Samenvatting

Samenvatting Samenvatting Er is een steeds groter aantal bacteriestammen dat resistent wordt tegen meerdere antibiotica. Deze multi‐drug resisitente bacteriën vormen een grote bedreiging voor de volksgezondheid. Om deze bacteriën ook in de toekomst te kunnen bestrijden moeten er een aantal stappen worden genomen. Ten eerste, naast het verbeteren van de huidige antibiotica, moet er geïnvesteerd worden in het ontwikkelen van nieuwe typen antibiotica. Daarnaast moet er worden gezocht naar mogelijke nieuwe doelen voor antibiotica. Hoofdstuk 2 van dit proefschrift beschrijft de ontdekking van een nieuw doel voor antibiotica. Remmers van het enzym “protein kinase B” (PKB/Akt1) worden op dit moment ontwikkeld als anti‐tumor medicijn. Ditzelfde enzym blijkt ook nodig te zijn voor sommige pathogene bacteriën, zoals Salmonella, om in de gastheer cel te kunnen overleven. Remmers van dit enzym zijn dus niet alleen te gebruiken als anti‐tumor medicijn, maar mogelijk ook als antibiotica. Hoofdstuk 3 beschrijft de synthese van een aantal verbindingen die analoog zijn van een bekende remmer van protein kinase A (H‐89), met als doel een actieve en selectieve remmer voor PKB/Akt1 te maken. Verschillende modificaties aan de structuur van deze verbinding onthulde twee posities die gebruikt konden worden om uitgaande van deze PKA 153 Samenvatting remmer, een remmer voor PKB te maken. Vervolgens wordt beschreven hoe een serie nieuwe verbindingen werd gesynthetiseerd en getest op hun potentie om PKB/Akt1 te remmen en zodoende de groei van Salmonella in de cel tegen te gaan. Dit leidde tot een nieuwe verbinding die, in vergelijking met H‐89, een vergelijkbare activiteit heeft voor PKB/Akt1 en een sterk verminderde activititeit voor PKA. Deze resultaten leidden tot nieuwe inzichten in de structuur‐activititeits relatie van dit type verbinding. Hoofdstuk 4 laat zien hoe de serie potentiële remmers voor PKB/Akt1 verder werd uitgebreid met een bibliotheek van 63 verbindingen die op een parallelle manier gemaakt werden. Kationische antimicrobiële peptides zijn antibiotica die werken op het membraan van bacteriën. Een voorbeeld van zo’n peptide is het natuurlijk voorkomende Gramicidine S (GS). Deze verbinding is echter ook hemolitisch, dat wil zeggen toxisch voor rode bloedcellen. In Hoofdsuk 5 van dit proefschrift wordt het onderzoek beschreven dat gaat over het modiciferen van GS met als doel de bijwerkingen te verminderen. GS is een cyclisch decapeptide dat is opgebouwd uit twee β‐strands, bestaande uit een leucine, ornithine en een valine residu, die aan elkaar gekoppeld zijn door twee type II’ β‐turns die elk bestaan uit een D‐phenylalanine en een proline residu. Middels het gebruik van suiker aminozuren als vervangers voor één van de turns kunnen GS analoga met nieuwe eigenschappen verkregen worden. Eerder onderzoek leerde dat het gebruik van een furanoïde suiker aminozuur leidde tot een GS analoog met een andere secundaire structuur in vergelijking met GS zelf, maar met een vergelijkbare antimicrobiële en hemolitische activititeit. Dit hoofdstuk beschrijft de synthese van drie nieuwe suiker aminozuren, één furanoïde en twee lineaire, en hun toepassing als β‐turn vervangers in nieuwe GS analoga. De structuur van deze analoga werd onderzocht met behulp van 1D en 2D NMR analyse. Hieruit bleek dat de structuur van het GS analoog met de furanoïde suiker aminozuur vergelijkbaar was met die van de eerder gemaakte GS analoog. De structuur van de analoga met de lineaire suiker aminozuren kwam weer overeen met die van natuurlijk GS. De antimicrobiële activiteit van alle drie de analoga waren vergelijkbaar met die van GS. Echter, de hemolitische activiteit van één van de analoga met een lineair suiker aminozuur was sterk verminderd. De reden van deze verminderde toxiciteit moet nog nader worden onderzocht. Het gebruik van suiker aminozuren als vervangers voor een dipeptide motief van een ander kationisch antimicrobiëel peptide, Loloatine C wordt in hoodstuk 6 beschreven. De biologisch active conformatie is een flexibele haltervormige structuur. De synthese van drie suiker amino zuur 154 Samenvatting bevattende Loloatine C analoga alsmede de bepaling van hun structuur in oplossing en hun biologische activiteit worden in dit hoofstuk beschreven. Afhankelijk van de positie van het suiker aminozuur in de cyclische peptides werd een meer of minder gedefiniëerde structuur gevonden. De biologische activiteit van de nieuwe analoga was beduidend lager dan die van Loloatine C zelf. Ook worden in dit hoofdstuk drie Loloatine C derivaten beschreven waarbij alleen de stereochemie van bepaalde residuen is veranderd met als doel te kijken of er hybride structuren tussen GS en Loloatine C gemaakt konden worden met gunstige biologische eigenschappen. Uit NMR analyse bleek één analoog een vergelijkbare structuur te hebben als Loloatine C. Helaas bleek geen van de hybride structuren biologisch actief. Hoofdstuk 7 beschrijft de synthese van een gebiotinyleerd methylfluorofosfonaat. Dit reagens werd voor twee studies gebruikt. In de eerste studie werd gezocht naar secundaire doel eiwitten die geremd worden door het zenuwgas sarin. Competitie experimenten tussen de gebiotinyleerde probe en sarin in lever homogenaten, longcellen en longcel lysaten resulteerde in de identificatie van 8 eiwitten die competetief geremd werden door sarin. In een tweede studie werd het methylfluorofosfonaat gebruikt voor de isolatie van butyrylcholinesterase uit plasma. Dit enzym kan preventief gebruikt worden ter bescherming tegen blootstelling aan zenuwgassen. De methode die in dit hoofdstuk beschreven wordt is een goed uitgangspunt voor het optimaliseren van de huidige, arbeidsintensieve, isolatie procedure voor dit enzym. Het werk beschreven in dit proefschrift concentreert zich op de ontwikkeling van nieuwe antibiotica. In de hoofdstukken 2 – 4 worden de ontwikkeling van selectievere remmers van PKB/Akt1 en hun toepassing als antibioticum beschreven. In hoofdstuk 8 worden nieuwe mogelijkheden gepresenteerd die toegepast kunnen worden in de ontwikkeling van nog potentere en selectievere remmers. Ook worden nieuwe voorstellen gedaan voor de toepassing van de kennis die is opgedaan naar aanleiding van de resultaten met suiker amino zuren als dipetide vervangers die beschreven zijn in de hoofdstukken 5 en 6. Tenslotte worden suggesties gedaan die kunnen helpen met het optimaliseren van de isolatieprocedure van butyrylcholinesterase uit plasma. 155