Er bestaan zowel klassieke GNA homologen, gelokaliseerd in de vacuolen, als nietklassieke cytoplasmatische GNA homologen (Lannoo and Van Damme, 2010). 1.3.3.5 Jacaline homologen Deze familie omvat de lectinen die één of meerdere jacaline domeinen bevatten. Jacaline is een lectine geïsoleerd uit de zaden van de broodvruchtboom (Eng.: Jack fruit) of Artocarpus integrifolia. Deze familie kan verder opgedeeld worden in twee subfamilies: 1) jacaline homologen met specificiteit voor galactose en 2) mannose specifieke jacaline homologen. De galactose specifieke lectinen accumuleren in de vacuole en kunnen dus beschouwd worden als klassieke lectinen, terwijl de mannose bindende lectinen eerder niet-klassieke cytoplasmatische lectinen zijn (Lannoo and Van Damme, 2010). 3 1.3.3.6 Nictaba homologen Algemeen Het Nicotiana tabacum agglutinine, of kortweg Nictaba, is een lectine dat opgezuiverd werd uit de bladeren van Nicotiana tabacum. Het is een induceerbaar lectine dat tot expressie komt in tabaksplanten behandeld met jasmonaat derivaten of in planten onderhevig aan insectenvraat. Het is een homodimeer van twee niet- geglycosyleerde 19 kD subunits. De enige post-translationele modificatie die Nictaba ondergaat is de acetylatie van het N-terminaal methionine. Nictaba heeft een NLS (nucleair lokalisatie signaal) bestaande uit vier opeenvolgende lysines waardoor transport naar de nucleus mogelijk is. Immunolokalisatie suggereerde ook effectief dat Nictaba zich in het cytoplasma en in de celkern bevindt (Chen, et al., 2002). Een GFP-Nictaba fusieconstruct met een mutatie in de NLS kon niet in de nucleus gedetecteerd worden terwijl een GFP-Nictaba construct met intact NLS wel in de nucleus werd aangetroffen (Lannoo, et al., 2006). Aangezien het lectine vooral affiniteit tegenover N-acetylglucosamine (GlcNAc) oligomeren vertoont, werd het oorspronkelijk beschouwd als een chitinebindend lectine (Chen, et al., 2002). Nictaba vertoont echter ook specificiteit ten opzichte van mannose-rijke en complexe N-glycanen. Door de nucleocytoplasmatische lokalisatie van het lectine vermoedt men dat Nictaba een endogene functie heeft en tussenkomt bij fysiologische processen en plantenafweer. De rol in plantenafweer werd namelijk aangetoond door het feit dat Nictaba erg resistent is tegen proteolytische afbraak door enzymes aanwezig in het darmkanaal van Lepidoptera. Ook groeiden Lepidoptera larven minder goed op Nicotiana attenuata planten die Nictaba tot overexpressie brachten. Dit duidt op de mogelijke rol van Nictaba bij de afweer tegen insecten (Vandenborre, et al., 2010). Sequenties die homoloog zijn aan deze van Nictaba werden gevonden in vele maar niet alle tabakssoorten (Lannoo, et al., 2006) en in verschillende Solanaceae soorten, Apium graveolens en Arabidopsis thaliana. De Cucurbitaceae floeemlectinen (PP2 proteinen) bevatten ook een Nictaba domein. In tegenstelling tot Nictaba zijn dit echter geen induceerbare lectinen maar komen ze constitutief tot expressie (Van Damme, et al., 2008). Sequenties homoloog aan Nictaba werden niet teruggevonden in monocotylen, gymnospermen of organismen buiten het plantenrijk (Lannoo and Van Damme, 2010). De Nictaba sequentie komt ook voor als onderdeel van grotere chimere proteïnen waarbij het Nictaba domein gekoppeld is aan een ander eiwitdomein (Lannoo, et al., 2008; Lannoo and Van Damme, 2010). Inductie van Nictaba Jasmijnzuur, zijn precursoren en derivaten (gezamenlijk aangeduid met de term jasmonaten), zijn hormonen die tussenkomen in verschillende plantprocessen zoals afweer, groei, ontwikkeling, veroudering en vruchtbaarheid. Jasmonaat speelt een belangrijke rol in signaaltransductie waarbij de interactie met andere hormonen zoals ethyleen, salicylzuur en abscisinezuur belangrijk is. 4 Jasmonaat wordt gesynthetiseerd via de octadecanoïd pathway onder invloed van externe stimuli zoals verwonding of pathogenen. In 2007 werd een onderzoek gedaan waarbij Nicotiana tabacum planten werden onderworpen aan verschillende stressfactoren en werden getest op Nictaba inductie aan de hand van agglutinatietesten en cDNA analyse op extracten van afgeknipte bladeren. Deze experimenten toonden aan dat enkel exogeen toegediend jasmonaat en JAME (jasmonaat methyl ester) de expressie van Nictaba induceert. Ook insectenvraat induceert Nictaba doch in mindere mate. Het lectine komt niet enkel tot expressie in het aangetaste blad maar wordt ook systemisch geïnduceerd. De lectineconcentratie is afhankelijk van de leeftijd van het blad en de positie van het blad (Lannoo, et al., 2007). GCC motieven en G-box motieven zijn promoterelementen die typisch zijn voor de jasmonaat respons. In silico analyse toonde aan dat deze jasmonaat responsieve elementen effectief aanwezig zijn in de Nictaba promoters. Naast deze in silico analyse werd ook een expressieanalyse uitgevoerd in Arabidopsis thaliana gebruik makend van een Nictaba promoter (promoter IL12) – GUS construct. Hoge GUS activiteit na extern toedienen van JAME werd vooral waargenomen in jonge weefsels, maar verminderde naarmate de plant ouder werd (Delporte, et al., 2011). Er werd in deze studie gekozen voor Arabidopsis thaliana omdat deze veelgebruikte modelplant gemakkelijk te transformeren is en ook getypeerd wordt door een snelle groeicyclus. De kans bestaat echter dat de jasmonaat respons van de Nictaba promoter in Arabidopsis thaliana niet helemaal representatief is voor de werkelijke Nictaba regulatie in tabak. Daarom werd de studie van Delporte et al uitgebreid naar Nicotiana tabacum cv Samsun NN planten getransformeerd met een promoter (IL12, NL32) – GUS construct. Hoge promoteractiviteit werd waargenomen in de cotyledonen van vooral jonge plantjes en in oudere planten was er vooral GUS kleuring van de oudere (eerste) bladeren, wat dus overeenkomt met de studie in Arabidopsis. Er kwamen echter ook enkele verschillen met de studie in Arabidopsis naar voren. Zo was bijvoorbeeld het apicale meristeem van de tabaksplantjes niet gekleurd terwijl dit bij de Arabidopsis plantjes wel het geval was. Verder was ook de GUS inductie in de wortels en bloemen van beide soorten compleet verschillend. Dit bewijst dus dat men moet opletten met promoter studies waarbij men een promoter binnen brengt in een plant met een verschillende genetische achtergrond ( Delporte, et al., 2013). 1.3.3.7 Functie van nucleocytoplasmatische lectinen Lectinen en glycoproteïne degradatie Wanneer zoogdierproteïnen verkeerd opgevouwen worden in het endoplasmatisch reticulum (ER), worden deze via de ‘endoplasmic-reticulum-associated protein degradation’ (ERAD) pathway gedegradeerd. Zogenaamde F-box proteïnes gaan binden aan de suikerstructuren aanwezig op het fout gevouwen eiwit en zullen de afbraak ervan sturen. In Arabidopsis bijvoorbeeld hebben F-box 5 proteïnen met een Nictaba domein een analoge functie als de Fbs proteïnen van zoogdieren (Lannoo and Van Damme, 2010). Lectinen en nucleair transport Men vermoedt dat lectinen een rol spelen bij de regulatie van eiwit- en RNA - transport van en naar de celkern (Lannoo and Van Damme, 2010). Vele proteïnen van de kernporiën dragen glycanen, waaraan lectines kunnen binden. Zo zou Nictaba kunnen binden aan de O-GlcNAc gemodificeerde kernporieproteïnen (Van Damme, et al., 2003; Lannoo and Van Damme, 2010). Lectinen en hun rol bij reactie op stresscondities Het is duidelijk dat er verschillende nucleocytoplasmatische lectinen bestaan die tot expressie komen wanneer planten onderworpen worden aan stress (Van Damme, et al., 2003; Lannoo and Van Damme, 2010). Zo komt Orysata (behorend tot de jacaline familie) tot expressie na blootstelling aan zout – en droogtestress (Claes, et al., 1990). Zoals reeds eerder vermeld is Nictaba een ander voorbeeld van een lectine dat een rol speelt bij stresssignalisatie. Nictaba synthese wordt geïnduceerd door jasmonaat of door insectenvraat (Chen, et al., 2002; Lannoo, et al., 2007; Vandenborre, et al., 2010; Delporte, et al., 2011). Lectinen met een EUL domein daarentegen zijn induceerbaar door ABA of door zoutstress (Lannoo and Van Damme, 2010). Al deze voorbeelden zijn het bewijs van het belang van nucleocytoplasmatische lectinen bij de stressrespons in planten. 1.4 Histonen 1.4.1 Het nucleosoom In de nucleus van eukaryoten komt DNA voor onder de vorm van chromatine, een associatie van DNA en proteïnen. De belangrijkste proteïnecomponenten van chromatine zijn de histonen waarrond het DNA gewikkeld is. Twee kopijen van de histonen H2A, H2B, H3 en H4 (de zogenaamde ‘core’ histonen) vormen een octameer waar 147 baseparen van DNA 1,65 keer rond gewikkeld zijn in een linkshandige superhelix. Deze associatie wordt het nucleosoom genoemd en vormt de basiseenheid van chromatine (Luger, et al., 1997). De vier ‘core’ histonen worden gekenmerkt door eenzelfde basisstructuur: de ‘histon fold’ (Arents, et al., 1991). De ‘histon fold’ bestaat uit een lange centrale helix met aan elke zijde een lus en een korte helix. Dit motief wordt ook het ‘helix-strand-helix’ (HSH) motief genoemd (Ramakrishnan, 1997)(Figuur 1). 6 Figuur 1: De ‘histon fold’ (Ramakrishnan, 1997) De histonen H2A en H2B vormen samen een dimeer net als de histonen H3 en H4. Twee histonen gaan dimeriseren via hun ‘histon fold’ volgens een zogenaamd ‘handshake’ motief (Arents, et al., 1991) (Figuur 2A). De streng in het HSH motief van het C-terminaal deel van het ene histon gaat associëren met de streng in het HSH motief van het N-terminaal deel van het andere histon, waardoor een β-sheet gevormd wordt. Het oppervlak van deze β-sheets bestaat uit basische aminozuren, die dus met het negatief geladen DNA kunnen binden. Twee H3-H4 dimeren gaan verder associëren via het C-terminaal HSH motief van beide dimeren tot een tetrameer (Figuur 2B). A B Figuur 2: A: Dimerisatie via ‘histon fold’. B: H3 – H4 tetrameer (Ramakrishnan, 1997) Aan elke zijde van het H3-H4 tetrameer gaat een H2A-H2B dimeer binden met vorming van het octameer tot gevolg. Deze binding komt er vooral door interactie tussen de C-terminale delen van H2B en H4 (Ramakrishnan, 1997). Naast deze ‘core’ histonen bestaan er nog de ‘linker’ histonen H1 en H5. H5 is een variant van H1 die enkel in de erytrocyten van vogels voorkomt (Happel and Doenecke, 2009). Het ‘linker’ histon H1 bindt aan het nucleosoom en aan het binnenkomende en uitgaande DNA, waardoor het DNA op zijn plaats blijft. 7 Het nucleosoom samen met het ‘linker’ histon wordt aangeduid met de term chromatosoom (Ramakrishnan, 1997). Opeenvolgende chromatosomen met daartussen 50 bp DNA worden aangeduid als de ‘beads on a string’ conformatie. Deze conformatie van chromatine wordt nog compacter georganiseerd: nucleosomen gaan associëren tot een 30 nm fibril (Figuur 3). Deze kunnen dan verder condenseren tot chromosomen. Figuur 3: Associatie van nucleosomen tot een 30 nm fibril (http://edoc.hu-berlin.de/dissertationen/seitzstefanie-2004-10-20/HTML/chapter1.html) Onder de vorm van compact chromatine is het dus mogelijk om de enorme hoeveelheid DNA op te slaan in de celkern. Het compact maken van DNA is echter niet de enige functie van histonen. De chromatinestructuur is namelijk dynamisch en nucleosomen spelen een belangrijke rol bij de genregulatie. Genen die niet tot expressie mogen komen zullen zich in het compact heterochromatine bevinden, zodat de transcriptiemachine geen toegang krijgt tot het desbetreffende DNA. DNA dat moet afgeschreven worden zal daarentegen voorkomen onder de vorm van niet compact euchromatine zodat transcriptie kan doorgaan (Ramakrishnan, 1997). 1.4.2 Histon modificaties Histonen, en dan vooral hun N-terminale delen, kunnen verschillende posttranslationele modificaties ondergaan zoals acetylatie, methylatie, fosforylatie, ubiquitinylatie, sumoylatie, O-GlcNAcylatie… Dit geheel van mogelijke histon modificaties wordt ook wel de histoncode genoemd. Door de verschillende modificaties kunnen histonen interageren met andere histonen, DNA en enzymen die de chromatinestructuur kunnen veranderen. Op die manier kan de histoncode aanzien worden als een epigenetisch mechanisme om de chromatinestructuur te veranderen zodat processen als transcriptie, replicatie, DNA-repair optimaal kunnen doorgaan (Bartova, et al., 2008, Sakabe, et al., 2010). 1.4.2.1 Acetylatie en methylatie Naast DNA methylatie zijn acetylatie en methylatie van welbepaalde lysine residuen van de histonen de best gekende epigenetische merkers. 8 Euchromatine wordt gekenmerkt door trimethylatie van H3K4, H3K36, H3K79 en een hoge graad van histon acetylatie. Deze acetylatie gebeurt door histon acetyl transferases (HAT’s). Histon deacetylases (HDAC’s) kunnen de acetylgroepen van euchromatine verwijderen en aanleiding geven tot repressie van transcriptie. Heterochromatine wordt dan weer gekenmerkt door trimethylatie van H3K9, H3K27 en H4K20 (Kouzarides, 2007). Figuur 4 geeft de veranderingen in histon modificaties weer tijdens de omzetting van actief euchromatine naar heterochromatine. Euchromatine wordt vooral gekenmerkt door H3K9 acetylatie en methylatie van H3K4. HDAC’s zorgen voor de deacetylatie van de histonen en histon demethylases zoals LSD1 zorgen voor de demethylatie van H3K4. Dit geeft aanleiding tot de activatie van histon methyltransferases zoals K9-HMT, waardoor H3K9 gemethyleerd wordt. H3K9 functioneert als bindingsplaats voor het heterochromatine proteïne 1 (HP1). HP1 zorgt voor condensatie van chromatine tot heterochromatine. Het medieert ook de kenmerkende DNAmethylatie bij heterochromatine door DNA methyltransferases (DNMT’s). Gemethyleerd DNA kan dan associëren met proteïnen die samen met HDAC’s de overige histon acetylaties wegwerken (Bartova, et al., 2008). Dit mechanisme werd uitvoerig beschreven in gist. Uit de literatuur blijkt echter dat dit systeem ook grotendeels geconserveerd is in planten (Braszewska-Zalewska, et al. 2012; Stepinski, 2012). Figuur 4: Veranderingen in histon modificaties bij omzetting van actief euchromatine tot inactief heterochromatine (Bartova, et al., 2008) 9 1.4.2.2 O-GlcNAcylatie β-N-acetylglucosamine kan gebonden worden aan de hydroxylgroep van serine– en threonineresiduen om zo een O-GlcNAc modificatie te vormen. Er zijn reeds een duizendtal verschillende proteïnen geïdentificeerd als substraat voor O-GlcNAc modificatie (Hanover, et al., 2012), waaronder ook veel nucleocytoplasmatische proteïnen. Deze modificatie speelt een rol bij verschillende cellulaire processen zoals transcriptie, signaaltransductie, stressrespons, celgroei en proteïne-proteïne interacties. O-GlcNAcylatie is net als fosforylatie een zeer dynamisch proces. Hoewel bij fosforylatie zeer veel verschillende enzymen tussenkomen, wordt de O-GlcNAc huishouding slechts door twee enzymen gereguleerd: O-GlcNAc transferase (OGT) zorgt voor het aanbrengen van O-GlcNAc en O-GlcNAcase kan het suikerresidu terug verwijderen (Hu, et al., 2010; Fong, et al., 2012). Het donor substraat voor O-GlcNAcylatie is UDP-GlcNAc en verhoogde intracellulaire concentraties UDP-GlcNAc werden dan ook gecorreleerd met een hoger niveau van O-GlcNAcylatie (Zhang, et al., 2011). UDP-GlcNAc is na ATP de meest abundante kleine hoog-energetische molecule aanwezig in de cel (Sakabe, et al., 2010). UDP-GlcNAc wordt geproduceerd via de hexosamine biosynthese pathway (HBP). Aangezien de HBP het metabolisme van zowel koolhydraten, aminozuren, vetten als nucleotiden integreert in de synthese van UDP-GlcNAc, kan de HBP gezien worden als een soort nutriëntensensor die het niveau van O-GlcNAcylatie, en dus ook de hiermee geassocieerde cellulaire processen, beïnvloedt (Zhang, et al., 2011; Hanover, et al., 2012). Er is steeds meer bewijs dat O-GlcNAc een belangrijke rol speelt inzake chromatinestructuur. O-GlcNAc werd waargenomen in gecondenseerd chromatine van Drosophila en RNA polymerase II, en vele transcriptiefactoren zijn gemodificeerd met O-GlcNAc . In dierlijke cellen zijn ook alle vier de histonen substraten voor O-GlcNAc modificatie waarbij histon H3 het meest abundant gemodificeerd lijkt te zijn met dit suikerresidu. Er werden reeds verschillende O-GlcNAc sites geïdentificeerd: Thr101 van H2A, Ser36 en Ser112 van H2B, Ser47 van H4, Ser10, Thr32, Ser28 en Thr3 van H3. Histon OGlcNAc modificaties zijn geassocieerd met histon modificaties die kenmerkend zijn voor zowel actief als inactief chromatine. Zo wordt H3 Ser10 O-GlcNAcylatie geassocieerd met inactief chromatine (verlies van H3K9Ac en verhoogd H3K9me) terwijl H2B Ser112 O-GlcNAcylatie de monoubiquitinylatie van H2BK120 bevordert, wat dan weer geassocieerd wordt met verhoogde transcriptie en dus actief chromatine (Hanover, 2006; Fujiki, et al., 2011; Zhang, et al., 2011; Fong, et al., 2012; Hanover, et al., 2012). In dierlijke cellen bestaat er een extensieve crosstalk tussen O-GlcNAcylatie en fosforylatie. Beide modificaties treden vaak in competitie voor dezelfde sites en ze zijn ook beiden celcyclus afhankelijk. Zo is de fosforylatie van Ser10, Ser28, Thr32 en Thr3 van H3 typisch voor de overgang van de G2 naar de M fase. O-GlcNAcylatie van Thr32 van H3 verhindert echter deze mitose-specifieke fosforylaties. Deze correlatie tussen O-GlcNAcylatie en celcyclus werd reeds aangetoond in dierlijke cellen, maar in plantencellen echter nog niet ( Hart, et al., 2007; Zhang, et al., 2011; Fong, et al., 2012; Hanover, et al., 2012). 10 O-GlcNAcylatie in planten De meeste informatie omtrent O-GlcNAcylatie komt uit onderzoek op dierlijke cellen. Over OGlcNAcylatie in plantencellen is echter minder geweten. Planten beschikken over twee verschillende OGT’s: de SPY (SPINDLY) en SEC (SECRET AGENT) type OGT’s, terwijl dieren en fungi beschikken over slechts één OGT van het SEC type (Hartweck, et al., 2002; Banerjee, et al., 2009). OGT’s bevatten meerdere tetratricopeptide herhalingen (TPR’s), welke dienst doen als proteïne-proteïne interactie domein. Naast dit proteïne bindend domein beschikken ze ook over een katalytisch domein (D'Andrea and Regan, 2003). Men vermoedt dat SEC en SPY overlappende functies hebben. Dubbele sec/spy mutante embryo’s sterven bijvoorbeeld prematuur, maar niet op een vast tijdstip in de ontwikkeling. Dit suggereert dat embryonale dood optreedt wanneer O-GlcNAcylatie beneden een bepaalde drempelwaarde zakt. Dit doet dus vermoeden dat beide enzymes een overlappende rol spelen of dat ze verschillende onafhankelijke processen sturen die allen moeten verhinderd worden vooraleer premature dood optreedt (Hartweck, et al., 2002; Olszewski, et al., 2010). Om het belang van OGT’s (en dus van O-GlcNAcylatie) in planten na te gaan werden spy en sec mutanten gescreend op veranderingen in bepaalde fysiologische processen. Bij sec mutanten werden veel minder ingrijpende fysiologische veranderingen waargenomen in vergelijking met de spy mutanten, waardoor men denkt dat SPY ofwel veel actiever is, ofwel dat SPY unieke, belangrijke processen reguleert waarbij SEC niet tussenkomt. Spy mutanten vertoonden echter wel grote verschillen vergeleken met de wild type planten (Hartweck, et al., 2002; Hartweck, et al., 2006; Olszewski, et al., 2010). Zo zou SPY een negatieve regulator zijn van de gibberelline (GA) respons. GA respons treedt op wanneer bepaalde transcriptiefactoren, de zogenaamde DELLA proteïnen, proteolytisch afgebroken worden. De hypothese luidt dat modificatie van de DELLA proteïnen met O-GlcNAc zou zorgen voor stabiliteit en activiteit van deze proteïnen, waardoor ze niet worden afgebroken en de GA respons bijgevolg wordt tegengehouden. Bewijs voor deze hypothese blijkt ook uit een studie op rijst waarbij SPY expressie werd verminderd door gebruik te maken van antisense RNAi. Deze verminderde SPY activiteit ging samen met activering van de GA respons en een verhoogde fosforylatie van de DELLA proteïnen. Bij dieren is aangetoond dat O-GlcNAcylatie en fosforylatie in competitie treden voor dezelfde aminozuur residuen. Vandaar zou de verhoogde fosforylatie kunnen wijzen op een verminderde O-GlcNAcylatie, waardoor de DELLA proteïnen kunnen afgebroken worden en de GA respons kan optreden. Deze wisselwerking tussen fosforylatie en O-GlcNAcylatie is typisch in dierlijke cellen, maar voor planten is hieromtrent weinig geweten (Shimada, et al., 2006; Olszewski, et al., 2010). SPY speelt ook een rol in cytokinine respons. SPY zou een positieve regulator zijn van de cytokinine respons aangezien bij spy mutanten de cytokinine respons verhinderd wordt (Greenboim-Wainberg, et al., 2005; Maymon, et al., 2009). SPY interageert ook met het Arabidopsis proteïne GIGANTEA (GI). Dit eiwit komt tussen bij de regulatie van verschillende circadiaanse processen maar ook bij andere processen zoals de respons op rood licht, hypocotyl elongatie en bloei-inductie. 11 Verder vermoedt men dat SPY de wortelontwikkeling beïnvloedt en dat het (in rijst) een negatieve regulator van brassinosteroïde biosynthese is (Fowler, et al., 1999; Tseng, et al., 2004; Olszewski, et al., 2010). O-GlcNAcylatie zou in planten ook een rol spelen bij intercellulair transport via de plasmodesmata. Deze laatste structuren zijn namelijk homoloog aan het nucleair poriëncomplex van dierlijke cellen, waarvan geweten is dat ze extensief gemodificeerd zijn met O-GlcNAc. Verder is ook aangetoond dat verschillende ‘non-cell autonomous proteins’ (NCAPS), eiwitten die van cel naar cel bewegen, gemodificeerd zijn met O-GlcNAc (Lee, et al., 2000; Taoka, et al., 2007; Hanover, et al., 2010). Ten slotte dient nog opgemerkt te worden dat onderzoek naar O-GlcNAcylatie in planten niet zo voor de hand liggend is. Slechts weinig plantaardige eiwitten die gemodificeerd zijn met O-GlcNAc werden geïdentificeerd en commerciële antilichamen tegen O-GlcNAc zijn vaak wel compatibel met dierlijke cellen, maar kunnen niet-specifiek reageren met plantaardige proteïnen (Kilcoyne, et al., 2009; Olszewski, et al., 2010). 1.5 Interactie tussen histonen en Nictaba Schouppe et al. toonden in 2011 aan de hand van lectine affiniteitschromatografie en pull-down assays aan dat Nictaba interageert met O-GlcNAc gemodificeerde histonen. Proteïnen werden geëxtraheerd uit de kern van Xanthi cellen en over een Nictaba-sepharose 4B kolom gestuurd. De geëlueerde proteïnen werden geïdentificeerd met behulp van Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS). De geëlueerde proteïnen bleken vooral de histonen H2A, H2B, H3 en H4 te zijn. Binding van Nictaba met H2B werd bevestigd door middel van affiniteitschromatografie door zuivere histonen van kalfthymus over de Nictaba kolom te sturen. De kalfhistonen konden van de kolom geëlueerd worden met behulp van GlcNAc oligomeren en ze vertoonden ook affiniteit t.o.v. het ‘wheat germ agglutinin’ (WGA: een lectine waarvan men weet dat het met GlcNAc en O-GlcNAc bindt). Verder was er ook reactie tussen de histonen geëlueerd van de Nictaba en WGA kolommen met een O-GlcNAc antilichaam en kon aan de hand van MS analyse bevestigd worden dat de histonen gemodificeerd waren met O-GlcNAc. Dit alles doet vermoeden dat histonen met Nictaba binden via hun O-GlcNAc modificaties (Schouppe, et al., 2011). 1.6 Enkele technieken voor lectine–glycoproteïne interactieonderzoek 1.6.1 Lectine affiniteitschromatografie Lectine affiniteitschromatografie is een veelgebruikte methode voor de karakterisatie van lectine – glycoproteïne interacties. Hierbij worden glycoproteïnen gestuurd over een kolom met geïmobiliseerd lectine. Het elutieprofiel geeft dan informatie over de specificiteit van de liganden. 12 Lectine affiniteitschromatografie is een eenvoudige methode maar geeft slechts beperkte informatie omtrent de bindingsaffiniteit. Het is moeilijk om de associatie – en dissociatieconstanten KA en KD te bepalen uitgaande van de elutiedata (Safina, 2012). 1.6.2 Pull Down Assay Bij Pull Down Assays gaat men een bepaald ‘prey’ proteïne vangen met behulp van een ‘bait’ proteïne. Op die manier kan men mogelijke interactiepartners van het ‘bait’ proteïne identificeren of vermoedens omtrent interacties tussen beide proteïnen bevestigen. Het ‘bait’ proteïne wordt als een fusieproteïne tot expressie gebracht waarbij het voorzien wordt van een bepaalde tag, zoals een polyhistidine tag. Via deze tag wordt het ‘bait’ proteïne gekoppeld aan een inert residu, zoals bijvoorbeeld agarose beads. Proteïnen die interacties aangaan met het bait proteïne gaan vervolgens binden. Ten slotte wordt de binding tussen het proteïnecomplex en de inerte drager verbroken en kan op gel geanalyseerd worden welke proteïnen deel uitmaken van het gevormde interactiecomplex (Arifuzzaman, et al., 2006; www.piercenet.com). Figuur 5: Schematisch overzicht van een Pull Down Assay (www.piercenet.com) 13 1.6.3 Far Western Blotting Far Western blotting is een techniek afgeleid van de conventionele western blot analyse om proteïne-proteïne interacties te detecteren. Bij conventionele western blotting gaat men het proteïne op de gel gaan detecteren m.b.v. antilichamen tegen dit proteïne. Bij far western blotting gaat men de blot (met daarop het ‘prey’ proteïne) eerst gaan incuberen met een mogelijke interactiepartner (het ‘bait’ proteïne) en gaat men vervolgens gaan detecteren m.b.v. antilichamen tegen dit ‘bait’ proteïne. Wanneer men een signaal krijgt ter hoogte van het ‘prey’ proteïne op de blot, weet men dat de twee proteïnen interactiepartners zijn. Aangezien secundaire en tertiaire proteïnestructuren een cruciale rol spelen bij het tot stand komen van proteïne interacties en proteïnen gedenatureerd worden door natriumdodecylsulfaat (SDS), is bij far western blotting vaak nog een denaturatie/renaturatie stap vereist van het ‘prey’ proteïne op de membraan (Wu, et al., 2007). 1.6.4 Biosensoren gebaseerd op Surface Plasmon Resonance (SPR) Hieronder zal het verschijnsel ‘surface plasmon resonance’ uitgelegd worden en hoe biosensoren gebaseerd op SPR kunnen gebruikt worden voor de studie van lectine-glycoproteïne interacties. Wanneer licht van een medium met hoge brekingsindex (bijv. glas) onder een welbepaalde invalshoek invalt op een medium met lage brekingsindex (bijv. water) wordt het licht gebroken naar het raakvlak van beide media toe. Vanaf een welbepaalde kritische hoek zal totale interne reflectie optreden. Wanneer er zich een goudlaagje op het glas bevindt zal een deel van het gereflecteerde licht omgezet worden in een soort elektrisch veld, ook wel ‘evanescent wave’ genoemd. Dit veld plant zich voort in het medium met lage brekingsindex tot een diepte van enkele honderden nanometer, waarbij de intensiteit van het veld exponentieel afneemt met de diepte. De ‘evanescent wave’ interageert met mobiele elektronen aanwezig in het goudlaagje, ‘surface plasmons’ genaamd. Bij een welbepaalde invalshoek gaat het moment van de fotonen gelijk zijn aan het moment van de ‘surface plasmons’ en treedt resonantie op, wat aanleiding geeft tot energietransfer in plaats van reflectie. De hoek waarbij SPR optreedt wordt de resonantiehoek genoemd. SPR kan waargenomen worden als een dipje in de intensiteitscurve van het gereflecteerde licht onder een welbepaalde hoek (Figuur 6). De meest gekende SPR-gebaseerde biosensor is deze van Biacore AB. Het ligand wordt geïmobiliseerd op het goudlaagje in het stroomkanaaltje van de sensor chip. De mogelijke bindingspartner stroomt continu door het kanaaltje. Wanneer zich binding voordoet, veranderen de resonantiecondities. De brekingsindex in de nabijheid van het sensoroppervlak vergroot waardoor er een verschuiving is van de resonantiehoek (Figuur 6A). In een sensorgram wordt deze verandering van de brekingsindex geplot als Resonance Units (RU) in functie van de tijd. Dissociatie van de bindingspartners leidt dan weer tot een afname van de SPR respons (Figuur 6B). SPR laat toe de specifieke interactiekinetiek te bepalen (Safina, et al., 2011; Safina, 2012). 14 Bij surface plasmon resonance imaging (SPRi) zijn verschillende liganden op verschillende locaties aangebracht op de sensorchip. Dit laat toe om tegelijk verschillende interacties te bestuderen. Een camera neemt het gereflecteerde licht waar en kan het signaal op die manier op de chip lokaliseren, waardoor men weet om welke interactie(s) het gaat (Scarano, et al., 2010) (Figuur 7). A B Figuur 6: A: Het principe van SPR en de implementatie ervan bij biosensoren. B: Sensorgram (Safina, 2012) Figuur 7: Het principe van SPRi: op verschillende locaties op de chip zijn verschillende liganden gebonden. Aan de hand van beeldvorming kan men dan nagaan om welke lectine-glycaan interacties het gaat (Safina, 2012) 15 2 Doelstelling Deze masterproef handelt over de interactie tussen histonen opgezuiverd uit BY-2 cellen en het lectine Nicotiana tabacum agglutinine, of kortweg Nictaba. Het lectine is reeds beschikbaar in het labo maar de histonen zullen nog moeten opgezuiverd worden vertrekkende van celculturen. Opdat de interactie tussen Nictaba en histonen kan plaatsvinden is het belangrijk dat de histonen gemodificeerd zijn met O-gelinkte N-actetylglucosamine (O-GlcNAc) residuen, aangezien het deze suikerstructuren zijn waarmee Nictaba kan interageren. Het is dus belangrijk dat wordt nagegaan of de opgezuiverde histonen over deze suikerstructuur beschikken. Hierna zal door middel van verschillende biochemische analysetechnieken de interactie in vitro bestudeerd worden. In eerste instantie zal een protocol voor het opzuiveren van histonen uit BY-2 cellen opgesteld worden. Na de omvorming van cellen tot protoplasten, kunnen hieruit vervolgens de kernen geëxtraheerd worden. Aangezien histonen zuuroplosbaar zijn, zullen de kernen ten slotte onderworpen worden aan een zuurextractie om een eiwitfractie aangerijkt aan histonen te verkrijgen. Om te bevestigen dat de opgezuiverde eiwitten effectief histonen zijn, zal nadien een sodium dodecyl sulfaat polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) uitgevoerd worden. Een western blot met antilichamen tegen histonen kan hierbij volledige zekerheid brengen. Wanneer er voldoende histonen verkregen zijn, kan de interactie tussen deze eiwitten en Nicataba onderzocht worden. De aanwezigheid van O-GlcNAc structuren op de histonen zal nagegaan worden via een Western Blot analyse met een antilichaam specifiek voor O-GlcNAc. Vervolgens kan aan de hand van verschillende analysetechnieken onderzocht worden of er effectief een interactie is tussen de histonen en het lectine Nictaba. Zo zullen opgezuiverde histonen over een Nictabakolom gestuurd worden in een lectine-affiniteitschromatografie experiment. Ook zal er een Pull-Down assay uitgevoerd worden, gebruik makend van zowel opgezuiverde histonen als een volledig kernextract van BY-2 cellen. Verder zou er ook geopteerd worden voor een Far Western blot experiment en, indien er genoeg tijd is, voor een surface plasmon resonance (SPR) analyse. Uit de literatuur blijkt dat de modificatie van histonen in dierlijke cellen met O-GlcNAc afhankelijk is van het tijdstip in de celcyclus. In planten is dit echter niet bevestigd. Vandaar zal geprobeerd worden om BY-2 cellen te synchroniseren met behulp van de drug aphidicoline. Vervolgens zullen gedurende de celcyclus cellen gecollecteerd worden waarop dan later analyses kunnen uitgevoerd worden. Hierbij zal eerst nagegaan worden of de synchronisatie effectief geslaagd is. Hiervoor kan men beroep doen op flow cytometrie of kan men de mitotische index bepalen via microscopie. Histonen zullen ook opgezuiverd worden uit de cellen gecollecteerd op de verschillende tijdspunten van de celcyclus. Hierna zal door middel van een western blot analyse met een antilichaam specifiek voor O-GlcNAc, gekeken worden wat de graad van O-GlcNAc modificatie is. 16 Dit laat toe om verschillen in deze modificatie doorheen de celcyclus te detecteren. Op de cellen, gecollecteerd op de verschillende tijdspunten, zal ook een RNA extractie uitgevoerd worden. Hiernaast zal met behulp van kwantitatieve Polymerase Chain Reaction (qPCR) het expressieniveau van het enzym O-GlcNAc transferase (OGT) nagegaan worden. Dit kan eveneens een indicatie zijn van de graad van O-GlcNAc modificatie. 17 3 Materiaal en methoden 3.1 Werken met celculturen 3.1.1 Opgroeien van BY-2 cellen BY-2 cellen worden opgegroeid als suspensieculturen in vloeibaar BY-2 medium. Voor het aanmaken van één liter vloeibaar BY-2 medium wordt 4,3 g Murashige & Skoog medium (Duchefa), 30 g sucrose (VWR) en 0,2 g KH2PO4 (VWR) afgewogen. Dit mengsel wordt aangelengd met dubbel gedestilleerd water (bidest) tot een totaal volume van één liter. Na instellen van de pH op een waarde van 5,7 – 5,8 wordt het medium geautoclaveerd. Het opgroeien van de cellen gebeurt bij 25°C terwijl de cellen geschud worden aan 150 toeren per minuut. Wekelijks wordt 2 ml van een oude celcultuur overgebracht naar 40 ml vers medium waaraan 40 µl BY-2 vitaminen (0,4 g/L 2,4D auxine (Duchefa) opgelost in ethanol (VWR), 1 g/L thiamine (Duchefa), 100 g/L myo-inositol (Duchefa)) zijn toegevoegd. 3.1.2 Synchronisatie van BY-2 cellen 3.1.2.1 Synchronisatie van cellen met behulp van de drug aphidicoline Een stockoplossing van 10 mg/ml aphidicoline (Sigma-Aldrich) in dimethylsulfoxide (DMSO) (VWR) wordt aangemaakt en bewaard bij 4°C. Aan 95 ml vers BY-2 medium wordt 52,5 µl van deze aphidicoline stockoplossing toegevoegd zodat een eindconcentratie van 5 mg/L wordt bekomen. Vervolgens zet men 10 ml van een 7 dagen oude celcultuur over in dit aphidicoline bevattende BY-2 medium. Hierdoor worden alle cellen geblokkeerd in de vroege S-fase. Na incubatie van de cellen bij 25°C en 150 t.p.m. moet de drug weggewassen worden zodat de cellen gelijktijdig de celcyclus kunnen hervatten. Het wegwassen van de drug gebeurt volgens de opstelling weergegeven in figuur 8. Hierbij wordt de celcultuur in een buchner-trechter gegoten met miracloth (31 µm) om de cellen te weerhouden. Het is belangrijk dat de cellen nooit lange tijd droog komen te staan tijdens de wasprocedure. 18 Figuur 8: Opstelling voor wegwassen van aphidicoline uit celcultuur (Kumagai-Sano, et al. 2006) Deze wasprocedure dient herhaald te worden totdat één liter wasmedium verbruikt is. De laatste 10 ml wasmedium worden behouden en hierin worden de gewassen cellen geresuspendeerd. Deze gewassen celcultuur wordt vervolgens overgebracht naar vers BY-2 medium en de cellen worden opnieuw gegroeid bij 25°C en 150 t.p.m. Op die manier kunnen de inmiddels gesynchroniseerde cellen de celcyclus hervatten (Kumagai-Sano, et al., 2006). 3.1.2.2 Controle van synchronisatie Bepalen van de mitotische index (MI) Om synchronie van BY-2 cellen na te gaan worden elk uur (en dit gedurende de duur van de celcyclus: ongeveer 15 uur) stalen genomen om de mitotische index (MI) te bepalen. De MI is de verhouding van het aantal cellen dat mitose ondergaat, ten opzichte van het totaal aantal cellen van een celpopulatie. De verandering van de MI doorheen de celcyclus geeft informatie omtrent de graad van synchronie. Elk uur wordt 500 µl celcultuur verzameld in een 1,5 ml epje. Nadat de cellen bezonken zijn, wordt het supernatans afgenomen. De cellen worden vervolgens gefixeerd door 500 µl Carnoy fixatief (een 1:3 verdunning van ijsazijnzuur (Merck) in 100% ethanol (VWR)) toe te voegen. De cellen worden 15 minuten geïncubeerd in dit fixatief. Vervolgens worden de cellen gewassen met 1 ml BY-2 medium waarna ze gedurende één minuut afgecentrifugeerd worden aan 5000 t.p.m. Het supernatans wordt verwijderd en 5µl DAPI (1 µg/ml) wordt toegevoegd aan de cellen. Hierna wordt de wasprocedure 19 herhaald. Na het verwijderen van het supernatans wordt 100 µl van de gefixeerde cellen op een draagglaasje aangebracht voor microscopische analyse. Met behulp van een fluorescentiemicroscoop en DAPI kleuring wordt het aantal cellen in mitose geteld (cellen in profase tot en met telofase) en de MI wordt bepaald. Per staal dienen minstens 200-400 cellen geteld worden (voor meer informatie omtrent microscopische analyse: zie 2.3). Controle van synchronisatie: flow cytometrische analyse Elk uur (gedurende 15 uur) worden de cellen uit 2 ml celcultuur geoogst en met behulp van een vacuümpomp geconcentreerd op een glasfilter. Vervolgens worden de cellen ingevroren bij -80°C. Na ontdooien wordt 1 ml Galbraith buffer (45 mM MgCl2 (VWR), 30 mM Na-citraat (VWR), 20 mM MOPS (VWR) en 1 g /l Triton X-100 (Across), pH= 7,0) toegevoegd en worden de cellen versneden met behulp van een scheermesje. De suspensie wordt vervolgens gefiltreerd over een 40 µm filter (BD Falcon REF 352340). Aan 400 µl van het bekomen filtraat wordt 50 µl propidium iodide (PI) (0,5 mg/ml) toegevoegd en dit mengsel wordt geanalyseerd aan de hand van flow cytometrie (in samenwerking met Drs Nico De Storme, vakgroep Plantaardige Productie, UGent). Het propidium iodide zal binden met het DNA en zorgen voor fluorescentie welke waargenomen wordt door de flow cytometer (Epics Altra; Beckman) (Figuur 9). Figuur 9: De werking van een flow-cytometer. Een laser exciteert de fluorescente moleculen in de cel (PI) en het fluorescentiesignaal (rood) wordt gemeten. (http://www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&rid=11446) 20 3.2 Histonopzuivering 3.2.1 Protocol 1 voor histonopzuivering, verkregen van Drs Daniel Buszewicz (Universiteit Warschau, Polen) BY-2 cellen worden geoogst via vacuümfiltratie. Deze cellen worden vervolgens gehomogeniseerd met behulp van vloeibare stikstof en een mortier. Eén gram van het verkregen celpoeder wordt gebruikt voor één opzuivering. Het poeder wordt opgelost in een histon isolatiebuffer (HI) (10 mM Tris-HCl (Sigma), 2mM EDTA (MP), 0,25 M HCl (VWR), 5 mM β-mercaptoethanol (Sigma), 0,2 mM PMSF (Roche), pH = 7,5), met als doel de vrijgekomen histonen te scheiden van de rest van het celmateriaal. Histonen zijn immers zuuroplosbaar en kunnen dus op basis van deze eigenschap gescheiden worden van de andere eiwitten. Het celmateriaal wordt vervolgens verder gehomogeniseerd door te vortexen in de HI buffer in aanwezigheid van glazen beads. Het homogenaat wordt gefiltreerd door een dubbele laag miracloth (31 µm) om resterende grote stukken celmateriaal te verwijderen. Het filtraat wordt gedurende 15 minuten gecentrifugeerd bij 4°C aan 12 000 g. Het supernatans wordt behouden en hieraan wordt 100% trichloorazijnzuur (TCA) (VWR) toegevoegd tot een finale concentratie van 25 % om de histonen te precipiteren. Dit mengsel wordt overnacht geïncubeerd bij 4°C op een rotator (Stuart, SB3). Hierna wordt gecentrifugeerd aan 16 000 g gedurende 40 minuten bij 4°C om een pellet te bekomen die aangerijkt is aan histonen. De pellet wordt tweemaal gewassen met ijskoude aceton (VWR) (na elke wasstap opnieuw 40 minuten centrifugeren bij 4°C aan 16 000 g). Tenslotte wordt de pellet aan de lucht gedroogd en wordt de eiwitfractie opgelost in 300 µl water. 3.2.2 Protocol 2 voor histonopzuivering (Trivedi, et al., 2012) Er wordt gestart met ongeveer 7 g BY-2 cellen of 7 g jong bladmateriaal van Nicotiana tabacum. Het materiaal wordt gehomogeniseerd met behulp van vloeibare stikstof en een mortier. Aan het verkregen poeder worden ongeveer zes volumes homogenisatiebuffer toegevoegd (1 M hexyleenglycol (Aldrich), 10 mM HEPES (Duchefa), 10 mM MgCl2 (VWR), 0,5 % Triton X-100 (Across), 5 mM β-mercaptoethanol (β-ME) (Sigma), 0,8 mM PMSF (Roche), pH=7 met KOH). Het homogenaat wordt vervolgens gefiltreerd door nylon (100 µm mesh) en Triton-X-100 wordt toegevoegd aan het filtraat tot een finale concentratie van 0,5 % (v/v). Het homogenaat wordt hierna nogmaals gefiltreerd, ditmaal door miracloth (31 µm mesh). Een centrifugatiestap van 10 minuten bij 4°C aan 3000 g zorgt ervoor dat een pellet van kernen gevormd wordt. Deze wordt geresuspendeerd in nuclei wasbuffer (0,5 M hexyleenglycol (Aldrich), 10 mM HEPES (Duchefa), 10 mM MgCl2 (VWR), 0,5 % Triton X-100 (Across), 5 mM β-ME (Sigma), 0,8 mM PMSF (Roche), pH= 7 met KOH) om de kernen te wassen. Percoll oplossingen van 80%, 60% en 40% percoll worden gemaakt door percoll buffer (Tabel 1) te verdunnen in percoll dilutie buffer (Tabel 2). 21 Percoll buffer Sucrose (VWR) 500 mM Tris-HCl (Sigma) pH 8 25 mM MgCl2 (VWR) 10 mM Triton-X-100 (Across) 0,5 % β-mercaptoethanol (β-ME) 5 mM (Sigma) PMSF (Roche) 0,8 mM Componenten opgelost in 100% Percoll Percoll dilutie buffer Sucrose (VWR) 500 mM Tris-HCl (Sigma) pH 8 25 mM MgCl2 (VWR) 10 mM Triton-X-100 (Across) 0,5 % β-mercaptoethanol (β-ME) 5 mM (Sigma) PMSF (Roche) 0,8 mM Componenten opgelost in bidest Tabel 1: Samenstelling percoll buffer Tabel 2: Samenstelling percoll dilutie buffer Vervolgens wordt in een 10 ml glazen buis een gradiënt gemaakt die van onder naar boven bestaat uit respectievelijk sucrose buffer (2 M sucrose (VWR), 25 mM Tris-HCl (Sigma) (pH=8), 10 mM MgCl2 (VWR), 0,5 % Triton X-100 (Across), 5 mM β-ME (Sigma), 0,8 mM PMSF (Roche)), 80% percoll, 60% percoll en 40% percoll. Hierop wordt 1 ml van de gesuspendeerde kernen in nuclei wasbuffer gebracht waarna deze gradiënt onderworpen wordt aan centrifugatie gedurende 30 minuten bij 4°C aan 3000 g. Na centrifugatie kunnen de kernen gecollecteerd worden tussen de sucrose en de 80% percoll laag. Hierna worden de nuclei gewassen in nuclei wasbuffer en opnieuw afgedraaid gedurende 10 minuten bij 4°C aan 3000 g. De bekomen pellet van kernen wordt aan een zuurextractie onderworpen door ze op te lossen in 0,2 M H2SO4 en te vortexen. Op die manier worden de zuuroplosbare histonen gescheiden van de overige nucleaire proteïnen. Na de kernen een nacht te incuberen in H2SO4 op een rotator (Stuart, SB3), wordt 10 minuten gecentrifugeerd aan 16 000 g om nucleair debris te verwijderen. Het supernatans met daarin de histonen wordt behouden en hieraan wordt 100% TCA toegevoegd tot een finale concentratie van 33% om de histonen te precipiteren. Het supernatans- TCA mengsel wordt overnacht op ijs geïncubeerd om een zo hoog mogelijke efficiëntie van histonprecipitatie te bewerkstelligen. De volgende dag worden de histonen gepelleteerd door centrifugeren gedurende 10 minuten bij 4°C aan 16 000 g. De pellet wordt tweemaal gewassen met ijskoude aceton (VWR), waarna telkens opnieuw gecentrifugeerd wordt bij 4°C aan 16 000 g gedurende 5 minuten. Nadat de histonpellet gedroogd werd aan de lucht, worden de histonen opgelost in een gepast volume bidest. 3.2.3 Eigen samengesteld protocol voor histonopzuivering Cellen van 4 dagen oud (typisch 4-8 g) worden geoogst via vacuümfiltratie en gedurende 3 uur bij 37°C geïncubeerd in enzymoplossing (2% cellulase RS (Duchefa), 1% macerozyme (Yakult), 0,1 % pectolyase (Duchefa), 0,4 M mannitol (VWR), 40 mM CaCl2 (VWR), 10 mM MES (Sigma) buffer, pH= 5,5) met als doel de celwand te verwijderen en protoplasten te verkrijgen. Hierna worden de protoplasten gefiltreerd door 100 µm nylon en wordt er wasbuffer (10 mM MES, 0,4 M mannitol (VWR), pH 6,7) over de filter gegoten zodat alle protoplasten door de filter gaan. De protoplasten worden gedurende 5 minuten afgedraaid aan 200 g en gewassen met wasbuffer. De gewassen 22 protoplasten worden vervolgens opgelost in 3 ml 20% ficoll (Sigma) (aangemaakt in wasbuffer) en hierop wordt een gradiënt van respectievelijk 10% en 0% (= zuivere wasbuffer) ficoll gebracht. Na 30 minuten centrifugeren bij 4°C aan 160 g worden de protoplasten gecollecteerd vanuit de 10%-0% interfase. Vervolgens worden de protoplasten gelyseerd door ze op te lossen in ijskoude nuclei isolatie buffer (NIB) (20 mM KCl (VWR), 20 mM HEPES (Duchefa), 0,6 % Triton X-100 (Across), 13,8% hexyleenglycol (Aldrich), 20 mM β-ME (Sigma), 50μM spermine (Sigma), 125 μM spermidine (Sigma), 1mM PMSF (Roche), 2 μg/ml apoprotinine (Sigma), pH = 7,4). Hierna worden de protoplasten mechanisch gescheurd door ze te onderwerpen aan zes tot acht passages door een 0,45 x 12 mm naald (Terumo). Vervolgens wordt de suspensie van gescheurde protoplasten gefiltreerd door 31 µm miracloth zodat niet gelyseerde protoplasten verwijderd worden. Het filtraat wordt op een 36%-25% iodixanol (Sigma) gradiënt gebracht, welke gedurende 30 minuten bij 4°C aan 3000 g gecentrifugeerd wordt. Nuclei worden hierna uit de 36%-25% interfase gecollecteerd en tweemaal gewassen met NIB buffer zonder Triton-X-100, waarna telkens opnieuw wordt gecentrifugeerd aan 3000 g bij 4°C. Vanaf hier verloopt het protocol hetzelfde als histonopzuivering protocol 2 (zie 2.2.2), samengevat: de kernen worden onderworpen aan zuurextractie en celdebris wordt verwijderd, waarna de histonen worden geprecipiteerd met 100% TCA, afgecentrifugeerd en opgelost in bidest. 3.3 Microscopie Voor de microscopische analyses werd een NIKON Ti geïnverteerde widefield fluorescentiemicroscoop voorzien van een CCD camera (Nikon) gebruikt. Bij de histonopzuivering was microscopie nodig om na te gaan of mooie protoplasten werden gevormd en later om via DAPI kleuring te controleren of mooie kernen bekomen werden. Voor de controle van de celsynchronisatie aan de hand van de mitotische index werd een DAPI kleuring uitgevoerd en analyse gebeurde door middel van de fluorescentiemicroscoop. Er werd telkens gebruik gemaakt van een 40X objectief en lucht als medium tussen het specimen en het objectief. 3.4 Algemene moleculaire technieken 3.4.1 RNA extractie Cellen worden gehomogeniseerd gebruik makend van een mortier en vloeibare stikstof. Het bekomen poeder wordt overgebracht naar een 2 ml epje waaraan 1 ml Tri-reagens (Sigma) wordt toegevoegd. Vervolgens wordt het mengsel gedurende 10 minuten geïncubeerd bij kamertemperatuur, gevortexed en 5 minuten gecentrifugeerd aan 14 300 g. Het supernatans wordt naar een vers epje gebracht en er wordt 250 µl chloroform (VWR) toegevoegd. Hierna wordt het mengsel gedurende 15 seconden geschud waarna het 2 tot 3 minuten geïncubeerd wordt bij 23 kamertemperatuur. Dan wordt het mengsel gecentrifugeerd gedurende 15 minuten aan 16 000 g waardoor 3 verschillende lagen zichtbaar worden. Het bovenste waterige laagje bevat het RNA, het tweede laagje bestaat uit DNA en het onderste laagje zijn eiwitten. Het waterige laagje dient dus behouden te worden en wordt overgebracht naar een vers epje waaraan 0,5 ml isopropanol (VWR) wordt toegevoegd. Er wordt vervolgens zachtjes geschud en opnieuw gedurende 10 minuten geïncubeerd bij kamertemperatuur. Hierna wordt gedurende 10 minuten gecentrifugeerd aan 14 300 g bij een temperatuur van 4°C waardoor een gelachtige witte RNA pellet verkregen wordt. Het supernatans wordt verwijderd en de pellet wordt gewassen door 1 ml 75% ethanol (VWR) toe te voegen en te vortexen. Hierna dient opnieuw gecentrifugeerd te worden gedurende 5 minuten aan 5100 g bij 4°C, om opnieuw een RNA pellet te verkrijgen. Nadat de pellet aan de lucht gedroogd is kan het RNA opgelost worden in 50 µl bidest en kan de RNA concentratie gemeten worden met behulp van de Nanodrop 2000 (Thermo scientific) (zie 2.4.6.1). Vervolgens wordt het opgezuiverde RNA behandeld met DNAse om het eventueel aanwezige DNA te elimineren. Hiervoor wordt 12 µl opgezuiverd RNA in een nieuw epje gebracht waaraan 2 µl DNAse buffer (10x), 2 µl DNAse I en 4 µl MilliQ H2O worden toegevoegd. Dit mengsel wordt gedurende 30 minuten op 37°C geplaatst. Hierna wordt aan het mengsel 2 µl EDTA (25 mM) toegevoegd waarna 10 minuten geïncubeerd wordt bij 65 °C. Na deze DNAse behandeling kan opnieuw de RNA concentratie bepaald worden (zie 2.4.6). 3.4.2 cDNA synthese en reverse transcription PCR (RT-PCR) Voor de cDNA synthese wordt gebruik gemaakt van de M-MLV reverse transcriptase kit van Invitrogen. Eén microgram van DNAse behandeld RNA wordt in een PCR epje gebracht. Hieraan worden 1 µl oligo-dT primer (evd 233, 2 µM), 1 µl deoxynucleotiden (dNTP’s, 10 mM) en MilliQ H 2O, tot een finaal volume van 12 µl, toegevoegd. Het mengsel wordt vervolgens gedurende 5 minuten geïncubeerd bij 65°C, waarna het onmiddellijk opnieuw afgekoeld wordt op ijs. Na het afkoelen wordt 4 µl M-MLV buffer en 2 µl DTT toegevoegd, waarna 2 minuten geïncubeerd wordt bij 37°C. Hierna wordt 1 µl M-MLV reverse transcriptase toegevoegd waarna gedurende 50 minuten geïncubeerd wordt bij 37°C. Om de reactie te stoppen wordt het mengsel gedurende 15 minuten bij 75°C geplaatst. 3.4.3 Polymerase Chain Reaction (PCR) De polymerase chain reaction is een techniek waarbij verschillende duizenden tot miljoenen kopieën van een specifieke DNA-sequentie worden geamplificeerd, uitgaande van een zeer kleine hoeveelheid DNA. De specificiteit van de reactie is het gevolg van de keuze van de primers: korte DNA fragmenten die complementair zijn aan de uiteinden van de te amplificeren sequentie en die door het polymerase (enzym dat DNA synthetiseert, complementair aan een enkelstrengig stuk DNA 24 dat fungeert als template) als basis gebruikt worden voor de verdere synthese van de DNA streng. Bij PCR volgen verschillende cycli, waarbij eerst verwarmd en vervolgens afgekoeld wordt, elkaar op. De opwarming zorgt ervoor dat het dubbelstrengig DNA opgesplitst wordt in enkele strengen waardoor de primers toegang krijgen tot het DNA. Afkoeling zorgt er vervolgens voor dat de primers kunnen binden aan het complementair DNA en de nieuwe DNA streng kan gesynthetiseerd worden. Op die manier ontstaat een kettingreactie waarbij het nieuwgevormde DNA als template dient voor de latere cycli. Het DNA wordt exponentieel geamplificeerd in de tijd (Bartlett and Stirling, 2003). De mastermix en het PCR programma voor het testen van het gevormde cDNA wordt weergegeven in tabellen 3 en 4. Component Volume (µl) cDNA dNTPs (10 mM) F primer (10 µM) R primer (10 µM) 10x KEY buffer + 15 mM MgCl2 1.5 µl 1 µl 1 µl 1 µl 2 µl Taq-polymerase (5 u/µl) 0.2 µl H2O 13.3 µl Tijd (s) 5’ 45’’ 30’’ 30’’ 5’ Temperatuur (°C) 95ËšC 95ËšC 60ËšC 72ËšC 72ËšC 40X Tabel 4: PCR programma Tabel 3: Samenstelling mastermix 3.4.4 Real-time Polymerase chain reaction (qPCR) Het verschil tussen de conventionele PCR en real-time PCR (ook wel quantitative polymerase chain reaction genaamd, vandaar de afkorting qPCR), is dat bij qPCR de hoeveelheid geamplificeerd DNA kan opgevolgd worden in real-time doordat een fluorescentiesignaal wordt geproduceerd waarvan de intensiteit gecorreleerd is aan de hoeveelheid geamplificeerd DNA. De fluorescentie komt tot stand door binding van de molecule SYBR green aan het gevormde dubbelstrengig DNA, waardoor een groen fluorescentiesignaal ontstaat. Op die manier laat qPCR toe om niveau’s van genexpressie na te gaan. De snelheid waarmee het fluorescentiesignaal toeneemt is namelijk een maat voor de hoeveelheid DNA die initieel aanwezig was. Wanneer de fluorescentie-intensiteit uitgezet wordt tegenover het aantal cycli, worden typische sigmoïdale curven bekomen. De CT waarde (cycle treshold) wordt gedefinieerd als het aantal cycli dat nodig is om een bepaalde fluorescentieintensiteit te bekomen. Hoe kleiner de CT waarde, hoe meer DNA er initieel aanwezig was (Figuur 10). Op die manier is het mogelijk om te bepalen of welbepaalde genen in verschillende situaties meer of minder tot expressie komen vergeleken met enkele referentiegenen. Het aantal reacties nodig voor een qPCR experiment wordt berekend door het totaal aantal te controleren genen (genen waarvan men expressie wil nagaan en referentiegenen) te vermenigvuldigen met het aantal stalen per gen en dit tenslotte te vermenigvuldigen met het aantal technische herhalingen (meestal drie). Verder moeten ook nog de reacties meegeteld worden die nodig zijn voor eventuele positieve en negatieve controles. Het gebruikte PCR toestel was de rotor25 Gene 3000 van Corbett Research. De mastermix voor één enkele qPCR reactie is weergegeven in tabel 5, het programma voor qPCR wordt weergegeven in tabel 6 en de gebruikte primers in tabel 7. Component 2x SensiMix™ SYBR 10µM FP 10µM RP water cDNA Totaal Volume (µl) 10 1 1 6 2 20 Tijd (s) 10 25 25 20 Tabel 5: Samenstelling mastermix voor één reactie Gen EF-1α NtubC2 L25 O-GlcNAcT Nt-H1 Nt-H3.3 Naam primer evd1073 evd1074 evd1080 evd1081 evd1075 evd1076 evd1067 evd1068 evd1069 evd1070 evd1071 evd1072 Temperatuur (°C) 95 95 60 45X 72 Tabel 6: Programma voor qPCR Sequentie primer TGAGATGCACCACGAAGCTC CCAACATTGTCACCAGGAAGTG CTGGACAGCAGACTGACATC CAGGATAATTTGCTGTAACAGATTA CCCCTCACCACAGAGTCTGC AAGGGTGTTGTTGTCCTCAATCTT ACCACGGGCAGCATATAAAG CAGGGCCAACAAGGAATACA TCTGCTAGAAAGGGGAGGAAG AACCACCCACAAAGATCCAG ATCTGCTCTGCTTTGTCGTG CCAGTATGCCACAGCCATT Tabel 7: Gebruikte primers voor RT-PCR en qPCR Figuur 10: Sigmoïdale qPCR curven 26 3.4.5 Agarose gelelektroforese Agarose gelelektroforese laat toe om DNA te scheiden op basis van grootte. Het negatief geladen DNA zal in een opgelegd elektrisch veld migreren weg van de negatieve pool, naar de positieve pool toe. Kleine DNA fragmenten zullen makkelijker en dus sneller migreren door de poriën van de agarosegel dan grote fragmenten. Op die manier wordt een scheiding bekomen op basis van grootte. Een 1,5% agarosegel wordt gemaakt door 1,5 g agarose (Invitrogen) op te lossen in 100 ml 0,5 M TrisAzijnzuur-EDTA buffer (TAE buffer) door opkoken. De 50x TAE stockoplossing bevat 2M Tris (Sigma), 0,05 M EDTA (pH 8) en 5.7% ijsazijnzuur (Merck). De gel wordt vervolgens gegoten en nadat deze gestold is, wordt het DNA op de gel geladen. Hiervoor wordt 5 µl DNA gemengd met 1,6 µl loading dye (Fermentas). Als merker wordt 4 µL Mass RulerTM DNA Ladder Mix (Fermentas) gebruikt. De elektroforese wordt vervolgens uitgevoerd gedurende 20-30 minuten bij 100 V. Om de DNA bandjes te visualiseren wordt de gel gedurende 15 minuten in een ethidiumbromide oplossing geïncubeerd, waarna het Gel doc XR systeem (Bio-rad) visualisatie van de DNA fragmenten mogelijk maakt. 3.4.6 DNA en RNA concentratiebepaling De Nanodrop 2000 (Thermo Scientific) is een toestel voor het meten van nucleïnezuur- en eiwitconcentraties. 2 µl RNA of DNA oplossing wordt op de nanodrop gebracht en de concentratie wordt geschat aan de hand van de absorptie bij 260 nm. Hiernaast wordt ook een 260/280 absorptieratio weergegeven welke informatie omvat omtrent de zuiverheid van het opgezuiverde RNA of DNA. Een 260/280 ratio van ongeveer 2 wordt beschouwd als zuiver. 3.5 Eiwit analysetechnieken 3.5.1 Concentratiebepaling 3.5.1.1 Concentratiebepaling met behulp van de Nanodrop 2000 Hoewel de Nanodrop 2000 (Thermo Scientific) vooral wordt gebruikt om DNA of RNA concentraties te bepalen is er ook een optie om proteïneconcentraties te meten. Hiervoor wordt de absorptie bij 280 nm gebruikt als een maat voor eiwitconcentratie. Een 280/260 nm ratio geeft de zuiverheid weer van de eiwitoplossing. De software gebruikt standaard de correlatie: 1 absorptie-unit bij 280 nm komt overeen met 1 mg/ml. 27 3.5.1.2 Bradford proteïne assay Een aantal microliter van een proteïneoplossing waarvan men de concentratie wil weten, wordt verdund met bidest in een welletje van een 96-well plaat. Doorgaans gebruikt men drie herhalingen per staal. Aan elke welletje wordt vervolgens 250 µl Bradford reagens (Coomassie (Bradford) Proteïne Assay kit, Thermo Scientific) toegevoegd en de absorptie bij 595 nm wordt gemeten met de Tecan GENios Plus microplate reader. Het verkregen signaal wordt vergeleken met een standaardcurve (van commercieel verkrijgbare kalfhistonen) waar het absorptiesignaal van een standaardreeks is uitgezet tegenover de concentraties van de standaardreeks (50 µg/ml, 100 µg/ml, 250 µg/ml, 500 µg/ml, 750 µg/ml en 1000 µg/ml). 3.5.1.3 Pierce 660 nm proteïne assay De 660 nm proteïne assay is analoog aan de Bradford proteïne assay. Deze assay is echter minder gevoelig aan interferentie door detergenten. Aan het verdunde staal wordt 150 µl 660 nm proteïne assay reagens (Pierce 660 nm Protein Assay kit, Thermo Scientific) toegevoegd en de absorptie bij 660 nm wordt gemeten. Het bekomen signaal wordt opnieuw uitgezet tegenover een standaardcurve van commercieel verkrijgbare kalfhistonen (50 µg/ml, 100 µg/ml, 250 µg/ml, 500 µg/ml, 750 µg/ml en 1000 µg/ml). 3.5.2 SDS-PAGE Natriumdodecylsulfaat polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) is een elektroforesetechniek om eiwitten op basis van moleculaire massa te scheiden. Het SDS (Across) zorgt ervoor dat de eiwitten gedenatureerd worden, een lineaire conformatie aannemen en bovendien ook een negatieve lading krijgen. De negatieve lading is evenredig verdeeld over de lengte van het gelineariseerd proteïne waardoor de grootte van de negatieve lading evenredig is met de moleculaire massa. Zo kunnen eiwitten vervolgens gescheiden worden enkel op basis van moleculaire massa: de gel wordt onderworpen aan een spanningsveld en de negatief geladen eiwitten migreren van de negatieve pool naar de positieve pool (Figuur 11). De polyacrylamidegel bestaat uit twee delen: de ‘stacking’ gel, met als functie de eiwitten mooi op te lijnen vooraleer deze gescheiden worden en de ‘separating’ gel, welke de eiwitten effectief scheidt op basis van moleculaire massa. Tabellen 8 en 9 geven de samenstellingen weer van beide gels. 28 Separating gel (15 %) Stacking gel (4%) Aq. Dest. acrylamidemix 30% Tris-HCl 0,5 M pH 6,8 SDS-solution 10% APS (Gibco BRL) solution 10% TEMED 3,05 ml 650 μl 1,25 ml 50 μl 25 μl 5 μl (of 10) Tabel 8: Samenstelling ‘stacking’ gel Aq. Dest. acrylamidemix 30% Tris-HCl 1,5 M pH 8,8 SDS-solution 10% APS (Gibco BRL)- solution 10% TEMED 1,7 ml 2,0 ml 1,3 ml 50 μl 50 μl 2 μl Tabel 9: Samenstelling ‘separating’ gel Om de gel te laden wordt 5 μl sample buffer (8% (w/v) SDS (Across), 200 mM Tris-HCl (Sigma) (pH 6,8), 40% (v/v) glycerol, 0,4% (w/v) bromo-fenolblauw (Merck)) toegevoegd aan 15 μl staal. Het mengsel wordt gedurende 7 minuten opgekookt en vervolgens kort afgecentrifugeerd. Per laantje van de gel wordt 20 μl geladen. De gel wordt eerst gedurende een kwartier op 130 V gelopen en vervolgens op 150 V om de eiwitten te scheiden in de separating gel. Figuur 11: Principe van SDS-PAGE. Het groene gedeelte is de stacking gel, het grijze gedeelte is deseparating gel. (http://ww2.chemistry.gatech.edu/~lw26/bCourse_Information/4581/techniques/gel_elect/page_protein.html) Na de gelelektroforese dienen de eiwitbandjes gekleurd te worden. De gel wordt ongeveer 15-30 minuten in coomassie reagens geplaatst (1g/L Coomassie blue R-250, 16,7 % (v/v) azijnzuur (VWR), 41,6 % (v/v) methanol (Roth)). Hierna is de volledige gel blauw gekleurd. Aangezien enkel de eiwitbandjes blauw mogen zijn moet nog ontkleurd worden met behulp van ontkleuringsreagens (15 % (v/v) ethanol (VWR), 7,5 % (v/v) azijnzuur (VWR)). Indien slechts zeer weinig eiwit op de gel aanwezig is en kleuring met coomassie reagens geen duidelijke bandjes oplevert, kan ontwikkeling van de bandjes ook gebeuren met de veel gevoeligere silverstaining methode. Hiervoor wordt de PageSilver silver staining kit van Fermentas Life Sciences gebruikt. 29 3.5.3 Western blot analyse Nadat eiwitten via SDS-PAGE op basis van moleculaire massa gescheiden zijn, kan men ze overbrengen op een PVDF of nitrocellulose membraan. Vervolgens kan men het overgebrachte eiwit waarin men geïnteresseerd is gaan detecteren met behulp van antilichamen. Het PVDF membraan (Pall) wordt eerst 5 minuten geïncubeerd in 100% methanol . Vervolgens wordt de SDS-PAGE gel op het PVDF membraan gelegd en deze twee worden tussen twee stukken blotpapier geplaatst, welke eerst kort in Towbin buffer (10 % (v/v) methanol (Roth), 3,03 g/L Tris (Sigma), 14,4 g/L Glycine (Sigma)) geplaatst werden. Dan wordt geblot met behulp van een TransBlot® SD Semi-Dry transfer cel (Bio-rad) gedurende 2 uur of langer bij 22V. Na het blotten wordt het PVDF membraan in blocking buffer (50 g/L melkpoeder (AppliChem) in trissaline (1,2 g/L Trizma base (Sigma), 2g/L NaCl (Duchefa), 1ml/L Triton-X-100 (Across), pH= 7,6)) geplaatst om alle onbezette plaatsen met eiwit te blokkeren. Hierna wordt het gedurende 5 minuten gewassen met trissaline. Deze wasstap wordt driemaal herhaald. Vervolgens wordt de blot één uur geïncubeerd met een primair antilichaam specifiek tegen het eiwit van interesse (voor gebruikte verdunningen: zie resultaten). Hierna wordt opnieuw driemaal gewassen met trissaline. Dan wordt de blot geïncubeerd met secundair antilichaam gekoppeld aan het enzyme horseradish peroxidase (HRP) (voor verdunningen: zie resultaten). Dit secundair antilichaam is specifiek gericht tegen het organisme waarin de primaire antilichamen geproduceerd werden. De meest gebruikte zijn Goat anti Rabbit (GAR) en Rabbit anti Mouse (RAM) secundaire antilichamen. Vervolgens wordt een voldoende hoeveelheid enhanced chemiluminiscence detection (ECL) substraat toegevoegd (dit bestaat uit een 1:1 verdunning van ‘clarity western peroxide reagens’ en ‘clarity western luminol/enhancer reagens’ , beiden van Bio-Rad). Visualisatie van de bandjes gebeurt via een ChemiDoc MP imaging system (Biorad). Figuur 12 geeft het principe weer van western blotting. In onze analysen werd geen kleurreactie uitgevoerd maar een ECL reactie (Figuur 13). Figuur 12: Principe van western blotting (http://www.komabiotech.co.kr/www/techniques/immunodection/wbProtocol.html) 30 Figuur 13: Principe van ECL detectie (http://www.crbdiscovery.com/newsletter/z_images/may/westardiagram.jpg) 3.6 Technieken om de interactie tussen histonen en Nictaba na te gaan 3.6.1 Lectine affiniteitschromatografie Voor achtergrondinfo over lectine affiniteitschromatografie: zie literatuurstudie (1.6.1). Eerst worden 2 kolomvolumes DAP (20mM) over de nictabakolom gestuurd om de kolommatrix te wassen en eventueel gebonden moleculen te elueren. Hierna wordt de kolom geëquilibreerd met 2 kolomvolumes PBS. Histonen worden op de Nictaba-kolom geladen. Nadat de histonen geladen zijn op de kolom, wordt gewassen met 1 kolomvolume PBS om de niet specifiek gebonden eiwitten te verwijderen. Vervolgens worden de gebonden histonen geëlueerd met behulp van 20 mM diaminopropanol (DAP) (Sigma) en 50-100 µl (twee druppels) van het eluaat wordt telkens opgevangen in een afzonderlijk epje. De concentratie van het opgevangen eluaat, van de doorloop en van de wasoplossing wordt bepaald gebruik makend van de Nanodrop 2000 (Thermo scientific). Het principe van lectine affiniteitschromatografie wordt weergegeven in figuur 14. Figuur 14: Principe van affiniteitschromatografie. De rode maanvormige structuren komen in ons geval overeen met Nictaba. De groene Y-vormige structuren komen dan overeen met histonen 31 3.6.2 Far western blot analyse Voor achtergrondinfo over far western blotting: zie literatuurstudie (1.6.3). Een far western blot is vrij analoog aan de conventionele western blot analyse. Eerst wordt een SDS-PAGE uitgevoerd met typisch ‘prey’ proteïne, in ons geval dus opgezuiverde histonen. Nadat de eiwitten gescheiden zijn via SDS-PAGE worden ze overgebracht naar een PVDF membraan (Pall) door blotting. Na de blotting stap worden de plaatsen die nog niet bezet zijn met ‘prey’ proteïne geblokkeerd met blocking buffer (zie western blot: 2.4.6). Na de blokkeringsstap wordt 5 minuten gewassen met trissaline (zie western blot: 2.4.6). Hierna wordt de blot geïncubeerd met 10 ml (1 µg/ml) ‘bait’ proteïne (Nictaba) gedurende 1 uur. Na opnieuw 5 minuten gewassen te hebben met trissaline wordt vervolgens het primair antilichaam (tegen het ‘bait’ proteïne) toegevoegd (voor verdunningen zie resultaten). Na één uur wordt driemaal 5 minuten gewassen met trissaline, vooraleer het secundair antilichaam wordt toegevoegd (voor verdunningen zie resultaten). Tenslotte wordt na een incubatietijd van 1 uur in secundair antilichaam opnieuw driemaal gewassen, vooraleer overgegaan wordt tot de ECL detectie (zie western blot: 2.4.6). 3.6.3 Pull down assay Voor achtergrondinfo over pull down assay: zie literatuurstudie (1.6.2). De pull down assay werd uitgevoerd gebruik makend van de ‘PierceTM Pull-Down PolyHis Protein interaction Kit’. Aan de Pierce Spin Columns worden beads toegevoegd waaraan kobalt gebonden is. Vervolgens worden de kolommen gewassen waarna het ‘bait’ proteïne (Nictaba-polyhistidine fusieproteïne) wordt toegevoegd. Dit ‘bait’ proteïne kan aan de kobalt beads binden door middel van de polyhistidine-tag. Ongebonden eiwitten worden weggewassen. Typisch 100-150 µg ‘prey’ proteïne wordt op de kolommen gebracht. Na een incubatietijd van een uur waarin wordt gewassen om eiwitten die niet met het ‘bait’ proteïne interageren te verwijderen. Tenslotte worden de gebonden ‘prey’ proteïnen geëlueerd . Eiwitten aanwezig in het eluaat worden geprecipiteerd met TCA. Deze worden op gel gezet voor SDS-PAGE. De bandjes waarin men geïnteresseerd is worden uitgeknipt en met behulp van MS analyse geïdentificeerd. 32 4 Resultaten Deze thesis had als doel de interactie te onderzoeken tussen Nictaba en tabakhistonen. Eerst werd een protocol opgesteld voor de opzuivering van deze histonen uit BY-2 cellen. Vervolgens werd gecontroleerd of de histonen gemodificeerd waren met O-GlcNAc structuren en of het O-GlcNAc modificatieniveau van tabakhistonen verandert doorheen de celcyclus. Tenslotte werd de interactie nagegaan tussen de opgezuiverde, O-GlcNAc gemodificeerde tabakhistonen en Nictaba. 4.1 Opzuivering van histonen 4.1.1 Protocol 1 voor histonopzuivering Een eenvoudig protocol voor histonopzuivering werd verkregen van Drs Daniel Buszewicz (Universiteit Warschau, Polen). Dit protocol werd uitgevoerd zoals beschreven in 3.2.1. De concentratie van de opgezuiverde histonoplossingen werd bepaald door middel van een Bradford assay, waarbij een verdunningsreeks van een commercieel preparaat van kalfthymus histonen (Sigma) werd gebruikt als standaardcurve (1 mg/ml, 100 µg/ml, 10 µg/ml). Vervolgens werd een SDS-PAGE uitgevoerd zodat het eiwitpatroon voor de commerciële kalfhistonen en de opgezuiverde tabakhistonen kon vergeleken worden (Figuur 15). Uitgaande van het resultaat van de Bradford proteïne assay werd het benodigde volume bepaald zodat ongeveer 3,75 µg eiwit kon geanalyseerd worden in elk laantje van de gel. Figuur 15: SDS PAGE van histoneiwitten. Van links naar rechts: ladder, kalf thymus histonen (controle) en 2 herhalingen van tabakhistonen opgezuiverd volgens protocol 1 33 Het eiwitelektroforesepatroon toonde aan dat er inderdaad eiwitten werden opgezuiverd uit tabak, die qua grootte sterk gelijken op de kalfhistonen. De moleculaire massa van de verschillende kalf-en tabakhistonen werd bepaald aan de hand van de aminozuursequentie van de desbetreffende proteïnen, afkomstig van de UniProt proteïne database, en de ‘compute pI/Mw tool’ van ExPASy. Tabel 10 toont de berekende moleculaire massa van de eiwitten waarbij geen rekening werd gehouden met posttranslationele modificaties. Kalfhistonen blijken iets kleiner te zijn dan de tabakhistonen. Dit verklaart waarom in figuur 15 de tabakhistonen minder ver gemigreerd zijn in de gel. Een correcte inschatting van proteïnemassa’s uitgaande van een SDS-PAGE gel is echter moeilijk, waardoor identificatie louter op basis van het eiwitpatroon niet mogelijk is. Hoewel het resultaat van de SDS-PAGE doet vermoeden dat inderdaad tabakhistonen werden opgezuiverd, liet de zuiverheid en de efficiëntie van het protocol te wensen over. Histonen H1 H2A H2B H3.2 H3.3 H4 Kalf (kD) 21 14,09 13,91 15,39 15,33 11,37 Tabak (kD) 29,98 15,47 15,96 15,27 15,41 11,43 Tabel 10: Moleculaire massa van kalf- en tabakhistonen. Hierbij werd geen rekening gehouden met mogelijke posttranslationele modificaties op de eiwitten 4.1.2 Protocol 2 voor histonopzuivering Vervolgens werd het protocol voor de histonopzuivering zoals beschreven door Trivedi, et al. (2012) uitgetest. Twee histonopzuiveringen werden in parallel uitgevoerd volgens dit protocol (materiaal en methoden 3.2.2), waarbij enerzijds met 7 g BY-2 cellen werd gestart en anderzijds met 7 g bladmateriaal van Nicotiana tabacum. Bij het staal afkomstig van celmateriaal waren de kernen verloren gegaan na applicatie van de Percoll gradiënt om kernen die vrijgesteld waren uit de gelyseerde cellen verder te scheiden van cellulair debris. Enkel bij het staal waarbij met bladmateriaal begonnen was, slaagde de fractionering met behulp van de Percoll gradiënt. Vervolgens werd de concentratie van de opgezuiverde histonen bepaald met behulp van de Bradford proteïne assay. Hiermee werd het benodigde volume van controle (kalfhistonen) en staal (opgezuiverde histonen uit bladmateriaal) bepaald voor SDS-PAGE om 7,5 µg eiwit te analyseren in elke laantje van de gel (Figuur 16 A). Omdat in het laantje van de opgezuiverde tabakhistonen weinig eiwit kon worden gedetecteerd, werd ook een silverstaining uitgevoerd met de PageSilver silver staining kit (Figuur 16 B). Na silverstaining waren wel bandjes te zien in het laantje van de opgezuiverde tabakhistonen. De duidelijkste bandjes liggen ongeveer ter hoogte van de bandjes van de controle, welke dus histonen kunnen zijn. Het is echter duidelijk dat er naast deze bandjes nog veel onzuiverheden aanwezig zijn. 34 Opmerkelijk is ook dat de Bradford proteïne assay niet zo accuraat blijkt te zijn, aangezien zowel het laantje van de kalfhistonen en dat van de opgezuiverde tabakhistonen evenveel eiwit zou moeten bevatten uitgaande van de Bradford assay. Het grote verschil in intensiteit tussen de bandjes van beide laantjes lijkt dit echter tegen te spreken. De eiwitten die iets verder migreerden dan het 17 kD merkereiwit in het laantje van de kalfhistonen kunnen overeenkomen met histonen. De eiwitten die iets verder migreerden dan het 34 kD laddereiwit zijn hoogstwaarschijnlijk het gevolg van dimerisatie van histonen, meerbepaald van histon H3. Dit is namelijk het enige histoneiwit dat een enkel cysteïne residu bevat dat sterk geconserveerd is (Fischle, et al., 2003). Hierdoor is dus dimerisatie mogelijk door een disulfidebinding. Op de website van Abcam wordt in de productinformatie van een preparaat van histon octameer proteïnen van kippenerytrocyten ook beschreven dat bij SDS-PAGE in niet reducerende omstandigheden een hoger gelegen proteïnebandje verkregen wordt ten gevolge van een H3 dimeer (http://www.abcam.com/Chicken-Erythrocyte-Histone-Octamers-protein-Loading-Controlab45275.html). Door gebruik van β-ME (zoals in deze thesis) zou deze dimerisatie echter niet mogen optreden. Mogelijks werden niet alle disulfidebindingen verbroken door het β-ME. A B Figuur 16: SDS-PAGE van kalfhistonen (controle) en tabakhistonen opgezuiverd volgens protocol 2. A: Coomassie kleuring. B: Silver staining 4.1.3 Eigen samengesteld protocol voor histonopzuivering Aangezien voorgaande protocols voor histonopzuivering onvoldoende zuivere histonpreparaten opleverden, werd ervoor gekozen om zelf een protocol samen te stellen, gebaseerd op protocols gevonden in de literatuur. Om meer zuivere histonfracties te bekomen en om het rendement van de extractie en opzuivering te verhogen werd geopteerd om eerst protoplasten te vormen, vervolgens kernen op te zuiveren en nadien deze kernen te onderwerpen aan een zuurextractie om uiteindelijk een preparaat van tabakhistonen over te houden. Deze stapsgewijze aanpak laat toe om 35 controlepunten in te bouwen in het protocol (bijvoorbeeld microscopische analyse om te kijken of effectief protoplasten gevormd werden en kernen opgezuiverd werden) en daarnaast wordt ook het risico verkleind dat de uiteindelijk opgezuiverde fractie ook (zuuroplosbare) eiwitten afkomstig van de celwand en het cytoplasma bevat. 4.1.3.1 Protoplast vorming Uit de literatuur blijkt dat de basisingrediënten voor een goede protoplastvorming de enzymmix, de aanwezigheid van een osmoticum (opdat de protoplasten geen osmotische lyse zouden ondergaan) en een protectant zoals CaCl2 zijn (Rao and Prakash, 1995). Hiernaast wordt ook gewezen op de hogere activiteit van de enzymen bij temperaturen van 30-37°C. De procedure van protoplastvorming uit het samengestelde protocol (materiaal en methoden 3.2.3) is gebaseerd op de protocols zoals beschreven door Oulee, et al. (1986), Nakayama, et al. (2008) en Xiong, et al. (2004). Deze protocols werden met elkaar vergeleken en rekening houdend met de overeenkomsten tussen de protocols, de belangrijkheid van de verschillende stappen en de beschikbaarheid van de benodigde producten, werd het samengesteld protocol opgesteld (3.2.3). 4.1.3.2 Opzuivering van kernen De procedure voor kernopzuivering is gebaseerd op de protocols zoals beschreven door Xiong, et al. (2004), Nakayama, et al. (2008), Schouppe (2010), Schouppe, et al. (2011) en Trivedi, et al. (2012). Opnieuw werden de verschillende protocols naast elkaar gelegd en na vergelijking werden de belangrijkste componenten geselecteerd voor het samengesteld protocol (3.2.3). Zo werd in de verschillende protocols gebruik gemaakt van een lysisbuffer om de protoplasten te lyseren. Deze lysisbuffer bleek ook in de verschillende protocols gelijkaardig te zijn en de uiteindelijke samenstelling van de lysisbuffer van het ‘hybride’ protocol werd hier dan ook op gebaseerd. Xiong, et al. (2004), Nakayama, et al. (2008) en Schouppe, et al. (2011) gebruikten naast deze lysisbuffer vervolgens ook nog een mechanische desintegratiestap om de protoplasten te scheuren. In het protocol van Nakayama, et al. (2008) gebeurde dit met behulp van een mortier. Aangezien dit reeds in de voorgaande inefficiënte histonopzuiveringsprotocols was geprobeerd, werd gekozen voor een mechanische desintegratie door de protoplasten door een naald te laten passeren zoals beschreven door Xiong, et al. (2004) en Schouppe, et al. (2011). Nadat de kernen vrijgesteld waren, werd gefiltreerd om eventuele niet-gelyseerde protoplasten te weerhouden. Vervolgens werden de kernen op een gradiënt gebracht om via centrifugatie een verdere opzuivering te bekomen. Deze filtratie en centrifugatiestap is gebaseerd op de protocols zoals beschreven door Xiong, et al. (2004) en Schouppe, et al. (2011). 36 4.1.3.3 Kernextractie De zuurextractie van histonen uit de opgezuiverde kernen is hetzelfde als deze van het histonopzuiveringsprotocol 2 (3.2.2). Dit protocol werd gebruikt door Shechter, et al. (2007) en Trivedi, et al. (2012). 4.1.3.4 Schematisch overzicht samengesteld protocol voor histonopzuivering •Cellen incuberen in enzymoplossing met osmoticum •30-37°C voor verhoogde enzymatische activiteit •Filtratie + centrifugatie voor opzuivering van potoplasten Protoplastvorming Kernopzuivering Zuurextractie van histonen •Protoplasten lyseren met behulp van lysisbuffer •Verdere mechanische desintegratie van protoplasten door passage door een naald •Filtratie + centrifugatie voor opzuivering van kernen •Kernen overnacht incuberen in 0,2 M H2SO4 •Afcentrifugeren van celdebris •TCA precipitatie van zuuroplosbare histonen in supernatans 4.1.3.5 Effectiviteit van het samengestelde protocol Eens het samengesteld protocol was opgesteld, werd het uitgevoerd zoals beschreven in 3.2.3. Voor de uitvoering van de ficoll gradiënt werd met behulp van de microscoop nagegaan of goede protoplasten werden gevormd (Figuur 17). Hieruit blijkt dat er mooie protoplasten werden bekomen. A B Figuur 17: A en B: Protoplasten gevormd uit BY-2 cellen aan de hand van het hybride protocol voor applicatie van de ficoll gradiënt 37 Nadat de protoplasten onderworpen werden aan de ficoll gradiënt werden ze opnieuw bekeken onder de microscoop. Figuur 18 toont aan dat de protoplasten na deze ficoll gradiënt niet meer intact waren. A B Figuur 18: A en B: Protoplasten gevormd uit BY-2 cellen aan de hand van het hybride protocol na applicatie van de ficoll gradiënt: protoplasten lijken niet meer intact te zijn Het niet meer intact zijn van de protoplasten kan veroorzaakt zijn door 2 zaken:  Volgens het protocol moeten de protoplasten heropgelost worden in de 20% ficoll laag. Deze 20% ficoll oplossing bevatte echter geen osmoticum, waardoor de protoplasten misschien door osmotische effecten gebarsten zijn.  Ook werden aanvankelijk plastic falcons gebruikt. Aangezien de pellet van gewassen protoplasten stevig vast zat in de falcontip was het nodig om te tikken tegen de tip om de protoplasten opgelost te krijgen in de 20% ficoll oplossing. Dit kan ervoor gezorgd hebben dat de protoplasten barstten. Met deze ideeën in het achterhoofd werden twee kleine aanpassingen aangebracht in het protocol:  Aan de ficoll oplossing werd mannitol (tot een finale concentratie van 0,4 M) toegevoegd als osmoticum  Er werd overgestapt naar het gebruik van glazen buisjes in plaats van plastic falcons, waardoor de pellet van protoplasten makkelijker kon worden heropgelost in de 20% ficoll oplossing door rustig op- en neer te pipetteren. Deze aanpassingen werden toegepast en de protoplasten werden opnieuw bekeken onder de microscoop na applicatie van de gradiënt. Ditmaal waren de protoplasten wel intact (Figuur 19). A B Figuur 19: A en B: Protoplasten gevormd uit BY-2 cellen aan de hand van het hybride protocol na applicatie van de ficoll gradiënt: na aanbrengen van twee aanpassingen in het protocol lijken de protoplasten wel opnieuw intact te zijn 38 Nadat de protoplasten gecollecteerd waren, werd overgegaan tot de kernopzuivering. De iodixanol gradiënt had als doel een nog zuiverder kernfractie te bekomen. Dit ging echter onvermijdelijk gepaard met een rendementsverlies. Deze gradiënt compliceerde het protocol verder onnodig aangezien ook zonder toepassing ervan relatief zuivere kernen werden bekomen (Figuur 20). Er werd dan ook geopteerd om deze gradiënt achterwege te laten. Figuur 20: DAPI gekleurde kernen opgezuiverd volgens het hybride protocol zonder applicatie van de iodixanol gradiënt. Relatief zuivere kernen zijn te zien Tenslotte werden de kernen onderworpen aan de zuurextractie zoals beschreven in 3.2.3. Aangezien bij de opzuiveringsexperimenten waarbij protocols 1 en 2 werden gebruikt, de concentratiebepaling met behulp van de Bradford proteïne assay niet accuraat bleek te zijn, werd gebruik gemaakt van de Pierce 660 nm proteïne assay. De Bradford proteïne assay is immers gevoelig voor interferentie door detergenten, wat een vertekend beeld geeft van de werkelijke proteïneconcentratie (Friedenauer and Berlet, 1989). Aangezien in een aantal stappen van het samengesteld protocol voor histonopzuivering (3.2.3) detergenten werden gebruikt (zoals bijvoorbeeld Triton-X-100), werd gekozen voor de Pierce 660 nm proteïne assay aangezien deze assay veel minder gevoelig is aan interferentie door detergenten. Een standaardcurve voor de Pierce 660 nm proteïne assay werd opgesteld met behulp van het commerciële preparaat van kalfhistonen. Ongeveer 2 µg van de opgezuiverde histonen werden op gel geanalyseerd door SDS-PAGE (Figuur 21). Figuur 22: Standaardcurve voor het bepalen van de moleculair massa van Figuur 21: SDS-PAGE analyse van SDS-PAGE bandjes, uitgaande van de preparaat van histonen bekomen afgelegde weg in de gel volgens het samengestelde protocol 39 Duidelijke bandjes zijn zichtbaar op de gel die, rekening houdend met de migratieafstand in de gel, kunnen overeenkomen met histonen. Om een nauwkeuriger bepaling van de moleculaire massa van tabakhistonen toe te laten werd de logaritme van de moleculaire massa van de merkereiwitten uitgezet tegenover hun afgelegde afstand in de gel, gemeten in centimeter. Op die manier werd een standaardcurve verkregen (Figuur 22). Door de migratieafstand van de opgezuiverde eiwitten uit te zetten tegenover deze afgelegde weg kon hun moleculair gewicht geschat worden. De geschatte moleculaire massa van het opgezuiverde eiwit met de grootste migratieafstand is gelijkaardig aan de moleculaire massa van H4. De geschatte moleculaire massa’s van de opgezuiverde eiwitten die hoger in de gel gesitueerd zijn vertonen dan weer gelijkenis met de moleculaire massa’s van de histon H3 en H2 varianten (Tabel 9). Bovenstaande methode doet sterk vermoeden dat de opgezuiverde eiwitten inderdaad histonen zijn. Om echter zeker te zijn werden western blots uitgevoerd met primaire antilichamen tegen H3 (Abcam, verdunning 1/30 000) en H4 (Millipore, verdunning 1/12 500). Vermits deze antilichamen in konijn werden aangemaakt, werd als secundair antilichaam goat-anti-rabbit gebruikt (GAR) (Sigma, verdunning: 1/25 000). Voor deze western blots werd de opzuivering van 6/3/2013 gebruikt (zie figuur 21). Figuren 23 en 24 geven de resultaten weer van de western blots met respectievelijk H3 en H4 antilichaam. Deze blots tonen aan dat wel degelijk histonen werden opgezuiverd. Figuur 23: Western blot analyse op Figuur 24: Western blot analyse op opgezuiverde tabakhistonen met H3 opgezuiverde tabakhistonen met H4 antilichaam antilichaam Tabel 11 geeft een overzicht van de verschillende histonopzuiveringen die werden uitgevoerd. Hierbij is telkens de initiële hoeveelheid celmateriaal gegeven waarmee gestart werd, alsook het rendement. Proteïneconcentraties werden bepaald met behulp van de Pierce 660 nm assay. Het is duidelijk dat het rendement verschilt van opzuivering tot opzuivering. Om sneller een grote hoeveelheid histonen te bekomen werd het opzuiveringsprotocol opgeschaald (zie 4/12/2012 in tabel 11). In plaats van een 40 ml celcultuur werd vertrokken van een 600 ml celcultuur. Aangezien het rendement van deze opschaling erg laag was in verhouding met de kosten (veel enzymen nodig, buffers,..) werd afgestapt van de opschaling. In de week van 13/3/2013 werden twee opzuiveringen parallel aan elkaar gedaan. Eén opzuivering werd uitgevoerd met cellulase R10 in plaats van cellulase RS om de efficiëntie te testen (cellulase RS wordt geproduceerd door een mutante Trichoderma viride, die verkregen werd uit de parentale stam die cellulase R10 produceert, 40 http://www.bioworld.com/productinfo/2_31_835_227/5309/Cellulase-RS-Onozuka-RS.html). Het cellulase R10 bleek echter voor een lager rendement te zorgen. Datum van opzuivering 12/10/2012 19/10/2012 04/12/2012 06/03/2013 (RS) 13/03/2013 (R10) 13/03/2013 Initieel celmateriaal (g) 4 8 69 5.3 7.6 6.5 Concentratie histonen (µg/ml) 406 973 597 573 677 217 Volume (µl) 300 400 1400 300 400 400 Hoeveelheid (µg) 121.8 389.2 835.8 171.9 270.8 86.8 Tabel 11: Overzicht van het rendement van de verschillende histonopzuiveringen. Histonconcentraties werden bepaald met behulp van de Pierce 660 nm proteïne assay Aangezien interactie tussen Nictaba en histonen tot stand komt door de O-GlcNAc modificaties op de histonen (Schouppe, et al., 2011), was het belangrijk te weten of de opgezuiverde histonen ook over deze O-GlcNAc modificaties beschikten. Om die reden werd een western blot analyse uitgevoerd met een antilichaam gericht tegen O-GlcNAc modificaties (Covance, verdunning 1/1000). Als secundair antilichaam werd Rabbit anti-Mouse (RAM) gebruikt (Sigma, verdunning 1/1000). Opnieuw werd de opzuivering van 6/3/2013 gebruikt. Figuur 25 geeft het resultaat weer van de anti-O-GlcNAc blot. De opgezuiverde histonen bleken dus over de O-GlcNAc modificaties te beschikken. Figuur 25: Western blot analyse op opgezuiverde tabakhistonen met O-GlcNAc antilichaam 41 4.2 Celsynchronisatie In dierlijke cellen is aangetoond dat het O-GlcNAc modificatieniveau van histoneiwitten celcyclus afhankelijk is (zie literatuurstudie). Om na te gaan of dit in tabaksplanten ook het geval is werden BY-2 cellen gesynchroniseerd. Eens de cellen gesynchroniseerd waren, werden ieder uur (gedurende 15 uur) stalen genomen voor: flow cytometrische analyse en microscopische analyse ter controle van synchronie, RNA extractie om de genexpressie van enkele genen in kaart te brengen en histonopzuivering om via western blot analyse het niveau van O-GlcNAc modificatie na te gaan. 4.2.1 Controle van celsynchronisatie 4.2.1.1 Flow cytometrische analyse Cellen kunnen gekleurd worden met propidium iodide, een fluorescente molecule die met DNA bindt op een aspecifieke manier. Door het meten van het ontstane fluorescentiesignaal kan vervolgens de DNA inhoud van de cel gekwantificeerd worden. BY-2 cellen zijn tetraploïd en wanneer ze in de S-fase treden zal hun DNA inhoud verdubbelen (8n in plaats van 4n). Figuur 26 geeft weer hoe, met behulp van flow cytometrie, de celsynchronisatie op die manier kan gecontroleerd worden: wanneer het aantal cellen wordt uitgezet ten opzichte van de intensiteit van het fluorescentiesignaal (welke evenredig is met de DNA inhoud) worden pieken bekomen die overeenkomen met cellen die zich in de 4n fase of de 8n fase bevinden. Dit laat toe om de graad van synchronie na te gaan aangezien een synchrone celpopulatie aanleiding zal geven tot mooie smalle pieken. Doorheen de celcyclus zal ook een shift plaatsvinden van een duidelijke 8n piek (cellen in S-fase) naar een duidelijke 4n piek (cellen die mitose ondergaan hebben). Figuur 26: A: De celcyclus B: Pieken in een DNA histogram (http://www.intechopen.com/source/html/18770/media/image3.png ). 42 Figuur 27 geeft de resultaten weer van de flow cytometrische analyse. 15 grafiekjes worden weergegeven welke overeenkomen met de 15 tijdspunten tijdens de celcyclus waarop een staal werd genomen. S-fase S-fase S-fase G2-fase G2-fase G2-fase Mitose Mitose Mitose Mitose G1-fase G1-fase G2-fase Mitose S-fase Figuur 27: Resultaten flow cytometrische analyse van gesynchroniseerde BY-2 cellen In figuur 27 zijn mooie smalle pieken zichtbaar, wat wijst op het feit dat de cellen gesynchroniseerd zijn. Verder zijn het opkomen en verdwijnen van de 4n en 8n pieken ook in overeenkomst met het verloop van de celcyclus. Vanaf tijdspunt 8 ontstaat een duidelijke 4n piek. Deze neemt vervolgens toe terwijl de 8n piek afneemt: de cellen ondergaan mitose. Deze mitose komt echter iets later dan men theoretisch gezien (Kumaga-Sano, et al., 2006) zou verwachten namelijk na ongeveer 8 uur na opheffen van de aphidicoline blok in plaats van 6 uur. 4.2.1.2 Bepalen van de mitotische index (MI) Naast flow cytometrische analyse werd de celsynchronie ook nog via een tweede methode gecontroleerd. De MI is de verhouding van het aantal cellen dat mitose ondergaat, ten opzichte van het totaal aantal cellen van een celpopulatie. De verandering van de MI doorheen de celcyclus geeft informatie omtrent de graad van synchronie. Met behulp van een fluorescentiemicroscoop en DAPI kleuring werd het aantal cellen in mitose geteld en de MI werd bepaald. Per staal werden minstens 200 cellen geteld. Cellen die zich in profase, metafase, anafase of telofase bevonden werden beschouwd als mitotisch. Figuur 28 toont aan hoe BY-2 cellen er onder de microscoop uitzien na DAPI kleuring in de verschillende fasen van de celcyclus. 43 Figuur 28: BY-2 cellen in de verschillende fasen van de celcyclus. Scale bar = 10µm (Kumagai-Sano, et al., 2006) Figuur 29 geeft enkele microscopische beelden weer van de gesynchroniseerde BY-2 cellen. In figuur 29 A zijn cellen te zien twee uur na wegwassen van het aphidicoline. Deze cellen zouden zich bijgevolg in de S-fase moeten bevinden (zie figuur 27). In figuur 29 B zijn cellen te zien 10 uur na wegwassen van het aphidicoline. Deze cellen bevinden zich normaal gezien in de mitose (zie figuur 27). Wanneer men figuren 29 A en 29 B vergelijkt met figuur 28, is het duidelijk dat in figuur 29 B veel meer mitotische cellen te zien zijn als in figuur 29 A. A B Figuur29 : DAPI kleuring van gesynchroniseerde BY-2 cellen. A: BY-2 cellen, 2 uur na wegwassen van aphidicoline, B: BY-2 cellen 10 uur na wegwassen van aphidicoline Vervolgens werd de mitotische index uitgezet tegenover de tijd verlopen na het verwijderen van het aphidicoline ( Figuur 30). 44 Figuur 30: Verloop van mitotische index doorheen de celcyclus De bekomen grafiek is dus in overeenstemming met de flow cytometrische analyse: de piek in de MI curve komt overeen met de shift van de fluorescentiepiek waargenomen bij flow cytometrie. Dit wijst dus terug op het synchroon zijn van de BY-2 cellen. Na het bereiken van de maximale MI is echter een brede schouder waar te nemen in de curve. Dit is te wijten aan het feit dat het effect van het aphidicoline na verloop van tijd vervaagt: na het wegwassen van de drug zijn de cellen mooi synchroon, maar na verloop van tijd zullen deze cellen opnieuw ‘hun eigen weg gaan’ als het ware en minder synchroon worden. 4.2.2 qPCR en RT-PCR Om het uur (gedurende 15 uur) werden de gesynchroniseerde BY-2 cellen gesampled voor RNA extractie (3.4.1). Hiervoor werden cellen uit telkens 8 ml gesynchroniseerde celcultuur geoogst via vacuümfiltratie. De RNA extractie had als doel om veranderingen in genexpressie van O-GlcNAc transferase doorheen de celcyclus na te gaan aan de hand van qPCR of RT-PCR. Inzicht in de regulatie van de expressie van dit enzym, en dus onrechtstreeks ook van O-GlcNAc modificatie doorheen de celcyclus, kan immers informatie bieden omtrent de functie van O-GlcNAc modificaties van histonen. Na RNA extractie werd cDNA gesynthetiseerd en werden RT-PCR reacties uitgevoerd ter controle van de cDNA synthese en voor het testen van de primers. De genen EF-1α (elongatie factor 1α), L25 (ribosomaal proteïne L25) en Nt-tubc2 (tubuline) werden gebruikt als referentiegenen bij de qPCR. Histonen H3.3 en H1 werden als positieve controle meegenomen omdat men van deze genen weet dat genexpressie verandert doorheen de celcyclus (Meshi, et al., 2000; Rattray and Muller, 2012). Agarose gelelektroforese na RT-PCR (met primers voor H3, H1, EF-1 α en Nt-tubc2) toonde aan dat de cDNA synthese gelukt was en dat ook de gebruikte primers efficiënt waren. Vervolgens werden de qPCR’s uitgevoerd, waarbij het eerste tijdspunt als referentie werd genomen (Figuur 31). 45 A B C Figuur 31: qPCR resultaten. Het relatieve expressieniveau ten opzichte van de referentiegenen is uitgezet voor de 15 tijdspunten van de celcyclus. Groen: significant, blauw: niet significant. A: H3 expressie, B: H1 expressie, C : O-GlcNAc transferase expressie Uit de literatuur blijkt dat histon expressie het hoogst is in de S-fase en afneemt na de S-fase en in de mitose (Meshi, et al. 2000). Aangezien de celcyclus door de aphidicoline behandeling gestopt wordt in de S-fase, zouden de cellen de eerste drie uur na wegwassen van het aphidicoline gekenmerkt moeten worden door hogere expressieniveaus van histonen. In figuur 31 A is deze trend gedeeltelijk te herkennen bij de expressie van histon H3. De hoogste expressie wordt gezien bij 1 uur na het hervatten van de celcyclus (S-fase) en vervolgens neemt het expressieniveau af. De eerste drie uren zou deze hoge expressie echter nog zichtbaar moeten zijn aangezien ook dan de cellen zich nog in de S-fase bevinden, wat echter minder duidelijk is. Verder is het ook vreemd dat er niet opnieuw een hoog expressieniveau wordt waargenomen bij de laatste tijdspunten. De cellen zouden zich hier namelijk reeds terug in de S-fase moeten bevinden. Bij de expressie van H1 (Figuur 31 B) is dit patroon minder duidelijk. Hier zijn namelijk ook veel qPCR’s niet significant waardoor deze niet in rekening kunnen gebracht worden. Door het feit dat de qPCR analyse niet volledig in overeenstemming is met het verwachte expressiepatroon zoals beschreven in de literatuur (Meshi, et al., 2000; Rattray and Muller, 2012) is het moeilijk om conclusies te trekken omtrent het expressiepatroon vanO-GlcNAc transferase (Figuur 31 C). 46 Een mogelijke verklaring voor het feit dat qPCR niet ideaal lijkt voor het nagaan van expressieniveaus doorheen de celcyclus is dat de gebruikte referentiegenen nog nooit eerder zijn gebruikt voor dergelijke studies en het is bijgevolg niet uitgesloten dat de expressie van de referentiegenen ook fluctueert in functie van de celcyclus. De onstabiele CT waarden voor de referentiegenen die bij de qPCR analysen werden waargenomen, lijken deze hypothese te bevestigen. RT-PCR kan ook gebruikt worden om expressieniveaus in kaart te brengen. De RT-PCR’s ter controle van cDNA synthese en voor het testen van de primers werden uitgevoerd met 40 cycli, waardoor bandjes bij elk tijdspunt zichtbaar waren. Wanneer het aantal cycli echter verlaagd wordt, tot het punt dat de eerste bandjes zichtbaar worden, kan men ook kwantitatieve informatie verwerven over het expressieniveau. Tijdspunten waar wel al bandjes zichtbaar zijn zullen immers duiden op een grotere hoeveelheid initieel cDNA, of dus een hogere expressie. Na uitproberen van verschillende aantallen PCR cycli, werd het optimaal aantal bepaald. Voor H3 was dit 20, voor H1 25 en voor O-GlcNAc transferase bleek 27 cycli het beste (Figuur 32). A B Figuur 32: Agarose gelelektroforese na RT-PCR: A: H3. B: H1. C: O-GlcNAc transferase. Telkens 15 tijdspunten, een ladder en een negatieve controle. C In figuur 32 A zijn er bij de eerste tijdspunten enkele intense bandjes te zien (2, 5). Ook de laatste tijdspunten zijn wat intenser (13, 14 ,15). Het typische patroon (S-fase en dus felle bandjes in het begin en opnieuw naar het einde toe) dat men zou verwachten is niet heel duidelijk, maar komt toch wat naar voren. In figuur 32 B komt dit patroon misschien iets beter naar voren: felle bandjes bij het begin (behalve dan tijdspunt 1), welke lichter worden naar de mitosefase (punten 8-12) toe en naar het einde zijn opnieuw fellere bandjes zichtbaar (13, 14, 15). Aangezien via RT-PCR analyse het verwachte expressiepatroon van de histonen naar voren komt, kan men ook verwachten dat het expressiepatroon van O-GlcNAc transferase relatief realistisch kan ingeschat worden met behulp van 47 RT-PCR (Figuur 32 C). Op het eerste zicht lijkt het er op dat de eerste tijdspunten minder duidelijke bandjes opleveren (behalve 2 en 5) en dat er vanaf tijdspunt 7 wat meer expressie lijkt te zijn voor het O-GlcNAc transferase. 4.2.3 Western blot analyse Naast het samplen van gesynchroniseerde BY-2 cellen voor RNA extractie, werden ook om het uur (terug gedurende 15 uur) stalen genomen voor histonextractie en western blot analyse met anti-OGlcNAc. Op die manier kon het O-GlcNAc modificatieniveau van de histonen doorheen de celcyclus nagegaan worden. Cellen uit 8 ml celcultuur werden telkens geoogst met behulp van vacuümfiltratie. Om histonen te extraheren uit deze cellen werd een verkort histon extractieprotocol gebruikt: cellen werden gegrind in een mortier met vloeibare stikstof en vervolgens gevortexed in aanwezigheid van glazen beads om de cellen verder te lyseren. Na centrifugeren werd het supernatans met de histonen onderworpen aan een zuurextractie zoals beschreven in het samengesteld protocol voor histonopzuivering (3.2.3). Om te controleren of het verkort protocol voor histonopzuivering geslaagd was werd eerst een western blot analyse uitgevoerd op de geëxtraheerde eiwitfractie met anti H3 (Abcam, verdunning 1/30 000) en GAR als secundair antilichaam (Sigma, 1/25 000) (Figuur 33). Figuur 33: Western blot analyse met anti-H3 op histonen geëxtraheerd uit synchrone BY-2 cellen op verschillende punten in de celcyclus Uit figuur 33 blijkt dat de histonopzuivering geslaagd is voor alle verschillende stalen. Bij de western blot analyse van de eerste 9 tijdspunten is er meer aspecifieke interactie van het H3-antilichaam met andere eiwitten waar te nemen (de hoger gelegen bandjes). Op basis van de intensiteit van de bandjes is het moeilijk te zien of de hoeveelheid histon aanwezig verschilt doorheen de celcyclus. Normaal gezien zouden er tijdens de S-fase meer histonen moeten aanwezig zijn in de cellen. Vervolgens werd op diezelfde stalen een western blot analyse uitgevoerd met anti-O-GlcNAc antilichaam (Covenance, verdunning 1/1000) en RAM als secundair antilichaam (Sigma, verdunning 1/1000) (Figuur 34). In figuur 34 is te zien dat de eerste tijdspunten gekenmerkt worden door eerder lichte bandjes ter hoogte van de histonfracties (bandjes op deze hoogte kunnen H3, H2B, H2A zijn, H4 ligt wat lager). Vanaf tijdspunt 5 beginnen de H3 bandjes wat duidelijker te worden en worden wat intenser naar de latere tijdspunten toe. Aangezien de eerste tijdspunten en de allerlaatste 48 beiden met de S-fase overeen zouden moeten komen, is het vreemd dat volgens figuur 34 het O-GlcNAc modificatieniveau wel lijkt te verschillen tussen deze punten. Anderzijds komt het voorkomen van lichtere bandjes bij de eerste tijdspunten wel min of meer overeen met de trend te zien in figuur 32 C: het OGlcNAc transferase lijkt tijdens de eerste tijdspunten ook wat minder tot expressie te komen. Naast de bandjes ter hoogte van H3 zijn er nog verschillende bandjes zichtbaar. Dit is niet tegen de verwachtingen in aangezien histonen natuurlijk niet de enige zuuroplosbare proteïnen zijn die kunnen gemodificeerd zijn met O-GlcNAc residuen. Figuur 34: Western blot analyse met anti-O-GlcNAc op histonen geëxtraheerd uit synchrone BY-2 cellen op verschillende punten in de celcyclus 4.3 Aantonen van interactie tussen Nictaba en tabakhistonen 4.3.1 Far western blot Om de interactie na te gaan tussen de opgezuiverde, O-GlcNAc gemodificeerde tabakhistonen en Nictaba, werd een far western blot analyse gedaan. Een SDS-PAGE werd uitgevoerd met de opgezuiverde tabakhistonen van 6/3/2013. Twee laantjes van de gel werden geladen met ongeveer 2 µg van de opgezuiverde histonen. Vervolgens werd de far western blot uitgevoerd waarbij 10 ml (1 µg/ml Nictaba werd gebruikt en verdunningen van 1/80 voor primair antilichaam (anti-Nictaba) en 1/25 000 voor secundair antilichaam (GAR) (Figuur 36). Opmerkelijk is de donkere achtergrond. Dit is waarschijnlijk het gevolg van niet specifieke interactie tussen Nictaba en geglycosyleerde proteïnen van de blocking buffer (melkpoeder opgelost in trissaline). Het feit dat de ladder zichtbaar is doordat sommige laddereiwitten veel lichter zijn dan de achtergrond bevestigt deze hypothese: die plaatsen die al bezet waren met (niet geglycosyleerde) laddereiwitten vertonen geen interactie met Nictaba. In de toekomst zou kunnen gebruik gemaakt worden van een ander type blocking buffer welke minder geglycosyleerde eiwit bevat zoals BSA. Hierdoor zou het achtergrondsignaal verminderd worden. 49 Ondanks de donkere achtergrond zijn de bandjes toch duidelijk zichtbaar. Wanneer je deze blot vergelijkt met de gel van figuur 21 is het duidelijk dat het hier gaat om dezelfde eiwitten. Op basis van de far western blot blijkt er dus effectief interactie te zijn tussen Nictaba en de opgezuiverde tabakhistonen. Figuur 36: Far western blot analyse met opgezuiverde tabakhistonen als ‘prey’ proteïne en Nictaba als ‘bait’ 4.3.2 Lectine affiniteitschromatografie Om de interactie tussen Nictaba en tabakhistonen verder te bevestigen werd een tweede experiment uitgevoerd: een lectine affiniteitschromatografie waarbij histonen op een Nictabakolom gebracht werden. Aangezien histonopzuivering een lange tijd in beslag nam terwijl slechts een relatief laag rendement werd bekomen, waren ondanks de vele opzuiveringen geen grote hoeveelheden tabakhistonen beschikbaar voor het kolomexperiment. Dit bracht enkele complicaties met zich mee: een heel kleine kolom werd gebruikt, heel kleine fracties van het eluaat werden opgevangen (slechts 2 druppels, wat overeenkomt bepalingsmethoden zoals de met Pierce 80 µl) 660nm en de proteïne conventionele assay proteïneconcentratie werden vervangen door proteïneconcentratie bepaling door middel van de Nanodrop 2000. Een groot deel van de opgevangen eluaatfracties zou bij gebruik van de Pierce 660 nm assay namelijk verloren gaan aan concentratiebepaling, terwijl voor concentratiebepaling met behulp van de Nanodrop 2000 slechts 2 µl nodig is. Gezien deze complicaties werd geopteerd om de proefopzet eerst uit te testen, gebruik makend van commercieel verkrijgbare kalfthymus histonen. 4.3.2.1 Testen van de lectinekolom met kalfhistonen Eén milliliter met een concentratie van 3 mg/ml kalfhistonen werd op de Nictabakolom gebracht en de lectine affiniteitschromatografie werd uitgevoerd (3.6.1). Vervolgens werd de concentratie van de verschillende eluaatfracties bepaald met behulp van de Nanodrop 2000. De Nanodrop software gaat uit van een correlatie 1 absorptie-unit bij 280 nm = 1mg/ml. Voor een mengsel van kalfthymus 50 histonen blijkt echter de correlatie 0,3 Abs = 1mg/ml te gelden (http://www.yorkbio.com/histones.htm). De door de Nanodrop gemeten concentraties werden dan ook vermenigvuldigd met een factor 3,33. De concentraties met een negatieve waarde werden gelijkgesteld aan 0 en de concentraties van de verschillende fracties van het eluaat werden uitgezet in een grafiek (Figuur 37). Figuur 37: Elutieprofiel van de kalfhistonen op de Nictabakolom Een duidelijke elutiepiek is zichtbaar in figuur 37. Vanaf eluaatfractie 16 tot en met 19 stijgen de eiwitconcentraties waarna deze weer geleidelijk dalen. Dit wijst er dus op dat bepaalde eiwitten wel degelijk gebonden werden op de Nictabakolom. Om na te gaan of de eiwitten van de elutiepiek ook effectief histonen zijn, werd een western blot analyse (na SDS-PAGE) uitgevoerd op de fractie van het eluaat met de hoogste eiwitconcentratie met een antilichaam tegen H3 (Abcam, 1/30 000) en GAR als secundair antilichaam (Sigma, 1/25 000)(Figuur 38). Met diezelfde fractie werd ook een western blot analyse uitgevoerd met O-GlcNAc antilichaam (Covenance, 1/1000) en RAM als secundair antilichaam (Sigma, 1/1000) (Figuur 39). Figuur 38: Western blot analyse met Figuur 39: Western blot analyse met anti-H3 op eluaatfractie 19 van het anti-O-GlcNAc op eluaatfractie 19 van kolomexperiment met kalfhistonen het kolomexperiment met kalfhistonen 51 4.3.2.2 Lectine affiniteitschromatografie met opgezuiverde tabakhistonen Na de test met de kalfhistonen was voldoende expertise opgedaan om de lectine affiniteitschromatografie uit te voeren met de opgezuiverde tabakhistonen. Alle resterende histonen die ooit werden opgezuiverd werden gepoold en voor dit experiment gebruikt. De concentratie van de gepoolde histonen werd bepaald met behulp van de Pierce 660 nm proteïne assay. In totaal was 1,7 ml met een concentratie van ongeveer 590 µg/ml beschikbaar, een totale hoeveelheid van dus ongeveer 1 mg tabakhistonen. Dit was driemaal minder dan wat bij de test met kalfhistonen gebruikt werd. Figuur 40 geeft het elutieprofiel weer van het experiment. De hoogste eluaatconcentraties liggen hier opmerkelijk hoger dan bij het testexperiment met de kalfhistonen. Deze concentraties zijn niet zo realistisch. Wanneer men namelijk de concentraties van eluaat, wasoplossing en doorloop vermenigvuldigde met de respectievelijke opgevangen volumes, werd na het experiment een hogere hoeveelheid histonen bekomen dan waarmee gestart was. Hoewel met de Nanodrop dus geen correcte absolute concentraties konden bepaald worden, werd er wel van uitgegaan dat de relatieve verhoudingen van de concentraties juist zijn en bijgevolg ook de positie van de elutiepiek. Deze doet zich op exact dezelfde positie voor als bij het testexperiment. Figuur 40: Elutieprofiel van de tabakhistonen op de Nictabakolom Met de eluaatfracties met de hoogste proteïneconcentraties werd opnieuw een SDS-PAGE uitgevoerd voor enerzijds coomassie kleuring en anderzijds western blot analyse met O-GlcNAc antilichaam (Figuur 41). 52 A B Figuur 41:SDS-PAGE van elutiefracties 19 en 20 van het kolomexperiment met tabakhistonen. A: Coomassie kleuring. B: Western blot met anti-O-GlcNAc Hoewel de kwaliteit van de gel niet optimaal is, zijn ter hoogte van het 17 kD merkereiwit toch duidelijke bandjes te zien. De eiwitten met deze moleculaire massa kunnen overeenkomen met de histonfractie (meer bepaald de H3 en H2 varianten). Doordat de SDS-PAGE iets te vroeg gestopt is (zie sample buffer front in figuur 41 A) is scheiding van eiwitten met een aanzienlijk kleinere moleculaire massa dan 17 kD niet opgetreden en is bijgevolg niet te zien of H4 ook deel uitmaakt van de elutiefracties. In figuur 41 B is ook een signaal te zien ter hoogte van de histonfracties, wat er op wijst dat de histonen die interactie vertoonden met het Nictaba op de kolom inderdaad O-GlcNAc modificaties droegen. Op de hoogte tot waar de SDS-PAGE is gelopen, is ook een duidelijk signaal waar te nemen (smal intens bandje). Dit is mogelijks te verklaren door O-GlcNAc gemodificeerd H4 dat op deze hoogte aanwezig is. Om hier zeker over te zijn had de SDS-PAGE echter wat langer moeten duren waardoor scheiding van H4 mogelijk was. 4.3.3 Pull down assay Om interactie tussen Nictaba en tabakhistonen andermaal te bevestigen werd ook een pull down assay uitgevoerd (3.6.3). Hierbij werd een Nictaba-polyhistidine fusieproteïne gebruikt als ‘bait’ proteïne, waarbij het polyhistidine label instaat voor de binding van Nictaba aan de kobalt beads van de kolommen van de pull down kit. Als negatieve controle werd een tweede pull down assay in parallel uitgevoerd waarbij geen polyhistidine-Nictaba gebonden werd aan de kobalt beads. Als ‘prey’ proteïnen werden opgezuiverde histonen gebruikt. Door positieve en negatieve controle met elkaar te vergelijken kon men nagaan of het wel degelijk om specifieke interactie ging tussen histonen en Nictaba en dat histonen bijvoorbeeld niet louter weerhouden werden door hindering of niet-specifieke binding met de kobalt beads. 53 De gebonden proteïnen werden geëlueerd, geprecipiteerd met 100% TCA en vervolgens op gel gezet voor SDS-PAGE (Figuur 42). Figuur 42: SDS PAGE op eluaat van pull down assay: links: negatieve controle (geen Nictaba gebonden aan de beads). De aangeduide eiwitten weren geïdentificeerd aan de hand van MS analyse Het valt op dat de negatieve controle aanleiding geeft tot nagenoeg hetzelfde bandenpatroon als wanneer wel Nictaba aan de kobalt beads gebonden werd. Om deze reden rees het vermoeden dat er iets fout gelopen was tijdens de uitvoering van de pull down assay. Door de gelijkenis tussen positieve en negatieve controle kwam de vraag naar boven of het polyhistidine-Nictaba wel gebonden was aan de kobalt beads en niet gewoon was weggewassen. Om dit na te gaan werd een SDS-PAGE en western blot uitgevoerd (met anti-histidine antilichaam, Sigma) op de wasfractie na het toevoegen van Nictaba-His aan de kolommen (Figuur 43). Figuur 43: Western blot analyse met anti-His op wasfractie: rechts naar links: ladder, wasfractie Het onderste duidelijke bandje komt overeen met een Nictaba monomeer (19 kD). Het hogere bandje kan verklaard worden door aanwezigheid van Nictaba-dimeren (38 kD). De blot toont aan dat het Nictaba-his weggewassen is en niet blijven hangen is aan de kobalt beads. Verder is het ook niet uigesloten dat het kobalt weggewassen is van de beads. Normaal gezien zou het kobalt moeten zorgen voor een typisch paarse kleur van de kolommen. Dit was echter niet te zien tijdens de pull 54 down assay. De opgezuiverde histonen zijn dus niet-specifiek gebonden aan ofwel de kobalt beads of aan naakte beads. De bandjes op de SDS-PAGE gel werden uitgesneden en geanalyseerd met behulp van massaspectrometrie. Significantie identificaties kwamen overeen met H4, H3 en H2B (zie figuur 42 aangeduid met pijltjes). Ook via MS analyse bleek er geen verschil te zijn tussen positieve en negatieve controle. Aan de hand van de pull down assay werd er dus niet in geslaagd om interactie tussen Nictaba en histonen aan te tonen. Door middel van de MS resultaten werd echter nogmaals bewijs geleverd dat wel degelijk histonen werden opgezuiverd met behulp van het ‘hybride’ protocol. 55 5 Discussie Deze thesis had als doel het onderzoeken van de interactie tussen histonen van Nicotiana tabacum en Nictaba. Het eerste luik was het opzuiveren van histonen uit BY-2 cellen. Aangezien uit de literatuur blijkt dat interactie tussen histonen en Nictaba tot stand komt dankzij O-GlcNAc modificaties op de histonen (Schouppe, et al., 2011), was het van belang om na te gaan of de opgezuiverde histonen inderdaad over deze structuren beschikten. Eens voldoende O-GlcNAc gemodificeerde histonen verzameld werden, kon vervolgens in een tweede luik overgegaan worden tot het interactieonderzoek. Het is geweten dat het O-GlcNAc modificatie van eiwitten in dierlijke cellen, net als fosforylatie, een erg dynamisch proces is en dat het O-GlcNAc modificatieniveau en fosforylatieniveau celcyclus afhankelijk zijn. In planten is echter weinig geweten over het al dan niet celcyclus afhankelijk zijn van de O-GlcNAc modificatie. Om die reden werd in een derde luik van deze thesis gefocust op de synchronisatie van BY-2 cellen, om de celcyclus afhankelijkheid van deze suikermodificatie na te gaan. Informatie hieromtrent kan meer inzichten geven in de mogelijke functies van de O-GlcNAc modificatie van histonen en het belang ervan in de interactie met Nictaba. 5.1 Opzuiveren van histonen uit BY-2 cellen Aangezien de protocols voor histonopzuivering verkregen van Drs Daniel Buszewicz (Universiteit Warschau, Polen) enerzijds en beschreven door Trivedi, et al. (2012) anderzijds, geen bevredigende resultaten gaven, werd een ‘hybride’ protocol opgesteld. Dit protocol bestaat uit drie grote delen. Eerst werden BY-2 cellen omgevormd tot protoplasten waaruit vervolgens de kernen geëxtraheerd werden. Tenslotte werden de kernen onderworpen aan een zuurextractie om de zuuroplosbare histonen te isoleren van de andere kernproteïnen. Uit de microscopische analysen bleek dat protoplastvorming efficiënt was. Kernen werden vervolgens vrijgesteld uit deze protoplasten en onderworpen aan een iodixanol gradiënt om een nog zuiverder kernfractie te bekomen. Kernen gingen echter telkens verloren na applicatie van deze gradiënt waardoor er dan ook geopteerd werd om deze stap achterwege te laten, wat eveneens goede resultaten opleverde. Omdat de Bradford proteïne assay gevoelig is aan interferentie door detergenten (Friedenauer and Berlet, 1989) en doorheen het opzuiveringsprotocol met verschillende detergenten werd gewerkt, werd gebruik gemaakt van de Pierce 660 nm proteïne assay voor concentratiebepalingen voor het kwantificeren van de opgezuiverde histonen. SDS-PAGE gevolgd door coomassie staining , MS analyse, alsook western blot analyse met anti-H3 en anti-H4 antilichamen, leverden bewijs dat een relatief zuivere histonfractie werd opgezuiverd aan de hand van het samengestelde protocol. Opmerkelijk is dat bij de western blot analyse met H3 antilichaam twee bandjes zichtbaar zijn. Dit fenomeen wordt ook door antilichaam producerende bedrijven zoals Agrisera en Abcam op hun website 56 (http://www.agrisera.com/en/artiklar/h3-histone-h3.html, http://www.abcam.com/Histone-H3-di- methyl-K36-antibody-ChIP-Grade-ab9049.html) in de productinformatie van H3 antilichamen beschreven. Hsu, et al (2012) deden een studie naar de verschillende H3 varianten en hun posttranslationele modificaties in de protist Dictyostelium. De drie H3 varianten (H3a, H3b en H3c) van Dictyostelium bleken vooral overeenkomsten te vertonen met H3.3 van hogere eukaryoten. In deze studie werd ook een dubbel bandenpatroon verkregen bij western blot analyse met H3 antilichaam. Dit was te verklaren door de aanwezigheid van 3 extra aminozuren in de eiwitsequentie van H3a vergeleken met deze van H3b/H3c. Deze extra aminozuren liggen in het N-terminale deel van de eiwitsequenties en kunnen dus verschillende modificaties dragen. In de studie wordt er verder aangehaald dat variaties van aminozuren in de N-terminale delen van H3 varianten zeldzaam zijn, maar ook waargenomen werden bij sequenties van vermoedelijke H3 varianten in planten. Wanneer een western blot analyse werd uitgevoerd op histonen uit mutanten die deficiënt waren voor H3b en H3c, werd slechts één bandje waargenomen op de western blot (Hsu, et al., 2012). Aangezien hogere eukaryoten over nog veel meer verschillende H3 varianten beschikken, welke ook nog eens door vele verschillende genen worden gecodeerd, is het hoogstwaarschijnlijk dat het dubbele bandenpatroon het gevolg is van verschillende H3 varianten welke ook nog een verschillend aantal posttranslationele modificaties kunnen dragen. Voorbeelden van reeds geïdentificeerde posttranslationele modificaties van H3 zijn trimethylatie van lysine residuen H3K4, H3K36, H3K79, H3K9, H3K27 alsook verschillende acetylaties, methylaties en fosforylaties (Kouzarides, 2007). Daarnaast is aan de hand van massa spectrometrie aangetoond dat H3 ook over verschillende O-GlcNAc modificatie sites beschikt (Schouppe, et al., 2011; Fong, et al., 2012; Hanover, et al., 2012). Net zoals in de studies uitgevoerd door Sakabe, et al. (2010), Schouppe, et al. (2011), Zhang, et al. (2011) en Fong, et al. (2012) werd O-GlcNAcylatie van histonen in deze thesis ook aangetoond door middel van western blot analyse. Hieruit bleek dat ondanks de zuurextractie, de opgezuiverde tabakhistonen nog beschikten over O-GlcNAc modificaties. Het gebruikte antilichaam is niet eiwitspecifiek: alle O-GlcNAc modificaties worden gedetecteerd. De vele bandjes die gedetecteerd werden op de blot met zuurgeëxtraheerde eiwitfracties van de gesynchroniseerde cellen met het anti-O-GlcNAc antilichaam suggereren dat de eiwitfractie meerdere O-GlcNAc gemodificeerde eiwitten bevat. 5.2 Celsynchronisatie Flow cytometrische- en microscopische analyse waarbij de mitotische index bepaald werd, toonden aan dat de synchronisatie van BY-2 cellen met behulp van een aphidicoline behandeling geslaagd was. Om objectieve, kwantitatieve conclusies te kunnen trekken bij de western blot analyse moet met gelijke hoeveelheden eiwit voor elk staal gestart worden. Deze situatie kon benaderd worden aan de hand van eiwit concentratiebepaling en berekening van het benodigd volume eiwitsuspensie dat nodig was om met gelijke eiwithoeveelheden te werken. 57 Het verwachte celcyclus afhankelijke expressiepatroon van H3 en H1 (Meshi, et al. 2000) kwam niet eenduidig naar voren door middel van RT-PCR- en qPCR analyse. Voorzichtigheid is dus geboden bij de interpretatie van het expressiepatroon van O-GlcNAc transferase, zoals bepaald gebruik makend van deze technieken. Uitgaande van de resultaten van de western blot analyse, lijkt het erop dat histonen minder O-GlcNAc modificaties dragen in de S- en vroege G2 fase, en meer naar de mitose toe en hierna. Dit komt in zekere mate overeen met de RT-PCR resultaten van het O-GlcNAc transferase waar het enzym ook in de eerste uren na opheffen van de aphidicoline blok minder tot expressie lijkt te komen. Aangezien weinig geweten is over O-GlcNAc modificaties in planten en zeker over de eventuele celcyclus afhankelijkheid ervan, zijn deze data echter moeilijk te staven met de literatuur. Uit een studie van Zhang, et al (2011) op HeLA cellen bleek O-GlcNAc modificatie van histonen hoog te zijn in G1 cellen, vervolgens af te nemen in de S-fase, waarna een verhoging van OGlcNAc modificatie werd waargenomen in de G2 fase en behouden bleef gedurende de mitose. Dit komt overeen met de resultaten van de western blot analyse uit deze thesis. In een studie van Fong, et al (2012) waarbij ook gewerkt werd met HeLa cellen kwam dan weer het omgekeerde naar voren: daar bleek H3 minder O-GlcNAc gemodificeerd te zijn in mitotische cellen en meer in niet-mitotische. De betekenis van de bekomen resultaten is dan ook moeilijk in te schatten. Verder dient ook opgemerkt te worden dat met behulp van western blot analyse men ook enkel het globale O-GlcNAc modificatieniveau nagaat, terwijl studies hebben uitgewezen dat de functie van OGlcNAcylatie site-specifiek is. Zo is O-GlcNAcylatie van welbepaalde histon aminozuurresiduen gecorreleerd met euchromatine terwijl O-GlcNAcylatie van andere histon sites dan weer geassocieerd wordt met heterochromatine (Fujiki, et al., 2011; Hanover, et al., 2012). Hieruit blijkt dat de O-GlcNAc modificatie geen eenduidige functie heeft. Zo zou het kunnen dat bepaalde sites tijdens de mitose, of een andere fase in de celcyclus, meer gemodificeerd zijn met O-GlcNAc terwijl voor andere sites het tegenovergestelde geldt. 5.3 Interactieonderzoek Het resultaat van de far western blot was duidelijk positief, wat een eerste bewijs leverde voor de interactie tussen de opgezuiverde tabakhistonen en Nictaba. Zowel bij het testexperiment met de kalfhistonen, als bij het experiment met opgezuiverde tabakhistonen was er een duidelijke elutiepiek na chromatografie van de eiwitfracties op de Nictaba kolom. Coomassie staining en western blot analyse toonden aan dat de fracties van de elutiepiek met de hoogste concentraties inderdaad histonen bevatten en dat deze O-GlcNAc gemodificeerd waren. In een studie van Schouppe et al (2011) werd eenzelfde kolomexperiment uitgevoerd met dezelfde commercieel beschikbare kalfhistonen. Bewijs dat de interactie tussen de kalfhistonen en de Nictabakolom specifiek was en het gevolg van de O-GlcNAc modificaties, werd enerzijds geleverd door het feit dat de gebonden kalfhistonen van de Nictabakolom konden geëlueerd worden met behulp van GlcNAc oligomeren. Anderzijds bewees de binding van dezelfde histonen aan een WGA kolom (lectine met specifieke affiniteit voor GlcNAc oligomeren) en de aanwezigheid van O-GlcNAc 58 modificaties op de geëlueerde histonen van beide kolommen, bevestigd door MS analyse, verder de specificiteit van de interactie. Deze studie is dus een onrechtstreeks bewijs dat de binding van de opgezuiverde tabakhistonen aan de Nictabakolom (die met behulp van DAP geëlueerd werden) in deze thesis, het gevolg was van specifieke interacties. Op basis van de resultaten van de far western blot en de kolomexperimenten kan men dus besluiten dat er inderdaad interactie is tussen Nictaba en O-GlcNAc gemodificeerde tabakhistonen. 5.4 Verder onderzoek In deze thesis werden histonen opgezuiverd uit BY-2 cellen en werd aan de hand van western blot analyse aangetoond dat deze O-GlcNAc modificaties droegen. Een bevestiging van de aanwezigheid van deze suikerresiduen zou bijvoorbeeld kunnen geleverd worden door MS analyse zoals uitgevoerd door Sakabe, et al. (2010), Schouppe, et al. (2011) en Fong, et al. (2012). In tegenstelling tot plantencellen zijn in dierlijke cellen reeds verschillende O-GlcNAc modificatiesites geïdentificeerd aan de hand van MS analyse. Het zou interessant zijn dat dergelijke O-GlcNAc modificatiesites op plantenhistonen ook in kaart gebracht werden. In deze thesis werden veranderingen in O-GlcNAc modificatieniveau doorheen de celcyclus nagegaan met behulp van western blot analyse met een O-GlcNAc antilichaam. Zoals reeds gezegd heeft dit het nadeel dat slechts een globaal beeld van het O-GlcNAc modificatieniveau wordt bekomen, terwijl O-GlcNAc modificatie zeer site-specifiek kan zijn. Met behulp van MS zou men dan de O-GlcNAcylatie van specifieke sites kunnen opvolgen in functie van de celcyclus. Uit deze thesis is ook gebleken dat relatieve qPCR niet echt ideaal lijkt te zijn voor het nagaan van het O-GlcNAc transferase expressiepatroon. De expressie van het O-GlcNAc transferase werd vergeleken met de expressie van enkele referentiegenen. Zoals reeds gezegd kan het echter zijn dat de expressie van de referentiegenen ook fluctueert in functie van de celcyclus, waardoor geen besluit kan getrokken worden in verband met expressie van O-GlcNAc transferase. Absolute qPCR biedt misschien een uitweg. Hierbij wordt namelijk de expressie van een bepaald gen niet vergeleken met een referentiegen, maar wordt het absolute aantal initiële kopijen mRNA (of cDNA) bepaald op basis van een standaardcurve. Verdunningen van een gekende hoeveelheid cDNA van het desbetreffende gen worden gemaakt. Op deze verdunningen wordt vervolgens een qPCR analyse uitgevoerd en een standaardcurve wordt opgesteld waarbij het initieel aantal cDNA kopijen wordt uitgezet tegenover de CT waarde. Het gen waarvoor een standaardcurve dient verkregen te worden, kan dan aangemaakt worden in een plasmide vector, en na concentratiebepaling kan tenslotte de gewenste verdunningsreeks gemaakt worden (Bustin, 2000). Op die manier kan misschien een meer betrouwbaar inzicht verkregen worden in het expressieniveau van O-GlcNAc transferase. Door middel van far western blotting en lectine-affiniteitschromatografie werd aangetoond dat deze opgezuiverde histonen interageren met Nictaba. Door het feit dat de concentratiebepaling bij de affiniteitschromatografie geen absolute correcte waarden opleverde (de onderste limiet voor concentratiebepaling door middel van de A280 methode van de Nanodrop is 100µg/ml, 59 http://www.nanodrop.com/Library/SPS_NanoDrop_HandOut_f.pdf), werd echter geen kwantitatieve informatie gewonnen over de efficiëntie van de interactie en de interactiekinetiek. Analyse met behulp van biosensoren op basis van het Surface Plasmon Resonance (SPR) principe kunnen hiervoor interessant zijn. Deze techniek laat namelijk toe om de specifieke interactiekinetiek te bepalen. 5.5 Conclusie Een efficiënt protocol werd opgesteld voor het opzuiveren van histonen uit BY-2 cellen. Deze cellen bleken O-GlcNAc gemodificeerd te zijn waardoor kon overgegaan worden tot het testen van interactie tussen de opgezuiverde histonen en Nictaba. Door middel van far western blotting en lectine-affiniteitschromatografie werd aangetoond dat inderdaad interactie optreedt. Kwantitatieve informatie omtrent bindingsefficiëntie en –kinetiek ontbreekt echter. BY-2 cellen werden succesvol gesynchroniseerd. Met behulp van RT-PCR en qPCR kon expressie van O-GlcNAc transferase echter moeilijk in kaart gebracht worden. Aan de hand van western blot analyse werd ook de celcyclus afhankelijkheid van het O-GlcNAc modificatieniveau van histonen nagegaan. Histonen lijken minder O-GlcNAc modificaties te dragen in de S- en vroege G2 fase, en meer naar de mitose toe en hierna. Deze bevindingen worden zowel bevestigd als tegengesproken in de literatuur. Om te weten wat het belang is van interactie tussen histonen en Nictaba bij epigenetische regulatie van genexpressie, en wat de link is tussen deze interactie en het expressieprofiel van het lectine, moeten nog heel wat puzzelstukjes op zijn plaats vallen. 60 6 Referenties 6.1 Artikels en boeken Arents, G., Burlingame, R.W., Wang, B.C., Love, W.E. and Moudrianakis, E.N. 1991. The nucleosomal core histone octamer at 3.1-Å resolution - a tripartite protein assembly and a lefthanded superhelix. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 88: 10148-10152. Arifuzzaman, M., Maeda, M., Itoh, A., Nishikata, K., Takita, C., Saito, R., Ara, T., Nakahigashi, K., Huang, H.C., Hirai, A., Tsuzuki, K., Nakamura, S., Altaf-Ul-Amin, M., Oshima, T., Baba, T., Yamamoto, N., Kawamura, T., Ioka-Nakamichi, T., Kitagawa, M., Tomita, M., Kanaya, S., Wada, C. and Mori, H. 2006. Large-scale identification of protein-protein interaction of Escherichia coli K-12. Genome Research, 16: 686-691. Ayyar, B.V., Arora, S., Murphy, C. and O'Kennedy, R. 2012. Affinity chromatography as a tool for antibody purification. Methods, 56: 116-129. Banerjee, S., Robbins, P.W. and Samuelson, J. 2009. Molecular characterization of nucleocytosolic O-GlcNAc transferases of Giardia lamblia and Cryptosporidium parvum. Glycobiology, 19: 331-336. Bartlett, J.M. and Stirling, D. 2003. A short history of the polymerase chain reaction. Methods in Molecular Biology, 226: 3-6. Bartova, E., Krejci, J., Harnicarova, A., Galiova, G. and Kozubek, S. 2008. Histone modifications and nuclear architecture: A review. Journal of Histochemistry & Cytochemistry, 56: 711-721. Braszewska-Zalewska, A., Dziurlikowska, A. and Maluszynska, J. 2012. Histone H3 methylation patterns in Brassica nigra, Brassica juncea, and Brassica carinata species. Genome, 55: 68-74. Bustin, S. A. 2000. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. Journal of Molecular Endocrinology, 25: 169-193. Chen, Y., Peumans, W.J., Hause, B., Bras, J., Kumar, M., Proost, P., Barre, A., Rouge, P. and Van Damme, E.J.M. 2002. Jasmonic acid methyl ester induces the synthesis of a cytoplasmic/nuclear chito-oligosaccharide binding lectin in tobacco leaves. The FASEB Journal, 16: 905-907. Claes, B., Dekeyser, R., Villarroel, R., Vandenbulcke, M., Bauw, G., Vanmontagu, M. and Caplan, A. 1990. Characterization of a rice gene showing organ-specific expression in response to salt stress and drought. Plant Cell, 2: 19-27. D'Andrea, L.D. and Regan, L. 2003. TPR proteins: the versatile helix. Trends in Biochemical Sciences, 28: 655-662. 61 Delporte, A., Van Holle, S. and Van Damme, E.J.M 2013. Qualitative and quantitative analysis of the Nictaba promoter activity during development in Nicotiana tabacum. Plant Physiology and Biochem istry, 67: 162-168. Delporte, A., Lannoo, N., Vandenborre, G., Ongenaert, M. and Van Damme, E.J.M. 2011. Jasmonate response of the Nicotiana tabacum agglutinin promoter in Arabidopsis thaliana. Plant Physiology and Biochemistry, 49: 843-851. Fischle, W., Wang, Y.M. and Allis, C.D. 2003. Histone and chromatin cross-talk. Current Opinion in Cell Biology, 15: 172-183. Fong, J.J., Nguyen, B.L., Bridger, R., Medrano, E.E., Wells, L., Pan, S. and Sifers, R. N. 2012. Beta-NAcetylglucosamine (O-GlcNAc) is a novel regulator of mitosis-specific phosphorylations on histone H3. Journal of Biological Chemistry, 287: 12195-12203. Fowler, S., Lee, K., Onouchi, H., Samach, A., Richardson, K., Coupland, G. and Putterill, J. 1999. GIGANTEA: a circadian clock-controlled gene that regulates photoperiodic flowering in Arabidopsis and encodes a protein with several possible membrane-spanning domains. EMBO Journal, 18: 46794688. Friedenauer, S. and Berlet, H.H. 1989. Sensitivity and variability of the Bradford protein assay in the presence of detergents. Analytical Biochemistry, 178: 263-268. Fujiki, R., Hashiba, W., Sekine, H., Yokoyama, A., Chikanishi, T., Ito, S., Imai, Y., Kim, J., He, H.H., Igarashi, K., Kanno, J., Ohtake, F., Kitagawa, H., Roeder, R.G., Brown, M. and Kato, S. 2011. GlcNAcylation of histone H2B facilitates its monoubiquitination. Nature, 480: 557-U188. Geelen, D.N.V. and Inze, D.G. 2001. A bright future for the bright yellow-2 cell culture. Plant Physiology, 127: 1375-1379. Greenboim-Wainberg, Y., Maymon, I., Borochov, R., Alvarez, J., Olszewski, N., Ori, N., Eshed, Y. and Weiss, D. 2005. Cross talk between gibberellin and cytokinin: The Arabidopsis GA response inhibitor SPINDLY plays a positive role in cytokinin signaling. Plant Cell, 17: 92-102. Hanover, J.A. 2006. Deciphering the 'O-GlcNAc code': Lessons from C. elegans and human disease. Glycobiology, 16: 1105-1105. Hanover, J.A., Krause, M.W. and Love, D.C. 2010. The hexosamine signaling pathway: O-GlcNAc cycling in feast or famine. Biochimica et Biophysica Acta-General Subjects, 1800: 80-95. Hanover, J.A., Krause, M.W. and Love, D.C. 2012. Bittersweet memories: linking metabolism to epigenetics through O-GlcNAcylation. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 13: 312-321. Happel, N. and Doenecke, D. 2009. Histone H1 and its isoforms: Contribution to chromatin structure and function. Gene, 431: 1-12. 62 Hart, G.W., Housley, M.P. and Slawson, C. 2007. Cycling of O-linked beta-N-acetylglucosamine on nucleocytoplasmic proteins. Nature, 446: 1017-1022. Hartweck, L.M., Genger, R.K., Grey, W.M. and Olszewski, N.E. 2006. SECRET AGENT and SPINDLY have overlapping roles in the development of Arabidopsis thaliana L. Heyn. Journal of Experimental Botany, 57: 865-875. Hartweck, L.M., Scott, C.L. and Olszewski, N.E. 2002. Two O-linked N-acetylglucosamine transferase genes of Arabidopsis thaliana L. Heynh. have overlapping functions necessary for gamete and seed development. Genetics, 161: 1279-1291. Hsu, D.W., Chubb, J.R., Muramoto, T., Pears, C.J. and Mahadevan, L.C. 2012. Dynamic acetylation of lysine-4-trimethylated histone H3 and H3 variant biology in a simple multicellular eukaryote. Nucleic Acids Research, 40: 7247-7256. Hu, P., Shimoji, S. and Hart, G.W. 2010. Site-specific interplay between O-GlcNAcylation and phosphorylation in cellular regulation. FEBS Letters, 584: 2526-2538. Kilcoyne, M., Shah, M., Gerlach, J.Q., Bhavanandan, V., Nagaraj, V., Smith, A.D., Fujiyama, K., Sommer, U., Costello, C.E., Olszewski, N. and Joshi, L. 2009. O-glycosylation of protein subpopulations in alcohol-extracted rice proteins. Journal of Plant Physiology, 166: 219-232. Kouzarides, T. 2007. Chromatin modifications and their function. Cell, 128: 693-705. Kumagai-Sano, F., Hayashi, T., Sano, T. and Hasezawa, S. 2006. Cell cycle synchronization of tobacco BY-2 cells. Nature Protocols, 1: 2621-2627. Lannoo, N. and Van Damme, E.J.M 2010. Nucleocytoplasmic plant lectins. Biochimica et Biophysica Acta, 1800: 190-201. Lannoo, N., Peumans, W.J. and Van Damme, E.J.M. 2006. The presence of jasmonate-inducible lectin genes in some but not all Nicotiana species explains a marked intragenus difference in plant responses to hormone treatment. Journal of Experimental Botany, 57: 3145-3155. Lannoo, N., Peumans, W.J. and Van Damme, E.J.M. 2008. Do F-box proteins with a C-terminal domain homologous with the tobacco lectin play a role in protein degradation in plants? Biochemical Society Transactions, 36: 843-847. Lannoo, N., Peumans, W.J., Van Pamel, E., Alvarez, R., Xiong, T.C., Hause, G., Mazars, C. and Van Damme, E.J.M. 2006. Localization and in vitro binding studies suggest that the cytoplasmic/nuclear tobacco lectin can interact in situ with high-mannose and complex N-glycans. FEBS Letters, 580: 6329-6337. Lannoo, N., Vandenborre, G., Miersch, O., Smagghe, G., Wasternack, C., Peumans, W.J. and Van Damme, E.J.M. 2007. The jasmonate-induced expression of the Nicotiana tabacum leaf lectin. Plant and Cell Physiology, 48: 1207-1218. 63 Lee, J.Y., Yoo, B.C. and Lucas, W.J. 2000. Parallels between nuclear-pore and plasmodesmal trafficking of information molecules. Planta, 210: 177-187. Luger, K., Mader, A.W., Richmond, R.K., Sargent, D.F. and Richmond, T.J. 1997. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 angstrom resolution. Nature, 389: 251-260. Maymon, I., Greenboim-Wainberg, Y., Sagiv, S., Kieber, J. J., Moshelion, M., Olszewski, N. and Weiss, D. 2009. Cytosolic activity of SPINDLY implies the existence of a DELLA-independent gibberellin-response pathway. Plant Journal, 58: 979-988. Meshi, T., Taoka, K. and Iwabuchi, M. 2000. Regulation of histone gene expression during the cell cycle. Plant Molecular Biology, 43: 643-657. Nagata, T., Nemoto, Y. and Hasezawa, S. 1992. Tobacco BY-2 cell-line as the Hela-cell in the cell biology of higher-plants. International Review of Cytology-a Survey of Cell Biology, 132: 1-30. Nakayama, T., Ishii, T., Hotta, T. and Mizuno, K. 2008. Radial microtubule organization by histone H1 on nuclei of cultured tobacco BY-2 cells. Journal of Analytical Chemistry, 283: 16632-16640. Olszewski, N.E., West, C.M., Sassi, S.O. and Hartweck, L.M. 2010. O-GlcNAc protein modification in plants: Evolution and function. Biochimica et Biophysica Acta-General Subjects, 1800: 49-56. Oulee, T.M., Turgeon, R. and Wu, R. 1986. Expression of a foreign gene linked to either a plant-virus or a Drosophila promoter, after electroporation of protoplasts of rice, wheat, and sorghum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 83: 6815-6819. Peumans, W.J. and Van Damme, E.J.M. 1995. Lectins as plant defense proteins. Plant Physiology, 109: 347-352. Peumans, W.J., Barre, A., Hao, Q., Rouge, P. and Van Damme, E.J.M. 2000. Higher plants developed structurally different motifs to recognize foreign glycans. Trends in Glycoscience and Glycotechnology, 12: 83-101. Peumans, W.J., Fouquaert, E., Jauneau, A., Rouge, P., Lannoo, N., Hamada, H., Alvarez, R., Devreese, B. and Van Damme, E.J.M. 2007. The liverwort Marchantia polymorpha expresses orthologs of the fungal Agaricus bisporus agglutinin family. Plant Physiology, 144: 637-647. Ramakrishnan, V. 1997. Histone structure and the organization of the nucleosome. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure, 26: 83-112. Rao, K.S. and Prakash, A.H. 1995. A simple method for the isolation of plant protoplasts. Journal of Biosciences, 20: 645-655. Rattray, A.M.J. and Muller, B. 2012. The control of histone gene expression. Biochemical Society Transactions, 40: 880-885. 64 Safina, G. 2012. Application of surface plasmon resonance for the detection of carbohydrates, glycoconjugates, and measurement of the carbohydrate-specific interactions: a comparison with conventional analytical techniques. A critical review. Analytica Chimica Acta, 712: 9-29. Safina, G., Duran Iu, B., Alasel, M. and Danielsson, B. 2011. Surface plasmon resonance for real-time study of lectin-carbohydrate interactions for the differentiation and identification of glycoproteins. Talanta, 84: 1284-1290. Sakabe, K., Wang, Z. and Hart, G.W. 2010. Beta-N-acetylglucosamine (O-GlcNAc) is part of the histone code. Proceedings of the National Academy of Sciences., 107: 19915-19920. Scarano, S., Mascini, M., Turner, A.P.F. and Minunni, M. 2010. Surface plasmon resonance imaging for affinity-based biosensors. Biosensors & Bioelectronics, 25: 957-966. Schouppe D. 2010. Functional characterization of the tobacco lectin. Doctoraatsproefschrift. FBW Schouppe, D., Ghesquiere, B., Menschaert, G., De Vos, W.H., Bourque, S., Trooskens, G., Proost, P., Gevaert, K. and Van Damme, E.J.M. 2011. Interaction of the tobacco lectin with histone proteins. Plant Physiology, 155: 1091-1102. Shechter, D., Dormann, H.L., Allis, C.D. and Hake, S.B. 2007. Extraction, purification and analysis of histones. Nature Protocols, 2: 1445-1457. Shimada, A., Ueguchi-Tanaka, M., Sakamoto, T., Fujioka, S., Takatsuto, S., Yoshida, S., Sazuka, T., Ashikari, M. and Matsuoka, M. 2006. The rice SPINDLY gene functions as a negative regulator of gibberellin signaling by controlling the suppressive function of the DELLA protein, SLR1, and modulating brassinosteroid synthesis. Plant Journal, 48: 390-402. Stepinski, D. 2012. Levels of DNA methylation and histone methylation and acetylation change in root tip cells of soybean seedlings grown at different temperatures. Plant Physiology and Biochemistry, 61: 9-17. Taoka, K., Ham, B.K., Xoconostle-Cazares, B., Rojas, M.R. and Lucas, W.J. 2007. Reciprocal phosphorylation and glycosylation recognition motifs control NCAPP1 interaction with pumpkin phloem proteins and their cell-to-cell movement. Plant Cell, 19: 1866-1884. Trivedi, I., Rai, K.M., Singh, S.K., Kumar, V., Singh, M., Ranjan, A., Lodhi, N. and Sawant, S.V. 2012. Analysis of histones and histone variants in plants. Methods in Molecular Biology, 833: 225-236. Tseng, T.S., Salome, P.A., McClung, C.R. and Olszewski, N.E. 2004. SPINDLY and GIGANTEA interact and act in Arabidopsis thaliana pathways involved in light responses, flowering, and rhythms in cotyledon movements. Plant Cell, 16: 1550-1563. Van Damme, E.J.M., Lannoo, N. and Peumans, W.J. 2008. Plant Lectins. Advances in Botanical Research, 48: 107-209. 65 Van Damme, E.J.M., Lannoo, N., Fouquaert, E. and Peumans, W.J. 2003. The identification of inducible cytoplasmic/nuclear carbohydrate-binding proteins urges to develop novel concepts about the role of plant lectins. Glycoconjugate Journal, 20: 449-460. Vandenborre, G., Groten, K., Smagghe, G., Lannoo, N., Baldwin, I.T. and Van Damme, E.J.M. 2010. Nicotiana tabacum agglutinin is active against Lepidopteran pest insects. Journal of Experimental Botany, 61: 1003-1014. Wu, Y.L., Li, Q. and Chen, X.Z. 2007. Detecting protein-protein interactions by far western blotting. Nature Protocols, 2: 3278-3284. Xiong, T.C., Jauneau, A., Ranjeva, R. and Mazars, C. 2004. Isolated plant nuclei as mechanical and thermal sensors involved in calcium signalling. Plant Journal, 40: 12-21. Zhang, S., Roche, K., Nasheuer, H.P. and Lowndes, N.F. 2011. Modification of histones by sugar betaN-acetylglucosamine (GlcNAc) occurs on multiple residues, including histone H3 serine 10, and is cell cycle-regulated. Journal of Biological Chemistry, 286: 37483-37495. 6.2 Websites www.abcam.com/Chicken-Erythrocyte-Histone-Octamers-protein-Loading-Control-ab45275.html www.abcam.com/Histone-H3-di-methyl-K36-antibody-ChIP-Grade-ab9049.html www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&rid=11446 www.agrisera.com/en/artiklar/h3-histone-h3.html, www.bioworld.com/productinfo/2_31_835_227/5309/Cellulase-RS-Onozuka-RS.html). www.botanical.com www.crbdiscovery.com/newsletter/z_images/may/westar-diagram.jpg www.ehow.com www.intechopen.com/source/html/18770/media/image3.png www.jlhudsonseeds.net/SeedlistN.htm www.komabiotech.co.kr/www/techniques/immunodection/wbProtocol.html www.nanodrop.com/Library/SPS_NanoDrop_HandOut_f.pdf www.piercenet.com www.york-bio.com/histones.htm 66
