Ewart de Bruijn

Automatisering van NGS processen
Ewart de Bruijn
Hubrecht Institute
Wie zijn we
• De Cuppen groep op het Hubrecht Instituut
• De Cuppen groep houdt zich bezig met het ontdekken en in kaart brengen
van de variaties die in DNA zitten. Vervolgens worden deze onderzocht
• Genetisch onderzoek wordt gedreven door technologie. Er wordt continue in
nieuwe technologie geïnvesteerd om het onderzoek optimaal te faciliteren
en unieke mogelijkheden te creëren
Sinds 2000
www.hubrecht.eu
Vanaf 2014
Wat is NGS
• NGS is een afkorting voor Next Generation Sequencing (Nieuwe
Generatie Sequencing)
• Sequencing staat voor het aflezen van de volgorde van DNA
bouwstenen
• De bewezen standaard methode voor sequencing is Sanger
sequencing (1977)
• Sinds 2005 zijn er nieuwe technieken (NGS) op de markt gekomen
die sneller en goedkoper sequencen
• 2012 wordt het jaar waarbij het gehele DNA van een mens (3 miljard
DNA letters) binnen 24 uur gesequenced kan worden voor minder
dan 1000 euro (aan chemicalien)
• Dit levert per individu enige miljoenen DNA verschillen op
Wat is de potentie van NGS
Veel ziektes en ziektegevoeligheden hebben een genetische basis
Door middel van DNA sequencing kunnen deze defecten opgespoord
worden
Hierdoor is het mogelijk om gericht een klinische behandeling of
preventie op de patient af te stemmen
Theoretisch is het potentieel dus groot, maar van veel variatie in ons
erfelijk materiaal weten we nog niet goed wat het doet of wat voor
consequenties het heeft
Het onderzoek in de Cuppen groep richt zich op het systematisch
begrijpen van DNA verschillen in ons erfelijk materiaal
Het lab proces van NGS 1
1)
2)
3)
4)
Isoleren van het gDNA
Opwerken van het DNA
Prepareren van een flowchip
Laden en runnen van het apparaat
2
3
4
?
Waarom automatiseren
Het opwerken van je DNA sample is een bewerkelijke procedure
waarbij details de kwaliteit bepalen van de daaruit vloeiende data en
conclusies. Eisen die gesteld worden aan dit opwerkingsprocess:
•Hoge kwaliteit
•Repetitief
Manueel onmogelijk
•Robuust
•Goedkoop
•Flexibel/veelzijdig
Automatisering van deze procedure is dus gewenst en moet aan deze
eisen voldoen. Doordat je gebruik gaat maken van een robot komen er
aanvullende behoeftes bij:
•Mogelijkheden tot integratie (andere) hardware en LIMS
•Service en support voor doorontwikkeling
•Langdurige verbintenis
•Kosten efficient
Huidige samenwerking
Doel
Het ontwikkelen van nieuwe geautomatiseerde toepassingen NGS
experimenten
Bijdrage’s
Beckman Coulter stelt apparatuur beschikbaar en levert product en
applicatie support
Life technologies geeft toegang tot de laatste ontwikkelingen d.m.v.
protocollen en reagentia
Hubrecht Instituut levert intellectuele input van NGS en voert de
daadwerkelijke experimenten uit
Wat is er bereikt
Standaard DNA opwerken voor NGS werkt en wordt nog steeds
doorontwikkeld
•Voldoet aan alle eerder genoemde eisen
•Nieuwe protocollen
•Nieuwe modules
•Toevoegen van meer toepassingen
Het opwerken van DNA voor Sanger sequencen
•Bestaande bewezen technieken en
in house protocollen werken op de biomek
Beckman Coulter Biomek FXp
Standaard methode NGS
Standaard methode van het opwerken van DNA voor NGS
Shear
DNA
End repair
Adapter
Nick translation
ligation
Amplification
AMPURE XP
Quantification
Size selection
normalization
Layout Biomek FXP
Standaard methode van het opwerken van DNA voor NGS
Resultaten
Standaard methode van het opwerken van DNA voor NGS
Wat willen we nog doen
Bestaande toepassingen doorontwikkelen
•Volledig interventieloos/overnacht
•Flexibiliteit binnen 1 applicatie/programma
– starthoeveelheid DNA
– subprocessen optioneel maken
Meerdere toepassingen automatiseren
•RNA sample preparatie
•Sample preparatie protocol voor het ontdekken van structurele
variaties in DNA
•Verrijking voor specifieke gebieden in het DNA
Met dank aan
Raymond van den Bergh
Vincent Veenbergen