kweekvanmicroorganismen2006 (nieuw venster)

Inhoudsopgave De kweek van micro-organismen
1 Inleiding
4
1.1 Waarom is deze leerstof zinvol?
4
1.2 Doel van de stofwisseling
5
1.3 Enzymen
5
2 .De energiestofwisseling of dissimilatie
8
2.1 Inleiding
8
2.1 Leven met of zonder zuurstof
9
2.3 De aerobe ademhaling
10
2.4 De anaerobe ademhaling
2.4.1 Nitraatademhaling
2.4.2 De sulfaatademhaling
11
11
12
2.2 De gisting
12
2.3 De gisting nader bekeken
13
2.4 Belangrijke groepen micro-organismen met een anaerobe stofwiseling
14
2.5 Oxydasetest
16
2.6 Katalasetest
16
2.7 Anaeroob kweken
18
2.8 Indeling op grond van stofwisseling
19
2.9 Chemo-organotroof versus chemolithotroof
21
3 De opbouw van celmateriaal of assimilatie
3.1 Welke bouwstoffen heeft een bacterie allemaal nodig?
23
23
3.2 De koolstofbron
23
3.2.1 .Heterotrofe micro-organismen
23
3.2.2
24
3.2.3 Indeling en naamgeving micro-organismen wat betreft gebruikte E- bron en Cbron
24
3.3 De stikstofbron
25
3.4 Zwavel
25
3.5 Fosfaat
25
3.6 Overige elementen
26
4 De samenstelling van een algemeen medium
28
4.1 Inleiding
28
4.2 het gebruik van een algemeen vloeibaar medium, in de praktijk
28
4.3 Het gebruik van een algemene vaste voedingsbodem
28
C.M.Wiersema 2006
1
Micro-organismen en milieu
4.4 Rijke en arme voedingsbodems
29
4.5 Natuurlijke ingrediënten
31
4.6 Energiebron
32
4.7 Buffer
32
4.8 NaCl
32
4.9 Water
32
4.10 Synthetische en natuurlijke media
33
5 Kweekomstandigheden
35
5.1 Inleiding
35
5.2 De zuurgraad
35
5.3 Temperatuur
36
5.4 Osmotische waarde, wateractiviteit
39
6 Selectief kweken
41
6.1 Waarom selectief kweken?
41
6.2 Het gebruik van vloeibare (s)electieve media
41
6.3 Het gebruik van vaste (s)electieve media
43
6.4 Hoe selectief kweken
43
6.5 Electiviteit
44
6.6 Selectieve groeiremmende of dodende stoffen
6.6.1 Anorganische stoffen
6.6.2 Kleurstoffen
6.6.3 Oppervlakactieve stoffen
6.6.4 Antibiotica
6.6.5 Moeilijke energiebron
44
45
45
46
46
47
6.7 Electieve ingrediënten
6.7.1 De vorming van zuur of gas uit een suiker
6.7.2 De vorming van basische stoffen uit aminozuren
6.7.3 Esculinesplitsing
6.7.4 Tellurietomzetting
6.7.5 Vorming van waterstofsulfide uit sulfiet
6.7.6 Reacties met eidooier
6.7.7 Chromogene substraten
47
48
48
48
48
48
49
49
6.8 De ideale (s)electieve voedingsbodem
49
6.9 De ideale (s)electieve voedingsbodem bestaat niet
6.9.1 Het medium is te selectief (de te bepalen cellen te kwetsbaar
6.9.2 Het medium is niet (s)electief genoeg
50
50
50
C.M.Wiersema 2000
2
7 Het maken van een voedingsbodem
52
7.1 De verschillende bereidingsstappen
52
7.2 Het bereiden van een medium uit verschillende ingrediënten
53
7.3 Het berekenen van de hoeveelheid nodige stof.
53
8 Het bewaren van reinculturen
56
C.M.Wiersema 2006
3
Micro-organismen en milieu
1 Inleiding
1.1 Waarom is deze leerstof zinvol?
Zoals in bij het vorige onderwerp “de telling van micro-organismen” is
gebleken is het in de meeste gevallen niet mogelijk om (het aantal)
aanwezige levende micro-organismen direct d.w.z. op het moment
zelf aan te tonen.
Daarom zal men in de meeste gevallen de aanwezige microorganismen op een voedingsbodem laten groeien tot kolonies zodat ze
zichtbaar worden en daarna gedetermineerd kennen worden en/of
geteld kunnen worden.
Om micro-organismen te laten groeien moet je weten op wat voor
voedingsbodem ze kunnen groeien dus wat voor stoffen ze nodig
hebben om hun celmateriaal te kunnen maken.
Allereerst is hiervoor nodig te weten uit welke stoffen het celmateriaal
is opgebouwd en uit welke elementen deze stoffen bestaan.
Daarnaast moet je weten of een micro-organisme een bepaalde
voedingsstof kan omzetten in het voor hem nodige celmateriaal. Je
moet dus iets weten over de stofwisseling van het te bepalen microorganisme. Behalve het voedsel moet er ook op het milieu waarin het
micro-organisme kan groeien gelet worden. Denk aan de aan- of
afwezigheid van zuurstof, de optimale temperatuur, de PH etc.
In veel gevallen wil men ook niet alle levende micro-organismen
bepalen maar alleen die welke een betekenis hebben voor de diagnose
van een ziekte of de kwaliteit (veiligheid) van een product. Men wil
dan de overige micro-organismen (stoorflora) in het monster
remmen of doden, dit is ook alleen mogelijk als men de stofwisseling
en de groeiomstandigheden van de te bepalen micro-organismen en de
stoorflora kent. De verschillen kan men dan gebruiken om selectief te
kweken.
C.M.Wiersema 2000
4
1.2 Doel van de stofwisseling
Stofwisseling is het vormen van een stof uit een andere stof.
In een bacterie vinden duizenden van deze reacties tegelijk plaats. Er
zijn twee soorten stofwisselingsprocessen:
 de energiestofwisseling of de dissimilatie
Door de afbraak (oxydatie of verbranding) van brandstoffen worden
voor de cel bruikbare energierijke verbindingen (ATP) gevormd.
Deze afbraak van een brandstof gaat stapsgewijs. Voor elke stap is een
eigen (specifiek) enzym nodig.
Op grond van hun energiestofwisseling zijn micro-organismen in
groepen te onderscheiden en in de praktijk te herkennen.
 de biosynthesestofwisseling of de assimilatie
uit bouwstoffen worden met behulp van ATP de celstructuren en
noodzakelijke enzymen gemaakt. Hierbij worden eenvoudige
moleculen tot veel grotere moleculen opgebouwd zoals enzymen en
DNA, of nog grotere structuren zoals bijvoorbeeld de celwand.
Dit gaat onvoorstelbaar snel: een Escherichia coli-cel vormt per
seconde 12000 lipiden en 3000 eiwitmoleculen.
Deze processen worden mogelijk gemaakt door de werking van
honderden verschillende enzymen.
Elk micro-organisme heeft zijn eigen specifieke set enzymen waardoor
herkenning en determinatie tot op de soort mogelijk is.
1.3 Enzymen
Enzymen zijn het gereedschap van de (bacterie)cel. Zoals bekend ligt
de mogelijkheid om bepaalde eiwitten te maken verankerd in het DNA
.
Enzymen zijn eiwitmoleculen. Eiwitten zijn lange ketens van
aminozuren. Er zijn 20 verschillende aminozuren . Een eiwit kan
honderden aminozuren lang zijn. Door verschil in volgorde en
samenstelling zijn er ontelbaar veel combinaties mogelijk, er zijn dus
heel (veel) verschillende enzymen mogelijk.
De samenstelling van een eiwit bepaalt de ruimtelijke bouw ervan.
C.M.Wiersema 2006
5
Micro-organismen en milieu
De ruimtelijke bouw bepaalt wat het enzym kan.
Het enzym bezit zo'n goede pasvorm dat daar meestal maar één type
beginproduct (het substraat) in past - zoals in een goed slot maar één
sleutel past- en houdt dit substraat zo goed omsloten dat het substraat
veranderd kan worden in een andere stof of andere stoffen.
Zo is het enzym dat lactose kan splitsen zo gebouwd dat lactose er
goed in past. Een enzym is behalve substraat-specifiek ook
werkingsspecifiek. Dat wil zeggen dat ze maar één soort reactie laat
plaatsvinden.
De verschillen bij de bacteriën worden dus veroorzaakt door dat elke
bacteriesoort zijn eigen enzymen heeft.
Zo kan Escherichia coli lactose wel splitsen en Salmonella niet. De
oorzaak is het al of niet bezitten van het DNA dat de informatie draagt
voor de synthese van het lactosesplitsende enzym. Omgekeerd heeft
Salmonella weer eigenschappen die Escherichia coli mist zoals de
mogelijkheid om H2S te vormen.
Van dergelijke eigenschappen maakt men gebruik om de bacterie
op een (specifieke) voedingsbodem te herkennen.
C.M.Wiersema 2000
6
C.M.Wiersema 2006
7
Micro-organismen en milieu
2 .De energiestofwisseling of dissimilatie
2.1 Inleiding
Net zo als mens en dier hebben micro-organismen energie in de vorm
van ATP nodig voor:
-de groei, Het maken van nieuw celmateriaal (assimilatie) kost zeer
veel energie
-het onderhoud van de cel, ook het in standhouden van de cel kost
energie
-actief transport over de cytoplasmamembraan
-de beweging van de cel
Deze energie winnen de meeste micro-organismen door een
organische stof te oxyderen. Bij deze afbraak (dissimilatie) ontstaat
ATP.
Deze afbraak van een organische stof (energiebron) kan net zoals bij
de mens geschieden door middel van de aerobe ademhaling, maar
er zijn bij micro-organismen nog veel meer mogelijkheden. Elke
groep (of zelfs) soort heeft zijn eigen type energiestofwisseling.
In onderstaande bespreking van de energiestofwisseling bij microorganismen wordt de energiestofwisseling bij de mens als bekend
verondersteld omdat deze al bij biologie is behandeld. Welke stof je
moet weten is als losse bijlage aan deze module toegevoegd.
Bij de toets van deze module mag je de bijlage gebruiken, mits er geen
aantekeningen op staan.
C.M.Wiersema 2000
8
2.1 Leven met of zonder zuurstof
Hoewel bijna alle planten en dieren bij de dissimilatie zuurstof nodig
hebben, is dit niet het geval bij alle micro-organismen. Veel microorganismen zijn in staat om zonder zuurstof (anaeroob) te leven
doordat ze in staat zijn de brandstof te verbranden zonder dat er
zuurstof bij nodig is. Ook zijn er enkele soorten die zich uitsluitend
zonder zuurstof kunnen ontwikkelen. Wat de invloed van de zuurstof
op de groei betreft kunnen we de mico-organismen als volgt indelen:
a.
b.
c.
Strikt of obligaat aerobe micro-organismen, die zich uitsluitend in
aanwezigheid van zuurstof kunnen ontwikkelen en zonder zuurstof
zelfs afsterven.
Voorbeelden hiervan zijn :
Pseudomonas
De meeste schimmels
Facultatief anaerobe micro-organismen,
die zich zowel in aanwezigheid als in afwezigheid van zuurstof
ontwikkelen. Voorbeelden zijn :
alle Enterobacteriën
de meeste Bacillussoorten
de staphylococcen
Listeria
de meeste gisten
Microaerofiele micro-organismen,
die zich het beste bij verminderde zuurstofconcentraties kunnen
ontwikkelen. Voorbeelden zijn
Lactobacillus
Campylobacter.
C.M.Wiersema 2006
9
Micro-organismen en milieu
d.
Strikt anaerobe micro-organismen,
die zich uitsluitend zonder zuurstof kunnen vermeerderen. De mate
waarin ze last hebben van zuurstof verschilt. Er zijn bacteriën met een
anaerobe stofwisseling die kleine hoeveelheden zuurstof kunnen
verdragen, zoals
Propionzuurbacteriën
Clostridium perfringens.
Tot slot zijn er binnen deze groep de bacteriën waarvoor elk spoortje
zuurstof giftig is, deze zijn zeer lastig te kweken.
e. Zuurstoftolerante anaerobe micro-organismen
Deze gebruiken geen zuurstof voor hun stofwisseling maar hebben er
ook geen last van.
De lactococcen zijn hier en goed voorbeeld van.
2.3 De aerobe ademhaling
Zowel strikt aerobe micro-organismen als facultatief anaerobe microorganismen zijn in staat tot een aerobe ademhaling.( zie bijlage)
Ze halen dankzij de ademhalingsketen veel energie uit hun
energiebron (in veel gevallen glucose). Zuurstof is hierbij de externe,
terminale waterstofacceptor.
Ook grotere moleculen als glucose (een monosaccharide) kunnen
door veel micro-organismen gebruikt worden. Voorwaarde is dan
wel dat het betreffende micro-organisme beschikt over een (of
meerder) enzym(en) die het grote molecuul splitst in monomeren die
daarna in de energiestofwisseling worden gebruikt. Een bekend
voorbeeld zijn de coliformen die met het enzym
- galactosidase
lactose (een disaccharide) splitsen in de monosacchariden glucose en
galactose. Ook zijn er micro-organismen die met het exo-enzym
amylase zetmeel in kleinere stukjes nl. glucosemoleculen splitsen.
Een (organische) chemische energiebron hoeft niet altijd glucose te
zijn ! Ook de tussenproducten in de ademhaling (glycolyse en citroenzuurcyclus) kunnen uit het medium door het micro-organisme
worden opgenomen en benut worden voor de ATP-winning.
Een bacterie kan ook een aminozuur als energiebron gebruiken, hij
haalt er de aminogroep af en het molecuul dat overblijft kan vaak vrij
eenvoudig meedoen in de citroenzuurcyclus.
C.M.Wiersema 2000
10
Niet altijd is een micro-organisme in staat een energiebron volledig te
oxyderen dus de hele energiestofwisseling af te maken doordat er
bepaalde enzymen ontbreken.
Ook zijn er micro-organismen die niet bij het officiele begin van de
energiestofwisseling beginnen maar slechts een gedeelte van de
biochemisch route afleggen, of een iets andere weg hebben. Zo zijn er
de azijnzuurbacteriën die ethylalcohol oxyderen tot azijnzuur. Deze
hebben wel een ademhalingketen maar slechts een beperkt aantal
enzymen waardoor azijnzuur niet verder in de citroenzuurcyclus wordt
afgebroken en in feite dus minder NADH en dus ATP wordt gevormd
als bij een volledige verbranding het geval zou zijn.
2.4 De anaerobe ademhaling
Sommige micro-organismen hebben een anaerobe ademhaling. Dat
wil zeggen dat ze over een ademhalingsketen beschikken (zie
bijlage).
Als we een vergelijking maken met de aerobe ademhaling dan is er
één verschil: er wordt geen zuurstof gebruikt als laatste stof om
gevormd NADH te oxyderen ( en zo ATP) te winnen maar een
andere stof die electronen kan opnemen zoals nitraat en sulfaat.
2.4.1 Nitraatademhaling
Deze anaerobe ademhaling waarbij nitraat als terminale
waterstofacceptor fungeert ( dus zuurstof "vervangt") komt onder
ander voor bij alle enterobacteriën en veel Bacillussoorten.
Het betreft hier micro-organismen die facultatief anaeroob zijn. Is er
zuurstof dan hebben ze een aerobe ademhaling, is de zuurstof er niet
(meer) dan schakelen ze over op de anaerobe ademhaling mits er
nitraat aanwezig is.
Dit nitraat wordt gereduceerd tot nitriet en dit nitriet kan weer verder
omgezet worden tot stikstofgas. Dankzij deze reductie wordt NADH
weer geoxydeerd en vindt tegelijk ATP-vorming plaats (zie bijlage :
ademhalingsketen)
C.M.Wiersema 2006
11
Micro-organismen en milieu
2.4.2 De sulfaatademhaling
De sulfaatademhaling vindt uitsluitend plaats in strikt anaerobe
bacteriën. Voorbeelden hiervan zijn Desulfovibrio en soorten uit het
geslacht Clostridium.
Sulfaat, thiosulfaat of sulfiet worden tot H2S of een sulfide
gereduceerd. ook weer met uiteindelijk doel de winning van ATP.
2.2 De gisting
Een veel vaker voorkomende manier om zonder zuurstof energie uit
een brandstof halen is de gisting. Deze brandstof kan glucose zijn,
maar ook grotere stoffen kunnen als energiebron benut worden mits de
enzymen die deze kunnen afbreken tot glucose aanwezig
zijn.Dervolgens vindt de vergisting van glucose plaats. Elk microorganisme doet dat op een andere manier. Als voorbeeld nemen we
een Lactobacillussoort die uitsluitend melkzuur vormt uit glucose:
glucosemelkzuur + 2 ATP
in formule: C6H12O62 C3H6O3 + 2 ATP
Opvallend is dat er geen externe waterstofaccceptor (wat is dat?) nodig
is, de cel zorgt zelf voor een hulpstof waardoor de glucose toch als
energiebron kan dienen. Glucose kan nu echter niet volledig verbrand
worden. Er ontstaat melkzuur dat verder niet gebruikt wordt door de
cel en wordt uitgescheiden. Het gevolg is dat er veel minder ATP
gevormd wordt als bij de aerobe verbranding (tot kooldioxide).
Een ander kenmerk van de gisting is dat het gevormde NADH niet in
een ademhalingsketen geoxydeerd kan worden waardoor er vergeleken
met een stofwisseling waarbij deze wel aanwezig is veel ATP verloren
gaat!
Zo'n anaerobe afbraak van glucose waarbij een ademhalingsketen
ontbreekt wordt een gisting of fermentatie genoemd. Elke (groep)
micro-organisme(n) heeft zijn eigen vergistingstype, dat wil zeggen
zijn eigen eindproducten die bij de gisting gevormd worden.
C.M.Wiersema 2000
12
2.3 De gisting nader bekeken
De eerste fase in de gisting is de glycolyse , en komt dus overeen met
de eerste fase in de ademhaling.
Daarna komt het verschil.
De tweede fase is terugvormen van NAD uit NADH.
Dit gebeurt door het eindproduct van de glycolyse, het pyruvaat, te
gebruiken om het H (electronen) aan af te geven. Er is dus sprake van
een interne ,zelf gemaakte, waterstofacceptor :pyruvaat. Deze
omzetting van pyruvaat met als doel NAD weer opnieuw te kunnen
gebruiken in de glycolyse kan op zeer veel verschillende manieren
geschieden, elke manier door een ander micro-organisme en met
andere eindproducten.
plaatje Knecht
C.M.Wiersema 2006
13
Micro-organismen en milieu
2.4 Belangrijke groepen micro-organismen met een anaerobe
stofwiseling
De melkzuurbacteriën
Dit is een verzamelnaam voor alle bacteriën die een obligate
melkzuurvergisting hebben. Dat wil zeggen dat ze niet aeroob
kunnen ademhalen, hun enige manier om energie te winnen is de
anaerobe vergisting.
Ze zijn grampositief, vormen geen sporen en zijn onbeweeglijk.
Ze vormen geen katalase. Toch zijn veel melkzuurbacteriën in staat
om in aanwezigheid van niet te veel zuurstof te groeien, het is wel
handig voor de determinatie : een aeroob groeiende bacterie zonder
katalase is vrijwel zeker een melkzuurbacterie.
Een ander gemeenschappelijk kenmerk is hun behoefte aan een rijk
medium.
Door deze hoge voedingseisen treft men ze aan op voedselrijke
plekjes. Men treft ze vrijwel nooit zomaar aan in de bodem of in het
water. De plaatsen waar ze van nature voorkomen zijn :
a. Melk, en de plaatsen waar dit wordt gewonnen of verwerkt.
b. Intacte en verterende plantendelen.
c. De darm en de slijmlagen van mens en dier
Door de grote hoeveelheden melkzuur die ze vormen en hun eigen
zuurtolerantie zijn ze in deze milieus al snel in de meerderheid.
Er zijn twee typen melkzuurvergisting, de homofermentatieve
melkzuurvergisting waarbij uitsluitend melkzuur gevormd wordt. en
de heterofermentatieve melkzuurvergisting waarbij naast melkzuur
ook kooldioxide (en azijnzuur of ethanol) gevormd wordt.
C.M.Wiersema 2000
14
Clostridia
Deze groep is strikt anaeroob, ze zijn katalasenegatief. Het zijn
staafvormige sporevormende bacterien. Strikt anaeroob wil zeggen
dat zuurstof giftig is.
Een van de vergistingsproducten is meestal boterzuur. Daarnaast
azijnzuur, kooldioxide en waterstof. Als substraat kan glucose worden
gebruikt maar ook veel grotere moleculen als zetmeel. Clostridium
tyrobutyricum kan lactaat (eindproduct van de melkzuurvergisting) als
energiebron gebruiken . Daarnaast is er een groep Clostridia die in
staat zijn eiwitten (peptonen, aminozuren) af te breken tot vergistbare
stoffen . Hieronder vallen de soorten Clostridiun botulinum en
Clostridium tetani.
C.M.Wiersema 2006
15
Micro-organismen en milieu
Propionzuurbacteriën
Het geslacht Propionibacterium heeft een anaerobe leefwijze. Ze zijn
meer aan anaerobe omstandigheden gebonden als de melkzuurbacteriën, maar verdragen kleine hoeveelheden zuurstof, ze zijn
microaerotolerant en in het bezit van katalase.
Propionzuurbacteriën komen voor in de pens en darm van herkauwers,
daar vormen ze voor deze dieren onmisbare vetzuren. In de melk
komen ze niet voor, ook zijn ze niet uit de bodem of uit water te
isoleren.
Waar ze in geënt worden is in Emmenthaler kaas waar ze zorgen voor
de karakteristieke grote gaten en de zoete smaak van deze kaas. Als
substraat gebruiken ze de melkzuur, in een eerder stadium gevormd
door de melkzuurbacteriën.
2.5 Oxydasetest
Er is een eenvoudige snelle en goedkope test om de strikt aerobe
micro-organismen
zoals
bijvoorbeeld
Pseudomonas
te
onderscheiden van de facultatief anaerobe micro-organismen zoals
de Enterobacteriën. Dit is de oxydasetest. Met deze test wordt een
ademhalingsenzym aangetoond dat in strikt aerobe micro-organismen
in zo'n hoge concentratie aanwezig is dat het zeer snel aantoonbaar is.
De bepaling zelf is zeer eenvoudig: men brengt wat koloniemateriaal
op een papiertje waarin zich stoffen ( N,N-dimethyl-pphenyleendiamine en ALFA-naphtol) bevinden die in aanwezigheid
van het oxydase direct donkerpaars kleuren. Is deze test positief dan
weet men dat men niet met een enterobacterie te maken heeft.
2.6 Katalasetest
Micro-organismen die in staat zijn tot een aerobe ademhaling
bezitten het enzym katalase, dat waterstofperoxide splitst in water en
zuurstof:
2 H2O2
2 H2O + 2 O2
C.M.Wiersema 2000
16
Waterstofperoxide onstaat tijdens de aerobe ademhaling, het is giftig.
Katalase voorkomt dus afsterving van de bacteriecel door het peroxide
af te breken.
Het bezit van katalase is heel snel vast te stellen door
waterstofperoxide in contact te brengen met koloniemateriaal. Bij een
positieve reactie ontstaan er direct na toevoeging belletjes, bij een
negatieve reactie ontstaan geen belletjes of pas na 30-40 seconden zeer
zwak bruisen ( door het enzyn peroxidase). Alle melkzuurbacteriën
zijn katalasenegatief en zo te onderscheiden van andere grampositieve
coccen en staven.
Een bijzondere plaats nemen de anaerobe Propionzuurbacteriën in,
deze hebben een anaerobe stofwisseling maar zijn wel katalasepositief.
C.M.Wiersema 2006
17
Micro-organismen en milieu
2.7 Anaeroob kweken
In sommige gevallen geven micro-organismen de voorkeur aan de
afwezigheid van zuurstof in hun directe omgeving of minder zuurstof
dan in de lucht voorkomt. Om in deze gevallen de micro-organismen
een voor de groei geschikt milieu te geven moet men speciale
maatregelen treffen.
a.
Het toevoegen van zuurstofbindende stoffen.
Aan een vloeibare voedingsbodem worden zuurstofbindende stoffen
toegevoegd.
Bekende voorbeelden zijn thioglycollaat en cysteine. Om na te gaan
of het in het medium inderdaad anaeroob is voegt men een zuurstofindicator toe. Deze zuurstofindicator is kleurloos onder anaerobe
omstandigheden maar wordt gekleurd (blauw bij methyleenblauw en
rood bij resazurine) als er zuurstof aanwezig
b
Het afsluiten van het medium van de omgeving (lucht).
Een andere methode (eventueel in combinatie met methode a) is het
afsluiten van een vloeibaar medium met een laagje paraffine of een
vast medium met een extra laag van het vaste medium.
c.
Het scheppen van een zuurstofarme omgeving
Een derde mogelijkheid is om het medium met de micro-organisme
erin of erop in een zuurstofvrije omgeving te brengen. Dit is meestal
een anaerobe pot. In deze pot gaat nadat de beënte media erin gestopt
zijn een bepaalde stof de zuurstof uit de lucht te binden. Verder wordt
er nog een zuurstofindicator bijgedaan om te zien of het inderdaad
anaeroob wordt. Deze zuurstofindicator is kleurloos onder anaerobe
omstandigheden maar wordt gekleurd (blauw bij methyleenblauw en
rood bij resazurine) als er zuurstof aanwezig is.
C.M.Wiersema 2000
18
2.8 Indeling op grond van stofwisseling
Met de tot nu toe besproken stofwisselingseigenschappen: oxydase,
katalase, aeroob of /en anaeroob kunnen we de bacteriën weer wat
beter indelen. Het is een indeling die te gebruiken is om snel een
onbekende bacterie thuis te brengen in de juiste groep. Ook kan men
op deze manier mogelijkheden uitsluiten. Een oxydase-positieve
gramnegatieve staaf is nooit een enterobacterie, een katalase positieve
grampositieve bacterie is geen melkzuurbacterie.
C.M.Wiersema 2006
19
Micro-organismen en milieu
C.M.Wiersema 2000
20
2.9 Chemo-organotroof versus chemolithotroof
Tot nu toe hebben we het uitsluitend gehad over de bacteriën die een
organische stof als energiebron gebruiken. Deze micro-organismen
noemt men chemo-organotroof. De weinige micro-organismen die een
anorganische stof als energiebron gebruiken noemen we chemolithotroof.
Gemeenschappelijke eigenschap is dat beide een chemische
verbinding als energiebron gebruiken.
Hierin verschillen ze van de fototrofe micro-organismen die hun
energie uit licht halen.
Energiebron
Naam
organisch
chemo-organotroof
anorganisch
chemo-lithotroof
licht
fototroof
C.M.Wiersema 2006
21
Micro-organismen en milieu
C.M.Wiersema 2000
22
3 De opbouw van celmateriaal of assimilatie
3.1 Welke bouwstoffen heeft een bacterie allemaal nodig?
Tot nu toe is alleen het gebruik van de brandstof aan de orde geweest.
De energie die daarmee wordt gewonnen wordt in hoofdzaak gebruikt
voor de groei. Dus geen groei zonder energiebron.
Echter, ook bouwstoffen zijn noodzakelijk.
Alle elementen die de bacteriecel bevat moeten uiteraard ook in
het medium worden aangeboden.
Het betreft de elementen koolstof (C), waterstof (H), zuurstof (O),
stikstof (N), zwavel (S) en fosfor (P), ook wel CHONSP. Daarnaast
heeft een bacterie nog wat andere elementen nodig in kleinere hoeveelheden, zoals ijzer (Fe) en magnesium (Mg).
3.2 De koolstofbron
3.2.1.Heterotrofe micro-organismen
Glucose of andere suikers zijn voor de cel een aanvoermogelijkheid
voor koolstof. Dat betekent dat deze suikermoleculen behalve als
energiebron ook de basis kunnen zijn voor de aanmaak van alle
organische stoffen in de cel. Of een cel alle koolstofverbindingen met
glucose als uitgangspunt kan maken hangt van het biosynthetisch
vermogen van de bacterie. Zo is Escherichia coli in staat om met
glucose als enige organische stof in het medium alle noodzakelijke
biomoleculen zelf te maken. Op zo'n medium zal een
melkzuurbacterie nooit kunnen groeien. Tegelijk met de koolstof krijgt
de bacterie ook de waterstof en de zuurstofatomen binnen, elementen
die in vrijwel alle organische stoffen aanwezig zijn en dus ook nodig.
Alle micro-organismen die een organische koolstofbron nodig
hebbem voor de opbouw van hun celmateriaal noemen we
heterotroof.
C.M.Wiersema 2006
23
Micro-organismen en milieu
3.2.2
Dit in tegenstelling tot de micro-organismen die hun organische
celbestanddelen (zelf) kunnen maken uit koolstofdioxide ( CO2), de
zogenaamde autotrofe micro-organismen.
Voorbeelden van autotrofe micro-organismen zijn veel
fotosynthetische micro-organismen ; de eukaryote algen, de
prokaryote blauwalgen en de prokaryote fotosynthetische bacteriën.
Een tweede groep van (koolstof)autotrofe micro-organismen zijn de
chemolithotrofe micro-organismen.
3.2.3Indeling en naamgeving micro-organismen wat betreft gebruikte
E- bron en C-bron
E-bron
naam
C-bron
naam
totale naam
organisch
chemoorganotroof
organisch
heterotroof
chemoorganoheterotroof
anorganisch
chemo-lithotroof
anorganisch
autotroof
chemo-lithoautotroof
licht
fototroof
anorganisch
autotroof
fotoautotroof
In de dagelijkse laboratoriumpraktijk is de eerste groep micro-organismen het
belangrijkste, het zijn de micro-organismen die ziekte veroorzaken of in een
levensmiddel goed kunnen gedijen.
De ander twee groepen spelen wel een belangrijke rol in de natuur maar
worden op het lab weinig gekweekt, reden om er in deze module verder geen
aandacht aan te besteden.
C.M.Wiersema 2000
24
3.3 De stikstofbron
In de bacteriecel zitten ook veel macromoleculen die stikstof bevatten.
Dit zijn onder andere de eiwitten, het DNA, het RNA, de ATPmoleculen.
Ook hier geldt weer dat het biosynthetisch vermogen van de
bacteriën sterk verschilt. Er zijn (koolstof)heterotrofe bacteriën die
met nitraat als enige stikstofbron kunnen groeien, dat wil dus zeggen
dat ze het stikstof uit nitraat kunnen gebruiken om alle stikstofverbindingen in de cel te maken. Uiteraard kost dit "doe het zelven" de
bacterie veel energie. Geef je een aantal nodige stikstofverbindingen
kant en klaar of in een "prefab" uitvoering dan zal de bacterie harder
groeien als de bacterie die het met een minimaal medium moet stellen.
Bacteriën die helemaal niet kunnen doe het zelven zijn de
melkzuurbacteriën. Deze moeten een medium hebben waarin alle
aminozuren kant en klaar aanwezig zijn, anders kunnen ze geen
eiwitten maken. Ook alle andere organische stikstofverbindingen
moeten hun worden aangeboden anders zullen ze niet groeien.
3.4 Zwavel
Zwavel komt voor in eiwitten, het zit in een zwavelhoudend
aminozuur. Met dit aminozuur zijn extra bindingen in het eiwit
mogelijk, waardoor het eiwit steviger wordt en beter bestand is tegen
verhitting. Zwavel kan als sulfaat worden gegeven, maar kan ook door
het micro-organisme uit het pepton worden betrokken in "kant en
klare vorm".
3.5 Fosfaat
Fosfaat is nodig voor ATP, DNA, RNA en fosfolipiden, het kan in
fosfaatvorm worden toegediend maar ook door het micro-organisme
uit de nucleïnezuren (aanwezig in pepton) worden gehaald.
C.M.Wiersema 2006
25
Micro-organismen en milieu
3.6 Overige elementen
De eerder genoemde elementen koolstof, waterstof, zuurstof, stikstof,
zwavel en fosfaat zijn in vrij grote hoeveelheden nodig (om zichtbare
groei te krijgen). Naast deze elementen kunnen een aantal andere
elementen ook niet gemist worden, de nodige concentraties zijn echter
veel lager, zo laag dat ze vaak niet apart hoeven worden toegediend
maar wel in de andere natuurlijke ingrediënten aanwezig zijn. Ze gaan
bij de receptuur meestal pas een rol spelen als het medium geen
natuurlijke ingredinten bevat zoals pepton of gistextract.
De meest bekende zijn : Natrium (Na), Kalium (K), Calcium (Ca),
ijzer (Fe), en magnesium (Mg).
C.M.Wiersema 2000
26
C.M.Wiersema 2006
27
Micro-organismen en milieu
4 De samenstelling van een algemeen medium
4.1
Inleiding
Onder een algemeen medium verstaat men een medium zonder stoffen
die een remmende invloed hebben op de groei van een groep microorganismen. Bekende voorbeelden zijn bouillonagar, bouillon en
plate count agar. Het wil niet zeggen dat letterlijk alle microorganismen erop willen groeien
4.2 het gebruik van een algemeen vloeibaar medium, in de praktijk
In een aantal gevallen brengt men een monster (kweekt men microorganismen) in een algemeen vloeibaar medium. Dit gebeurt onder
andere als eerste stap bij de Salmonellabepaling om de bacterie in een
goede conditie te krijgen voor het vervolg van de bepaling, de
zogenaamde resuscitatie. Resuscitatie wordt ook bij andere
bepalingen toegepast als een micro-organisme in voor hem slechte
omstandigheden heeft verkeerd en men kan verwachten dat het microorganisme zonder resuscitatie de bepaling niet overleeft of in ieder
geval niet goed gaat groeien en dus niet of in kleinere aantallen wordt
aangetoond. Deze bepalingen zijn meestal bepalingen waarbij
selectieve stoffen worden gebruikt.
Ook het kweken van reeds reingekweekte micro-organismen
gebeurt in een algemeen vloeibaar medium.
4.3 Het gebruik van een algemene vaste voedingsbodem
Dankzij de ontdekking van de agar-agar beschikt men gelukkig over
de mogelijkheid een voedingsbodem vast te maken, en kan men algemene vaste voedingsbodems gebruiken.(de selectieve vaste
voedingsbodems komen nog aan de orde).Het grote voordeel hiervan
is dat vrijwel alle micro-organismen hierop kolonies te vormen.
Ook kan men micro-organismen reinkweken. Dit is onmisbaar voor
C.M.Wiersema 2000
28
de daaropvolgende determinatie.
Ook is een telling mogelijk: het zogenaamde totale kiemgetal.
Uiteraard telt men niet echt alle micro-organismen, de incubatietemperatuur, het al dan niet aeroob incuberen en een verhitting als
voorbehandeling zorgen altijd voor een bepaalde selectie.
Zo spreekt men van het aantal aerobe mesofiele micro-organismen als
beert.
Van de micro-organismen die groeien is het in een aantal gevallen
mogelijk om op de algemene voedingsbodem al aan het uiterlijk en de
geur van de kolonie de bacterie te herkennen.
Ook kan van één bepaald micro-organisme (kolonie) een preparaat
gemaakt worden en/of een oxidase of katalasetest uitgevoerd worden,
tevens kan het micro-organisme verder rein gekweekt worden. Zo
komen we weer stapje verder in het op naam brengen van een
onbekend micro-organisme.
4.4 Rijke en arme voedingsbodems
De samenstelling van een medium waarop een bacterie goed kan
groeien hangt dus af van de eisen die een bacterie stelt). Uiteraard
moet CHONSP erin zitten, de vraag is echter in welke
(molecuul)vorm deze elementen in het medium zitten. Een
veeleisende melkzuurbacterie met twee linkerhanden heeft meer
verschillende stoffen nodig dan de doe het zelver Escherichia coli. Zie
de volgende bladzijde , daar staat een medium beschreven met de stoffen die een melkzuurbacterie minimaal nodig heeft voor zijn groei en
een mediun dat Escherichia coli minimaal nodig heeft voor zijn groei.
Toch zal deze laatste als hem een rijk medium wordt aangeboden geen
nee zeggen, hij maakt dankbaar gebruik van de kant en klare verbindingen en gaat ze niet zelf meer maken :zonde van de energie die
dat kost!! De energie die is niet alleen nodig voor het bouwen zelf,
voordat het bouwen kan beginnen moet een bacterie ook het gereedschap- de enzymen- zelf maken.
C.M.Wiersema 2006
29
Micro-organismen en milieu
C.M.Wiersema 2000
30
4.5 Natuurlijke ingrediënten
Peptonen
Zo'n rijk medium waarin veel verschillende stoffen zitten hoeven we
niet uit al die afzonderlijke stoffen te gaan samenstellen. Dus alle
twintig aminozuren hoeven we niet één voor één af te wegen en daarna
bij elkaar te gooien. Dat is bewerkelijk, duur en niet nodig. Omdat alle
organismen eiwitten bevatten kun men ook vlees, melk of soja
gebruiken. "Men" is in dit geval de fabrikant van de voedingsbodem.
Omdat de eiwitten in de genoemde grondstoffen te groot zijn om de
celmembraan te passeren wordt de grondstof met enzymen behandeld
waardoor de eiwitten in kleine ketens van aminozuren worden
gesplitst. Uiteraard zitten in vlees, melk, soja ook de andere (gesplitste) grote biomoleculen zoals DNA, RNA, fosfolipiden . De meeste
bacteriën hebben wat betreft hun bouwstoffen genoeg aan pepton.
Andere natuurlijke ingrediënten
Melkzuurbacteriën krijgen daarnaast nog wat andere natuurlijke
ingrediënten zoals bijvoorbeeld tomatensap.
Voor pathogenen is bloed een vaak gebruikte toevoeging. Ook andere
extracten van dierlijke herkomst worden gebruikt.
Zo kan men uit de leefwijze van het te bepalen micro-organismen vaak
wel afleiden welke voedingseisen het stelt.
C.M.Wiersema 2006
31
Micro-organismen en milieu
4.6 Energiebron
De meeste bacteriën kunnen hun energie uit de pepton halen door
daarin aanwezige aminozuren of vetten af te breken tot verbindingen
die de energiestofwisseling in draaien. Zo bevat bouillonagar pepton
(en geen aparte energiebron).
Een snellere groei wordt mogelijk gemaakt door een koolhydraat als
energiebron toe te voegen en bijvoorbeeld glucose toe te voegen. Dit
is dan ook bij zeer veel media het geval zoals bijvoorbeeld bij Plate
Count Agar.
4.7 Buffer
Wat ook vrijwel altijd in een algemeen medium voorkomt is een buffer. Deze vangt de pH veranderingen op die het micro-organisme
door zijn groei veroorzaakt. Vaak is er sprake van een fosfaatbuffer,
deze is werkzaam in het neutrale gebied (optimum voor de meeste
micro-organismen) en niet giftig.
Door de afbraak van aminozuren worden basische stoffen
gevormd. Bij het gebruik van een koolhydraat als energiebron
ontstaan er zuren.
Ook hebben de aminozuren in pepton een bufferende werking.
4.8 NaCl
Een micro-organisme wordt beinvloed door de osmotische waarde
van de omgeving, bijvoorbeeld de vloeistof waardoor hij wordt
omringd. Een te groot verschil in concentraties opgeloste stoffen
tussen "buiten en binnen" leidt tot problemen. Om dit te voorkomen
wordt in veel gevallen NaCL toegevoegd.
4.9 Water
Uiteraard zijn alle voedingsstoffen opgelost in water. Dit water mag
geen groeiremmende stoffen bevatten. Het micro-organisme heeft het
water zelf ook nodig voor de vorming van de nieuwe cellen: een
C.M.Wiersema 2000
32
bacteriecel bestaat voor het grootste gedeelte uit water.
4.10 Synthetische en natuurlijke media
Uiteraard moet een micro-organisme alle stoffen die hij zelf niet kan
maken in de voedingsbodem aangeboden krijgen.
Men kan deze stoffen allemaal afzonderlijk dus in zuivere vorm een
voor een afwegen en bijelkaar doen. Een alternatief is het gebruik
van natuurlijke ingrediënten zoals pepton, bloed, eidooier
waardoor veel stoffen in een keer tegen lagere kosten in het
medium terecht komen.
Het eerstgenoemde medium noemt men een synthetisch medium,
voordelen zijn dat de samenstelling exact bekend is en het medium
makkelijkreproduceerbaar is.
Nadelen zijn de hoge kosten, zeker bij veeleisende micro-organismen.
In veel gevallen zijn micro-organismen zo niet te kweken omdat niet
alle eisen bekend zijn.
C.M.Wiersema 2006
33
Micro-organismen en milieu
C.M.Wiersema 2000
34
5 Kweekomstandigheden
5.1 Inleiding
Een micro-organisme heeft niet alleen de voor zijn stofwisseling
nodige stoffen in het medium hebben, maar ook de
kweekomstandigheden moeten aan de behoeften en mogelijkheden
van het micro-organisme worden aangepast. Men zal kiezen voor de
meest geschikte kweekomstandigheden, in de meeste gevallen die
omstandigheden waarbij het micro-organisme het snelste groeit.
5.2 De zuurgraad
Elk micro-organisme heeft een bepaalde pH nodig voor de groei. De
pH is een maat voor de zuurgraad van een milieu. Hoe lager de pH,
hoe zuurder het milieu. De meeste bacteriesoorten groeien het beste bij
een pH van 7. Maar tussen 6 en 8 is de groei van bijna alle microorganismen mogelijk, omdat de daarvoor nodige enzymen in dit
gebied het beste werkzaam zijn.
Beneden pH 6 wordt de groei van de meeste micro-organismen
geremd.Heel erg belangrijk is met welk zuur de pH verlaagd is. Is dat
een organisch zuur als melkzuur of azijnzuur dan remt dit de groei
sterker af (dan het geval is met zoutzuur) en kunnen bacteriën zelfs afsterven.
Micro-organismen die ook nog bij lagere pH-waarden (van 4 en 5)
kunnen groeien zijn de melkzuurbacteriën en de schimmels en gisten.
C.M.Wiersema 2006
35
Micro-organismen en milieu
5.3
Temperatuur
De snelheid van chemische reacties is afhankelijk van de temperatuur.
Bij een lage temperatuur verlopen reacties erg langzaam, dit geldt
ook voor de stofwisseling. In een diepvries vindt geen groei plaats, in
een koelkast kunnen sommige micro-organismen al gaan groeien.
Chemische reacties en dus ook de stofwisseling verlopen in eerste
instantie sneller als de temperatuur stijgt. Bij een hogere temperatuur
zal dan ook de groei sneller verlopen.
Deze stijging blijft niet voortduren. Vanaf een bepaalde temperatuur
gaan de hittegevoelige enzymen minder goed werken en uiteindelijk
sterven de cellen af.
De laagste temperatuur waarbij nog groei plaatsvindt heet de
minimuntemperatuur. De hoogste temperatuur waarbij nog groei
mogelijk is heet de maximumtemperatuur. De temperatuur waarbij
de groei het snelst verloopt heet de optimumtemperatuur.
Grafiek die het verband tussen temperatuur en groeisnelheid aangeeft:
C.M.Wiersema 2000
36
Elk micro-organisme heeft zijn eigen minimum, maximum em
optimumtemperatuur. Afhankelijk van de ligging van het optimum
spreekt men van thermofiele , mesofiele en psychrofiele microorganismen.
Thermofiele micro-organismen treft men aan in warme milieus waar
ze als er voedingsstoffen aanwezig zijn razendsnel kunnen groeien.
Mesofiele micro-organismen treft men vrijwel overal aan. Ze zijn
wat temperatuur betreft ook aangepast aan de lichaamtemperatuur van
mens (en warmbloedige) dieren.
Psychrofiele micro-organismen treft men alleen in koude milieus
aan, van nature komem ze voor in gebieden met een koud klimaat.
Dit geldt niet voor micro-organismen met een breed optimum van ca
20 kast) temperaturen te groeien. Deze micro-organismen worden psychrotroof
genoemd. Zo treft men de laatste jaren steeds meer psychrotrofe
stammen van Bacillus cereus aan. Een andere beruchte bacterie die
ook bij lage temperaturen groeit is Listeria monocytogenes.
Er bestaan ook thermotrofe micro-organismen welke ook een breed
optimum hebben maar dan aan de hoge kant van ca 37De verschillende groepen staan hieronder nog eens in een tabel:
type
minimum
optimum
maximum
psychrofiel
- 15
10-15
18-20
psychrotroof
-5
20-30
35-40
mesofiel
+5-10
30-37
ca 45
thermotroof
10
37-47
ca 50
thermofiel
25-45
50-80
60-85
Wanneer we bovenstaande groepen in een grafiek weergeven dan
krijgen we het volgende plaatje:
C.M.Wiersema 2006
37
Micro-organismen en milieu
TORTORA
Kwaliteitscontrole
Om bij de vereiste temperatuur te incuberen gebruikt men een
broedstoof of een waterbad. Van groot belang is de controle van deze
apparatuur, steeds meer laboratoria controleren en registreren de
temperaturen van deze apparaten continue , dit in verband met de
kwaliteitscontrole waarbij het verplicht is om (ook achteraf) aan te
tonen dat een bepaling bij de voorgeschreven temperatuur is
uitgevoerd. Is er een storing dan kan men snel ingrijpen en in ieder
geval de afwijkende uitslagen verklaren.
C.M.Wiersema 2000
38
5.4 Osmotische waarde, wateractiviteit
Zonder water is er geen leven. De bacteriecel en zijn omgeving
bestaan grotendeels uit water. Voortdurend gaat er water in en uit de
cel. Zijn de concentraties aan opgeloste stoffen binnen en buiten de cel
aan elkaar gelijk dan merken we niets van deze waterbewegingen,
bevinden zich in de bacteriecel meer opgeloste stoffen als daarbuiten
dan zal er meer water naar binnen gaan dan naar buiten. De cel zuigt
als het ware water aan, er ontstaat een druk op de celmembraan en ook
op de celwand, deze laatste is stevig en kan tot bepaalde grenzen deze
druk weerstaan.
Gebeurt nu het omgekeerde, is dus de concentratie aan opgeloste
stoffen buiten de cel hoger dan binnen de cel, dan wordt er water aan
de cel onttrokken, de cel droogt als het ware uit.Zie onderstaande
figuur.
De mate waarin een omgeving water kan aantrekken wordt ook
wel wateractiviteit genoemd.Een milieu met een lage wateractiviteit
trekt zelf water aan uit de omgeving. De wateractiviteit is afhankelijk
van het vochtgehalte en de hoeveelheid en de aard van de opgeloste
stoffen.
C.M.Wiersema 2006
39
Micro-organismen en milieu
Micro-organismen zijn in verschillende mate gevoelig voor een
lage wateractiviteit
Ook hier zijn er weer micro-organismen die tegen extreme
omstandigheden kunnen en wel tegen een lage wateractiviteit kunnen.
Het zijn de
- osmofiele micro-organismen die uitsluitend in een suikerrijk milieu
kunnen groeien,
- xerofiele micro-organismen die uitsluitend in een vochtarm milieu
kunnen groeien
-halofiele micro-organismen die uitsluitend in een zoutrijk milieu
kunnen groeien.
Op het lab waar alles er op gericht is om eventueel aanwezige, te
bepalen micro-organismen goed te laten groeien moet men er alert op
zijn dat een cel niet teveel water "wil" opzuigen of juist met uitdrogen
bedreigt wordt.
C.M.Wiersema 2000
40
6 Selectief kweken
6.1 Waarom selectief kweken?
In veel gevallen is men geinteresseerd in slechts één bepaalde groep
bacteriën of zelfs één bepaalde bacteriesoort. Immers micro-organismen komen overal voor, dus dat ergens bacteriën inzitten is vaak
niet interessant. Veel interessanter of er een risico is voor de
volksgezondheid of dat materiaal ziekteverwekkers bevat. Het
onderzoek moet dus een betekenis hebben. Zo zal men willen weten of
in een bepaald product al of niet Enterobacteriën voorkomen of bijvoorbeeld Listeria monocytogenes. De aanwezigheid van Enterobacteriën heeft wel degelijk een betekenis, omdat deze aanwezigheid aantoont dat tijdens de fabrikage een nabesmetting heeft plaatsgevonden.
En Listeria in een product vormt een risico voor de consument.
Hetzelfde geldt voor het onderzoek van patiëntenmateriaal, het is niet
interssant dat er micro-organismen aanwezig zijn, maar wel belangrijk
om te weten of er een bepaalde ziekteverwekker aanwezig is.
6.2 Het gebruik van vloeibare (s)electieve media
Vloeibare selectieve voedingsmedia worden gebruikt voor
* ophopingsmedia:
omdat in een monster (klinisch materiaal zoals bv. faeces of een
levensmiddel zoals een broodje tartaar) altijd meer micro-organismen
zitten die men niet wil bepalen dan die men wel wil bepalen moet men
proberen de eerste 'ongewenste" groep in de groei te remmen en er
tegelijk voor zorgen dat het gezochte beest zich ongebreideld kan
vermenigvuldigen. Dit noemt men ophopen, dus zorgen voor een
groter aandeel van het gezochte micro-organisme wt.o.v. de rest wat
ook wel de stoorflora genoemd wordt. Na de ophoping kan men dan
uitstrijken op een (s)elective plaat en zo het gezochte beest verder
reinkweken, zie ook proef 8 ,microbiologie proeven m2b.
C.M.Wiersema 2006
41
Micro-organismen en milieu
* MPN methode:
Wil men een bepaalde groep micro-organismen tellen met de MPNmethode dan kan dat door een (s)electief medium te gebruiken.
* In apparatuur zoals bactometer en bioscreen wordt voor de bepaling
van een bepaalde bacterie(groep) ook een selectief vloeibaar medium
gebruikt.
C.M.Wiersema 2000
42
6.3 Het gebruik van vaste (s)electieve media
Vaste selectieve media worden gebruikt voor:
* isolatie en herkenning gezochte micro-organismen na ophoping,
voorbeeld Salmonella
* bepaling kiemgetal van een bepaalde groep micro-organismen,
voorbeeld entero"s
6.4 Hoe selectief kweken
De kunst van het selectief kweken is de gezochte micro-organismen
wel goed te laten groeien en de andere micro-organismen die vrijwel
altijd ook in het te onderzoeken materiaal aanwezig zijn geen kans te
geven om te groeien of zelfs te doden
Om deze tactiek te laten slagen moet men zich verdiepen in de sterke
en zwakke punten van het gezochte micro-organismen en de andere
micro-organismen
Deze andere micro-organismen die in het product voorkomen noemt
men ook wel de begeleidingsflora of stoorflora. Elk type product heeft
zijn eigen kenmerkende flora, dus daar kan men bij het ontwikkelen
van een bepalingsmethode al rekening mee houden
Enkelen voorbeelden van selectieve behandelingen of kweekomstandigheden zijn:
Een verhittingsstap
cellen maar niet de endosporen.
Een hoge incubatietemperatuur: enterobacteriën afkomstig van
niet meer.
Een anaeroob milieu: voor de kweek van onder andere
Clostridiumsoorten.
Een lage pH: kan gebruikt worden voor de selectie van schimmels,
gisten en melkzuurbacteriën.
Het gebruik van groeiremmende stoffen in de voedingsbodem.
C.M.Wiersema 2006
43
Micro-organismen en milieu
Het gebruik van een specifieke energiebron die het gezochte microorganismen wel en andere micro-organismen niet kunnen gebruiken,
zie $ 6.6.5 en 6.7.7.
6.5 Electiviteit
Tot dusver hebben we het alleen over de selectie gehad, dus het
selectief laten groeien van bepaalde groepen micro-organismen.
Omdat het in veel gevallen niet mogelijk is om alle andere microorganismen in hun groei te remmen is een selectief medium in veel
gevallen tegelijkertijd ook electief. Dat wil zeggen dat men op de plaat
het gezochte micro-organismen aan het kolonieuiterlijk kan onderscheiden van andere -niet gezochte- micro-organismen
De electieve kenmerken worden veroorzaakt door:
* een pH indicator die afbraak E of C of N bron verklapt
* een stof die door een micro-organismen al dan niet wordt
afgebroken, deze afbraak is te zien als een neerslagzone of juist een
opheldering rond de kolonie
* het gebruik van stoffen die uitsluitend door één bepaalde
bacteriegroep of soort kunnen worden omgezet in een bepaalde
kleurstof.
Meer hierover in & 4.7.
6.6 Selectieve groeiremmende of dodende stoffen
De meest gebruikte stoffen die zorgen voor een selectief medium zijn
te verdelen in de volgende groepen:
* anorganische zouten
* kleurstoffen
* oppervlakte-actieve stoffen
C.M.Wiersema 2000
44
* antibiotica
* moeilijke energiebron
6.6.1 Anorganische stoffen
Natriumazide
Wordt gebruikt om gramnegatieve bacteriën in de groei te remmen
(conc 0,02%). Het is een stof die de energiestofwisseling van de bacterie verstoort. Het wordt veel gebruikt in selectieve media voor
Streptococcen.
Bismuth sulfiet
Een stof die in combinatie met briljantgroen bijna alle micro-organismen remt met uitzondering van de Salmonella-soorten. Omdat de stof
erg instabiel is moet het medium steeds vers gemaakt worden.
Lithium(chloride)
Een metaal dat gramnegatieve organismen in de groei remt
Telluriet
Giftig voor gramnegatieve bacteriën maar ook voor veel grampositieve
micro-organismen. Eidooier beschermt staphylococcen tegen de
giftige werking.
Tetrathionaat: deze stof is giftig voor micro-organismen die niet in het
bezit zijn van het enzym tetrathionase. Salmonella bezit dit enzym wel
en is dus ongevoelig voor deze stof (mits de concentratie niet te hoog
is, hoe hoger de incubatietemperatuur, hoe gevoeliger ook Salmonella
wordt).
6.6.2Kleurstoffen
Acriflavine
Wordt veel gebruikt om Listeria op te hopen en te isoleren.
Briljantgroen
Remt de meeste grampositieve en sommige gram-negatieve bacteriën
Malachietgroen
Remt de meeste grampositieve en sommige gram-negatieve bacteriën
Kristalviolet
Remt de meeste grampositieve en sommige gram-negatieve bacteriën
C.M.Wiersema 2006
45
Micro-organismen en milieu
6.6.3Oppervlakactieve stoffen
Galpreparaten
Worden gewonnen uit de galblazen van slachtdieren. Het is een
chemisch ongedefinieerd preparaat, zodat variaties tussen verschillende charges van een medium kunnen optreden. Media met extracten
van natuurproducten dienen dan ook altijd door de fabrikant op hun
werking getest te worden.
De galzouten werken tegen de meeste grampositieve bacteriën en
sommige gramnegatieve bacteriën.
Desoxycholaat
Een specifiek galzout waarvan bekend is dat het het in hoge
concentraties remmend werkt op grampositieve bacteriën en
coliformen en niet op Salmonella, in lagere concentraties kunnen alle
entero's goed groeien en de grampositieve bacterien niet. Citraat
versterkt het remmend effect van desoxycholaat door de binding van
Mg wat de remmende werking van desoxycholaat verzwakt.
Cetrimide
Heeft een breed werkingsspectrum, het werkt in op de membranen van
vrijwel alle micro-organismen behalve Pseudomonas.
Laurylsulfaat
Gaat de groei van grampositieve micro-organismen tegen.
6.6.4Antibiotica
Antibiotica zijn antimicrobe stoffen gevormd door micro-organismen.
Ze werken specifiek, dus tegen bepaalde groepen micro-organismen.
In veel gevallen voegt men een mengsel van twee of drie antibiotica
aan een selectief medium toe. Dit gebeurt vrijwel altijd na sterilisatie,
omdat de meeste antibiotica hittelabiel zijn.
Bekende voorbeelden zijn:
Polymyxine-B-Sulfaat in selectieve media voor Bacillus cereus
C.M.Wiersema 2000
46
Oxytetracycline in media voor de isolatie en teling van schimmels en
gisten
Natamycine om schimmels en gisten in de groei te remmen
6.6.5Moeilijke energiebron
Behalve dat men een remstof kan toevoegen aan een medium om het
selectief te maken is het ook mogelijk om een gemakkelijke
energiebron weg te laten en te vervangen door een energiebron die
maar weinig micro-organismen kunnen gebruiken. Tot deze laatste
groep behoren dan uiteraard de micro-organismen die men wil
bepalen.
Een zeer bekend voorbeeld is lactose en de coliformen. Omdat lactose
alleen door de coliforme enterobacteriën wordt vergist en niet door de
hele groep kan men met deze stof als energiebron de coliformen
bevoordelen, daarnaast kan men deze vergisting zichtbaar maken door
op gasvorming te letten of door de zuurvorming aan te tonen.
6.7 Electieve ingrediënten
Om een bepaalde bacterie te herkennen uit een grotere groep welke op
een selectief medium kan groeien is het buitengewoon handig om het
medium ook electief te maken. Het kan zijn dat alleen de gezochte
bacterie een betekenis heeft voor de kwaliteit van het product en/of de
veiligheid voor de consument. Het selectieve medium laat dan eigenlijk "te veel " micro-organismen groeien zodat de electieve stoffen de
beslissing moeten brengen of men al dan niet met de boosdoener te
maken heeft. Hieronder volgen een aantal voorbeelden van electieve
eigenschappen waarmee het mogelijk is specifieke bacteriën te
herkennen.
C.M.Wiersema 2006
47
Micro-organismen en milieu
6.7.1De vorming van zuur of gas uit een suiker
Zoals in & 4.6.6 al staat vermeld kan men aan een medium een
bepaalde energiebron (suiker) toevoegen en vervolgens nagaan of deze
wordt vergist. Deze vergisting kan men zichtbaar maken door een
pH-indicator aan het medium toe te voegen welke de verzuring
zichtbaar maakt. Alleen rond de zuurvormende kolonies vindt dan een
verkleuring plaats.
Gasvorming is te zien als opstijgende belletjes (prik), of met behulp
van een Durhambuisje waarin het gas opgevangen wordt.
6.7.2De vorming van basische stoffen uit aminozuren
Als er voor hem geen vergistbaar suiker in de buurt is zal een microorganisme zich moeten redden met pepton als energiebron. Zo'n
micro-organisme vormt hieruit dan basische stoffen welke ook
zichtbaar gemaakt kunnen worden met een pH-indicator, zo kan het
zijn dat men een en dezelfde plaat zowel zuurvormende als basevormende soorten kan herkennen (om ze eventueel daarna verder te
onderzoeken).
6.7.3Esculinesplitsing
Kan een bacterie zoals een streptococ esculine splitsen dan onstaat een
zwart gekleurde stof en dus ook een zwarte kolonie.
6.7.4Tellurietomzetting
Kan een bacterie telluriet omzetten tot het zwarte telluur dan vormen
zich zwarte kolonies.
6.7.5Vorming van waterstofsulfide uit sulfiet
Kan een bacterie uit sulfiet sulfide vormen dan onstaat er met
Ijzer(ionen) welke dus ook in het medium moeten zitten een zwart
neerslag
C.M.Wiersema 2000
48
6.7.6Reacties met eidooier
Door het toevoegen van een eidooieremulsie wordt het medium geel
en ondoorschijnend. met deze eidooier zijn verschillende reacties
mogelijk, sommige micro-organismen zijn in staat om door proteolyse
(eiwitsplitsing) een helder zone te vormen rond hun kolonie. Daarnaast
zijn er micro-organismen welke juist een brede neerslagzone vormen
door het het lecithine dat in eidooier zit af te breken. Ook zijn er nog
micro-organismen welke m.b.v. lipase aanwezige vetten splitsen
waarbij vetzuren neerslaan, hierbij ontstaat een kleine neerslagring van
vetzuren.
6.7.7Chromogene substraten
Sinds kort zijn er ook media in de handel waarin zich een zogenaamd
chromogeen of fluorogeen substraat bevindt.
Dit zijn stoffen die door een (uiteraard specifiek) enzym kunnen
worden omgezet in een gekleurde of fluorescerende verbinding.
Omdat het bezit van het enzym dat het substraat kan omzetten soortof groepspecifiek is kan men op een plaat een bepaalde soort of groep
onderscheiden van de andere micro-organismen. Als men dan per
substraat nog een andere kleur kiest kunnen op een medium verschillende groepen micro-oragnismen herkend worden.
Zo kan op een selectieve plaat voor coliformen de coliformen herkend
worden aan hun rode kleur het resultaat van de vorming van een
enzym welke van een bepaald substraat een rode kleur afsplitst wordt
terwijl Escherichia coli dankzij nog een extra soortspecifiek enzym
donkerblauw tot paars wordt.
6.8 De ideale (s)electieve voedingsbodem
Wat is een ideale selectieve voedingsbodem?
Alle aanwezige levende gezochte micro-organismen gaan op het
medium groeien en alle begeleidingsflora groeit niet of wordt zelfs gedood.
Wat is een ideale electieve voedingsbodem?
Alleen het gezochte micro-organismen vertoont de herkennings-
C.M.Wiersema 2006
49
Micro-organismen en milieu
verschijnselen. Alle andere gegroeide m.o (selectiviteit is hier dus niet
ideaal!) zien er heel anders uit.
6.9 De ideale (s)electieve voedingsbodem bestaat niet
Zo ideaal als hierboven beschreven is geen enkele voedingsbodem. Dit
ligt niet alleen aan de voedingsbodem maar ook aan de aanwezige
micro-organismen en het monster waar ze in verblijven. Wat hebben
de te bepalen micro-organismen al meegemaakt? Onder welke
omstandigheden verkeren ze tijdens het bemonsteren of tijdens de
bepaling? Welke andere micro-organismen zijn er aanwezig? en welke
invloed hebben deze tijdens de bepaling op het te bepalen micro-organisme? Dit kan de onderstaande gevolgen hebben.
6.9.1Het medium is te selectief (de te bepalen cellen te kwetsbaar
In veel gevallen kan het gezochte micro-organisme ook minder goed
tegen het selectieve medium. Meestal vind je minder groei op selectieve dan op algemene voedingsbodems als je een monocultuur van je
gezochte micro-organisme op beide media uitplaat.
Dit effect is groter naarmate de conditie van de cellen slechter is: oude
cellen en cellen die aan schadelijke invloeden zijn blootgesteld
geweest zoals een lage pH, verhittingsstap, uitdroging.
Dus hoe meer het product of het productieproces of een eerdere stap in
de bepaling de micro-organisme schade toebrengt hoe voorzichtiger je
moet zijn met de toepassing van selectieve media
6.9.2Het medium is niet (s)electief genoeg
Aan de andere kant moet de begeleidingsflora niet groeien, dus bij een
minder selectief medium meer kans op ongewenste groei hiervan. Dit
geldt vooral voor producten waarin verwante micro-organismen als
begeleidingsflora voorkomen naast het te bepalen micro-organisme.
Hetzelfde geldt voor de electiviteit, het is erg vervelend als een
medium niet electief genoeg is en andere micro-organismen er net zo
C.M.Wiersema 2000
50
uitzien als het gezochte micro-organisme.
In alle situaties moet dus naar een compromis gezocht worden :
begeleidingsflora zo veel mogelijk remmen en gezochte microorganismen zoveel mogelijk ontzien.
C.M.Wiersema 2006
51
Micro-organismen en milieu
7 Het maken van een voedingsbodem
7.1 De verschillende bereidingsstappen
Bij het bereiden van een voedingsbodem komt heel wat kijken.
Vanaf de inkoop tot en met het moment dat de platen klaarstaan voor
gebruik kan er heel wat misgaan.Onder misgaan wordt verstaan dat het
doel van de voedingsbodem tijdens het onderzoek niet gehaald wordt :
het medium heeft een te lage opbrengst, het medium is niet selectief
genoeg,de gezochte micro-organismen zijn niet te herkennen.
Hieronder staan de verschillende stappen genoemd. Bij de oefenvragen
is hier een opdracht bij geschreven, de antwoorden ervan gaan we
klassikaal bespreken.
bewaren droge ingredienten
afwegen
water erbij
inweken
pH controleren, eventueel bijstellen
steriliseren
gieten
drogen
bewaren van de gegoten platen
7.2 Etiketten
Op het etiket van een pot met een voedingsbodem of een ingrediënt
geeft heel veel informatie.
Er staat op:
* Het merk, daaronder
* de naam, altijd engelstalig (soms in het duits)
* het doel, meestal onder de naam van het medium
* de samenstelling, in grammen per liter en de beoogde pH
* de bereidingswijze (inclusief sterilisatiemethode)
* de houdbaarheid(sdatum)
C.M.Wiersema 2000
52
7.2 Het bereiden van een medium uit verschillende ingrediënten
Niet altijd zitten alle ingrediënten voor een medium samen in een pot.
Zo'n medium is dus niet een kant en klaar, alleen nog op te lossen (en
te steriliseren medium).
Het kan zijn dat er nog een enkele stof na het steriliseren aan het
medium moet worden toegevoegd. De reden is meestal dat dit
"toevoegsel" niet tegen verhitten kan. Antibiotica zijn vaak
hittegevoelig. Hetzelfde geldt voor rode bloedcellen en eidooier.
Ook kunnen tijdens het verhitten stoffen met elkaar reageren waardoor
ongewenste groeiremmende stoffen ontstaan. Zo kunnen koolhydraten
en eiwitten (of peptiden) onderling een reactie aangaan waarbij bruin
gekleurde eindproducten ontstaan welke groeiremmend werken.
7.3 Het berekenen van de hoeveelheid nodige stof.
Meestal staat op de pot of in het bereidingsvoorschrift wel vermeld
hoeveel van de droge stof moet worden afgewogen voor een liter
medium.
Het kan zijn dat er met percentages wordt gewerkt, een 1% oplossing
betekent dat 1 gram van de droge stof wordt opgelost in 100 ml water.
Je kunt dus eerst uitrekenen hoeveel medium je nodig hebt voor een
bepaalde proef en dan kun je met dat volume berekenen hoeveel je
moet afwegen.
Als je stoffen in zeer lage concentraties moet toevoegen, zoals
antibiotica en pH indicatoren, dan moet zo,n stof eerst opgelost
worden en dan pas bij het medium worden gepipetteerd.
Als je stoffen afweegt die apart gesteriliseerd moeten worden en
daarna bij het mediun gevoegd, dan moet zo'n stof ook tijdens de
sterilisatie in het water zitten, d.w.z. dat je na afloop van de sterilisatie
het 'bijvoegsel" verdunt met het basismedium en het basismedium met
het "bijvoegsel". Hier zijn oefenvragen over!!
C.M.Wiersema 2006
53
Micro-organismen en milieu
Eerst echter een voorbeeld
broomcresolpurper-glucoseagar.
Broomcresolpurper-glucoseagar:
Maak het volgende basismedium:
trypton
1,0 %
gistextract
0,25 %
NaCL
0,5 %
Agar
1,5 %
Broomcresolpurper 15 mg per liter medium
pH 7,0 + 0,1
sterilisatie:20 minuten,120 C
Maak eveneens een 10 % glucoseoplossing
sterilisatie:35 minuten bij 110 C
Voeg na sterilisatie aan het handwarme basismedium zoveel
glucoseoplossing toe dat de glucoseconcentratie na toevoegen 1 %
wordt.Zorg er ook voor dat dit toegevoegd volume in het basismedium van het volume water is afgetrokken.
Tot zover de tekst uit een voorschrift;
Nu de vragen:
a. Hoeveel van de volgende stoffen moet je afwegen voor 300 ml
medium?
trypton
gistextract
NaCL
Agar
...... gram
.......gram
.......gram
.......gram
b. Wat te doen met broomcresolpurper?
Je kunt 15 mg nog net afwegen, en bent dus gedwongen om 15 mg af
te wegen in een bekend volume water op te lossen en vervolgens de
benodigde hoeveelheid bij de rest van het medium te pipetteren. Je
maakt nog steeds 300 ml medium.
b.1.Hoeveel pipetteer je als je de 15 mg in 10 ml hebt opgelost?
b.2.Hoeveel pipetteer je als je de 15 mg in 15 ml hebt opgelost?
C.M.Wiersema 2000
54
c. Het glucoseprobleem
Je hebt 10% steriele glucoseoplossing gemaakt. Dit wordt toegevoegd
aan het basismedium met de overige stoffen.
c.1.Hoeveel van deze oplossing is nodig voor 300ml medium?
c.2.Hoeveel ml water moet je dus aan de ingrediënten van het
basismedium toevoegen voordat dit gesteriliseerd wordt?
d. een ander glucoseprobleem
je hebt geen 10% oplossing glucose maar een 25% oplossing,
Hoe ga je nu te werk?
Antibiotica
Ook antibiotica moeten vaak in zeer lage concentraties in een medium
zitten. De meeste antibiotica zijn hittegevoelig en moeten dus na
sterilisatie toegevoegd worden aan het medium.
Voordat dit gebeurt wordt het gewenste antibioticum door filtratie
gesteriliseerd: de gewenste hoeveelheid wordt opgelost in een kleine
hoeveelheid vloeistof (meestal water, soms een buffer).Deze kleine
hoeveelheid vloeistof wordt in een injectiespuit gedaan waarop een
filter zit gemonteerd. Nu wordt de vloeistof door het filter in een
steriele buis of fles gespoten en kan daarna de benodigde hoeveelheid
vloeistof (steriel) bij het medium worden gepipetteerd. Het is dus
belangrijk om je niet in de decimalen te vergissen wat gauw gebeurt
bij zulke kleine hoeveelheden. Daarom even een oefenopgave:
In een medium moet uiteindelijk (na sterilisatie) 0,1 mg polymyxine
per ml medium aanwezig zijn. Er wordt 300 ml medium gemaakt.
Hoeveel mg is nodig ?
C.M.Wiersema 2006
55
Micro-organismen en milieu
8 Het bewaren van reinculturen
Om een cultuur te bewaren en in leven te houden zijn er verschillende
methoden mogelijk.
Een reincultuur kan men op een schuine agar bewaren. Men ent de stam en
incubeert de agar tot er redelijke groei te zien is. De agar wordt goed
afgesloten om uitdrogen te voorkomen en in de koelkast bewaard. Sommige
micro-organismen kunnen zo een week, andere weken tot maanden in leven
worden gehouden. Af en toe worden ze overgeënt op een nieuwe agar. In
sommige gevallen, wanneer vaste agar niet voldoet, wordt de stam in
vloeibaar medium bewaard.
Om micro-organismen langer te bewaren kan men ze ook invriezen of
vriesdrogen, zodat de biochemische activiteiten zeer sterk worden
gereduceerd.
Invriezen kan gebeuren in het medium zelf maar vaak wordt een
beschermend middel toegevoegd zoals glycerol of saccharose. Buizen
worden meestal snel ingevroren met behulp van aceton-droogijs of vloeibare
stikstof. Micro-organismen met kwetsbare celwanden worden bij voorkeur
langzaam ingevroren. De culturen kunnen bij -20 0C, maar beter nog bij -70
0
C bewaard worden.
Vriesdrogen is het onttrekken van water aan een cultuur onder vacuüm,
nadat de cultuur eerst bij - 70 werd ingevroren. Wanneer de cultuur
gedroogd is, wordt het buisje onder vacuüm afgesloten. Het kan bij
kamertemperatuur worden bewaard. Het is op deze manier mogelijk een
verzameling van stammen aan te leggen die gebruikt worden voor
bijvoorbeeld kwaliteitscontrole..
C.M.Wiersema 2000
56