TENTAMEN BIOCHEMIE

Naam:
1
2
3
4
5
6
Studentnummer:
Opleiding:……..
EINDTOETS Biochemie (8RA00) en TENTAMEN Biochemie (8S135)
Prof. Dr. Ir. L. Brunsveld
15-08-2014 09:00 – 12:00 (totaal 100 punten, plus max. 5 extra voor bonus)
6 opgaven in totaal + 1 bonusvraag! (aangegeven tijd is indicatie)
Gebruik geen rode pen! Geef uw antwoorden direct op dit tentamen. In principe
volstaat de gegeven ruimte; gebruik indien nodig de achterkant van de specifieke
opgave. Schrijf naam en studentnummer bovenaan iedere pagina!
In rood zijn de antwoorden aangegeven. N.B. voor sommige vragen zijn ook
andere antwoorden mogelijk / goed.
1
Peptiden en eiwitten
(~25 minuten; 20 punten)
B
Tot
a. Beschouw bovenstaand peptide. Geef de 1-lettercode van de aminozuren in dit, ietwat
cynische, peptide in de corresponderende volgorde. (4P)
VAKANTIE
b. Alle L aminozuren hebben een S absolute configuratie, behalve L-cysteine. Legt u uit
(eventueel met een tekening) waarom L-cysteine de R absolute configuratie heeft. (2P)
De functionele zijketen van alle andere aminozuren heeft een
lagere prioriteit dan de amine en carbonzuur groep op het alfakoolstof. Bij cysteine heeft deze groep een hogere prioriteit dan de
carbonzuur groep en daardoor wordt de absolute configuratie R
ipv S.
c. Laat met behulp van een tekening van een chemische structuur
het vouwpatroon en de waterstofbruggen zien een anti-parallele beta-sheet. (4P)
Naam:
Studentnummer:
Opleiding:……..
d. Het enzym protein disulfide isomerase (PDI) katalyseert uitwisselingsreactie tussen
disulfidebruggen (RSSR) en sulfhydril-groepen (RSH). PDI zet inactief gevouwen
ribonuclease snel om in actief ribonuclease. In tegenstelling, als actief insuline wordt
behandeld met PDI wordt het snel inactief. Wat kunt u uit deze observaties afleiden over
de relatie tussen de aminozuursequenties van beide eiwitten en hun 3-dimensionale
structuur. (4P)
Ribonuclease bevat blijkbaar alle informatie over hoe te vouwen / over zijn 3dimensionale structuur in zijn eigen aminozuursequentie. Insuline bevat deze informatie
niet voor zichzelf en heeft dus nog andere informatie nodig (gehad) om correct te kunnen
vouwen. (Via pro-insuline gebeurt dit).
e. Eiwitten kunnen heel gemakkelijk en goed op grootte gescheiden en geanalyseerd
worden met behulp van SDS-gelelectroforese. Waarom is deze techniek echter niet
geschikt als (procesmatige) zuiveringstap voor eiwitten? (2P)
SDS-gelectroforese is een analytische techniek, die niet alleen slecht kleine
hoeveelheden eiwit kan verwerken, maar belangrijker via denaturatie van de te
analyseren eiwitten werkt (middels SDS, thiol, en temperatuur). De eiwitten zijn na de
scheiding dus niet meer functioneel.
f.Collageen is een eiwit dat vouwt in een zogenaamde triple helix. De niet-natuurlijke
peptidesequentie poly-(Gly-Pro-Pro)n kan ook een triple helix vormen. Is deze triple helix
stabieler of minder stabiel als natuurlijk collageen? Waarom? (4P)
Natuurlijk collageen wordt verder gestabiliseerd door waterstofbruggen tussen de
geoxideerde zijstaarten van de prolines (hydroxyprolines) (en ook die van lysine). De
hydroxygroepen vormen waterstofbruggen met elkaar en cross-linken op die manier de
drie keten in de triple helix met elkaar. Het synthetische GPPn heeft deze modificaties
niet en daardoor zijn de interacties in de triple helix zwakker.
Naam:
Studentnummer:
Opleiding:……..
2
Enzymactiviteit
(~30 minuten; 20 punten)
a. Maak met behulp van een of meerdere tekeningen en een korte ondersteunende
tekstuele uitleg duidelijk hoe de activatiestrategie van een aspartyl protease functioneert
(met andere woorden hoe zorgt een aspartyl protease ervoor dat water en het substraat
efficiënt met elkaar reageren). Teken hierbij de aminozuren van de actieve site (en
natuurlijk het substraat en water) en laat hierdoor duidelijk zien wat hun rol is. (6P)
Plus uitleg
Naam:
Studentnummer:
Opleiding:……..
b. De enzymen trypsine en subtilisine zijn convergent geëvolueerd tot serine proteasen.
Legt u uit wat dat betekent. Gaat u daarbij in op de conceptuele overeenkomsten en
verschillen tussen trypsine en subtilisine. (4P)
Overeenkomst: Dit betekent dat beide enzymen eenzelfde functie hebben, serine
protease. In dit geval zelfs nog specifieker en namelijk dat beide enzymen deze
functie uitvoeren middels een gelijke katalytische triade baserend op een serine as
nucleofiel. Hierbij is de katalytische triade opdezelfde manier geordend in het enzym
(niet noodzakelijk voor antwoord).
Verschillen: Deze enzymen zijn ontstaan uit verschillende startpunten (genen). De
resulterende 3D structuur van de eiwitten, welke de katalytische site omringt, is
compleet verschillend. De structuur is dus verschillend. De functie gelijk.
On the side: trypsine en subtilisine verschillen ook in de substraat selectieviteit. Dit
heeft met de S-pockets van doen. Is echter niet direct gerelateerd aan het type
evolutie. (Dus ook geen onderdeel van het essentiële antwoord hier).
c. De hiernaast afgebeelde verbinding is een inhibitor voor het
enzym trypsine. Legt u uit waarom. Gaat u daarbij in op de
moleculaire interacties van deze inhibitor met de verschillende
pockets van het enzym. (4P)
Deze inhibitor heeft twee zeer karakteristieke elementen waarmee
de interactie met het trypsine wordt aangegaan.
1. De basische zijstaart bindt in de S1 pocket van trypsine (welke
normaal een lysine of arginine bindt). De zijstaart is een mimic van lysine.
2. De boorzuuramide groep is een overgangstoestand mimic en bind aan het oxyanion
gat. (het negatief geladen zuurstofatoom mimicked het oxyanion van een normaal
peptide substraat).
Naam:
Opleiding:……..
Studentnummer:
d. U voert een enzymatische reactie uit bij verschillende substraatconcentraties in
aanwezigheid van een vaste concentratie non-competitieve inhibitor en meet daarbij de
initiële snelheid van substraatomzetting (zie tabel). Bereken/bepaal KM en Vmax voor dit
enzym in aanwezigheid van de inhibitor (bijv. middels een Lineweaver-Burk plot). (4P)
Substraatconcentratie [S] (mM)
Initiële snelheid (V0) (M/minuut)
0.5
0.65
1
1
2
1.4
4
1.8
8
2
2.0
1.8
1/V0 (min./M)
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
Zonder Inhibitor
0.4
0.2
0.0
-1.0
-0.5
0.0
-0.2
0.5 1/[S] (mM
1.0 -1)
1.5
2.0
2.5
Km = 1.33 mM
Vmax = 2.4 M/min
e. U voert bovenstaand experiment nogmaals uit, maar dan zonder non-competitieve
inhibitor. Teken hoe het verloop van de lijn in de dubbel-reciproke plot verandert t.o.v.
het experiment met de non-competitieve inhibitor. (2P)
Zonder non-competitieve inhibitor is de Vmax hoger (en de y-as afsnede dus lager) en
verandert de Km niet.
Naam:
Studentnummer:
Opleiding:……..
3
Membranen en hun eiwitten
(~20 minuten; 15 punten)
a. Multiple choice. Slechts 1 antwoord is correct. (5P)
I Membranen bestaan voornamelijk uit:
A) Lipiden
B) Eiwitten
C) Collageen
D) A en B
E) A, B, en C
D
II Welke van de volgende membranen is het meest fluïde (vloeibaar)?
A) Een bilaag gevormd door lipiden met meervoudig onverzadigde C18 vetzuren
B) Een bilaag gevormd door lipiden met verzadigde C18 vetzuren
C) Een bilaag gevormd door lipiden met verzadigde C16 vetzuren
D) Een bilaag gevormd door lipiden met meervoudig onverzadigde C16 vetzuren
D
III Welke van de volgende stellingen is juist
A) Alle membraaneiwitten zijn integraal en associëren met het hydrofobe gedeelte van
het membraan.
B) Zowel membraaneiwitten als lipiden ondergaan transverse diffusie (flip-flop).
C) Membraanlipiden zelf-assembleren om de lipide bilaag te vormen.
D) Celmembranen zijn symmetrisch.
C
IV Welke van de volgende stellingen is niet correct met betrekking tot ABC domeinen?
A) Ze ondergaan een conformatie verandering door ATP binding.
B) De ATP-bindingsdomeinen worden ook wel ATP-binding cassettes genoemd.
C) Ze transfereren een fosfaat groep naar een geconserveerde threonine.
C
V Als een kaliumion door een ionkanaal gaat zijn de geassocieerde watermoleculen
A) eraf gehaald.
B) nog steeds gebonden.
C) anders gepositioneerd.
D) gereageerd met CO2.
A
Naam:
Studentnummer:
Opleiding:……..
b. Verklaar (eventueel met behulp van een tekening) waarom de onverzadigde dubbele
bindingen in vetzuurstaarten van phospholipiden bijna altijd cis-dubbele bindingen zijn.
Betrek in uw antwoord de functie van de dubbele bindingen (4P).
Trans-dubbele bindingen hebben ongeveer dezelfde lineaire conformatie als een
verzadigde alkylstaart en zullen daarmee weinig invloed hebben op de eigenschappen
van een membraan (en daarmee relatief nutteloos). Cis-dubbele bindingen hebben een
gekinkte/gebogen conformatie welke de pakking van de vetzuurstaarten in het
membraan verstoord en daarmee de fluïditeit van het membraan controleert.
c. Bepaalde membraaneiwitten (pompen) zorgen voor het transport van toxische stoffen
uit de cel, zoals Multidrug-Resistance Proteins. Deze eiwitten bevatten zogenaamde
ABC domeinen (ATP Binding Cassette). Maak met behulp van een aantal schematische
stapsgewijze tekeningen duidelijk hoe Multidrug-Resistance Protein functioneren. (6P)
Ongeveer zoals onderstaand.
Naam:
Studentnummer:
Opleiding:……..
4
Over DNA
(~20 minuten; 20 punten)
a. Teken de moleculaire structuur van een Watson-Crick DNA basenpaar (GC of AT) naar
keuze. U hoeft niet de suikergroep te tekenen, maar geeft u wel aan waar de betaglycosidische binding naar de deoxyribose zich aan de base bevindt en teken ook het
waterstofbrugpatroon tussen de basen. (6P)
b. Leg (met behulp van het antwoord op bovenstaande vraag) uit welke deel van het
basenpaar de major-groove vormt en welk deel de minor-groove in de dubbelhelix
van B-DNA. (2P)
Zie boven
c. DNA replicatie kan eenvoudig in een reageerbuis in een biochemisch lab gedaan
worden met behulp van de zogenaamde polymerase chain reaction (PCR). Welke
moleculaire componenten (reagentia, katalysator, etc.) heeft u naast het templaat DNA
nodig om deze reactie te laten verlopen. Wees specifiek in uw antwoord. (4P)
dATP, dGTP, dCTP en TTP
twee primers
DNA polymerase
(Mg2+)
Naam:
Studentnummer:
Opleiding:……..
d. De Polymerase Chain Reaction (PCR) is een reactieprotocol wat cyclisch
doorgevoerd wordt bij een aantal verschillende temperaturen. Beschrijf elke
temperatuurstap, geef aan wat er bij iedere temperatuur gebeurt, waarom hiervoor deze
specifieke temperatuur nodig is en in welke volgorde de verschillende
temperatuurstappen worden doorlopen. (4P)
Verwarm tot 95 graden om alle dubbelstrengs DNA te smelten (de twee strengen van
elkaar af te halen). Dit gebeurt bij hoge temperatuur zodat alles uit elkaar gaat.
Bij 55 graden wordt geequilibreert om de korte primers te laten binden aan het templaat
DNA. Deze temperatuur ligt dus onder het smeltpunt van de primers met het templaat.
Bij de optimale temperatuur voor de DNA polymerase, ca 72 graden, wordt de
templaatreactie gestart, primers worden verlengd.
Proces wordt vervolgens herhaald volgens 95  55  72  95.
e. U wilt het DNA tussen de twee hieronder getoonde sequenties amplificeren met
behulp van PCR. Kies uit de lijst van acht primers, welke u hiervoor nodig heeft. (4P)
3’-GCGATATGCG-----------------------ATATGCGATAT-5’
5’-CGCTATACGC-----------------------TATACGCTATA-3’
------------------- = de lange tussenliggende DNA sequentie
1)
2)
3)
4)
5’-GCGATATGCG-3’
5’-ATATGCGATAT-3’
5’-CGCTATACGC-3’
5’-ATATCGCATAT-3’
3 en 6
5)
6)
7)
8)
5’-GCGATATCGC-3’
5’-TATAGCGTATA-3’
5’-TATA-3’
5’-ATAT-3’
Naam:
Studentnummer:
Opleiding:……..
5
Van DNA naar RNA
(~15 minuten; 10 punten)
a. U wilt alle mRNAs uit een cel-lysaat isoleren. Suggereer een scheidingstechniek om
mRNA te kunnen scheiden van de andere typen RNA die voorkomen in een
eukaryotische cel. Legt u in uw antwoord deze scheidingstechniek kort uit. (5P)
mRNA onderscheidt zich van andere typen RNA doordat alle mRNA een lange 3’ poly A
sequentie hebben. Deze poly A sequentie kan specifiek hybridiseren aan een poly T /
poly dT sequentie, iets wat de andere RNAs niet kunnen. We immobiliseren dus een poly
T sequentie op een vaste drager (polymere beads bijvoorbeeld) en incuberen ons RNA
hiermee. Wegwassen van de niet gebonden RNAs en elutie (bijvoorbeeld door
verandering van temperatuur of pH/zout concentratie) geeft de mRNAs.
b. Hoe kunnen uit een en hetzelfde gen toch verschillende eiwitten ontstaan? Geef aan
welk principe hiervoor verantwoordelijk is en beschrijf kort hoe dit principe functioneert.
(5P)
Door alternatief splicen / alternative splicing.
Eukaryotische genen zijn opgebouwd uit intronen en exonen. De intronen worden
verwijderd uit het mRNA (middels splicen) en alleen de exonen die coderen voor het
uiteindelijke eiwit blijven over. Dit proces heet mRNA splicing.
In het splicing proces worden echter niet per definitie alle exonen meegenomen naar het
uiteindelijke mRNA. Afhankelijk van de cel (aanwezigheid splicing factoren), kan het
mRNA uit verschillende exonen zijn opgebouwd en dientengevolge voor verschillende
eiwitten coderen.
Naam:
Studentnummer:
Opleiding:……..
6
Van RNA naar eiwit
(~20 minuten; 15 punten)
Van een stukje dubbelstrengs prokaryotisch
DNA is de volgende sequentie bekend voor
de templaat streng.
5’-CCGGATGTTTCACCTATAGAC-3’
a. Geef de sequentie van het
overeenkomstige mRNA als dit
dubbelstrengs DNA met een RNA
polymerase wordt uitgelezen. Geeft u hierbij
ook de uiteindposities aan (5’ / 3’). (2P)
3’-GGCCUACAAAGUGGAUAUCUG-5’
of
5’-GUCUAUAGGUGAAACAUCCGG-3’
b. Het zo ontstane mRNA wordt vervolgens uitgelezen met behulp van het ribosoom.
Welke aminozuursequentie komt overeen met deze nucleïnezuursequentie (de eerste
drie basen vormen een triplet codon)? Geef hierbij ook de -NH2 en -COOH uiteinden van
de aminozuursequentie aan. (2P)
H2N-Val-Tyr-Arg-COOH
c. Bij de translatie van mRNA naar eiwit wordt het triplet codon op het mRNA herkend
door het beladen tRNA. Hierbij is er verschil in de sterkte van binding / selectiviteit tussen
de 1e, 2e, en 3e positie op het codon. (Bepaalde posities zijn stringenter in hun herkenning
dan andere posities). Welke positie is uws inziens het minst selectief / belangrijk voor de
herkenning. Verklaar uw mening. (3P)
Dit is waarschijnlijk de 3e positie. De tripletcodons voor hetzelfde aminozuur verschillen
vaak alleen op de 3e positie. Dit is een indicatie dat de 3e posities minder selectief is,
omdat een eventuele foute herkenning van de 3 e positie nog steeds leidt tot het inbouwen
van het juiste aminozuur of een aminozuur met gelijke eigenschappen.
Naam:
Studentnummer:
Opleiding:……..
d. De Elongatie Factor Tu (EF-Tu) bindt aan de aminoacyl-tRNA (tRNA beladen met een
aminozuur) en escorteert deze naar het ribosoom. Wat zijn de twee belangrijkste functies
van EF-Tu in dit proces. (4P)
EF-Tu bindt aan beladen tRNA en voorkomt daarmee een vroegtijdige hydrolyse van de
amino acyl binding
De combinatie van de EF-Tu met de beladen tRNA maakt een correcte herkenning door
het ribosoom mogelijk en alleen indien daaraan voldaan is laat de EF-TU het tRNA los
onder hydrolyse van GTP.
e. Transfer RNAs (tRNAs) zijn noodzakelijk voor de eiwitsynthese. Noem twee
verschillende biomoleculen welke in de cel kunnen binden /een interactie aan gaan met
tRNA moleculen en geef van ieder van deze componenten kort aan hoe ze aan tRNA
binden en wat hun rol is. (4P)
Bijvoorbeeld:
tRNA synthetase: herkent de specifieke tRNA en belaadt deze met een aminozuur
EF-Tu: bindt aan beladen tRNA, voorkomt vroegtijdige hydrolyse van de amino acyl
binding en transporteert de tRNA naar het ribosoom (alwaar deze het tRNA loslaat onder
hydrolyse van GTP).
Ribosoom: bindt aan tRNA in drie verschillende toestanden en zorgt voor de
overdracht van de groeiende peptideketen op een tRNA.
Bonusvraag
(~1 minuut; max. 5 punten extra)
Voor de structuur- en functieopheldering van welke eiwitmachine werd in 2009 de
Nobelprijs voor de Scheikunde toegekend?
Ribosoom