CAT: Flowcytometische immunofenotypering van
advertisement
CAT: Flowcytometrische immunofenotypering op lymfeklierbiopsies/-aspiraten apr. Dries Coenen 12 december 2006 Het lymfatisch systeem = systeem van lymfevaten, lymfeklieren en extranodaal lymfatisch weefsel lymfeklieren = boonvormige orgaantjes (+/- 2 cm³) gelegen langs het verloop van de lymfevaten filteren van de lymfe opname van antigenen (bacteriën, virussen, …) door macrofagen macrofagen presenteren de antigenen aan lymfocyten = activatie van het immuunsysteem Lymfeklieren Lymfoproliferatieve aandoeningen = grote groep van neoplastische aandoeningen van het lymfatisch systeem (klonale proliferatie van lymfoïde cellen) lymfadenopathie = zwelling van een lymfeklier oorzaken meestal reactief (inflammatoire reactie) soms lymfoproliferatieve aandoening Lymfoproliferatieve aandoeningen lymfoom = neoplastisch proces gelokaliseerd in de lymfeklieren of in extanodaal lymfatisch weefsel (vb. MALT) lymfoom ↔ leukemie dezelfde ziekte met verschillende klinische presentatie (SLL / B-CLL) Hodgkin lymfomen ↔ non-Hodgkin lymfomen (NHL) op basis van de aanwezigheid van Reed-Sternbergcellen Classificatiesystemen verleden: Rappaport classification Kiel classification Working Formulation REAL classification heden: WHO classification (2001) WHO-classificatie van lymfoproliferatieve aandoeningen klinisch-pathologische entiteiten gedefinieerd op basis van: kliniek morfologie immunofenotype cytogenetische en moleculaire data → multidisciplinaire aanpak vereist classificatie B-cell neoplasms T- and NK-cell neoplasms Hodgkin’s lymphoma Proposed WHO Classification of Lymphoid Neoplasms (2001) B-NHL vallen onder de mature B-cell neoplasms 85% van de NHL meest voorkomende types zijn: diffuus grootcellig B-cel lymfoom folliculair lymfoom MALT lymfoom CLL/SLL mantelcellymfoom 30.6% 22.1% 7.6% 6.7% 6.0% T-NHL vallen onder mature T-cell neoplasms 12% van de NHL meest voorkomende types: perifeer T-cel lymfoom (niet gespecifieerd) anaplastisch grootcellig lymfoom meer frequent in Azië (virus HTLV-1) 7.0% 2.4% Lymfeklieronderzoek ikv lymfoproliferatieve aandoeningen staalname van een lymfeklier of extranodaal lymfatisch weefsel via chirurgische biopsie via punctie (vb. fijne naald aspiratie (FNA)) FNA versus chirurgische biopsie voordeel: minder invasieve procedure nadeel: verlies van weefselarchitectuur → geen informatie over patroon van tumorgroei onderzoeken histologie / cytologie immunofenotypering cytogenetica / moleculaire diagnostiek Wat is immunofenotypering? = aantonen van expressie van cellulaire antigenen (CD-antigenen) hoe? met behulp van monoklonale antilichamen gelabeld met een enzym of fluorochroom 2 technieken: immunohistochemie (IHC) simultane beoordeling celmorfologie en antigenexpressie met een lichtmicroscoop uitgevoerd door de anatomopatholoog flowcytometrische immunofenotypering (FCI) meting van fluorescentie-intensiteit op een celpopulatie met een flowcytometer Immunofenotypering bij lymfoproliferatieve aandoeningen bepalen van de cellijn van een abnormale lymfoïde populatie (B of T) CD19 - CD20 - CD22 → B-cel CD2 - CD3 - CD5 - CD7 → T-cel aantonen van monoklonaliteit B-cel: IgKappa of IgLambda lichte ketenrestrictie T-cel: overexpressie van bepaalde V-beta familie bepalen of monoklonale celpopulatie een specifiek immunofenotype heeft geassocieerd met een bepaald type lymfoproliferatieve aandoening (classificatie) Principe FCI incubatie met monoklonale antilichamen gelabeld met een fluorochroom cel per cel hydrodynamisch gefocusseerd doorheen één of meer laserstralen meten van lichtverstrooiing en fluorescentie-intensiteit per cel forward scatter ~ celgrootte side scatter ~ granulariteit fluorescentieintensiteit ~ antigenexpressie meerdere antigenen aantoonbaar per cel gebruik van verschillende antilichamen met verschillende fluorochromen met andere fluorescentie-emissie golflengte cellen weergegeven als puntenwolk in histogrammen Principe FCI celdifferentiatie op basis van ligging op: CD45-SCC histogram SCC-FSC histogram R2 R1 R3 R4 100 101 102 SSC-Height 103 104 0 200 400 600 FSC-Height 800 1000 ‘gating’ van relevante celcluster en onderzoeken op expressie van antigenen Flowcytometrie in LAG 4-kleuren flowcytometrie in het kader van diagnose/classificatie/MRD van een lymfoproliferatieve aandoening uitgevoerd op: perifeer bloed beenmergaspiraat niet op lymfeklierweefsel Critically Appraised Topic Wat is de waarde van FCI op lymfeklierweefsel bij de diagnose en classificatie van lymfomen volgens de literatuur? Wat zijn de voordelen/nadelen van FCI in vergelijking met IHC? Vereisten voor flowcytometrie op lymfeklierweefsel suspensie van afzonderlijke intacte cellen celsuspensie perifeer bloed / beenmergaspiraat / FNA reeds celsuspensies lymfeklierweefsel bekomen via chirurgische biopsie eerst celsuspensie bereiden door mechanische of enzymatische desaggregatie en filtratie intacte cellen vers staal binnen < 24h analyseren Referentiewaarden in lymfeklieren omwille van ethische redenen weinig gegevens beschikbaar primaire follikels → secundaire follikels oiv antigenstimulus B-lymfocyten in het germinaal centrum van secundaire follikels → exprimeren zwak CD10 B-lymfocyten in mantelzone (1/3) van de follikel → exprimeren CD5 Lymfeklier Referentiewaarden in lymfeklieren Bagglatia et al. vergelijking lymfocytenpopulaties in lymfeklieren en perifeer bloed bij 22 patiënten (4 patiënten met een goedaardige aandoening en 18 vrouwen met gynaecologische tumor in vroeg stadium) T-cellen B-cellen NK-cellen Analytische performantie van FCI geen gegevens beschikbaar voor FCI op lymfeklierweefsel analytische sensitiviteit Sánchez et al. studie op PB en BM stalen met 4-kleuren flowcytometer 1 aberrante cel op 104 à 105 cellen Diagnostische performantie van FCI op lymfeklierbiopsies 3 grotere relevante studies Ravoet C, Demartin S, Gerard R, Dehon M, Peny MO, Petit B, Delannoy A, Husson B. Contribution of flow cytometry to the diagnosis of malignant and non malignant conditions in lymph node biopsies. Leuk Lymphoma. 2004 Aug;45(8):1587-93. Martinez A, Aymerich M, Castillo M, Colomer D, Bellosillo B, Campo E, Villamor N. Routine use of immunophenotype by flow cytometry in tissues with suspected hematological malignancies. Cytometry B Clin Cytom. 2003 Nov;56(1):8-15. Dunphy CH. Contribution of flow cytometric immunophenotyping to the evaluation of tissues with suspected lymphoma? Cytometry. 2000 Oct 15;42(5):296-306. Ravoet et al. Hospital of Jolimont, Haine-Saint-Paul, Belgium retrospectieve studie van 118 consecutieve lymfeklierbiopsies 4-kleuren FCI 116 geschikte stalen panels voor detectie van B-, T-, RS-, en epitheliale cellen Ravoet et al. Ravoet et al. overeenkomst FCI – histologie in 88% (102/116) classificatie B-NHL 77% (23/30) correct geclassificeerd Hodgkin lymfoom diagnose op basis van aanwezigheid van cellen met Reed-Sternberg fenotype (CD45-/CD15+/CD30+) 6/15 diagnose zeer waarschijnlijk (> 1 op 104 cellen) 6/15 diagnose waarschijnlijk (> 1 op 105 cellen) echter niet specifiek criterium Martinez et al. Hospital Clinic, University of Barcelona, Spain 422 consecutieve biopsies 3-kleuren FCI 377 geschikte stalen Martinez et al. voor NHL sensitiviteit = 90% specificiteit = 100% ppv = 79% npv = 100% voor Hodgkin lymfoom sensitiviteit = 0% goede overeenkomst morfologie/IHC en FCI behalve voor Hodgkin lymfomen Martinez et al. Ig-lichte ketenexpressie analyse 91 gevallen zowel IHC als FCI interpretatie mogelijk IHC: 42% (38/91) FCI: 100% (91/91) wel goede overeenkomst tussen IHC en FCI Martinez et al. classificatie B-NHL CLL en MCL: goed FL: matig Dunphy St. Louis University Health Sciences Center, Missouri, USA retrospectieve studie van 373 biopsiestalen met data van histologie/IHC en 2-kleuren FCI Dunphy 198 = # histology/IHC FCI 161 B-cell lymphoma monoclonal or aberrant B-cell population 16 T-cell lymphoma aberrant or common thymocytic Tcell population 21 B-/T-NHL negative for lymphoma 26 Hodgkin lymphoma negative for lymphoma 128 benign negative for lymphoma 13 nonhematopoietic malignancy negative for lymphoma 4 nonlymphomatous hematopoietic malignancy negative for lymphoma and nonlymphomatous hematopoietic malignancy by other flow markers 2 composite lymphoma or composite malignancy aberrant T-cell or monoclonal Bcell population 2 posttransplantation lymphoproliferative disorder negative Dunphy voor NHL sensitiviteit = 89% specificiteit = 100% voor Hodgkin lymfoom sensitiviteit = 0% Diagnostische performantie van FCI op fijne naald aspiraten talrijke studies onderzochten de bijdrage van FCI voor de diagnose en classificatie van lymfomen op fijne naald aspiraten combinatie cytologie/FCI op FNA meestal vergeleken met histologie meeste studies concentreren zich op mogelijkheid van FCI om NHL te diagnosticeren en te classificeren diagnose van NHL in +/- 75-95% mogelijk met combinatie cytologie/FCI classificatie in +/- 70-80% van de positieve gevallen mogelijk Oorzaken van vals negatieve FCI sampling error: onvoldoende of niet representatieve staalname partiële lymfoominvasie weefselsclerose fragiliteit van sommige lymfoomcellen afwezigheid van sIgκ of sIgλ geen CD45 expressie lage aantallen maligne cellen op een reactieve achtergrond FCI en diffuus grootcellige B-cel lymfomen 30% van de NHL heterogene groep zonder specifiek immunofenotype vaker vals negatieve FCI (+/- 25%) vaker weefselsclerose fragiele natuur van deze lymfoomcellen vaker afwezigheid van Ig-lichte ketenrestrictie FCI en Hodgkin lymfomen 15% van alle lymfomen Reed-Sternbergcellen omgeven door vele inflammatoire lymfocyten (CD4/CD8verhouding ↑, echter weinig specifiek) fragiele natuur fibreus weefsel → moeilijke cellulaire dispersie geen consensus over antigenprofiel (CD15+/CD30+?) → detecteren/diagnosticeren van een Hodgkin lymfoom is onmogelijk met FCI Besluit diagnostische performantie indien monoklonale populatie aantoonbaar met FCI → lymfoproliferatieve aandoening aanwezig indien negatief FCI resultaat → maligniteit kan niet uitgesloten worden histologie/cytologie blijft zeker nodig! Voordelen FCI tov IHC simultane detectie van meerdere antigenen (meerkleuren FCI) kortere TAT (analyseduur 3 uur, elke weekdag) kwantitatieve resultaten waardoor interpretatie minder subjectief detectie van lagere aantallen maligne cellen uitgebreider aanbod monoclonale antilichamen superieur voor aantonen sIgκ/sIgλ mogelijk op kleinere hoeveelheid staal Nadelen FCI tov IHC geen visuele correlatie tussen morfologie en antigenexpressie verlies van patroon van tumorgroei ingeval van biopsiemateriaal vers staal nodig Diagnostische impact WHO-diagnose nooit gesteld op basis van één type diagnostisch onderzoek integratie van deeldiagnoses tot een volledige diagnose (multidisciplinaire aanpak) Aantonen van monoclonale populatie met FCI kan belangrijk argument zijn in de diagnosestelling Indien definitieve diagnose reeds mogelijk met histologisch onderzoek is FCI slechts van beperkte waarde Therapeutische impact Wat is de impact op behandeling? FCI kan bijdragen in diagnosestelling en classificatie en zo therapie initiëren therapiekeuze afhankelijk van type lymfoom en stadium Kan behandeling optimaler toegediend worden? FCI bruikbaar voor aantonen targetantigen van sommige therapieën (CD20 – rituximab) Health outcome indien definitieve diagnose mogelijk op een FNA kunnen meer invasieve investigaties vermeden worden vooral interessant ingeval van recidief Werd test opgenomen in guidelines? British Committee for Standards in Haematology (BCSH) guideline “Diagnosis and therapy for nodal non-Hodgkin’s lymphoma” (2002) eerst PB (cytologie en FCI) om CLL of ALL uit te sluiten lymfeklierweefsel via excisiebiopsie, FNA afgeraden immunofenotypering met flowcytometrie of immunohistochemie US-Canadian Consensus Recommendations on immunophenotypic analysis (1997) immunofenotypering op lymfeklierbiopsies met FCI of IHC FCI superieur omwille van lagere detectielimiet, objectiviteit en snelheid FCI niet geschikt voor Hodgkin lymfomen FNA afgeraden Kost impact Reële productiekost consumables = 10.18 € x aantal gebruikte antilichamen task unit & labor = 6.14 € overhead = 1.77 € totale kost per FCI met 10 antilichamen = 109.71 € RIZIV-nomenclatuur klinische biologie nummer 555730-555741(B500) en nummer 556474-556485 (B400) voor identificatie van antigenen (max. 13) van hematopoïetische cellen in bloed APO nummer 588070-588081 voor immunohistochemische onderzoeken (max.4) voor het aantonen van antigenen in coupes geen RIZIV-nomenclatuur voor FCI op lymfeklierweefsel Decision making impact van de FCI op lymfeklierweefsel op het beslissingsproces van de clinicus en patiëntenmanagement? aantonen van monoclonale populatie in lymfeklier kan doorslaggevend argument vormen in de definitieve diagnose Is er voldoende interesse vanuit de kliniek? prof. G. Verhoef en dr. A. Janssens (hematologen) hebben interesse FNA als ‘eerste screening’ bij een nieuwe patiënt (niet voor definitieve diagnosestelling) in geval van recidief kan FNA wel prof. C. Peeters (anatomopatholoog) is bereid om ons een deel van de lymfeklier ter beschikking te stellen indien voldoende materiaal Wat doen andere centra? AZ Sint-Jan Brugge OLV Aalst Virga Jesse Hasselt UZ Gent Erasmus Rotterdam voeren FCI uit op lymfeklierweefsel FCI op lymfeklierweefsel invoeren? argumenten pro de voordelen van FCI tov IHC combinatie van verschillende testen kan leiden tot betere diagnostische accuraatheid: FCI op lymfeklierweefsel als bijkomend argument argumenten contra de nadelen van FCI tov IHC relatief veel vals negatieve FCI geen RIZIV-terugbetaling voor FCI op klierweefsel mogelijk lage testfrequentie FNA geen algemeen aanvaarde diagnostische techniek To Do / Actions Al dan niet invoeren van FCI op lymfeklierweefsel (FNA en/of biopsie) in overleg met hematologen / anatomopathologen Indien we beslissen de test in te voeren valideren van de analyse opstellen van een SOP aanvragen RIZIV terugbetaling organiseren overleg tussen hematologen / klinisch biologen / anatomopathologen om elkaars bevindingen met elkaar te correleren
