Voedselpathogenen

Voedselpathogenen
Hfst 1: Inleiding
1.1 indeling
voedselinfecties
voedselintoxicaties


Veroorzaakt door de bacterie zelf
Veroorzaakt door M.O. die in staat zijn enterotoxinen te vormen
1.2 terminologie
toxinen

organische moleculen die door M.O. geproduceerd worden
|
|- Endotoxinen - Worden in het cellichaam geproduceerd, komen vrij na lysis van de
cel
- Zwak antigenisch
- Thermostabiel
- Vooral door G- gevormd
|
|- Exotoxinen  - Worden gesecreteerd in het milieu
- = Proteïnen
- Vooral door G+ gevormd
- Sterk antigenisch
Antitoxinen
Toxoïde
Anatoxine
 Antistoffen die door het lichaam gevormd worden in het bloed, de
weefsels en de melk.
 Is een niet giftige vorm van een toxine die verkregen word door het
toxine te laten verouderen.
 Niet giftige vorm van een toxine, bekomen door een
formolbehandeling
1.3 werking van toxinen volgens de zijketen theorie van EHR-lich
1.4 het belang van toxinen in voedingsmiddelen
- M.O. zijn macroscopisch zichtbaar (kleur, geur, smaak,…)
- Toxinen zijn
* niet macroscopisch zichtbaar
* bestand tegen meeste bewaringsmethoden
* door levende actieve cellen geproduceerd
* niet gevormd door sporen, hun sporen kunnen ontkiemen tot vegetatieve cellen bij
bereiding, …
Hfst 2: Voedselvergiftigingen
2.1 inleiding
Verhitte levensmiddelen zijn het meest verantwoordelijk voor voedselintoxicaties
1
2.2 botulisme
2.2.1 Clostridium botulinum
= boterzuurbacterie
- behoort tot de familie van Bacillaceae
Kenmerken
* Gram positief
* Strikt anaërobe kiem
* sporen zijn hitte resistent
* toxinen zijn thermolabiel
2.2.2 botulinumtoxine
* Indien verhit, recipiënt kan nog sporen bevatten.
* Komen bij verhoogde bewaartemperatuur uit en kunnen zo toxinen maken in het
voedingsmiddel.
* mens word vergiftigd als het toxine geabsorbeerd word in het spijsverteringskanaal.
2.2.2.1 stabiliteit
De toxinen bestaan uit 2 delen:
1) toxisch component, is een neurotoxine
2) niet toxische component, beschermd te toxische component tegen inactiveren
* pH > 7,5  Toxine dissocieert in de 2 componenten
* meeste voedselmiddelen: pH < 7,0  stabielste vorm komt voor
* Drinkwater: pH > 7,5  Toxine dissocieert in 2 componenten, toxisch component verliest
zijn activiteit
* In levensmiddelen zijn geen stoffen aanwezig die de toxiciteit beïnvloeden (zouten en pH
geen effect)
* Voedsel 1 min op 86°C verwarmen zodat alle aanwezige toxinen worden geïnactiveerd.
2.2.2.2 eigenschappen
Symptonen: oogverlamming, verlamming aan de nekspieren, … , dood
Bij orale toediening: conc. 1000 maal hoger.
2.2.3 botulinum-antitoxinen
* Word bekomen door een paard in te spuiten met anatoxinen.
2
Verschillende types
Type A:
Type D
- vooral in VS en Europa.
- Veroorzaakt botulisme bij mens en dier
(runderen, varkens, ratten en katten).
- is een proteolytisch type
- meest toxische
- Zuid afrika
- gevonden in veevoeding
- niet toxisch voor de mens
- niet ovolytisch
Type E
Type B
- europa
- veroorzaakt botulisme bij: idem A +
eenden en ganzen
- minder toxisch
Type C
- botulisme bij vogels
- niet ovolytisch
- botulisme bij vissen
- niet ovolytisch type
- mens vergiftigd door eten vergiftigd eten
Type F
- Denemarken
- type gelijk aan A en B maar met
uitzondering van zijn toxinen
2.2.4 opsporing van het botulinumtoxine in voedingsmiddelen
Meeste stammen van A en B zijn proteolytisch en rottend  er treed onaangename geur op en
later gasproductie.
Opsporing  mogelijk door toxinotypsie
Toxine (na waterextractie uit het voedingsmidel) word in vitro gemend met de specifieke
antisera. De mengsel worden ingespoten in 5 loten muizen. Het lot dat overleeft duid het
toxine aan dat aanwezig was.
2.2.5 factoren die de toxineproductie beïnvloeden
Afhankelijk van intrinsieke en extrinsieke factoren
* samenstelling VM  ongeveer overeenstemmen met de voedingsvereisten van Clostridia
* vochtigheidsgraad ↓  geringe toxineproductie
aw = dampdruk van het voedingsmiddel bij een bepaalde temperatuur op de dampdruk van
zuiver water bij de zelfde temperatuur. = p/p0
0 ≤ aw ≤ 1  meeste voedingswaarden hebben een aw waarden van 0,98 ; 0,99
E.R.V. evenwichts relatieve vochtigheid: aw x 100
* pH < 4,5  geen toxinen meer geproduceerd.
Type E minder zuurgevoelig
* redoxpotentiaal: anaëroob
3
* zoutconc. 
* bewaartemp 
* verpakking 
Vanaf 8 % remt de groei van toxinen
- optimaal: 37°C,
- Minimum temp voor ontkieming sporen: 15°C (uitz. Type E = 10°C)
opgeloste tin in conservenblikken stopt de groei van C. Botulinum.
2.2.6 besmettingsbronnen
Komt vooral voor in de grond en daarom in levensmiddelen
Type E komt voor in zeewater
2.2.7 ziekte
Frequentie van voorkomen
Vleeswaren, vis en zuivel leveren de meeste intoxicaties op
in de natuur
* vogels: lange, warme periode
* komt veel voor in eurotrofe en anoxische wateren op warme zomerdagen
* op plaatsen waar koelwater word geloosd
Symptomen
* Incubatieperiode van 12 tot 36 uren
* misselijkheid, braken en diaree
* verstoord de zenuwprikkel  verlamming
* hartstilstand
Immuniteit
Actieve immuniteit

Botulinumtoxoïde

Antitoxinen

niet verworven omdat de dosis toxine klinisch te klein is om de
antitoxinenproductie te stimuleren
word toegediend aan mensen die veel in contact komen met
botulisme
word toegediend indien je besmet voedsel binnen hebt maar de
symptomen nog niet zichtbaar zijn.
2.2.8 noodzakelijke voorwaarden voor botulisme
* Sporen moeten kunnen kiemen
* onvoldoende verhit zodat de sporen overleven
2.2.9 voorzorgsmaatregelen om botulisme te voorkomen
* persoonlijke hygiëne
* geen kleur, smaak en geurverandering vaststellen
gerookte vacuümverpakte vis opletten !!  bij het roken overleven de sporen van type E,
(daarom vlug opwarmen en afkoelen). Zelfde bij gekoelde maaltijden
4
2.2.10 behandeling van botulisme
* Moet snel gebeuren
* persoon krijgt serotherapie met immuun paardenserum. Gelijktijdig krijgt de persoon een
injectie anatoxinen  Patiënt vormt zelf antitoxinen.
 dubbel dosis antitoxinen
2.3 Clostridium Perfringens
2.3.1 Morfologie en groei
* grampositief
* sporenvormend
* familie van Bacillaceae
* 6 verschillende soorten, enkel A en C verantwoordelijk voor voedselintoxitaties
Type A  verantwoordelijk voor
- gangangreen (koudvuur)
- voedselvergiftiging
Het verschil in oorzaak van de ziekte zit hem in de aard van de sporen/toxinen en de
hoeveelheid ervan
* α – toxine


= fosfolipase C
bevat een hemolytische (β) en lecithinase – activiteit
Fosfolipase
Lecithinase


enzym dat vetten afbreekt en draagt een fosforgroep
enzym dat lecitine (vetstof) afbreekt
Lytische afbraak van lecithine
(tek)
5
* θ - toxine vertoont een hemolytische activiteit (β) en veroorzaakt een abnormale afbraak van
de rode bloedcellen
* κ – toxinen is een collegenase die het bindweefsel afbreekt
2.3.1.1 herkennen α – toxine
* Voedingsbodem (SBA) + 7% bloed.
(tek)
roodbruine kolonies + helder hafje.
↓
Rode bloedcellen zijn afgebroken door
hemolysimen = α – toxinen
 vergroening van de hemoglobine door H2O
2.3.1.2 herkennen lecithinase
* voedingsbodem (SB) 5 ml + 0,5 ml eigeelemulsie 50%
(tek)
Precipitatie verzadigde
vetzuren (tek)
colloidale recipient
(tek)
LEC+
LEC-
* voedingsbodem (SBA) 18ml + 2 ml eigeelemulsie 50%
Kolonies + troebele hals
Precip. van vetzuren
Lec+
lec-
2.3.1 morfologie en groei(vervolg)
C. perfringens type A





groeit optimaal bij 46°C
niet zo strikt anaëroob als C. botulinum
2,5% NaCl remt de groei
sporen zijn thermosresistent
enterotoxine is thermolabiel
6
2.3.2 besmettingsbronnen
C.P.


gebruikt om algemene vervuiling aan te tonen
komt veel in de bodem voor
* Dieren in stress en rustig verschillen aan waarde van C.P.
rustig 
pH daalt van 7,4 naar 5,6 of lager door glycogeen 
stress 
pH daalt niet en blijft constant bij 7 
remt de groei van CP
ideaal voor M.O.
2.3.3 intoxicatie
* inname van CP door besmet voedsel
* vermenigvuldiging en sporulatie in de ingewanden
* vrijstelling van enterotoxinen na lysis van de cellen
* diarree treed op
* CP sporuleert niet gemakkelijk in levensmiddelen

moeilijk terug te vinden
2.3.4 de ziekte
Symptomen
* Incubatieperiode 
8 tot 24 uren
* klachten: diarree, abdominale klachten,…
Immuniteit
* In vitro
* in vivo


het enterotoxine neutraliseren door het specifiek antitoxine.
antitoxine niet geneutraliseerd in darm maar in bloedbaan
2.3.5 maatregelen om CP intoxicatie te voorkomen
Efficiënt en vlug koelen van verhitte levensmiddelen
2.3.6 clostridium tetanie
* behoren tot de bodembacteriën
* teruggevonden in besmette aarde, darm van paard, …
* via steekwonden, brandwonden, dierenbeten, … in het lichaam in anaërobe omstandigheden
* produceren exotoxine dat zich langs de zenuwen verspreid  wondkrampen
* bacillen blijven op de infectieplaats aanwezig en wijzigen het uitzicht van de wond niet
* geen bacteriemie dus maar toxinemie (toxinen in het lichaam)
7
2.4 opsporen van clostridia in levensmiddelen
2.4.1 microscopisch beeld
Genus Clostridium





behoort tot de familie Bacillaceae
zijn anaëroob
G+ die sporen vormen
sporen zijn terminaal of subterminaal
sporediameter vaak groter dan celdiameter
2.4.1.1 Klassieke methode
* suspensie maken van bacterie met aanwezige sporen in wringeroplossing
* evenveel kleurstof toevoegen (Ziehl’s carbolfuchsine)
* mengen
* 10 min incuberen in een kokend waterbad
* 1 druppel oplossing + 1 druppel nigrosine – oplossing op vw. Glas
* druppels mengen + drogen aan de lucht
* immersie onderzoek
Doel nigrosine
Resultaat

fuchsine weg wassen uit het cellichaam en achtergrond kleuren
rode sporen en kleurloze tot lichtroze cellen op grijze achtergrond
wringeroplossing = fysiologische oplossing = 0,085% NaCl oplossing.
↓
Isotomisch aan de cel

cel gaat niet plasmolyseren (vocht afgeven)

cel gaat niet autolyseren (vocht opnemen)
2.4.1.2 methode van Schaeffer en Fulton
* bacteriesuspensie uitstrijken op een draagglas, drogen en fixeren
* 2 min. kleuren op malassez bank
* spoelen, 1 min kleuren met safranine, spoelen
Resultaat

groene sporen in rode cellen
2.4.2 waarneming in het voedingsmiddel
Toxine niet organoleptisch waarneembaar, wel merkbaar door
* gasvorming
* geur van ranzige boter of vreemde aromatische geur
2.4.3 opsporen van de pathogeniteit en de toxiciteit met dieren
Gebeurt direct na vermoeden infectie,
- isolatie duurt te lang
- Clostridia kunnen gedood zijn
Besmet voedsel word aan dieren toegevoegd, in geval van besmetting:
binnen de 24h verlamming.
8
2.4.4 isolatie en telling van Clostridia
Men gebruikt een minder specifieke medium zodat men alle clostridia kan tellen
2.4.4.1 differential reinforced clostridial medium (DRCM)
Is vloeibaar
RRCM


rijke voedingsbodem
laat groei toe van de meeste clostridia maar ook andere M.O.
Bevat
* basis (pepton, N – bron, C – bron, S – houdend aminozuur)
* thermolabiele componenten

na het autoklaveren toevoegen
Na2SO3 en Fe(3)citraat

steriliseren door bacteriefilter
* Na2SO3  Na2S
* Na2S + Fe(3)citraat 
- Pepton
Fe2S3↓ + Na-citraat (zwarte neerslag)

In alle voedingsbodems, treed op als buffer om overproductie
zuur tegen te gaan.
- S – houden aminozuur = L – cysteïne 
HCl nodig om de oplosbaarheid te verhogen
2.4.4.2 Vlees – lever – sulfiet agar
Is vast
Basis + ijzeraluin
* Na2SO3  Na2S
* Na2S + Fe2(SO4)3 
Fe2S3↓ + Na2SO4 (zwarte neerslag)
2.4.4.3 werkwijze met het DRCM – medium
Bereiden van VB
* Basis (zonder thermolabiele componenten) word verdeeld in flesjes en gesteriliseerd
* na koeling flesjes word mengsel van Na2SO3 en Fe(3)citraat gemengd (zelfde reactie)
* 0,5 ml van mengsel wordt toegevoegd per flesje basis
Enting
* 10 ml voedingsmiddel in 90 ml steriele peptonoplossing en gehomoniseerd
* 3 opeenvolgende decimale verdunning maken
* 1 ml van de decimale verdunning enten op DRCM – media (5x)
Water tot 10-8
Aarde tot 10-12
9
Incubatie
* 7 dagen incuberen op 37 dagen
* meeste kleuren flesjes zwart na 3/4 dagen
Aflezing
*aantal zwartkleuringen per decimale verdunning wordt geteld
* kental samenstellen
* aantal clostridia bepalen via de tabellen van Mc Crady
Om louter het aantal sporen te bepalen  voorbehandeling uitvoeren
* verdunning in een dikwandige proefbuis steken
* verhitten in een waterbad van 75°C / 30min.
* na koelen decimale verdunning maken
* aantal zwart kleuringen tellen na incubatie
* bepalen van meest waarschijnlijke aantal clostridia per gram voedingsmiddel.
DRCM methode is niet bijzonder specifiek  kan verkleuring ontstaan door andere M.O.
Oplossingen
1) (tek)
 vloeibare steriele parafine er boven op  anaëroob
2) JAR
 ascarbinezuur
 redox indicator
2.4.4.4 bepaling van het kiemgetal
Kiemgetal
 aantal levende M.O. per - ml indien het om vloeistoffen gaat
- gram indien het om vaste substraten gaat
- per liter of m3 bij lucht
2.4.4.4.1 MPN – methode
= most probable number
* voor elke reeks een 5voudige enting met ieder een decimale verdunning
* VB = Standaard – bouillon
* na enting een verhouding van 9/10 bekomen
Reeks A : 10 ml enten met 9 ml VB  verhouding 9/19  VB 2x zo geconcentreerd
Reeks B : 1 ml enten met 9 ml VB
Reeks C : 0,1 ml enten met 9 ml VB
* bij aflezing wordt het aantal buisjes met groei per decimale verdunning geteld, en per reeks.
10
Berekening van het kiemgetal
Kental  bestaat uit 3 cijfers
 1ste cijfer = aantal keer dat men de enting deed (5)
 2de en 3de cijfer horizontaal/vertikaal aflezen naast/onder 1ste cijfer
Vb:
- kental 5 3 1
- tabellen van MC Crady, voor 5 3 1 vinden we 110/100 ml.
- rekening houden met de decimale verdunning. Vb: 10-4
MPN = (110 x 104)/100 ml = 11 x 103 ml
Kies steeds voor het kleinste kiemgetal doordat de kans op besmetting te groot is.
2.4.4.4.2 plaatmethode
* decimale verdunning maken (1,0 ml + 9,0 ml ringeropl.)
* 1,0 ml van elke verdunning in steriele petriplaat + 15 ml gesmolten Plate Count Agar (PCA)
* petriplaten omgekeerd incuberen
* na incubatie  juiste telplaat nemen ( plaat waar aantal kolonies tussen 30 en 300 ligt)
* kolonies tellen en kiemgetal uitrekenen.
* kiemgetal uitdrukken in kolonievormende eenheid (k.v.e.), bacteriën in kettingvorm geven
aanleiding tot 1 kolonie
2.4.4.4.3 spiraaltechniek
* toestel die platen met een vooraf ingesteld volume automatisch beënt.
* met pipet een hoeveelheid monstersuspensie opzuigen
* punt van de pipet dicht bij het midden van het plaatopp. plaatsen
* apparaat aanleggen  tafel waarop plaat rust begint te draaien
* kleine hoeveelheid suspensie wordt op de plaat gebracht
* pipet naar buitenkant van de plaat brengen  ontstaan van een spiraalvormige entlijn
* na incubatie de kolonies tellen met kolonieteller, kolonieteller heeft verdelingen met
segmenten en sectoren
* van ieder opp. is het aantal toegevoegde ml suspensie gekend  kiemgetal uitrekenen per
sector.
2.4.4.4.4 de bacteriënfilter methode
* door bacteriefilter een gekend volume lucht of vloeistof zuigen
* na filtratie  filter op geschikte VB.
* platen omgekeerd incuberen
* na incubatie kiemgetal berekenen
* kiemgetallen bepaald door membraanfiltratie zijn onderworpen aan statische variatie
Aantal M.O. > 20  zekerheidsgrens van 95% berekenen
Bovengrens  C + 2(2 + √ C)
Ondergrens  C – 2(1 + √ C)
11
2.4.4.4.5 ATP – bioluminiscentietechniek
Principe
Alle cellen bevatten energie onder de vorm ATP (dode cellen verliezen dit door autolyse)
Microbieel ATP  vrije ATP en somatische ATP (= lichaamscellen) = vb:bloedcellen
Niet microbieel ATP 
moet verwijder worden
ATP bepaling steunt op een biochemische reactie:
* Energie opgeslagen in ATP wordt omgezet in licht door het enzym luciferase en zijn
substraat luciferine
* licht = zwak  amplificatie nodig
* voorgebracht licht ≈ ATP hoeveelheid in het monster  elk ATP molecule zendt 1 foton uit
Algemene methode
Vrij en somatisch ATP verwijderen
+ NRS – reagens 
+ Somase – reagens 
+ NRB – reagens 
+ lufricine – luciferase 
- maakt de celwand van somatische cellen permeabel waardoor
ATP wordt vrijgesteld
- Hydrolyseert het vrijgesteld somatisch ATP en vrije ATP 
in cuvet enkel nog bacterieel ATP aanwezig
- Maakt bacterieel ATP vrij uit bacteriële cellen
- uitzending van licht als gevolg, lichthoeveelheid wordt digitaal
weergeven met RLU
Reactie
1) activiatie van luciferine
Luciferine + luciferase + ATP
Mg2+
 (Luciferine – luciferase – AMP) + pyrofosfaat
2) oxidatie en decarboxylatie van luciferine
O2
(Luciferine – luciferase – AMP)  oxyluciferine + luciferase + CO2 + AMP + licht
2.4.5 isolatie en telling van Clostridium Perfringens
2.4.5.1 telling dor de gietplaat methode
* VB = TSC zonder eierdooier (tryptose–sulfiet–cycloserine–agar)
* is een breedspectrum – antibioticum, effectiever tegen G+ dan G- (uitz: Clostridia)
* geen eierdooier  vertraagd de groei van Clostridia
* platen anaëroob incuberen
* zwarte kolonies tellen en kiemgetal berekenen
Clostridia
Fe3+
+ SO32+ S-
 S Fe2S3 ↓ (zwart)
12
2.4.5.2 Telling door membraanfiltratie
C.P. wordt onderscheid van andere Clositridia door
* afwezigheid van β-D-glucosidase
* fermentatie van sucrose
* productie van zure fosfaten
* C.P. is β-D-glucosidase negatief

chromogeen indoxyl-β-D-glucoside wordt niet
afgebroken  niet blauw
* C.P. fermenteert sucrose met zuurvorming  broomcresolpurper wordt geel
(C.P. = gele kolonies)
* Meeste clostridia vormen paarse kolonies, zijn sucrose negatief
* of blauwgroene kolonies  indoxyl-β-D-glucoside wordt afgebroken tot indigoblauw en
Sucrose wordt gefermenteerd
Gele kolonies
 onderzocht op aanwezigheid van zure fosfaat
 boven NH4OH dampen houden
 kolonies kleuren roze/rood
* andere clostridia soms ook geel, maar worden dan niet roze/rood doordat ze fosfatase-neg
zijn
* FeCl3 Bevordert de groei van C.P.
Broomcresolpurper: zuur geel,
base  purper
2.4.5.3 Bevestigde testen
Zwarte kolonies op TSC VB zijn C.P. als
* M.O. produceren een α-toxine dat kan geneutraliseerd worden het specifiek α-antitoxine
* indool negatief
* onbeweeglijk
* gelatinase – pos.
* nitraatreductase-pos. met vorming van NO2* Lactose-pos. met zuur en gasvorming.
2.4.5.3.1 serologie
* α-toxinevorming wordt nagegaan door α-antitoxine.
* Pos. reactie = verkrijging van agglutinatie
2.4.5.3.2 de indooltest
* Bouillon enten bij M.O. en incuberen
* reagens van Kovacs toevoegen
 donkerrode ring bovenaan in de alcohollaag: kiem indool-pos
 geelbruine ring bovenaan in de alcohollaag: kiem indool-neg.
13
2.4.5.3.3. Beweeglijkheidtest
* halvast medium gebruikt (motility agar)
* VB enten met steekenting
* na incubatie de groei beoordelen over de ganse steekenting
 onbeweeglijke bacteriën: groeien langs de steeklijn
 beweeglijke bacteriën : zwermen uit, vormen vertakkingen
* methode niet gepast voor strikt anaërobe bacteriën en sommige bewegen enkel op
kamertemperatuur.
2.4.5.3.4 de gelatinetest
* sommige bacteriën  bezitten enzym dat gelatine afbreekt en vervloeit
* aantonen met VB die gelatine bevat
1) Nutrient gelatine (SBG)
* 12% gelatine in deze VB.
* medium opgekookt en verdeeld in cultuurbuisjes van 5ml
* autoclaveren
* VB recht laten stollen
* steekenting uivoeren
* incuberen bij 22µ°C (gelatine smelt bij 28°C), gelatine heeft functie als stolmiddel
* vervloeing van medium controleren
2) gelatinase test volgens Clarke
* 12% gelatine
* na autoclaveren VB gesmolten en in petriplaten gegoten
* lijenting uitvoeren
* incubatie bij 37°C (gelatine hier geen functie als stolmiddel maar agar wel)
* voor beoordeling overvloeit men de plaat met HgCl2 (Gelatine vormt met Hg2+ witte
neerslag, afbraakproducten doen dit niet)
(tek)
Gelatinase +
- Helder zone rond entlijn
- Polipeptide aanwezig
- Melkachtig troebeling enkel zichtbaar
aan zijkanten
gelatinase - Vorming wit neerslag met duidelijke
groeilijn
- gelatine niet afgebroken
- melkachtig troebel
14
3) gelatinase test volgens Kohn-Lautrop
* Test gebruikt bij minisysteem API voor identificatie van Enterobacteriaceae
* Houtskoolgelatineschijfje + bacteriesuspensie. (bevat C, gelatine en formaldehyd)
* formaldehyd = verharder (doet eiwitten samenvlokken  smeltpunt gelatine verhoogd)
 Incubatie bij 37°C
Beoordeling: tablet nog intact of niet
Gelatinase +
↓
Tables nog intact
gelatinase –
↓
C partikels vallen uiteen  alles is zwart
2.4.5.3.5 de nitraatreductasetest
* sommige M.O. bezitten de enzymen nitraatreductasen. (gebruiken nitraat als
waterstofacceptor)
NO3- gereduceerd tot NO2- of N2 (hier nitriet aangetoond)
* VB = Standaard nitraat bouillon
* VB verdeeld in cultuurbuisjes, + omgekeerd durhambuisje in elke cultuurbuis (vangt
eventueel gevormde N2 gas op)
* enten van VB en incuberen
Beoordeling: Griessreagens A en Griessreagens B toevoegen aan cultuurbuisje
1) cultuurbuisje kleurt rood  NO3- gereduceerd tot NO22) cultuurbuisje kleurt niet rood  NO3- of N2 aanwezig
↓
Mespuntje zinkpoeder toevoegen
* Zink reageert met azijnzuur uit Griessreagentia, atomaire H word gevormd
* Waterstof kan NO3- omzetten tot NO22 HOAc + Zn  Zn(OAc)2 + 2H
3) buisje kleurt rood  Er was nog NO3- aanwezig  Nitraatreductase neg. kiem
4) buisje blijft kleurloos  Kiem heeft NO3- gereduceerd tot N2 (er word gasbel een
gevormd Nitraatreductase-pos. kiem
2.4.5.3.6 Lactosevergisting
* lactosebouillon + 1% lactose
* VB verdelen in cultuurbuisjes + omgekeerde durhambuisje (N2 opvangen)
* enten en incuberen
Beoordeling: broomthymolblauw toevoegen
* gele kleur  lactosevergisting pos.
* groenblauw  lactosevergisting neg.
Gasbel in durhambuisje  gasvorming uit lactose
15
2.5 Staphylococcus aureus
2.5.1 algemene eigenschappen
* G+ kok
* niet sporenvormende M.O.
* geen kapsel
* aëroob tot facultatief anaëroob
* door pasteurisatie vernietigd
* minimum aw voor groei is 0,86
* vormt kolonies van smooth type met witte of gele kleur
* manitol alleen door pathogene staphylococcus spp. Vergist
* vertoont een hoge halotolerantie (10% NaCl)
2.5.2 stapphylococcus aureus enterotoxines
* S.A. is in staat enterotoxinen te produren  molmassa zeer laag  thermostabiel
* toxinen vertonen antigene structuur
* minimum aw voor toxineproductie is hoger dan min. aw voor de groei van S.A.
Levensmiddelen met glucose  remt de productie van toxinen door de melkzuurbacterie
(doet pH van levensmiddelen ↓)
* S.A. kan 8 ≠ enterotoxinen produceren (A,B,C1,C2,D,E,F en G)  verschillen in toxiciteit
* A en D  grootste deel van voedselintoxicatie
* veroorzaken ontsteking van maag en ingewanden
* toxinen = geheel van afbraakproducten ontstaan door de vermenigvuldiging van S.A. ten
koste van de eiwitten
Door S.A. worden verschillende stoffen gesecreteerd
1) toxische proteïne 
2) coagulase

afgescheiden in log fase

antigenische waarde
enzym dag geoxaleerd bloedplasma coaguleert doordat het
oplosbaar fibrinogeen omzet in onoplosbaar fibrine
3) fibrinilosine

ontstaat uit het fibrinogeen 
lost fibrine op
4) hyaluronidase

tast hyaluronzuur aan

essentiël element bij het
bindweefsel
↓
Viscositeit van het bindweefsel ↓
↓
M.O. kunnen zich beter verspreiden
* niet alle coagulase pos. Staph. Spp zijn toxigeen
enterotoxinen
* grote thermostabiliteit (sterilisatie)
* verwarmen = toxische kracht ↓
* gekookte levensmiddelen kunnen nog intoxicaties veroorzaken
16
* resistent tegen proteolytische enzymen  pepsine  activiteit van S.A.enterotoxine B ↓
indien pH < 2
pH > 2  werking faalt
* S.A. zit in vlees, vis  eiwitten stimuleren de groei van S.A.
2.5.3 Infectiebronnen
* S.A. aanwezig in neus,handen, haar, …
* normaal parasiet  mens met verzwakt weerstandsvermogen kan S.A. pathogeen worden
* groeit weinig of niet in darmkanaal
* rauwe levensmiddelen: weinig risico vanwege antagonische activiteiten van de initiële flora
* voedselintoxicaties  meestal door slechte bereidingstechnieken
De gevoeligste groepen levensmiddelen zijn de verhitte levensmiddelen die te traag of
helemaal niet worden afgekoeld.
* S.A.  grote rol bij masitis (hoog kiemgetal)  melk besmet
2.5.4 ziekte
Symptomen
* gevoeligheid = variabel
* overdreven speekselafvoer
* buikkrampen
* braken en diarree komen samen voor !!
* geen koorts
Diagnose
* uit verdacht levenmiddelen  aantal S.A. > 106/g = voldoende enterotoxinen geproduceerd
* aangetoond met serologische technieken
* voedsel verhit  opsporen van toxinen door thermoresistente DNase of thermonuclease
Voorwaarde voor intoxicatie
* voedsel moet besmet zijn met enterotoxine producerende S.A.
* voedingsmiddel moet geschikte VB zijn
* temp, pH, … moet goed zijn
* enterotoxine moet geabsorbeerd worden
Voorzorgsmaatregelen
Gevaarlijkste groep  - verhitte levensmiddelen die te traag gekoeld zijn en die niet meer
voor consumptie moeten heropgewarmd worden
- bereide gerechten
* sanitaire maatregelen
* gebruik maken van ingrediënten die vrij zijn van S.A.
17
* dragers van S.A. vermijden (personen)
* bewaren onder koeling of lage pH (melkzuurbacterie toevoegen)
Vernietigen S.A.  pasteurisatie
2.6 opsporen van S.A. in voedingsmiddelen
2.6.1 situering
S.A. behoort tot de familie Micrococcaceae
Genus
Leefruimte
Pathogeen
Zuurstof
Micrococcus
Saprofiet in water, vlees, …
Nee
Strikt aëroob
Verzuring
Gramkleuring
Glucose door oxidatie
G+
Staphylococcus
Neusholte, feces, keel, …
Ja
Aëroob tot facultatief
anaëroob
Glucose door fermentatie
G+
Bevat 3 belangrijke species
1) S. aureus

* pathogeen
* Vergist mannitol door fermentatie
* coagulase negatief
2) S. epidermidis

* niet pathogeen
* Mannitol niet omgezet
* coagulase negatief
3) S. saprophycitis

* niet pathogeen
* mannitol positief door oxidatie
* coagulase negatief
= Witte Staphylococcus
= Staphylococcus albus
Voor differentiatie 
suiker = glucose
Onderlinge differentiatie  suiker = mannitol
De Hugh en Leifson test (O/F test)
= Het verschil aantonen tussen een kiem suiker oxidatief of fermentatief omzet
1 suiker testen  2 cultuurbuisjes nodig
Buisje 1  oxidatief vermogen testen (O-buisje)
Buisje 2  fermentatief vermogen testen (F-buisje)
VB = O/F basis
Indicator = broomhtymolblauw
18
* 0,5 ml suikeropl. Van 11% aan 5 ml  eindconcentratie 1%
* basis verdelen in buisjes
* 10 min autoclaveren  sommige suiker kunnen hydrolyseren door de warmte
* steekenting uitvoeren
* F buisje  vl. Steriele parafine bijdoen (anaëroob)
Begin buisje helder groenblauw
O-buisje
Geel
Geel
Blauw
Inerte kiem


F-buisje
Geel
Groenblauw
Groenblauw
+/+
+/-/-
Beoordeling
Fermentatieve kiem
Oxidatieve kiem
Inerte kiem
gebruiken aminozuren als C -en energie bron
aminozuren oxidatief gedeamineerd tot NH3 en ketozuur
NH2
|
H2O  NH3
R – C – COOH
|
H
OH
|
oxi
R – C – COOH
|
H
O
||
Krebsyclus
R – C – COOH  CO2 + H2O
ketozuren
pH ↑  Oplossing = Blauw
specifiek onderscheid tussen S. saprophyticus en S. epidermidis  Antibiogram inzetten
antibiogram
VB = Mueller Hinton Agar (MHA) + S. aphrofyticus
(tek)
 Novobicine
 kan groeien tot tegen de disc
Is een R-kiem
R = resistent
VB = Mueller Hinton Agar (MHA) + S. Epidermidis
(tek)
 Discen
 kan niet groeien tot tegen de disc, heeft een
inhiberende zone
Is een S-kiem
S = Sensitive
Allebei omgekeerd incuberen
19
2.6.2 aanrijken en isolatie
1) aanreiken
2) isolatie
3) Identificatie
2.6.2.1 aanrijking
Altijd een bouillon
* S.A. massaal laten groeien  10 g monster + 90 ml steriele “Giolitti Cantoni” bouillon
* Afdekken met steriel paraffine (uitsluiten micrococcen)
2.6.2.2 isolatie
2 eigenschappen
* Mannitolvergisting
* Hoge tolerantie
Mannitol-zout-agar of het milieu van Chapman (MSA)
Verplicht in drinkwater
* Suiker = Mannitol
* NaCl = 7,5%
* Indicator = Fenolrood
zuur = geel
Base = Oranje rood
S.A.  kleurt bodem geel (zuurvorming uit mannitol)
Niet pathogene S. spp  groeien minder  Vormen rode zone
Uitz: S.S.  mannitol positief  gele voedingsbodem  bevestigde test uitvoeren
Het “Baird Parker” medium
Gebruikt bij voeding
* medium = zeer geschikt voor isolatie S.A. uit voeding
* Natriumpyruvaat  maakt H2O2 onwerkzaam (anders worden bacteriën zonder katalaseactiviteit beschadigd)
=
O O
O O
|| ||
red.
|| ||
katalase
oxi
CH3 – C – C – O
CH3 – C – C – H
H2O2
H2O + O2
H2O2 zet rem op bep. M.O. tenzij M.O. katalase hebben
20
* Lithiumchloride
* kaliumtelluriet
* Glycine + kaliumtelluriet
* eigeel
* natriumsulamethazine
 remstof voor een aantal G+ bacteriën
 inhibeert veel G+
 remming van S. spp., andere dan S.A.
 bevat lecithine  lecithinase – activiteit van S.A. aangetoond
 remt groei en uitzending van proteus spp.
Eigeel en kaliumtelluriet
 toevoegd onder eigeel-telluriet emulsie NA autoclaveren
Beoordeling
Pathogene S.  zwarte kolonies omgeven door troebele zone
* zwarte kleur  afkomstig van reductie van telluriet tot metalisch tellurium.
* troebele zone  wijzen op pos. lecithinasereactie
* Praktijk: alle 2 de mediums gebruiken
* selectiviteit = niet groot  Bacillus kunnen ook groeien
* eerst gramkleuring uitvoeren voor testen
2.6.3 bevestigde testen
2.6.3.1 morfologie
Grampositieve kokken
2.6.3.2 mannitolvergisting met zuurvorming
* mannitolbouillon enten met zuur-base indicator, na incubatie omslag beoordelen
* O/F test uitoveren
2.6.3.3 de coagulasetest
Coagulase = enzym dat bloedplasma coaguleert
* komt voor bij S.A. maar ook bij Serratia marcescens, E. coli, Bacillus subtillus, S.
intermedius, … (minder mate)
* subcultuur aanleggen in brain-heart-infusion broth (BHi)
* verdeeld, gesteriliseerd en geënt
* enzym coagulase op 2 manieren vinden
1) macrotechniek uitgevoerd in agglutinasebuisje (tube test)
2) microtechniek uitgevoerd op VW – glas (slide-test)
2.6.3.3.1 Tube test of macrotechniek
*subcultuur aanleggen in BHi
21
Werkwijze
* in haemolysebuisje
* 0,5 ml konijnenplasma + 2 dr. Subcultuur
* incuberen in warmwaterbad
* gelvorming indien positief
2.6.3.3.2 De slide test of microtechniek
* vaste cultuur
* VB = BHi + agar
* koken
* verdelen in cultuurbuisjes
* VB schuin laten stollen (slent)
Werkwijze
 flamberen
Geen S.A.
(geen fibrine vorming)
Fibrine vorming
 S.A. + coagulase pos.
Auto – agglutinatie
Oorzaken auto – agglutinatie
1) Cultuur te oud
2) Tussendoor niet geflambeerd (plasma overgegaan van C naar R)
3) Vertrokken van bouillon (stofdeeltjes zijn partikels van BHi)
Slide test
 traag coagulase pos kiemen niet opsporen
 = neg, tube test uitvoeren
2.6.3.4 De DNase – test
DNase = enzym dat DNA depolymeriseert tot nucleotiden
* laat betrouwbare diagnose van S.A. toe
22
* VB = DNase – agar
* lijnenting
* omgekeerd incuberen
* voor beoordeling plaat overvloeien met HCl 1 mol/l
Beoordeling
DNase – pos.
DNase – neg.
* Heldere zone rond entlijn
* troebel over de gehele plaat
* DNA slaat niet neer
* DNA slaat neer in zuur midden
in zuur midden
* Troebel aan zijkanten door DNA
2.6.3.5 De haemolysetest
* VB = bloedplaten
* uitdunningenting
* beoordeling = haemolysereactie
* S.A. = β-haemolytisch  rond roodbruine kolonies is helder kofje (rode bloedcellen
afgebroken)
* S.E. en S.Sap zijn γ-haemolytisch  er gebeurt niets
2.6.3.6 De lecithinasetest
Enzym lecithinase  zet lecithine om in vrije vetzuren, glycerol en fosforylcholine
VB = eigeelbouillon
Lecithinase pos kiem  samenvlokking van de vetzuren met heldere zones er tussen
Lecithinase neg kiem  behouden van colloïdale opl.
2.6.3.7 De katalasetest
* Katalse = haemoproteïne met Fe3+ als reactief element
* Zuurstofwater op M.O. brengen en reactie bekijken
Reactie:
2 H2O2  2 H2O + O2 ↑
Katalase pos kiemen 
Katalase neg kiem 
vormen gasbellen
druppel blijft onveranderd
23
Katalase +
Katalase ±
Katalase
Katalase -




aërobe kiem (Micrococcus)
Facultatief anaërobe kiem (E. coli)
facultatief aërobe kiem
anaërobe kiem (Clostricium B)
2.6.3.8 De gelatinasetest
Zie hoofdstuk C.P.
2.7 Bacillus cereus
2.7.1 Morfologie en groei
* Familie = Bacillaceae
* is G+
* sporenvormend staafje
* min. aw = 0,90 (= 15% NaCl)
* sporen = thermoresistent, kiemen bij 50°C
* aëroob  katalase pos.
* verzuring van glucose zonder gas
* grondsaprofyt
* pas na 106/g aanwezig word je ziek
2.7.2 De intoxicatie
* B.C. kan gemakkelijk vermenigvuldigen in koolhydraatrijk voedsel
* vooral in droge producten
* snelle ontwikkeling in voedingsmiddelen die lang warm gehouden worden bij een te lage
temp. of voedingsmiddelen die terug opgewarmd worden.
Enterotoxinen
* antigene structuur
* thermolabiel
Toxinevorming op 2 manieren
1) toxineproductie treed op tijdens bewaren v/h voedsel.  toxine opgenomen via
voedsel
2) sterke vermenigvuldiging in fase 1 en toxinevorming in de potentiële ziekte zelf.
Intoxicatie gekenmerkt door
1) vooral diarree

vlees, soep, pudding, …
* proteïne met hoge Mm  thermolabiel
* vroeger dacht men dat het C.P was
2) vooral braken

gebakken, gekookte rijst
* proteïne met lage Mm  stermostabiel
* vroeger dacht men dat het S.A. was
24
* Intoxicatie is niet dodelijk
* opsporen van B.C.  in verdacht levensmiddelen
2.7.3 besmettingsbronnen
Komt overal voor
2.7.4 fysiologische kenmerken
Door B.C. aantal extracellulaire metabolieten geproduceerd.
* protease
* β – lactamase (breekt peniciline af)
* fosfolipase
* hemolysine
samen een activiteit gelijk aan α-toxine van C.P.
2.7.5 maatregelen om B.C. intoxicatie te voorkomen
* lage aantallen zijn ongevaarlijk
* verhitte levensmiddelen direct consumeren
* na bereiding snel afkoelen
2.7.6 isolatie en identificatie
* V.B. = Trypton-soya-bouillon
* Decimaal verdund tot 10-5 (lage aantallen zijn ongevaarlijk)
* verwarmen  vegetatieve cellen sterven af, sporen overleven
* enten
* BCA-basis koken en steriliseren (bevat mannitol en indicator broomthymolblauw)
* + polymyxine B toevoegen (inhibiter G-)
* + steriele eigeelemulsie
* na stolling geënt als strijkplaat
1 kolonie op VB = besmet ! !
B.C.
 vergist geen mannitol
 veroorzaakt precipitatie v/h gehydrolyseerde lecithine (Blauwe kolonies met
troebele zone er rond)
Zo B.C. onderscheiden van andere B., behalve van B. thuringiensis (dood larven van insecten)
2.8 Mycotoxinen
= metabolieten van schimmels die bij mens en dier pathologische verschijnselen kunnen
verwerken.
Belangrijkste = aflatoxines
a  Aspergillus
fla  flavus
 geproduceerd door sommige stammen van Aspergillus flavus
25
2.8.1 Aspergillus flavus
* saprofyte schimmel (bodem en levensmiddelen)
* aw > 0,83
* goede substraten  noten, melkpoeder en granen
2.8.2 Chemische kenmerken
* Aflatoxinen zijn oplosbaar in methanol en chloroform
* vertonen een geringe oplosbaarheid in water
2.8.3 Biologische activiteit
Aflatoxinen
 kankerverwekkend
 veroorzaken leverkanker
Ziekte  1ste fase: gekenmerkt door moeilijk te stoppen bloedingen (hemorragisch) in
ingewanden
 2de fase: ontstaan van kwaadaardige gezwellen die de bouw hebben van
bindweefsels of aanverwante weefsels
2.8.4 Andere mycotoxinen
2.8.5 voorzorgsmaatregelen
* voorkomen dat schimmels in voeding terecht komen
* oppassen bij oogsten, stockeren van plantaarde producten (vochtigheid is hoog)
Detectie  selectieve eliminatie v/d besmette hoeveelheden
mycotoxinen  grote fysische en chemische resistentie (moeilijk kapot te maken)
↓
Soms door alkalische oplossingen
 bezitten geen antigenische structuur → dieren kunnen opnieuw ziek komen
Hfst 3: Voedselinfecties
3.1 inleiding
Voedselinfectie =
gevolg van consumptie van levensmiddelen dat besmet is met een
pathogeen m.o.
Preventie = besmetting van grondstoffen tegen gaan
3.2 Salmonellose
Infectie verwekt door een groot aanal m.o. van het genus Salmonella
26
3.2.1 Taxonomie
* Genus Salmonella bevat 2 species
* naam sereotype genoemd naar
1) plaats waar eerst geïsoleerd
2) ziektebeeld
Genus

Species 
Subsp.

Sereotype 
Cursief
Cursief
niet cursief
Cursief geschreven en met hoofdletter (aantonen geen aparte species)
Genus: Salmonella
Species: S. entericia
Subs.: entericia
Sereotype: Enteritidis
3.2.2 Morfologie en groei
* G- Staafje
* niet sporevormend staafje
* oude culturen  voorkomen verlengde cellen
* geen kapsel
* beweeglijke  gevaarlijk voor de mens
* aëroob tot facultatief anaëroob
* hittegevoelig
* overleven vries en koeltemp.  gaan over in slaapstand (dorming state)
* 4 < pH < 9  salmonella sterft af boven onder 4, boven 9
* overleeft in droge voedingsmiddelen
* groei en vermenigvuldiging zonder waarneembare afwijkingen in geur of smaak
3.2.3 overdracht van Salmonella
* Mens = drager
* Salmonella nog aanwezig na de genezing
* Eiwitrijke en coolhydraatrijke voedselmiddelen zijn gevoelig voor Salmonella
3.2.4 ziektebeeld
* Via voedsel in lichaam en kunnen slijmlagen doorbreken.
* via bloed verspreid naar lever en nier
27
3 verschillende groepen
1) Gastro – enteritis 
* incubatie = 8 tot 72 uren
* lichtste vorm
* symptomen = bloederige en slijmerige diarree, buikkrampen,
misselijkheid, braken en koorts
2) Typhoïde koorts

* veroorzaakt door S. entericia, sereotype Typhi
* incubatie 3 tot 28 dagen
* symptomen = - koorts en hoofdpijn, koorts stijgt en blijft
enkele dagen zo
- koorts neem af, verschijnen tyfussymptomen
(overal pijn)
3) Lokale infecties

* kan optreden in verschillende weefsels.
Na ziekte: mens kan nog 2 tot 4 weken dragen zijn
Immuniteit: toedienen van vaccins
3.2.5 voorwaarden voor Salmonellose
* voedingsmiddel = besmet
* voedingsmiddel = geschikte VB
* tijd lang genoeg en temp moet goed zijn
* zure pH van maagsap werkt bactericidaal
o.a. tegen Salmonella
3.2.6 Voorzorgsmaatregelen
* vermijd contaminatie
* persoonlijke hygiëne
* Salmonella kan vernietigd worden door pasteurisatie, sterilisatie en γ-irradiatie
3.3 opsporen van Salmonella in voedingsmiddelen (ex)
3.3.1 Situering
* Familie = Enterobacteriaceae
* Veel suikers worden vergist met zuur en gasvorming
* nauw verwant met Shigella spp.
H2S productie
Citraat
Lysinedecarboxylase
G. salmonella
Ja
Pos.
Pos.
G. Shigella
Nee
Neg.
neg.
3.3.2 determinatie
In 3 stappen
1) aanrijking
2) isolatie
3) identificatie
28
3.3.2.1 de aanrijking
1) niet selectieve aanrijking (TSB)
2) selectieve aanrijking
Tetrathionaatbouillon
* Tetrathionaat (Na2S2O3) gereduceerd door jodium tot Na2S4O6
* basis + CaCO3  voorkomen dat ov. Zuuproductie tot autosterilisatie gebeurd
* VB wordt gekookt en dan lugol toevoegen
Resultaat
* Alle bacteriën die het tetrathionaat reduceren kunnen zich massaal ontwikkelen zoals
Salmonella spp.
Selenietbouillon
* VB gesteriliseerd in warm water bad
* Seleniet  remt G+ en ook E. coli en proteus spp. Indien in klein aantal aanwezig
Rappaport-vassiliadis-bouillon
* Inhibitoren: MgCl2 en malachietgroen versterken elkaar.
* remt G-, E. coli, Proteus, Pseunomonas en Shigella
Werkwijze
* 25 g monster + 225 ml van aanrijkingsmedia  verhouding 1/10
* incubatie bij 43°C  selectiviteit bevorderd (meeste groeien niet/sterven af boven 37°C)
3.3.2.2 De isolatie
Op vaste VB ! !
* 1 öse uitstrijken op selectief isolatiemedium
3.3.2.2.1 Bismuthsulfiet-agar
* bevat: Bi2(SO3)3, briljantgroen, FeSO4
Inhibitoren
Door Salmonella gereduceerd tot zwart FeS en bruin Bi2S3
Bi2(SO3)3 + FeSO4  FeS + Bi2S3
29
3.3.2.2.1 Salmonella Shigella agar (SS – agar)
* C-bron = lactose  Salmonella en Shigella zijn lactose neg. (geen zuurvorming uit lactose)
* Galzouten remmen G+
* Briljantgroen remt lactose pos. anaëroben
* Voor H2S detectie  Na2S2O3 en Fe3+citraat aanwezig
* indicator neutraalrood
1)
2)
3)
4)
Salmonella spp.
Shigella
Citrobacter spp.
Lactosevergisters
 doorschijnende kolonies met zwart ingezonken centrum
 doorschijnende kolonies
 roze kolonies met grijszwart centrum
 kolonies met roze centra
3.3.2.2.3 Mac conkey – agar
* lijkt goed op SS maar zonder H2S detectie en briljantgroen
* isolatiemedium = minder selectief
* wordt gebruikt hij het coliformenonderzoek
1) Salmonella spp
2) E. coli
3) M.R.S.A.
 Kleurloze kolonies
 rode kolonies
 groenbruine kolonies die fluoriscerend zijn
3.3.2.4 Manitol-lysine-kristalviolet-briljantgroen-agar (MLCB)
* C-bron = mannitol (Salmonella is mannitol pos.)
* aminozuur = lysine (Salmonella decarboxyleert lysine tot primair amine cadaverine)
* Inhibitoren = kristalviolet, briljantgroen
* Voor H2S detectie  Na2S2O3 en Fe3+citraat aanwezig
1) H2S + Salmonella  Grote paarszwarte kolonies
2) H2S – Salmonella  paarsgrijze kolonies met ingezakt centrum
Mannitol  zuurvorming  pH ↓
NH2
|
R – C – COOH
|
H
CO2 ↑
NH2
|
R–C–H
|
H
= cadaverine pH ↑
[Mannitol] < [Lysine]  pH ↑
3.3.2.2.5 Xylose-lysine-deoxycholaat-medium (XLD)
* aminozuur = lysine (Salmonella decarboxyleert lysine tot primair amine cadaverine)
* suikers = Xylose, lactose en sucrose
* Voor H2S detectie  Na2S2O3 en Fe3+citraat aanwezig
30
1) Salmonella
 * enkel zuur uit xylose, decarboxyleert het aminozuur lysine
* [lys] > [xyl]  basische reactie van indicator (rood)
* Vorming van Fe2S3  rode kolonies met zwart centrum
2) Shigella
 * geen zuur uit aanwezige suikers, geen decarboxylering van lysine
* niet sulfietreducerend
* rode kolonies
3) Coliformen
 * groeien moeizamer
* grote hoeveelheid zuur uit lactose / sucrose  gele,
doorschijnende kolonies
3.3.2.2.6 Modified Semi-solid Rappaport Vassiliadis-medium (MRSV)
* halfvast medium
* Inhibitoren = malachietgroen & MgCl2
* VB koken en koelen, nadien novobiocine toevoegen
* VB enten met 3 dr. v/d aanrijking
* Recht incuberen bij 43°C
Beweeglijke Salmonella  strokleurige kolonies aan de rand v/d inoculatie
Omgeven door een halo
(tek)
3.3.2.3 De inditificatie
= biochemische reeks
* vertrekken van kolonie gegroeid op isolatiemedia
* enten op ureum bouillon of BHi
* Salmonella = urease negatief
Principe v/d ureasetest
* bacterie produceert enzym urease  kan ureum afbreken t.g.v. productie CO2 en NH3
↓
NH2
pH stijgt
||
↓
O = C – NH2
+ H2O  2 NH3 + CO2
indicator word rood
* VB = ureumbouillonbasis
* verdeeld in cultuurbuisjes
* autoklaveren
* Indicator = fenolrood
31
Ureum = thermolabiel component
↓
Via bacteriefilter toevoegen aan ureumbouillonbasis  eindconc. = 2%
Na steriliteitscontrole  VB = geel en helder (steriel)
 VB = roze (besmetting met luchtkiemen die urease pos. zijn)
1) Urease pos = NH3 vorming, VB word alkalisch  pH ↑, indicator wordt rood
Vb = Proteus spp.
2) Urease neg = groeien in medium, geen kleurverandering
Vb = Salmonella spp.
3) zwak urease pos. = zijn na 48 uren incubatie nog urease neg.
Vb = Enterobacter
Ureasetest = belangrijke biochemische test voor de Enterobacteriaceae
3.3.2.3.1 motility test
Zie 2.4.5.3.3
Salmonella spp.  motility pos. (uitz.: S. Gallinarum en S. pullorum)
3.3.2.3.2 indooltest
zie 2.4.5.3.2
Salmonella  indool neg.
3.3.2.3.3 Decarboxylasetest
Nagaan of kiem AZ kan decarboxyleren
de decarboxylasebasis
* VB bevat weinig glucose
* indicator = broomcresolpurper (z = geel, b = paars)
* verdeeld in cultuurbuisjes
* steriliseren
Decarboxylasebasis + AZ
* AZ = thermolabiel  toevoegen na autoclaveren via bacteriënfilter
 toevoegen voor autoclaveren, maar 10 min. ipv 20 min
1) lysine.HCl
2) ornithine.HCl  behandeld met HCl, betere oplosbaarheid
3) arginine.HCl
eindconc. = 1%
32
toevoegen AZ
1) kleur basis wordt geel door HCl  pH aanpassen met NH4OH
2) VB te alkalisch  kiemen groeien niet meer  pH aanpassen
* enten + laag vloeibare, steriele paraffine (anaëroob)
↓
Oxidadatieve deaminatie van AZ door O2 vermijden
(vorming NH3)
NH2
|
H2O  NH3
R – C – COOH
|
H
OH
|
oxi
R – C – COOH
|
H
O
||
Krebsyclus
R – C – COOH  CO2 + H2O
ketozuren
pH ↑  B.C.P. = paars
lucht O2 
resultaat
1) decarboxylasebasis + weinig glucose  info over glucose omzetting
- glucose verzuurd = indicator geel
- geen pH wijzing
2) decarboxylasebasis + AZ  info over decarboxylisering van AZ tot primaire
aminen
- reageren in alkalisch midden
NH2
||
R – C – NH2
|
H

NH2
||
R – C – H + CO2
|
H
Lysine  cadaverine + CO2
Ornithine  putrescine + CO2
Arginine  agmatine + CO2
In decarbonxylasebasis + AZ zit ook glucose  beide buisjes beoordelen
Glucose omzetting
AZ decarboxylatie
Kleur basis
Kleur basis met
1% AZ
Paars
Paars
+
Paars
Paarser
+
Geel
Geel
+
+
Geel
paars
↓
Toch paars doordat
conc. AZ 20 x groter is.
33
Verschil Paars / paarser 
- aan basis x dr. HCl toevoegen tot kleuromslag
- aan basis + AZ evenveel druppels zuur toegevoegd
Glucose omzetting
AZ decarboxylatie
Basis
Basis + AZ
Geel
Geel
+
Geel
paars
3.3.2.3.4 Methylrood – “voges proskauer”-test (MRVP)
Enterobacteriaceae ingedeeld in 2 groepen volgens reducerend vermogen
1) - door enzymatische werking een gebufferde glucosebouillon met veel zuren
verwekken. (azijnzuur, melkzuur,wijnsteenzuur, … en weinig ethanol)
- pH medium > 4,4  indicator methylrood = rood (Z = rood, B = geel)
2) – glucose verzuren niet zo ver door (meer ethanol productie en 2,3 butyleenglycol)
↓
Tussenproduct = acetylmethylcarbinol
= AMC = 3-hydroxybutanon
↓
Aangetoond met VP test
VB = MRVP – medium
- bevat AZ argenine
- bevat gebufferd pepton
Na steriliteitscontrole  doorzichtig (als H2O)
* verdeeld in 2 cultuurbuisjes.
Buis 1  MR test
Buis 2  VP test
MR test:
rode kleur = pos. reactie
Gele keur = negatieve reactie
VP test
Toevoegen katalysator  α – naftoloplossing (of creatine oplossing)
Toevoegen base – opl.  KOH (of NaOH)
* in volgorde !
* goed geschud  goede luchtcontact
* 10 min wachten
Resultaat  vorming koperrode kleurstof = pos.
MR +
MR MR MR +
VP VP +
VP VP +
E. coli, Salmonella
Enterobacter
Glucose neg bacteriën
Proteus mirabilis (zwakke
MR en zwakke VP)
34
3.3.2.3.5 Kliglertest
VB = Kligler iron agar (KIA)
- bevat glucose (1g/l) en lactose (10 g/l)
- H2S detectiemiddel  Na2S2O3 en Fe(citraat)
Indicator = fenolrood (Z = geel, B = rood)
* KIA koken, verdelen in cultuurbuisjes
* autoclaveren
* schuin stollen  korte tong (slant), grote but (stomp)
* Steekenting en zigzagenting
Resultaat
Suikers = C-bron vooraleer AZ uit pepton word afgebroken (meer E uit suikers)
↓
Enkel aëroob afgebroken
1) enkel Glucose 0,1%vergist  kleine hoeveelheid zuur : indicator wordt geel
↓
Glucose = op, bacterie kan geen lactose vergisten  afbreken pepton
↓
Aan de tong oxi. Deaminering aan de luchtO2 met vorming NH3 en ketozuren
↓
Verder afgebroken door krebscyclus tot CO2 en H2O
Zure reactie aan tong = tijdelijk.
KIA  gele stomp, rode tong
2) enkel lactose 1% vergist  zure reactie blijvend
↓
Tong en stomp = geel
3) Glucose en lactose vergist  tong en stomp = geel
* soms gasvorming
* soms H2S productie uit zwavelhoudendeAZ  stomp = zwart
Tong
+
geel
Rood
Stomp
+
geel
- Rood
Gas
+
Gasbellen
Nihil
H2S
+
Zwart
Niet zwart
* in volgorde aflezen ! ! !  indeling van Kliglergroep
* Salmonella spp. Behoort tot -+++  Belgische vlag configuratie (rood, geel, gas, zwart)
citraa
35
3.3.2.3.6 Triple sugar iron agar (TSI)
= CLED medium
* 3 vergistbare suikers
1) Glucose 1%
2) Lactose 10%
3) Sucrose 10%
* H2S detectiemiddel (Na2S2O3 en Fe+3citraat
* indicator = fenolrood
* gekookt, verdeeld in cultuurbuisjes, geautoclaveerd
* VB schuin stollen !
* Steek en zigzag enting
Aflezing
* geen suiker vergist  VB = rood
* enkel glucose vergist  Stomp = geel, tong = rood (oxidatieve deaminering door lage conc.
aan glucose)
* andere mogelijkheden = Volledig geel
* gasvorming  in en onder de stomp bekeken
* H2S vorming  zwarte neerslag
Stomp
Rood
Geel
Glucose Glucose +
Rood
Geel
Tong
Lactose – sucrose a
lactose + en sucrose –
b
lactose + en sucrose –
c
lactose – en sucrose +
* Aflezen in volgorde  bepalen TSI groep
Onderscheid tussen b en c  CLED medium gebruiken
↓
= Cysteïne-Lactose-Elektrolyten-Deficiënt-medium
* AZ cysteïne + suiker lactose = bevordert groei van M.O.
* geen elektrolyten  bacteriën niet uitzwermen
* indicator = broomthymolblauw
* gekookt, gesteriliseerd, in petriplaten gegoten
* uitdunningsenting vertrekken van BHi
* omgekeerd incuberen
Aflezing
* lactose pos  gele kolonies
* lactose neg  blauwgroene kolonies
* reinheid van cultuur controleren  kolonies met verschillend kleur = besmetting van de
BHi
36
en b  niet op het CLED medium gescheiden.
* salmonella  glucose +, lactose -, sucrose -, soms gas en H2S + (Belgische vlag conf.)
a
3.3.2.3.7 Fenylanalinedeaminasetest
= APP of PA tet
VB = fenylalani-agar
Bevat fenyline
* gekookt, verdeeld in cultuurbuisjes, autoclaveren
* volledig schuin stollen (goede luchtcontact  oxidatie)
* massaal enten over het gehele opp.
Aflezing
* Fenylalaninedeaminase aanwezig  fenylalanine afgebroken tot fenylpyrodruivenzuur
* Na deaminatie  oxidatie door luchtcontact
NH2
|
CH2-CH-COOH
|
aminozuuroxidase
O
||
CH2-CH-COOH
|
+ NH3
(= APP=
Fenylalanine + Fe3+  geen reactie
APP + FeCl3
 groenblauw oxidatieproduct
Aflezing  tong overspoelen met FeCL3
APP +
Groenblauwe verkleuring
APP Geel van FeCl3
3.3.2.3.8 Katalasetest
Salmonella is katalase pos.
3.3.2.3.9 Oxidasetest
 goed om familie aan te tonen
Co-enzym cytochroom C aanwezig  aantonen met e- donor:
N,N,N’,N’-tetramethyl-p-fenyleendiamine (=TPD)
Test genoemd naar enzym, co enzym wordt echter aangetoond.
Chytochroomoxidase +  co-enzym cytochroom C aanwezig
37
Cyt C (ox)
cyt C (red)
oxidase
O2 traag
* enzym niet aanwezig  reactie kan doorgaan door oxidatie van luchtzuurstof
Werkwijze
Filtreerpapier
* Verse TPD 1% opl. maken
* in koelkast en afscherming licht bewaren
* stuk filtreerpapier bevochtigen met TPD
* bacteriën uitsmeren met pasteur pipet op bevochtigd stuk
Aflezing
Pseudonomadadeae
Bacillus
Enterobacteriaceae
< 10 sec paarsblauw
> 10 sec en < 1 min
> 1 min
Sterk oxidase pos
Zwak oxidase pos
Oxidase neg
Na 1 min is door oxidatie van luchtzuurstof
Methode van oxidasenstrips
* Reactiezone op strip bevat TPD
* met steriele pasteurpipet kolonie op reactiezone brengen
< 1 min
> 1 min


pos
neg
TPD
3.3.2.3.10 Citraattest
Synthetisch medium = 1 stikstofbron en C-bron = natriumcitraat
Koserictraatmedium
Indicator = broomthymolblauw (Z = geel, B = blauw)
* verdeeld in cultuurbuisjes, steriliseren, enten en incuberen
38
Aflezing
Citraat pos
- groei
 citaatverbruik
 verbruik van N-bron
 NH3 laat pH stijgen
 broomthymolblauw = blauw
Citraat neg
Geen groei
 broomthymolblauw = groen
Simmons’ citraatagar
 onderscheid tussen Salmonella en Shigella
* vaste, synthetische VB
* agar
* indicator = broomthymolblauw
* gekookt, autoklaveren, uitplaten.
* massale enting
* omgekeerd incuberen
aflezing
Citraat pos
Groei
 citraat en N verbruik
 pH stijgt
 broomthymolblauw = blauw over de
gehele plaat
Citraat neg
Geen groei
 groene plaat
* bij enten  geen bodem overdragen
↓
Niet enten vanuit een vl VB
* niet hermetisch afsluiten, luchtcontact nodig
3.3.3 Serologie van Salmonella
3.3.3.1 soorten antigenen
3 soorten
1) somatische antigenen  O
 gebonden en structuur als celwand
 polysachariden
 thermosstabiel
2) flagellaire antigenen  H
 gebonden en structuur als zweepdraden
 eiwitten
 thermolabiel
39
3) virulente antigenen
 Vi
 aanwezig als Salmonella het levend individu verlaten heeft
 liggen op celwand (maskeren O-antigenen)
 alleen gedood door Vi serum
 vernietigd door warmte, verd. zuren en fenol (O-niet)
* Antigenen vormen antigenisch potentiaal van Salmonella
* in werkelijkheid = niet om telkens één O-antigen en één H-antigen
3.3.3.2werkwijze
Groepsbepaling
Species (variëten)  samen in 1 groep als ze 1 of meer O – antigenen gemeen hebben
Soort –of variëteitbepaling
* Verdere indificatie  via H-antigenen
* 1 cultuur kan drager zijn van 2 verschillende H-antigenen = difasisch
* cultuur bevat 1 soort H-antigen = monofasisch
Fase 1  a,b,c, …
Fase 2  1,2,3,…
Salmonella Typhimurium komt het meest voor in België (± 57%)
3.3.3.3 Serologisch onderzoek volgens de objectglasmethode
Eerst  agglutinatie met het polyvalent O-antiserum
* Pos = bepalen O-groep
* Neg = mogelijkheid dat Vi, O maskeert
↓
Suspensie 1 uur, 60°C verwarmen (Vi-antigenen vernietigen)
↓
Terug agglutinatie uitvoeren
1) pos = bepalen O-groep
2) neg = geen Salmonella
* O-groep bepalen d.m.v. specifieke O-antisera
 daarna H-groep bepalen met bacteriën in het condenswater van TSI-agar
KIA, TSI
40
Neg: geen S.T.
pos: i-fase ?
Zwermmethode toepassen
VB = half vast = Swarm - agar
+ 1,2 antiserum
* in petriplaat gegoten
* gedroogd + lijnenting
Bacteriën zonder 1,2 antigenen  zwermen uit
Met 1,2 antigen  worden vastgezet
* van plaat overenten op TSI – agar
↓
Na incubatie, agglutinatie met i-antiserum
1) pos = S.T.
2) neg = geen S.T., wel 1,2 H-antigen
* Sereologisch identificatie  uitgevoerd na aflezing biochemische reeks.
* Salmonella kan kruisantigenen bezitten met andere Enterobacteriaceae (Citrobacter)
↓
Verschil zoeken met ONPG test
Pos = Citrobacter
Neg = Salmonella
* Co-aglutinatie = 2 verschillende bacteriën bevatten het zelfde antigen
3.3.4 Lysotypie van Salmonella
= identificatie van M.O. door onderzoek naar hun gevoeligheid aan de werking van specifieke
fagen.
3.4 Shigella
Shigelose = bacillaire dysenterie  epidemische ziekte in zomermaanden
3.4.1 Shigella Dysenteriae
* Familie = Enterobacteriaceae
* G-
* niet sporenvormend staafje
* onbeweeglijk
41
* geen kapsel
* hittegevoelig (pasteurisatie)
* gevoelig aan uitdroging en licht
* aëroob als anaëroob
* in levenmiddelen = beperkte levensduur
Ziekte komt niet vrij voor in de natuur
3.4.2 Ziekte
Veroorzaakt door M.O.
* ontsteking dikke darm + zweervorming
* ziekte = overgedragen tss zieke en omgeving
* door consumptie besmet voedsel of drinkwater
Toxinen
Shigella in darm + groei  gepaard met productie toxinen
↓
* Hittestabiel endotoxinen, O-antigen
Toxine = enterotroop of neutotroop
3.4.3 Symptomen
* Incubatie = 4 dagen
* buikpijn, diarree, hoge koorts
* veelvuldig slijmerige stoelgang + vermagering
3.4.4 Besmettingsbronnen
* geen saprofyt
* zeer korte levensduur in levensmiddelen
* mens = besmettingsbron
3.4.5 Andere Shigella species
4 sereologische types
1) groep A  S. dysenteriae
2) groep B  S. flexneri
3) groep C  S. boydii
4) groep D  S. sonneï
3.4.6 indificatiereeks
* glucosevergisting zonder gas (behalve
groep B)
* lactose-neg. behalve S. sonnei (laat)
* H2S neg
* urease – neg (geel, fenolrood, geen NH3
vorming)
* citraat neg (simmons – citraat, groen)
* lysinedecarboxylase-neg (beide buisjes
geel)
* kligler test (-,+,-,-)
42
3.5 Escherichia coli
3.5.1 De coliformen
Omvat 4 genera
1) Escherichia
2) Enterobacter
3) Citrobacter
4) Klebsiella
En sommige Serratia  ondersheid van Enterobacteriaceae
↓
Lactosevergisting binnen 48 u, gepaard met gas en zuurvorming
* G* niet sporevormend staafje
* aëroob tot facultatief anaëroob
* geen kapsel (behalve Klebsiella)
* beweeglijk (behalve Klebsiella)
* sterke vitaliteit  weerstand tegen fenol, galzouten en bep. Kleurstoffen
* goed geremd door seleniet, tetrathinaat, …
* belangrijkste vertegenwoordigen E. coli
E. coli  hogere incubatietemp.
 wordt gebruikt om een fecale pollutie aan te tonen
 opsporing E. coli: 44°C (andere Enterobacteriaceae geremd)
 opsporing in water 37°C
 overige levensmiddelen: 30°C
↓
Sommige coliformen vormen geen gas bij 37°C, bij 30°C wel
E. coli is
* darmcommensaal die reeds optreedt kort na de geboorte
↓
Door melkvoeding kan in het begin overheersing van anaërobe
lactosevergistende Bifidobacterium
* in darm  in competitie met aëroben of anaëroben. (aantal en afhankelijk v/d voeding)
* natuurlijk habitat = spijsverteringskanaal, niet pathogeen.
↓
Is potentieel pathogeen
1) als ze men vind dan het M.O. in een steriel deel (bloed, urine, …)
2) als ze in groot aantal voorkomen op een slijmvlies (meestal kolonisatie, geen infectie)
3) bepaalde E.coli verwekken gastro-enteritis. (gevaarlijk voor zuigelingen)
↓
= gevaarlijke diaree
43
* Darmwand beschadigd door verwondingen v/e andere infectie  colibacillose
Symptomen
* bloederige diarree
* buikkrampen
* lichte koorts
* zelfimiterend (gaat vanzelf over)
Bij kinderen of ouderen HUS-syndroom
↓
Rode bloedcellen worden afgebroken, nieren worden geïnactiveerd en er kunnen blijvende
nierletsels voorkomen
3.5.2 Toxinen en andere metabolieten
Toxinen
* Exogeen neutotroop toxinen  thermolabiel, verlammingsverschijnsel bij infectie
* enterotroop endotoxinen
 thermostabiel
Andere metabolieten
E. coli  produceert colilysine
↓
Haemolysine dat rode bloedcellen van paarden aantast
 β-lactamase produceren, zal de β-lactaman-antibiotica remmen
↓
Hierdoor ongevoelig voor penicilline
3.6 opsporing van coli-achtigen
3.6.1 situering
Familie = Enterobacteriaceae
* G- staafje
* geen sporen
* aëroob tot facultatief anaëroob
* lactosevergisting binnen 48u met gas en zuurvorming
* belangrijkste vertegenwoordigen = E. coli
3.6.2 isolatie
* opsporing coliformen = belangrijk
↓
- Parameter voor hygiëne of onhygiëne.
- klassieke bepaling bij drinkwateronderzoek
44
3.6.2.1 aangewende media bij onderzoek van vloeibare substraten
3.6.2.1.1 lactosebouillon
* 1% lactose + nutriënt bouillon.
* verdeeld in cultuurbuisjes, durhambuisje, steriliseren, enten
* indicator = broomthymolblauw
* zuurvorming en gasvorming gecontroleerd
3.6.2.1.2 briljantgroen-lactose-ossengal 2%-bouillon (BLO 2%)
* C-bron = koolstof
* briljantgroen  remt lactose pos. bacteriën
* galzouten  remmen G+ kiemen + sommige Enterobacteriaceae
* gasvorming = aanwezigheid van coliformen
* groene kleur van VB wordt behouden
3.6.2.1.3 Minerals Modified Glutamante Medium
* VB aangewend i.p.v. BLO 2% bij onderzoek van gechloreerd water
* C-bron = lactose
* indicator = broomcresolpurper
* coliformen  vergisten lactose met zuur en gasvorming
↓
Indicator = geel, gasbel aanwezig
 1 of 2 of 3 wordt de MPN methode gebruikt om te tellen
1) 5 cultuurbuizen (100ml) + 20 ml VB + durhambuisje: enten met 10 ml drinkwater
2) 5 cultuurbuizen (20 ml) + 10 ml VB + durhambuisje: enten met 1 ml drinkwater
3) 5 cultuurbuizen (20 ml) + 10 ml VB + durhambuisje: enten met 1 ml van eerste dec. verd.
* incuberen bij 37°C
* aantal cultuurbuizen tellen met gasbel per decimale verdunning
* kental samenstellen
3.6.2.2 aangewende media bij onderzoek van vaste voedingswaar
Te onderzoeken eetwaar  monster maken
↓
10 g voedingswaar overbrengen in plastic zak + 90 ml tyrpton-soya-bouillon
* stomacheren (eerste decimale verdunning)
* verder decimaal verdunnen in fysiologisch water (voldoende ver  VB niet zo selectief)
* kleurreactie v/d VB beoordeeld
45
3.6.2.2.1 algemene telling van Enterobacteriaceae
Violet red bile glucose medium (VRBG)
* bevat kristalviolet (G+), neutraalrood, galzouten en glucose
* koken
* verdelen in cultuurbuisjes zonder te stollen.  gebruikt als gietplaat
* 1 ml vooraanrijking overbrengen in petriplaat + 10 ml VRBG
* stollen
* 2de laag VRBG opgieten  dubbellagig (Entero’s = facultatief anaëroob)
# KVE
x reciproke waarde van de verd. factor = # KVE/g
Volume inoculum (ml)
Aflezing  paarse kolonies
3.6.2.2.2 Voor telling van coliformen
Tergitol-7-agar
= “mossel”-fecale contaminatie-medium
* C-bron = lactose
* indicator = broomthymolblauw
* Tergitol-7-natriumheptadecylsulfaat  remt veel bacteriën maar geen coliformen
* suplement = trifenyl-tetrazolium-chloride (TTC)
* Gele kolonnies (zuurvorming uit lactose)
* TTC  gereduceerd door Enterobacteriaceae maar niet door coliformen
↓
Rode kolonies met een blauwachtige zone
* G+  groeien niet
* verdere bevestiging nodig  Pseudomonas en gisten groeien op dit medium
Endo-agar
* C- bron = lactose
* bevat Na2SO3
* moment van bereiding  basische fuchsine toevoegen
* platen in donker bewaren (roze kleur behouden)
* coliformen  rode kolonies
↓
Niet uit lactose maar uit acetaldehyde vorming
Acetaldehyde bind met Na2SO3  fushsine behoud zo haar kleur
Salmonella  kleurloze kolonies op een roze fond
46
Mac Conkey-agar
Rode kolonies
Chromogenic E. coli/coliformen Medium
E. coli  produceert β-galactosidase en β-glucuronidase
Coliformen  alleen β-galactosidase
In VB  2 kleurdragers (chromogenen) X-glu en X-gal
X-glu  functie = enzym β-glucuronidase aantonen, blauw ingebouwd chromofoor
X-gal  functie = enzym β-galactosidase aantonen, roze ingebouwd chromofoor
* C-bron = lactose
* indicator = neutraalrood
* enten door open te strijken met glazen buis
* controleren of er chromoforen vrijgesteld worden.
E.coli  paarse kolonies (mix van beide)
Andere coliformen  roze kolonies
Niet coliformen  strokleurige kolonies
3.6.2.2.3 Voor telling van E. coli
* C-bron = lactose
* inhibitoren = eosine + mehtyleenblauw
E.coli  kolonies met donkerpaars centrum en groene metaalglans
 vormt meer zuur dan andere coliformen
↓
pH, voldoende laag  condensatiereactie tss beide kleurstoffen (vorming complex)
↓
Eosine-methyleenblauw-complex , precipiteerd op kolonies
↓
Groene metaalglans
3.6.3 Determinatie
Typische kolonie enten in ureumbouillon  biochemische reeks enten
E. coli = urease neg
3.6.3.1 Kligler test
* E. coli vergist glucose met gas en zuurvorming
* Lactose ook vergist
Volledig geel me gasbellen, H2S negatief ( +++- )
47
3.6.3.2 IMViC schema
= indool-methylrood-voges Proskauer-citraat
E. coli = indool pos, methylrood pos, V.P. negatief en citraat negatief
3.6.3.3 Motility test
E. coli = beweeglijk
3.6.3.4 Fenylalaninedeaminasetest
E. coli = APP neg
3.6.3.5 Gelatinasetest
E. coli = gelatinase neg
3.6.3.6 ONPG test
* Uitgevoerd in 1 ml ringeropl.  geen VB
* massaal enten (M.O. kunnen hier niet op groeien) tot visuele troebeling
* ONPG-disc toevoegen = o-nitrofenyl-β-galactopyrasnoside (kleurloos)
* incubatie in waterbad (37°C)
Aflezing
Bacterie produceerd enzym β-galactosidase
↓
β-verb. wordt verbroken, ONPG omzetten tot o-nitrofenyl (ONP) en galactose
↓
= geel
* Test = belangrijk bij onderzoek Entero’s.  gedeeltelijke controle over lactose omzetting
* Lactose omzetten  bacterie in bezit van 2 enzymen:
1) permease
2) β-galactosidase
Moet in de celwand aanwezig zijn
↓
Lactose opgenomen in cellichaam
* β-galactosidase zet lactose om in glucose en galactose
Permease
β-galactosidase
Lactose omzetting
-
+
-
+
+
+
+
-
Nog andere testen uitvoeren, niet zeker
48
Na incubatie - + - toch soms lactose vergisten
↓
Oude cellen hebben permeabele celwand  lactose toch opgenomen
↓
Onderscheid tss snelle en trage lactose vergisters
Verband ONPG-test
OPNG neg kiem = lactose neg
OPNG pos kiem = lactose neg of pos
3.6.3.7 Malonaattest
* V.B. = malonaatbouillon (synthetisch medium)
* C – bron : natriummalonaat
* N – bron : (NH4)2SO4
* indicator = broomthymolblauw
* verdelen, steriliseren, enten en incuberen
Malonaat +
Groei
Malonaat Geen groei
Verbruik van Malonaat + N-bron
 NH3 komt vrij
 V.B. wordt basischer
 blauwkleuring
* E. coli :
Groen
- malonaat negatief
- mannitol positief
- amylase negatief
3.6.3.9 amylasetest
* V.B. = zetmeelbouillon-agar  bestaat uit nutrient agar + 2% zetmeel
* lijnenenting uitvoeren
* minstens 48 uren incuberen
* aantonen  afbraak van zetmeel
Aflezing
1) kijken of er groei is
2) plaat overvloeien met lugoloplossing (I2/KI)
Amylase +
amylse –
49
* Groeilijn = breed (geel)
* Heldere zone rond groeilijn
Zetmeel  afgebroken tot polysachariden
 geen blauwkleuring met I2
Brede groeizone
 blauwe plaat
 zetmeel kleurt blauw met I2
3.6.4 Serologie
3.6.4.1 de coli-antigenen
1) somatische antigenen 
- = O – antigenen
- gelegen op de celwand
- hebben gluco-lipido-polypeptide-structuur
- zijn hittebestendig
2) flagellaire antigenen 
- = H – antigenen
- gelegen op de zweepdraden
- hebben eiwitstructruur
- zijn thermolabiel
3) K-antigenen

- gebonden aan opp. v/d cel
- K-aglutinatie overlapt O-aglutinatie
Heeft 3 variëteiten
3.1) A-antigenen
- vormen morfologisch kapsel
- zijn thermostabiel bij 100°C, kapot bij 120°C
3.2) L-antigenen
- zijn thermolabiel
3.3) B-antigenen
- kapot na half uur op 100°C
- overlappen met O-antigen
3.6.4.2 Diagnose van enteropathogene colibacillen
Isolatie
* enten van feces op selectieve V.B. (mac conkey-agar)
* na 1 dag incubatie  3 rode kolonies zichbaar
* alle3 over enten op TSA
* zelfde avond  afflutiantie
Agglutinatie
* op draagglas: te testen reincultuur + druppel pentavalent antiserum van groep 2, 3 en 4
* entlus v/d groei mengen met antisera tot homogene melkachtige suspensie
- Grove agglutinatie < 5 sec in 1 v/d 3 antisera  aanwezigheid van 1 v/d 14 sereotypes
- fijne en laattijdige agglutinaties  niet van belang
Agglutinatieculturen  behandeld met specifieke monovalente antisera
50
Confirmatie
Bijkomende test  identificatie van het O-antigen
3.7 infecties door vibrio
3.7.1 Morfologie en groei van Vibrio
* G* kommavormige gebogen staafjes
* aëroob tot facultatief anaëroob
* beweeglijk
* geen sporen
* pH : 6,5 en 9,6  alkali-tolerant (aanrijking en isolatie)
Bevat 2 menselijke darmpathogenen
1) Vibrio cholerae
2) Vibrio parahaemolyticus
3.7.2 Vibrio cholerae
Toxine
* Via besmet voedsel of water in spijsverteringskanaal v/d mens
↓
Vermenigvuldigen
↓
Secreteren een neuramidase-enzym en een toxine
Beschadigd de slijmlagen
ontregeld Na+/K+ transport in de darmwand
 uitdroging  dood
* > 70 sereotypes, slechts 1 produceert enterotoxine
- is hittelabiel
- eiwitstructuur
Symptomen
* incubatieperiode = 2 dagen
* symptomen = braken, waterige diarree  uitdroging
↓
Spierkrampen, gewichtverlies en anurie
* infecties  vooral bij fysische zwakke mensen
* Gezonde pers  goede maagsecretie: eten  pH ↑
↓
Bacterie sterft af doordat het alkalisch tolerant is
* weinig eten  problemen met maagsecretie  te weinig eiwitten
↓
Bacterie door maag in dunne darm  ziek
51
Algemene profylaxis en immuniteit
* Streken waar cholera heerst  quarantaines
Immuniteit
 verworven door inenten van dode cellen (2 maal in 1 jaar)
 geen antibiotica
↓
Bij optreden van symptomen  cellen gelyseerd voor vrijstelling enterotoxine
3.7.3 Vibrio parahaemolyticus
* beweeglijk
* in vaste V.B.  vorming van peritriche zweepdraden
* in vl. V.B.  vorming van polaire zweepdraden
* kiem = halofiel (zoutlievende bacterie)
symptomen
* korte incubatieduur (12 uur)
* buikpijn, diarree, misselijkheid, braken
* laag sterftecijfer
* geen immuniteit
Besmettingsbronnen  zeewater, vissen (vooral in warme kustwaters)
3.7.4 opsporing van Vibrio in levensmiddelen
Aanrijking
* in alkalisch peptonwater
* 10 g monster overbrengen in 90 ml peptonwater
* incuberen
Isolatie
* op thiosulfaat-citraat-bile-sucrose-agar (TCBS)
* niet autoklaveren
* in peptriplaten gieten
* omgekeerd incuberen
Aflezing
* door Na2S2O3 en Fe3+ - citraat  H2S detectie
* galzouten  remmen G+
* C-bron = sucrose
* indicator = broomthymolblauw
* pH = 8,6
52
Vibrio: Zijn sucrose +  gele kolonies
Vibrio p.  uitzondering: is sucrose neg.  groenblauwe kolonies
Pseudomonas  ook groen  verder uitzoeken
Bep. Kokken  ook geel
 verder uitzoeken
3.9 infecties door campylobacter
* zit niet in een “echte” familie
* is moeilijk kweekbaar
* even belangrijk als Salmonella
3.9.1 situering van Campylobacter in de taxonomie
* samen met 5 andere geklasseerd: de vibroïde, G- staafjes
* morfologie brengt ze samen
3.9.2 Morfologie
* klein, niet sporevormend G- staafje
* typische kurkentrekkerbeweging
* oude culturen  worden coccoïd (bolvormige cel) = teken van degeneratie
* plat, grijsblauw en lijken zeer sterk op waterdruppels
* gramkleuring + zuurvaste kleuring = goed
3.9.3 Biochemische en fysiologische eigenschappen
* is een micro-aërofiele soort = zuurstof arme omgeving
 werken met gecontroleerde atmosfeer (5% O2, 10% CO2, 85% N2)
* optimum temp = 42°C,
< 25°C  geen groei
* koolhydraten niet geoxideerd
* Krebcyclus bestaat wel.
* Energie geleverd door oxidatie van verb. zoals citraat, …
Katalase +
Oxidase +
VP –
Indool –
Methylroodrest –
≠ AZ worden gedecarboxyleerd
* gevoelig voor NaCl (1,5% in H2O en 2,5% = dood)
* gevoelig voor tal van antibiotica  selectiviteit bevorderen
3.9.4 ziekteverschijnselen door Campylobacter
* = darmcommensaal bij dieren (vooral kip)
↓
Moeilijk infectie tegengaan
= reizigersziekte
53
3.9.7 isolatie en identificatie
Gebruik gemaakt van de atmosfeer, temp, VB met antibiotica en afwezigheid van suikers
Vooraanrijking
* Zijn aanwezig in levensmiddelen in subletale vorm.
↓
Cellen terug in normale toestand brengen door vooraanrijking
* vooraanrijking in niet TE selectief medium  BHi zonder suiker
* incubatie = 37°C in gereduceerde atmosfeer
* overenten op normale aanrijkingsVB
Aanrijking
* gebruik gemaakt van zelfde basismedium als vooraanrijking + toevoegsels
↓
Inhiberen voor andere bacteriën, bevorderd voor campylobacter
Bv: bloed of antibiotica
Isolatie
* Op vaste VB
* zelfde basismedium als de vooraanrijking + toevoegsels (≠ antibiotica’s, redoxverlageres en
bloed)
* isolatiemedium = campylosel-agar  vaste VB + 5% schapenbloed + ≠ antibiotica’s
* incuberen bij 42°C
* micro-aërofiele atomosfeer
2 kolonies komen voor
1) op verse vochtige platen  platte, gespreide kolonies met onregelmatige uitzicht
2) droge oudere platen  ronde gelijkmatige kolonies
beide zijn haemolytisch en grijs van kleur
* isolatimedium = Campylobacter Blood Free Selective medium ( VB zonder bloed)
* grijze kolonies op zwart medium
* verschillende M.O.  kunnen groeien op media
↓
meestal witglanzend van kleur, soms haemolytisch  soms verworpen als campylobacter
* verdachte kolonies  levend preparaat gemaakt en Ziehl’s cafbofuchsine-kleuring
↓
typische kurkentrekkerbeweging + kommavormige celmorfologie = 1ste bevestiging
* verder overgeënt op BHi  katalase en hippuraattest uitvoeren
* Campylobacter = oxidase pos
54
3.10 Listeria
* is aanwezig in verschillende zuivelproducten
3.10.1 situering van listeria in de algemene taxonomie
* Behoort tot de regelmatige, niet – sporevormende, G+ staven
* nauw verwant met Lactobacillus  onderscheid door beweeglijkheid en katalase +
* Listeria = afzonderlijk geslacht
3.10.2 Morfologie
* korte staafjes
* afgeronde cellen
* komen vrij algemeen voor bij overenting in vl milieu
* er komen 2 verschillende vormen voor  V en Y vorm (verwarring met streptococcus)
* heeft een typische tuimelende beweging ! !  door peritriche flagellen
↓
Slechts gevormd bij vermenigvuldiging bij 20 – 25 °C
↓
actiever bij 25°C dan bij 37°C = hoofdeigenschap
* kolonies = rond met blauwdruppel-uitzicht en grijsblauwe schijn
* bij Henri-belichting (45°)  kleur over naar typische groenblauwe keur
↓
Herkenningsmiddel voor Listeria
3.10.3 biochemische en fysiologische eigenschappen
* Optimale groei  tussen 30 en 37°C
* Vermenigvuldigen  tussen 1 en 45°C
↓
Lysteria aangerijkt bij koude temp.
* Lysteria is alkalitolerant
* bij lage pH sterk geremd
* E-bron = glucose
* metabolisme  via glycolyse
* citraat wordt niet afgebroken
* ≠ groeifactoren (vitamines, AZ)  noodzakelijk voor de groei
* katalase +
* methylrood +
* VP +
* oxidase test –
* indool –
* H2S productie – (IMViC -++-)
* resistent tegen bepaalde antibiotica en remstoffen
55
3.10.4 Ziekteverschijnselen bij Listeriosis
* = infectieziekte
* kans op infectie = zeer laag
↓
Personen uit risicogroep (zwangere vrouwen, pasgeborene, bejaarde, …)
↓
- hevige hoofdpijn, koorts, stijve nek
↓
hersenvliesontsteking ( † 48u)
- enderocarditis (hart), longontsteking en conjunctivitis (ogen)
* Zwangere vrouwen  grieperig, hoofdpijn en keelpijn
- voor moeder = geen probleem
- voor kind = dood of ziek geboren († 7 w)
* behandeling = niet moeilijk  wel voldoende lang gebeuren
3.10.5 voorkomen van Listeria
* in darmen van dieren  normaal geen last. (schapen = gevoelig)
* in melk en afgeleide producten
3.10.6 isolatie en identificatie
* isolatietechniek  niet bepaald door de groeimogelijkheden
↓
Koude aanrijkingsmethoden
Aanrijking nodig
* bep. hoeveelheid monster in selectief aanrijkingsmedium
* 6 weken bewaren op temp = 4°C
↓
Lage incubatietemp + aanwezigheid inhibitoren  selectieve aanrijking
* te selectief medium = minder goede resultaten bij koude aanrijking
 alleen gebruiken bij warme aanrijking
Aanrijkingsmethode bij hogere temp.
* hoge temp = selectievere aanrijking
↓
Met: - LEB (Listeria Enrichment Broth)
- FRASER Broth
Isolatie
beide 4 d incuberen op 25°C
* met het - Oxoford – medium
- Palcam – medium
* selectiviteit = combinatie van inhibitoren  zwarkleuring VB (zie reactie hieronder)
56
FRASER:
Alle disteria
Aesculine
Aesculitine + glucose
Fe3+-citraat
Zwarte neerslag
* Palcam medium  minder antibiotica en 1 suiker = mannitol
↓
Lysteria = mannitol – en aesculine +
↓
Zwarte kolonies met krater in het centrum op rode achtergrond
* Lysteria = alkalitolerant  pH wordt verhoogd door KOH opl
Bevestigde testen
* verdachte kolonies  overgeënt op TSA
↓
Verdere testen uitoeren
3.10.7 Besluit
* tolerantie = minder dan 100 / g
3.11 Infecties door D-streptococcus spp.
3.11.1 Het genus Streptococcus
Familie = Lactobacillaceae. Streptococcus spp.
* G+
* rond tot eivormige cellen (kettingen)
* onbeweeglijk
* niet spore vormend
* anaëroob tot microfiel – aëroob
3.11.2 de indeling of identificatie
* α – haemolyse  vergroening op de bloedplaat  door H2O2
↓
Niet ontbonden door enzym katalase (zijn katalse -)
* β – haemolyse  op bloedplaat: helder kofje rond iedere kolonie
↓
Rode bloedcellen zijn er opgelost
* γ – haemolyse  geen visuele ≠ op bloedplaat
57
3.11.2.1 Strep. die een specifieke koolhydraat bezitten: polysaccharide c.
3 groepen van belang
1) Lancefieldgroep A
* = Streptococcus pyogenes
* belangrijkste menselijke pathogeen
* veroorzaken allerlei ontstekingen op slijmvliezen (angina, roodvonk)
* β – haemolytisch
* gevoelig voor lage conc. bacitracine
* temp = 10, temp = 45  geen groei
2) Lancefieldgroep B
= Streptococcus agalactiae
* veroorzaakt infecties bij pasgeborene
* urinaire infecties bij mens
* β – haemolytisch
* resistent tegen antibioticum bacitracine
3) Lancefieldgroep D
* behoort tot commensale darmflora
* gewoonijk niet haemolytisch (γ)
* sommige: sterk β – haemolytisch of zwak vergroenend (α)
* groei bij 10 en 45°C
2 groepen
3.1) fecale streptococcus spp
- weerstandig aan bacitracine en 40% gal
- ontbind aesculine in glucose en aesculitine  zwarte neerslag met ijzerzouten
- M.O.  opgespoord om fecale pollutie aan te tonen
3.2) niet-Enteroccus spp
- species: Streptococcus equinus en Streptococcus bovis
↓
↓
* Is darmcommensaal
* is darmcommensaal bij rund
* Komt niet voor bij mens
* komt voor bij mens
* Niet gevoelig aan penicilline
* Gevoelig aan penicilline
4) Lancefieldgroep N
* melkstreptococcen (Lactococcus lactis)  behoren tot deze groep
* komen voor in melk
58
3.11.2.2 Streptococcus zonder specifiek koolhydraat
De viridansgroep
* M.O. zijn commensaal in mondholte en darm
* gekenmerd door α – haemolyse
De Pneumokokken
* 1 soort = klinisch belangrijk: Streptococcus pneumoniae
* zijn G+ diplokokken met kapsel
* α – haemolyse
* gevoelig aan antibioticum optichine
De strikt anaërobe Streptococcus spp.
Ondergebracht in genus Peptostreptococcus
3.11.3 voorkomen en pathogeen vermogen van fecale Strep. spp.
* commensaal in de darm
↓
Steeds gezocht in voeding en drinkwater
* veroorzaakt diarre, misselijkheid en braken
* kleine aantallen  in mond en slijmvliezen vagina
* zijn potentiaal pathogeen  komen terecht in steriel lichaamsvocht: infecties
- urinaire infecties
- infecties van galblas en galwegen
- bacteriële endocarditis
3.12 opsporing van D-Streptococcus spp. in levensmiddelen
3.12.1 situering
* Famile = lactobacillaceae
* Genus = Streptococcus
* Lancefieldgroep D (D-streptococcus)
3.12.2 hoofdeigenschappen van fecale Strep. ! ! !
* groeien niet overvloedig op vaste media
* koolhydraten en polyhydroxyalcoholen  afgebroken
Homofermentatief heterofermentatief
↓
↓
- vorming melkzuur - vorming melkzuur + azijnzuur, ethanol en CO2
* micro-aërofiel tot anaëroob
* alkalitolerant
* halofiel
59
* resistent tegen methyleenblauwmelk (0,1%)
* katalase neg
* 40% gal en 10% bloed  groei mogelijk
* familie
* resistent aan basitracine
* omzetting aesculine
3.12.3 isolatie en determinatie
3.12.3.1 voorbehandeling
* 10 g monster + 90 ml steriel trypton-soya-bouillon
* homogeniseren en stomacheren
3.12.3.2 isolatie
Slanetz en Bartley medium
* V.B. : niet geautoclaveerd  selectiviteit gaat verloren
* V.B. verwarmt tot kookpunt
* 30 sec roeren  agar lost op
* V.B. uitplaten
* enten als strijkplaat
* incubatie bij 44°C
Aflezing
* V.B. bevat natriumazide (NaN3)  remt G* indicator = trifenytetrazoliumchloride (TTC)
↓
Gereduceerd tot formazan (roodbruin)
Kanamycine-aesculine-azide-agar (KAA)
* kanamycine = supplement  toevoegen aan medium
* autoclaveren en uitplaten
* enten als strijkplaat
* incuberen bij 44°C
Aflezing
* NaN3  remt G* kanamycine = breed spectrum antibioticum
* incicator = aesculine  zwarte neerslag
* verdere determinatie nodig
3.12.3.3 bevestiging
* Katalse -
60
3.12.3.4 determinatie
* specificatie binnen de groep  suikervergisting nagaan
* ≠ tussen Enterococcus en Strep. bovis  aangetoond met antibiogram
↓
↓
- Gevoelig voor penicilline
gevoelig aan antibiotica waar entero resistent tegen is
- resistent tegen ≠ antibiotica
3.12.4 kwalitatieve bepaling
* kijken of ze aanwezig zijn  SF-medium
↓
- medium bereid
- verdeeld in cultuurbuisjes, gesteriliseerd, enten
- incubatie bij 44°C
Aflezing
* NaN3  remt G* C-bron = glucose
* indicator : broomcresolpurper
Glucose +
Indicator  gele kleur
61
Fermentaties
Hfst 1: fermentatieve bereiding van azijnzuur CH3COOH
1.1 Azijnzuurbacterie
1.1.1 algemene eigenschappen
* strikt aërobe staafjes
* groei bij lage pH (4 – 4,5)
* G* geen sporenvorming
* polymorf
* beweeglijk / onbeweeglijk
* soms pigmenten / celluloseproductie
* komt voor in de natuur
1.1.2 Taxonomie
Familie = Acetobacteriaceae
1) Genus = Acetobacter
* slechte azijnzuurbacterie
* overoxidysers  oxideren ethanol tot azijnzuur, oxideren azijnzuur verder tot CO2 en H2O
2) Gluconobacter
* goede azijnzuurbacterie
* underoxidysers  geen verdere afbraak van azijnzuur
1.1.3 Industriële stammen
* gestart van geschikt M.O.  vlug mutaties  mutant-meng-cultuur
Tijdens fermentatie selectie zodat
* allen azijnzuurtolerante over blijven
* geen overoxidaties van azijnzuur
gebeuren
* er weinig behoefte aan extra-nutriënten
* hoge productiesnelheid is
* met faag-resistente stammen gewerkt
Entculturen
* G. acetigenum
- zeer beweeglijk, kleurt met I2 blauw
- ethylacetaat als nevenproduct
- optimale temp = 33°c
* G. orléans
- oudste
* G. scheuzenbachii
- meest gebruikt
- optimale temp = 25-27,5° (temp > 37°C  geen azijnzuurvorming
* G. xylinoïdes
62
A. ascendens en A. xylinum
- zijn overoxydisers
- slijmvormers
- vormen langzaam azijnzuur maar snel slecht smakende stoffen
- indien voorkomt  pasteuriseren
In bier  Overoxydisers = ongewenste besmetting (bier slijmerig en zuur)
1.2 Biochemie v/d azijnzuurvorming
Ethanol  azijnzuur = tweestapsreactie
* sterk aëroob en exotherm
Fig. zie p3
O
O
||
||
C6H12O6  CH3 – C – COOH  CH3 – C – H
Glucose
pyrodruivenzuur
formaldehyde
NADP+ = Nicotineamide-adenine-dinucleotide-fosfaat
↓
Neemt H+ op
↓
H+ wordt getransfereerd naar cytochroomsysteem (gelegen in de mitochondriën)
↓
H+ bind aan zuurstof tot H2O
1.3 voedingsvereisten
1.3.1 alcohol
= C-bron
* ruwe of gezuiverde fermentatieve ethanol  moet verdund zijn
↓
* Conc > 14 %  alcohol onvolledig geoxideerd
10 à 13 %
↓
Bacteriële film moeilijker gevormd
* conc = te laag  verliezen van azijnzuur door verdere afbraak
1.3.2 Nutriënten
* ruwe grondstoffen  geen extra toevoegingen
* soms fosfaten, droge gist of gistextracten
Voor azijn met meer dan 12 % azijnzuur
- glucose
- fosfaten
- sulfaat
- sporenelementen
63
1.3.3 zuurstofbehoefte
= sterk aëroob proces
* 1120 l lucht / kg glucose
* lucht = slecht oplosbaar in water  meer volume nodig dan theoretisch bepaald
Omrekening zie p 4
1.4 fermentatieprocessen
1.4.1 Orléans-proces
= oudste bereidingswijze
* oxidatie in open vaten van ± 200 l
* 1/3 gevuld met mengsel (wijn, ruwe wijnazijn en azijnzuurbacterie)
* M.O. = Gluconobacter orléans
* temp = kamertemp.
* exotherm proces
* proces teneinde als alcoholgehalte < 0,2%
* aan opp  vlottend houten rooster met azijnzuurbacteriën
↓
In openingen  bacterie vormen een vlies
↓
↓
Hier gebeuren oxidaties
↓
↓
↓
Belangrijk  per dag: 0,5 l/m2 opp. bact vlies toevoegen
* na fermentatie  ruwe azijn afgetapt, bacteriële film bewaard.
1.4.2 Trickling-generator
* tank = Frings-generator (luchtdicht uit cypressenhout)
* onderaan tank = berkenhoutkrullen op houten traliewerk
* helemaal onderaan = collectiekamer
* Mengsel naar pomp gestuurd, via warmtewisselaar naar boven gestuurd;
* mengsel over houtschavelingen verspreid door sproeier
* zuurstofvoorziening = onderaan tank via luchtfilter
* temp  gemeten op verschillende hoogten
- bovenaan = 28°C
- onderaan = 35°C  afkoelen
* Toevoerleiding = roestvrij staal
* mengsel herhaaldelijk doorstromen  azijn wordt sterker
* einde  ethanolconc. kritisch
↓
Meer dan 0,2% residu alcohol overblijven (cellen sterven anders af)
* Cellimmobilisatie  cellen blijven grotendeels vastzitten bij aftapping ruwe azijn
* rendement = 90%  door sterke aëratie vervluchtig een deel van azijnzuur en ethanol
64
1.4.3 submersproces
* Proces afgeleid van antibiotica-submersfermentatie
* gebruik van Frigs-acetaror
* aëratie = zeer efficiënt
* frigs-aërator  zeer fijne luchtbelletjes verspreid
* keerschotten  verspreid de lucht gelijkmatig
* zuustofgebrek = onmiddellijk gevolg op leefbaarheid van Gluconobacter
Koeling via interne koelspiralen
Inoculatie via ruwe azijn uit vorig proces
Productie = 10 maal sneller dan vorige proces
Tijdens fermentatie: 0,2% alcohol blijf tover
↓
35% v/d azijnvl. wegpompt, vervangen door ethanol, wijn, …  cyclus herhalen
* bacteriën afgescheiden door filtratie en bezinking.
1.5 behandelingen van azijn na microbiële fermentaties
* filtreren  grote troebele deeltjes verwijderen
* membraanfiltratie  verwijderen bacteriën
* Kiezelgührfiltratie  adsorptie v/d kleinste troebele deeltjes
* klaren  donkere kleur houtkrullen verdwijnt na toevoeging K4Fe(CN)6
Hfst 2: Fermentatieve bereiding van melkzuur
2.1 Micro-organismen
Fam: Lactobacillaceae
↓
Bevat de anaërobe Bifidobacteria
- G+
- geen sporen
Industrieel meest gebruikt = homofermentatieve bacteriën
- lactobacillus bulgaricus
- lactobacillus delbrückii
Vw:
* snel melkzuur produceren
* zo weinig mogelijk nevenproducten
Boterzuurbacterie (Clostridia) = gevaarlijk infectie-agent
↓
Melkzuurbacterie
- onder optimale voedingswaarden enten
- hun max. metabolisme doorvoeren bij hoge temp.
65
↓
Keuze geschikte stammen vermindert
Tempeff = zeer belangrijk op groei
* L. bulgaricus
* L. delbrückii
beiden thermofiel + homofermenters
2.2 biochemie
* Homofermentatieven
- bezitten het enzym aldolase
- geen glucose–6–fosfaat-dehydrogenase
hebben dus verschillende enzymen
* heterofermentatieven
- eisen het omgekeerde
2.3 voedingsresten
2.3.1 koolstofbron
Praktijk 
- glucose, sucrose of lactose
- maïs of aardappelzetmeel na zure hydrolyse
Keuze hangt af van
Conc. hangt af van
- de prijs
- de aan te wenden M.O.
- fermentatietemp
- soort grondstof
- vergistingvoorwaarden
- varieert van 5 tot 20%
2.3.2 voedingsstoffentoevoegingen
* Toevoeging  nodig om actief metabolisme van melkzuurbact. te verzekeren
↓
Afhankelijk v/d gebruikte C-bron
↑
↑
Verhogen rendement melkzuur door
↑
- additie van oplosbare org. Stikstofverb. (aminozuren, peptiden, nooit NH4+ zouten)
- moutextracten
- C.S.L. = Corn Steep Liquor (maïsweekwater)
* Groeifactoren  vitamine B2,PB, pantoteenzuur, …
* groeisnelheid afhankelijk van vitamineconc. in medium
* vetzuren  stimuleren de groei
66
* fosfaten en mineralen  stimuleert de melkzuurproductie
2.3.3 zuurstof
Zijn anaëroob  O2 overbodig
2.3.4 zuurtegraad
* Controle pH  van groot belang (5,5 – 6)
↓
Geproduceerd melkzuur remt groei van bacterie zelf
↓
Neutralisatie van gevormde melkzuur nodig tijdens fermentatie door carbonaten
* pH < 4,5  fermentatie volledig geremd
* pos. ionen vormen zouten v/h melkzuur  pH ↑
2.3.5 Fermentatieduur en rendement
Rendement = 85 à 90%
2.4 Bereiding van melkzuurbacterie
2.4.1 inleiding
* groot belang  zuiverheid v/d grondstoffen kennen
↓
Mais, aardappelen, rijst, …
↓
Moeten gehydrolyseerd worden
* vb v/d mouthydrolyse
1) hydrolysekuip  voorzien van - roerder
↓
- verwarmings -en koelelement
- Half gevuld met water
- verwarmd tot 45°c
2) inbrengen - 3 liter melkzuur
- 20 kg fijn gemalen groenmout
- al roerend aardappelzetmeel toevoegen
3) - geheel 30 min verwarmen tot 70 à 75 °C
- geheel koelen tot 56°C
- groenmout toevoegen
- mengsel 1°C / h verhoogd (4 à 5 u)
4) - inactivatie van enzymen door temp (80°C)
- het gehydrolyseerde wort wordt verdund tot maltoseconc. van 10 à 11 %
* uit lactose van melk
↓

melkzuur vormen
67
Kan als grondstof gebruikt worden
Rijk aan veel zouten  afscheiding = omslachtig
* riet en bietmelassen  melkzuur bekomen
* uit sulfietloog  melkzuur vormen
↓
door fermentatie van melkzuur door Lactobacillus pentosus
2.4.2 Inoculum (entingmateriaal)
* grote hoeveelheden enten  vergisting vlug en gemakkelijk gebeuren
Inoculumbereiding
* slentcultuur  gesuspendeerd in maltextract
↓
- 25 uur incuberen bij 45°C
- cultuur controleren op zuiverheid
* cultuur overenten op 100 ml voedingsopl. + CaCO3 (neutralisatie van melkzuur, werkt
inhiberend op bacteriën)
* incuberen bij 50°C, 2 dagen
* overenten in
1) kolf met 1 - 2 liter VB
2) kolf met 4 liter VB
3) tank met 20 – 50 liter VB
4) tank met 1000 – 2000 l VB
* hiermee fermentatietank enten
 bereiding is verschillend naargelang het gebruikt substraat en het soort M.O.
2.4.3 melkzuurproces
2.4.3.1 melkzuurgisting uit zetmeel door discontinu proces: Lactobascillus delbrückii proces
* conc. koolhydraten = beperkt (hoge conc niet gewenst)
↓
CaCO3 wordt toegevoegd voor neutralisatie = slecht oplosbaar
* bovenaan fermentatietank zijn koel en warmwaterleidingen aan binnenwand bevestigd
* fermenterende massa  door roerwerk bewogen
* pH cte houden door CaCO3 (5,5 a 6,0)
* trage agitatie  nodig om niet opgelost CaCO3 in suspensie te houden
* begin fermentatie  waargenomen door vorming van CO2 en warmte
↓
Gering  verwarming nodig (50°C)
* tijdens fermentatie, controles van
- pH
- microbiele infecties
- temp
- CO2 vorming
- suikerconc.
*einde gisting  afhankelijk van de suikerconc. (2 – 4 dagen)
↓
68
Moet kleiner zijn dan 0,1 % om snelle recovery te bekomen
Zichtbaar door het ophouden van CO2 productie
* Opbrengst = 93 tot 95% op basis van glucose
Zuivering v/h melkzuur
-
-
fermentatievloeistof wordt met H2SO4 behandelt zodat CaSO4 neerslaat
na filtreren wordt filtraat onder zwak vacuüm ingedampt
azijnzuur en
propionzuur verdwijnen
eliminatie van storende factoren:
o kleurstoffen verwijderd door actieve koolstof
o overgebleven zouten worden geëlimineerd door ionenuitwisseling
o onaangename reuk- en smaakstoffen verdwijnen na behandeling met
KMnO4 of H2O2
netto-resultaat: na indamping 80% geconcentreerd en gezuiverd melkzuur
bekomen
2.4.3.2 melkzuurvergisting uit melk door het discontinu proces: Lactobacillus bulgaris proces
* substraat = volle of afgeroomde melk
↓
Uit melk vooral caseïne met HCl of melkzuur neergeslagen
* Inoculum bereiding = vorige
* kleinere fermentatietanks of vorige
↓
Heeft speciale voorzieningen
- stoomleiding onderaan  Eerst: medium opwarmen
Later: lactalbuminen coaguleren hierdoor
- roerwerk en automatische temp. regelaar
- beweegbare decanteerbuis
* fermentatie duurt ongeveer 42u, bij 43°C
* om de 6 uur wordt Ca(OH)2 toegevoegd  pH cte houden
Na eigenlijke fermentatie volgt de nabehandeling:
-
groenachtige fermentatievloeistof wordt door stoom verhit tot 96°
coagulatie
van de lactalbuminen optreedt en M.O. afsterven
bovenstaande vloeistof is calciumlactaat aanwezig
decanteerbuis
heldere vloeistof afgelaten en gefiltreerd
gefiltreerde fermentatiemengsel
actieve koolstof of kiezelgühr gezuiverd
wordt geconcentreerd in vacuümverdamper
Ca-lactaat bij 10-15° gedurende 10 à 12h uitkristalliseren
2.4.3.3 melkzuurgisting in een continu proces
69
Apparatuur: vergistingstank
- temperatuurregeling (43°),
- roerwerk
- aansluiting voor de legertank met melk en Ca(OH)2
Vergistingstank  gevuld met gepasteuriseerde melk
inoculum  start vergisting bij 43°
* heeft geen stoomleiding  beesten sterven niet af !
* Lactoseconc. < 1%  opnieuw melk en Ca(OH)2 toevoegen
 op zelfde moment: gelijke hoeveelheid gefermenteerde vl afgevoerd
* in legertank  verdere bewerkingen uitvoeren
2.5 eigenschappen en toepassingen van melkzuur
Melkzuur is
- stroperige,
- kleurloze tot lichtgele vl
- Heeft typische zure smaak
- Sterk corrosief
- zwak zuur, is α-hydroxypropionzuur
FeCl3
groenblauwe α-hydroxyzuren
- Goed oplosbaar in water, alcohol en ether, niet in chloroform
Melkzuur bezit een asymmetrisch C-atoom:
D(-) vorm
L(+) vorm
LD racemaat
COOH
|
H – C – OH
|
CH3
COOH
|
HO – C – H
|
CH3
D – isomeer
L – isomeer
* vorming van optisch actief en racemisch melkzuur  kan twee wegen volgen
pyrodruivenzuur
D – melkzuurdehydrogenase
D – melkzuur
L - melkzuurdehydrogenase
L (+) melkzuur
70
D (-) en L (+) melkzuur
-
dierlijke cellen
L(+) melkzuur voor omdat enkel L-melkzuurdehydrogenase
aanwezig is
- opname van D(-) of DL kan leiden tot aanrijking van D(-) melkzuur in bloed
hyperaciditeit van de urine
- limiet bedraagt 100 mg per kg per dag
- Streptococcus spp. produceren L(+) melkzuur
- Meeste M.O. produceren DL
Toepassingen:
-
voedingsindustrie: gebruikt als additief voor verduurzaming van levensmiddelen
(softdrinks, fruitsappen, jam, siropen, …)
acidificatie van fruitwijnenen en zure degen
leerlooierij: weken en ontkalken
textielindustrie: kleur en drukproces
plasticindustrie
cosmetica
gefermenteerde voeding: olijven, zuurdesem, kaas, …
farmaceutische producten
bij behandeling anemie
3.2 bakkersgist
3.2.1 inleiding
Klasse
Orde
Familie
Subfamilie
Genus
Species
Ascomycotina
Endomycetales
Saccharomycetaceae
Saccharomycoïdeae
Saccharomyces
Saccharomyces cerevisiae
* Bakkersgist  in broodbereiding 4 voudige betekenis
1. verhoogt het deegvolume door gasproductie tijdens de fermentatie van de suikers uit
de bloem
2. ontwikkelt bepaalde textuur en structuur van de deeg door expansie teweeggebracht
door gasproductie
3. verwekt een kenmerkende geur en smaak
4. verhoogt voedende waarde van het brood
* vergistbaar deel v/d bloem
1. tarwebloem, samengesteld uit
- koolhydraten
- enzymen
- eiwitten
- vetten
2. gist  kan koolhydraten uit bloem opnemen (2% v/d D.S)
↓
1ste helft: direct opgenomen en verbruikt
2de helft: onder invloed v/d α- en β- amylasen gehydrolyseert
↓
71
Hierdoor: zetmeel omgezet tot - fermenteerbare maltosen
- niet fermenteerbare dextrinenen
* Duur deegfermentatie  bepaald door de temp
↓
Vroeger: 25°C  langdurige fermentatie
Heden 35°C  hogere productieresultaat
3.2.2 Voedingsvereisten van bakkersgist
* Medium met goede C-bron  gistcellen goed ontwikkelen
↓
Versneld door medium aan te rijken met supplementen
3.2.2.1 koolstofvoeding
* eenvoudige hexosesuikers = energie en voedingsbron (bv glucose)
* aërobe omstandigheden  meer C-verb. bruikbaar dan onder anaërobe omstandigheden
↓
- alcoholen
- zuren
- acetaldehyde
- AZ
* industriële productie bakkersgist  riet en bietmelassen gebruikt
- bevatten ± gelijke hoeveelheden
- reducerende suikers
- niacine
- kalium
- pyridoxine
- sporenelementen
- inositol
- bietmelasse  5 maal meer org. N-verb. (± 50% is betaïne  niet bruikbaar)
- aanrijking met fosfaten
- soms toevoeging (biotine, Mg)
* melassen bevatten soms inhibitoren
- SO2  gebruikt in suikerindustrie
- hydroxymethylfurfural  tengevolge van oververhitting of bewaring
↓
In anaërobe omstandigheden conc kleiner dan aërobe omstandigheden
- kaliumimidodisulfonaat  gevormd tijdens suikerfabricatie uit bieten
↓
Nitrieten: ontstaan door bacteriële activiteiten
Reageren met toegevoegde sulfieten  vormen kaliumcomplex
- azijnzuur metaboliseerbaar door gist (conc < 0,75%, geen probleem)
Hogere conc  inhiberend
3.2.2.2 stikstofvoeding
* Gist assimileert N-verb.
* anorganische ammoniumzouten = belangrijkste N-bron
72
* AZ worden ook verbruikt
↓
Enkel L-vormen, uitz: glu en asp  D-vorm
Goede N-bronnen
- Mengsel van AZ in graanwort (beste)
- Glutaminezuur
- Asparagine
- Allemaal hoger dan ammoniumfosfaat
- Asparaginezuur
* Stickland-reactie  reactie tss 2 AZ waarbij ene waterstofacceptor is en andere
waterstofdonor is.
↓
P 35
* bij assimilatie van AZ door gist kunnen 4 reacties optreden
1) Deaminatie
H NH2
\ /
C
/ \
R COOH
+ NAD+
+ H2O
R
|
C=O
|
COOH
+ NADH
+ H+ + NH3
 ketozuur
2) Decarboxylatie
H NH2
\ /
C
/ \
R COOH
H NH2
\ /
C
+ CO2
/ \
R H  amine
3) Reductie
H NH2
\ /
C
/ \
R COOH
H NH2
\ /
C
/ \
R CH2OH
4) onveranderde assimilatie met directe ombouw tot eiwitten
/
* Eenvoudige peptiden en amiden  omgezet tot NH3
* org. N-verb.  ook omgezet
Totale N in de cel  grote invloed op fermentatieve activiteit
3.2.2.3 minerale voeding
73
* Majorelementen: P, S, K, Na, Mg
* Minorelementen: Zn, Fe, Cu
* mineralen dienen als activator voor enzymen of als stabilisator voor eiwitten
3.2.2.4 groeifactoren
* basis van melasse
* synthetisch medium
Corn steep liquor
groeifactoren toegevoegd:
nicotinezuur, inositol, thiamine,
biotine, pyridoxine.
3.2.2.5 zuurstofvoorziening
Goede aeratie
maximale groei van gistcultuur en efficiënt verbruik van substaat te
bekomen: gram zuurstof / gram gist
3.2.2.6 temperatuur
* Temp is niet kritisch: tss 20 en 40°
* Industrie: 25 en 35°
* Lager groeitemperatuur hoe
↓
grote efficiëntie van de conversie van het substraat tot celmateriaal
door lagere energiebehoeften
* Temp > 35°
- rendementsverlies
- betere stabiliteit van de gist
↓
Te wijten aan Ca behoefte van de gist
Ca beschermt enzymen
tegen denaturatie
3.2.2.7 zuurtegraad
* Tss 3,5 en 7,0
* Industrieel: 3,5 en 4,5
↓
bacteriën in hun groei geremd
* Bij pH < 5
donker gekleurde gesuspendeerde
↓
bestanddelen uit de melasse geadsorbeerd door celwand van de gist
3.2.2.8 gistconcentratie
* Goede gist
groeien tot 50 gram droge stof per liter VB
* conc > 150 gram  niet bereikt
74
↓
anders remming
* men spreekt van densiteits-afhankelijke inhibitie:
- veel warmteproductie
- intense zuurstof- en voedingsbehoeften
- hoge concentratie aan niet-geassimileerde stoffen
- hoge concentratie aan gesecreteerde stoffen
3.2.3 doel van de gistproductie
- maximale hoeveelheid gist
- zo weinig mogelijk niet-leefbare cellen
- zo weinig mogelijk vreemde M.O.
- de best mogelijke gistingscapaciteit vertonen
- maximaal rendement
3.2.4 toediening van antischuimmiddelen
* Schuimvorming = inhiberend
* antischuimiddel:
- dierlijk of plantaardige vetten
- hogere een of tweewaardige alcoholen
- sulfonaten van paraffinen
- siliconen gesuspendeerd in ether of trichloorethyleen
* opstijgende schuim
↓
Komt in contact met elektrische draad
↓
antischuimmidel in dunne film over fermenterende vloeistof gespoten
↓
schuimdaling
↓
contact wordt verbroken
↓
sproeiing wordt gestopt
3.2.5 rijping van de gist
* einde kweekproces  stopzetting voedingsstoffen, aeratie gaat nog 30 tot 60 minuten voort
↓
niet-verbruikte voedingsstoffen worden geassimileerd
↓
Knopvormende cellen delen en rijpen  gistkwaliteit verhoogt.
3.2.6 nabehandeling
3.2.6.1 centrifugeren v/d gistsuspensie
75
afsluiten van kweekfase
gistsuspensie geconcentreerd worden
na wassen
opnieuw centrifugeren
gistcrème
centrifugatie
3.2.6.2 koeling en opslag
In tanks
3.2.6.3 filtreren
Filtratie
doek of persfilter of door roterende vacuümfilters
Als Filtratie doorheen roterende vacuümfilters
plastisch, zacht product
kan
Mautner-proces worden toegepast
toevoegen van 0,2 tot 0,6% NaCl
veroorzaakt
een inkrimping van de cellen door osmose.
Overmaat zout wordt verwijdert doorwater te sproeien over gistlaag
enkele seconden
volgende minuten
osmotisch evenwicht wordt hersteld
gist zwelt op door
opname van extracellulair water
resultaat: vast product
3.2.6.4 Machinaal kneden, verpakken en opslag:
Na verwijdering van de filters
gist gekneed en verpakt
stockage bij temp onder de
10°
omzetting van opgeslagen suikers in de cel te voorkomen waardoor teveel warmte
zou vrijkomen
Lokalen waar gist wordt bewaart
voorkomen
UV-licht om schimmel en bacteriële infecties te
76