Medische Celbiologie 2013 Niek Groot 1 College 1 Tight junctions

Medische Celbiologie 2013
Niek Groot
College 1
Tight junctions (apicaal)
Tight junctions, or zonula occludens, are the closely associated areas of
two cells whose membranes join together forming a virtually impermeable barrier to fluid. It
is a type of junctional complex present only in vertebrates. De zonula occludens heeft drie
vitale functies:



Ze houden cellen bij elkaar.
Barriere formatie
o Binnen - buiten
o Apicaal – basolateraal (fence)
Spelen een rol in intracellulaire signalering
De functie van tight junctions is te meten m.b.v.
elektrische weestand of fluorescentie. Tight
junctions bestaan uit een aantal belangrijke eiwitten,
namelijk:




JAMs
Claudines
Occludines
ZO-eiwitten
Adherens junctions (lateraal)
De zonula adhaerens of de intermediate junction is een bepaald type van hechte verbinding
tussen verschillende cellen in een weefsel. In deze verbinding spelen de
zogenaamde cadherines een belangrijke rol. Deze transmembranale proteïnen vormen een
sterke specifieke binding (homodimeer) met de cadherines van de aanliggende cellen. Aan de
cytoplasmatische zijde van de celmembraan zijn de cadherines via een aantal adaptoreiwitten verbonden met de actinefilamenten van het cytoskelet.
Functie
 Adhesie tussen cellen (binnen – buiten)
 Stevigheid door binding cytoskelet (meestal actine, maar sommigen ook microtubuli)
Adherens junctions ontstaat doordat er een cadherin dimeer ontstaat onder de invloed van
calcium. Deze cadherin dimeer kan een binding aangaan met een gelijk molecuul op het
membraan van een andere cel. Belangrijke eiwitten:



E-Cadherin
N-Cadherin
β-catenin
1
Medische Celbiologie 2013
Niek Groot
Desmosomen (lateraal)
Een desmosoom is een structuur in de celmembraan van dieren die er voor zorgt dat cellen
aan elkaar kunnen hechten. Desmosomen komen tevens voor in de zogenaamde
intercalairschijven tussen hartspiercellen van de mens, en tussen de cellen met microvilli in
de dunne darm.
Een desmosoom bestaat uit cadherine-eiwitten die door het celmembraan heensteken (een
zogenaamd transmembraaneiwit) en eiwitten die aan keratinefilamenten (IF, intermediate
filaments) binden. Functie desmosomen:



Adhesie tussen cellen
o Binnen – buiten
Stevigheid door binding cytoskelet
o Intermediate filaments
Zorgt voor stevigheid in cel
Er zijn enkele eiwitten betrokken bij de formatie van een desmosoom:





Desmocollin
Desmogleïn
Plakoglobin
Plakophillin
Desmoplakin (bindt uiteindelijk de intermediate filaments)
Een gap junction of nexus is een kanaal dat twee elektrisch actieve cellen met elkaar verbindt.
Met hun diameter van 1.2 tot 2 nanometer kunnen gap junctions kleine ionen en moleculen
doorlaten (ionen, voedingsstoffen, signaalmoleculen, peptiden). Gap junctions komen voor in
spieren die in staat zijn zelfstandig gecoördineerd samen te trekken, zoals de hartspier, de
wanden van bloedvaten en de uterus. Ze zijn cruciaal voor het functioneren van deze spieren
omdat ze elektrische stroom in de vorm van kalium- of calciumionen tussen cellen doorlaten
en zo het synchroniseren van actiepotentialen mogelijk maken. Daarnaast zijn ze gevonden in
elektrische synapsen en in de retina.
Een gap junction bestaat uit twee halve kanalen, de zogeheten connexons, die elk weer uit 6
connexines bestaan.
2
Medische Celbiologie 2013
Niek Groot
Functie van gap-junctions





Electrische synchronisatie
Energie metabolisme
Antigen presentatie
Wondheling
Groeicontrole
Wanneer de connexons van twee cellen elkaar ontmoeten vormen ze samen een gap junction.
Merk ook in de afbeelding hiernaast op dat ZO-1 en ZO-2 eiwitten betrokken zijn bij de
vorming van gap-junctions en dat gap junctions microtubuli kunnen binden.
College 2
Impermeable cell monolayers (tight junctions, adherens junctions, desmosomes)



Physically separate distinct environments
Protects the body against potentially hostile environment
Allow regulated exchange of molecules with environments
Inflammatoiry bowel disease (IBD)
A group of inflammatory conditions of the colon and small intestine. The major types of IBD
are Crohn's disease and ulcerative colitis. IBD leads to diarrhea, which can be attributed to
epithelial barrier dysfunction (leaky gut  loss of fluid). Tight junctions spelen de
belangrijkste rol wanneer het aankomt op impermeabiliteit.
3
Medische Celbiologie 2013
Niek Groot
Kleine bacterie passeert darmepitheel 
Immuunreactie  TNF alfa bindt aan
basale kant van het darmepitheel 
Myosine light chain kinase fosforyleert de
myosine light chain  contractie
cytoskelet  nog grotere ruimten tussen
epitheelcellen  vicious circle
Sommige tight junctions/adherens junctions
worden gebruikt door infectious agents als
een receptor, wat er vervolgens voor zorgt
dat de junction zal worden opgeruimd of
afgebroken.
College 3
Contact inhibitie
Normal somatic cells when grown in culture will become growth inhibited when they
encounter another cell. Confluence houdt in dat de totale hoeveelheid cellen gelijk blijft door
het doodgaan en het delen van cellen  vorming monolayer. Cancer cellen stoppen niet met
delen wanneer confluence is bereikt  klompvorming cellen (focus). Wanneer gezonde
cellen worden weggeschrapt met bijvoorbeeld een naald zullen beide kanten weer richting
elkaar groeien totdat de ‘wond’ weer gedicht is.
verschillende cel-cel junctions hebben gemeenschappelijke eiwitten (junctional membrane
proteins). Deze spelen wellicht een rol in contact inhibitie. Zo kan ZO-1 het eiwit ZONAB
binden, wat mogelijk weer invloed heeft op transcriptie.
Er zijn 3 type signaleringsmogelijkheden:



Magnetic bar
Crosstalk (translocatie)
Cleavage
Signalering door magnetic bar function
Hierbij is er een correlatie tussen ZONAB en celaggregatie. Wanneer ZONAB minder tot
expressie komt, zal er minder proliferatie optreden. Daarnaast is het zo dat wanneer er meer
ZO-1 tot expressie wordt gebracht, er minder proliferatie zal optreden. Je kunt dus zeggen dat
ZO-1 een soort magneet voor ZONAB is.
4
Medische Celbiologie 2013
Niek Groot
Signalering crosstalk (trans?)locatie
Dit een type Wnt signalering waarbij stabiel b-catenine
als transcriptiefactor wordt gebruikt. Hierbij migreert
ongefosforyleerd b-catenine naar de nucleus, waar het
bindt aan LEF-1/TCF, zodat Groucho loslaat, zodat de
transcriptie van Wnt-responsive genes kan beginnen.
Mogelijk vindt er cross-talk plaats tussen adherens
junctions en Wnt signalering, maar dit is controversieel.
Mogelijk spelen desmosomen ook een rol in
signaleringsprocessen. Het eiwit Pg kan namelijk net als
b-catenine. Cel-cel junctions zijn een soort magneet voor
transcriptie (co) factoren. Wanneer cel-cel contacten
verloren gaan, gaat ook de magneet verloren, wat de
vanzelfsprekende consequenties heeft.
Signalering door cleavage (delta/notch)
Delta op de ene cel bindt met de notch recepto op de
andere cel. Als een gevolg hiervan gaat de staart van
notch de kern in  transcriptiefactor. EpCAM (epithelial
cell adhesion molecule) is een transmembraan
glycoproteine wat hoog tot expressie wordt gebracht in
carcinomen en minder in normaal epitheel.
5
Medische Celbiologie 2013
Niek Groot
Voor veel cadherines is er evidentie dat het cytoplasmatische deel als transcriptiefactor kan
functioneren. Hier zijn veel proteases bij betrokken, die geblokkeerd moeten worden voor
onderzoek.
Wanneer er een mutatie in EpCAM wordt aangebracht (zoals voorkomt bij Congenital tufting
enteropathy, CTE, een erfelijke aandoening). Zullen er symptomen als chronische diarree en
tufts (soort klontering van epitheelcellen). Er zijn 8 mutaties van het EpCAM gen bekend,
welke allemaal tot dezelfde ziekte leiden.
Conclusie:



EpCAM is essential for the normal development of the intestinal epithelium
All epcam mutations identified in CTE patients prevent EpCAM from localizing at
the cell surface
EpCAM needs to be localized at the plasma membrane for proper function
College 4
Cell polarity
Epithelial cells adhere to one another through tight junctions, desmosomes and adherens
junctions, forming sheets of cells that line the surface of the animal body and internal cavities
(e.g., digestive tract and circulatory system). These cells have an apical-basal polarity defined
by the apical membrane facing the outside surface of the body, or the lumen of internal
cavities, and thebasolateral membrane oriented away from the lumen. The basolateral
membrane refers to both the lateral membrane where cell-cell junctions connect neighboring
cells and to the basal membrane where cells are attached to the basement membrane, a thin
sheet of extracellular matrix proteins that separates the epithelial sheet from underlying cells
and connective tissue.
6
Medische Celbiologie 2013
Niek Groot
Cell surface polarity is critical for the functioning of epithelial cells.
Het golgi-apparaat draagt bij aan de polariteit van (epitheel) cellen. Het maakt daarbij
onderscheid tussen apicale en basale vesicles door bepaalde eiwitten of “sorting signals” aan
de vesicles te binden (soort postzegel).
Calcium cation depletion (EGTA) leads to loss of tight junctions and randomization of apical
and basolateral plasma membrane components. Lipids in the outer leaflet of the apical or
basolateral surface domain do not diffuse to the other surface domain  intramembraneous
fence (tight junctions).
Vervolgens wou men kijken welk eiwit belangrijk is voor een cel om te differentiëren in
gepolariseerde epitheelcellen  K.O. muis.





Occludin-deficient embryonic stem cells can differentiate into polarized epithelial
cells bearing tight junctions.
Claudin-deficient is lasting te bepalen omdat er tientallen soorten claudins zijn.
ZO-1-deficient stem cells can differentiate in epithelial cells expressing tight
junctions, adherens junctions and cell polarity
ZO-3 deficient stem cells can differentiate in epithelial cells expressing cell-cell
junctions.
ZO-1/2 deficient stem cells can differentiate into polarized epithelial cells, except for
a complete lack of tight-junctions (verdwijnen transepitheliale weerstand).
Conclusie: Tight junctions may not act as an intramembraneous fence to restrict the polarized
distribution of proteins per se.
Vervolgens vroeg men zich af of adherens junctions misschien een rol spelen in cel-polariteit.
 K.O. muis.

E-cadherin and b-catenin deficient cells show polarity and protein trafficking.
Conclusie: Both tight and adherens junctions may not act as an intramembraneous fence to
restrict the polarized distribution of proteins per se.
Vervolgens vroeg men zich af of cel-cel adhesie überhaupt wel essentieel is voor celpolariteit.

Complete polarization of single intestinal epithelial cells
It thus appears that cell-cell adhesion may not be required for establishing apical-basolateral
plasma membrane polarity. But what about lipids? Is there another type of intramembraneous
fence one that does not involve cell-cell junctions?
7
Medische Celbiologie 2013
Niek Groot
Fact remains that destruction of cell-cell junctions
randomization of plasma membrane domain
components. Involvement of cell-cell junctions/
adhesion other than as intramembraneous fences?

Segregation of receptor and ligand regulates
activation of epithelial growth factor receptor
Conclusies




Fact remains that destruction of cell-cell junctions randomization of plasma
membrane domain components
Involvement of cell-cell junctions/ adhesion other than as intramembraneous fences?
Cell-cell junctions as separators of extracellular environments
Cell-cell adhesion may not be essential for the establishment of cell surface polarity
but, once established, cells may become dependent on cell-cell adhesion to maintain
surface polarity and restrict proliferation.
College 5
Er is een genetische component betrokken bij ontwikkeling van zowel COPD als astma en
gevoeligheid voor schadelijke prikkels van buiten af als rook en allergenen. Men denkt dat
epitheelgenen een belangrijke rol spelen in de ontwikkeling van aandoeningen als astma. Om
dit te testen heeft met een celkweek van één cellaag dik gemaakt, waardoor deze cellen na
blootstelling aan lucht zullen differentiëren in mucosa- en epitheelcellen. Deze differentiatie
vindt pas plaats bij goede cel-cel contacten.
8
Medische Celbiologie 2013
Niek Groot
Onderzoek heeft uitgewezen dat astmaepitheel erg gevoelig is voor huisstofmijt. Huisstofmijt
bevat namelijk proteolytische enzymen. Het bleek dat astmapatienten een verminderde Ecadherine expressie hadden nadat zij werden blootgesteld aan huisstofmijt.
De ECIS (weerstand meten in welletjes) toonde aan dat de weerstand in de welletjes toeneemt
wanneer er meer cel-cel contacten ontstaan. In de welletjes met E-cadherin K.O. cellen werd
een lagere weerstand geconstateerd. Het blijkt dus dat E-cadherine aan de epithelial growth
factor receptor (EGFR) kan binden, waardoor de celgroei geremd zal worden, de cel-cel
adhesie zwakker zal zijn en de Th2 cytokineproductie verhoogd zal zijn. Verhoogde Th2
cytokineproductie  inflammatie.
Daarnaast was er een onderzoek gedaan naar het effect van sigarettenrook op de expressie
van ZO-1. Het bleek dat sigarettenrook de expressie van ZO1 verminderde in 16HBE
(epitheliale E-cadherin K.O. cellijn) cellen.
Behandeling met corticosteroiden leidt tot verbetering in longfunctie bij COPD. Deze
verbetering in longfunctie gaat gepaard met de verhoogde expressie van genen betrokken bij
epitheel junctions en barriere functie door corticosteroiden.
College 6
Zoals eerder vermeld kunnen epitheelcellen zogenaamde cel-cel junctions vormen, waaronder
desmosomen. Nu is het zo dat myocyten in het hart net als epitheelcellen desmosmen kunnen
vormen. Een aantal eiwitten die hiervoor gebruikt worden zijn hiervoor hetzelfde, maar niet
allemaal.
Dsp = desmoplakine, PG = plakoglobine, Plectin, Dsg = desmogleine, Dsc = desmocollin, PP
= plakophiline
9
Medische Celbiologie 2013
Niek Groot
Zoals je in de bovenstaande afbeelding kunt zien zijn er een aantal overeenkomstige, maar
ook een aantal verschillende eiwitten te onderscheiden.


Epidermis
o Dsg1 en Dsg3
o Dsc1 en Dsc3
o PP1 en PP3
Myocard
o Dsg2
o Dsc2
o PP2
Verder zijn plakoglobin, desmoplakin en plectin gelijk. Wanneer er mutaties optreden in één
van deze eiwitten zullen er dus niet alleen in het hart of in de huid problemen, maar in beiden.
De aandoeningen die hierdoor ontstaan noemt men cardiocutaneous desmosome diseases.
Bij het syndroom van carvajal is er een mutatie opgetreden in het desmoplakin, dat zowel in
de huid als het hart voorkomt.
Lethal acantholytic epidermolysis bullosa
Dit is een aandoening waarbij een mutatie in één van de eiwitten betrokken bij de formatie
van een desmosoom is ontstaan. Toen er een aantal jaar geleden een baby werd geboren
waarbij de huid losliet ging men opzoek naar een mogelijke verklaring. Er waren op het
eerste gezicht geen afwijkingen zichtbaar in het
plakophilin, plakoglobin en desmoplakin. EM
opnames lieten zien dat de desmosoom er
normaal uitzag, maar dat het geen IF kon
binden (zie afbeelding hiernaast). Wat bleek
was dat de fluorescente AB’s gebruikt voor het
kleuren van desmoplakin alleen het eerste deel
van het desmoplakin bonden (N-terminus). Het
kindje had een mutatie aan de C-terminus kant
van het desmoplakin.
Pemphigus
Pemphigus of Pemphigus vulgaris is een ernstige auto-immuunziekte die zich vooral situeert
aan de mond in de vorm van blazen, bloedingen en korsten op de lippen en in de mondholte.
Pemphigus is een auto-immuunziekte. De oorzaak is het produceren vanantilichamen (IgG)
door het lichaam die gericht zijn tegen zichzelf, namelijk tegen desmogleïne (Dsg) 1 of 3 (of
beiden), dat verwerkt zit in de desmosomen die de huidcellen in het stratum spinosum (een
huidlaag vlak boven de basale laag, dat de onderste laag is in de huid) bij elkaar houden.
Deze bruggen tussen deze cellen worden dus afgebroken (=acantholyse), zodoende dat de
stevigheid en de samenhang van de huid verstoord is.
10
Medische Celbiologie 2013
Niek Groot
College 7
MS
Multiple sclerosis (MS), also known as disseminated sclerosis or encephalomyelitis
disseminata, is a inflammatory disease in which myelin sheaths around axons of the brain and
spinal cord are damaged, leading to loss of myelin and scarring. The cause is not clear, but
the underlying mechanism is thought to be either destruction by the immune system or failure
of the myelin-producing cells.




Meest voorkomende oorzaak neurologische handicap bij jonge mensen
Beginleeftijd meestal 20-40 jaar
Vrouwen: mannen = 2:1
Prevalentie 1/1000, dus ca. 16.000 in Nederland
Wanneer er een witte vlek op een MRI-afbeelding van de hersenen verschijnt kan dit duiden
op MS. MS is een ziekte van het centrale zenuwstelsel, wat waarschijnlijk wordt veroorzaakt
door een immuunstoornis van Th1 en Th17 cellen. Deze immuunrespons tast myeline
scheden aan (witte stof). Uiteindelijk kan dit leiden tot celverlies en axonverlies. De oorzaak
is niet bekend, maar men denkt aan virussen of genetische factoren.
Several subtypes, or patterns of progression, have been described. Subtypes use the past
course of the disease in an attempt to predict the future course. They are important not only
for prognosis but also for therapeutic decisions. In 1996 the United States National Multiple
Sclerosis Society standardized four clinical course.
1.
2.
3.
4.
relapsing remitting,
secondary progressive,
primary progressive, and
progressive relapsing.
11
Medische Celbiologie 2013
Niek Groot
Na verloop van tijd zal er wel een partieel herstel van de geleiding van de zenuw optreden
omdat de geleiding wordt hersteld doordat de dichtheid van de natriumkanalen zal toenemen.
Daarnaast zullen axonen geremyeliniseerd worden door oligodendrocyten, maar het zal nooit
meer precies worden zoals het was (partiele remyelinisatie). Deze plekken zullen dus iets
minder wit zijn dan de plekken waar acute demyelinisatie optreedt.
EAE staat voor experimental autoimmune encephalitis. Hierbij wordt er een myeline eiwit
geinjecteerd, waardoor CD4+ anti-myeline T cellen ontstaan. Deze cellen zorgen uiteindelijk
voor een inflammatoire demyelinatie in het CZS, wat dus lijkt op MS.
In de bovenstaande afbeelding spreekt men over de secundair progressieve vorm van MS. De
relapsing-remitting vorm van MS gaat vaak over in de secundair progressieve vorm.
Medicijnen werken voornamelijk in de relapsing-remitting vorm. Tijdens de secundair (ook
primair)progressieve vorm kan er axonale schade ontstaan. Deze vorm is dus
neurodegeneratief.
MS kan leiden tot zowel motorische als sensorische manifestaties. Beide symptomen zijn
afhankelijk van de lokalisatie van de ontstekingsreactie in de hersenen.
Diagnose



MRI: T2 of Flair opnames
Liquor: Ig G index, eiwitspectrum
Evoked potentials: VEP, SSEP
12
Medische Celbiologie 2013
Niek Groot
Behandeling ter voorkoming


Interferon-β
o 3 soorten
o Injecties sc of im
o verminderT aantal schubs met 1/3
o werkzaam bij RR vorm
Copaxon
o Sc injectie elke dag
o Werkzaam bij RR vorm
o Vermindert aantal schubs (terugvallen) met 1/3
In de behandeling van patiënten met MS zijn verschillende aspecten te onderscheiden:
aangezien men de precieze oorzaak van MS niet kent, is de behandeling van de ziekte met
name gericht op het remmen van de progressie en het behandelen van de symptomen die de
ziekte veroorzaakt.
Bij de behandeling van exacerbaties hebben corticosteroïden een belangrijke plaats. Het
toedienen van methylprednisolon (500mg per dag gedurende drie of vijf dagen) intraveneus
kan afhankelijk van de symptomen bij de exacerbatie een positief effect hebben. De
exacerbatie herstelt sneller, terwijl de bijwerkingen van de behandeling vrij gering zijn bij
deze slechts enkele dagen durende behandeling. Overigens is het niet noodzakelijk om iedere
exacerbatie op deze manier te behandelen; het is vaak aan te raden om enkele dagen aan te
zien of er snel een spontane remissie optreedt.
13
Medische Celbiologie 2013
Niek Groot
College 8
Verloop van MS
Je kunt het verloop van MS in verschillende fasen onderscheiden. Ten eerste treedt er een
(auto) immuunreactie op. Dit wordt gevolgd door een demyelinisatie door oligodendrocyten.
Eerst zal er weer remyelinisatie optreden, maar dit zal op een gegeven moment falen,
waardoor na verloop van tijd een beschadiging van axonen (degeneratie) optreedt. Het
herstel is afhankelijk van:



De mate van de ontstekingsreactie
Remyelinisatie
Axonoverleving
Zoals al eerder vermeld is de behandeling gebaseerd op immuunmodulatie (IFN bèta) en op
immuunsuppressie (prednisolon). Het is echter nog niet mogelijk om remyelinisatie te
induceren.
Remyelination is the process in which entire myelin sheaths are restored to demyelinated
axons, reinstating saltatory conduction and resolving functional deficits.
Het demyelinisatieproces kan beide kanten op werken. Als er oligodendrocyten (die meerdere
axonen myeliniseren) sterven, zal er demyelinisatie optreden. Het omgekeerde kan ook:
Wanneer het myeline kapot gaat, zal de bijbehorende oligodendrocyt ook steren.
Onthouden: Remyelinisatie  steeds minder myeline
Je kunt remyelinisatie onderdelen in 4 stappen. Ten eerste is er nog niks aan de hand. Ten
tweede treedt er demyelinisatie op, waardoor OPC (oligendrocyte proginator cells)
geactiveerd worden. Daarnaast zullen microglial cells (macrofagen van het CNS) de
overgebleven stukjes myeline opruimen. Ten derde zal er OPC recruitment optreden (wat
bestaat uit proliferatie en migratie). Tenslotte zal er daadwerkelijke differentiatie optreden,
waarbij de OPC een interactie aangaat met een axon en myelinescheden gaat vormen. DUS:




Normal adult white matter
Demyelination and OPC activation
OPC recruitment (proliferation and migration)
OPC differentiation (axon engagement and myelin sheath formation)
Remyelinisatie is belangrijk omdat:
 Nodal organization: saltatory conduction
 Prevent axonal degeneration: oligodendrocyte-derived trophic factor role of myelin
proteins and lipids inflammation protective
14
Medische Celbiologie 2013
Niek Groot
Shadow laesions
Zoals eerder vermeld ontstaan er bij remyelinisatie
zogenaamde schaduw laesies. Dit zijn dunnere en
kortere myelinesegmenten, waardoor zij lichter van
kleur zijn dan het witte hersenenweefsel (rode
pijltjes).
Chronische laesies
Naast shadow laesions zijn er ook chronische laesies.
Dit zijn gebieden waar nauwelijks remyelinisatie
optreedt. Dit komt door uitputting en het stilblijven
(quiescent) van oligodendrocyt proginator cells). ZE
ZIJN DUS WEL AANWEZIG!
Voorwaarden voor remyelinisatie:
 Activeren van oligodendrocyt voorlopercellen
 Recruiteren van oligodendrocyt voorlopercellen naar de laesie
 Differentiatie van oligodendrocyt voorlopercellen in de laesie
Bij de behandeling van MS kan het waardevol zijn om de remyelinisatie te bevorderen. Dit
zou men op de volgende manieren kunnen doen.

‘Uitputting’ : aanbieden van exogene myeliniserende cellen (voorlopercellen,
neuronale stamcellen, ES cellen, iPS cellen)

‘Stil’: veranderen van de omgeving; stimuleren van endogene remyelinisatie
(recruiteren, deling, verplaatsing overleving en induceren van differentiatie)
Astrocyte
Form the blood-brain barrier (by holding together neurons and blood vessel with a separation
into a two-layered structure) and support other cells
Oligodendrocyte
Form the myelin sheath around axons of the CNS. Myelinate serveral axons at the same time
(up to 50 a time)!
Microglia
Phagocyte cells that migrate through the CNS removing foreign matter and degenerated brain
tissue
Ependymal cells
epithelial cells that line the brain and central canal of the spinal cord
15
Medische Celbiologie 2013
Niek Groot
De geleidingssnelheid van een axon hangt af van verschillende factoren, namelijk de
diameter van de axon, de temperatuur en de aanwezigheid of afwezigheid van myeline.

Compact opeengestapelde plasma membraan ‘vellen’ of
lamellen (fosfolipiden dubbellagen) die een axon
omhullen (CNS: oligodendrocyten, PNS: Schwann
cellen)

Rijk aan lipiden (sfingolipiden en cholesterol), laag
watergehalte (70-75% lipiden)

Myeline segmenten (150-200 μm) functie:
o Zorgen voor elektrische isolatie (geen signalen naar andere neuronen)
o Maken de prikkelgeleiding sprongsgewijs (saltatorische geleiding) en
daardoor sneller en efficiënter (van 2 m/s naar 70-120 m/s)
o Beschermen van axonen
MBP en PLP
Omdat myeline uit fosfolipide bilagen bestaat, zullen de koppen elkaar afstoten wanneer het
myeline om de axon wordt gewikkeld. Om dit probleem op te lossen zijn er twee eiwitten,
namelijk PLP en MBP. MBP zorgt ervoor dat de lipide pilagen (negatief geladen) elkaar niet
afstoten. PLP doet hetzelfde, maar dit is een transmembraaneiwit.
Remyelinisatie is morfologisch identiek aan myelinisatie. Ook
oligodendrocyten kennen een polariteit. Hierbij zijn de
myelinemembranen basolateraal en het cellichaam apicaal.
Eiwitten groter dan 30 aminozuren kunnen MBP niet passeren.
Hierdoor ontstaat een diffusiebarriere die eiwitdiffusie
limiteerd.
Zoals eerder vermeld bestaat myeline voor 70% uit lipiden en voor 30% uit eiwitten.


Lipiden
Eiwitten


GalCer en sulfatide
Myelin basic protein en proteolipid protein (MBP en PLP)
Deze eiwitten en lipiden worden niet allemaal tegelijk tot expressie gebracht. In de
onderstaande afbeelding zie je dat eerst sulfatide, daarna GalCer en vervolgens pas PLP en
MBP tot expressie komen.
16
Medische Celbiologie 2013
Niek Groot
Transport PLP en MBP
PLP en MBP worden verschillend richting de basolaterale zijde van de cel getransporteerd.
PLP wordt via een indirecte manier, trancytose genaamd, getransporteerd. Transcytose is een
soort van vesiculair transport waarbij PLP eerst in het apicale membraan wordt geplaatst, om
vervolgens weer los te budden richting cytoplasma (soort endocytose).
MBP wordt getransporteerd d.m.v. (direct) mRNA transport. Hierbij wordt het mRNA van
MBP getransporteerd richting de basolaterale zijde, waar het vervolgens getransleerd zal
worden.


MBP: direct mRNA transport, on site protein synthesis
PLP: indirect vesicular transport via transcytosis
17
Medische Celbiologie 2013
Niek Groot
De synthese van MBP wordt geïnitieerd door contact tussen de oligodendrocyt en de axon
(Axonaal L1 met oligodendroglial F3).
De synthese van PLP wordt geinitieerd door oplosbare, neuronaal-derived signals.
Daarnaast kan er WEL myeline gevormd worden zonder PLP, maar NIET zonder MBP!
MBG zorgt voor de initiatie van het ‘omwinden’ van myeline.
Ontwikkeling van oligodendrocyten
Ongeveer 50% van de immature oligodendrocyten gaan in apoptose. Alleen de
oligodendrocyten die in aanraking komen met een axon zullen overleven.
De stappen die hierboven staan beschreven (1 tmt 3) worden gefaciliteerd door zowel
extrinsic als intrinsic factoren. Deze drie beslismomenten zijn erg belangrijk.



Proliferatie
Differentiatie
Survival
Eén van deze factoren zijn groeifactoren. Deze groeifactoren zorgen voor de communicatie
tussen neuronen en oligodendrocyten. Wat je moet onthouden is dat groeifactoren meerdere
effecten hebben.
Daarnaast moet je weten dat membraan compartamentilisatie ook een rol speelt. De PDGFaR
receptor heeft een andere functie in oligodendrocyt progenitor dan in immature
oligodendrocyten doordat de receptor zich in verschillende compartimenten bevindt.
18
Medische Celbiologie 2013
Niek Groot
Je moet dus onthouden dat er contact afhankelijke signalen zijn, maar ook uitgescheiden,
lange afstand signalen.
Groeifactoren zijn natuurlijk één voorbeeld van een oplosbaar, lange afstand signaal. Er zijn
er nog meer, namelijk neurotransmitters, chemotactische factoren, electrische activiteit en
galectine-4.
Er zijn ook contact-afhankelijke signalen (denk aan F3-L1). Een ander belangrijk voorbeeld
hiervan zijn de integrines en de laminines.
I.t.t. groeifactoren hebben integrines één specifiek effect. Integrines zorgen dat een receptor
in een specifiek compartiment na het binden van een groeifactor.
Omdat de ontwikkeling van oligodendrocyten asynchroon is, zijn de tijd en plaats van
bepaalde stoffen en factoren belangrijk. Hierdoor zal de oligodendrocyt worden blootgesteld
aan een combinatie van signalen (bijvoorbeeld integrines en PDGF).
Waarom faalt remyelinisatie bij MS? (kennen)

Non-disease-related factors
o Age, sex, genetic background (intrinsic and extrinsic)

Disease-specific factors
o Deficiency in precursor cells
o Failure of recruitment
o Environmental restriction for differentiation
19
Medische Celbiologie 2013
Niek Groot
Nadat er schade is opgetreden aan myeline zullen er een aantal dingen gebeuren. Ten eerste
wordt het myeline opgeruimd door microgliacellen. In de tweede fase treedt er herstel van het
beschadigde myeline op.
Vervolgens heeft men gekeken naar de rol van fibronectine en remyelination. Men denkt dat
Fibronectine oligodendrocyt proginator cells recruiteert.
Uit dit onderzoek bleek dat fibronectine de myelinisatie in vitro remt door het gepolariseerde
transport richting het myeline te remmen.. Daarnaast is gebleken dat fibronectine ophoopt in
MS laesies. Deze ophopingen (aggregaten), worden te groot om op te ruimen waardoor ze de
remyelinisatie remmen.
Toch kan fibronectine ook een vriend zijn in de strijd tegen MS omdat fibronectine
aggregaten voorkomen kunnen worden. Ook kan de afbraak van fibronectine aggregaten
gestimuleerd worden.
College 9
Opname van glucose
Wanneer er geen insuline aanwezig is,
kan glucose niet de cel in diffunderen.
Wanneer er wel insuline aanwezig is en
aan de insuline receptor bindt, zullen de
GLUT-4 transporters via translocation op
het celmembraan terecht komen,
waardoor glucose de cel in kan
diffunderen. Later zullen de GLUT-4
transporters via endocytose weer
loskomen van het membraan.
Fosfolipiden
Phospholipids are a class of lipids that are a major component of all
cell membranes as they can form lipid bilayers. Most phospholipids
contain a diglyceride, a phosphate group, and a simple organic
molecule such as choline; one exception to this rule is sphingomyelin,
which is derived from sphingosine instead of glycerol.
Er bestaan een boel verschillende soorten fosfolipiden, waarvan de
naam wordt bepaald door de kopgroep (in het geval van de afbeelding
hiernaast is dit choline). Het is belangrijk om te onthouden dat
verschillende soorten fosfolipiden zich op verschillende plaatsen in
de cel bevinden (mitochondriën, ER, Golgi, plasmamembraan,
lysosomes).
20
Medische Celbiologie 2013
Niek Groot
Ook is het belangrij k om te weten dat CIS-vetzuren het membraan vloeibaarder maken,
terwijl verzadigde vetzuren membranen juist meer rigide (harder) maken.


CIS
Verzadigd


Vloeibaarder en KORTER
Rigide en LANGER
Dus: de kopgroep van een lipide bepaalt de soort en de vorm van het lipide.
Lading lipiden
Phosphatidyl serine is het enige lipide dat een
negatieve lading heeft. Er bestaan geen positief
geladen lipiden. De meesten zijn zwitter-ionisch,
waarbij de positieve en de negatieve lading elkaar
opheffen.
Functies membranen



Signaling (receiving information)
Transport (import & export of molecules)
Movement (movement & expansion)
Hydrophobic mismatch
Dit houdt in dat kleine eiwitten zich omringen met
kortere, onverzadigde fosfolipiden en grotere eiwitten
juist met lange, verzadigde fosfolipiden. “Lipid-protein
interactions and the lateral segregation of proteins”
Lipiden en het plasmamembraan
Er is een verschil tussen de lipiden die zich in het extracellulaire of het intracellulaire
gedeelte van de bilayer van het plasmamembraan bevinden. Aan de extracellulaire kant
bevindt zich meer cholesterol, phosphatidylcholine, sphingomyeline en glycolipiden. Aan de
intracellulaire kant bevindt zich ook cholesterol, maar in mindere maten. Naast cholesterol zit
er ook phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine en phosphoinositides.
21
Medische Celbiologie 2013
Niek Groot
Deze lipide asymmetrie wordt gegenereerd in het Golgi-apparaat door de glycolysatie van
glycosphingolipiden door ABC-transporters. De asymmetrie wordt ook in stand gehouden bij
het plasmamembraan door flippases (deze ‘flippen’ lipiden) en ook door de eerder genoemde
ABC-transporters. Wanneer het intracellulaire lipide phosphatidylserine (PS) aan de
buitenkant van het plasmamembraan verschijnt zullen er drie dingen gebeuren:



Apoptose
Macrofaagactivatie
Activatie van bloedstolling
De meestvoorkomende lipiden in eukaryote membranen zijn fosfolipiden,
glycosphingolipiden en cholesterol.
Sphingomyeline en phosphatidylcholine (outer leaflet) vormen structuren door het vormen
van waterstofbruggen. Sphingomyelin is zowel een H-donor als H-acceptor.
Phosphatidylcholine is enkel een H-acceptor.
GPI-anchor
Glycosylphosphatidylinositol (GPI anchor) is a glycolipid that can be attached to the Cterminus of a protein during posttranslational modification. Dit is dus een manier om een
eiwit aan het (plasma)membraan te hechten.
The plasma membrane of cells is made of a combination of glycosphingolipids and protein
receptors organized in glycolipoprotein microdomains termed lipid rafts. These specialized
membrane microdomains compartmentalize cellular processes by serving as organizing
centers for the assembly of signaling molecules, influencing membrane fluidity and
membrane protein trafficking, and regulating neurotransmission and receptor trafficking.
Lipid rafts are more ordered and tightly packed than the surrounding bilayer, but float freely
in the membrane bilayer. Although more common in plasma membrane, lipid rafts have also
been reported in other parts of the cell, such as Golgi and lysosomes. Cholesterol is the
dynamic "glue" that holds the raft together. Lectines kunnen eiwitcomplexen clusteren.
22
Medische Celbiologie 2013
Niek Groot
Veel lipiden die voorkomen in biologische membranen vormen geen bilayers. De non-bilayer
forming lipids zijn dus membraan-destabiliserende lipiden. Deze zorgen voor dynamiek van
het membraan (vesiculatie, fusie etc.).

Bilayer forming:
o Phosphatidylcholine
o Phosphatidylserine
o Sphingomyelin

Non-bilayer forming lipids:
o Phosphatidylethanolamine
o Cholesterol
o Diacylglycerol
o Glycosphingolipids (ceramides)
o Lysophospholipids
Non-bilayer forming lipiden hebben verschillende vormen, namelijk de cone en de inverted
cone. Bilayer-forming lipiden hebben een cilindrische vorm en vormen een bilayer.
Hieronder vind je een afbeelding van het stalk concept, waarbij de vorm van de lipide een
effectorfunctie heeft.
23
Medische Celbiologie 2013
Niek Groot
Myeline bestaat voornamelijk uit lipiden (70%) en eiwitten (30%). Deze lipiden bestaan
voornamelijk uit raft-achtige lipiden, namelijk galactolipiden, cholesterol en GalCer. Deze
laatste (GalCer) was schijnbaar belangrijk, samen met sulfatide. De belangrijkste eiwitten
zijn al eerder behandeld (PLP en MBP).
Wanneer een oligodendrocyt een axon nadert zullen er bepaalde adhesiemoleculen aan elkaar
binden, waardoor een cel-cel binding ontstaat. Er zijn specifieke eiwitten in beide cellen
aanwezig om een bepaalde interactie aan te gaan. De lokalisatie van eiwitten in de vorm van
RAFTS is belangrijk om de interactie te bewerkstelligen. Zowel cel adhesie moleculen,
cytoskelet eiwitten en RAFTS spelen een rol.
In de biogenese van myeline spelen syntaxins een belangrijke rol. Syntaxin 3 bevindt zich
voornamelijk apicaal en syntaxin 4 voornamelijk basolateraal.


Syntaxin 3
Syntaxin 4


Apicaal
Basolateraal
Het bleek dat de overexpressie van syntaxin 3 ervoor zorgde dat het transport van PLP
geinhibeerd werd. Dit was niet het geval wanneer syntaxin 4 tot overexpressie werd gebracht.
Dit komt omdat syntaxin 3 klonten vormt wanneer het tot overexpressie wordt gebracht. PLP
lokaliseert dus richting rafts met syntaxin 3.
Het komt er dus op neer dat GalCer en sulfatide belangrijk zijn in het vesiculaire transport
van PLP (MBP gaat rechtstreeks richting de basolaterale kant  sheet).
24
Medische Celbiologie 2013
Niek Groot
College 10
Stamcellen
Een stamcel is een cel die in staat is om in een ander celtype te veranderen (differentiëren).
Afhankelijk van het type stamcel heeft deze meer of minder mogelijkheden om tot
verschillende celtypes te differentiëren. Naar afnemende veelzijdigheid worden vier
differentiatie-graden van stamcellen onderscheiden:




Totipotente stamcellen
Pluripotente stamcellen
Multipotente stamcellen
Unipotente stamcellen
Een embryo bestaat in eerste instantie enkel uit totipotente
stamcellen. Later gaan deze zich specialiseren en vormen ze cellen
met elk een eigen functie. Deze gespecialiseerde cellen kunnen
daarna geen andere functies meer vervullen (uitzondering:
plasticiteit) en ze kunnen ook nooit meer teruggaan in hun
ontwikkeling om weer stamcellen te vormen. Als de celfunctie
deling toestaat worden door deling alleen soortgelijke of nog
sterker gespecialiseerde cellen gevormd.
Een stamcel moet dus aan twee dingen voldoen. Ten eerste moet
het kunnen differentiëren naar een specifiek celtype. Daarnaast
moet er na de deling nog steeds een stamcel aanwezig blijven
self renewal.
The zygote, formed by the fusion of egg and sperm, could be considered to be the first
totipotent cell. The zygote divides to form the inner cell mass and extra-embryonic tissue of
the blastocyst. When isolated from the blastocyst in vitro, the cells of the inner cell mass can
be maintained in culture as pluripotent embryonic stem cell lines. During the development of
the embryo, the pluripotent stem cells in the inner cell mass become increasingly restricted in
their lineage potential and generate tissue-specific, multipotent stem cells. These include
epidermal stem cells that form skin and hair, hematopoietic stem cells in the bone marrow
that give rise to all hematopoietic cells, neural stem cells in the subventricular zone of the
brain, gastrointestinal stem cells that are located in the crypt of the small intestine, oval cells
that give rise to liver (not shown), and mesenchymal stem cells that reside in the bone
marrow and can form bone, stromal cells and adipocytes (not shown).
Hematopoietic stem cells are the best characterized adult stem cells and can therefore serve as
a model to study stem cell characteristics.


ICM
Adult SC’s


pluripotent
in kleine properties in weefsels
25
Medische Celbiologie 2013
Niek Groot
Er zitten ongeveer 7 dagen tussen de bevruchting en de
daadwerkelijk innesteling. Dit komt omdat de
bevruchting in de tuba plaatsvindt.
How to access pluripotency of embryonic stem cells
Dit doe je door cellen van de ICM van een blastocyst te
nemen. Deze cellen kweek je en injecteer je vervolgens
in de ICM van een andere (muis) blastocyst. Hieruit
ontstaat vervolgens een chimere muis. Wanneer je cellen
van een zwarte muis transplanteert in de blastocyst van
een witte muis en deze implanteert in een
schijnzwangere muis krijg je dus een zwart/witte
chimere muis.
Embryonale stamcellen
Aangezien ICM-cellen pluripotent zijn, zou je ze in
principe in vitro kunnen laten differentieren in
bijvoorbeeld dopaminerge neuronen, bèta cellen,
cardiomyocyten of hematopoietic stem cells. Dit klinkt
misschien mooi, maar er is een probleem, namelijk
afstoting.
Er zal dus een afstotingsreactie plaatsvinden omdat je
nooit eigen pluripotente stamcellen kunt produceren.
Somatic cell nuclear transfer (SCNT)
The nucleus of a somatic cell is removed and kept, and
the host's egg cell is kept and nucleus removed and
discarded. Now we have a lone nucleus and an empty (or deprogrammed) egg cell. The lone
nucleus is then fused with the 'deprogrammed' egg cell. After being inserted into the egg, the
lone (somatic-cell) nucleus is reprogrammed by the host egg cell. The egg, now containing
the somatic cell's nucleus, is stimulated with a shock and will begin to divide. After many
mitotic divisions, this single cell forms a blastocyst (an early stage embryo with about 100
cells) with almost identical DNA to the original organism.
iPS
Induced pluripotent stem cells, commonly abbreviated as iPS cells or iPSCs are a type
of pluripotent stem cell artificially derived from a non-pluripotent cell - typically an
adult somatic cell - by inducing a "forced" expression of specific genes. Induced pluripotent
stem cells are similar to natural pluripotent stem cells, such as embryonic stem (ES) cells, in
many aspects, such as the expression of certain stem cell genes and proteins,chromatin
methylation patterns, doubling time, embryoid body formation, teratoma formation,
viable chimera formation, and potency and differentiability, but the full extent of their
relation to natural pluripotent stem cells is still being assessed. Induced pluripotent cells have
been made from adult stomach, liver, skin cells and blood cells. PROOF KENNEN!
26
Medische Celbiologie 2013
Niek Groot
College 11
Wanneer je iemand bestraalt wil je dat de tumor bij een lagere stralingsdosis een hogere
respons heeft t.o.v. het normale gezonde weefsel. Kortom: Je wil de tumor grafiek naar links
en de grafiek van het normale weefsel naar rechts.
27
Medische Celbiologie 2013
Niek Groot
Therapeutic window
The Therapeutic window (or pharmaceutical window) of a drug is the range of drug dosages
which can treat disease effectively while staying within the safety range. In other words, it is
the dosages of a medication between the amount that gives an effect (effective dose) and the
amount that gives more adverse effects than desired effects.
Energetische waarde
Straling met een korte golflengte heft een hogere energetische waarde. Wanneer straling een
bepaalde energetische waarde bereikt wordt het schadelijk (vanaf 10-9). Deze straling kan dan
bepaalde effecten hebben (indirect en direct). DNA schade is de meest kritische schade na
straling.




Microbestralingen van cellen laten zien dat de energie absorptie in de kern bij een
veel lagere dosis tot celdood leidt dan energie absorptie in het cytoplasma
Isotopen met een korte dracht leiden niet tot celdood wanneer geincorporeerd in het
celmembraan en wel indien geincorporeerd in het DNA
De incidentie van chromosoom afwijkingen na bestraling is sterk gerelateerd aan
celdood
Cellen met een defect in DNA herstel zijn stralingsgevoelig.
28
Medische Celbiologie 2013
Niek Groot
UV, X-ray of bepaalde chemicalien kunnen verschillende soorten DNA schade veroorzaken.
UV-licht afkomstig van de zon veroorzaakt zo ongeveer 10.000 dimeren per uur, terwijl Xray
juist DNA breuken teweegbrengt. DNA breuken veroorzaken chromosoom aberraties. Dit
zijn gewoon stukjes chromosoom die afbreken. Sommige van deze stukjes zullen dan weer
aan een ander chromosoom binden (mutatie).
Defects in Double Strand Break (DSB) zoals
voorkomt in Ataxia Telangiectasia



Elevated cancer risk
Early ageing
Hypersensitive to radiotherapy
Fractioneren van de dosis
Men fractioneert de stralingsdosis om gebruik te
maken van het herstelvermogen van cellen. Cellen die
om het uur 2Gy krijgen overleven langer dan een cel
die in één keer 4Gy krijgt. Daarnaast trek je de curves
van tumorweefsel en normaal weefsel uit elkaar
wanneer je intervallen gebruikt (snel delend en
langzaam delend).
Effect straling op stamcellen
Op een gegeven moment zal straling ook een effect
hebben op stamcellen. Hier geldt: Hoe hoger de
activiteit van de stamcellen, hoe sneller er schade zal
optreden. Hierdoor ontstaat er een verschil tussen het
verlies van cellen door ageing en de productie van cellen
door stamcellen. Dit zie je vooral veel in darmepitheel t.g.v. bestraling, waarbij de villi
gewoon loslaten.
Tijdens college werd vermeld dat één bulge cell (haarstamcel) een hele pluk haar kan
vormen.
29
Medische Celbiologie 2013
Niek Groot
Tijdseffect
Het is belangrijk om je te realiseren dat de tissue turnover tijd de responstijd bepaalt en NIET
de stralingsdosis. Hierbij geldt dat hoe sneller cellen delen, hoe eerder de stralingsrespons te
zien is. Om dit aan te tonen heeft men een beest geëpileerd (delingssnelheid >) en vervolgens
bestraald en vergeleken met een controle. Hieruit bleek dat de geëpileerde cellen sneller een
reactie lieten zien. Soms kan zelfs 2 jaar na bestraling schade optreden door de trage
delingssnelheid van de organen zoals de nier en de blaas.
Ook moet je weten dat het beenmerg zo’n beetje het gevoeligste orgaan is voor straling.
Chronische effecten
Voor de nier en de long geldt dat de gevoeligheid van een subunit afhankelijk is van het
aantal stamcellen per subunit. Hieruit kan men afleiden dat de gevoeligheid van het orgaan
afhankelijk is van het verlies van subunits.




Endotheelcellen gaan in apoptose
Fibroblasten differentieren in post-mitotische fibrocyten die collageen aanmaken
Macrofagen maken ROS/NOS species en cytokinen aan
Deze factoren veroorzaken celdood
College 12
Adulte stamcellen
Adulte (somatische of van weefsel afkomstige) stamcellen zijn orgaan specifiek en vormen in
het algemeen alleen celtypes van het orgaan waaruit zij voorkomen (unipotent).
Beenmergtransplantatie
Stamceltransplantatie wordt in de geneeskunde toegepast als behandeling bij bloedkanker
(leukemie, plasmaceldyscrasie), lymfklierkanker (lymfoom) en bepaalde bloedziekten
(thalassemie, immuundeficiënties en aplastische anemie). In de toekomst kan het misschien
ook bij andere ziekten worden gebruikt.
Een aantal patiënten krijgt chemotherapie en/of radiotherapie in een hoge dosering
toegediend. Deze behandeling vernietigt naast zieke cellen ook gezonde cellen in
de beenmergholte.
30
Medische Celbiologie 2013
Niek Groot
Daarom worden na een behandeling met hoge dosis chemotherapie en/of radiotherapie
aansluitend gezonde, goedwerkende stamcellen aan de patiënt toegediend. Stamcellen kunnen
verschillende typen bloedcellen maken en zorgen voor herstel van het beenmerg.
Enkele jaren terug werden de benodigde stamcellen vooral uit het beenmerg gehaald:
een beenmergtransplantatie. De laatste jaren gebeurt dat alleen nog bij uitzondering.
Stamcellen worden tegenwoordig vrijwel altijd rechtstreeks uit het bloed gehaald. We
spreken dan van een stamceltransplantatie.
De stamcellen worden getransplanteerd van een gezonde donor naar een zieke ontvanger bij
wie alle hematopoïetische cellen ziek zijn of afwezig door hoge dosis chemotherapie
(allogene stamceltransplantatie).
Soms kan iemand zijn eigen stamcellen teruggetransplanteerd krijgen, als er een manier
bestaat om uit het beenmerg van de patiënt die stamcellen te selecteren die niet ziek zijn
(autologe stamceltransplantatie).
Men kan beenmerg stamcellen
mobiliseren door verschillende
groeifactoren toe te dienen, waardoor
de stamcellen in het beenmerg zich
naar de bloedbaan zullen begeven. Dit
bloed wordt vervolgens door een
FACS gehaald. Aangezien de markers
van stamcellen bekend zijn is het
mogelijk om stamcellen te isoleren.
Om kapotte speekselklieren te
herstellen heeft men geprobeerd om
speekselklier stamcellen te nemen.
Vervolgens heeft men deze stamcellen
opgekweekt en sferen laten vormen (in
vitro).
Stamcellen kunnen verschillende
soorten division ondergaan. Bij
asymmetric division ontstaan er na het
delen van de stamcel zowel een
multipotente proginator als een nieuwe
stamcel. Daarnaast is er symmetrische
division, waarbij er na deling enkel
nieuwe stamcellen ontstaan. Tenslotte
is er ook nog restrictive division,
waarbij er geen nieuwe stamcellen ontstaan,
waardoor het weefsel geen vernieuwing kan ondergaan.
31
Medische Celbiologie 2013
Niek Groot
Je wilt dus eigenlijk een asymmetrische deling, omdat je zowel stamcelvernieuwing als de
vorming van duct/acinaire cellen (speekselklier) wil. Uit onderzoek bleek dat de speekselklier
stamcellen voldeden aan:




Zelfvernieuwing
Brachten na differentiatie epitheliele markers tot expressie
Differentieerden in vitro
Brachten stamcelmarkers tot expressie
Nu moest nog worden gekeken of deze cellen ook konden zorgen voor weefselregeneratie.
32
Medische Celbiologie 2013
Niek Groot
Men bracht dus zowel c-kit (-) als c-kit (+)
cellen in een muis. C-kit positieve cellen
verzorgde een grotere speekselproductie dan ckit negatieve cellen.
Dus, muizen speekselklier stamcellen:
Celen afkomstig van de speekselklier




Bevatten cellen met stamcelmarkers
Kunnen zichzelf vernieuwen in vitro en in vivo
Kunnen differentiëren in vitro en in vivo
Kunnen bestraalde speekselklieren regenereren.
Het bleek dat dit bij mensen ook kan. Hiervoor nam men stamcellen van de patiënt en
behandelde deze net zoals de muizen stamcellen (DUS c-kit positieve cellen!)
33
Medische Celbiologie 2013
Niek Groot
Colllege 13
Mogelijke oorzaken van veroudering





Chromosome biology (telomeres/DNA repair)
Regulation of gene expression (genetics en epigenetics)
Regeneration and homeostasis (including immunity)
Protein folding and post-translational modifications
Energy/ metabolism/ oxygen radical biology (environment and diet)
Stamcellen zijn belangrijk voor de homeostase en maintenance, maar bepalen ook de lifespan
van een bepaald weefsel.
Tijdens hun differentiatie brengen (hematopoietische) stamcellen verschillende markers tot
expressie, waaraan zij herkend kunnen worden. Hierbij is de proliferative index het grootst in
de tussenfase.
Klinische beenmergtransplantatie
Bij een beenmergstransplantatie worden er beenmergcellen uit het beenmerg genomen. Dit
beenmerg wordt gefiltreerd tot er alleen nog beenmergcellen over zijn. Deze beenmergcellen
worden vervolgens aan de ontvanger gegeven via een infuus (DUS IN DE BLOEDBAAN!).
Een andere manier om een beenmergtransplantatie uit te voeren gebeurt met behulp van
groeifactoren. Deze groeifactoren worden ingespoten, waardoor de beenmergstamcellen zich
zullen mobiliseren. Deze gemobiliseerde perifere bloed beenmerg(stam)cellen worden
vervolgens uit het bloed gefiltreerd en in de donor geinjecteerd (weer in bloedbaan).
34
Medische Celbiologie 2013
Niek Groot
CLINICAL STEM CELL TRANSPLANTATION



Stem cell sources
o Bone marrow
o Mobilized peripheral blood
o Umbilical cord blood
Donors
o Autologous (patient)
o Allogeneic (family member, MHC matched)
o Unrelated (MHC matched)
Diseases
o Leukemias (malignant)
o Genetic diseaseas affecting blood cell formation (one or more lineages)
Het problem met umbilical cord blood SC’s is dat het er vaak te weinig zijn. Daarnaast moet
de ontvangende partij ook nog geconditioneerd worden. Ten eerste moet er ruimte worden
gemaakt in het beenmerg (oude cellen eruit halen). Ten tweede moet het immuunsysteem
worden onderdrukt wanneer er over allogene barrières wordt getransplanteerd. Tenslotte
moeten overgebleven residuele malignante cellen worden geëlimineerd (bloed). Vervolgens
worden de donorcellen intraveneus toegediend.
Daarnaast is er naast het major HC (MHC) ook het minor HC, waardoor immunosuppressiva
wellicht toch nodig zijn.
Het is belangrijk dat je onthoudt dat humane stamcellen CD34 tot expressie brengen. Murine
stamcellen hebben niet per definitie. Bij murine stamcellen kijk je naar het gebrek aan mature
lineage markers. Wel brengen murine stamcellen Sca-1 en c-kit tot expressie.
35
Medische Celbiologie 2013
Niek Groot
In de afbeelding hierboven kun je zien dat er na elk stadium een bepaalde marker verdwijnt.
Daarnaast daalt de kwaliteit van stamcellen na transplantaties, chemotherapieën of
veroudering in het algemeen.
Serial transplantations
Door stamcellen in serie te
transplanteren is het mogelijk om
hematopoietische stamcellen uit
te putten. Door de muizen ook te
bestralen (waardoor je alle
Hematopoietische cellen doodt)
induceer je een sterke
replicatieve stress, waardoor er
of loss of self renewal, of juist
leukemieen kunnen ontstaan.
Several independent components to HSC aging:



Intrinsic loss of HSC functioning
Loss of stem cell pool size control
Skewed ratio of different HSC subsets
Defects are restricted to HSC, and not to progenitors
Polycomb
Polycomb reguleert de epigenetische regulatie van transcriptie. Hierbij kun je onderscheid
maken tussen twee complexen, polycomb repressive complex 2 en polycomb repressive
complex 1.
36
Medische Celbiologie 2013
Niek Groot
Van complex 2 is EZH2 het belangrijkste. Wanneer dit complex geactiveerd wordt, zal het
DNA op die plek compacter worden door het aanbrengen van trimethylaties. Vervolgens zal
complex 1 deze trimethylaties herkennen en deze ubiquitineren, waardoor het DNA nog
compacter zal worden.
Wanneer PrC (polycomb repressive complex) actief is zullen genen dus worden
uitgeschakeld. Wanneer deze echter afwezig is zullen de genen worden uitgeschakeld
CBX eiwitten
Er bevindt zich slechts één Cbx eiwit in een PRC1 complex op een bepaald moment. (PRC1
complexen beinvloeden de toegankelijkheid van DNA. Vervolgens heeft men Cbx 7 en Cbx 8
tot overexpressie gebracht in beenmergcellen en gesorteerd mb.v. FACS. Hieruit bleek
hetvolgende:


Cbx 7 
Cbx 8 
Verhoogt het aantal kolonies
Verlaagt het aantal kolonies.
SELF RENEWAL (leukemie)
DIFFERENTIATION
In de afbeelding staat CBX7 links en CBX 8 rechts weergegeven.




Hematopoetic stem cells are extremely rare, but are able to maintain tissue
homeostasis (blood cell formation) for the lifetime of each individual
Hematopoietic stem cells are able to regenerate the entire hematopoietic system
During aging, the regenerative capacity of hematopoietic stem cells decreases
Aging renders hematopoietic stem cells more vulnerable to loss of function (anemia,
loss of immunity) or gain of function (leukemia)
37
Medische Celbiologie 2013
Niek Groot
College 14
Poly-Q diseases
Poly-glutamine (Q) diseases are an expansion of CAG repeats leading to poly--‐glutamine
(Q) stretch. Gezonde mensen hebben ook wel repeats, maar niet meer dan ~20. Zieke mensen
hebben er meestal meer dan 40.



Expansion of CAG repeats leading to poly-q stretch
Family of neuro/muscular degenerative diseases (8 stuks), mostly autosomal dominant
As such, poly-Q diseases are no ageing diseases but, due to its usual late onset the
disease is age-related and the cause for its manifestation is related to cellular ageing.
De leeftijd waarop de ziekte zich uit is zeer gecorreleerd met de hoeveelheid repeats. Toch is
er veel interindividuele variatie.
Bij Huntingtonpatienten is vooral het striatum aangedaan, waardoor er op dat gebied
neuronale dysfunction ontstaat. Dit leidt in veel gevallen tot bewegingsstoornissen (chorea),
personaliteitsveranderingen en later zelfs tot dementie of cognitieve aandoening. Ongeveer 1
op de 10,000 mensen hebben Huntington, wat autosomaal dominant overerft.



Unaffected individuals carry repeats from 6-35 CAG
At risk for transmitting (carriers) have 35-40 CAG
Meer dan 40 repeats  pathologisch
Main hallmark: protein aggregation. De ziekte uit zich via twee mechanismen, namelijk een
loss of function en een deletrious gain of function.


Loss of function
o No difference between homo and heterozygotes
o No effect of reduced expression levels
o Null mutation has no phenotype in mice
Deleterious gain of function
o Overexpression of disease gene in mice cause disease
o Protein aggregation is hallmark of many diseases and disturbs protein
homeostasis
o Protein aggregation may impair axonal transport and transcription which cause
cell death.
38
Medische Celbiologie 2013
Niek Groot
Dus: Poly-Q proteins result in the formation of inclusions that are detrimental to the cells,
first leading to dysfunction and subsequently to cell death associated with the progressiveness
of the disease phenotype.
Er ontstaat een soort sneeuwbaleffect (poly-q stretching) waarbij andere eiwitten
geinactiveerd worden. Ten eerste klonteren Poly-Q eiwitten en gezonde eiwitten als
transcriptiefactoren aan elkaar, waardoor deze geinactiveerd worden. Ten tweede wordt het
protein quality control systeem uitgeschakeld en ontstaat er een structurele toxicity waarbij
het vesicle transport belemmerd wordt.
Omdat er grote intra individuele verschillen bestaan is interventie wellicht mogelijk.
Insulin signalling & ageing
Uit het college bleek dat insuline alshetware het quality-control mechanisme van cellen
uitzet. Daarnaast lijkt het erop dat calorierestrictie (weinig insuline) ervoor zorgt dat de
youthfulness, longetivity, stress resistance en proteostasis toeneemt door de transcriptie
HSF-1, dat de transcriptie van Heat shock proteins beinvloedt. . Dit laatste kan wel eens van
toepassing zijn voor de ziekte van Huntington.
Heat shock proteins (HSP were difined as proteins encoded by genes that contain so called
heat shock elements in their genes that are regulated by the “Heat shock transcription factor
(HSF).
HSP  Molecular Chaperones  Voorkomen ongewenste interacties tussen eiwitten
Humane HSP families kennen vele soorten. Uit onderzoek bleek dat er twee belangrijke
chaperones bij de Hsp40 (DNAJ) familie horen, namelijk DNAJB6 en DNAJB8. Men kruiste
een DNAJB6 overexpressie muis met een modelmuis voor Huntington (>200 repeats).
Hieruit bleek dat de nakomelingen minder aggregaten vormden en langer op het rad konden
balanceren dan de Huntingtonmuizen. Daarnaast lieten spreidde deze muizen hun poten
wanneer ze aan hun staart werden opgetild. Al met al leidde het tot een 23% increase in
lifespan.
39
Medische Celbiologie 2013
Niek Groot
Uit onderzoek bleek ook dat ongevouwen eiwitten door een proteasoom in stukjes worden
geknipt. Het is echter niet in staat om in de poly-Q tail te knippen, waardoor er een los stuk
poly-Q tail ontstaat dat aggregaten kan vormen.
Disease Associated Protein  Denaturatie  Aggregation  Toxicity
Er zijn dus verschillende manieren om in te grijpen.




Ten eerste zou je chaperones kunnen gebruiken om eiwitten op een correcte manier te
vouwen (refolding)
Ten tweede zou je anti-aggregatie eiwitten kunnen upreguleren
Ten derde zou je slecht gevouwen kunnen laten afbreken door een proteasoom (werkt
niet voor poly-Q)
Tenslotte kan je het autofage-lysosomale systeem stimuleren, waardoor toxische
aggregaten worden opgeruimd.
DNAJB6 en DNAJB8 hervouwen dus niet, maar voorkomen de seeding die plaatsvindt bij
overmatige proteasomale afbraak.
40