De rol van ECT2L in normale en maligne T
advertisement
De rol van ECT2L in normale en maligne T-cel ontwikkeling Maaike VAN TRIMPONT Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen Promotor: Prof. Dr. Pieter Van Vlierberghe Begeleider: Dr. Filip Matthijssens Vakgroep Pediatrie en genetica Academiejaar 2015-2016 De rol van ECT2L in normale en maligne T-cel ontwikkeling Maaike VAN TRIMPONT Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen Promotor: Prof. Dr. Pieter Van Vlierberghe Begeleider: Dr. Filip Matthijssens Vakgroep Pediatrie en genetica Academiejaar 2015-2016 “De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef.” 9 mei 2016 Maaike Van Trimpont Pieter Van Vlierberghe VOORWOORD “I have not failed. I’ve successfully discovered 10000 things that won’t work” zei Thomas Edison ooit. Wetenschap gaat inderdaad niet alleen om het uitvinden van dingen, maar ook om het ontdekken waarom sommige dingen niet werken. Hoewel het uitvoeren van deze masterproef niet altijd van een leien dakje ging, kan ik toch zeggen dat ik oprecht trots ben op het eindresultaat. Zes jaar geleden had ik nooit verwacht om hier te staan met alle kennis die ik nu heb. Mijn ouders hebben hierin een grote rol gespeeld en ik zou hen dan ook graag bedanken voor de kans die ze mij gegeven hebben om te studeren. Ook mijn vriend mag ik niet vergeten te bedanken om mij steeds te steunen tijdens alle hectische dagen. In het bijzonder wens ik mijn promotor Prof. Dr. Pieter Van Vlierberghe te bedanken, die dankzij zijn grote deskundigheid binnen het vakgebied een grote bijdrage leverde aan de kwaliteit van deze masterproef. Ik zou ook graag Filip Matthijssens bedanken voor de tijd en energie die hij in dit project heeft geïnvesteerd om mij een goede begeleiding te geven, steeds te antwoorden op mijn vragen en praktische hulp te geven. Ik wil Pieter en Filip eveneens bedanken voor de goede adviezen en suggesties voor deze masterproef. Gedurende dit jaar heb ik zeer veel bijgeleerd. De persoon die hierin een grote rol heeft gespeeld is Bea, dus bij deze een hele dikke merci aan Bea! Dankzij jou heb ik nu heel wat technieken onder de knie. Ik zal je tips and tricks, uitmuntende zangkunsten en humor in het labo nooit vergeten en ik zal hier steeds met een lach aan terugdenken. Een andere persoon die ik hiervoor moet bedanken is Lindy. Ook bij jou kon ik steeds met vragen of bedenkingen terecht. Dan rest mij nog Renate te bedanken om mij een middagje te vergezellen naar de faculteit van de bioingenieurs. Ook mijn lieve medestudenten Nienke en Nathalie mag ik niet vergeten. Zonder Nienke was ik ongetwijfeld nog steeds bezig met de paginanummering in Word en grafieken in Excel. Nathalie zorgde dan weer voor een komische noot met haar opmerkingen en we konden steeds met elkaar lachen, zelfs wanneer we onze masterproef weer wat minder zagen zitten. Ik zal de herinneringen aan de lange dagen in het labo met ons drietjes zeker koesteren. Ook de leuke sfeer en andere studenten in ons veel te kleine studentenlokaaltje zal ik nooit vergeten! i INHOUDSOPGAVE Voorwoord ............................................................................................................................................... i Inhoudsopgave......................................................................................................................................... ii Afkortingenlijst ....................................................................................................................................... v Samenvatting ........................................................................................................................................... 1 Summary ................................................................................................................................................. 2 1. Inleiding........................................................................................................................................... 3 1.1 Leukemie ................................................................................................................................. 3 1.1.1 Definitie en enkele cijfers................................................................................................ 3 1.1.2 Classificatie leukemie ...................................................................................................... 3 1.1.3 Normale en maligne hematopoëse................................................................................... 4 1.1.4 Normale en maligne T-cel ontwikkeling ......................................................................... 5 1.1.5 Early T-cell precursor acute lymphoblastic leukemia ..................................................... 7 1.1.6 ECT2L mutaties en leukemie........................................................................................... 7 Epithelial cell transforming 2 oncogene-like .......................................................................... 8 1.2 1.2.1 ECT2L gen ....................................................................................................................... 8 1.2.2 Domeinen ........................................................................................................................ 9 1.2.3 Functie ........................................................................................................................... 10 1.2.4 Orthologen en modelorganismen .................................................................................. 11 1.2.5 Expressie ....................................................................................................................... 12 1.3 2. 3. ECT2L in andere kankers ...................................................................................................... 14 Materiaal en Methoden .................................................................................................................. 16 2.1 Conditioneel knockout muismodel ........................................................................................ 16 2.2 Collecteren muisweefsels ...................................................................................................... 18 2.3 RNA isolatie .......................................................................................................................... 18 2.4 cDNA synthese ...................................................................................................................... 18 2.5 qPCR ..................................................................................................................................... 18 2.6 Cellyse ................................................................................................................................... 19 2.7 Meten van eiwitconcentraties ................................................................................................ 19 2.8 Western blot analyse ............................................................................................................. 19 2.9 Transfectie van cellen ............................................................................................................ 19 Resultaten ...................................................................................................................................... 21 ii 3.1 Expressie in T-ALL cellijnen ................................................................................................ 21 3.1.1 Visualisatie van het ECT2L eiwit in T-ALL cellijnen met Western blot ...................... 21 3.1.2 ECT2L expressie analyse met qPCR in T-ALL cellijnen .............................................. 22 3.1.3 Visualisatie van het ECT2L eiwit in T-ALL cellijnen via Western blot analyse met het Aviva Biology Systems antilichaam ............................................................................................. 23 3.2 Expressie in humane weefsels ............................................................................................... 23 ECT2L expressie analyse met qPCR in humane weefsels ............................................. 23 3.2.1 3.3 Expressie in muisweefsels ..................................................................................................... 24 3.3.1 Visualisatie van het Ect2l eiwit in muisweefsels en MOLT-4 met Western blot .......... 24 3.3.2 Ect2l expressie analyse met qPCR op selectie van muisweefsels ................................. 26 3.3.3 Visualisatie van het ECT2L eiwit in muisweefsels via Western blot analyse met het Aviva Biology Systems antilichaam ............................................................................................. 26 ECT2L expressie in longkanker cellijnen .............................................................................. 27 3.4 3.4.1 ECT2L expressie analyse met qPCR in longkanker cellijnen ....................................... 27 3.4.2 ECT2L expressie analyse met qPCR in longkanker cellijnen met nieuwe primers ....... 29 3.5 Cellulaire lokalisatie van het ECT2L eiwit ........................................................................... 30 3.5.1 Visualisatie van ECT2L-GFP en ECT2L-3xFLAG getransfecteerde HEK293TN cellen ... 30 3.5.2 Validatie van de ECT2L-GFP en ECT2L-3xFLAG transfectie met qPCR ................... 32 3.5.3 Validatie van de ECT2L-GFP transfectie met Western blot analyse ............................ 34 Conditioneel Ect2l knockout muismodel ............................................................................... 35 3.6 3.6.1 Conditioneel Ect2l knockout muismodel ....................................................................... 35 3.6.2 Ect2l full knockout muismodel ...................................................................................... 39 Valideren full knockout muismodel ....................................................................................... 40 3.7 3.7.1 4. Genexpressie analyse met qPCR ................................................................................... 40 Bespreking ..................................................................................................................................... 40 4.1 Expressie in humane weefsels ............................................................................................... 41 4.2 ECT2L expressie in T-cellen gedurende verschillende fasen van de T-cel ontwikkeling ..... 41 4.3 Expressie in T-ALL cellijnen ................................................................................................ 41 4.4 Focus op longkanker cellijnen ............................................................................................... 43 4.5 Cellulaire lokalisatie .............................................................................................................. 44 4.6 Expressie in muisweefsels ..................................................................................................... 45 4.7 Conditioneel Ect2l knockout muismodel ............................................................................... 46 5. Conclusie ....................................................................................................................................... 48 6. Referenties ..................................................................................................................................... 49 iii Bijlagen .................................................................................................................................................... I Bijlage 1: Genotyperen Ect2l muizen: DNA isolatie (quick dirty prep) en PCR ................................. I Bijlage 2: Protocol oogsten van cellen uit muisweefsels .................................................................. III Bijlage 3: Protocol RNA isolatie ....................................................................................................... VI Bijlage 4: Protocol cDNA synthese.................................................................................................. VII Bijlage 5: Protocol qPCR ............................................................................................................... VIII Bijlage 6: Protocol cellyse .................................................................................................................. X Bijlage 7: Meten van eiwitconcentraties ........................................................................................... XI Bijlage 8: Western blot analyse ........................................................................................................ XII Bijlage 9: Protocol transfectie van HEK293TN cellen en fixatie op microscoopslides ................ XVII Fixatie op microscoopslides ...................................................................................................... XVII Bijlage 10: LabChip resultaten voor genotypering van Ect2l muizen..........................................XVIII Bijlage 11: ECT2L expressie in T-cellen gedurende verschillende fasen van de T-cel ontwikkeling .................................................................................................................................................... XXVII Bijlage 12: RNA sequentie data ECT2L in T-ALL cellijnen ..................................................... XXVII iv AFKORTINGENLIJ ST °C µl µM 5’UTR ALL ARHGEF32 BCA Bim BLAST bp BSA C6orf91 CCLE CD cDNA CML COSMIC Cppt Cq Cre DAPI DN DNA DNase dNTP ECT2L Ect2l EDTA ETP-ALL ETV6 FBXO49 FBXW7 fl FLIP FlpE FOXO3 FPKM FRT G G6pdH GADPH GATA3 GDP GFP GTP ° Celsius microliter micromolair 5' untranslated region acute lymfoblastische leukemie Ras homologue A guanine nucleotide exchange factor 32 bicinchoninic acid bcl-2 interacting mediator of cell death Basic Local Alignment Search Tool basenparen bovine serum albumin chromosome 6 open reading frame 91 Cancer Cell Line Encyclopedia cluster of differentiation complement deoxyribonucleic acid chronische myeloïde leukemie Catalogue of Somatic Mutations in Cancer central polypurine tract quantitation cycle causes recombination 4',6-diamidino-2-fenylindool double negative deoxyribonucleic acid desoxyribonuclease deoxy nucleoside triphosphate Epithelial cell transforming 2 oncogene-like Epithelial cell transforming 2 oncogene-like ethyleendiaminetetra-azijnzuur early T-cell precursor acute lymphoblastic leukemia Ets variant 6 F-box only 49 F-Box And WD Repeat Domain Containing 7 floxed FLICE-like inhibitory protein the eighth generation flippase Forkhead box O3 Fragments Per Kilobase Of Exon Per Million Fragments Mapped flippase recognition target gravity Glucose-6-phosphate dehydrogenase Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase GATA Binding Protein 3 guanosinedifosfaat Green fluorescent protein guanosinetrifosfaat v Hba Hbb-γ hECT2L HMBS HPRT1 IRES kDa KO LFDH LoxP LTR mA MEF2C mg MHC ml mM MnSOD mRNA MYC NCBI NCI ng nm NOTCH1 NP-40 ORI PBS PCR PFA PGK1 PH PTEN PUMA qPCR Rho GTPasen RhoGEF/DH RIPA RNA RNase RPL13A Rpm RRE RSV RUNX1 RUNX2 SCF SDHA Hemoglobin alpha 2 Hemoglobin beta – gamma humaan ECT2L Hydroxymethylbilane synthase Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 internal ribosome entry site kilodalton knockout Lung-specific F-box and DH domain-containing protein locus of X-over P1 long terminal repeat milliampère Myocyte enhancer factor 2C milligram major histocompatibility complex millilitre millimolair Manganese superoxide dismutase messenger ribonucleic acid Myelocytomatosis viral oncogene National Center for Biotechnology Information National Cancer Institute nanogram nanometer Neurogenic locus notch homolog protein 1 nonyl phenoxypolyethoxylethanol origen of replication phosphatase buffered saline polymerase chain reaction paraformaldehyde phosphoglycerate Kinase 1 pleckstrin homology Phosphatase and tensin homolog p53 upregulated modulator of apoptosis quantitative Polymerase Chain Reaction Ras homologue A guanine nucleotide exchange factor guanosinetriphosphatase Ras homologue A guanine nucleotide exchange factor /Dbl homologous radioimmunoprecipitation assay buffer ribonucleic acid ribonuclease Ribosomal Protein L13a rounds per minute reverse response element rous sarcoma virus Runt-related transcription factor 1 Runt-related transcription factor 2 Skp, Cullin, F-box containing complex succinate dehydrogenase complex flavoprotein subunit A vi SDS SDS-PAGE Skp T-ALL TBP TBS TBST TCR U UBC UZ v Vav-iCre WPRE YWHAZ sodium dodecyl sulfate sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Seventeen Kilodalton Protein T-cel acute lymfoblastische leukemie TATA Box Binding Protein Tris-buffered saline Tris-Buffered Saline and Tween 20 T-cel receptor units ubiquitin C Universitair Ziekenhuis volt Vav Codon-improved Cre recombinase Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element Tyrosine 3-Monooxygenase/Tryptophan 5-Monooxygenase Activation Protein, Zeta vii SAMENVATTING Inleiding: ECT2L codeert voor een eiwit waarvan de functie tot op heden nog onbekend is. In 2012 werd een studie gepubliceerd waarin whole genome sequencing op het DNA van 12 early T-cell precursor acute lymphoblastic leukemia (ETP-ALL) patiënten werd uitgevoerd. Hierbij werden somatische ECT2L mutaties gevonden die recurrent voorkwamen in leukemische cellen van deze ETP-ALL patiënten. Mogelijk veroorzaken deze wijzigingen een daling van ECT2L expressie of een verstoring van de functie van dit eiwit, hetgeen zou kunnen bijdragen tot de maligne transformatie van precursor T-cellen. In deze masterproef zal de rol van ECT2L in normale en maligne T-cel ontwikkeling, evenals de mogelijke functie van ECT2L in andere kankers, onderzocht worden. Materialen en methoden: De expressie van ECT2L wordt in humane weefsels, muisweefsels, T-ALL en longkanker cellijnen nagegaan door middel van qPCR. De aanwezigheid van het ECT2L eiwit in T-ALL cellijnen en muisweefsels wordt gevisualiseerd via Western blot analyse met verschillende antilichamen. De cellulaire lokalisatie van ECT2L in HEK-293TN cellen wordt aangetoond via transiënte transfectie met een ECT2L-GFP vector. Een conditioneel Ect2l knockout muismodel wordt via het Cre-Lox systeem ontwikkeld om de in vivo rol van Ect2l te bestuderen. Resultaten: De expressie van ECT2L is hoog in de long, maar zo goed als onbestaande in de thymus. T-ALL en longkanker cellijnen vertonen eveneens een zeer lage ECT2L expressie. Visualisatie van ECT2L is moeilijk bij gebrek aan een goed antilichaam waardoor de Western blot procedure voor dit eiwit nog verder geoptimaliseerd zal moeten worden. Transfectie van adherente HEK293TN cellen met een ECT2L-GFP vector toont een duidelijke cytoplasmatische lokalisatie van het ECT2L eiwit aan. Een Ect2l conditioneel knockout muismodel kon nog niet worden ontwikkeld maar door germline leakage van Vav-iCre werd onverwacht een full knockout muis gecreërd. De afwezigheid van Ect2l in deze full knockout muis werd gevalideerd in het longweefsel. Conclusie: ECT2L komt zeer laag tot expressie in normale en maligne T-cellen, waardoor de rol van ECT2L als tumorsuppressorgen in de context van T-ALL in vraag kan gesteld worden. De ontwikkeling van een Ect2l knockout muismodel opent echter perspectieven om de rol van Ect2l in normale ontwikkeling en andere tumor entiteiten verder te bestuderen. 1 SUMM ARY Background: ECT2L encodes for a protein with an unknown function. Recently, a whole genome sequencing study in ETP-ALL patients was published and somatic mutations in ECT2L were found. These changes possibly lead to a decrease of ECT2L or an aberrant function of ECT2L leading to the malignant transformation of precursor T-cells. The role of ECT2L in Tcell development, as well as its function in other cancers, will be investigated. Methods: The expression in human and mouse tissues, T-ALL and lung cancer cell lines is checked with qPCR. Western blot is used to check for the presence of ECT2L. The cellular localization of ECT2L is demonstrated with transient ECT2L-GFP transfection of HEK-293TN cells. The Cre-Lox system is used to develop a conditional Ect2l knockout mouse model to investigate the in vivo role. Results: Expression is high in the lungs, but non-existent in the thymus. T-ALL and lung cancer cell lines barely show expression. ECT2L-GFP transfection of HEK293TN cells shows a clear cytoplasmatic localisation of ECT2L. Optimisation of Western blot analysis for ECT2L is necessary. A conditional knockout mouse could not yet be established. Though, due to Vav-iCre germline leakage a full knockout mouse was created with a validated absence of Ect2l in lung tissue. Conclusions: ECT2L has a low expression in normal and malignant T-cells, questioning the role of ECT2L as a tumor suppressor in T-ALL. The development of a Ect2l knockout mouse model opens new possibilities to investigate the function of Ect2l in normal cell development and other tumor entities. 2 1. 1.1 INLEIDING Leukemie 1.1.1 Definitie en enkele cijfers Leukemie, ook wel bloedkanker genoemd, is een verzamelnaam voor verschillende types van kanker die het rijpingsproces van witte bloedcellen of leukocyten verstoren. Hierbij zullen onrijpe witte bloedcellen ongecontroleerd delen waarna ze zich vervolgens opstapelen in het beenmerg. Eveneens zullen deze leukemische cellen de gezonde bloedcellen verdringen en de aanmaak van nieuwe cellen verhinderen [1-2] . Hierdoor zal er een tekort zijn aan rode en witte bloedcellen en zelfs bloedplaatjes waardoor patiënten vaak risico lopen op bloedarmoede, infecties of bloedingen. Indien de leukemische cellen uiteindelijk in de bloedsomloop terecht komen, kunnen ook andere organen naast het bloed worden aangetast zoals de nieren, milt en lever. Patiënten vertonen vaak symptomen zoals de bovengenoemde bloedarmoede, koorts, algemene malaise, een vergrote lever of milt, gezwollen tonsillen en bleekheid [3]. Soms kunnen de leukemische cellen ook het centrale zenuwstelsel infiltreren waardoor symptomen zoals hoofdpijn ontstaan [4-6]. Indien er geen behandeling wordt gestart, zal leukemie bijna zeker leiden tot de dood [3]. De incidentie van leukemie bedraagt wereldwijd 3 per 100000. Leukemie staat hiermee op de 11de plaats van de meest voorkomende kankers. Het is eveneens na lymfoom de tweede meest voorkomende bloedkanker. Doorgaans worden er meer mannen dan vrouwen getroffen. De incidentie van leukemie is sterk gerelateerd aan de leeftijd en is het hoogst in de oudere leeftijdscategorie. Hoewel leukemie het meest bij oudere volwassen wordt vastgesteld, is het toch de meest voorkomende kanker bij kinderen. Ongeveer 30% van alle kankers die vastgesteld worden bij kinderen zijn leukemieën. In 2012 waren er wereldwijd ongeveer 8,2 miljoen doden ten gevolge van kanker en 3,2% hiervan was te wijten aan leukemie [7-9]. 1.1.2 Classificatie leukemie Leukemie wordt ingedeeld op basis van de klinische progressie en de hematologische oorsprong. Op basis van de klinische progressie kan er een onderscheid worden gemaakt tussen een acute en chronische vorm. De acute leukemieën vertonen een zeer snelle proliferatie van immature ongedifferentieerde maligne cellen die blasten worden genoemd. Het gaat hier dus voornamelijk om de snelle opstapeling van immature lymfoblasten. De ziektetekenen zullen 3 zich dan ook op een zeer korte periode manifesteren en de ziekte zal snel verergeren. Acute leukemie moet dan ook onmiddellijk worden behandeld. De chronische vorm daarentegen kent een tragere progressie. Personen met chronische leukemie maken nog steeds genoeg gezonde bloedcellen aan en de ziekte manifesteert zich meer geleidelijk aan. Chronische leukemieën vertonen een tragere accumulatie van mature doch afwijkende leukocyten. Deze vorm van leukemie wordt eerder toevallig vastgesteld omdat de patiënten vaak nog geen symptomen vertonen [3,10]. Leukemie kan ook ingedeeld worden op de plaats van voorkomen of hematologische origine. Indien er problemen zijn met het rijpingsproces van de lymfoblasten tot volwaardige B- of Tlymfocyten, wordt er gesproken van lymfoblastische leukemie. Bij myeloïde leukemie daarentegen ontstaan er problemen in het differentiatieproces van beenmergcellen tot granulocyten waardoor er afwijkende myeloblasten ontstaan [3,10]. Op basis van de hematologische origine en klinische progressie kunnen er vier grote groepen onderscheiden worden. Acute myeloïde leukemie wordt het vaakst bij volwassen gediagnosticeerd, terwijl acute lymfoblastische leukemie de meest voorkomende vorm van bloedkanker bij kinderen is en ook wel childhood leukemia wordt genoemd. Chronische myeloïde leukemie komt voornamelijk bij volwassenen voor en wordt slechts af en toe bij kinderen vastgesteld. Chronische lymfoblastische leukemie komt amper voor bij kinderen, maar wel bij volwassenen vanaf 55 jaar en wordt geassocieerd met een goede overlevingskans [3]. 1.1.3 Normale en maligne hematopoëse Hematopoëse is een zeer complex proces waarbij de hematopoëtische stamcellen naast prolifereren ook differentiëren en bijdragen tot de lymfoïde en myeloïde takken van het hematopoëtische systeem. Een hematopoëtische stamcel is een multipotente cel die in staat is om zichzelf steeds te hernieuwen, maar ook kan differentiëren in een common myeloïd progenitor die zich verder ontwikkelt tot de cellen van de myeloïde lijn of in een common lymphoïd progenitor die verder zal ontwikkelen tot lymfoblasten. Deze lymfoblasten zullen in het beenmerg uitrijpen tot B-lymfocyten of migreren naar de thymus waar ze uitrijpen tot mature T-lymfocyten. Leukemie wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van genetische afwijkingen ter hoogte van deze hematopoëtische stamcel zodat er afwijkende bloedcellen ontstaan. Deze proliferatie van afwijkende bloedcellen gebeurt doordat de mechanismen die instaan voor celproliferatie en differentiatie ontregeld zijn. Door de problemen die ontstaan tijdens het rijpingsproces van de leukocyten kan er een ophoping van onrijpe bloedcellen ontstaan. Deze abnormale witte bloedcellen 4 zijn niet in staat om infecties te bestrijden en zorgen ervoor dat het beenmerg geen normale bloedplaatjes of erythrocyten meer kan aanmaken [11-13]. 1.1.4 Normale en maligne T-cel ontwikkeling De thymus speelt een belangrijke rol in het ontstaan van T-cellen en heeft de unieke eigenschap om binnendringende voorlopercellen uit het beenmerg te ondersteunen in hun ontwikkeling tot mature T-cellen. Indien de thymus afwezig is door een genetisch defect of thymectomie in neonatale muizen, wordt er een gebrek aan perifere T-cellen geobserveerd wat kan leiden tot ernstige immunodeficiëntie. De lymfoïde voorlopercellen, die afkomstig zijn uit een hematopoëtische stamcel, zijn dus sterk afhankelijk van de thymus voor hun differentiatieproces tot T-cellen. De voorlopercellen spenderen in de thymus ongeveer een week tijd aan dit differentiatieproces waarna ze overgaan tot proliferatie. De thymus van een jongvolwassen muis bevat 1 miljard thymocyten en elke dag worden er ongeveer 5 x 107 nieuwe cellen gegenereerd. Hiervan zal ongeveer 2 à 4% de thymus verlaten als mature T-cellen. Hoewel T-cel precursors dus extensief prolifereren, zal het merendeel toch afsterven in de thymus [12]. De lymfoïde voorlopercel migreert vanuit het beenmerg naar de thymus om zich hier te ontwikkelen tot een volwaardige T-cel. Deze T-lymfoblast moet eerst een aantal differentiatiestappen ondergaan vooraleer er gesproken kan worden van een mature T-cel. De progenitorcel ontvangt signalen, waarschijnlijk afkomstig van de stromale cellen in de thymus, die doorgegeven worden door de NOTCH1 receptor zodat specifieke genen worden aangeschakeld. Bij de ontwikkeling tot lymfocyten zal de NOTCH signalisatie ervoor zorgen dat de precursorcel zich eerder ontwikkelt tot een T-lymfocyt dan een B-lymfocyt. NOTCH is gedurende de hele T-cel ontwikkeling zeer belangrijk en helpt de T-lymfoblast enkele keuzes te maken tijdens het ontwikkelingsproces [12-15]. Zeer vroege T-cellen expresseren nog geen T-cel receptor en bevinden zich in een dubbelnegatief stadium. Dit betekent dat ze nog geen CD4 en CD8 receptor hebben op hun celmembraan. Deze dubbelnegatieve thymocyten kunnen worden ingedeeld in 4 subgroepen: DN1, DN2, DN3 en DN4. Thymocyten die stage DN2-DN4 doorlopen, zullen geleidelijk aan een pré T-cel receptor expresseren. T-lymfocyten herkennen antigenen aan de hand van T-cel receptoren. Het humane genoom heeft echter niet genoeg unieke DNA-sequenties om te coderen voor T-cel receptoren die alle vreemde antigenen herkennen waaraan een persoon gedurende zijn hele leven wordt blootgesteld. Om deze beperking te overkomen, zullen T-cel receptorgenen com- 5 plexe DNA-herschikkingen ondergaan om meer dan een biljoen unieke T-cel receptoren te produceren. Succesvolle gen herschikkingen en correcte pré-TCR expressie zal ervoor zorgen dat de T-cel naar een dubbelpositief stadium gaat. Hier zal de pré-TCR worden omgezet tot een complete TCR en zal de cel zowel een CD4 als CD8 receptor expresseren. Vervolgens zullen de thymocyten doorheen een selectieproces worden gestuurd. De dubbelpositieve cellen zullen interageren met MHC klasse I en II moleculen die geassocieerd zijn met self-peptides. Te weinig reactie van de dubbelpositieve thymocyten op de self-peptide MHC liganden zal leiden tot apoptose. Dit proces staat ook wel gekend als death by neglect. Indien er een te sterke reactie is, zal er negatieve selectie optreden waarbij de thymocyt ook overgaat tot apoptose. Het is dus noodzakelijk dat de thymocyt een goede balans vindt tussen te veel en te weinig reactie. Dit proces heet positieve selectie. De dubbelpositieve cellen zullen gered worden van geprogrammeerde celdood en zich verder ontwikkelen tot een mature CD4 of CD8 T-cel [12-15]. Indien er problemen ontstaan tijdens de maturatie van een lymfoïde voorlopercel tot een volwaardige T-cel en er zich op een korte periode heel wat onrijpe T-lymfoblasten opstapelen, is er sprake van T-cel acute lymfoblastische leukemie (T-ALL). Dit is een agressieve hematologische tumor die ontstaat door de maligne transformatie van precursor T-cellen. Deze tumor wordt vaak vastgesteld bij kinderen en adolescenten waar het verantwoordelijk is voor 10-15% van het totale aantal acute lymfoblastische leukemie (ALL) gevallen. Bij volwassenen bedraagt dit percentage 25% [16]. T-cel transformatie is een oncogeen meerstapsproces en komt tot stand uit meerdere coöperatieve gebeurtenissen. De stapsgewijze accumulatie van chromosomale abnormaliteiten en genetische defecten tijdens de differentiatie van immature thymocyten naar T-cellen ligt aan de basis van T-ALL. Er zullen meerdere coöperatieve mechanismen moeten plaatsvinden vooraleer er van kanker kan worden gesproken. Concreet betekent dit dat er meestal twee, drie of meerdere kenmerkende T-ALL mutaties in patiënten moeten optreden vooraleer de patiënt ook effectief T-ALL ontwikkelt [6,10,17]. De genetische abnormaliteiten die in T-ALL voorkomen zijn voornamelijk chromosomale translocaties, deleties, amplificaties, duplicaties en mutaties. T-ALL is een heterogene kanker omdat er zeer veel genen bij betrokken zijn. De genetische defecten in T-ALL kunnen worden opgedeeld in vier verschillende klassen: celcyclus defecten, defecten in proliferatie en overlevingssignalen, defecten die de stamceleigenschappen en T-cel specificatie beïnvloeden en tot slot defecten die leiden tot de ectopische expressie van transcriptiefactoren en een differentiatie- 6 stop. Het volledige genetische spectrum van T-ALL is echter nog niet gekend. Het begrijpen van de T-ALL pathogenese is essentieel voor het ontwikkelen van nieuwe therapeutische compounds. Eveneens zou men prognostische merkers kunnen gebruiken om patiënten met een verhoogd risico op herval op te sporen [6,17]. 1.1.5 Early T-cell precursor acute lymphoblastic leukemia T-ALL kan worden opgedeeld in verschillende subtypes. Recente studies hebben echter nog een bijkomende subgroep geïdentificeerd waarvan het transcriptionele programma gerelateerd is aan immature vroege progenitor T-cellen. Dit subtype, early T-cell precursor acute lymphoblastic leukemia (ETP-ALL), wordt gekenmerkt door T-cellen die zeer vroeg in de T-cel differentiatie stoppen met ontwikkelen. ETP-ALL wordt gekarakteriseerd door een gebrek aan de typische T-cel oppervlaktemerkers CD1a en CD8. Er is eveneens een zwakke of zelfs afwezige expressie van CD5 en een aberrante expressie van myeloïde en hematopoëtische stamcelmerkers. Deze immature T-cellen vertonen een stop in het dubbelnegatief stadium van de T-cel ontwikkeling en behouden het vermogen om te differentiëren in cellen van zowel het myeloïde als het T-cel systeem. ETP-ALL is op zich verantwoordelijk voor 15% van alle T-ALL gevallen. Het zijn voornamelijk deze patiënten die een hoog risico hebben op herval. ETP-ALL wordt gekenmerkt door een abnormale expressie van het MEF2C gen, maar ook door mutaties in acute myeloïde leukemie oncogenen en tumorsuppressorgenen. De inactivatie van belangrijke transcriptiefactoren zoals RUNX1, GATA3 en ETV6 speelt eveneens een rol. In huidig onderzoek ligt de focus vooral op de rol van nieuwe oncogenen, tumorsuppressorgenen en de bijbehorende mechanismen [1, 17-20]. 1.1.6 ECT2L mutaties en leukemie Zhang et al. publiceerden in 2012 een studie waarin het DNA van 12 ETP-ALL patiënten werd onderzocht. Op het DNA van deze leukemiepatiënten werd whole genome sequencing uitgevoerd. Er werden bij twee van deze patiënten somatische missense mutaties in het epithelial cell transforming 2 oncogene-like (ECT2L) gen geobserveerd. Vervolgens werd er gekeken of dit recurrente mutaties zijn in een cohorte van 94 ETP-ALL en non-ETP-ALL patiënten. Op deze manier werden er nog bijkomende nonsense, missense en splice site ECT2L mutaties geidentificeerd. Deze varianten bleken echter niet somatisch te zijn (Figuur 1). De identificatie van zowel somatische als kiembaan ECT2L mutaties in deze leukemie stalen zou erop kunnen wijzen dat het hier om zogenaamde passenger mutaties gaat. Echter, het recurrente karakter van deze afwijkingen zou er anderzijds ook op kunnen wijzen dat een vermindering of verlies 7 van de ECT2L activiteit toch zou kunnen bijdragen tot de ontwikkeling van ETP-ALL [21]. Figuur 1: Recurrente ECT2L mutaties in T-ALL [21]. In de groep van 12 ETP-ALL patiënten werden 2 somatische mutaties geïdentificeerd met behulp van whole genome sequencing. De herhaalbaarheid van deze mutaties in ECT2L werd nagegaan in een cohorte van 94 ETP-ALL en non-ETP-ALL patiënten. Er werden bijkomende germinale mutaties gevonden, bestaande uit missense, nonsense en splice site mutaties die verspreid liggen doorheen het hele gen en niet specifiek zijn voor één domein. De rol van ECT2L als een mogelijk tumorsuppressorgen in leukemie is tot op heden nog niet onderzocht. Nochtans zou dit kunnen leiden tot het beter begrijpen van de pathologie die gepaard gaat met T-ALL. Er kunnen nieuwe drugtargets worden geïdentificeerd waardoor er mogelijk meer specifiek op de kankercellen kan worden gewerkt. De prognose van patiënten die hervallen zou kunnen verbetereren, net als de kans op genezing. Het is dus belangrijk dat de functie van ECT2L in normale en maligne T-cel ontwikkeling wordt opgehelderd. 1.2 Epithelial cell transforming 2 oncogene-like 1.2.1 ECT2L gen Het epithelial cell transforming 2 oncogene-like proteïne wordt gecodeerd door het ECT2L gen dat zich bevindt op de lange arm van chromosoom 6 (6q24.1). Dit gen is gekend onder de alternatieve benamingen ARHGEF32, FBXO49, ECT2-Like, Lung-Specific F-Box And DH Domain-Containing Protein, Putative Guanine Nucleotide Exchange Factor LFDH, F-box Protein 49 en C6orf91 [22]. Er zijn verschillende ECT2L transcripten die ontstaan door alternatieve splicing. Dit mechanisme komt zeer frequent voor bij eukaryoten en draagt bij tot het divers repertoire aan eiwitten dat door het genoom kan worden gecodeerd. Het is een post-transcriptioneel proces dat plaatsvindt net voor de translatie van mRNA naar eiwitten [23] . De twee be- langrijkste splice varianten die ontstaan door dit mechanisme coderen beiden voor een eiwit 8 van 904 aminozuren met een grootte van 104 kDa, maar verschillen op het transcriptniveau door alternatieve splicing ter hoogte van de 5’UTR regio [22,24]. 1.2.2 Domeinen Het ECT2L eiwit bestaat uit zeer sterk geconserveerde domeinen, waaronder een RhoGEF/DHdomein, PH domein en F-box domein (Figuur 2) [25]. Figuur 2: Eiwitdomeinen in ECT2L. ECT2L heeft een grootte van 904 aminozuren en geconserveerde functionele domeinen waaronder een PH, RhoGEF/DH en F-box domein. F-box is een eiwitmotief dat ongeveer 50 aminozuren omvat en functioneert als een plaats voor specifieke eiwit-eiwitinteracties. F-box eiwitten maken deel uit van SCF ubiquitine-ligase complexen (genoemd naar Skp1, Cullin en een F-box proteïne) dat substraten bindt zodat deze vervolgens via ubiquitinatie proteasomale afbraak kunnen ondergaan. Het F-box motief linkt het F-box proteïne aan andere delen van het complex door te binden met de kern van het SCF complex. Elke afwijkende vorm van normale degradatie van tumorsuppressorgenen of oncoproteïnen kan een drijvende kracht zijn achter tumorigenese. F-box proteïnen kunnen bij overexpressie de rol van oncoproteïnen overnemen als hun substraten een kanker onderdrukkende functie hebben. Overexpressie van F-box eiwitten kan er eveneens voor zorgen dat deze functioneren als een tumorsuppressor indien hun substraten een kankerbevorderende functie uitoefenen in de cel [26]. Het DH of RhoGEF domein bestaat uit ongeveer 150 aminozuren en maakt een belangrijk structureel onderdeel uit van guanine exchange factors. Het DH domein wordt meestal voorafgegaan door een PH domein. Deze regio zorgt ervoor dat Rho GTPasen worden geactiveerd doordat GDP wordt uitgewisseld voor GTP. Rho proteïnen spelen een belangrijke rol in genexpressie, signalisatie van groeifactoren en transport over de membraan. Het RhoGEF domein wordt niet alleen in ECT2L maar ook in vele andere proteïnen gevonden die betrokken zijn bij intracellulaire signalisatie of deel uit maken van het cytoskelet [27]. 9 1.2.3 Functie Tot dusver is er slechts weinig bekend over de functie van ECT2L gen. Zoals hierboven beschreven, heeft ECT2L een F-box domein. Een ander gekend eiwit dat eveneens een F-box domein heeft en een rol speelt in bepaalde kankers zoals leukemie is het ubiquitine ligase FBXW7. Loss-of-function mutaties in FBXW7 werden reeds geobserveerd in tal van kankers wat een rol als tumorsuppressor suggereert. FBXW7 is frequent gedeleteerd in tumoren en er wordt geschat dat 6% van alle kankers een mutatie in dit gen dragen. FBXW7 mutaties worden het meest gedetecteerd in T-cel acute lymfoblastische leukemie, maar ook in borst-, darm- en botkanker. Inactiverende mutaties van FBXW7 verhinderen proteasomale degradatie van zijn substraten MYC en NOTCH1. Dit resulteert in een verhoogde activiteit van deze oncogenen. MYC is een doelwit van NOTCH1 en is betrokken bij de celcyclus, celgroei en stimulatie van apoptose. Aangezien ECT2L ook een F-box domein bevat, doet dit vermoeden dat het misschien een belangrijke rol speelt bij de proteasomale degradatie van bepaalde doeleiwitten [26,28]. De ECT2L promotor heeft een voorspelde bindingsplaats voor transcriptiefactoren van de FOXO3 familie. Leden van deze familie worden gekarakteriseerd door de aanwezigheid van een forkhead DNA-bindend domein. Deze proteïnen triggeren mogelijk apoptose door de opregulatie van pro-apoptotische genen zoals Bim en PUMA of neerregulatie van anti-apoptotische genen zoals FLIP. Er wordt gedacht dat sommige leden van de FOXO3 familie betrokken zijn bij het beschermen van de cel tegen oxidatieve stress door het opreguleren van antioxidanten zoals het catalase en MnSOD [22,29]. De aanwezigheid van het RhoGEF domein suggereert ook een rol voor ECT2L als guanine nucleotide exchange factor. Deze factoren activeren GTPasen die op hun beurt een belangrijke rol spelen in bepaalde signaaltransductiepaden. De meest gekende GTPasen behoren tot de Ras superfamilie en zijn betrokken bij essentiële processen zoals celdifferentiatie, proliferatie, vesiculair en nucleair transport. Rho guanine nucleotide exchange factoren schipperen voortdurend tussen een inactieve GDP en actieve GTP gebonden staat. Indien deze RhoGEFs worden geactiveerd, wordt er een fosfaatgroep afgestaan aan een Rho GTPase. Deze stimuleren ter hoogte van het Rho GTPase een uitwisseling van een GDP voor een GTP zodat een actief Rho GTPase wordt gegenereerd dat vervolgens via second messengers aan verdere signaaltransductie kan doen. Een afwijkende activiteit van Rho GTPasen werd reeds gezien in kanker en andere ziekten. De aberrante activatie van Rho GTPasen wordt meestal veroorzaakt door een gedereguleerde expressie of activiteit van RHOGEFs en wordt vaak waargenomen bij kanker [27,30-31]. 10 Tenslotte toonden Choksi et al. aan dat het verlies van ect2l in zebravissen gepaard gaat met het korter worden van beweegbare cilia in nierbuisjes. Er werd eveneens een belangrijke rol voor ect2l aangetoond in het correct functioneren van beweegbare cilia in het zich ontwikkelende oor en Kuppffer’s vesikel [32]. Deze studie is op dit moment de enige publicatie waarin een mogelijke functionele rol voor ect2l naar voren wordt geschoven. 1.2.4 Orthologen en modelorganismen 1.1.4.1 Ortholoog Ect2l Een ortholoog van het ECT2L gen kan teruggevonden worden in de zebravis en de muis. Een gen is ortholoog indien het voorkomt in verschillende soorten en afkomstig is van een gemeenschappelijke voorouder. De muis heeft een gen dat een sterke homologie vertoont met het humane ECT2L [3]. Op de website van het NCBI kan er een BLAST worden uitgevoerd met het muis Ect2l en humaan ECT2L. Op eiwitniveau is het muis Ect2l 78% identiek aan het humane ECT2L. Dit maakt van de muis een goed modelorganisme voor het bestuderen van de in vivo rol van Ect2l [33]. 1.1.4.2 Conditioneel knockout muismodel Een conditioneel knockout muismodel kan ontwikkeld worden door middel van het Cre-Lox systeem. Deze moleculaire techniek is gebaseerd op homologe recombinatie en kan gebruikt worden om deleties in bepaalde delen van het genoom aan te brengen. Het Cre-Lox systeem maakt gebruik van het enzym Cre recombinase dat de recombinatie van DNA tussen specifieke LoxP plaatsen in het DNA katalyseert. De cellen die zowel LoxP (“floxed”) sites bevatten als het Cre recombinase tot expressie brengen, zullen een deletie van het stuk tussen de LoxP sites ondergaan [34] . Voor het ontwikkelen van een Ect2l conditioneel knockout wordt er eerst een targeting construct ontwikkeld, dat bestaat uit een neomycine resistentie cassette geflankeerd door FRT sites ter hoogte van intron 3. In het construct bevinden zich eveneens 2 LoxP sites die exon 3 van Ect2l flankeren. Deze vector wordt via elektroporatie in C57/BL/6J embryonale stamcellen ingebracht. Via homologe recombinatie zal de vectorsequentie ter hoogte van de genlocus van interesse recombineren met zijn homologe sequentie, waardoor de vectorsequentie zich nu in het genomisch DNA ter hoogte van exon 3 van Ect2l bevindt. Dankzij de neomycine resistentie cassette kan er via positieve selectie geselecteerd worden op de cellen die het construct hebben opgenomen. Deze succesvol gemodificeerde embryonale stamcellen werden vervolgens geïnjecteerd in een blastocyst die kan ingebracht worden in een pseudo zwangere muis. Chimere mannelijke nakomelingen worden tenslotte gekruist met Ect2l wild type muizen 11 om kiembaan transmissie te bevestigen. Na de ontwikeling van het model, werden de conditionele knockout muizen gekruisd met een muizen stam die het FlpE recombinase expresseren waardoor de neomycine resistentie cassette gedeleteerd zal worden. Vervolgens kunnen de nakomelingen worden ingekruist met muizen die het Cre recombinase tot expressie brengen in welbepaalde weefsels. In deze studie werd bijvoorbeeld gebruik gemaakt van Vav-iCre muizen die ervoor zorgen dat exon 3 van Ect2l wordt gedeleteerd in de hematopoëtische weefsels waardoor een frameshift mutatie ontstaat en Ect2l expressie verloren gaat (Figuur 3) [35-36]. Figuur 3: Kweekstrategie die wordt toegepast om homozygote conditionele Ect2l KO muizen te bekomen [35]. F1 muizen worden in kweek gebracht met FlpE muizen (A) om heterozygote flox/+ nakomelingen te bekomen (B). Deze F2 nakomelingen worden gekruist om flox/+ en flox/flox te genereren en vervolgens gekruist met muizen die een weefselspecifiek Cre-recombinase tot expressie brengen (C). Er zullen nakomelingen ontstaan die in bepaalde weefsels op 1 of 2 allelen het exon gedeleteerd hebben (D). De +/- muizen worden gekruist met flox/flox of flox/+ muizen zodat homozygote conditionele KO muizen in het weefsel van interesse ontstaan (E). 1.2.5 Expressie 1.2.5.1 Expressie op RNA niveau Publieke expressiedata kan geraadpleegd worden op de Illumina Body Map en het GenotypeTissue Expression project. Deze data werden gegenereerd door next generation RNA sequencing toe te passen op verschillende humane weefsels. Uit deze data blijkt dat de expressie van 12 ECT2L hoog is in de longen, eierstokken, hart en de testis. Er is nagenoeg geen expressie in de thymus en in het beenmerg (Figuur 4) [22]. Figuur 4: ECT2L expressie op RNA niveau in humane weefsels [22]. RNA-sequentie data toont aan dat ECT2L expressie hoog is in de longen, eierstokken, hart en testis. De expressie van ECT2L in de thymus en het beenmerg is echter afwezig. 1.2.5.2 Expressie op eiwitniveau In The Human Protein Atlas kan de expressie van ECT2L in verschillende humane weefsels op eiwitniveau worden bekeken. Uit deze data blijkt dat de bijnieren, cerebellum, cerebrale cortex, duodenum, hartspierweefsel, eierstokken, pancreas, rectum en testis een hoge ECT2L expressie vertonen. De lever, colon, borstweefsel en eileiders hebben daarentegen een gemiddelde ECT2L expressie terwijl de expressie in de long en milt een zeer laag is [37]. 13 1.3 ECT2L in andere kankers Er worden niet alleen ECT2L mutaties in leukemie geobserveerd, maar ook andere kankertypes blijken mutaties in dit gen te dragen. In The Human Protein Atlas kan men analyseren welke kankertypes ECT2L expressie vertonen op eiwitniveau. Dit wordt gedaan aan de hand van immunohistochemische kleuringen met een antilichaam tegen ECT2L. De hoogste ECT2L expressie wordt gezien in baarmoederkanker, hoofd- en nekkanker, huidkanker en teelbalkanker. Er is een gemiddelde expressie in onder andere borstkanker, longkanker en eierstokkanker (Figuur 5) [37]. Figuur 5: ECT2L expressie op eiwitniveau in 20 soorten kanker [37]. Baarmoederkanker, hoofd- en nekkanker, huidkanker en teelbalkanker vertonen de hoogste ECT2L expressie. Ook longkanker, borstkanker en eierstokkanker vertonen een gemiddelde expressie van het ECT2L eiwit. In de COSMIC databank is er een overzicht beschikbaar van somatische mutaties in genen die betrokken zijn bij verschillende soorten kankers. Voor ECT2L werden er veel missense maar ook nonsense en synonieme mutaties geobserveerd in verschillende kanker entiteiten. Er zijn ook enkele inserties en deleties die lijken te leiden tot een frameshift mutatie. Deze mutaties worden waargenomen in verschillende soorten kankers. De mutaties zijn verspreid over het hele gen en kunnen niet teruggekoppeld worden aan een specifiek domein. Dikke darm adenocarcinomen zijn goed voor 21% van het totaal aantal mutaties, huidkanker 15%, longkanker 11%, leverkanker 11% en endometriumkanker bijna 9% [38]. St. Jude Children’s Research Hospital ontwikkelde een applicatie ProteinPaint waarmee kankergenoom data gevisualiseerd en geanalyseerd kan worden. Deze tool omvat informatie over bijna 27500 mutaties van meer dan 1000 pediatrische patiënten met 21 verschillende kankertypes. Analyse van ECT2L in deze dataset toont aan dat de expressie van dit gen hoog is in een bepaalde vorm van hersenkanker, namelijk ependymoom. De top 20 van hoogste ECT2L expressie bestaat uit maar liefst 19 gevallen van ependymoom (Figuur 6). Er kan gespeculeerd worden dat ECT2L mogelijk een belangrijk gen is in hersenkanker, maar concreet bewijs is er niet [39-40]. 14 Figuur 6: ECT2L expressie in pediatrische kankers [39-40]. De expressie van ECT2L wordt uitgedrukt in FPKM waarden. De oranje cirkels geven gevonden ECT2L mutaties in ependymomen weer. De top 20 van hoogste ECT2L expressie wordt ingenomen door dit type van hersentumoren. Uit deze dataset blijkt eveneens dat er ECT2L mutaties in neuroblastoom werden geobserveerd. Neuroblastoom is een tumor van het sympathische zenuwstelsel die hoofdzakelijk bij kinderen wordt vastgesteld. Er werden zowel nonsense als missense mutaties in ECT2L waargenomen in dit type van kanker (Figuur 7). Hoewel het mogelijk is dat ECT2L een rol speelt in neuroblastoom, blijft dit slechts bij speculatie aangezien er ook hier geen concreet bewijs is [39-40]. Figuur 7: ECT2L mutaties in neuroblastoom. Aangepast overgenomen uit ProteinPaint [39-40] . In neuroblastoompatiënten worden ook nonsense en missense mutaties in ECT2L geobserveerd. Deze nonsense mutaties blijken germinale kiembaanmutaties te zijn, terwijl de missense mutatie van somatische origine blijkt te zijn. Deze frequente mutaties in ECT2L, zowel in ETP-ALL als in andere kankers doen een universele rol als tumorsuppressorgen vermoeden. In deze masterproef wordt daarom voor het eerst de rol van ECT2L in ETP-ALL en andere kankers functioneel onderzocht. De expressie van 15 ECT2L in T-ALL en longkanker cellijnen, verschillende humane weefsels en muisweefsels zal worden geanalyseerd. Het gebruik van een genetisch gemodificeerd muismodel is belangrijk om processen die gedreven worden door het verlies van bepaalde tumorsuppressorgenen te karakteriseren. Daarom wordt de in vivo rol van Ect2l nader bestudeerd door een conditioneel Ect2l knockout muismodel te ontwikkelen. De intracellulaire lokalisatie van ECT2L zal eveneens worden nagegaan door het uitvoeren van transfectie experimenten met ECT2L-GFP en ECT2L-3xFLAG vectoren. 2. 2.1 M ATERIAAL EN M ETHODEN Conditioneel knockout muismodel In de onderzoeksgroep van Pieter Van Vlierberghe werd dit project reeds voor de aanvang van deze masterproef opgestart. Ect2l fl/fl (C57BL/6) muizen werden ontwikkeld door Cyagen Biosciences en gehuisvest in het centraal animalarium in blok B van het UZ Gent. In de inleiding werd de kweekstrategie die zal toegepast worden reeds toegelicht. Na het opzetten van kweken worden de nakomelingen gegenotypeerd aan de hand van een PCR op een stukje weefsel uit het oor. Op dit stukje oor wordt een DNA-isolatie uitgevoerd volgens de quick dirty DNA preparation. Het stukje oor wordt in een eppendorf met een 25mM NaOH/0.2 mM EDTA oplossing gebracht en gedurende 1 uur op 98°C in een heat block geplaatst. Vervolgens wordt er 40 mM TrisHCl (pH 5,5) toegevoegd en het geheel wordt gecentrifugeerd. Het supernatans kan overgebracht worden naar nieuwe eppendorfs en moet 1/100 worden verdund. De PCR mastermix wordt aangemaakt met volgende producten uit de KAPA2G Robust PCR kit (Kapa Biosystems): 5x buffer, 25µM MgCl2, 10 mM dNTP mix en Taq (5U/µl). Aan deze mix worden ook nog de gewenste primers en 2 µl van het 1/100 verdund staal toegevoegd. Het geheel wordt aangelengd met water (Sigma-Aldrich) tot een eindvolume van 25µl. Het primerpaar LoxP_F (Cyagen Biosciences) en LoxP_R (Cyagen Biosciences) wordt gebruikt voor de Ect2l genotypering. Deze primercombinatie geeft voor een wild type Ect2l allel een PCR product van 194 bp en voor een floxed Ect2l allel een amplicon van 255 bp. Voor Vav-iCre worden primers gebruikt die aanleiding geven tot een PCR product van 320 bp. De primers voor de FlpE genotypering geven een amplicon van 725 bp. Als interne controle wordt bij de FlpE genotypering een bijkomend primerpaar gebruikt dat resulteert in een amplicon van 324 bp. De voorgenoemde Ect2l primers kunnen enkel een Ect2l floxed of wild type allel aantonen, maar zijn niet in staat om na te gaan of exon 3 gedeleteerd werd door Cre recombinase 16 activiteit. Hiervoor kunnen bijkomend andere primers gebruikt worden die dit wel aantonen. LoxP_F (Cyagen Biosciences) en Control_R (Cyagen Biosciences) geven samen een fragment van 222 bp voor het Ect2l wild type en 283 bp voor een Ect2l floxed allel. Echter, de combinatie van LoxP_F (Cyagen Biosciences) en Neo_Del_R (Cyagen Biosciences) geeft een amplicon van 1341 bp voor een wild type allel en een fragment van 175 bp indien excisie van exon 3 heeft plaatsgevonden (Figuur 8). Een overzicht van de verschillende Ect2l genotypes en amplicongroottes voor mogelijke primercombinaties wordt weergegeven in Tabel 1. Er wordt ook telkens een positieve Ect2l fl/fl VaviCre +/+ en negatieve Ect2l wild type VaviCre tg/+ controle meegenomen. De PCR programma’s en primersequenties kunnen worden teruggevonden in Bijlage 1. Tabel 1: Ect2l genotypes en amplicongroottes voor mogelijke primercombinaties. LoxP_F en LoxP_R LoxP_F en Control_R LoxP_F en Neo_Del_R Ect2l wild type 194 bp 222 bp 1341 bp Ect2l floxed 255 bp 283 bp 175 bp Figuur 8: Het wild type en floxed Ect2l met weergave van de gebruikte primers en hun plaats van binding [35]. Voor een wild type Ect2l muis zal het primerpaar LoxP_F en LoxP_R een fragment van 194 bp geven. Een floxed muis heeft een extra LoxP plaats waardoor LoxP_F en LoxP_R een groter fragment van 255 bp produceren. In aanwezigheid van de neomycine resistentie cassette zal Neo_Del_F2 en Neo_Del_R een amplicon van 434 bp geven, terwijl bij afwezigheid een amplicon van 294 bp ontstaat. Indien exon 3 van Ect2l gedeleteerd werd, zullen LoxP_F en Neo_Del_R een fragment van 175 bp produceren. 17 2.2 Collecteren muisweefsels Wild type en floxed Ect2l muizen worden opgeofferd voor verscheidene experimenten. Er wordt onder andere long-, hart-, trachea-, milt-, thymus en leverweefsel verzameld. Voor de long, het hart en de trachea wordt het weefsel eerst behandeld met 2mg/ml collagenase. Collagenase moet gedurende 1 uur op 37°C opgewarmd worden en vervolgens door een bacteriële filter worden geduwd. Daarna moet het 45 minuten bij 37°C inwerken op het fijngemaakte long-, hart- of tracheaweefsel. De weefsels worden doorheen een zeef gehaald en eventueel behandeld met rode bloedcel lysisbuffer. Vervolgens kunnen er cellen worden verzameld voor Western blot analyse en genexpressie analyse met qPCR (zie Bijlage 2) 2.3 RNA isolatie Cellen worden gelyseerd in 700 µl Trizol (QIAGEN). Voor de RNA extractie wordt de RNeasy Mini Kit van QIAGEN gebruikt. Er wordt chloroform aan de stalen toegevoegd om fasescheiding te bekomen. De bovenste laag bevat het DNA en RNA. Dit volume wordt op RNeasy spin kolommen gebracht zodat het RNA op de kolommen kan binden. Vervolgens wordt het RNA geëlueerd met DNase/RNase vrij water en opgevangen (zie Bijlage 3). 2.4 cDNA synthese Na RNA extractie kan de RNA concentratie gemeten worden (ng/µl) met de Nanodrop 1000 spectrofotometer (Thermo Fisher Scientific). Vervolgens wordt er cDNA gemaakt door middel van de iScript™ cDNA Synthesis Kit en de T100™ Thermalcycler (Bio-Rad). Dit cDNA wordt vervolgens verdund naar 2,5 ng/µl met DNase/RNase vrij water (zie Bijlage 4). 2.5 qPCR QPCR is een moleculaire techniek waarbij de amplificatie van een DNA streng in real time wordt gevolgd. Er wordt gebruik gemaakt van de Sso Advanced SYBR™ green supermix van Bio-Rad. Referentiegenen worden gebruikt voor normalisatie bij verdere analyse met qBase+ (Biogazelle). Voor humane stalen zullen HMBS, TBP, YWHAZ, HPRT1, SDHA en RPL13A worden gebruikt en voor de muis GADPH, UBC, G6pdH, HPRT1, Hbb-γ en Hba. Analyse van de qPCR-reactiemengsels gebeurt met de LightCycler 480 (Roche) in een 384-well plaat (BioRad). Het berekenen van de relatieve expressieniveaus en het bepalen van de meest stabiele referentiegenen gebeurt aan de hand van het softwarepakket qBase+ (Biogazelle). Het qPCR protocol en de gebruikte primersequenties kunnen worden teruggevonden in bijlage (zie Bijlage 5). 18 2.6 Cellyse Cellyse gebeurt met 400 µl RIPA lysis buffer. Deze RIPA lysis buffer wordt voor gebruik aangereikt met een protease inhibitor (7x stock). De stalen worden 1 uur op 4°C geroteerd en na 1 uur gedurende 10 minuten aan 8000 g op 4°C gecentrifugeerd. Het supernatans wordt overgebracht naar voorgekoelde eppendorfs (zie Bijlage 6). 2.7 Meten van eiwitconcentraties De concentratie wordt bepaald met de Micro BCA™ Protein Assay Kit (Thermo Fisher). Deze methode is gebaseerd op de reductie van koper door eiwitten in een zuur medium. De gereduceerde koperionen zullen door chelatie van BCA een paars eindproduct produceren. De absorbantie bij 560 nm wordt met de GloMax® spectrofotometer (Promega) gemeten (zie Bijlage 7). 2.8 Western blot analyse Western blot is een analytische techniek waarbij één of meerdere eiwitten uit een mengsel van eiwitten gedetecteerd worden met behulp van specifieke antilichamen. Tijdens de gelelektroforese worden gedenatureerde eiwitten op basis van hun grootte gescheiden. De gescheiden eiwitten worden getransfereerd naar een nitrocellulosemembraan en geïncubeerd met antilichamen die gericht zijn tegen het eiwit van interesse. Detectie gebeurt via op luminol gebaseerde chemische luminescentie. Het Western blot protocol kan teruggevonden worden in de bijlage (zie Bijlage 8). 2.9 Transfectie van cellen HEK293TN cellen worden in een 6-well plaat uitgezaaid aan 400000 cellen per ml. De cellen worden 24 uur geïncubeerd op 37°C. Enkele uren voor de transfectie wordt het medium voorzichtig ververst. De transfectie wordt uitgevoerd met een ECT2L-GFP (Vectorbuilder) en ECT2L-3xFLAG vector (Vectorbuilder) met de JetPEI® kit (PolyPlus transfection). JetPEI® verpakt de vectoren in positief geladen partikels die binden met de celmembraan en via endocytose worden opgenomen. Voor de JetPEI® transfectie worden NaCl, ECT2L-GFP of ECT2L3xFLAG vector en JetPEI® samengebracht en druppelsgewijs op de cellen gebracht. De cellen worden bij 37°C gehouden en na 48 uur geoogst. Er worden ook microscoopslides gemaakt die onder de fluorescentie- en confocale microscoop worden geanalyseerd (zie Bijlage 9). 19 De ECT2L-GFP vector zal aanleiding geven tot een ECT2L-GFP fusie-eiwit. Dit fusie-eiwit laat toe om via confocale of fluorescentiemicroscopie de cellulaire lokalisatie van ECT2L te bepalen. Aangezien ECT2L een fusie vormt met GFP, zal het ECT2L eiwit zich automatisch bevinden op de plaats waar groen signaal van het GFP wordt waargenomen (Figuur 8). De ECT2L-3xFLAG vector daarentegen geeft aanleiding tot een ECT2L-3xFLAG fusie-eiwit. Tussen de 3xFLAG sequentie en GFP sequentie zit er echter een stop waardoor GFP geen fusieeiwit met ECT2L-3xFLAG kan vormen (Figuur 9). Deze vector doet dus dienst als controle door GFP lokalisatie zonder ECT2L-fusie. Figuur 9: A. Vectormap van de ECT2L-GFP vector. De Rous sarcoma virus (RSV) promotor laat Tat-onafhankelijke productie van viraal mRNA toe. HIV-1 getrunceerde 5’ long terminal repeat (LTR) regio zorgt voor verpakking van virale partikels en reverse transcriptie van viraal mRNA. HIV-1 psi (Ψ) zorgt eveneens voor verpakkingssignalen. HIV-1 Reverse response element (RRE) zorgt voor nucleaire migratie van viraal mRNA. Central polypurine tract (cPPT) facilliteert nucleaire import van HIV-1 cDNA. De phosphoglycerate kinase promotor (PGK), gevolgd door de Kozak sequentie, de sequentie voor GFP (EGFP) en het hECT2L leiden tot het ECT2LGFP fusie-eiwit. Woodchuck hepatitis virus posttrancriptional regulatory element (WPRE) facilliteert de terminatie van trancriptie aan de 3’ LTR. ΔU3/3' LTR is het HIV-1 getrunceerde 3’ LTR dat virale packaging toelaat. Dit element bevat eveneens een polyadenylatiesignaal voor polyadenylatie van het mRNA in getransduceerde cellen, net zoals SV40. Het ampiciline resistentiegen functioneert als een selectiemerker. De pUC origine of replication (ORI) laat toe om de vector te repliceren en onderhouden in E. coli. B. Vectormap van de ECT2L-3xFLAG vector. Alle elementen die bij A. besproken werden, komen hier terug. De PGK promotor, gevolgd door de Kozak sequentie, de sequentie voor het 3xFLAG en het ECT2L eiwit leiden hier tot de vorming van een ECT2L-3xFLAG fusie-eiwit. Tussen de sequentie voor GFP (EGFP) en de 3xFLAG sequentie zit een internal ribosome entry site (IRES), die toelaat om opnieuw translatie te starten en zorgt voor de vorming van het GFP eiwit. Vermits er tussen de EGFP en 3xFLAG een linker (IRES) zit, zal GFP geen fusie-eiwit vormen met het ECT2L-3xFLAG eiwit. 20 3. RESULTATEN 3.1 Expressie in T-ALL cellijnen 3.1.1 Visualisatie van het ECT2L eiwit in T-ALL cellijnen met Western blot Er werd een Western blot analyse uitgevoerd op enkele T-ALL cellijnen om de expressie van ECT2L in deze cellijnen te controleren. Hiervoor werden twee ECT2L antilichamen gebruikt (Sigma-Aldrich en LifeSpan BioSciences). Op deze manier kunnen de resultaten worden vergeleken en kan het beste ECT2L antilichaam worden geselecteerd voor verdere experimenten. Het ECT2L eiwit heeft een grootte van 104 kDa. Het antilichaam van Sigma-Aldrich toont een bandje ter hoogte van 70 kDa (Figuur 10). Bij de T-ALL cellijn LOUCY wordt er echter geen signaal waargenomen. Na kwantificatie met β-actine (42 kDa) blijkt echter dat er geen staal werd geladen voor LOUCY. Voor alle T-ALL cellijnen, met uitzondering van LOUCY, wordt er geen bandje ter hoogte van 104 kDa voor ECT2L geobserveerd. 70 kDa 42 kDa Figuur 10: Western blot analyse op T-ALL cellijnen met het ECT2L antilichaam van Sigma-Aldrich (links) en kwantificatie met β-actine (rechts). Voor LOUCY werd er geen ECT2L signaal waargenomen, maar na kwantificatie met β-actine bleek er amper staal geladen. De andere T-ALL cellijnen vertonen wel bandjes, maar het is niet duidelijk welk bandje specifiek voor ECT2L is. Het antilichaam van LifeSpan BioSciences toont echter wel een bandje ter hoogte van 100 kDa, maar eveneens een bandje op 70 kDa dat bij HSB-2 zelfs zeer uitgesproken is (Figuur 11). Het is onduidelijk of dit aspecifieke binding van het antilichaam is of dat er mogelijk een ECT2L variant in deze cellijn tot expressie komt waarop het antilichaam eveneens bindt. Ook hier wordt er geen signaal ter hoogte van LOUCY waargenomen, maar kwantificatie met β-actine (42 kDa) toont aan dat dit te wijten is door de afwezigheid/slechte kwaliteit van het staal. 21 100 kDa 70 kDa 42 kDa Figuur 11: Western blot analyse op T-ALL cellijnen met het ECT2L antilichaam van LifeSpan BioSciences (links) en kwantificatie met β-actine (rechts). Er wordt geen signaal voor LOUCY geobserveerd, hetgeen na kwantificatie met β-actine (42 kDa) te wijten bleek aan de afwezigheid of slechte kwaliteit van het staal. De andere T-ALL cellijnen vertonen wel een ECT2L signaal. Deze Western blot analyse toont ook bandjes ter hoogte van 70 kDa. Het is onduidelijk of dit door aspecificiteit van het antilichaam komt of toch specifiek voor ECT2L is. 3.1.2 ECT2L expressie analyse met qPCR in T-ALL cellijnen De ECT2L expressie in verschillende T-ALL cellijnen werd geanalyseerd met qPCR. Er werd een uitgebreid panel gekozen dat de volgende T-ALL cellijnen bevat: LOUCY, DND-41, TALL-1, ALL-SIL, KOPTK-1, Karpas-45, PEER, HSB-2, MOLT-16, KE37, HBP-ALL en Jurkat. HSB-2, LOUCY en PEER vertonen nagenoeg geen ECT2L expressie. De andere T-ALL cellijnen vertonen wel wat expressie, doch is dit nog steeds heel laag (Figuur 12). PEER LOUCY HSB-2 ALL-SIL DND-41 TALL-1 KOPTK-1 HBP-ALL MOLT-16 Karpas-45 KE37 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Jurkat Relatieve ECT2L expressie ECT2L expressie in T-ALL cellijnen T-ALL cellijnen Figuur 12: ECT2L expressie in verschillende T-ALL cellijnen. In HSB-2, LOUCY en PEER blijkt de ECT2L expressie afwezig. De andere T-ALL cellijnen vertonen wel wat expressie, maar dit is in combinatie met de lage Cq waarden, nog steeds zeer laag tot haast onbestaande. 22 3.1.3 Visualisatie van het ECT2L eiwit in T-ALL cellijnen via Western blot analyse met het Aviva Biology Systems antilichaam Bij voorgaande experimenten kon de betrouwbaarheid van ECT2L antilichamen in vraag worden gesteld. Via antibodypedia (www.antibodypedia.com) werd er een antilichaam van Aviva Biology Systems gekozen dat door het bedrijf gevalideerd werd via Western blot in de K-562 CML cellijn. Daarom werd K-562 als een positieve controle meegenomen in dit experiment. Western blot analyse toont niet alleen bandjes ter hoogte van 100 kDa, maar ook rond 60 kDa en 90 kDa (Figuur 13). De ladingscontrole β-actine (42 kDa) werd gebruikt voor kwantificatie en toont aan dat er overal eenzelfde hoeveelheid staal werd geladen. 100 kDa 60 kDa 42 kDa Figuur 13: Western blot analyse op T-ALL cellijnen met het ECT2L antilichaam van Aviva Systems Biology (links) en kwantificatie met β-actine (rechts). Bij alle T-ALL cellijnen wordt een gelijkaardig bandenpatroon geobserveerd. Rond 60 kDa worden er drie bandjes gezien, waarvan het niet duidelijk is of dit ECT2L is. Er wordt eveneens een heel licht bandje bij 90 kDa gezien. Rond 104 kDa ligt eveneens een bandje voor ECT2L dat voor DND-41 en CUTTL-1 zeer sterk aanwezig is. Voor de andere T-ALL cellijnen, met uitzondering van LOUCY, is dit wat lichter. Voor LOUCY wordt er niet echt een bandje ter hoogte van 100 kDa gezien. Kwantificatie met βactine (42 kDa) toont overal een gelijke hoeveelheid geladen staal aan. 3.2 Expressie in humane weefsels 3.2.1 ECT2L expressie analyse met qPCR in humane weefsels Er werd een qPCR uitgevoerd op het cDNA van verschillende humane weefsels (gift Prof. Dr. P. Mestdagh) om de ECT2L expressie op RNA niveau te detecteren en te kwantificeren. De resultaten tonen aan dat de eileider, long en trachea de hoogste expressie hebben, gevolgd door het linker- en rechterventrikel, rechteratrium, vena cava, hart en ileum. De andere weefsels vertonen amper of geen ECT2L expressie (Figuur 14). 23 ECT2L expressie in humane weefsels 80,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 Trachea Eileider Long Rechter ventrikel Linker ventrikel Linker atrium Vena cava Ileum Hart Rechter atrium Proximale colon Testikel Duodenum Prostaat Blaas Pericardium Uterus Hersenen Cervix Distale colon Placenta Vetweefsel Slokdarm Skeletaal spierweefsel Pancreas Schildklier Thymus Cerebellum Frontale cortex Karpas-45 Hersen striatum Pariëtale cortex Occipitale cortex Hersenstam Foetale hersenen Bijnieren Borst Colon Dunne darm Eierstok Jejunum Lever Lymfeknoop Maag Milt Nier Relatieve ECT2L expressie 70,00 Humane weefsels Figuur 14: ECT2L expressie in de eileider, long en trachea is het hoogst. Het linkeratrium, linkerventrikel, rechterventrikel, vena cava, hart en ileum vertonen een iets mindere ECT2L expressie. De expressie in de andere weefsels is nagenoeg afwezig. 3.3 Expressie in muisweefsels 3.3.1 Visualisatie van het Ect2l eiwit in muisweefsels en MOLT-4 met Western blot Er werden enkele muisweefsels geselecteerd op basis van de vorige verzamelde expressiedata. Er werd gekozen voor de long, milt en lever. Naast enkele muisweefsels, werd ook MOLT-4 geselecteerd aangezien op RNA-sequentie data gezien werd dat deze T-ALL cellijn ECT2L expressie zou moeten vertonen. Zowel het ECT2L antilichaam van Sigma-Aldrich als het antilichaam van LifeSpan BioSciences werden getest zodat het beste antilichaam voor verdere experimenten kan worden geselecteerd. Op het ogenblik van deze experimenten was het antilichaam van Aviva Biology Systems nog niet beschikbaar. Western blot op de lever, long en milt van muizen en MOLT-4 met het ECT2L Sigma-Aldrich antilichaam toont opnieuw veel bandjes aan (Figuur 15). Ter hoogte van 100 kDa wordt er eigenlijk voornamelijk bij de lever signaal waargenomen. Opnieuw worden er bandjes ter hoogte van 70 kDa geobserveerd. Kwantificatie met β-actine (42 kDa) toonde aan dat er voor de lever minder staal geladen werd. 24 100 kDa 70 kDa 42 kDa Figuur 15: Western blot analyse op de lever, long en milt van muizen en MOLT-4 met het ECT2L SigmaAldrich antilichaam (links) en kwantificatie met β-actine (rechts). Lever en long vertonen een bandje ter hoogte van 30 kDa dat niet verklaard kan worden. Ter hoogte van 70 kDa zien we voor alle stalen een bandje dat voor de lever en MOLT-4 zeer uitgesproken is, maar voor de long en milt minder aanwezig is. Het bandje op een hoogte van 100 kDa is zeer prominent voor de lever, maar minder voor de andere stalen. Kwantificatie met β-actine (42 kDa) toont aan dat er voor de lever iets minder staal geladen werd. Western blot analyse op de lever, long en milt van muizen en MOLT-4 met het ECT2L LifeSpan BioSciences antilichaam toont heel wat minder aspecificiteit (Figuur 16). Er wordt signaal ter hoogte van 100 kDa gezien voor de lever en MOLT-4, maar niet voor de long en de milt. 100 kDa 70 kDa 42 kDa Figuur 16: Western blot analyse op de lever, long en milt van muizen en MOLT-4 met het ECT2L LifeSpan BioSciences antilichaam (links) en kwantificatie met β-actine (rechts). Voor de lever en MOLT-4 wordt er een bandje ter hoogte van 70 kDa en 100 kDa gezien dat afwezig is voor de andere stalen. Kwantificatie met β-actine (42 kDa) toont aan dat er voor de lever minder staal geladen werd in vergelijking met de andere stalen die wel een gelijkaardig β-actine patroon vertonen. 25 3.3.2 Ect2l expressie analyse met qPCR op selectie van muisweefsels Een wild type muis werd opgeofferd en de milt, lever, long, thymus en hartweefsel werden geïsoleerd. De cellen werden geoogst voor genexpressie analyse en Western blot. Uit de qPCR data blijkt dat de long een hoge Ect2l expressie vertoont, analoog aan het humaan longweefsel. Het hart vertoont een lage expressie, eveneens overeenkomstig met humaan hartweefsel. De lever, milt en thymus vertonen geen expressie (Figuur 17). Ect2l expressie in muisweefsels Relatieve Ect2l expressie 12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 Long Hart Milt Lever Thymus Muisweefsels Figuur 17: Ect2l expressie in muisweefsels. Ect2l expressie in longweefsel van de muis blijkt hoog, in hartweefsel laag en in de overige weefsels haast onbestaande. De resultaten bevestigen de eerder gevonden resultaten uit het experiment op humane weefsels. 3.3.3 Visualisatie van het ECT2L eiwit in muisweefsels via Western blot analyse met het Aviva Biology Systems antilichaam Er werd een western blot uitgevoerd op deze weefsels om de expressie van ECT2L te bestuderen. De vorige twee ECT2L antilichamen (Sigma-Aldrich en LifeSpan BioSciences) gaven niet echt een duidelijk bandje ter hoogte van 104 kDa. Het antilichaam van Aviva Biology Systems werd daarom gebruikt in de hoop een beter antilichaam te vinden voor ECT2L. Dit experiment werd uitgevoerd op cel pellets die werden verkregen uit dezelfde weefsels als waarop bovenstaande qPCR werd uitgevoerd. Er was echter geen cel pellet van het hart beschikbaar voor Western blot. De resultaten tonen ter hoogte van de lever “een smeer” aan. Er wordt hetzelfde patroon geobserveerd als bij de voorgaande blots, namelijk een signaal ter hoogte van 100 kDa en 70kDa. De long toont nu wel een bandje op 100 kDa in tegenstelling tot de vorige antilichamen. Kwantificatie met β-actine (42 kDa) toont minder geladen staal aan voor de lever, waarschijnlijk door de slechte kwaliteit van het staal door incomplete cellyse (Figuur 18). 26 100 kDa 70 kDa 42 kDa 30 kDa Figuur 18: Western blot analyse op de long, lever, milt en thymus van muizen met het ECT2L Aviva Biology Systems antilichaam (links) en kwantificatie met β-actine (rechts). De lever vertoont een smeer. Er worden lichte bandjes ter hoogte van 30 kDa gezien. Opnieuw is er rond 60 à 70 kDa een duidelijk signaal. Ter hoogte van 104 kDa zijn er bandjes zichtbaar voor de long, lever en thymus maar niet voor de milt. β-actine kwantificatie toont minder geladen staal voor de lever aan. 3.4 ECT2L expressie in longkanker cellijnen 3.4.1 ECT2L expressie analyse met qPCR in longkanker cellijnen Aangezien de expressie van ECT2L in de T-ALL cellijnen haast onbestaande is, werd er gekozen om te kijken naar de expressie in longkanker cellijnen. Voorgaande expressiedata en experimenten tonen immers aan dat ECT2L hoog tot expressie komt in de longen. Op basis van publieke expressiedata en beschikbare cellijnen werd er gekozen voor H1650, H1975, H596, H69V, Calu1 en A549 (gift Prof. Dr. Karim Vermaelen) (Tabel 2). De long werd gebruikt als positieve controle en de milt als negatieve controle. De resultaten uit de genexpressie analyse tonen echter geen ECT2L expressie in de longkanker cellijnen aan (Figuur 19). Aangezien de positieve longcontrole een goede expressie vertoont en de negatieve controle geen expressie, kan er wel met zekerheid gesteld worden dat het experiment geslaagd is (Figuur 20). Tabel 2: Longkanker cellijnen en hun oorspronkelijke origine. Naam H1650 H1975 Calu1 A549 H69V H596 Type Bronchoal- Niet-klein- Niet-klein- Longcarcinoom Kleincellig Adeno- veolair cellig long- cellig long- enkele karakteristie- longcarci- squameus adenocar- adenocarci- carcinoom ken van type II alveo- noom carcinoom cinoom noom met laire epitheliale cellen 27 ECT2L expressie in longkanker cellijnen Relatieve ECT2L expressie 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 A549 Calu1 H1650 H1975 H596 H69V Longkanker cellijnen Figuur 19: Genexpressie analyse voor ECT2L in longkanker cellijnen. In combinatie met de lage geobserveerde Cq waarden kan er gesteld worden dat de expressie in deze longkanker cellijnen laag is. Relatieve ECT2L expressie ECT2L expressie in longkanker cellijnen 350 300 250 200 150 100 50 0 Long positieve controle Milt negatieve controle Figuur 20: Genexpressie analyse voor ECT2L in de long (positieve controle) en milt (negatieve controle). De long toont een duidelijke ECT2L expressie, terwijl de milt geen expressie vertoont. Deze resultaten tonen aan dat het experiment wel degelijk gelukt is. Op dit moment was er genexpressie data beschikbaar uit de Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) van H69 waaruit blijkt dat de reads van ECT2L voornamelijk ter hoogte van de eerste exonen gelegen zijn (Figuur 21). De primers die bij bovenstaand experiment gebruikt werden zijn echter gericht tegen exon 21 en 22 waar veel minder reads liggen (Figuur 22). Daarom werd er besloten om dit experiment te herhalen met nieuwe primers. Primerpaar 1 is gericht tegen exon 7/8 en primerpaar 2 tegen exon 8/9. 28 exonen 7 8 9 Figuur 21: Analyse van CCLE data voor ECT2L in de longkanker cellijn H69 in Integrative Genomics Viewer. Ter hoogte van exon 7, 8 en 9 is een groot aantal van de reads gelegen. exon 21 en 22 Figuur 22: Analyse van CCLE data voor ECT2L in de longkanker cellijn H69 in Integrative Genomics Viewer. De eerstgebruikte primers binden ter hoogte van exon 21 en 22 waar minder reads gelegen zijn. 3.4.2 ECT2L expressie analyse met qPCR in longkanker cellijnen met nieuwe primers De ECT2L expressie in longkanker cellijnen werd met nieuw ontwikkelde primers opnieuw nagegaan. Deze nieuwe primerparen kunnen echter geen betere ECT2L expressie aantonen (Figuren 23 en 24). 29 ECT2L expressie in longkanker cellijnen 4,50 ECT2L expressie primerpaar 1 Relatieve ECT2L expressie 4,00 ECT2L expressie primerpaar 2 3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 A549 -0,50 Calu1 H1650 H1975 H596 H69V Longkanker cellijnen Figuur 23: ECT2L expressie in longkanker cellijnen met de nieuw ontwikkelde primers. Deze nieuwe primers konden geen betere ECT2L expressie aantonen in de verschillende longkanker cellijnen. Relatieve ECT2L expressie ECT2L expressie in longkanker cellijnen 8.00 7.00 6.00 ECT2L expressie primerpaar 1 5.00 ECT2L expressie primerpaar 2 4.00 3.00 2.00 1.00 0.00 Long positieve controle Milt negatieve controle Figuur 24: ECT2L expressie in longkankercellijnen met de nieuw ontwikkelde primers. De long werd gebruikt als positieve controle en vertoont duidelijk ECT2L expressie. De milt is een negatieve controle en vertoont geen expressie. Op basis hiervan kan er besloten worden dat het experiment geslaagd is. 3.5 Cellulaire lokalisatie van het ECT2L eiwit 3.5.1 Visualisatie van ECT2L-GFP en ECT2L-3xFLAG getransfecteerde HEK293TN cellen HEK293TN cellen werden getransfecteerd met ECT2L-GFP, na 48 uur gevisualiseerd met de invertmicroscoop en gefixeerd na een DAPI-kleuring (Figuren 25 en 26). HEK293TN cellen werden eveneens getransfecteerd met ECT2L-3xFLAG vectoren en na 48 uur gevisualiseerd met de invertmicroscoop (Figuur 27). 30 Figuur 25: Fluorescente imaging van ECT2L-GFP getransfecteerde HEK293TN cellen. A. Algemeen overzichtsbeeld van de ECT2L-GFP getransfecteerde HEK293TN cellen op een 4x vergroting. B. Beeld van de getransfecteerde ECT2L-GFP HEK293TN cellen met een GFP filter op een 10x vergroting. De aanwezigheid van groene cellen toont aan dat de transfectie succesvol is. C. Beeld van de getransfecteerde ECT2L-GFP HEK293TN cellen met een GFP filter op een 20x vergroting. ECT2L vormt een fusie-eiwit met GFP, waardoor de aanwezigheid van GFP signaal automatisch betekent dat ook ECT2L hier zich bevindt. D. Beeld van de getransfecteerde ECT2L-GFP HEK293TN cellen met een GFP filter op een 40x vergroting. A B C Figuur 26: Confocale imaging van HEK293TN cellen getransfecteerd met een ECT2L-GFP vector en vervolgens gefixeerd na DAPI kleuring van de kern. A. Overzichtsbeeld van ECT2L-GFP getransfecteerde cellen die gekleurd werden met DAPI. Het groene signaal bevindt zich in het cytoplasma. B. Beeld van ECT2L-GFP getransfecteerde cellen. Het groene GFP signaal is in het cytoplasma te zien. C. In verschillende cellen werden er één of twee groene spots in het cytoplasma gevonden, die met ECT2L lijken geassocieerd te zijn. 31 Figuur 27: Fluorescente imaging van ECT2L-3xFLAG getransfecteerde HEK293TN cellen A. Algemeen overzichtsbeeld van de ECT2L-3xFLAG getransfecteerde HEK293TN cellen op een 4x vergroting. B. Beeld van de getransfecteerde ECT2L-3xFLAG HEK293TN cellen met een GFP filter op een 10x vergroting. De aanwezigheid van enkele groene cellen toont aan dat de transfectie succesvol is, maar het aantal groene cellen is echter wel heel laag. C en D. Beeld van de getransfecteerde ECT2L-GFP HEK293TN cellen met een GFP filter op een 20x vergroting. ECT2L-3xFLAG vormt geen fusie-eiwit met GFP, hetgeen betekent dat GFP doorheen de hele cel aanwezig is. Dit beeld kan dienen als een controle voor de ECT2L-GFP getransfecteerde cellen. 3.5.2 Validatie van de ECT2L-GFP en ECT2L-3xFLAG transfectie met qPCR De hierboven beschreven transfectie experimenten met ECT2L-GFP en ECT2L-3xFLAG worden op RNA niveau bevestigd. Als negatieve controle worden niet-getransfecteerde cellen meegenomen. De qPCR resultaten tonen een hoge GFP en ECT2L expressie aan voor de ECT2LGFP getransfecteerde HEK293TN cellen alsook voor de positive controle zijnde ECT2L-GFP getransfecteerde HEK293TN cellen waarvan in het verleden reeds gevalideerd werd dat deze ECT2L en GFP tot overexpressie brengen (Figuur 28). In de ECT2L-3xFLAG getransfecteerde cellen wordt echter maar een zeer beperkte expressie waargenomen (Figuur 29) in vergelijking met de ECT2L-GFP getransfecteerde cellen. De positieve controle toont een sterke ECT2L en GFP expressie waardoor er besloten kan worden dat het experiment is gelukt. 32 Validatie van ECT2L-GFP en ECT2L-3xFLAG getransfecteerde HEK293TN cellen 6.50 6.00 Relatieve ECT2L expressie 5.50 5.00 4.50 4.00 3.50 3.00 2.50 2.00 ECT2L 1.50 GFP 1.00 0.50 0.00 ECT2L-3xFLAG ECT2L-3xFLAG controle ECT2L-GFP ECT2L-GFP controle GFP positieve controle ECT2L-GFP en ECT2L-3xFLAG getransfecteerde HEK293TN cellen Figuur 28: Validatie van ECT2L-GFP en ECT2L-3xFLAG getransfecteerde HEK293TN cellen. De positieve controle, zijnde getransfecteerde HEK293TN cellen waarvan reeds in het verleden werd gevalideerd dat deze ECT2L en GFP tot overexpressie brengen, toont inderdaad een hoge ECT2L en GFP expressie aan waardoor er besloten kan worden dat het experiment succesvol was. De ECT2L-GFP getransfecteerde cellen tonen een hoge ECT2L en GFP expressie aan waardoor de lichtmicroscopische beelden bevestigd kunnen worden en dat er kan aangenomen worden dat de transfectie gelukt is. De ECT2L-3xFLAG getransfecteerde cellen tonen een lage GFP en ECT2L expressie aan, hetgeen ook de lage aanwezigheid van groene cellen op de lichtmicroscopische beelden bevestigt. De ECT2L-3xFLAG transfectie was dus minder succesvol. Relatieve ECT2L expressie Validatie van ECT2L-GFP en ECT2L-3xFLAG getransfecteerde HEK293TN cellen detail ECT2L-3xFLAG 3 ECT2L 2,5 GFP 2 1,5 1 0,5 0 ECT2L-3xFLAG ECT2L-3xFLAG controle Figuur 29: Detail van ECT2L-3xFLAG getransfecteerde HEK293TN cellen. De resultaten tonen een zeer lage ECT2L en GFP expressie, hetgeen de fluorescentie microscopie data bevestigt. Deze ECT2L-3xFLAG transfectie blijkt dus niet efficiënt. 33 3.5.3 Validatie van de ECT2L-GFP transfectie met Western blot analyse De goede werking van de primers en antilichamen wordt bevestigd via Western blot analyse op ECT2L-GFP getransfecteerde HEK293TN cellen (Figuur 30). Als controle worden er niet-getransfecteerde HEK293TN cellen meegenomen. Het ECT2L-GFP fusie-eiwit heeft een moleculair gewicht van 129 kDa, terwijl het GFP eiwit een grootte van 25 kDa heeft. Opmerkelijk is dat het bandje van ECT2L zowel in de controle als in de ECT2L-GFP getransfecteerde cellen op eenzelfde hoogte lijken te liggen terwijl het ECT2L eiwit 104 kDa groot is en het ECT2LGFP fusie-eiwit 129 kDa. Kwantificatie met β-actine (42 kDa) toont aan dat er overal een gelijke hoeveelheid staal geladen werd (Figuur 31). 130 Da 130 kDa 130 kDa 130 kDa 130 kDa 130 kDa Figuur 30: Validatie van de ECT2L-GFP getransfecteerde cellen met Western blot analyse. A, B en C. Western blot analyse met het GFP antilichaam toont een duidelijke band aan ter hoogte van 130 kDa aan. D. Western blot analyse met het Sigma-Aldrich antilichaam toont in de controle cellen geen band aan voor ECT2L ter hoogte van 104 kDa en voor de ECT2L-GFP getransfecteerde cellen wel een bandje ter hoogte van 130 kDa. E en F. Western blot analyse met het antilichaam van Aviva Biology Systems (E) en LifeSpan BioSciences antilichaam (F) toont in de controle cellen een band aan voor ECT2L die op dezelfde hoogte als de band voor het ECT2L-GFP fusie-eiwit ligt. 34 42 kDa Figuur 31: Validatie van de ECT2L-GFP getransfecteerde cellen met Western blot analyse. A. Kwantificatie met β-actine op de Western blot met het Sigma-Aldrich antilichaam toont overal een gelijk geladen hoeveelheid staal aan. B. Kwantificatie met β-actine (42 kDa) op de Western blot met het Aviva Biology Systems antilichaam toont overal een gelijk geladen hoeveelheid staal aan. C. Kwantificatie met β-actine op de Western blot met het Life Span BioSciences antilichaam toont overal een gelijk geladen hoeveelheid staal aan. 3.6 Conditioneel Ect2l knockout muismodel 3.6.1 Conditioneel Ect2l knockout muismodel 3.6.1.1 Uitkruisen van FlpE en inkruisen van Vav-iCre Deze kweken werden opgestart met als doel het verkrijgen van Ect2l fl/fl FlpE +/+ Vav-iCre tg/+ muizen (Figuur 32). Figuur 32: Uitkruisen van FlpE en inkruisen van Vav-iCre. A. Deze kweek werd opgezet met het oog op verkrijgen van Ect2l fl/fl FlpE +/+ Vav-iCre +/+ muizen. B en C. Deze kweken werden opgezet met het oog op verkrijgen van Ect2l fl/fl FlpE +/+ Vav-iCre tg/+ muizen. Het genotyperen van de nakomelingen gebeurt met een PCR reactie zoals bij “Materialen en methoden” besproken. Een Ect2l wild type allel geeft een bandje van 194 bp en een Ect2l floxed allel een fragment van 255 bp. Het FlpE recombinase zal, indien aanwezig, een bandje van ongeveer 725 bp geven. De interne controle die samen met FlpE gebruikt wordt, moet echter 35 altijd zichtbaar zijn en een band ter hoogte van 324 bp geven. Indien het Vav-iCre transgen aanwezig is, verwachten we een bandje met een grootte van 320 bp. De LabChip resultaten kunnen worden geraadpleegd in Figuren A - I in Bijlage 10. De resultaten worden samengevat in onderstaande tabellen (Tabel 3 - 5). Tabel 3: Samenvatting van alle nakomelingen bekomen uit kweek A. In de tabel zijn UZG nummer, geslacht, Ect2l, FlpE en Vav-iCre status weergegeven. Nakomelingen kweek A UZG-018283-15 UZG-018284-15 UZG-018285-15 UZG-018286-15 UZG-018287-15 UZG-018288-15 UZG-018289-15 UZG-018508-15 UZG-018509-15 Geslacht ♀ ♀ ♀ ♀ ♀ ♂ ♂ ♂ ♂ Ect2l fl/+ fl/+ fl/+ fl/+ fl/+ +/+ +/+ +/+ +/+ Vav-iCre tg/+ tg/+ +/+ tg/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ FlpE +/+ +/+ tg/+ tg/+ +/+ tg/+ tg/+ +/+ tg/+ Tabel 4: Samenvatting van alle nakomelingen bekomen uit kweek B. In de tabel zijn UZG nummer, geslacht, Ect2l, FlpE en Vav-iCre status weergegeven. Nakomelingen kweek B UZG-018258-15 UZG-018259-15 UZG-018260-15 UZG-018261-15 UZG-018262-15 UZG-018263-15 UZG-018264-15 UZG-018265-15 UZG-018266-15 Geslacht ♀ ♀ ♀ ♀ ♂ ♂ ♂ ♀ ♀ Ect2l fl/+ fl/+ fl/+ fl/+ fl/+ fl/+ fl/+ fl/+ +/+ Vav-iCre +/+ tg/+ +/+ tg/+ tg/+ +/+ +/+ tg/+ / FlpE +/+ +/+ tg/+ +/+ tg/+ tg/+ tg/+ tg/+ / Tabel 5: Samenvatting van alle nakomelingen bekomen uit kweek C. In de tabel zijn UZG nummer, geslacht, Ect2l, FlpE en Vav-iCre status weergegeven. Nakomelingen kweek C UZG-018267-15 UZG-018268-15 UZG-018269-15 UZG-018270-15 UZG-018271-15 UZG-018507-15 UZG-018510-15 Geslacht ♀ ♀ ♀ ♀ ♂ ♂ ♂ Ect2l fl/+ fl/+ fl/+ fl/+ +/+ fl/+ +/+ Vav-iCre tg/+ tg/+ +/+ +/+ +/+ / tg/+ FlpE tg/+ +/+ tg/+ tg/+ tg/+ tg/+ tg/+ 36 Deze kweken werden opgestart met als doel het verkrijgen van Ect2l fl/+ FlpE +/+ Vav-iCre tg/+ muizen (Figuur 33). Figuur 33: Uitkruisen van FlpE en inkruisen van Vav-iCre. D, E en F. Deze kweken werd opgezet met het oog op verkrijgen van Ect2l fl/+ FlpE +/+ Vav-iCre tg/+ muizen. Tijdens het verloop van deze thesis werd vernomen dat het Vav-iCre transgen leaky expressie kan vertonen in de germline cellen (persoonlijke mededeling Dr. Steven Goossens). Hierdoor bestaat de mogelijkheid dat in sommige muizen Ect2L-floxed muizen na inkruisen van het VaviCre transgen, Ect2l gedeleteerd wordt en doorgegeven naar de nakomelingen. Daarom wordt er een bijkomende PCR gedaan met drie primers. Met deze drie primers wordt er voor het Ect2l wild type allel een fragment van 222 bp en voor een Ect2l floxed allel 283 bp gezien. Indien excisie van exon 3 heeft plaatsgevonden, wordt er een amplicon van 175 bp waargenomen. De LabChip resultaten kunnen worden geraadpleegd in Figuren J - R in Bijlage 10. De resultaten worden samengevat in onderstaande tabellen (Tabel 6 - 8). Tabel 6: Samenvatting van alle nakomelingen bekomen uit kweek D. In de tabel zijn UZG nummer, geslacht, Ect2l, FlpE, Vav-iCre en Ect2l excisie status weergegeven. Nakomelingen kweek D UZG-021156-15 UZG-021157-15 UZG-021158-15 UZG-021159-15 UZG-021160-15 UZG-021161-15 Geslacht ♀ ♂ ♀ ♀ ♀ ♀ Ect2l fl/+ + + fl/+ + + Vav-iCre +/+ +/+ +/+ tg/+ +/+ tg/+ Excisie Ect2l Ect2l fl/+ Ect2l +/+ Ect2l +/+ Ect2l fl/+ Ect2l +/Ect2l +/+ 37 Tabel 7: Samenvatting van alle nakomelingen bekomen uit kweek E. In de tabel zijn UZG nummer, geslacht, Ect2l, FlpE, Vav-iCre en Ect2l excisie status weergegeven. Nakomelingen kweek E UZG-021014-15 UZG-021015-15 UZG-021016-15 UZG-021017-15 UZG-021018-15 Geslacht ♂ ♀ ♂ ♀ ♂ Ect2l fl fl + + + Vav-iCre / tg/+ tg/+ tg/+ +/+ Excisie Ect2l Ect2l +/Ect2l +/Ect2l +/Ect2l +/Ect2l +/+ Tabel 8: Samenvatting van alle nakomelingen bekomen uit kweek F. In de tabel zijn UZG nummer, geslacht, Ect2l, FlpE, Vav-iCre en Ect2l excisie status weergegeven. Nakomelingen kweek F UZG-021019-15 UZG-021020-15 UZG-021021-15 UZG-021022-15 UZG-021023-15 UZG-021024-15 UZG-021025-15 Geslacht ♀ ♂ ♂ ♀ ♂ ♀ ♂ Ect2l fl/+ fl/+ + fl/+ + fl/+ fl/+ Vav-iCre +/+ +/+ tg/+ tg/+ tg/+ tg/+ +/+ Excisie Ect2l Ect2l fl/+ Ect2l fl/+ Ect2l +/+ Ect2l fl/+ Ect2l +/+ Ect2l fl/+ Ect2l fl/+ 3.6.1.2 Kweken van Ect2l fl/fl muizen Aangezien uit bovenstaande genotyperingen werd bevestigd dat een aantal muizen een constitutieve deletie van één Ect2L bevatten, kon een kweek worden opgestart met als doel het verkrijgen van Ect2l fl/fl FlpE +/+ en Vav-iCre +/+ muizen (Figuur 34). Figuur 34: Kweken van Ect2l fl/fl muizen G. Deze kweek werd opgezet met het oog op verkrijgen van Ect2l conditionele knockout muizen: Ect2l fl/fl FlpE +/+ Vav-iCre +/+. De LabChip resultaten kunnen worden geraadpleegd in Figuren S – V in Bijlage 10. De resultaten worden samengevat in onderstaande tabel (Tabel 9). 38 Tabel 9: Samenvatting van alle nakomelingen bekomen uit kweek G. In de tabel zijn UZG nummer, geslacht, Ect2l, FlpE, Vav-iCre en Ect2l excisie status weergegeven. Nakomelingen kweek G UZG-004195-16 UZG-004196-16 UZG-004197-16 UZG-004198-16 UZG-004199-16 UZG-004200-16 UZG-004201-16 UZG-004202-16 UZG-004203-16 UZG-004204-16 3.6.2 Geslacht ♀ ♂ ♂ ♂ ♂ ♂ ♀ ♂ ♂ ♀ Ect2l FlpE +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ / +/+ +/+ fl/fl fl/+ fl/+ fl/+ fl/fl fl/fl Vav-iCre +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ Excisie Ect2l Ect2l +/+ Ect2l +/+ Ect2l +/+ Ect2l +/+ Ect2l +/+ Ect2l +/+ Ect2l +/+ Ect2l +/+ Ect2l +/+ Ect2l +/+ Ect2l full knockout muismodel Aangezien uit bovenstaande genotyperingen werd bevestigd dat een aantal muizen een constitutieve deletie van één Ect2L allel bevatten, kon een kweek worden opgestart met als doel het verkrijgen van Ect2l full knockout muizen (Figuur 35). Figuur 35: Kweken van full knockout muizen. H. Deze kweek werd opgezet met het oog op verkrijgen van Ect2l full knockout muizen. De LabChip resultaten kunnen worden geraadpleegd in Figuren W - Z Bijlage 10. De resultaten worden samengevat in onderstaande tabel (Tabel 10). Tabel 10: Samenvatting van alle nakomelingen bekomen uit kweek H. In de tabel zijn merknummer, geslacht, Ect2l, FlpE, Vav-iCre en Ect2l excisie status weergegeven. Nakomelingen kweek H Geslacht Ect2l Vav-iCre 2 ♂ +/+ 3 ♂ Geen bandjes te zien aangezien een knockout op 2 allelen is gebeurd en LoxP_R niet meer kan binden. +/+ +/+ Excisie Ect2l Ect2l -/- Ect2l +/- 39 3.7 Valideren full knockout muismodel 3.7.1 Genexpressie analyse met qPCR Uit de opgezette full knockout kweek werd één full knockout muis bekomen volgens de Ect2l genotypering. Via een genexpressie analyse met qPCR werd er nagegaan of er in het longweefsel effectief een knockout van Ect2l heeft plaatsgevonden. Er werd longweefsel van een wild type Ect2l muis meegenomen als positieve controle. Uit de resultaten blijkt de expressie in longweefsel van de full knockout muis afwezig, terwijl de positieve controle een duidelijk Ect2l expressie vertoont (Figuur 36). ECT2L expressie in longweefsel van full knockout muis Relatieve ECT2L expressie 25 20 15 10 5 0 Long full knockout Long positieve controle Figuur 36: Validatie Ect2l full knockout model. Longweefsel van de full knockout muis vertoont geen Ect2l expressie, terwijl in de positieve controle, longweefsel van een wild type Ect2l muis, een duidelijke Ect2l expressie kan worden waargenomen. 4. BESPREKI NG T-cel acute lymfoblastische leukemie is een agressieve hematologische tumor die ontstaat door de maligne transformatie van precursor T-cellen. In 2012 werd er een studie gepubliceerd waarbij somatisch verworven mutaties in ECT2L bij ETP-ALL patiënten werden beschreven [21]. Er kan worden aangenomen dat deze mutaties een verlies van de ECT2L expressie ECT2L veroorzaken. De rol van ECT2L in normale en maligne T-cel ontwikkeling is echter niet gekend en moet nog worden opgehelderd. Ook in andere kankers blijkt ECT2L een mogelijke rol als tumorsuppressorgen te hebben, maar dit werd tot op heden nog niet onderzocht. Nochtans zou dit kunnen leiden tot het beter begrijpen van de pathologie die gepaard gaat met T-ALL of andere kankers. 40 4.1 Expressie in humane weefsels De expressie van ECT2L werd gecontroleerd in een panel van 46 humane weefsels. De hoogste expressie werd geobserveerd in de trachea, gevolgd door de eileider, longen, rechter- en linkerventrikel, linkeratrium en vena cava. De expressie in de andere weefsels is zeer laag tot nagenoeg haast onbestaande. Opmerkelijk is dat de thymus, cruciaal in de T-cel ontwikkeling, geen ECT2L expressie vertoont. In de whole genome sequencing studie van Zhang et al. werden er loss-of-function mutaties in ECT2L gedemonstreerd [21] . Een loss-of-function mutatie gaat meestal gepaard met een gedeeltelijk of volledig verlies van de activiteit van het desbetreffende eiwit. Er kan dus worden gespeculeerd dat gezonde weefsels een goede ECT2L expressie vertonen, dat een ECT2L loss-of-function mutatie leidt tot een vermindering of afwezige expressie van ECT2L en dat dit mogelijk gerelateerd is aan het ontstaan van kanker. De resultaten van de genexpressie analyse in humane weefsels lijken dit echter tegen te spreken, maar toch vertonen deze een overeenkomst met de eerder gevonden expressiedata tijdens de literatuurstudie. In de Illumina Body Map was de expressie van ECT2L zeer hoog in de longen, eierstokken, hart en de testis [22]. Dit werd bevestigd door onze qPCR data, behalve voor de testikels. De mogelijke rol van ECT2L in maligne T-cel ontwikkeling kan uit dit experiment niet echt bevestigd worden vanwege de lage expressie in de thymus, maar de hoge expressie in de long daarentegen demonstreert mogelijk een rol voor ECT2L in longkanker geassocieerd met loss-of-function mutaties in dit gen. 4.2 ECT2L expressie in T-cellen gedurende verschillende fasen van de T-cel ontwikkeling Er werd naar de RNAseq data gekeken van de verschillende subsets van differentiërende Tcellen. In alle verschillende stadia werd echter erg lage expressie gevonden (zie Figuur i in Bijlage 11). 4.3 Expressie in T-ALL cellijnen Er is RNA sequentie data voor ECT2L in T-ALL cellijnen beschikbaar. De expressie van ECT2L in deze cellijnen lijkt op het eerste zicht zeer laag (zie Figuur ii in Bijlage 12). Het is moeilijk om een biologisch relevante FPKM cutoff waarde te bepalen, maar de FPKM waarden die hier worden geobserveerd duiden op een erg lage expressie. Toch kan een gen dat geen constitutieve (hoge) expressie vertoont functioneel nog steeds belangrijk zijn, bijvoorbeeld indien er opregulatie is onder invloed van bepaalde stimuli of temporeel tijdens een bepaalde fase van de celcyclus. 41 Verschillende T-ALL cellijnen werden gescreend op de aanwezigheid van het ECT2L eiwit aan de hand van Western blot analyse. In het Centrum voor Medische Genetica Gent waren er twee antilichamen beschikbaar zijnde het antilichaam van Sigma-Aldrich en LifeSpan BioSciences. Beide antilichamen werden getest om zo het beste te kunnen selecteren voor verdere experimenten. Voor het Sigma-Aldrich antilichaam werd er ter hoogte van ECT2L, dat een moleculair gewicht van 104 kDa heeft, geen enkel signaal waargenomen. Er werd echter wel voor alle cellijnen, met uitzondering van LOUCY, een bandje tussen 60 en 80 kDa geobserveerd. Voor het antilichaam van LifeSpan BioSciences werd er eveneens, opnieuw met uitzondering van LOUCY, een signaal tussen de 60 en 80 kDa waargenomen. Bij dit antilichaam wordt er wel ter hoogte van 104 kDa een bandje geobserveerd. Omdat er voor beide antilichamen een signaal rond 60 à 80 kDa werd gezien, werd Ensembl geraadpleegd om de grootte van eventuele ECT2L alternatieve splice site varianten te controleren. Er werden echter geen splice site varianten gevonden van deze grootte, dus mogelijk gaat het om een aspecifieke binding van het antilichaam. Omdat er een grote onzekerheid heerst over de correcte werking van beide antilichamen, werd er op zoek gegaan naar een ander antilichaam. Er werd gekozen voor het antilichaam van Aviva Biology Systems dat reeds gevalideerd werd met Western blot analyse in de K562 cellijn. Bij deze validatie werden er bandjes gezien ter hoogte van 60 kDa, 95 kDa en 104 kDa (Figuur 37). Dit is vergelijkbaar met de resultaten die werden gegenereerd in ons experiment. Het Aviva Biology Systems antilichaam geeft een duidelijker beeld dan de vorige twee antilichamen. Een verklaring voor de afwijkende bandjes op 60 kDa en 95 kDa wordt niet besproken door het bedrijf en kan ook door ons niet worden verklaard. Mogelijk gaat het om een aspecifieke binding van het antilichaam. De specificiteit van de antilichamen voor ECT2L zou in de toekomst kunnen getest worden door knockout experimenten, gevolgd door een Western blot analyse uit te voeren. Figuur 37: Validatie van het ECT2L antilichaam van Aviva Biology Systems via Western blot analyse in K562 cellijn (lysaten 35 µg/laan). Het ECT2L eiwit wordt aangegeven door de pijl [41]. 42 Ook op RNA niveau werd de ECT2L expressie nagegaan met een qPCR genexpressie analyse. Er werd echter amper expressie in de T-ALL cellijnen waargenomen. Een mogelijke verklaring is dat de primers niet goed werken, maar het lijkt onwaarschijnlijk aangezien deze primers ook werden gebruikt in de genexpressie analyse experimenten op de humane weefsels waarbij wel goede resultaten werden bekomen. Het vinden van een cellijn die ECT2L op een stabiele manier tot uiting brengt is één van de beperkingen die in dit onderzoek werden geobserveerd. Een stabiele ECT2L cellijn biedt immers de mogelijkheid om knockdown en knockout experimenten uit te voeren. Het inactiveren van ECT2L in T-ALL cellen kan helpen om de effecten geassocieerd met het verlies van ECT2L op transcriptniveau na te gaan en de signaaltransductiepaden downstream van ECT2L te onderzoeken. De cellulaire effecten die gepaard gaan met een verlies van ECT2L zoals veranderingen in celproliferatie, celoverleving en apoptose kunnen onderzocht worden met in vitro ECT2L knockout cellijnen. De functie van ECT2L als tumorsuppressorgen in maligne T-cellen zou op deze manier nader onderzocht kunnen worden. In de toekomst zou de focus in dit onderzoek dus liggen op het vinden van zo’n stabiele ECT2L cellijn. NCI-60, een panel van 60 humane kanker cellijnen, werd eveneens gescreend op de aanwezigheid van ECT2L maar ook hier kon er geen cellijn worden geselecteerd met een abundante ECT2L expressie. In een poging om toch een goede cellijn te vinden voor verdere experimenten in deze masterproef en gezond longweefsel een goede ECT2L expressie vertoont, werd er gekozen om te kijken naar de expressie van dit gen in longkanker cellijnen. 4.4 Focus op longkanker cellijnen In samenwerking met de onderzoeksgroep van Prof. Karim Vermaelen werden er cel pellets van verscheidene longkanker cellijnen verkregen. De expressie van ECT2L in deze longkanker cellijnen werd nagegaan aan de hand van genexpressie analyse met qPCR. Opnieuw kon er echter geen ECT2L expressie worden waargenomen. Mogelijk is er gewoon geen ECT2L expressie in deze longkanker cellijnen ofwel werken de primers niet goed. Deze gebruikte primers zijn gericht tegen exon 21 en 22 van het ECT2L gen. Uit CCLE data van H69 blijkt echter dat de ECT2L reads voornamelijk ter hoogte van de eerste exonen worden gedetecteerd en niet ter hoogte van de achterste exonen (Figuren 22 en 23). Daarom werden er nieuwe primerparen ontwikkeld tegen exon 7/8 en exon 8/9. Het genexpressie experiment werd vervolgens met de nieuwe primers herhaald, maar ook nu kon er geen goede expressie in deze longkanker cellijnen worden aangetoond. Deze lage expressie van ECT2L in de T-ALL en longkanker cellijnen suggereert echter een mogelijke rol van ECT2L als tumorsuppressorgen, aangezien kankercellen alleen kunnen groeien als ECT2L expressie laag of afwezig is en gezond longweefsel wel een 43 goede expressie vertoont. Loss-of-function mutaties in tumorsuppressorgenen zorgen er namelijk voor dat de celcyclus niet meer wordt afgeremd en dat cellen slechts enkele stappen van kanker verwijderd zijn. Concreet betekent dit dat kankercellen vrij kunnen groeien indien een loss-of-function in een tumorsuppressorgen, in dit geval ECT2L, heeft opgetreden samen met andere genetische wijzigingen. Het is ook mogelijk dat ECT2L alleen in bepaalde subtypes van longweefsel tot expressie komt die verschillen van het weefsel of de lijn waarvan de onderzochte longkanker cellijnen afkomstig zijn. Verder onderzoek is noodzakelijk. Er werd eveneens geprobeerd om ECT2L tot overexpressie te brengen via transductie en transfectie experimenten met een ECT2L-GFP en ECT2L-3xFLAG vector in de A549 longkanker cellijn om de effecten van ECT2L activatie te bestuderen in cellen waarin endogene ECT2L expressie voorkomt. Na transfectie en transductie kon er echter geen enkele cel worden gedetecteerd die GFP tot expressie bracht. Een mogelijke verklaring is dat de PGK1 promotor in de ECT2L vectoren niet of slecht werkzaam is in de A549 cellijn. Er werd vervolgens besloten om deze experimenten te herhalen, maar deze keer in HEK293TN cellen waar gebruik van de PGK promoter wel tot sterke overexpressie leidt. 4.5 Cellulaire lokalisatie HEK293TN cellen werden getransfecteerd met ECT2L-GFP en ECT2L-3xFLAG vectoren. De aanwezigheid van een GFP proteïne in beide vectoren stelt ons niet alleen in staat om voor de cellen die de vector hebben opgenomen te selecteren, maar het feit dat GFP met ECT2L een fusie-eiwit vormt in de ECT2L-GFP vector laat ons ook toe om de cellulaire lokalisatie van ECT2L te bepalen. De ECT2L-3xFLAG vector bevat naast een ECT2L-3xFLAG fusie-eiwit, ook een GFP eiwit dat geen fusie vormt met ECT2L. Op deze manier functioneert deze vector als een controle voor de ECT2L-GFP vector. De resultaten van de qPCR en Western blot analyse bevestigen dat de ECT2L-GFP transfectie succesvol was. Opmerkelijk is dat via Western blot werd gezien dat het ECT2L-GFP fusie-eiwit (129 kDa) en het ECT2L eiwit (104 kDa) op eenzelfde hoogte gelegen zijn, terwijl men verwacht dat het ECT2L-GFP fusie-eiwit iets hoger zou moeten liggen. Mogelijk komt dit doordat op deze hoogte de eiwitten minder sterk van elkaar gescheiden worden. Dit kan verholpen worden door gels te gebruiken met een hoger percentage acrylamide. Via de fluorescentiemicroscoop werd er gezien dat het ECT2L eiwit een duidelijke cytoplasmatische lokalisatie vertoont. Eveneens werden er in sommige cellen één of twee groene stipjes gezien. Deze resultaten werden besproken met Prof. Dr. Winnok De Vos die aangaf dat dit patroon mogelijk kan wijzen op associatie van ECT2L met het centrsoom. 44 Opmerkelijk is dat centrosomen zijn opgebouwd uit centriolen en dat centriolen kunnen migreren naar het celoppervlak waar het moedercentriool een basaal lichaam vormt dat een rol speelt in de vorming van cilia. In de inleiding werd reeds vermeld dat het gebrek van ect2l in zebravissen leidt tot het verkorten van beweegbare cilia in nierbuisjes [32]. In de genexpressie analyse experimenten werd eveneens gezien dat de expressie van ECT2L hoog was in de long, trachea en eileider, allemaal organen die gekarakteriseerd worden door trilhaarepitheel. Het is dus mogelijk dat de ECT2L functie gerelateerd is aan de aanwezigheid van cilia. Dit zou verder onderzocht kunnen worden door een immuunhistochemische dubbelkleuring tegen gamma-tubuline, een unieke merker voor centrosomen, en ECT2L uit te voeren, maar dit kon wegens tijdsgebrek niet meer binnen het kader van deze masterproef worden uitgevoerd. In de toekomst zou het RNA van HEK293TN cellen die overexpressie van ECT2L vertonen, kunnen worden geïsoleerd en gebruikt worden voor RNA sequenering. Door dit RNA te vergelijken met het RNA van niet-getransfecteerde HEK293TN cellen zou men kunnen zien welke genen op- of neergereguleerd zijn en dus mogelijk door ECT2L worden aangestuurd of afgeremd. 4.6 Expressie in muisweefsels Er werden enkele muisweefsels geïsoleerd uit wild type muizen en gecontroleerd op Ect2l expressie. In een eerste fase werden de antilichamen van Sigma-Aldrich en LifeSpan BioSciences getest op long-, lever-, en miltweefsel. Uit RNA-sequentie data bleek MOLT-4 de meest overtuigende reads ter hoogte van het ECT2L gen te hebben en deze T-ALL cellijn werd eveneens meegenomen in deze Western blot analyse als een soort van positieve controle. Voor het SigmaAldrich antilichaam worden er veel bandjes waargenomen. Het ECT2L eiwit heeft een grootte van 104 kDa, maar er wordt echter amper signaal waargenomen op 104 kDa, behalve mogelijk voor de lever en een heel klein beetje voor de long. Voor MOLT-4 wordt er niks geobserveerd, terwijl RNA sequentie data toch een aanwezigheid van het ECT2L eiwit suggereren. Er is eveneens signaal op ongeveer 70 kDa. Mogelijk is dit een aspecifieke binding van het antilichaam. Het LifeSpan BioSciences toont een mogelijk bandje op 104 kDa voor de lever en MOLT-4 maar niet voor de long en milt. Opmerkelijk is dat er voor beide antilichamen amper signaal voor de long wordt geobserveerd. Voorgaande expressiedata toont immers een hoge Ect2l expressie aan in de long. Het antilichaam van Aviva Biology Systems toont wel zichtbare bandjes op 104 kDa voor de long, milt en lever. Voor de lever is er op deze blot een “smeer” te zien die mogelijk te wijten is aan het feit dat de lever een vet orgaan is en dat de cellyse niet goed verlopen is. De zichtbare bandjes zijn echter vrij zwak. Dit illustreert opnieuw dat er nood is aan een optimalisatie van de Western blot procedure voor het ECT2L eiwit. 45 4.7 Conditioneel Ect2l knockout muismodel Een muismodel is een zeer waardevolle tool om pathologische kenmerken van bepaalde aandoeningen door mutaties in genen nader te bestuderen. In dit project werd er gekozen om een conditioneel Ect2l knockout muismodel te ontwikkelen met het Cre-Lox systeem om het effect van mutaties in Ect2l in de T-ALL pathogenese te bestuderen. In het Centrum voor Medische Genetica Gent werd door de onderzoeksgroep van Pieter Van Vlierberghe reeds gestart met het Ect2l conditioneel knockout muismodel en hierop werd in deze masterproef verder gebouwd. Omwille van de tijdslimiet die deze masterproef met zich meebrengt, is men er nog niet in geslaagd om een conditioneel Ect2l knockout muismodel te creëren. Op dit moment beschikken we over Ect2l fl/fl muizen waarbij het FlpE recombinase en neomycine werden uitgekruist. Deze muizen kunnen nu, afhankelijk van in welk weefsel men Ect2l wil deleteren, worden ingekruist met verschillende weefselspecifieke Cre lijnen om de functie van dit gen in ontwikkelende T-cellen te bestuderen. Tijdens het verloop van deze thesis werd vernomen dat het Vav-iCre transgen leaky expressie kan vertonen in de germline cellen (persoonlijke mededeling Dr. Steven Goossens). Hierdoor bestaat de mogelijkheid dat in sommige muizen Ect2L-floxed muizen na inkruisen van het VaviCre transgen, Ect2l gedeleteerd wordt en doorgegeven naar de nakomelingen. Genotypering van enkele muisjes toonde inderdaad aan dat ze niet beschikten over Vav-iCre in hun genoom en niet Ect2l floxed waren, maar toch een excisie van exon 3 van het Ect2l gen hadden ondergaan. Hoewel Vav-iCre specifiek is voor hematopoëtische en endotheliale cellen, werd er in andere studies Vav-iCre recombinase activiteit in de testes van Vav-iCre muizen gerapporteerd. Dit resulteerde in enkele muizenjongen met een germinale deletie. In de toekomst kan dit probleem vermeden worden door steeds te kruisen met Vav-iCre vrouwelijke muizen in plaats van VaviCre mannelijke muizen [42]. Niettegenstaande we initieel enkel voor ogen hadden om een conditioneel Ect2l knockout muismodel te maken, werd er besloten om van de Vav-iCre germline leakage gebruik te maken om een Ect2l full knockout muismodel te creëren. Twee muizen met op het ene allel het wild type Ect2l en op het andere allel het gedeleteerde Ect2l werden hiervoor met elkaar gekruist. Uit deze kruising kwamen slechts twee muizenjongen voort. Vanwege dit lage aantal werd er vermoed dat een homozygote Ect2l deletie mogelijk een lethaal fenotype geeft waardoor deze muizenjongen in utero sterven. Na genotyperen van deze jongen bleek er echter één van de twee 46 een Ect2l full knockout te zijn. Er kan wel worden vermoed dat de deletie van Ect2l op 1 allel voldoende is om de vruchtbaarheid van deze muizen te doen afnemen, maar om dit te bevestigen zouden er nog meer kweken moeten worden opgezet. Een belangrijke observatie is wel dat muizen kunnen leven zonder Ect2l. De full knockout muis die voortkwam uit de opgezette kweek werd voor dit project opgeofferd om via Western blot en qPCR na te gaan of de Ect2l expressie weldegelijk afgenomen is. In ideale omstandigheden zou het echter aangeraden zijn om met deze muis verder te kweken om nog meer Ect2l full knockout nakomelingen te bekomen of om te blijven kweken met het kweekkoppel dat deze full knockout muis tot stand heeft gebracht. In de toekomst zou men het RNA van verschillende organen waaronder bijvoorbeeld de thymus en het bloed, of in de context van longkanker de longen, kunnen isoleren om hierop RNA sequenering uit te voeren. Het vergelijken van de RNA sequentie data van wild type Ect2l, conditionele en full knockout muizen kan helpen om de transcriptionele programma’s geassocieerd met Ect2l te identificeren doordat er kan worden geanalyseerd welke genen mogelijk op- of neergereguleerd zijn. Men zou eveneens een Ect2l full knockout muis kunnen kruisen met een PTEN knockout muis. PTEN is een tumorsuppressor die vaak gemuteerd is in verschillende kankers. Kanker is een meerstapsproces waarbij er meerdere coöperatieve events moeten plaatsvinden vooraleer een tumor zich daadwerkelijk ontwikkelt. Door het kruisen van een Ect2l knockout muis met een PTEN knockout muis creëert men een situatie waarbij dit meerstapsproces wordt nagebootst. Op deze manier kan men zien of een mutatie in Ect2l ertoe leidt dat de kanker zich erger of sneller ontwikkelt. In dit geval werd de full knockout muis geëuthanaseerd en de lever, milt, hart, longen en thymus werden geïsoleerd. Op deze weefsels werd er een Western blot analyse uitgevoerd om te kijken of het ECT2L eiwit weldegelijk afgenomen was in de full knockout muis. Uit deze resultaten kon er echter niets worden geconcludeerd, mede door de grote onzekerheid van het ECT2L antilichaam. In de toekomst is er een grote nood aan de optimalisatie van Western blot antilichamen voor verdere analyse. Genexpressie analyse op het RNA van deze full knockout muis toonde echter wel aan dat de Ect2l expressie inderdaad verdwenen was in de longen. Aangezien Ect2l amper tot expressie komt in organen zoals de thymus, lever en milt van een wild type muis is het moeilijk om met qPCR in deze organen te valideren of ook hier effectief Ect2l afwezig is. Een oplossing hiervoor is dat men naast RNA ook DNA isoleert en deze weefsels genotypeert via een PCR reactie. 47 5. CONCLUSIE Het is niet duidelijk of ECT2L een belangrijke rol speelt in T-ALL. De gevonden resultaten in deze masterproef duiden niet echt op een directe link tussen ECT2L en T-ALL. Het merendeel van de gevonden mutaties in het artikel van Zhang et al. omvat germinale mutaties waardoor gesuggereerd kan worden dat dit kan gaan om zogenaamde passenger mutaties. Anderzijds, gezien het feit dat er ook recurrente somatische ECT2L mutaties geïdentificeerd werden, zou het ook kunnen zijn dat verlies van ECT2L resulteert in een genetische voorbeschiktheid tot tumorontwikkeling. In een volgende stap zouden additionele patiëntstalen gescreened kunnen worden op ECT2L mutaties. Het is eveneens belangrijk om een stabiele cellijn te vinden die geschikt is voor overexpressie en knockout experimenten zodat het effect op downstream gelegen genen en transcriptionele mechanismen geïdentificeerd kan worden met behulp van RNA sequentie analyse. Het gebrek aan een goed ECT2L antilichaam voor Western blot analyse maakt het moeilijk om de aanwezigheid van het ECT2L eiwit te visualiseren. Er moet dus op zoek worden gegaan naar een goed antilichaam of de reeds bestaande antilichamen optimaliseren. Hoewel de functie van ECT2L niet achterhaald kon worden, is het wel duidelijk dat het ECT2L eiwit gelokaliseerd is in het cytoplasma en het hier een mogelijke functie uitoefent. De hoge expressie van ECT2L in gezond longweefsel en afwezigheid in longkanker cellijnen laat de mogelijkheid open dat ECT2L een rol speelt als tumorsuppressorgen in longkanker. Het Ect2l conditioneel knockout muismodel kan mogelijk in de toekomst gebruikt worden om de in vivo rol van Ect2l in de longen beter te begrijpen. Verder kunnen conditionele of full knockout muizen gekruisd worden met muizen die een mutatie dragen in een gekend kankergen zodat het coöperatief mechanisme in kanker wordt nagebootst in deze modellen en eventuele kankerbevorderende eigenschappen van Ect2l aan het licht komen. 48 6. REFERENTI ES [1] National Cancer Institute (2013). What you need to know aboutTM leukemia (Online) http://www.cancer.gov/publications/patient-education/wyntk-leukemia/AllPages (Gelezen op 26/03/2016). [2] National Cancer Institute (2014). A snapshot of leukemia (Online) http://www.cancer.gov/researchandfunding/progress/snapshots/leukemia (Gelezen op 26/03/2016). [3] Nicholas, F. et al. (2013). Leukaemia update. Part 1: diagnosis and management. British Medical Journal 346: 1-6. [4] Pui, C.-H. (2006). Central nervous system disease in acute lymphoblastic leukemia: prophylaxis and treatment. American Society of Hematology Educational Program 2006: 142-146. [5] Del Principe, MI. et al. (2014). Central nervous system involvement in adult acute lymphoblastic leukemia: diagnostic tools, prophylaxis and Therapy. Mediterranean Journal of Hematology and Infectious Diseases 6(1): [6] Van Vlierberghe, P. Molecular-genetic insights in pediatric T-cell acute lymphoblastic leukemia. (2008). [7] Ferlay, J. et al. (2015). Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. International Journal of Cancer 136(5): E359–E386. [8] International Agency for Research on Cancer (2015). Globocan 2012: estimated cancer incidence, mortality and prevalence worldwide in 2012 (Online) http://globocan.iarc.fr (Gelezen op 26/03/2016). [9] National Cancer Institute (2015). Surveillance, epidemiology, and end results program (Online) http://seer.cancer.gov/statfacts/html/leuks.html (Gelezen op 26/03/2016). [10] Speleman, F. (2015) Cursus kankergenetica. Gent, Universiteit Gent. [11] Rieger, MA. et al. (2012). Hematopoiesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology 4(12): a008250. [12] Murphy, K. Janeway’s Immunobiology. (Garland Science, 2012). [13] Leclercq, G (2012). Cursus immunologie. Gent, Universiteit Gent. [14] Germain, RN (2002). T-cell development and the CD4–CD8 lineage decision. Nature Reviews Immunology 2: 309–322. [15] Zúñiga-Pflücker, JC (2004). T-cell development made simple. Nature Reviews Immunology 4: 67-72. [16] Pui CH, RM (2004). Acute lymphoblastic leukemia. The New England Journal of Medicine 350: 1535– 1348. [17] Van Vlierberghe, P. et al. (2012). The molecular basis of T cell acute lymphoblastic leukemia. The Journal of Clinical Investigation 122: 3398–3406. [18] Haydu, JE. et al. (2013). Early T-cell precursor acute lymphoblastic leukaemia. Current Opinion in Hematology 20(4): 369-73. [19] Coustan-Smith, E. et al. (2010). Early T-Cell precursor leukemia: a subtype of very high-risk acute lymphoblastic leukemia identified in two independant cohorts. The Lancet 10: 147-156. [20] Allen, A. et al. (2013). Early T-cell precursor leukemia/lymphoma in adults and children. Leukemia Research 37: 1027-1034. [21] Zhang, J. et al. (2012). The genetic basis of early T-cell precursor acute lymphoblastic leukaemia. Nature 481(7380): 157-163. [22] The GeneCards Human Gene Database (2016). Epithelial Cell Transforming 2 Like. (Online) http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=ECT2L (Gelezen op 01/03/2016). [23] Kornblihtt, AR. et al. (2013). Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation. Nature Reviews Molecular Cell Biology 14: 153-165. 49 [24] Ensembl (2015). Epithelial Cell Transforming 2 Like. (Online) http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Gene/Summary?db=core;g=ENSG00000203734;r=6:138795926-138904070 (Gelezen op 01/03/2016). [25] UniProt (2016). Epithelial Cell Transforming 2 Like. (Online) http://www.uniprot.org/uniprot/Q008S8 (Gelezen op 24/03/2016). [26] Skaar, JR. et al. (2013). Mechanisms and function of substrate recruitment by F-box proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology 14: 369-381. [27] Schmidt, A. et al. (2002). Guanine nucleotide exchange factors for Rho GTPases: turning on the switch. Genes & Development 16:1587–1609. [28] King, B. et al. (2005). The ubiquitin ligase FBXW7 modulates leukemia-initiating cell activity by regulating MYC stability. Cell 153: 1552-1556. [29] Morris, BJ. et al. (2005). A forkhead in the road to longevity: the molecular basis of lifespan becomes clearer. Journal of hypertension 23(7): 1285-1309. [30] Cook, DR. et al. (2014). Rho guanine nucleotide exchange factors: regulators of Rho GTPase activity in development and disease. Oncogene 33: 4021–4035. [31] Etienne-Manneville, S. et al. (2002). Rho GTPases in cell biology. Nature 420: 629-635. [32] Chokski, SP. et al. (2014). Systematic discovery of novel ciliary genes through functional genomics in the zebrafish. Development 141(17): 3410-3419. [33] National Center for Biotechnology Information (2016). Blast ECT2L and Ect2l (Online) http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (Gelezen op 24/03/2016). [34] Nagy, A. et al. (2000). Cre Recombinase: The universal reagent for genome tailoring. Genesis 26(2): 99109. [35] Cyagen Biosciences (2015). F1 Germline mouse breeding recommendations for conditional knockout models (neomycin cassette-intact F1). [36] Georgiades, P. et al. (2002). VavCre transgenic mice: a tool for mutagenesis in hematopoietic and endothelial lineages. Genesis 34: 251-256. [37] The Human Protein Atlas (2016). ECT2L (Online) http://www.proteinatlas.org/ENSG00000203734ECT2L/tissue/primary+data (Gelezen op 26/03/2016). [38] Catalogue of somatic mutations in cancer (2016). ECT2L (Online). http://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/gene/analysis?ln=ECT2L (Gelezen op 26/03/2016). [39] St. Jude Children’s Research Hospital. ProteinPaint: ECT2L (Online) https://pecan.stjude.org/home (Gelezen op 27/04/2016). [40] Zhou, X. et al. (2016). Exploring genomic alteration in pediatric cancer using ProteinPaint. Nature Genetics 48: 4-6. [41] Aviva Systems Biology (24/07/2013). Product Protocol: ECT2L antibody tested with human K562 by western blot (OAAB07847). (Online) https://www.avivasysbio.com/wordpress/product-protocols/western-blotprotocols-product-protocols/product-protocol-ect2l-antibody-tested-with-human-k562-by-western-blotoaab07847/ (Gelezen op 24/04/2016). [42] Chacko, J et al. (2013). Deciphering hematopoietic stem cells in their niches: a critical appraisal of genetic models, lineage tracing, and imaging strategies. Cell Stem Cell 13(5): 520-533. 50 B IJLAGEN Bijlage 1: Genotyperen Ect2l muizen: DNA isolatie (quick dirty prep) en PCR DNA isolatie (quick dirty prep) 1. Knip een stukje weefsel uit de oren van de muis. 2. Breng stukje oor in 40 µl 25 mM NaOH / 0,2 mM EDTA. 3. Plaats in een heat block bij 98°C gedurende 1 uur. 4. Voeg 40 µl Tris HCl (pH 5.5) toe. 5. Centrifugeer de stalen op 4000 rpm gedurende 3 minuten. 6. Verdun het staal 1/100. Gebruik hiervoor het supernatans. Neem 2 µl supernatans en leng aan met 198 µl sigma water. PCR op geïsoleerd DNA FlpE mastermix en PCR programma Reagentia 5x buffer 25 µM MgCl2 10 Mm dNTP mix 5 µM F primer FlpE 5 µM R primer FlpE 5 µM F primer interne controle 5 µM R primer interne controle Taq (5U/µl) Water DNA template (1/100) TOTAAL Stap 1 2 3 4 5 6 Temperatuur 95°C 95°C 58°C 72°C 72°C 10°C Tijdsduur 3 minuten 30 seconden 1 minuut 1 minuut 2 minuten Altijd Aantal 5 µl 2,5 µl 0,5 µl 1,6 µl 1,6 µl 1,6 µl 1,6 µl 0,2 µl 8,4 µl 2 µl 25 µl Opmerking Herhaal stappen 2-4 gedurende 35 cycli I Ect2l mastermix en PCR programma Reagentia 5x buffer 25 µM MgCl2 10 Mm dNTP mix 5 µM F primer Ect2l 5 µM R primer Ect2l Taq (5U/µl) Water DNA template (1/100) TOTAAL Stap 1 2 3 4 5 6 Temperatuur 95°C 95°C 58°C 72°C 72°C 10°C Tijdsduur 3 minuten 30 seconden 1 minuut 1 minuut 2 minuten Altijd Aantal 5 µl 2,5 µl 0,5 µl 1,6 µl 1,6 µl 0,2 µl 11,6 µl 2 µl 25 µl Opmerking Herhaal stappen 2-4 gedurende 35 cycli Vav-iCre mastermix en PCR programma Reagentia 5x buffer 25 µM MgCl2 10 Mm dNTP mix 5 µM F primer Vav-iCre 5 µM R primer Vav-iCre Taq (5U/µl) Water DNA template (1/100) TOTAAL Stap 1 2 3 4 5 6 Temperatuur 95°C 95°C 62°C 72°C 72°C 4°C Tijdsduur 3 minuten 40 seconden 40 seconden 40 seconden 5 minuten Altijd Aantal 5 µl 2,5 µl 0,5 µl 1,6 µl 1,6 µl 0,2 µl 11,6 µl 2 µl 25 µl Opmerking Herhaal stappen 2-4 gedurende 35 cycli II Primersequenties Gen FlpE Forward FlpE Reverse Interne controle FlpE Forward Interne controle FlpE Reverse Vav-iCre Forward Vav-iCre Reverse LoxP_F LoxP_R Neo_del_R Control_R Primersequenties 5’-CACTGATATTGTAAGTAGTTTGC-3’ 5‘-CTAGTGCGAAGTAGTGATCAGG-3’ 5‘-CTAGGCCACAGAATTGAAAGATCT-3’ 5‘-GTAGGTGGAAATTCTAGCATCATCC-3’ 5’-CTCTGACAGATGCCAGGACA-3’ 5’-ACACCATTCTTTCTGACCCG-3’ 5’-CCTTGAACAGTAGACCGATCTCACC-3’ 3’-GAGGTCAGCATCCCTGAAAGCA-5’ 3’-ATTACACCTGAAAGACCCAC-5’ 3’-CACTGCCATTGTGAGCTGTG-5’ Bijlage 2: Protocol oogsten van cellen uit muisweefsels Isoleren van cellen uit long, trachea, hart 1. Offer een muis op door cervicale dislocatie. 2. Maak de huid nat met 70% ethanol. 3. Pin de muis vast op een foam plankje. 4. Maak een Y-vormige incisie. 5. Verwijder de longen, trachea en/of hart. 6. Plaats de weggenomen weefsels in ijskoude 1 x PBS (Gibco Life Technologies) in een 6-well plaat die op ijs gehouden wordt. 7. Breng de weefsels over in een eppendorf en knip deze zeer fijn met een schaar. 8. Voeg hieraan 25 ml voorverwarmde collagenase (2 mg/ml – Sigma-Aldrich) toe (37°C). 9. Laat dit 45 minuten incuberen op 37°C terwijl het zachtjes schudt. 10. Maak vervolgens het weefsels nog fijner door het mengsel een 12tal keer door een 30 cc naald te halen. 11. Het fijngemaalde mengsel wordt door een cell strainer gehaald die zich op een 50 ml tube bevindt. De zeef wordt nog wat nagespoeld met 1 x PBS om eventuele restjes nog doorheen de zeef te duwen. 12. Deze suspensie wordt gecentrifugeerd aan 1200 rpm gedurende 5 minuten op 4°C. 13. Het supernatans wordt afgezogen. III 14. Indien de pellet nog erg rood is, moet er rode bloedcel lysis buffer worden toegevoegd. Naargelang de grootte van de pellet wordt er een aantal ml toegevoegd en dit geheel wordt 5 minuten op kamertemperatuur gehouden. Voeg vervolgens in een 5x overmaat 1 x PBS toe om de lysis buffer te neutraliseren. Dit wordt 5 minuten gecentrifugeerd aan 1200 rpm op 4°C. Het supernatans moet worden afgenomen. Indien de pellet nu nog heel rood is, moet stap 14 herhaald worden. Indien dit niet zo is, kan er worden overgegaan naar stap 15. Samenstelling 10 x rode bloedcel lysis buffer: Voor 100 ml: - 8,26 g NH4Cl - 1,19 g NaHCO3 - 200 µl EDTA (0,5 M ; pH 8) - Leng aan met gedestilleerd water tot 100 ml. - Pas de pH naar 7,3. - Haal doorheen een filter om te steriliseren. 15. Voeg een volume 1 x PBS toe (bijvoorbeeld 10 ml) en homogeniseer goed. 16. Tel de cellen door 20 µl van de gehomogeniseerde suspensie op een telkamertje te brengen. 17. Bereken hoeveel ml er nodig is van de gehomogeniseerde suspensie om pellets van 5 miljoen cellen te maken. Breng dit over in 1,5 ml eppendorfs. 18. Draai de eppendorfs af aan 1600 rpm gedurende 5 minuten op 4°C. 19. Neem het supernatans af. 20. Voor latere eiwitexperimenten: - Flash freeze de pellet in vloeibare stikstof. Voor latere RNA experimenten: - 700 µl Trizol (QIAGEN) toevoegen en flash freezen in vloeibare stikstof. IV Isoleren van cellen uit thymus, milt en lever 1. Offer een muis op door cervicale dislocatie. 2. Maak de huid nat met 70% ethanol. 3. Pin de muis vast op een foam plankje. 4. Maak een Y-vormige incisie. 5. Verwijder de thymus, milt en/of lever. 6. Plaats de weggenomen weefsels in ijskoude 1 x PBS in een 6-well plaat die op ijs gehouden wordt. 7. De weefsels worden door een cell strainer gehaald die zich op een 50 ml tube bevindt. De zeef wordt nog wat nagespoeld met 1 x PBS om eventuele restjes nog doorheen de zeef te duwen. 8. Deze suspensie wordt gecentrifugeerd aan 1200 rpm gedurende 5 minuten op 4°C. 9. Het supernatans wordt afgezogen. 10. Indien de pellet nog erg rood is, moet er rode bloedcel lysis buffer worden toegevoegd. Naargelang de grootte van de pellet wordt er een aantal ml toegevoegd en dit geheel wordt 5 minuten op kamertemperatuur gehouden. Voeg vervolgens in een 5x overmaat 1 x PBS toe om de lysis buffer te neutraliseren. Dit wordt 5 minuten gecentrifugeerd aan 1200 rpm op 4°C. Het supernatans moet worden afgenomen. Indien de pellet nu nog heel rood is, moet stap 14 herhaald worden. Indien dit niet zo is, kan er worden overgegaan naar stap 15. Samenstelling 10 x rode bloedcel lysis buffer: Voor 100 ml: - 8,26 g NH4Cl - 1,19 g NaHCO3 - 200 µl EDTA (0,5 M ; pH 8) - Leng aan met gedestilleerd water tot 100 ml. - Pas de pH naar 7,3. - Haal doorheen een filter om te steriliseren. 11. Voeg een volume 1 x PBS toe (bijvoorbeeld 10 ml) en homogeniseer goed. V 12. Tel de cellen door 20 µl van de gehomogeniseerde suspensie op een telkamertje te brengen. 13. Bereken hoeveel ml er nodig is van de gehomogeniseerde suspensie om pellets van 5 miljoen cellen te maken. Breng dit over in 1,5 ml eppendorfs. 14. Draai de eppendorfs af aan 1600 rpm gedurende 5 minuten op 4°C. 15. Neem het supernatans af. 16. Voor latere eiwitexperimenten: - Flash freeze de pellet in vloeibare stikstof. Voor latere RNA experimenten: - 700 µl Trizol (QIAGEN) toevoegen en flash freezen in vloeibare stikstof Bijlage 3: Protocol RNA isolatie Reagentia: - MiRNeasy mini kit (QIAGEN) - RNase- Free DNase set Voor starten: - Vooraleer de RWT en RPE buffer voor het eerst gebruikt worden moet het juiste volume absolute ethanol (100%) worden toegevoegd zoals aangeduid op de fles zodat een werkoplossing wordt bekomen. - De centrifuge moet gekoeld worden op 4°C. Startmateriaal: - De cellen: oogst de cellen en los de pellet op in 700 µl Qiazol. Homogeniseer goed. Vries in bij -80°C. Procedure: 1. Ontdooi de cellen in Qiazol en laat 5 minuten op kamertemperatuur staan. 2. Voor 1 staal: voeg 140 µl chloroform toe (in de trekkast). 3. Vortex tot de doorzichtige laag bovenaan komt te liggen. 4. De stalen worden 2 minuten bij kamertemperatuur gehouden. 5. De stalen worden 15 minuten gecentrifugeerd bij 4°C aan 12000g. Na deze centrifugatie moet de centrifuge opgewarmd worden naar kamertemperatuur. VI 6. Na centrifugatie is er een bovenste waterige fase die DNA en RNA bevat. Deze bovenste waterige fase moet in een nieuw epje worden overgebracht en op ijs worden bewaard. 7. Voeg 1,5 volume 100% EtOH toe en pipetteer goed op en neer. 8. Breng 700 µl van uw staal op een RNeasy spin kolom in een 2 ml collectie tube op kamertemperatuur. 9. Centrifugeer 15 seconden aan maximale snelheid. 10. Giet uw afval weg en breng de rest van uw staal op dezelfde kolom. 11. Centrifugeer 15 seconden aan maximale snelheid. 12. Giet uw afval weg. 13. Was de kolom met 350 µl RWT buffer en centrifugeer 15 seconden aan maximale snelheid. 14. Giet uw afval weg en voeg aan elk staal 80 µl DNase I toe. 15. Laat de stalen 15 minuten staan op kamertemperatuur. 16. Was de kolom met 350 µl RWT buffer en centrifugeer 15 seconden aan 13,2 rpm. 17. Gooi uw afval weg en breng 500 µl RPE op de kolom. 18. Centrifugeer 15 seconden aan 13,2 rpm. 19. Breng nogmaals 500 µl RPE op de kolom. Centrifugeer 2 minuten op 13,2 rpm. 20. Breng de kolom in een nieuwe 2 ml collectie tube en centrifugeer 5 minuten op volle snelheid. 21. Breng de kolom in een nieuw epje en elueer met DNase/RNase vrij water (Sigma-Aldrich). Voeg hiervoor 30 µl DNase/RNase vrij water toe. 22. Laat 1 minuut staan op kamertemperatuur en centrifugeer 1 minuut op maximale snelheid. 23. Verwijder de kolom en breng het epje op ijs. 24. Meet de concentratie met de Nanodrop® ND 1000 (Thermofisher Scientific). Bijlage 4: Protocol cDNA synthese De stalen dienen op ijs gehouden te worden. 1. Meet de RNA concentratie met de Nanodrop® ND 1000 (Thermofisher Scientific). 2. Bereken per staal het aantal µl RNA dat je nodig hebt om 500 ng RNA aan te maken. Leng dit aantal µl RNA aan met DNase/RNase vrij water (Sigma-Aldrich) tot 15 µl. VII 3. Voeg per staal 4 µl Iscript buffer en 1 µl Iscript enzym (iScript™ cDNA Synthesis Kit – Bio-Rad) toe. 4. Tik op de epjes en draai af. 5. Plaats de epjes in de MyCycler® Thermal Cycler (Bio-Rad) en stel volgend programma in: 42.0°C 30 min 85.0°C 5 min Sample volume = 20 µl Bijlage 5: Protocol qPCR qPCR mastermix en PCR programma Reagentia Sso Advanced SYBR™ Green Supermix (Bio-Rad) Forward Primer (5 µM) Reverse Primer (5 µM) Aantal 2,5 µl 0,25 µl 0,25 µl 384-well plaat (Bio-Rad) - Stap 1 2 3 4 5 6 3 µl mastermix 2 µl cDNA (2,5 ng/µl) Temperatuur 95°C 95°C 62°C 72°C 60-95°C 37°C Tijdsduur 2 minuten 5 seconden 30 seconden 1 seconde 0,11°C per seconde 3 minuten Opmerking Enzymactivatie Denaturatie Annealing/elongatie Herhaal stappen 2-4 gedurende 44 cycli Smeltcurve VIII Humane primersequenties Gen Primersequenties ECT2L Forward 5’-CCCTTCATCGGTTACTCATAG-3’ ECT2L Reverse 3’-TACTGACAGCCATAGGAACT-5’ ECT2L nieuwe primers exon 7/8 Forward 5’-GCCTCTCCCAGACTGTAAGG-3’ ECT2L nieuwe primers exon 7/8 Reverse 3’-CTTTGATAATAAAGGGTAGGAATGG-5’ ECT2L nieuwe primers exon 8/9 Forward 5’-GAATATTTAGCGATGGAGACAGC-3’ ECT2L nieuwe primers exon 8/9 Reverse 3’-TTCTTCAGTGGCCACATAGC-5’ HMBS Forward 5’-GCTGAAAGGGCTTTTCTGAG-3’ HMBS Reverse 3’-TGCCCATCTTTCATCACTGT-5’ TBP Forward 5’-CACGAACCACGGCACTGATT-3’ TBP Reverse 3’-TTTTCTTGCTGCCAGTCTGGAC-5’ YWHAZ Forward 5’-TAAATGGTCTGTCACCGTCT-3’ YWHAZ Reverse 3’-GGAAATACTCGGTAGGGTGT-5’ HPRT1 Forward 5’-TGACACTGGCAAAACAATGCA-3’ HPRT1 Reverse 3’-GGTCCTTTTCACCAGCAAGCT-5’ SDHA Forward 5'-TGGGAACAAGAGGGCATCTG-3' SDHA Reverse 5'-CCACCACTGCATCAAATTCATG-3' RPLT13A Reverse 5’- CCTGGAGGAGAAGAGGAAAGAGA-3’ RPLT13A Reverse 5’-TTGAGGACCTCTGTGTATTTGTCAA-3’ Muis primersequenties Gen Ect2l Forward Ect2l Reverse GAPDH Forward GAPDH Reverse Ubc Forward Ubc Reverse G6pdH Forward G6pdH Reverse HPRT1 Forward HPRT1 Reverse Hbb-γ Forward Hbb-γ Reverse Hba Forward Hba Reverse GFP Forward GFP Reverse Primersequenties 5’-TTCTGAGTGCTGCCAATATC-3’ 3’-CTGTAGTCTGTCTCGTAGGT-5’ 5’-CCCCAATGTGTCCGTCGTG-3’ 5’-GCCTGCTTCACCACCTTCT-3’ 5’-AGGTCAAACAGGAAGACAGAC-3’ 5’-TCACACCCAAGAACAACGACA-3’ 5’-ATGCAGAACCACCTCCT-3’ 5’-TTCAACACTTTGACCTTCTCA-3’ 5’-GGATTTGAATCACGTTTGTGT-3’ 5’-TGGCAACATCAACAGGACTC-3’ 5’-GGCCTGTGGAGTAAGGTCAA-3’ 5’-GTGCAGTTCACTGAGCTTGG-3’ 5’-TTGGCTAGCCACCACCCT-3’ 5’-CCAAGAGGTACAGGTGCA-3’ 5’-CAAGCAGAAGAACGGCATCA-3’ 5’-AGGTAGTGGTTGTCGGGCA-3’ IX Bijlage 6: Protocol cellyse 1. Maak de RIPA lysis buffer aan: - 40,5 ml water (Sigma-Aldrich) - 250 mg sodium deoxycholaat (DOC; Sigma-Aldrich) - 1,5 ml van een 5 M NaCl oplossing (Sigma-Aldrich) - 2,5 ml van een 1 M TrisHCl (pH 7,5) (Sigma-Aldrich) oplossing - 0,5 ml van een 10% SDS oplossing (Sigma-Aldrich) - 5 ml van een 10% NP-40 (Sigma-Aldrich) oplossing 2. Hoewel RIPA stabiel is gedurende 1 maand op 4°C, moeten de protease inhibitors pas toegevoegd worden net voor gebruikt. Eén Roche tablet is genoeg voor 10ml lysis buffer. De protease inhibitor kan dus meteen aan de lysis buffer worden toegevoegd of er kan een stockoplossing worden gemaakt door het tabletje in 1,5 volume water (SigmaAldrich) op te lossen en dit als een 7x stock te gebruiken. Deze stock kan meerdere weken bewaard worden op -20°C. 3. Dus: er wordt een geschikt volume van de protease inhibitor stockoplossing toegevoegd aan de lysis buffer in een 1:6 ratio (bijvoorbeeld 100 µl stockoplossing aan 600 µl RIPA). 4. De buffer moet gekoeld worden voordat deze wordt toegevoegd aan de cellen en elke volgende stap moet op ijs of 4°C worden uitgevoerd. 5. Laat de cel pellets ontdooien en voeg een 400 µl RIPA lysis buffer toe aan de cel pellets. Tijdens het toevoegen van de lysis buffer moet er goed op en neer worden gepipetteerd zodat alles goed gehomogeniseerd wordt. 6. Om meer complete cellyse te bekomen, worden de eppendorfs met het RIPA lysaat geroteerd gedurende 30 – 60 minuten op 4°C. 7. Centrifugeer de lysaten gedurende 10 minuten op 4°C aan 8000 g zodat het cellulair afval naar beneden valt. 8. Breng het heldere lysaat over naar voorgekoelde eppendorfs en gooi de eppendorfs met het cellulair afval weg. X Bijlage 7: Meten van eiwitconcentraties Benodigdheden: - Micro BCA™ Protein Assay Kit (Thermo Fisher) - Eiwitstalen - BSA eiwit standaard, reeds verdund naar 1 mg/ml (Sigma-Aldrich) - 96-well plaat - Seal voor plaat 1. Laad de BSA standaard (1 mg/ml) in kolom 1 en 2 van rijen A-F volgens onderstaand schema: 1 2 A 0 µl 0 µl B 2 µl 2 µl C 4 µl 4 µl D 6 µl 6 µl E 8 µl 8 µl F 10 µl 10 µl G / / H / / 2. Laad de stalen in triplicaat in de kolommen. Meestal wordt er 2 µl van elk staal geladen maar in principe kan er 2 – 10 µl geladen worden. 3. Maak de reagent mix aan. Per staal is er 200 µl reagent mix nodig. Voor 1 staal + 12 stalen voor de standaardreeks: 1 staal x 3 wells + 12 wells voor standaardcurve x 200 µl per well = 3 ml reagent mix Er wordt op 10% meer gerekend om te corrigeren voor pipetteerfouten dus er moet 3,3 ml reagent mix worden aangemaakt voor 1 staal. Om 3,3 ml reagent mix te maken, moet er 3,3 ml van reagent A en 66 µl (3,3 ml x 1000/50) van reagent B bij elkaar worden toegevoegd. Dit moet goed worden gemixt. XI 4. Voeg 200 µl reagent mix toe aan de wells met die het staal of de standaardreeks bevatten. 5. Verzegel de plaat met de seal en plaats dit geheel 30 minuten in de incubator bij 37°C. 6. Meet de absorbantie bij 560 nm met de GloMax® spectrofotometer (Promega) - Zet de GloMax® aan om de software op te starten. - Selecteer op het scherm: protocol volgende absorbantie volgende BCA proteïne assay volgende klaar. - Open de deur door op “deur” te klikken verwijder de seal en plaats de plaat in de machine (A1 moet in de rechtse bovenhoek zitten) klik start. - Geef een naam aan je bestand door op “edit” te klikken en klik op ok. - Wanneer de meting gedaan is, verschijnt het resultaat op het scherm. Bijlage 8: Western blot analyse Voorbereiding: - De lysaten moeten gedenatureerd worden vooraleer deze op de gel geladen kunnen worden. Hiervoor wordt een 5 x Laemli denaturatiebuffer aangereikt met β-mercaptoethanol en toegevoegd aan de stalen. De 5 x Laemli denaturatiebuffer moet uiteindelijk 1/5 verdund zijn en β-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich) 1/40. 5 x Laemli denaturatiebuffer: - 25 ml 10% SDS oplossing (Sigma-Aldrich) 21,25 ml 100% glycerol (Life technologies) 7,75 ml 1M TrisHCl pH 6,8 (Sigma-Aldrich) 0,0125 mg Bromofenol blauw (GE healthcare) Zoek naar het staal met de laagste concentratie. Per staal hebben we n µl nodig om te laden. Bereken hoeveel µg staal geladen zal worden voor het staal met de laagste concentratie: n µl x laagste concentratie staal = x µg wordt geladen voor dit staal. XII Van elk staal moet er evenveel geladen worden om de stalen onderling te kunnen vergelijken, dus x µg. Bereken dus hoeveel µl je van de andere stalen nodig hebt om x µg te laden: x µg / concentratie in µg/µl Bereken vervolgens met hoeveel water je moet aanlengen om 25 µl te bekomen. - De denaturatiemix wordt aan de stalen toegevoegd en deze worden gedurende 10 minuten op 95°C in een heat block geplaatst om te denatureren. SDS-PAGE - - Aanmaken van de running buffer: 100 ml 10 x Tris/glycine/SDS buffer (Bio-Rad) 900 ml gedestilleerd water Mix de running buffer door de maatbeker af te sluiten met een parafilm en enkele keer op en neer te schudden. - Neem de voorgegoten gels (10% Mini-Protean TGX Precast Gel – 30 µl of 50 µl BioRad) en open de folie. Vergeet de groene sticker onderaan de gel niet te verwijderen. - Plaats de gel aan de ene kant van de houder en de andere gel aan de andere kant. Bij een oneven aantal gels moet er langs de andere kant een plastieken buffer dam (Bio-Rad) worden geplaatst. - Vul de tank met running buffer. - Laad de stalen op de gels: 3 µl prestained marker (Bio-Rad) om het moleculair gewicht op de gel te visualiseren tijdens het lopen en 2 µl gebiotinyleerde merker (Cell-Signaling) om het moleculair gewicht tijdens het ontwikkelen van de blots te visualiseren. De gedenatureerde stalen (bijvoorbeeld 28 µl in 10% Mini-Protean TGX Precast Gel – 30 µl of 48 µl in 10% Mini-Protean TGX Precast Gel – 50 µl). - Loop de gels (100 V , 250 mA) gedurende 1 tot 2 uur tot het blauw front de onderkant van de gel bereikt. Transfer - Maak de transfer buffer aan: 100 ml 10 x Tris/Glycine buffer (Bio-Rad) XIII - 200 ml methanol (Thermo Fisher Scientific) 700 ml gedistilleerd water Mix de transfer buffer door de maatbeker af te sluiten met een parafilm en enkele keer op en neer te schudden. - Maak de blotting sandwich: Plaats de zwarte kant van de houder op de tafel. Week een sponsje in de transfer buffer en plaats op de zwarte kant van de houder. Rol over het sponsje om luchtbellen te vermijden. Week een Whatman papier (Bio-Rad) in transfer buffer en plaats op het zwarte sponsje. Rol over het Whatman papier om luchtbellen te vermijden. Verwijder de gel uit de houder en maak los uit de twee glazen platen. Week de gel in transfer buffer en plaats op het Whatman papier. Rol voorzichtig over de gel. Week een nitrocellulosemembraan (Bio-Rad) in de transfer buffer en plaats op de gel. Rol voorzichtig. Week een Whatman papier (Bio-Rad) in transfer buffer en plaats op de membraan. Rol over het Whatman papier om luchtbellen te vermijden. Week een sponsje in de transfer buffer en plaats op het Whatman papiertje. Rol over het sponsje om luchtbellen te vermijden. Sluit de houder en plaats in de cassette. Zorg dat de zwarte kant gericht is naar de zwarte kant van de houder. - Plaats een ijsblok voor de houder in de buffer tank en voeg de transfer buffer toe. - Blot gedurende 1 uur op 100 V en 250 mA. Immunoblotting - Haal de membraan uit de blotting sandwich en blok gedurende 1 uur in 5% melk/TBST. 10 x TBS 24,3 g Tris (MP Biomedicals) 87,75 g NaCl (VWR) 950 ml gedistilleerd water Voeg HCl (VWR) toe tot een pH van 7,4 wordt bereikt Voeg gedistilleerd water toe tot een totaalvolume voor 1 liter XIV 1 x TBST 100 ml 10 x TBS 900 ml gedistilleerd water 1 ml Tween-20 (Sigma-Aldrich) 5% melk/TBST 5 g melkpoeder (Nestlé) 100 ml TBST - Incubeer de blot met het primair antilichaam naar keuze opgelost in 5% melk/TBST in een gepaste verdunning gedurende overnacht op 4°C. ECT2L (Sigma-Aldrich): 1/500 ECT2L (LifeSpan BioSciences): 1/1000 ECT2L (Aviva Biology Systems): 1/1000 GFP (Cell Signaling): 1/1000 - Was de blot 3 x 5 minuten met TBST. - Incubeer de blot met het secundair antilichaam naar keuze opgelost in 5% melk/TBST in een gepaste verdunning gedurende 1 uur. Voeg eveneens een antilichaam voor biotine toe die zal toelaten om de gebiotinyleerde merker tijdens het ontwikkelen van de blots te visualiseren. ECT2L (Sigma-Aldrich): anti-konijn ECT2L (LifeSpan BioSciences): anti-konijn ECT2L (Aviva Biology Systems): anti-konijn GFP (Cell Signaling): anti-muis Anti-konijn (Cell Signaling): 1/50000 Anti-muis (Cell Signaling): 1/50000 Anti-biotine (Cell Signaling): 1/20000 - Was de blots 3 x 5 minuten met TBST. XV Visualisatie - Incubeer de blot met een luminol/enhancer buffer in een 1:1 ratio (Super Signal West Dura Extented Duration Substrate 200 ml – Thermo Fisher Scientific of Super Signal West Femto Maximum Sensitivity Substrate 200 ml – Thermo Fisher Scientific) gedurende 1 minuut. - Visualiseer met een UVP machine (Ultra Violet Products Ltd.). Kwantificatie met β-actine - Voeg het primair β-actine antilichaam (Cell-Signaling) toe in een 1/10000 verdunning in 5% melk/TBST gedurende 30 – 60 minuten. - Was de blots 3 x 5 minuten met TBST. - Voeg het secundair muis antilichaam (Cell Signaling) toe in een 1/50000 verdunning in 5% melk/TBST met eveneens het anti-biotine antilichaam (Cell Signaling) in een 1/20000 verdunning. Laat gedurende 30 – 60 minuten incuberen. - Was de blots 3 x 5 minuten met TBST. - Visualiseer de blots. Strippen van de blots - Incubeer de blots gedurende 15 minuten met stripping buffer. - Blokkeer de blots met 5% melk/TBST gedurende 1 uur. - Was de blots 3 x 5 minuten met TBST. - Incubeer de blot met het primair antilichaam naar keuze opgelost in 5% melk/TBST in een gepaste verdunning gedurende overnacht op 4°C. - Was de blots 3 x 5 minuten met TBST. - Incubeer de blot met het secundair antilichaam naar keuze opgelost in 5% melk/TBST in een gepaste verdunning gedurende 1 uur. Voeg eveneens een antilichaam voor biotine toe die zal toelaten op de gebiotinyleerde merker tijdens het ontwikkelen van de blots te visualiseren. - Was de blots 3 x 5 minuten met TBST. - Visualiseer de blots. XVI Bijlage 9: Protocol transfectie van HEK293TN cellen en fixatie op microscoopslides Transfectie van HEK293TN cellen 1. Ververs het medium een aantal uur voor de transfectie. 2. Maak de transfectie mix in een 15 ml tube. Voor 9 wells: - 2933 µl NaCl (Polyplus Transfection) - 7,5 µl ECT2L-GFP (Vectorbuilder) of ECT2L-3XFLAG (Vectorbuilder) - 60 µl JetPEI® (Polyplus Transfection) Voeg eerst 2933 µl NaCl toe. Vortex en draai de ECT2L-GFP vector af. Voeg 7,5 µl van de ECT2L-GFP toe aan de mix en vortex het geheel nog een keer. Voeg 60 µl JetPEI toe en meng door goed op de 15 ml tube te tikken. 3. Laat de transfectie mix 30 minuten incuberen op kamertemperatuur. 4. Voeg 300 µl druppelsgewijs toe aan de cellen. 5. Plaats gedurende 24 uur terug in de incubator en volg de getransfecteerde cellen op met de microscoop. Fixatie op microscoopslides 1. Neem het medium van de cellen voorzichtig af en was met 2 ml 1x PBS (Gibco Life Technologies). 2. Voeg 4% PFA (Sigma-Aldrich) toe onder de trekkast op de cellen. Dit fixeert de cellen op het draagglaasje. 3. Laat het geheel 15 minuten fixeren op kamertemperatuur. 4. Was de cellen 3 x 5 minuten met 1x PBS. 5. Voeg 1 druppel 0,5% Triton-X (Thermofisher Scientific) toe en laat 5 minuten permeabiliseren zodat DAPI in de kern kan. 6. Was de cellen 3 x 5 minuten met 1x PBS. 7. Voeg 8 µl – 10 µl VECTASHIELD® (Vectorlabs)+ DAPI (1 µg/ml) toe. 8. Monteer het draagglaasje op een coverslip. 9. Bewaar de microscoopslide in het donker bij 4°C. XVII Bijlage 10: LabChip resultaten voor genotypering van Ect2l muizen Kweek A 1 2 1 Controle Ect2l fl/fl Vav-iCre wild type 2 Controle Ect2l wild type Vav-iCre transgen Figuur A: Kweek A: LabChip resultaten voor Ect2l. LoxP_F en LoxP_R. Ect2l floxed geeft een bandje ter hoogte van 255 bp, terwijl Ect2l wild type een bandje ter hoogte van 194 bp geeft. 1 1 1 Controle Ect2l fl/fl FlpE transgen Figuur B: Kweek A: LabChip resultaten voor FlpE. FlpE geeft een bandje ter hoogte van 725 bp. De interne controle geeft een bandje ter hoogte van 324 bp. 1 2 1 Controle Ect2l fl/fl Vav-iCre wild type 2 Controle Ect2l wild type Vav-iCre transgen Figuur C: Kweek A: LabChipresultaten voor Vav-iCre. Vav-iCre geeft een bandje ter hoogte van 320 bp. XVIII Kweek B 1 2 1 Controle Ect2l fl/fl Vav-iCre wild type 2 Controle Ect2l wild type Vav-iCre transgen Figuur D: Kweek B: LabChip resultaten voor Ect2l. LoxP_F en LoxP_R. Ect2l floxed geeft een bandje ter hoogte van 255 bp, terwijl Ect2l wild type een bandje ter hoogte van 194 bp geeft. 1 1 Controle Ect2l fl/fl FlpE transgen Figuur E: Kweek B: LabChip resultaten voor FlpE. FlpE geeft een bandje ter hoogte van 725 bp. De interne controle geeft een bandje ter hoogte van 324 bp. 1 2 1 Controle Ect2l fl/fl Vav-iCre wild type 2 Controle Ect2l wild type Vav-iCre transgen Figuur F: Kweek B: LabChipresultaten voor Vav-iCre. Vav-iCre geeft een bandje ter hoogte van 320 bp. XIX Kweek C 1 2 1 Controle Ect2l fl/fl Vav-iCre wild type 2 Controle Ect2l wild type Vav-iCre transgen Figuur G: Kweek C: LabChip resultaten voor Ect2l. LoxP_F en LoxP_R. Ect2l floxed geeft een bandje ter hoogte van 255 bp, terwijl Ect2l wild type een bandje ter hoogte van 194 bp geeft. 1 1 Controle Ect2l fl/fl FlpE transgen Figuur H: Kweek C: LabChip resultaten voor FlpE. FlpE geeft een bandje ter hoogte van 725 bp. De interne controle geeft een bandje ter hoogte van 324 bp. 1 2 1 Controle Ect2l fl/fl Vav-iCre wild type 2 Controle Ect2l wild type Vav-iCre transgen Figuur I: Kweek C: LabChip resultaten voor Vav-iCre. Vav-iCre geeft een bandje ter hoogte van 320 bp. XX Kweek D 1 2 1 Controle Ect2l fl/fl Vav-iCre wild type 2 Controle Ect2l wild type Vav-iCre transgen Figuur J: Kweek D: LabChip resultaten voor Ect2l. LoxP_F en LoxP_R. Ect2l floxed geeft een bandje ter hoogte van 255 bp, terwijl het wild type een bandje van 194 bp geeft. Er kan met deze primers niet bevestigd worden of er Ect2l excisie heeft plaatsgevonden. Men kan enkel observeren of het Ect2l fl/fl, Ect2l fl/+ of Ect2l +/+ is en niet of het Ect2l fl/- of Ect2l +/- is. 1 2 1 Controle Ect2l fl/fl Vav-iCre wild type 2 Controle Ect2l wild type Vav-iCre transgen Figuur K: Kweek D: LabChip resultaten voor Vav-iCre. Vav-iCre geeft een bandje ter hoogte van 320 bp. 1 2 1 Controle Ect2l fl/fl Vav-iCre wild type 2 Controle Ect2l wild type Vav-iCre transgen Figuur L: Kweek D: Genotypering met 3 primers. De combinatie LoxP_F en Neo_Del_R geeft 1341 bp voor een wild type Ect2l, 175 bp indien er excisie heeft plaatsgevonden en geen bandje indien Ect2l floxed is. De combinatie LoxP_F en Control_R geeft 222 bp voor het wild type en 283 bp voor floxed Ect2l. XXI Kweek E 1 2 1 Controle Ect2l fl/fl Vav-iCre wild type 2 Controle Ect2l wild type Vav-iCre transgen Figuur M: Kweek E: LabChip resultaten voor Ect2l. LoxP_F en LoxP_R. Ect2l floxed geeft een bandje ter hoogte van 255 bp, terwijl het wild type een bandje van 194 bp geeft. Er kan met deze primers niet bevestigd worden of er Ect2l excisie heeft plaatsgevonden. Men kan enkel observeren of het Ect2l fl/fl, Ect2l fl/+ of Ect2l +/+ is en niet of het Ect2l fl/- of Ect2l +/- is. 1 2 1 Controle Ect2l fl/fl Vav-iCre wild type 2 Controle Ect2l wild type Vav-iCre transgen Figuur N: Kweek E: LabChip resultaten voor Vav-iCre. Vav-iCre geeft een bandje ter hoogte van 320 bp. 1 2 1 Controle Ect2l fl/fl Vav-iCre wild type 2 Controle Ect2l wild type Vav-iCre transgen Figuur O: Kweek D: Genotypering met 3 primers. De combinatie LoxP_F en Neo_Del_R geeft 1341 bp voor een wild type Ect2l, 175 bp indien er excisie heeft plaatsgevonden en geen bandje indien Ect2l floxed is. De combinatie LoxP_F en Control_R geeft 222 bp voor het wild type en 283 bp voor floxed Ect2l. XXII Kweek F 1 2 1 Controle Ect2l fl/fl Vav-iCre wild type 2 Controle Ect2l wild type Vav-iCre transgen Figuur P: Kweek F: LabChip resultaten voor Ect2l. LoxP_F en LoxP_R. Ect2l floxed geeft een bandje ter hoogte van 255 bp, terwijl het wild type een bandje van 194 bp geeft. Er kan met deze primers niet bevestigd worden of er Ect2l excisie heeft plaatsgevonden. Men kan enkel observeren of het Ect2l fl/fl, Ect2l fl/+ of Ect2l +/+ is en niet of het Ect2l fl/- of Ect2l +/- is. 1 2 1 Controle Ect2l fl/fl Vav-iCre wild type 2 Controle Ect2l wild type Vav-iCre transgen Figuur Q: Kweek F: LabChip resultaten voor Vav-iCre. Vav-iCre geeft een bandje ter hoogte van 320 bp. 1 2 1 Controle Ect2l fl/fl Vav-iCre wild type 2 Controle Ect2l wild type Vav-iCre transgen Figuur R: Kweek D: Genotypering met 3 primers. De combinatie LoxP_F en Neo_Del_R geeft 1341 bp voor een wild type Ect2l, 175 bp indien er excisie heeft plaatsgevonden en geen bandje indien Ect2l floxed is. De combinatie LoxP_F en Control_R geeft 222 bp voor het wild type en 283 bp voor floxed Ect2l. XXIII Kweek G 1 2 1 Controle Ect2l fl/fl 2 Controle Ect2l wild type Figuur S: Kweek G: LabChip resultaten voor Ect2l. LoxP_F en LoxP_R. Ect2l floxed geeft een bandje ter hoogte van 255 bp, terwijl Ect2l wild type een bandje ter hoogte van 194 bp geeft. Er kan met deze primers niet bevestigd worden of er Ect2l excisie heeft plaatsgevonden. Men kan enkel observeren of het Ect2l fl/fl, Ect2l fl/+ of Ect2l +/+ is en niet of het Ect2l fl/- of Ect2l +/- is. 1 2 1 Controle FlpE transgen 2 Controle FlpE wild type Figuur T: Kweek G: LabChip resultaten voor FlpE. FlpE geeft een bandje ter hoogte van 725 bp. De interne controle geeft een bandje ter hoogte van 324 bp. 1 2 1 Controle Vav-iCre transgen 2 Controle Vav-iCre wild type Figuur U: Kweek G: LabChip resultaten voor Vav-iCre. Vav-iCre geeft een bandje ter hoogte van 320 bp. XXIV 1 2 1 Controle Ect2l fl/fl 2 Controle Ect2l wild type Figuur V: Kweek G: Genotypering met 3 primers. De combinatie LoxP_F en Neo_Del_R geeft 1341 bp voor een wild type Ect2l, 175 bp indien er excisie van Ect2l heeft plaatsgevonden en geen bandje indien Ect2l floxed is. De combinatie LoxP_F en Control_R geeft 222 bp voor het wild type en 283 bp voor floxed Ect2l. Kweek H Positieve controle Ect2l fl/fl Negatieve controle Ect2l wild type Figuur W: Kweek H: LabChip resultaten voor Ect2l. LoxP_F en LoxP_R. Ect2l floxed geeft een bandje ter hoogte van 255 bp, terwijl Ect2l wild type een bandje ter hoogte van 194 bp geeft. Er kan met deze primers niet bevestigd worden of er Ect2l excisie heeft plaatsgevonden. Men kan enkel observeren of het Ect2l fl/fl, Ect2l fl/+ of Ect2l +/+ is en niet of het Ect2l fl/- of Ect2l +/- is. XXV Positieve controle FlpE transgen Negatieve controle FlpE wild type Figuur X: Kweek H: LabChip resultaten voor FlpE. FlpE geeft een bandje ter hoogte van 725 bp. De interne controle geeft een bandje ter hoogte van 324 bp. Positieve controle Vav-iCre wild type Negatieve controle Vav-iCre transgen Figuur Y: Kweek H: LabChip resultaten voor Vav-iCre. Vav-iCre geeft een bandje ter hoogte van 320 bp. Positieve controle Ect2l fl/fl Negatieve controle Ect2l wild type Figuur Z: Kweek H: Genotypering met 3 primers. De combinatie LoxP_F en Neo_Del_R geeft 1341 bp voor een wild type Ect2l, 175 bp indien er excisie van Ect2l heeft plaatsgevonden en geen bandje indien Ect2l floxed is. De combinatie LoxP_F en Control_R geeft 222 bp voor het wild type en 283 bp voor floxed Ect2l. XXVI Bijlage 11: ECT2L expressie in T-cellen gedurende verschillende fasen van de T-cel ontwikkeling ECT2L expressie in T-cellen gedurende verschillende fasen van de T-cel ontwikkeling 0,40 0,35 0,30 0,20 0,15 0,10 0,05 CB2 CD34+lin- g/d 3+ 1- g/d 3+ 1+ SP 8+ 3+ SP 4+ 3+ DP 4+ 8+ 3+ DP 4+ 8+ 3- CD4+ 34/3/8- 28+ CD4+ 34/3/8- 28- CD34+ 4+ CD34+ 4- 1+ 0,00 CD34+ 4- 1- FPKM waarden 0,25 T-cel ontwikkelingsstadia Figuur i: ECT2L expressie in T-cellen gedurende verschillende fasen van de T-cel ontwikkeling. Expressie van ECT2L is laag in alle verschillende differentiatiestadia. Bijlage 12: RNA sequentie data ECT2L in T-ALL cellijnen RNA sequentie data ECT2L in T-ALL cellijnen 1,2 1 0,6 0,4 T-ALL cellijnen TALL-1 SUP-T1 SUP-T13 RPMI-8402 MOLT-4 MOLT-14 LOUCY KE-37 KARPAS-45 JURKAT HSB-2 HPB-ALL DND41 ALLSIL 0 PF-382 0,2 P12ICHIK… FPKM waarden 0,8 Figuur ii: RNA sequentie data van ECT2L in T-ALL cellijnen. De expressie van ECT2L in deze T-ALL cellijnen lijkt op het eerste zicht zeer laag. XXVII
