Bachelorproef De effecten van PPAG en aspalathine op β
advertisement
Bachelorproef De effecten van PPAG en aspalathine op β-cel apoptose geïnduceerd door verschillende stress inducerende stoffen in vitro. Vrije Universiteit Brussel Laarbeeklaan 103, 1090 Jette Eddy Himpe, doctoraatstudent, promotor Karen Poels, contactpersoon EhB Chloë Verspecht Departement GEZ-LA Bachelor Biomedische Laboratoriumtechnologie Farmaceutische en Biologische Laboratoriumtechnologie 2013-2014 Voorwoord Allereerst zou ik Myriam Brisaert en Luc Bouwens willen bedanken. Myriam Brisaert omdat zij de contacten heeft gelegd voor mij met de stageplaats en Luc Bouwens, verantwoordelijke van de onderzoeksgroep DIFF en professor biologie, omdat hij heeft toegezegd dat ik stage mocht doen gedurende drie maanden. Beide hebben ervoor gezorgd dat ik aan deze ervaring kon beginnen. Tijdens mijn drie maanden werd ik zeer goed begeleid door Eddy Himpe, waarvoor ik hem wil bedanken. Hij heeft mij geholpen mijn technische vaardigheden te verbeteren, efficiënt te leren werken, dingen te plannen en mee te helpen aan het op punt stellen van een model. Ook de hele crew van DIFF zou ik willen bedanken, want zij hebben mij goed ontvangen, opgenomen in de groep en mij laten thuis voelen. Naast het praktische werk heeft Eddy mij ook zeer goed geholpen bij het schrijven van mijn eindwerk, met dit werk als resultaat. Hierbij mag ik Karen Poels niet vergeten te bedanken, die regelmatig mijn eindwerk heeft nagelezen en heeft bijgestuurd waar nodig was qua structuur en lay-out om tot dit resultaat te komen. Als laatste zou ik mijn ouders willen bedanken omdat zij ook hun steentje hebben bijgedragen door het eindwerk na te lezen en zo veel mogelijk spellingsfouten te verbeteren, die andere over het hoofd hebben gezien. Organigram Vrije Universiteit Brussel Faculteit Geneeskunde en Farmacie Cel Differentiatie Lab DIFF (Diabetes cluster) Luc Bouwens Hoofd Andrea De Smedt Secretariaat Isabelle Houbracken Postdoctoraat Evelien De Waele Doctoraat studente Jonathan Baldan laatste jaar master in de biomedische wetenschappen Josue Kunjom Mfopou Postdoctoraat Elke Wauters Doctoraat studente Marijke Baekeland Laborante Eddy Himpe Doctoraat student Chloë Verspecht laatste jaar bachelor Biomedische laboratorium technologiëen Emmy De Blay Hoofd laborante Imane Song Doctoraat studente Iris Mathijs Assistent / Doctoraat studente Inhoudstafel Voorwoord Organigram Inhoudstafel Lijst van gebruikte afkortingen ................................................................................................................ 6 Samenvatting........................................................................................................................................... 8 Abstract ................................................................................................................................................... 9 1 2 Inleiding ......................................................................................................................................... 11 1.1 De pancreas ........................................................................................................................... 11 1.2 Type 1 diabetes en type 2 diabetes....................................................................................... 13 1.3 Onderzoekslab Cell differentiation DIFF ............................................................................... 14 Literatuurstudie ............................................................................................................................. 16 2.1 Lipotoxiciteit .......................................................................................................................... 17 2.2 Apoptose ............................................................................................................................... 17 2.2.1 Extrinsieke signaalweg................................................................................................... 18 2.2.2 Intrinsieke signaalweg ................................................................................................... 20 2.3 Het endoplasmatisch reticulum en stress ............................................................................. 20 2.4 UPR-signaalweg ..................................................................................................................... 21 2.5 Stress inducerende stoffen.................................................................................................... 23 2.5.1 Streptozotocine ............................................................................................................. 23 2.5.2 Alloxaan ......................................................................................................................... 25 2.5.3 Cyclopiazonic acid.......................................................................................................... 26 2.5.4 Waterstofperoxide ........................................................................................................ 26 2.6 Gebruikte kleuringen en kits ................................................................................................. 28 2.6.1 3 JC-1 assay ....................................................................................................................... 28 Materiaal en Methoden ................................................................................................................ 29 3.1 Materiaal ............................................................................................................................... 29 3.1.1 Celcultuur ...................................................................................................................... 29 3.1.2 Genotypering ................................................................................................................. 45 3.2 Methode ................................................................................................................................ 46 3.2.1 Celcultuur ...................................................................................................................... 46 3.2.2 In vivo experiment (reeds uitgevoerd) .......................................................................... 55 3.2.3 4 Genotypering van muizen ............................................................................................. 56 Resultaten...................................................................................................................................... 58 4.1 In vitro ................................................................................................................................... 58 4.1.1 Hoechst-Pi en TUNEL kleuring op MIN-6 cellen ............................................................ 58 4.1.2 Hoechst-Pi en TUNEL kleuring op INS-1 cellen .............................................................. 60 4.1.3 Optimale condities bepalen met Cell Titer Glow-kit op INS-1 cellen ............................ 61 4.2 In vivo .................................................................................................................................... 66 5 Discussie ........................................................................................................................................ 68 6 Besluit ............................................................................................................................................ 73 Referenties Lijst van gebruikte afkortingen A1: Bcl-2 A1 Ask1: apoptotische signalerend kinase 1 ATF-6: activating transcription factor 6 ATP: adenosinetrifosfaat Bak: Bcl-2 antagonist killer Bax: Bcl-2 associated X protein Bcl-2: B-cellymfoma 2 β-cel: beta-cel Bim: Bcl-2 interacting mediator of cell death Bip: binding immunoglobulin protein CAD: caspase activated DNase CPA: cyclopiazonic acid cGMP: cyclische guanosinemonofosfaat CNTF: ciliary neurotrofische factor CHOP: C/EBP homology protein DFF45: DNA fragmentatie factor 45 DMEM medium: Dulbecso's modified Eagle Medium DMSO: dimethylsulfoxide DNA: desoxyribonucleïnezuur DP5: death protein 5 epje: eppendorf tube ER: endoplasmatisch reticulum ERAD: endoplasmatische reticulum-geassocieerde degradatie ER-stress: endoplasmatisch reticulum-stress FADD: Fas-geassocieerd dooddomein FBS: foetal bovine serum GLUT2: glucose transporter 2 iCAD: inhibitor of caspase activated DNase IDDM: Insuline afhankelijke (dependent) diabetes INS-1: INS-1 832|13 cellijn Page 6 of 73 IRE-1α: inositol-requiring enzym 1α JIK: c-Jun N-terminaal inhibitor kinase JNK: c-Jun N-terminaal kinase Mcl-1: myeloïd cell leukemia sequence 1 NAD+: nicotinamideadeninedinucleotide NIDDM: niet-insuline afhankelijke diabetes mellitus NMU: N-methyl-N-nitrosourea NO: stikstof monoxide NP: natriumpyruvaat PARP: poly-(ADP-ribose) polymerase PERK: RNA-activated PRO kinase like eukaryotic initiation factor 2α kinase PP1: protein fosfatase 1 PPAG: phenylpyruvic acid-2-O-β-D-glucoside PS: penicilline en streptomycine (Pen Strep) PUMA: P53 – upregulated modulator of apoptosis ROS: reactieve zuurstof soorten RPMI medium: Roswell Park Memorial Institute-medium STZ: streptozotocine SERCA pomp: sarco (endo) plasmatisch reticulum calcium ATP-ase pomp T1D: type 1 diabetes T2D: type 2 diabetes TNF-α: tumor necrose factor α TNFR: tumor necrose factor receptor TRAF2: TNF receptor-associated factor 2 UCP: uncoupeling protein 2 UPR: unfolded protein response XBP-1: X-Box–binding protein-1 Page 7 of 73 Samenvatting Het aantal mensen dat diabeet wordt, neemt elk jaar maar toe en dit deels door het feit dat meer en meer mensen met een groot overgewicht kampen (obese zijn). Diabetes en obesitas kunnen gelinkt worden door lipotoxiciteit, waarbij de overtollige hoeveelheid aan verzadigde vetzuren voor stress zorgt in het endoplasmatisch reticulum in de β-cellen. Langdurige stress veroorzaakt apoptose en zorgt voor een vermindering van de β-cel massa, wat kan leiden tot het ontwikkelen van diabetes type 2. Anti-oxiderende stoffen van natuurlijke oorsprong krijgen meer en meer belangstelling van de wetenschappelijke onderzoekswereld, waar de plant Rooibos een voorbeeld van is. Op 2 stoffen, PPAG en aspalathine, geëxtraheerd uit Rooibos, wordt momenteel onderzoek gedaan om hun antidiabetische eigenschappen te achterhalen. Hierdoor zijn goede in vitro en in vivo modellen nodig om hun effecten te testen. In vitro werd er gebruik gemaakt van MIN-6 en INS-1 cellen. De TUNEL-Hoechst-Pi kleuring werd gebruikt om een onderscheid te maken tussen apoptotische, necrotische en levende cellen. Celdood werd veroorzaakt door 4 stress-inducerende stoffen: streptozotocine (1mM en 10mM STZ), alloxaan (5mM), cyclopiazonic acid (25µM CPA) en waterstofperoxide (50µM). De cellen werden behandeld met PPAG (30µM) en aspalathine (10 en 100µM) om hun effect hierop te testen. Per stress-inducerende stof werd een concentratiereeks getest met behulp van de Cell Titer Glow-test, waarbij er enkel onderscheid gemaakt kan worden tussen levende en dode cellen. In vivo werd gehanteerd voor streptozotocine om diabetes te veroorzaken bij Balb/c muizen. Deze werden ook behandeld met PPAG om het effect in vivo waar te nemen. Zowel in vitro als in vivo werd een verlaging van celdood waargenomen na de behandeling met PPAG (30µM in vitro en 10mg/kg in vivo), wat bevestigt dat PPAG een antidiabetische eigenschap bezit: minder celdood betekent minder β-cellen die afsterven in de pancreas en minder verlies van insuline aanmaak. STZ 1mM, CPA 25µM en waterstofperoxide 50µM zijn de ideale concentratie voor het induceren van celdood om later andere stoffen, waar interesse voor is, te testen (waaronder aspalathine, maar dan met een andere detectiemethode dan de TUNEL en Cell Titer Glow-kit). Page 8 of 73 Uit de experimenten zijn 2 modellen gekomen die snel celdood veroorzaken: in vitro 50µM waterstofperoxide gedurende 1 uur (wat ook een zeer goedkoop model is) en in vivo 200mg/kg STZ gedurende 30 uur. Door heel wat problemen moet er nog veel opnieuw getest worden met dezelfde test en bevestigd worden door een tweede test. Over PPAG antidiabetische eigenschappen is wat meer opgehelderd of eerder gezegd bevestigd. En over aspalathine’s eigenschappen moet eerst nog extra onderzoek gedaan worden (zowel in vitro als in vivo) om hierover een uitspraak te doen. Abstract The number of people who becomes diabetic rise every year and this because more and more people have overweight (become obese). Lipotoxicity links diabetic and obesities together at which the excess amount of saturated fatty acids induces stress in the endoplasmic reticulum in β-cells. Prolonged stress induces apoptosis and reduces the β-cell mass, which can lead to the development of diabetic type 2. The interest from the scientific world in antioxidants of natural origin enlarges, Rooibos is an example. At the moment the research is being done on two substances, PPAG and aspalathin, extracted from Rooibos, to detect their possible antidiabetic properties. A good in vivo and in vitro model are necessary to test the effects. MIN-6 and INS-1 cell lines where used in vitro. The TUNEL-Hoechst-Pi coloring was used to make the difference between apoptotic, necrotic and living cells. Cell death is caused by four stress induced substances: streptozotocin (1mM and 10mM STZ), alloxan (5mM), cyclopiazonic acid (25µM CPA) and hydrogen peroxide (50µM). De cells where treated with PPAG (30µM) and aspalathin (10µM and 100µM) to test their effects on cell death. Per stress inducing substance a concentration range was tested using the Cell Titer Glow-assay, only death and living cells were detected. In vivo they used streptozotocine to induce diabetic in Balb/c mousses. They were also treated with PPAG to detect effects in vivo. A decrease in cell death was detected in both in vitro and in vivo after the treatment with PPAG (30µM in vitro, 10mg/kg in vivo), which confirms PPAGs antidiabetic property: Page 9 of 73 reduction in cell death also means less β-cells which die in the pancreas and also less loss of insulin production. STZ 1mM, CPA 25µM and hydrogen peroxide 50µM are the ideal concentrations to induce cell death to test other substances of interest in the future (including aspalathin, but with another detection method than TUNEL and Cell Titer Glow-assay). Two models that induce quick cell death are the result of the experiments: in vitro 50µM hydrogen peroxide for 1 hour (it’s a very cheap model) and in vivo 200mg/kg STZ for 30 hours. Due to many problems a lot of experiments need to be retested with the same assay and confirmed with another assay. PPAG antidiabetic properties have been more clarified or as a matter of fact confirmed. More additional research needs to be done before there can be a statement about the properties of aspalathin. Page 10 of 73 1 Inleiding Wereldwijd leven er momenteel 347 miljoen mensen met diabetes. Tegen 2030 zal dit aantal nog toegenomen zijn (WHO). Deze gegevens tonen de noodzakelijkheid aan om hiernaar onderzoek te doen en een behandeling te zoeken die diabetes kan genezen of de ontwikkeling ervan kan tegenhouden. Op dit moment bestaan er enkel therapieën die de patiënten helpen om zo goed en zo lang mogelijk met diabetes te kunnen leven. Als algemene definitie kan diabetes mellitus omschreven worden als een metabolische afwijking, ook als chronische ziekte, waarbij er een absoluut of relatief te kort is aan functionele β-cellen (DIFF). Er bestaan verschillende types van diabetes waarvan type 1 diabetes (T1D) en type 2 diabetes (T2D) de belangrijkste zijn. 1.1 De pancreas De pancreas (zie figuur 1) bevat cellen die de bloedsuikerspiegel, glycemie, regelt in het lichaam. Het is een heterogene klier die bestaat uit een exocrien gedeelte en een endocrien gedeelte (Tayler, 2012). In een gezonde pancreas zijn 98% van de cellen exocriene cellen die verteringsenzymen aanmaken (Diabetes Research Institute Foundation). Deze cellen worden ook de acinaire cellen genoemd. Een acinaire cel kan 15 verschillende soorten (pro)-enzymen aanmaken. Naast acinaire cellen zijn er nog de ductale cellen die de afvoergangen maken waarlangs het exocriene secretieproduct naar het duodenum wordt afgevoerd. De meerderheid van deze enzymen wordt als inactief zymogeem aangemaakt. Deze moeten eerst nog omgezet worden in hun actieve vorm en dit gebeurt meestal op de plaats waar het zijn functie moet uitvoeren (Skelin et al, 2012). Pancreatische amylase, trypsine, lipase en ribonuclease zijn enkele voorbeelden van deze verteringsenzymen (Taylor, 2012). Deze worden samen met een alkalische vloeistof, pancreassap, afgegeven aan het duodenum (Wat doet de pancreas) om daar verder koolhydraten, eiwitten, vetten en nucleïnezuren af te breken die aanwezig zijn in voedsel (Taylor, 2012). 1% van de cellen zijn endocriene cellen die gegroepeerd zijn in clusters, ook de eilandjes van Langerhans genaamd (Diabetes Research Institute Foundation). De endocriene cellen kunnen onderverdeeld worden in 4 celtypes die ieder een ander hormoon produceren en Page 11 of 73 deze afgeven in het bloed: alfa-cellen (α-cellen), beta-cellen (β-cellen), delta-cellen(δ-cellen) en PP-cellen (Wat doet de pancreas). De α-cellen scheiden glucagon af (Wat doet de pancreas). Glucagon zorgt ervoor dat de lever glycogeen omzet in glucose en deze afgeeft aan het bloed. Hierdoor zal de glycemie verhogen (Taylor, 2012). De β-cellen maken insuline aan (Wat doet de pancreas). Insuline is antagonistisch aan glucagon. Het verlaagt de glycemie door de lever, spieren en vetweefsel aan te sporen om glucose op te nemen (Taylor, 2012). Ofwel wordt glucose omgezet in glycogeen en opgeslagen in de lever ofwel wordt de opgenomen glucose gebruikt als energiebron in het functioneren van de cel, weefsel of orgaan. De delta-cellen scheiden somastatine af en de PP-cellen pancreas polypeptide (Wat doet de pancreas). Figuur 1: De pancreas is retroperitoneaal in de buikholte gelegen, achter de maag en duodenum (bovenaan rechts figuur). Uitvergroting van de pancreas: de pancreas bestaande uit hoofd, lichaam en staart en staat in contact met het duodenum (links figuur). Het bevat een exocrien en endocrien gedeelte (onderaan figuur). Het endocrien gedeelte bestaat uit vier celtypes die samen clusters, of ook wel eilandjes van Langerhans genoemd, vormen: α -, β-, δ- en PPcellen. Alle vier produceren ze hun eigen hormoon. Het exocriene gedeelte neemt het grootste deel in van de pancreas en bestaat uit acinaire cellen die verschillende verteringsenzymen aanmaken (Figuur afkomstig van EncyclopædiaBritannica, 2003). Page 12 of 73 1.2 Type 1 diabetes en type 2 diabetes Type 1 diabetes (T1D) wordt ook IDDM genoemd, wat staat voor insuline afhankelijke (dependent) diabetes mellitus, want deze patiënten moeten meerdere malen per dag een insuline injectie krijgen (WHO). Ook wordt er gesproken van juveniele diabetes (jeugd diabetes) omdat dit type voorkomt bij kinderen (Casteels). Hier is sprake van een autoimmuunreactie, waarbij het lichaam antilichamen aanmaakt die de β-cellen in de pancreas aanvallen. Hierdoor ontstaat er een tekort aan insuline. Type 2 diabetes (T2D) wordt NIDDM genoemd, wat staat voor niet-insuline afhankelijke diabetes mellitus. Hier wordt de hyperglycemie veroorzaakt door een defect in de insuline secretie (β-cel functie), insuline werking of beide (WHO). Er kan meestal nog voldoende insuline aangemaakt worden, maar er treedt insuline resistentie op van de cellen, waardoor insuline zijn functie niet goed kan uitoefenen. Vroeger werd dit type ouderdomsdiabetes genoemd, maar nu wordt dit type meer en meer gelinkt aan obesitas (Casteels) & (Cnop et al, 2005). Bij een patiënt met T2D zal getracht worden om de glycemie te verlagen en onder controle te houden door combinatie van beweging en een dieet met eventueel inname van orale medicatie die de insulinegevoeligheid van de cellen verhoogt. Indien dit allemaal niet voldoende is, kan er ook overgeschakeld worden op het toedienen van insuline (Casteels) & (WHO). Indien de glycemie niet goed onder controle wordt gehouden, is er een veel grotere kans op het ontwikkelen van ernstige complicaties. Wanneer de glycemie steeds te hoog is, is er sprake van hyperglycemie en kunnen volgende ernstige complicaties optreden: nefropathie, nieren die aangetast zijn; angiopathie, bloedvaten die aangetast zijn; retinopathie, ogen die aangetast zijn en neuropathie, zenuwen die aangetast zijn (Casteels) & (WHO). Er is sprake van hyperglycemie en dus van diabetes bij een bloedsuikerwaarde van 7mmol/l of meer in nuchtere toestand of een bloedsuikerwaarde van 11,1mmol/l of meer twee uur na inname van 75g glucose (WHO). Ook een te lage glycemie, hypoglycemie, is gevaarlijk. Lichte symptomen zijn beven, trillen, bleek worden, afwezig zijn, maar de symptomen kunnen ook veel ernstiger zijn zoals het bewustzijn verliezen of in coma geraken (Casteels). Page 13 of 73 1.3 Onderzoekslab Cell differentiation DIFF In de onderzoeksgroep DIFF wordt onderzoek gedaan naar de verschillende luiken van de oorzaken van diabetes en naar de mogelijke behandeling ervan. Vooral de celdifferentiatie en weefselgeneratie in de pancreas worden onder de loep genomen in verschillende onderzoeksprojecten. Daarnaast loopt ook het experiment dat besproken wordt in dit eindwerk en dat tot doel heeft een geneesmiddel te vinden die de β-cellen kunnen beschermen tegen cytotoxische schade. Een van de experimenten dat momenteel aan de gang is, is onderzoek naar β-celregeneratie in de pancreas. Hoe kunnen reeds gedifferentieerde cellen in de pancreas geherprogrammeerd worden naar insuline-producerende β-cellen voor het genereren van βcellen die kunnen getransplanteerd worden bij T1D patiënten of voor het regenereren van de endogene β-cellen van de patiënt (DIFF). Dit onderzoek heeft al geleid tot de ontdekking van een combinatie geneesmiddelen, een cocktail bestaande uit cytokines, epidermale groeifactor plus leukemie remmende factor (LIF) of ciliary neurotrophic factor (CNTF), die endocriene – exocriene transdifferentiatie kunnen induceren en die β-celregeneratie induceren (Ev, 2014). Ook onderzoek naar β-cel regeneratie is aan de gang waarbij het epidermaal groeifactor plus gastrine worden toegediend in muizen. Bij beide experimenten is men bezig met de ontrafeling van de onderliggende mechanismen en signaal transductie wegen die betrokken zijn (DIFF). Als laatste is er ook nog het onderzoek om embryonale stamcellen te laten differentiëren tot het geschikte cellulaire fenotype, hier β-cel fenotype. In theorie is er geen twijfel mogelijk dat dit kan, maar in de praktijk blijkt dit toch veel moeilijker. Op dit moment probeert men de juiste inducerende omstandigheden te vinden die leiden tot in vitro differentiatie van embryonale cellen in functionele β-cellen (DIFF). Bij al deze onderzoeken is het van belang te beschikken over een ideaal in vitro en/of in vivo model om β-cel differentiatie, cellulaire transductie en stamcel differentiatie te bestuderen. Ofwel zijn deze modellen er al, ofwel moeten ze nog op punt gesteld worden (DIFF). Page 14 of 73 Een van de laatste op punt te stellen experimenten is het testen van de effecten van twee stoffen, die geëxtraheerd zijn uit de Rooibos plant, Aspalathus linearis, aspalathine en PPAG (phenylpyruvic acid-2-O-β-D-glucoside of ook wel RX-1 genoemd) en of één van beide stoffen β-cellen beschermt. Door β-cellen te beschermen met dergelijke stoffen hoopt men de ontwikkeling van diabetes (type-2) te kunnen voorkomen of stop te zetten. Page 15 of 73 2 Literatuurstudie Meer en meer is er interesse voor componenten afkomstig uit een plant (van natuurlijke afkomst) met therapeutische eigenschappen. Aspalathine en PPAG (RX-1) zijn twee stoffen geëxtraheerd uit de Aspalathus linearis of Rooibos plant. Deze plant groeit enkel in een welbepaald gebied in Zuid-Afrika en is daar zeer populair onder de vorm van herbal tea (Sinisalo et al, 2010), (Han et al, 2013)& (Ulicna et al, 2005). De thee wordt ook gebruikt in de traditionele geneeskunde voor het behandelen van onder andere astma, allergieën en huidproblemen (Sinisalo et al, 2010). Wereldwijd neemt de interesse toe voor deze plant, vanwege de eigenschappen die het bezit, waaronder de antioxiderende activiteit. Ook werd (en wordt nog steeds) deze plant door medicijnmannen gebruikt als traditioneel medicijn tegen onder andere diabetes. Diabetes mellitus is een metabole stoornis, waarbij er sprake is van verandering in het metabolisme van drie grote nutriënten: koolhydraten, vetten en proteïnen (Kawano et al, 2009). Bij T2D is de hyperglycemie veroorzaakt door insuline resistentie, β-cel dood (verlies van β-cel massa) en β-cellen die hun functie niet goed meer kunnen uitvoeren. Deze laatste twee dragen bij tot het niet meer in staat zijn van het lichaam om voldoende hoeveelheden insuline te produceren (Luo, J.Z. & L, 2006). Het verlies van de β-cel massa kan veroorzaakt worden door het afsterven (apoptose) van βcellen en/of onvoldoende proliferatie/neogenese van β-cellen (Cnop et al, 2005). Er zijn reeds in vivo - en in vitro experimenten uitgevoerd om te onderzoeken of PPAG de β-cellen beschermt. In dit experiment zal er gebruik gemaakt worden van de INS-1 en MIN-6 cellijn. Dit zijn β-cel achtige cellen. INS-1 staat voor insulinoma cellijn, afkomstig van de pancreas van de rat. De insulinoma werd geïnduceerd door bestraling van de cellen. De cellen bevatten belangrijke kenmerken van de β-cel van de pancreas, waaronder een hoge insuline inhoud en reageren op glucose (geassocieerd met expressie van glucose transporter 2 (GLUT2) en glucokinase) binnen de fysiologische waardes (skelin et al, 2010). MIN-6 cellen zijn afkomstig van een transgene C57BL/6 muis insulinoma die een insuline promotor/T-antigen construct uitdrukt. Ze drukken ook GLUT2 en glucokinase uit (Skelin et al, 2010). Page 16 of 73 Op basis van de in vivo experimenten heeft men ontdekt dat PPAG mogelijk zou kunnen dienen als bescherming tegen diabetes en wel meer bepaald bescherming tegen het verlies van β-cel massa die veroorzaakt wordt door stress. Op cellulair niveau is een verdriedubbeling van de β-cel massa waargenomen en op moleculair niveau een toename in de expressie van het anti-apoptotische proteïne B-cel lymfoma2 (Bcl-2). In vitro experimenten waarbij INS-1 cellen werden blootgesteld aan palmitaat tonen aan dat PPAG een beschermend, dosisafhankelijk anti-apoptotisch effect heeft op de β-cellen. Concluderend werd aangenomen dat PPAG een anti-apoptotische effect heeft op de βcellen. Nu wordt er gekeken of PPAG zijn beschermende eigenschap stimulans specifiek is en daarom gaan er andere stress inducerende factoren getest worden, waaronder streptozotocine (STZ), alloxaan, waterstofperoxide (H2O2) en cyclopiazonic acid (CPA). Hiervoor moet een in vitro model geoptimaliseerd worden waar later andere analoge stoffen op kunnen uitgetest worden. Naast PPAG gaat aspalathine ook in vitro getest worden. 2.1 Lipotoxiciteit Centraal in dit experiment staat β-cel apoptose die getriggerd wordt door endoplasmatisch reticulum-stress (ER-stress). Meer en meer wordt er een link gelegd tussen obesitas en T2D. Hierbij ligt de nadruk vooral op de stijgende niveau’s van verzadigde vetzuren, zoals palmitaat, in het bloed die de ER-stress induceren. De verzadigde vetzuren zouden een effect hebben op de levensvatbaarheid van de β-cellen en op lange termijn zorgen voor een daling in de β-celmassa. Men spreekt hiervan lipotoxiciteit (Diakogiannaki & Morgan, 2008). Deze lipotoxiciteit ontregelt de ER-homeostase. Het onderliggend mechanisme van deze lipotoxiciteit is de ER-stress respons of UPR, unfolded protein respons. Deze UPR probeert de ER-homeostase terug in balans te krijgen door de aanmaak van proteïnen op het ER membraan te verminderen en de ER plooi capaciteit te laten toenemen. Wanneer UPR hier in faalt, leidt dit tot apoptose (Cnop at al, 2010) & (Pineau et al, 2010). 2.2 Apoptose Apoptose of geprogrammeerde celdood, is een gecontroleerd proces dat in een cel kan plaats vinden (Edmonds). Dit proces neemt deel aan een groot aantal processen in het lichaam, waaronder ontwikkeling, onderhoud van homeostase in een cel of weefsel en het Page 17 of 73 elimineren van bijvoorbeeld kankercellen (Genomicobjects). Er zijn verschillende signaalwegen die leiden naar apoptose. De twee bekendste zijn de intrinsieke en extrinsieke signaalweg (zie figuur 2). 2.2.1 Extrinsieke signaalweg De extrinsieke of dood-receptor gemedieerde signaalweg staat onder controle van de tumor necrose factor familie (TNF-familie), waaronder Fas ligand (Fas L) en tumor necrose factor (TNF). Deze liganden zullen binden op de doodreceptor, Fas of tumor necrose factor receptor (TNFR) respectievelijk, die zich op het celoppervlak bevindt. Eenmaal deze receptor geactiveerd is, bindt het dooddomein van deze receptor met een adaptor molecule FADD (Fas-geassocieerde dooddomein). De binding activeert deze signaalweg door het recruteren van twee pro-caspase 8 eiwitten die zullen resulteren in 2 actieve caspase 8 eiwitten (LewisWambi et al, 2009) & (Wali et al, 2013). De geactiveerde caspase 8 kan caspase 3, 6 en 7 (Wali et al, 2013) activeren. Caspase 3 klieft DNA fragmentatie factor 45 (DFF45/iCAD). Heterodimeer factor DFF45 dissocieert van DFF40 (CAD), waardoor DFF40 oligomeriseert en zijn DNase activiteit geactiveerd wordt. DFF40 oligomeer veroorzaakt de internucleosomale DNA fragmentatie, wat typerend is voor apoptose (Genomicobjects). Page 18 of 73 Figuur 2: Schematische weergave van de extrinsieke en intrinsieke signaalweg die leiden tot apoptose. Beide zorgen voor de fragmentatie van het DNA. In de extrinsieke signaalweg wordt caspase 3 geactiveerd na het binden van de Fas-ligand met de doodreceptor die zorgt voor activatie van caspase 8. In de intrinsieke signaalweg wordt caspase 3 geactiveerd door caspase 9 die zelf geactiveerd wordt door een complex bestaande uit cytochroom C, Apaf-1 en ATP (Figuur afkomstig van Stages in Apoptosis (Cell Death), (2004)). Page 19 of 73 2.2.2 Intrinsieke signaalweg De intrinsieke, mitochondriale gemedieerde signaalweg wordt geactiveerd door cellulaire stress zoals blootstelling aan straling, groeifactoren die opgenomen worden door de cel, hoge concentratie glucose of palmitaat, … . Deze signaalweg staat onder controle van Bcl-2 proteïnen familie, waarbij er een evenwicht moet zijn tussen de hoeveelheid aan pro- en aan anti-apoptotische factoren (pro-overlevingsfactoren). De pro-apoptotische proteïnen bestaan onder andere uit Bim, Noxa, Bid, PUMA, Bad, Bax, Bak en DP5. Verschillende cellulaire stressors kunnen sommige pro-apoptotische Bcl-2 eiwitten activeren en kunnen ook voor een downregulatie (verminderde aanmaak) van de anti-apoptotische eiwitten zorgen. Activatie van de pro-apoptotische factoren zorgt voor translocatie van Bax en Bak naar het buitenmembraan van de mitochondrium, waardoor er poriën in het membraan gevormd worden en cytochroom C vrijgezet kan worden in het cytosol. Cytochroom C vormt samen met Apaf-1 en ATP een complex en activeert procaspase 9 (Stages in Apoptosis (Cell Death) (2004)). Caspase 9 zorgt op zijn beurt voor de klieving en activering van caspase 3, 6 en 7. Zoals bij de extrinsieke signaalweg zal dit leiden tot apoptose (Wali et al, 2013). 2.3 Het endoplasmatisch reticulum en stress Het endoplasmatisch reticulum (ER) is een dynamisch organel dat instaat voor o.a. lipidensynthese, regulatie van calcium homeostase en biosynthese van proteïnen die bestemd zijn voor intracellulaire organellen of voor het celoppervlak. Ook speelt het een centrale rol in het vouwen van secretoire proteïnen tijdens hun doortocht (Pineau et al, 2010). Het ER bepaalt ook welk lot de cel ondergaat onder stress condities. Stimuli die de functie van de ER-homeostase verstoren, zijn: verandering in eiwit glycosylering, verzwakt of vertraagde doortocht (verkeer) door het ER, proteïnen die aggregeren, virus infectie, hypoxie, … (Diakogiannaki & Morgan, 2008). Met ER-stress wordt de opstapeling van slecht geplooide of ongeplooide proteïnen in het lumen van het ER (Wali et al, 2013) bedoeld doordat de balans tussen de hoeveelheid proteïnen die op het ER aangemaakt worden en de plooicapaciteit van het ER verstoord is (Pineau et al, 2010). Er is sprake van ER-stress wanneer de homeostase verstoord is (Wali et al, 2013). Hiernaast zijn nog twee andere factoren die ER-stress kunnen veroorzaken: verandering in de ER-calciumvoorraad en in het verkeer van eiwitten van het ER naar het Golgi-apparaat. Page 20 of 73 Wanneer de calciumvoorraad van het ER geledigd wordt of er is een verminderde opname, dan heeft dit een effect op het calcium afhankelijk plooiproces van de proteïnen dat plaats vindt in het ER. Hierdoor kunnen mis of niet geplooide proteïnen zich opstapelen en ERstress veroorzaken. Wanneer het verkeer tussen het ER en het Golgi-apparaat bemoeilijkt wordt, kunnen er zich ook proteïnen opstapelen in het ER (Cnop et al, 2010). Als respons zal het ER de UPR signaalweg triggeren. Deze signaalweg beschikt over verschillende strategieën om ER-stress tegen te gaan (Pineau et al, 2010) (om de werkdruk op ER te verlagen (Wali et al, 2013)), door het ER te helpen de opstapeling aan misvormde proteïnen te verhelpen (Pineau et al, 2010). Dit kan door de algemene translatie te verlagen en/of een toename in chaperon proteïnen aanmaak (Wali et al, 2013). Als deze stimulans (UPR) verlengd of hardnekkig aanwezig blijft, zal de ER-stress verergeren (Diakogiannaki & Morgan, 2008) en resulteert dit in een shift van UPR naar apoptose (Wali et al, 2013). 2.4 UPR-signaalweg De UPR-signaalweg (zie figuur 3) bestaat uit drie gescheiden wegen die elk onder controle staan van een sensor proteïne: IRE-1α, PERK en ATF-6. Wanneer de proteïnen opstapeling zijn limiet heeft bereikt zal Bip (binding immunoglobulin protein), een ER resident lid en ER chaperon, dissociëren van de sensor proteïnen waardoor deze drie sensors geactiveerd worden (Pineau et al, 2010) & (Wali et al, 2013). PERK (RNA-activated PRO kinase like eukaryotic initiation factor 2α kinase) staat in voor de fosforylatie van eIF2α, dat de synthese van cellulaire proteïnen verlaagd, waardoor de aanmaak van proteïnen door het ER afneemt (Wali et al, 2013). Maar op dat zelfde moment zorgt de fosforylatie van eIF2α ook voor een stijging in de translatie van genen, waaronder transcriptie factor ATF-4 (Cnop et al, 2010), (Pineau et al, 2010) & (Wali et al, 2013). Deze upregulatie zorgt voor een toename in de expressie van de pro-apoptotische moleculen CHOP (C/EBP homologyprotein) en ATF-3 (Wali et al, 2013). CHOP induceert de vorming van GADD34, een cofactor van protein fosfatase 1 (PP1). PP1 zorgt voor de defosforylatie van eIF2α, wat uiteindelijk resulteert in de ophef van de globale translatie inhibitie (Cnop et al, 2010). Page 21 of 73 Figuur 3: De unfolded protein respons signaalweg staat onder controle van drie sensor proteïnen: PERK, ATF-6 en IRE-1α en wordt geactiveerd wanneer de ER-homeostase verstoord wordt door ER-stress. De UPR signaalweg probeert de ERhomeostase terug te herstellen door de translatie initiatie te inhiberen en plooicapaciteit van het ER te verhogen. Dit gebeurt via verschillende wegen. Indien er niet in geslaagd wordt om de ER-homeostase te herstellen, gaat UPR over in apoptose (figuur is een combinatie van Cnop et al, 2010 en van Pineau et al, 2013). De tweede tak van UPR-signaalweg wordt gestart door de activatie van ATF-6 (activatingtranscription factor 6). ATF-6 blijft op het ER door interactie met Bip. Na de dissociatie van Bip door overlading aan misgeplooide proteïnen vindt de translocatie plaats van ATF-6 van ER naar het Golgi-apparaat. In het Golgi-apparaat wordt ATF-6 gekliefd door twee proteases, S1 en S2. De gekliefde ATF-6 wordt gerelokaliseerd naar de nucleus (Pineau et al, 2010), waar het zorgt voor de upregulatie van genen die coderen voor ER chaperons, degradatie enzymen en co chaperonen waaronder Bip, Pdia1 en P58 (Pineau et al, 2010) & (Wali et al, 2013). De derde UPR signaalweg begint wanneer IRE-1α (inositol-requiring enzym 1α) zijn actieve vorm aanneemt na dissociatie van Bip, namelijk IRE-1α-p. De activatie gaat gepaard met een dimerisatie en autofosforylatie die de endoribonuclease activiteit activeert. Het substraat voor deze endonuclease activiteit is XBP-1 (Pineau et al, 2010). Het mRNA XBP-1 (X-Box– Page 22 of 73 binding protein-1) wordt gespliced, waardoor de translatie van XBP-1s plaats vindt (Cnop et al, 2010). Deze heeft als functie de aanmaak induceren van ER-chaperonen, co-chaperonen, vouwenzymen en verschillende factoren van de ERAD signaalweg (endoplasmatische reticulum-geassocieerde degradatie signaalweg) (Cnop et al, 2010) & (Wali et al, 2013). Wanneer UPR faalt, wordt van de PERK en IRE-1α tak de apoptotische signaalweg getriggerd: PERK fosforyleert eIF2α, die transcriptiefactor ATF-4 activeert, die op zijn beurt transcriptie factor CHOP activeert. CHOP onderdrukt de expressie van Bcl-2 wat uiteindelijk zal leiden tot de klieving van caspase 3 en daaropvolgend apoptose. Geactiveerde IRE-1α kan JIK (c-JunNterminaal inhibitor kinase) binden waardoor TRAF2 (TNF receptor-associated factor 2) gerecruteerd wordt naar ER membraan die het apoptotische signalerend kinase 1 activeert (Ask1). Deze kinase activeert door fosforylatie JNK (c-Jun N-terminaal inhibitor kinase) proteïne die ook apoptose induceert (Pineau et al, 2010). 2.5 Stress inducerende stoffen Tijdens het experiment zal er gebruik gemaakt worden van verschillende stoffen die intracellulaire stress (resulterend in apoptose) kunnen induceren waaronder streptozotocine (STZ), alloxaan, waterstofperoxide (H2O2) en cyclopiazonic acid (CPA). Deze modellen zullen op punt gesteld worden, om later gebruikt te worden om analoge stoffen te kunnen uittesten en om te zien of ook deze bescherming geven tegen apoptose. 2.5.1 Streptozotocine Streptozotocine, STZ, is een glucosamine-nitrosourea component (zie figuur 4), waarbij de Nmethyl-N-nitrosourea groep (NMU) verbonden is met koolstof nummer 2 van hexose (Graham et al, 2004) & (Lenzen, 2008). STZ wordt aangemaakt door Streptomyces achromogenes (GezginciOktayoglu et al, 2011) & (Szkudelski, 2001). STZ kan zowel necrose als apoptose veroorzaken. Figuur 4: Structuurformule van streptozotocine (STZ). STZ is een glucosamine-nitrosourea, waarbij de N-methyl-N-nitrosourea groep (NMU) de toxiciteit van STZ deels veroorzaakt. STZ methyleert proteïnen door een methylgroep van NMU over te zetten naar proteïnen en leidt tot inactivatie van proteïnen. Naast deze alkylatie, zorgen stikstofmonoxide (NO) en reactieve zuurstof soorten (ROS) ook voor het toxisch effect van STZ aan β-cellen (Afbeelding afkomstig van wikipedia). Page 23 of 73 De toxiciteit van STZ wordt veroorzaakt door 3 activiteiten: stikstofmonoxide (NO) alkylatie, en reactieve zuurstof soorten (ROS), waarvan het alkyleren de belangrijkste is voor de inductie van diabetes (zie figuur 5) (Gezginci-Oktayoglu et al, 2011), (Lenzen, 2008) & (Szkudelski, 2001). STZ wordt opgenomen in β-cellen van de pancreas door de laag affiniteit glucose transporters 2, GLUT2, (Gezginci-Oktayoglu et al, 2011), (Graham et al, 2004) & (Lenzen, 2008) en Figuur 5: De toxische activiteit wordt weergegeven in bovenstaand schema: STZ activeert via alkylatie (en vorming van stikstofmonoxide (NO), wat resulteert in DNA schade) poly (ADP-ribosylatie) wat een verlaging van ATP en NAD+ veroorzaakt en uiteindelijk de biosynthese en secretie van insuline door β-cellen inhibeert (figuur afkomstig van Szkudelski, 2001). methyleert zowel proteïnen als DNA, door de methylgroep van MNU groep over te zetten naar desoxyribonucleïnezuur, DNA, of proteïnen (Lenzen, 2008). Bij DNA is de methylatie op O6 van guanine, O6- methylguanine, de belangrijkste en resulteert deze DNA schade in DNA fragmentatie (Gezginci-Oktayoglu et al, 2011) & (Lenzen, 2008). Deze DNA schade zorgt er ook voor dat poly-(ADP-ribose)-polymerase (PARP) geactiveerd wordt en overgestimuleerd in een poging om DNA te herstellen (Gezginci-Oktayoglu et al, 2011), (Lenzen, 2008), (Morgan et al, 1994) & (Szkudelski, 2001). Deze herstellingspoging heeft een negatief effect op de cellulaire concentratie van de cofactor NAD+, dat als substraat wordt gebruikt om het DNA te herstellen (Morgan et al, 1994), en als gevolg ook een verlaging in adenosinetrifosfaat (ATP) concentratie (Lenzen, 2008). Necrose ontstaat door uitputting van cellulaire energievoorraad, apoptose door DNA methylatie en functioneel defect aan de cel door methylatie van de aanwezige proteïnen (Lenzen, 2008), m.a.w. inhibeert insuline biosynthese en secretie (Graham et al, 2004). De nitrosogroep, N=O, van STZ kan ook NO vrijzetten en daarom is STZ ook een intracellulaire NO donor (Lenzen, 2008) & (Szkudelski, 2001). Deze vrijzetting verhoogt de activiteit van guanylylcyclase en de vorming van cyclisch guanosinemonofosfaat, cGMP, wat Page 24 of 73 typerende kenmerken zijn voor aanwezigheid van NO (Lenzen, 2008). Maar NO is niet cruciaal voor de toxiciteit van STZ (Lenzen, 2008) & (Szkudelski, 2001). Als laatste is er ook nog de productie van ROS, waaronder de superoxiden en hydroxyl radicalen afkomstig van waterstofperoxide dismutatie, die het toxisch effect van STZ gaat helpen en het β-cel vernietigingsproces gaat versnellen. Deze ROS worden gevormd als finaal product tijdens degradatie van ATP door xanthine oxidase tijdens hypoxanthine metabolisme (Lenzen, 2008) & (Szkudelski, 2001). 2.5.2 Alloxaan Alloxaan wordt heel snel opgenomen door β-cellen via GLUT2 door zijn structurele gelijkenis met glucose (zie figuur 6). Kort na toediening ontstaat een stijging in insuline secretie in de aan- of afwezigheid van glucose. Deze stijging wordt gevolgd door een complete onderdrukking van eilandjes cellen om te reageren op glucose. De stijging in insuline secretie wordt veroorzaakt Figuur 6: Structuurformule van alloxaan. Alloxaan bezit drie toxische eigenschappen: verstoring van calcium homeostase, binden met thiol groepen van glucokinase en redoxcyclus opstarten waardoor er reactieve zuurstof soorten gevormd worden (Afbeelding afkomstig van wikipedia). doordat alloxaan de intracellulaire calcium homeostase verstoort. Alloxaan depolariseert de β-cel, waardoor voltage afhankelijke calciumkanalen geopend worden en de concentratie cytoplasmatische vrije calcium toeneemt. De onderdrukking van glucose geïnduceerde insuline secretie ontstaat doordat alloxaan glucokinase, de glucose sensor van de β-cel, inactiveert door te binden met de twee thiol groepen in de suikerbindende site van glucokinase. Dit veroorzaakt een daling in de oxidatie van glucose en ATP generatie, waardoor een onderdrukking van de glucose geïnduceerde insuline secretie plaats vindt. Naast deze twee eigenschappen, bezit alloxaan nog een derde eigenschap die bijdraagt tot zijn toxiciteit. Alloxaan heeft een voorkeur voor thiol bevattende cellulaire componenten. Alloxaan kan gereduceerd worden naar dialurinezuur in de aanwezigheid van verschillende reducerende componenten en dialurinezuur kan gereoxideerd worden naar alloxaan, waardoor een redoxcyclus ontstaat. Tijdens deze cyclus worden superoxide radicalen en reactieve zuurstof soorten (ROS) gevormd. ROS hebben als doelwit het DNA van de eilandjes van de pancreas. Er treedt DNA fragmentatie op en deze DNA schade activeert zoals bij STZ PARP (Szkudelski, 2001) & (Rohilla et al, 2012). Page 25 of 73 2.5.3 Cyclopiazonic acid Cyclopiazonic acid (CPA) is een inhibitor van de sarcoplasmatisch reticulum Ca2+-ATPase pomp (SERCA pomp). CPA blokkeert de actieve opname van calcium ionen door SR wat leidt tot passieve lediging van de intracellulaire opslag aan calcium ionen uit het SR (Marthan, 2004). Figuur 7: Structuurformule cyclopiazonic acid (CPA). CPA blokkeert de werking van de SERCA pomp (Afbeelding afkomstig van wikipedia). 2.5.4 Waterstofperoxide De mitochondrium is de belangrijkste cellulaire bron van productie van ROS in β-cellen. Samen met superoxiden en hydroxyl radicalen, maakt H2O2 deel uit van ROS. Via de mitochrondriale respiratoire signaalweg (elektronentransport keten bestaande uit 4 complexen, cytochroom C en transport co-enzym Q) en oxidatie van mitochondriale binnen membraan fosfolipide, cardiolipine, veroorzaakt ROS apoptose van β-cellen. In elektronentransport keten worden superoxiden gevormd tijdens elektronen transfer. Deze radicalen worden natuurlijk of door de matrix mangaan superoxide dismutase (MnSOD) gedismuteerd naar waterstofperoxide. Normaal wordt H2O2 gedetoxificeerd in matrix door catalase en glutathion peroxidase. Maar β-cellen hebben een lage expressie van deze antioxidanten zodat H2O2 reageert met ijzer ionen (Fe2+) via fenton reactie en reactieve hydroxyl radicalen (OH•) vormt. Deze zorgen voor de start van peroxidatie van binnen mitochondriaal membraan fosfolipide cardiolopine. Cardiolipine is gelocaliseerd in het binnen mitochondriaal membraan (IMM) en zorgt voor het behoud van structuur van de mitochondrium en het membraan potentiaal. Cytochroom C zit verankerd aan de buitenzijde van IMM door elektrostatische en hydrofobe interactie aan cardiolipine. Door de hydroxyl radicalen wordt cardiolipine geoxideerd, wat zorgt voor een instabiele interactie met cytochroom C. Cytochroom C komt los van het membraan en wordt vrijgezet in het cytoplasma door poriën in het buiten mitochondriaal membraan. Dit resulteert in de vorming van apoptosoom, activatie van caspase 9, 3, 6 en 7 (zie apoptose, intrinsieke signaalweg, puntje 2.2.2). Page 26 of 73 ROS activeert ook uncoupeling protein 2 (UCP2). UCP2 regelt het mitochondriaal membraan potentiaal door protonen te laten weglekken om het potentiaal te verlagen. Hierdoor is er niet voldoende energie voor ATP synthase om ATP te synthetiseren uit ADP. Verlaging in cytoplasmatische ATP/ADP ratio sluit de ATP gevoelige kalium kanalen (KATP) niet, waardoor er geen depolarisatie van het plasmamembraan plaats vindt en de voltage poort calcium kanalen gesloten blijven. Geen influx van calcium ionen (Ca2+) en dus geen trigger voor exocytose van insuline wat resulteert in de dysfunctie van de β-cellen. Naast deze werking, heeft ROS ook nog andere manieren om apoptose te veroorzaken (zie STZ, puntje 2.5.1 en alloxaan, puntje 2.5.2). De werking kan samengevat worden in volgend schema: Figuur 8: Schematische weergave van de werking van ROS die in β-cellen apoptose veroorzaakt: Door oxidatieve stress •wordt de productie van ROS door mitochondrium gestimuleerd, waaronder superoxiden (O2 ). Deze radicalen worden via dismutatie omgezet naar waterstofperoxide en deze reageren met ijzer ionen in een Fenton reactie tot hydroxyl radicalen (OH•). OH• activeren de oxidatie van cardiolipin die op zijn beurt uncoupeling proteïn 2 (UCP2) activeert en zorgt voor vrijzetting van cytochroom C. UCP2 zorgt voor β-cel dysfunctie, terwijl cytochroom C ervoor zorgt dat β-cel massa vermindert (figuur bewerkt en afkomstig van Ma et al, 2011). Page 27 of 73 2.6 Gebruikte kleuringen en kits Naast apoptose is er ook necrose opgemerkt. Voor de celtelling zal er duidelijk onderscheid moeten gemaakt worden tussen levende, apoptotische (vroeg en laat) en necrotische cellen. Hiervoor zal gebruik gemaakt worden van verschillende testen en kleuroplossing: propidiumjodide (zie puntje 3.1.1.1), Hoechst (zie puntje 3.1.1.1), de TUNEL assay (zie puntje 3.1.1.1), Cell Titer Glo assay (zie puntje 3.1.1.3) en JC-1 assay. Er zijn duidelijke morfologische verschillen tussen vroeg -, laat apoptose en necrose. Bij vroeg apoptose treedt er een verandering op in het mitochondriaal membraan potentiaal en kan het verlies van de potentiaal hierop volgen. Hierdoor ontstaan er permeabele poriën waarlangs ionen en kleine moleculen kunnen passeren, waaronder cytochroom C (Parenteau, 2011). De cel gaat krimpen, het cytoplasma wordt denser en de organellen in de cel komen dichter bij elkaar te liggen. De cel breekt in smalle, membraan omringende fragmenten, apoptotische lichaampjes genoemd. Deze lichaampjes worden verwijderd door macrofagen. Op het celoppervlak ontstaat membraan blebbing. Er treedt ook nucleaire en chromosomale DNA fragmentatie op na activatie van caspases en chromatine condenseert (Diffen). Verplaatsing (flip flop beweging) van het lipide fosfatidylserine van in het plasmamembraan naar oppervlak van de cel is een laatste kenmerk van vroeg apoptose (Stages in Apoptosis (Cell Death) (2004)). Bij laat apoptose wordt het plasmamembraan permeabeler waardoor elementen kunnen afgegeven worden naar buiten en opgenomen worden. Bij necrose gaat de cel opzwellen en scheuren, membraan beschadiging treedt op, ATP lediging, de metabole activiteit valt stil. Als gevolg treedt er inflammatie op. 2.6.1 JC-1 assay JC-1 wordt gebruik om te detecteren of er een verandering is opgetreden in het mitochondriaal membraan potentiaal. JC-1 dringt het mitochondrium binnen en vormt er aggregaten. Deze zenden een fluorescerende emissie uit bij 590nm, terwijl er bij een verandering in het membraan potentiaal geen aggregaten, maar monomeren gevormd worden en de emissie plaats vindt bij 530nm. Normaal is er een mix van rood en groen (cellen met een hoog en laag mitochondriaal membraan potentiaal) en indien er veel celdood veroorzaakt wordt, zullen er veel groene cellen aanwezig zijn. Page 28 of 73 3 Materiaal en Methoden 3.1 Materiaal 3.1.1 Celcultuur De INS-1 832|13 cellijn (INS-1) en de MIN-6 cellijn zijn afkomstig van de afdeling BENE van de Vrije Universiteit Brussel te Jette. De INS-1 cellen worden gekweekt in RPMI medium met 11,1mM D-glucose. De MIN-6 cellen worden gekweekt in DMEM medium met 25mM Dglucose. Beide mediums zijn afkomstig van Gibco. Beide mediums worden gesupplementeerd met 10% foetaal bovine serum (FBS) afkomstig van Thermo Scientific, 100U/ml penicilline, 100µg/ml streptomycine (Pen Strep) en 1mM natriumpyruvaat (NP) afkomstig van Life technologies. Cultuurflesjes en 96 wellplaten zijn afkomstig van BD Bioscience, DMSO, Hoechst 33342 (Ho), propidium jodide (Pi), alloxaan en streptozotocine zijn afkomstig van Sigma-Aldrich. Triton van MB BIO, waterstofperoxide 30% (H2O2) van Prolabs, In situ cell deathdetection kit (TUNEL kit) van Roche, CellTiter-Glo®Luminescent Cell Viability Assay van Promega (Cell Titer Glow-kit) en PBS van Lonza. Bereiden van het kweekmedium Van de 500ml RPMI 1640 medium (R10F) en van de 500ml DMEM (D10F) wordt 60ml verwijderd en aangevuld met: 50ml FBS, 5ml sodium pyruvaat 100X en 5ml PennStrep. Dit wordt bewaard in de frigo op 4°C. Page 29 of 73 3.1.1.1 Hoechst-Pi en TUNEL kleuring op MIN-6 cellen Bereiding PPAG (RX-1) Elke keer dat er PPAG toegevoegd wordt, moet het opnieuw gemaakt worden. Telkens wordt er 30µM PPAG toegevoegd. Op dag 1 moet PPAG 6x geconcentreerder zijn, want er wordt 10µl toegevoegd aan 50µl, wat een totaal volume van 60µl geeft. Er wordt 0,0024g PPAG afgewogen en dit moet opgelost worden in 40,90ml DMEM. Berekening 30µmol/l omzetten naar g/l Verdunningsfactor 6 Omzetten naar g/ml Er wordt 0,0024g afgewogen V= -> V = 0,0024g/ = 40,90ml Op dag 2 moet PPAG 8x geconcentreerder zijn, want er wordt 10µl toegevoegd aan 60µl (en nog 10µl stress induceerder), wat een totaal volume van 80µl geeft. Er wordt 0,0027g PPAG afgewogen en dit moet opgelost worden in 34,51ml DMEM. Berekening 30µmol/l omzetten naar g/l Verdunningsfactor 8 Omzetten naar g/ml Er wordt 0,0027g afgewogen V= -> V = 0,0027g/ = 34,51ml Bereiding van aspalathine Elke keer dat er aspalathine toegevoegd wordt, moet het opnieuw gemaakt worden. Telkens wordt er 10µM of 100µM aspalathine toegevoegd. Op dag 1 moet aspalathine 6x Page 30 of 73 geconcentreerder zijn, want er wordt 10µl toegevoegd aan 50µl, wat een totaal volume van 60µl geeft. Er wordt 0,0005g aspalathine afgewogen en dit moet opgelost worden in 1,84ml DMEM. Dit is de 100µM oplossing en voor de 10µM wordt 100µl van de 100µM oplossing genomen en wordt er 900µl DMEM toegevoegd. Berekening 100µmol/l omzetten naar g/l Verdunningsfactor 6 Omzetten naar g/ml Er wordt 0,0005g afgewogen V= -> V = 0,0005g/ = 1,84ml Op dag 2 moet aspalathine 8x geconcentreerder zijn, want er wordt 10µl toegevoegd aan 60µl (en nog 10µl stress induceerder), wat een totaal volume geeft van 80µl. Er wordt 0,0010g aspalathine afgewogen en dit moet opgelost worden in 2,76ml DMEM. Dit is de 100µM oplossing en voor de 10µM wordt 100µl van de 100µM oplossing genomen en wordt er 900µl DMEM toegevoegd. Berekening 100µmol/l omzetten naar g/l Verdunningsfactor 8 Omzetten naar g/ml Er wordt 0,0010g afgewogen V= -> V = 0,0010g/ = 2,76ml Bereiding van controles DMEM met DMSO Voeg 6,73µl DMSO en 993µl DMEM samen. Citraatbuffer Page 31 of 73 Citraatbuffer bestaat uit natriumcitraat en citroenzuur. Beide stoffen worden apart bereid: 1,472g natriumcitraat wordt opgelost in 50,07ml water en 0,993g citroenzuur in 47,29ml water. 1ml natriumcitraat wordt samengevoegd bij 2ml citroenzuur. Als controle (0mM bij STZ) wordt 100µl citraatbuffer toegevoegd aan 900µl DMEM. Bereiding van stress induceerders Alloxaan Alloxaan wordt opgelost in DMEM medium. De 5mM alloxaan moet acht keer geconcentreerder zijn, want er wordt aan elke well 10µl toegevoegd waar reeds 70µl aanwezig is, wat een totaal volume van 80µl geeft. Er wordt 0,027g afgewogen en dit wordt opgelost in 4,22ml DMEM medium. Berekening 5mmol/l omzetten naar g/l Verdunningsfactor 8 Omzetten naar g/ml Er wordt 0,027g afgewogen V= -> V = 0,027g/ = 4,22ml Streptozotocine (STZ) STZ wordt opgelost in citraatbuffer. De 10mM STZ moet acht keer geconcentreerder zijn, want er wordt aan elke well 10µl toegevoegd waar reeds 70µl aanwezig is, wat een totaal volume van 80µl geeft. Er wordt 0,012g afgewogen en dit wordt opgelost in 0,58ml citraatbuffer. Hieruit wordt de 1mM STZ bereid: 100µl van 10mM STZ oplossing wordt toegevoegd aan 900µl DMEM. Berekening 10mmol/l omzetten naar g/l Verdunningsfactor 8 Page 32 of 73 Omzetten naar g/ml Er wordt 0,012g afgewogen V= -> V = 0,012g/ = 0,58ml Cyclopiazonic acid (CPA) CPA wordt opgelost in DMSO (dimethylsulfoxide). Er wordt 5mg opgelost in 500µl DMSO (stockoplossing). Hiervan wordt 6,73µl genomen en hieraan wordt 993,27µl DMEM toegevoegd. Berekening Berekening 5mg/500µl (stockoplossing) omzetten naar g/l Omzetten naar mmol/l (mM) = 29,782mM Gewenste concentratie: 25µM 8x geconcentreerder Er wordt 6,73µl van stockoplossing genomen Vverd cverd = Vconc cconc -> Vconc = -> Vconc = = 6,73µl Waterstofperoxide (H2O2) H2O2 wordt opgelost in DMEM medium. De 50µM H2O2 moet tien keer geconcentreerder zijn, want er wordt aan elke well 10µl toegevoegd waar reeds 90µl aanwezig is, wat een totaal volume van 100µl geeft. Er wordt 0,500ml 30% H2O2 toegevoegd aan 50ml DMEM. Hiervan wordt 0,250ml genomen en toegevoegd aan opnieuw 50ml DMEM. Berekening 30% H2O2 omzetten naar mol/l In 1l: 300ml H2O2 en 700ml H2O (dichtheid: 1,11kg/l) 300ml = 333g -> 333g / 34,015 Neem 500µl 30% H2O2 en toevoegen aan 50ml 100x verdund: = 9,79mol ~ 10mol/l = 0,1M Page 33 of 73 DMEM 250µl 0,1M toevoegen aan 50ml DMEM 200x verdund: = 0,0005M = 500µM Bereiding van kleuroplossing propidium jodide (Pi) en Hoechst (Ho) Hoechst (Ho) kan de cel vrij betreden, of het plasmamembraan nu intact is of niet, en kleurt het DNA blauw wanneer deze gevisualiseerd wordt onder de fluorescentiemicroscoop. Dit detecteert de kern van de cel. Met deze kleurstof worden alle kernen gekleurd. Propidium jodide (Pi) kan enkel de cel binnendringen wanneer het plasmamembraan niet meer intact is. De kleurstof bindt aan het DNA en kleurt het DNA rood (Zhou et al, 1998). De rode cellen geven necrotische cellen weer. De eindconcentratie in elke well is gelijk aan 10µg/ml. Er wordt aan elke well 10µl toegevoegd. Er moet een werkoplossing gemaakt worden met een concentratie van 100µg/ml of 1mg/10ml, omdat deze kleuroplossing 10x verdund wordt in de well. Afgewogen hoeveelheden zijn: van Pi 0,0015g en van Ho 0,0013g. 0,0015g Pi wordt opgelost in 0,75ml en 0,0013g Ho wordt opgelost in 0,65ml, wat voor beide een concentratie van 2mg/ml geeft. 500µl Pi (2mg/ml) en 500µl Ho (2mg/ml) worden samengevoegd, waaraan 9ml PBS wordt toegevoegd en uiteindelijk een concentratie van 1mg/10ml heeft. Bereiding van Triton 125µl Triton 100 (0,25%) wordt toegevoegd aan 50ml PBS. Bereiding van TUNEL kit oplossing Naast de Hoechst en propidium jodide wordt ook een TUNEL kleuring uitgevoerd om apoptotische cellen te detecteren. TUNEL staat voor TdT mediated dUTP-X nick end labeling. De kit bestaat uit een enzymoplossing (Terminaal deoxynucleotidylTransferase, TdT) en een labelingoplossing (fluoresceïne gekoppeld aan dUTP). De kit wordt gebruikt om enkelstrenige en dubbelstrenige DNA breuken op te sporen die veroorzaakt worden doordat het DNA gekliefd wordt. Deze breuken komen voor in het vroeg stadium van apoptose. Na het fixeren en permeabiliseren van de cellen kunnen de nicks (inkepingen waar er geen Page 34 of 73 fosfodiesterbinding is tussen aangrenzende nucleotiden van een streng, dus een breuk) in het DNA, veroorzaakt door schade, gedetecteerd worden door de labeling van fluoresceïnedUTP aan de vrije 3-OH-uiteindes in een enzymatische reactie. Het enzym TdT herkent de nicks en hecht er dUTPs aan waaraan fluoresceïne hangt (Roche Diagnostics, 2008).Er wordt een onderscheid gemaakt tussen vroeg en laat apoptose. De cellen die groen gekleurd zijn, zijn in vroeg apoptotisch stadium en de cellen die geel zijn (combinatie van rood (Pi) en groen (TUNEL positief)), bevinden zich in het laat apoptotisch stadium. Per well wordt er 30µl TUNEL oplossing toegevoegd: per well wordt er 3µl enzymoplossing samengevoegd bij 27µl label oplossing. Page 35 of 73 3.1.1.2 Hoechst-Pi en TUNEL kleuring op INS-1 cellen Bereiding PPAG (RX-1) Elke keer dat er PPAG toegevoegd wordt, moet het opnieuw gemaakt worden. Telkens wordt er 30µM PPAG toegevoegd. Op dag 1 moet PPAG 8x geconcentreerder zijn, want er wordt 10µl toegevoegd aan 70µl, wat een totaal volume geeft van 80µl. Er wordt 0,0031g PPAG afgewogen en dit moet opgelost worden in 39,62ml RPMI. Berekening 30µmol/l omzetten naar g/l Verdunningsfactor 8 Omzetten naar g/ml Er wordt 0,0031g afgewogen V= -> V = 0,0031g/ = 39,62ml Op dag 2 moet PPAG 10x geconcentreerder zijn, want er wordt 10µl toegevoegd aan 80µl (en nog 10µl stress induceerder), wat een totaal volume geeft van 100µl. Er wordt 0,0025g PPAG afgewogen en dit moet opgelost worden in 25,56ml RPMI. Berekening 30µmol/l omzetten naar g/l Verdunningsfactor 10 Omzetten naar g/ml Er wordt 0,0025g afgewogen V= -> V = 0,0025g/ = 25,56ml Bereiding van aspalathine Elke keer dat er aspalathine toegevoegd wordt, moet het opnieuw gemaakt worden. Telkens wordt er 10µM of 100µM aspalathine toegevoegd. Page 36 of 73 Op dag 1 moet aspalathine 8x geconcentreerder zijn, want er wordt 10µl toegevoegd aan 70µl, wat een totaal volume geeft van 80µl. Er wordt 0,0012g aspalathine afgewogen en dit moet opgelost worden in 3,32ml RPMI. Dit is de 100µM oplossing en voor de 10µM wordt 100µl van de 100µM oplossing genomen en er wordt 900µl RPMI toegevoegd. Berekening 100µmol/l omzetten naar g/l Verdunningsfactor 8 Omzetten naar g/ml Er wordt 0,0012g afgewogen V= -> V = 0,0012g/ = 3,32ml Op dag 2 moet aspalathine 10x geconcentreerder zijn, want er wordt 10µl toegevoegd aan 80µl (en nog 10µl stress induceerder), wat een totaal volume geeft van 100µl. Er wordt 0,0012g aspalathine afgewogen en dit moet opgelost worden in 2,65ml RPMI. Dit is de 100µM oplossing en voor de 10µM wordt 100µl van de 100µM oplossing genomen en er wordt 900µl RPMI toegevoegd. Berekening 100µmol/l omzetten naar g/l Verdunningsfactor 10 Omzetten naar g/ml Er wordt 0,0012g afgewogen V= -> V = 0,0012g/ = 2,65ml Bereiding van controles Citraatbuffer: Zie puntje 3.1.1.1: zelfde bereidingswijze Page 37 of 73 Bereiding van stress induceerderss Streptozotocine (STZ) STZ wordt opgelost in citraatbuffer. De 10mM STZ moet 10x geconcentreerder zijn, want STZ wordt in de well tien maal verdund: concentratie die bereid moet worden is 100mM STZ oplossing. Er wordt eerst een 1000mM STZ stockoplossing bereid om hieruit een 100mM STZ oplossing te bereiden (om een veel lagere concentratie citraatbuffer aanwezig te hebben). Er wordt 0,0177g afgewogen en dit wordt opgelost in 0,067ml citraatbuffer. Berekening 100mmol/l omzetten naar g/l Verdunningsfactor 10 Omzetten naar g/ml Er wordt 0,0177g afgewogen V= -> V = 0,0177g/ = 0,067ml Uit de 1000mM STZ wordt de 100mM bereid: 67µl 1000mM STZ en 603µl RPMI medium. 10mM STZ (tien maal geconcentreerder dan 1mM) wordt bereid uit de 100mM: 100µl van 10mM STZ oplossing wordt toegevoegd aan 900µl RPMI. Waterstofperoxide (H2O2) H2O2 wordt opgelost in RPMI medium. Eerst wordt een stockoplossing bereid met een concentratie van 500µM (tien maal geconcentreerder dan 50µM, want wordt in de well tien maal verdund). Er wordt 0,500ml 30% H2O2 toegevoegd aan 50ml RPMI. Hiervan wordt 0,250ml genomen en toegevoegd aan opnieuw 50ml RPMI. Berekening 30% H2O2 omzetten naar mol/l In 1l: 300ml H2O2 en 700ml H2O (dichtheid: 1,11kg/l) 300ml = 333g -> 333g / 34,015 Neem 500µl 30% H2O2 en voeg toe aan 50ml RPMI 100x verdund: = 9,79mol ~ 10mol/l = 0,1M Page 38 of 73 250µl 0,1M toevoegen aan 50ml RPMI 200x verdund: = 0,0005M = 500µM Bereiding van kleuroplossing propidium jodide (Pi) en Hoechst (Ho) Zie puntje 3.1.1.1: zelfde bereidingswijze Bereiding van Triton Zie puntje 3.1.1.1: zelfde bereidingswijze Bereiding van TUNEL kit oplossing Zie puntje 3.1.1.1: zelfde bereidingswijze Page 39 of 73 3.1.1.3 Cell Titer Glow-kit op INS-1 cellen Bereiding van PPAG (RX-1) Elke keer dat er PPAG toegevoegd wordt, moet het opnieuw gemaakt worden. Telkens wordt er 30µM PPAG toegevoegd. Op dag 1 moet PPAG 8x geconcentreerder zijn, want er wordt 10µl toegevoegd aan 70µl, wat een totaal volume geeft van 80µl. Er wordt 0,0034g PPAG afgewogen en dit moet opgelost worden in 43,45ml RPMI. Berekening 30µmol/l omzetten naar g/l Verdunningsfactor 8 Omzetten naar g/ml Er wordt 0,0034g afgewogen V= -> V = 0,0034g/ = 43,45ml Op dag 2 moet PPAG 10x geconcentreerder zijn, want er wort 10µl toegevoegd aan 80µl (en nog 10µl stress induceerder), wat een totaal volume geeft van 100µl. Er wordt 0,0062g PPAG afgewogen en dit moet opgelost worden in 63,40ml RPMI. Berekening 30µmol/l omzetten naar g/l Verdunningsfactor 10 Omzetten naar g/ml Er wordt 0,0062g afgewogen V= -> V = 0,0062g/ = 63,40ml Bereiding van de controles RPMI met DMSO 16,82µl DMSO en 983,18µl RPMI samenvoegen. Page 40 of 73 Citraatbuffer Zie puntje 3.1.1.1: zelfde bereidingswijze Bereiding van de induceerders Alloxaan Alloxaan wordt opgelost in RPMI medium. Eerst wordt een stockoplossing bereid met een concentratie van 50mM (tien maal geconcentreerder dan 5mM, want oplossing wordt in elke well tien maal verdund) om hieruit de concentratiereeks te bereiden. Er wordt 0,031g afgewogen en dit wordt opgelost in 0,39ml RPMI medium. Berekening 50mmol/l omzetten naar g/l Verdunningsfactor 10 Omzetten naar g/ml Er wordt 0,031g afgewogen V= -> V = 0,031g/ = 0,39ml Uit de 50mM worden de andere concentraties bereid: Concentratie 10x geconcentreerder Uit de 50mM alloxaan Totaal nodig 200µl Concentratie na 10x verdunning in well alloxaan 1mM 4µl 196µl alloxaan 0,1mM alloxaan 3mM 12µl 188µl alloxaan 0,3mM alloxaan 10mM 40µl 160µl alloxaan 1mM alloxaan 50mM 200µl 0µl alloxaan 5mM Streptozotocine (STZ) STZ wordt opgelost in citraatbuffer. Eerst wordt een stockoplossing bereid met een concentratie van 1000mM (honderd maal geconcentreerder dan 10mM, want de concentratie citraatbuffer mag niet te hoog zijn). Deze stockoplossing wordt 10 maal verdund en hieruit wordt de concentratiereeks bereid. Er wordt 0,165g afgewogen en dit wordt opgelost in 0,0622ml citraatbuffer. Page 41 of 73 Berekening 100mmol/l omzetten naar g/l Verdunningsfactor 10 Omzetten naar g/ml Er wordt 0,165g afgewogen V= -> V = 0,165g/ = 0,0622ml Uit de 1000mM STZ wordt de 100mM bereid: 62,2µl 1000mM STZ en 599,8µl RPMI medium. Uit de 100mM worden de andere concentraties bereid: Concentratie 10x geconcentreerder Uit de 100mM STZ Totaal nodig 200µl Concentratie na 10x verdunning in well STZ 10mM 20µl 180µl STZ 1mM STZ 25mM 50µl 150µl STZ 2,5mM STZ 50mM 100µl 100µl STZ 5mM STZ 75mM 150µl 50µl STZ 7,5mM STZ 100mM 200µl 0µl STZ 10mM Cyclopiazonic acid (CPA) CPA wordt opgelost in DMSO. Er wordt 5mg opgelost in 500ml DMSO (stockoplossing). Een stockoplossing van 500µM (tien maal geconcentreerder, want oplossing wordt in elke well tien maal verdund) wordt bereid en hieruit wordt een concentratiereeks gemaakt. Hiervan wordt 16,82µl genomen en aan 983,18µl DMEM toegevoegd. Berekening 5mg/500µl (stockoplossing) omzetten naar g/l Omzetten naar mmol/l (mM) = 29,782mM Gewenste concentratie: 50µM 10x geconcentreerder Page 42 of 73 Er wordt 16,82µl van stockoplossing genomen Vverd cverd = Vconc cconc -> Vconc = -> Vconc = = 16,82µl Uit de 500µM stockoplossing wordt volgende concentratiereeks bereid en er wordt extra DMSO toegevoegd om steeds dezelfde hoeveelheid DMSO concentratie te bezitten: Concentratie 10x geconcentreerder Uit de 500µM CPA Totaal nodig 200µl DMSO aanwezig Extra DMSO Concentratie na 10x verdunning in well CPA 25µM 10µl 190µl 0,168µl 3,196µl CPA 2,5µM CPA 50µM 20µl 180µl 0,336µl 3,028µl CPA 5µM CPA 125µM 50µl 150µl 0,841µl 2,523µl CPA 12,5µM CPA 250µM 100µl 100µl 1,682µl 1,682µl CPA 25µM CPA 500µM 200µl 0µl 3,364µl 0µl CPA 50µM Waterstofperoxide (H2O2) H2O2 wordt opgelost in RPMI medium. Eerst wordt een stockoplossing bereid met een concentratie van 1000µM (tien maal geconcentreerder, want oplossing wordt in elke well tien maal verdund) om hieruit de concentratiereeks te bereiden. Er wordt 0,500ml 30% H2O2 toegevoegd aan 50ml RPMI. Hiervan wordt 0,500ml genomen en toegevoegd aan opnieuw 50ml RPMI. Berekening 30% H2O2 omzetten naar mol/l In 1l: 300ml H2O2 en 700ml H2O (dichtheid: 1,11kg/l) 300ml = 333g -> 333g / 34,015 = 9,79mol ~ 10mol/l Neem 500µl 30% H2O2 en voeg toe aan 50ml RPMI 100x verdund: = 0,1M 500µl 0,1M toevoegen aan 50ml RPMI 100x verdund: = 0,001M = 1000µM Uit de 1000µM wordt volgende concentratiereeks bereid: Page 43 of 73 Concentratie 10x Uit de 1000µM H2O2 geconcentreerder Totaal nodig 200µl Concentratie na 10x verdunning in well H2O2 100µM 20µl 180µl H2O2 10µM H2O2 250µM 50µl 150µl H2O2 25µM H2O2 500µM 100µl 100µl H2O2 50µM H2O2 750µM 200µl 50µl H2O2 75µM H2O2 1000µM 200µl 0µl H2O2 100µM Bereiding Cell Titer Glow-kit oplossing Met de Cell Titer-Glow®Luminescent Cell Viability Assay (Cell Titer Glow-kit) wordt de cel viabiliteit (levensvatbaarheid) gemeten op basis van ATP dat aanwezig is en wat duidt op metabolisch actieve cellen. De kit bestaat uit een bufferoplossing en een enzym/substraatoplossing die je samen voegt (Cell Titer-Glo reagent). Het reagent zorgt ervoor dat de cellen gaan lyseren waardoor ATP vrij komt (Promega Corporation A, 2012). In de luminescentie reactie die optreedt, wordt er licht geproduceerd door overdracht van chemische energie die ontstaat door de oxidatie van luciferine waardoor oxyluciferine ontstaat. De oxidatie wordt gekatalyseerd door luciferase waarbij ATP en Mg2+ als cosubstraat dienst doen. Figuur 9: Omzetting van luciferine in oxyluciferine gekatalyseerd door luciferase in de aanwezigheid van Mg2+, ATP en zuurstof, waarbij licht ontstaat die gemeten wordt met een luminometer (figuur afkomstig van promega Corporation A, 2012). De 10ml buffer wordt toegevoegd aan de gevriesdroogde enzym/substraatmix en beide oplossingen worden gemengd tot een homogene oplossing verkregen is. Page 44 of 73 3.1.2 Genotypering Tailbuffer (reeds gemaakt 1l: 100ml 1M Tris-HCl, 40ml 5M NaCl, 10ml 0,5M EDTA (pH8) en 20ml 10% SDS (aanlengen tot 1l met DMPC water)), 100% ethanol en DMSO afkomstig van Sigma-Aldrich, DMPC, Lim-buffer en 1xTBE worden in het labo zelf gemaakt, primeroplossingen afkomstig van Qiagen, proteïne kinase K, dNTP’s, Taq polymerase (Taq), Ultra Pure TM agarose en 50bp ladder zijn afkomstig van Life technologies. Page 45 of 73 3.2 Methode 3.2.1 Celcultuur Cellijn ontdooien De cellen zijn ingevroren in DMSO en serum en worden bewaard in vloeibare stikstof. Ze worden ontdooid in het waterbad op 37°C tot er geen ijs meer waar te nemen is. De oplossing in de cryotubes wordt geresuspendeerd met een micropipet en toegevoegd aan 9ml verwarmd (37°C) medium. De cellen worden afgedraaid op 150g gedurende drie minuten. Het supernatans wordt afgezogen. De celpellet wordt geresuspendeerd in 1ml verwarmd medium en toegevoegd aan 9ml verwarmd medium. De afdraaistap wordt herhaald: drie minuten op 150g. Het supernatans wordt afgezogen en de celpellet wordt opgelost in 1ml verwarmd medium. Een derde maal wordt de afdraaistap uitgevoerd: drie minuten op 150g. Het supernatans wordt opnieuw afgezogen. In 1ml verwarmd medium wordt de celpellet opgelost en overgebracht in een cultuurflesje. Aan elk cultuurflesje wordt nog eens 9ml medium toegevoegd, RPMI met 10% FBS (R10F) aan de INS-1 en DMEM met 10% FBS (D10F) aan MIN-6. De cultuurflesjes worden geplaatst in de incubator op 37°C en 5% CO2. Cellen losmaken en tellen De INS-1 cellen worden losgemaakt met trypsine. Nadat het medium afgezogen is, wordt er 5ml trypsine toegevoegd aan het cultuurflesje. Na een halve minuut, wordt alles opgezogen en overgebracht in 5ml R10F/D10F. Dit wordt afgedraaid op 150g gedurende 3 minuten. Een celpellet is gevormd en het bovenstaand medium wordt afgezogen. De celpellet wordt geresuspendeerd in 1ml R10F/D10F en er wordt 4ml R10F/D10F toegevoegd. Om de cellen te tellen wordt 10µl in de Burker telkamer aangebracht. Onder de microscoop (10x occulair) worden tweemaal 25 vakjes geteld. Er wordt een gemiddelde genomen en vermenigvuldigd met factor 5 en 10 000 om het aantal cellen per 5ml te verkrijgen. Page 46 of 73 3.2.1.1 Hoechst-Pi kleuringen TUNEL kleuring op MIN-6 cellen Cellen uitplaten Op dag 0 worden de cellen uitgeplaat. Er wordt gebruik gemaakt van een 96 wellplaat. Per well wordt er 100µl medium aangebracht met een cel concentratie van 250 000 cellen per ml of 25 000 cellen per 100µl. De hoeveelheid cellen per 5ml moet verdund worden naar 250 000 cellen per ml. De cellen hebben twee dagen de tijd om te hechten. Medium verversen Op dag 3 wordt het medium vervangen door 50µl DMEM medium met 10% foetaal bovin serum (D10F). PPAG (RX-1) en aspalathine Op dag 4 en 5 wordt 10µl DMEM, PPAG 30µM, aspalathine 10µM en 100µM toegevoegd aan de cellen. DMEM wordt toegevoegd als controle aan de eerste drie kolommen (1, 2 & 3), PPAG aan de drie volgende (4, 5 & 6) en aspalathine 1mM aan de kolommen 7, 8 en 9. Aspalathine 10mM aan de laatste drie kolommen (10, 11 & 12). Stress induceerders Op dag 5 worden de stress induceerders en controles toegediend. Enkel H202 wordt pas op dag 6 (23 uur later) toegediend. Van de induceerders en controles wordt telkens 10µl aan elke well toegediend: rij A DMEM, rij B DMEM met DMSO, rij C citraatbuffer, rij D alloxaan 5mM, rij E STZ 1mM, rij F STZ 10mM, rij G CPA 25µM en rij H H2O2 50µM. DMEM is de negatieve controle, DMEM met DMSO is de controle van CPA en citraatbuffer is de controle van STZ. Page 47 of 73 Tabel 1: Schematische voorstelling van een 96 well plaat. Per rij wordt een andere stof toegevoegd: 3 controles (DMEM, DMEM en DMSO, citraatbuffer) en 4 stress inducerende stoffen (alloxaan, streptozotocine (STZ), cyclopiazonic acid (CPA) en waterstofperoxide (H2O2). In de rode kader is de Hoechst-Pi kleuring toegevoegd (aan elke well) en wellen in geel ook TUNEL kleuring. DMEM PPAG (RX) 30µM Aspalathine 1mM Aspalathine 10mM DMEM DMEM +DMSO citraatbuffer alloxaan 5mM STZ 1mM STZ 10mM CPA 25µM H2O2 50µM Kleuring Hoechst-propidium jodide kleuring (Ho-Pi) Op dag 6 wordt 10µl Ho-Pi oplossing (aan elke well) toegediend. Na het toedienen wordt de plaat 1 uur in de incubator geplaatst. Het medium wordt afgezogen en er wordt in elke well 100µl 4% formol aangebracht om de cellen te gaan fixeren. Na 10 minuten wordt het formol afgezogen en start de voorbehandeling voor de TUNEL kleuring: permeabiliseren van de cellen met behulp van Triton. TUNEL kleuring Enkel in de kolommen 1, 4, 7 en 10 wordt 100µl triton aangebracht. In de rest van de kolommen wordt 100µl PBS aangebracht. Na 10 minuten wordt de triton afgezogen en wordt 30µl TUNEL kit oplossing aangebracht. De plaat wordt een uur in de incubator gezet op 37°C. Na het incuberen wordt de TUNEL kit oplossing afgezogen en 100µl PBS opgezet. Wikkel aluminiumfolie rond de plaat en in de frigo bewaren. Foto’s nemen van cellen onder confocale microscoop Foto's werden genomen met de LSM 710 Zeiss observer 2.1. Tunel positieve cellen werden gedetecteerd na aanstraling met de Argon laser (488nm). Groene fluorescentie emissie werd bepaald tussen 489-560nm. Propidium jodide positieve cellen werden gedetecteerd na Page 48 of 73 aanstraling met de DPSS laser (561nm). Rode fluorescentie emissie werd bepaald tussen 562-630nm. Er werd gebruik gemaakt van de multi photon laser (mai-tai) om de kernen die gekleurd waren met Hoechst 33342 te detecteren. De cellen werden aangestraald op 710nm en de emissie werd opgepikt tussen 360-500nm. Foto's werden later geanalyseerd met LSM image Browser (gratis software van Zeiss). Page 49 of 73 3.2.1.2 Hoechst-Pi en TUNEL kleuring op INS-1 cellen Cellen uitplaten Op dag 0 worden de cellen uitgeplaat. Er wordt gebruik gemaakt van een 96 wellplaat. Per well wordt er 100µl medium aangebracht met een cel concentratie van 250 000 cellen per ml of 25 000 cellen per 100µl. De hoeveelheid cellen per 5ml moet verdund worden naar 250 000 cellen per ml. De cellen hebben een dag de tijd om te hechten. Medium verversen Op dag 1 wordt het medium vervangen door 70µl RPMI medium met 10% foetaal bovin serum (R10F). PPAG (RX-1) en aspalathine Op dag 1 en 2 wordt 10µl RPMI, PPAG (RX-1) 30µM, aspalathine 10µM en 100µM toegevoegd aan de cellen. RPMI wordt toegevoegd als controle aan de eerste drie kolommen (1, 2 & 3), PPAG aan de drie volgende (4, 5 & 6) en aspalathine 1mM aan de kolommen 7, 8 en 9. Aspalathine 10mM aan de laatste drie kolommen (10, 11 & 12). Stress induceerders Op dag 2 worden de stress induceerders en controles toegediend om gedurende een uur een insult te geven. Van de induceerders en controles wordt telkens 10µl aan elke well toegediend: rij A RPMI, rij B citraatbuffer, rij C STZ 1mM, rij D STZ 10mM en rij E H2O2 50µM. RPMI is de negatieve controle en citraatbuffer is de controle van STZ. De plaat wordt 1uur in de incubator geplaatst. Tabel 2: Schematische voorstelling van een 96 well plaat. Per rij wordt een andere stof toegevoegd: 2 controles (RPMI en citraatbuffer) en 2 stress inducerende stoffen (streptozotocine (STZ) en waterstofperoxide (H 2O2)). RPMI PPAG (RX) 30µM Aspalathine 1mM Aspalathine 10mM RPMI Citraatbuffer STZ 1mM STZ 10mM Page 50 of 73 H2O2 50µM Kleuring Hoechst-propidium jodide kleuring (Ho-Pi) 1 uur na het geven van de insult, wordt 10µl Ho-Pi oplossing (aan alle welletjes) toegediend. Na het toedienen wordt de plaat 1uur in de incubator geplaatst. Het medium wordt afgezogen en er wordt in elke well 100µl 4% formol aangebracht om de cellen te gaan fixeren. Na 10 minuten wordt het formol afgezogen en start de voorbehandeling voor de TUNEL kleuring: permeabiliseren van de cellen met behulp van Triton. TUNEL kleuring Er wordt 100µl triton aangebracht. Na 10 minuten wordt de triton afgezogen en wordt 30µl TUNEL kit oplossing aangebracht. De plaat wordt een uur in de incubator gezet op 37°C. Na het incuberen wordt de TUNEL kit oplossing afgezogen en 100µl PBS opgezet. Wikkel aluminiumfolie rond de plaat en in de frigo bewaren. Foto’s nemen van cellen onder confocale microscoop: zie puntje 3.2.1.1 Page 51 of 73 3.2.1.3 Optimale condities bepalen met Cell Titer Glow-kit op INS-1 cellen Cellen uitplaten Op dag 0 worden de cellen uitgeplaat. Er wordt gebruik gemaakt van vier 96 wellplaten. Per well wordt er 70µl medium aangebracht met een cel concentratie van ongeveer 357 000 cellen per ml of 25 000 cellen per 70µl. De cellen hebben een dag de tijd om te hechten. De cellen worden geresuspendeerd in R10F. PPAG (RX) Op dag 1 en 2 wordt 10µl RPMI aan de eerste zes kolommen en PPAG (RX) 30µM aan de laatste zes kolommen toegevoegd aan de cellen. RPMI wordt toegevoegd als controle. Stress induceerders Op dag 2 worden de stress induceerders toegevoegd. Enkel H202 wordt pas op dag 3 (23uur later) toegediend. Van de induceerders wordt telkens 10µl aan elke well toegediend. Aan plaat 1 wordt een concentratiereeks van STZ (0; 1; 2,5; 5; 7,5 en 10mM, respectievelijk rij A t.e.m. F), aan plaat 2 een concentratie reeks van CPA (0; 2,5; 5; 12,5; 25 en 50µM, respectievelijk rij A t.e.m. F), aan plaat 3 een concentratiereeks van alloxaan (0; 0,1; 0,3; 1 en 5mM, respectievelijk rij A t.e.m. E) en aan plaat 4 een concentratiereeks van H2O2 (0; 10; 25; 50; 75 en 100µM, respectievelijk rij A t.e.m. F) toegediend. Tabel 3: Schematische voorstelling van een 96 well plaat. Per rij wordt een andere concentratie streptozotocine (STZ) toegevoegd en 1 controle (citraatbuffer). RPMI PPAG (RX) 30µM citraatbuffer (STZ 0mM) STZ 1mM STZ 2,5mM STZ 5mM STZ 7,5mM STZ 10mM Page 52 of 73 Tabel 4: Schematische voorstelling van een 96 well plaat. Per rij wordt een andere concentratie cyclopiazonic acid (CPA) toegevoegd en 1 controle (RPMI en DMSO). RPMI PPAG (RX) 30µM RPMI + DMSO (CPA 0µM) CPA2,5µM CPA 5µM CPA12,5µM CPA25µM CPA 50µM Tabel 5: Schematische voorstelling van een 96 well plaat. Per rij wordt een andere concentratie alloxaan toegevoegd en 1 controle (RPMI). RPMI PPAG (RX) 30µM RPMI (alloxaan 0mM) alloxaan 0,1mM alloxaan 0,3mM alloxaan 1mM alloxaan 5mM Page 53 of 73 Tabel 6: Schematische voorstelling van een 96 well plaat. Per rij wordt een andere concentratie waterstofperoxide (H 2O2) toegevoegd en 1 controle (RPMI). RPMI PPAG (RX) 30µM RPMI (H2O2 0µM) H2O2 10µM H2O2 25µM H2O2 50µM H2O2 75µM H2O2 100µM Cell Titer Glow-kit Op dag 3 wordt aan de hand van de Cell Titer Glow-kit de luminescentie bepaald met behulp van de luminometer glo max. De gemeten luminescentie is evenredig met de hoeveelheid ATP (zie reactie puntje 3.1.1.3) en ook evenredig met de hoeveelheid levende cellen. Eerst worden de platen uit de incubator gehaald om op kamertemperatuur te laten komen (een half uur). Voeg de 10ml buffer toe aan het substraat/enzym potje en zorg dat alles oplost. Voeg van dit reagent 100µl aan elke well. Vijf minuten op een schudder (500 rounds per minute). 15 minuten laten staan na schudden. Voeg 100µl van elke well toe aan een ‘Lumitract 200’ 96 wellplaat. Plaats de plaat in de luminometer en meet de luminescentie. Page 54 of 73 3.2.2 In vivo experiment (reeds uitgevoerd) Er werd gebruik gemaakt van mannetjes Balb/c muizen, 10 weken oud en STZ wordt gebruikt om diabetes bij de muizen te veroorzaken. In totaal werden 15 muizen gebruikt en deze werden onder verdeeld in 3 groepen, telkens 5 muizen per groep. Het experiment liep gedurende een drietal dagen. De eerste groep is de negatieve controle en krijgt geen PPAG of STZ toegediend. Groep 2 is de positieve controle en krijgt enkel de insult (STZ toegediend). De laatste groep muizen wordt drie maal behandeld met PPAG voor het geven van de insult en eenmaal na het geven van de insult. 48 uur voor het toedienen van de insult (STZ) wordt aan de eerste en tweede groep oraal fysiologisch water toegediend en de derde groep krijgt oraal PPAG (10mg/kg). 24 uur voor de insult krijgen de twee eerste groepen weer oraal fysiologisch water toegediend en de derde groep krijgt weer PPAG (10mg/kg) oraal toegediend. Voor het toedienen van STZ intra peritoneaal krijgen de eerste twee groepen nogmaals oraal fysiologisch water toegediend en de derde groep PPAG (10mg/kg). Groep 1 krijgt geen STZ maar citraatbuffer intra peritoneaal toegediend. Groep 2 en groep 3 krijgen STZ (200mg/kg opgelost in citraatbuffer) intra peritoneaal toegediend. 24 uur na de insult krijgt groep 3 nogmaals PPAG (10mg/kg) oraal toegediend en groep 1 en 2 krijgen fysiologisch water. Zes uur later (30 uur na de insult) worden de muizen gedood en wordt de pancreas eruit gehaald en wordt ingebed om coupes te maken en verschillende kleuringen uit te voeren om verschillende elementen te testen. Wanneer de β-cel massa toegenomen blijkt, kan er gekeken worden of deze toename veroorzaakt werd door proliferatie, transdifferentiatie of neogenese. Hiervoor moeten andere muizen gebruikt worden dan de Balb/c muizen. Een voorbeeld voor proliferatie te testen zouden muizen zijn die de genen Elacre en YFP bezitten. Na toediening van Tamoxifen worden beide genen gecombineerd en kleuren deze de acinaire cellen in de pancreas aan. Moesten de cellen van de toegenomen β-cel massa insuline aanmaken en fluoresceren, dan zijn deze β-cellen afkomstig van acinaire cellen die geprofileerd zijn naar β-cellen. Om te kijken of de muizen de juiste genen bezitten (positief zijn voor deze genen) worden de muizen gegenotypeerd. Page 55 of 73 3.2.3 Genotypering van muizen De muizen moeten op 2 genen gecontroleerd worden: Elacre en YFP (acinaire cellen aankleuren). Genotypering bestaat uit knippen van muisstaartjes, DNA isoleren, PCR en uitzetten op een gel. Staartjes knippen De stukjes staart van de muizen worden geplaatst in mengsel van 5µl proteïne kinase K en 500µl tailbuffer. Per staartje wordt een eppendorf tube (epje) voorzien en klaargemaakt voordat de stukjes staart geknipt worden. Met een steriel mesje wordt een stukje staart van 3 à 4mm afgesneden en in een epje overgebracht. De epjes worden overnacht in warmwaterbad geplaatst op 55°C zodat de proteïne kinase geactiveerd wordt en kunnen de eiwitten afgebroken worden zodat het DNA vrijkomt. DNA isoleren De epjes worden na overnachting op 55°C gevortext om zeker te zijn dat de staartjes volledig opgelost zijn. Deze worden 10 minuten afgedraaid bij 15300g. In nieuwe epjes wordt 500µl ethanol 100% aangebracht. Het supernatans wordt overgegoten bij de ethanol en deze wordt een tiental keer gekanteld om alles goed te mengen. Het DNA slaat neer en komt tevoorschijn als een wolkje witte draadjes. Opnieuw afdraaien gedurende tien minuten bij 15300g. Het supernatans wordt afgegoten en een shortspin volgt (tot 8000rpm). Het supernatans wordt weggepipetteerd met een micropipet. Laat tien minuten drogen aan de lucht. Vervolgens voeg je 1ml DMPC toe en laat het 10 minuten staan op kamertemperatuur. Resuspendeer DNA pellet. PCR Er wordt voor elk gen een mix gemaakt. Voor ElaCre bestaat deze uit (per staal): 3,75µl dNTP, 2,5µl lim-buffer, 2µl primeroplossing 1226, 2µl primeroplossing 1227, 2µl primeroplossing 1228, 2,5µl DMSO, 0,25µl Taq en 5µl miliQ water. Voor YFP bestaat de mix per staal uit: 3,75µl dNTP, 2,5µl lim-buffer, 2µl primeroplossing 1221, 2µl primeroplossing 1222, 2,5µl DMSO en 0,25µl Taq. De Taq wordt pas aan mix toegevoegd als DNA in PCR epjes is aangebracht. Page 56 of 73 Voor Ela wordt in elk PCR epje 5µl DNA toegevoegd en 20µl mix na toevoeging van Taq. Voor YFP wordt er 12µl DNA en 13µl mix samengevoegd. Beide worden apart in een PCR toestel gestoken en voor Ela is het programma 30cyc55c en voor YFP is het programma YFP. Beide programma’s eindigen met een koeling op 4°C voor oneindig. Tabel 7: De programma's gebruikt bij PCR. YFP programma Stap graden tijd Denaturatie Denaturatie Annealing Extensie Extensie Einde 1 2 3 4 5 6 96 94 60 72 72 4 3 1 1 1 7 oneindig 30cyc55c programma stap graden tijd Denaturatie Denaturatie Annealing Extensie Extensie Einde 1 2 3 4 5 6 94 94 55 72 72 4 1 min 30 30 sec 30 sec 30 sec 7 oneindig Cycli 34 * cycli 29* Gel maken Nadat de gelhouder klaargemaakt is met 4 kammen met 20 slotjes, kan de gel klaargemaakt worden. Weeg 3g agarose af en voeg hier 250ml TBE 1x bij. Plaats in de microgolf tot al het agarose poeder opgelost is. Laat de erlenmeyer kort afkoelen onder stromend koud water. Voeg 25µl gelred toe aan de gel en giet het gelmengsel in de gelbak. Verwijder eventuele belletjes ter hoogte van de slotjes. Na 1 uur plaats je de gel in de gelbak gevuld met 1x TBE buffer. Stalen laden Aan elk staal wordt 15µl loading buffer (om het staal visueel blauw te maken en het te verzwaren, anders zou het uit de welletjes migreren) toegevoegd en hiervan wordt 15µl in een slotje aangebracht. Ook een marker (50bp ladder) moet aangebracht worden, maar slechts 5µl. Laat 45 minuten runnen op 115 volt. Page 57 of 73 4 Resultaten 4.1 In vitro 4.1.1 Hoechst-Pi en TUNEL kleuring op MIN-6 cellen Effect van PPAG (RX) en aspalathine op H2O2 geinduceerde celdood CTRL H202 50µM 40% 35% 30% % celdood 25% 20% 15% 10% 5% 0% PBS DMEM RX ASP 10 ASP 100 Grafiek 1: Effect van PPAG en aspalathine op MIN-6 cellen waaraan waterstofperoxide (H2O2) 50µM is toegediend gedurende 1 uur voor het induceren van celdood. Apoptotische cellen werden gedetecteerd met TUNEL assay. Necrotische cellen werden gekleurd met propidium jodide (Pi). DMEM medium is de controle van H 2O2. (Statistisch enkel de standaard error weergegeven) Page 58 of 73 Effect van PPAG (RX) en aspalathine op STZ geinduceerde celdood CTRL STZ 10mM 100% 90% 80% 70% % celdood 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% DMEM PBS RX ASP 10 ASP 100 Grafiek 2: Effect van PPAG en aspalathine op MIN-6 cellen waaraan streptozotocine (STZ) 10mM is toegediend gedurende 24 uur voor het induceren van celdood. Apoptotische cellen werden gedetecteerd met TUNEL assay. Necrotische cellen werden gekleurd met propidium jodide (Pi). Citraatbuffer toegediend als controle van STZ. (Statistisch enkel de standaard error weergegeven) Page 59 of 73 4.1.2 Hoechst-Pi en TUNEL kleuring op INS-1 cellen Effect van RX en Aspalathine op H2O2 en streptozotocine geïnduceerde celdood (1h insult) CTRL PBS RX ASP 10 ASP 100 100,0% 95,0% 90,0% % Cel overleving 85,0% 80,0% 75,0% 70,0% 65,0% 60,0% 55,0% 50,0% RPMI CTRL H2O2 stz 1 mM stz 10 mM Grafiek 3: Effect van PPAG en aspalathine op INS-1 cellen waaraan verschillende stress inducerende stoffen zijn toegediend gedurende 1 uur om celdood te induceren: waterstofperoxide (H2O2) 50µM en streptozotocine (STZ) 1mM en 10mM. Als controle werd RPMI (voor H2O2) en citraatbuffer (voor STZ) gebruikt. (Statistisch enkel de standaard error weergegeven) Page 60 of 73 4.1.3 Optimale condities bepalen met Cell Titer Glow-kit op INS-1 cellen Concentratiereeks van streptozotocine (STZ) op INS cellen % cel overleving (genormalizeerd naar controle) 120% 100% 80% 60% 40% 20% 0% Ct Bf STZ 1 mM STZ 2,5 STZ 5 mM STZ 7,5 STZ 10 mM (18h) mM (18h) (18h) mM (18h) (18h) Grafiek 4: Effect van concentratiereeks van streptozotocine (STZ), toegediend aan INS-1 cellen, op de celviabiliteit. STZ 1mM, STZ 2,5mM, STZ 5mM, STZ 7,5mM en STZ 10mM werden aan de cellen toegediend gedurende 24 uur om de ideale concentratie te bepalen die celdood veroorzaakt. Als controle werd er enkel citraatbuffer toegediend aan cellen. De celviabiliteit werd bepaald met de Cell Titer Glow-kit door de aanwezige ATP te meten. (Statistisch enkel de standaard error weergegeven) Page 61 of 73 Concentratiereeks van alloxaan op INS cellen % cel overleving (genormaliseerd naar controle) 120% 100% 80% 60% 40% 20% 0% RPMI Alloxaan 0,1 Alloxaan 0,3 mM mM Alloxaan 1mM Alloxaan 5mM Grafiek 5: Effect van concentratiereeks van alloxaan, toegediend aan INS-1 cellen, op de celviabiliteit. Alloxaan 0,1mM, alloxaan 0,3mM, alloxaan 1mM en alloxaan 5mM werden aan de cellen toegediend gedurende 24 uur om de ideale concentratie te bepalen die celdood veroorzaakt. Als controle werd er enkel RPMI medium toegediend aan cellen. De celviabiliteit werd bepaald met de Cell Titer Glow-kit door de aanwezige ATP te meten. (Statistisch enkel de standaard error weergegeven) Page 62 of 73 Concentratiereeks van cyclopiazonic acid (CPA) op INS cellen % cel overleving (genormaliseerd naar controle) 120% 100% 80% 60% 40% 20% 0% DMSO CPA 2,5 µM CPA 5 µM CPA 12,5 µM CPA 25 µM CPA 50 µM Grafiek 6: Effect van concentratiereeks van cyclopiazonic acid (CPA), toegediend aan INS-1 cellen, op de celviabiliteit. CPA 2,5µM, CPA 5µM, CPA 12,5µM, CPA 25µM en CPA 50µM werden aan de cellen toegediend gedurende 24 uur om de ideale concentratie te bepalen die celdood veroorzaakt. Als controle werd er enkel DMSO toegediend aan cellen. De celviabiliteit werd bepaald met de Cell Titer Glow-kit door de aanwezige ATP te meten. (Statistisch enkel de standaard error weergegeven) Page 63 of 73 Concentratiereeks van H2O2 op INS cellen % cel overleving (genormaliseerd naar controle) 120% 100% 80% 60% 40% 20% 0% RPMI H2O2 10µM H2O2 25 H2O2 50 H2O2 75 H2O2 100 µM µM µM µM Grafiek 7: Effect van concentratiereeks van waterstofperoxide (H2O2), toegediend aan INS-1 cellen, op de celviabiliteit. H2O2 10µM, H2O2 25µM, H2O2 50µM, H2O2 75µM en H2O2 100µM werden aan de cellen toegediend gedurende 1 uur om de ideale concentratie te bepalen die celdood veroorzaakt. Als controle werd er enkel RPMI medium met DMSO toegediend aan cellen. De celviabiliteit werd bepaald met de Cell Titer Glow-kit door de aanwezige ATP te meten. (Statistisch enkel de standaard error weergegeven) Page 64 of 73 % cell overleving genormaliseerd met CPA Effect van PPAG (RX) op CPA geïnduceerde cell dood 160% 140% 120% 100% 80% 60% CPA 25µM CPA 25µM + RX Grafiek 8: Het effect van PPAG op celdood veroorzaakt door cyclopiazonic acid (CPA) toegediend aan INS-1 cellen gedurende 24 uur. De celviabiliteit werd gemeten met de Cell Titer Glow-kit door de aanwezige ATP te meten. (Statistisch enkel de standaard error weergegeven) Page 65 of 73 4.2 In vivo Effect van PPAG (RX) op STZ behandelde muizen (glucose concentratie) 300,0 250,0 mg/dl 200,0 150,0 100,0 50,0 0,0 CTRL STZ STZ+RX Grafiek 9: Het effect van PPAG op de glucose concentratie bij muizen behandeld met streptozotocine (STZ) gedurende 30 uur. Glucose werd bepaald met glucosemeter. Als negatieve controle (CTRL) werd bij een groep muizen alles vervangen door fysiologisch water. (Statistisch enkel de standaard error weergegeven) Effect van PPAG (RX) op STZ behandelde muizen (β-cel massa) 120% BCM (genormaliseerd) 100% 80% 60% 40% 20% 0% CTRL STZ STZ+ RX Grafiek 10: Het effect van PPAG op de β-cel massa bij muizen behandeld met streptozotocine (STZ) gedurende 30 uur. De β-cel massa werd bepaald door de morfometrie te bepalen in parafine secties gemaakt van de pancreas. Als negatieve controle (CTRL) werd bij een groep muizen alles vervangen door fysiologisch water. (Statistisch enkel de standaard error weergegeven) Page 66 of 73 Tunel positieve cellen in STZ behandelde muizen % apoptotische cellen 2,50% 2,00% 1,50% 1,00% 0,50% 0,00% CTRL STZ STZ + RX Grafiek 11: Het effect van PPAG (RX) op het aantal apoptotische cellen bij muizen behandeld met streptozotocine (STZ) gedurende 30 uur. De apoptotische cellen werden gedetecteerd met de TUNEL assay. Als controle werd bij een groep muizen alles vervangen door fysiologisch water. (Statistisch enkel de standaard error weergegeven) Page 67 of 73 5 Discussie Type 2 diabetes wordt gekenmerkt door dysfunctie van β-cellen, insuline resistentie en verlies van β-cel massa die leiden tot de deficiëntie van de insuline secretie in β-cellen (Cnop et al, 2001). Gelinkt aan obesitas kan het verlies van de β-cel massa verklaard worden door cellulaire stress die zorgt dat β-cellen in apoptose gaan (Cnop et al, 2010). De interesse is gevallen op de Zuid-Afrikaanse plant Rooibos, Aspalathus linearis. Deze plant is zeer populair onder de vorm van herbal tea. Er is al redelijk wat onderzoek gedaan op deze plant (in zijn geheel, gefermenteerde of ongefermenteerde extracten ervan). Rooibos bevat een breed gamma aan antioxidanten (Ulicna et al, 2005), waaronder fenolen (Han et al, 2013). Dit maakt van Rooibos een interessante kandidaat om te gaan testen op antidiabetische eigenschappen. Rooibos thee kan toegediend worden als behandeling en bescherming tegen oxidatieve stress (Han et al, 2013, getest op ratten). Nu wordt er volop onderzoek gedaan naar componenten waaruit Rooibos bestaat en wat hun eventuele antidiabetische eigenschappen zijn. PPAG en aspalathine zijn 2 stoffen geëxtraheerd uit Rooibos. Van beide stoffen is nog niet heel veel geweten. Enkel van PPAG is er reeds een in vivo experiment uitgevoerd en daar werd een effect van PPAG gezien op de expressie van Bcl-2, een anti-apoptotische proteïne. PPAG zou dus een beschermend effect hebben op β-cellen tegen apoptose, wat zou zorgen dat er minder verlies is van de β-cel massa. Om in de toekomst andere stoffen met mogelijk antidiabetische eigenschappen te kunnen testen is het belangrijk om over een in vitro model met verschillende stress inducerende stoffen te beschikken waarbij de stoffen snel en gemakkelijk gescreend kunnen worden, waarbij de nadruk ligt op high troughput screening en niet op werkingsmechanisme. Ook over een goed in vivo model beschikken is belangrijk om na in vitro experimenten te kunnen overschakelen op een in vivo studie. Om apoptotische cellen aan te tonen werd er gebruik gemaakt van de TUNEL assay gecombineerd met de Hoechst-Pi kleuring, wat een goede en gemakkelijke detectiemethode is, want het onderscheidt gemakkelijk alle groepen van cellen (vroeg en laat apoptotische-, necrotische- en levende cellen) (Roche Diagnostics, 2008). Het eerste experiment werd uitgevoerd op MIN-6 cellen. Er werden 4 stress-inducerende stoffen gebruikt Page 68 of 73 (streptozotocine (STZ) 1mM en 10mM, alloxaan 5mM, cyclopiazonic acid (CPA) 25µM en waterstofperoxide 50µM) en de insult werd gegeven voor 24 uur (uitzondering van waterstofperoxide maar 1 uur). Aan de cellen werd tweemaal PPAG en aspalathine toegediend (48 uur voor en net voor het toedienen van de insult). CPA en alloxaan (resultaat niet weergegeven) zorgde bij het toedienen van de insult (positieve controle, zonder toevoeging van PPAG of alloxaan) niet of niet voldoende voor apoptose. Voor alloxaan is dit in strijd met Sakuraï et al (2001), waarop de concentratie gebaseerd was, waar 5mM alloxaan bij een insult van 6 uur meer dan 50% celdood veroorzaakt. STZ 10mM en waterstofperoxide zorgden wel voor celdood (zie grafiek 1 en 2). Alleen zorgde STZ 10mM voor 100% celdood, wat te verklaren valt door de hoge concentratie citraatbuffer waarin STZ 10mM was opgelost en citraatbuffer veroorzaakt zelf veel celdood (resultaat niet weergegeven). Bij STZ 1mM was niet echt duidelijk celdood waar te nemen (resultaat niet weergegeven). Waterstofperoxide veroorzaakte 30% celdood (iets minder dan Hui et al (2003), 50µM waterstofperoxide gedurende 30 minuten veroorzaakt meer dan 50% celdood). Ook is er een effect waar te nemen van PPAG en aspalathine: beide verlagen het percentage celdood met ongeveer 20%. Het experiment werd herhaald, maar nu op INS-1 cellen en enkel STZ en waterstofperoxide insult werden toegediend. STZ werd gedurende 6 uur toegediend en waterstofperoxide gedurende 1 uur. De overschakeling naar INS-1 cellen maakt het mogelijk om te gaan vergelijken met reeds uitgevoerde in vitro experimenten (ook op INS-1 cellen, unpublished data). Door eerst een hogere concentratie STZ te bereiden (oplossen in citraatbuffer) en deze dan te verdunnen in medium, bezit STZ 10mM een tien keer lagere concentratie citraatbuffer en veroorzaakt nu maar (zie grafiek 3) 25% celdood (in plaats van 100% bij experiment 1, grafiek 1). Ook hier is bij STZ 1mM geen duidelijk celdood waar te nemen. Wel zorgt waterstofperoxide weer voor 30% celdood (zelfde als bij het eerste experiment). Waterstofperoxide 50µM gedurende 1 uur toedienen kan beschouwd worden als een gemakkelijke en goedkope screeningstest die snel celdood (apoptose en necrose) induceert. Ook hier is een beschermend effect van PPAG en aspalathine bij waterstofperoxide (10%) en bij STZ 10mM (10% voor PPAG en 20% voor aspalathine). Wat bij beide experimenten opvalt (grafiek 1, 2 en 3) is dat aspalathine de celdood bijna terug op basaal niveau brengt bij de niet gestimuleerde condities. Het tweede experiment zou moeten overgedaan worden om Page 69 of 73 betrouwbare resultaten te verkrijgen en dan pas is het nuttig om er statistiek op uit te voeren. Ook moeten er meer cellen geteld worden, want de standaard error is bij sommige condities zeer groot. Om voor de drie andere stress inducerende stoffen verder de ideale concentratie te zoeken, moest er overgeschakeld worden naar een goedkopere methode, want de TUNEL assay is een heel dure detectiemethode. Gecombineerd met Hoechst-Pi kost 1 plaat 1354€ (werkuren en materiaal inbegrepen) en dan zou het voor drie platen op 4150€ komen (als het meteen lukt), wat veel te duur is. Volgende detectiemethoden zijn nuttig om te gebruiken als detectiemethode: Cell Titer Glow, JC-1, caspase Glow en Hoechst-Pi. Bij caspase Glow wordt er gebruik gemaakt van fluoresceïne gebonden aan substraat (gekliefd door caspases) en wordt er enkel apoptose gedetecteerd, maar is veel te duur (510€ per plaat). Cell Titer Glow detecteert celdood doordat de aanwezige ATP ( samen met O2 en Mg2+) luciferine omzetten naar oxyluciferine en hierbij wordt licht geproduceerd en gemeten met luminometer. Met deze kit werd een derde experiment uitgevoerd, want het is een zeer goedkope (60€ per plaat), snelle en gemakkelijke test, want het bevat geen voorbereidende stappen zoals het fixeren en permeabiliseren van de cellen). Er werd een concentratiereeks voor elke stress-inducerende stof getest op INS-1 cellen. STZ (0mM, 1mM, 2,5mM, 5mM, 7,5mM en 10mM), CPA (0µM, 2,5µM, 5mM, 12,5mM, 25µM en 50µM) en alloxaan (0mM, 0,1mM, 0,3mM, 1mM en 5mM) werden gedurende 24 uur toegediend en waterstofperoxide maar 1 uur (0µM, 10µM, 25µM, 50µM, 75µM en 100µM). Voor STZ (zie grafiek 4) is 1mM duidelijk de ideale concentratie (40% celdood veroorzaakt), wat bevestigd wordt door Zhang et al (2007) waar 1mM STZ (voor 4 uur insult) 30 tot 35% celdood veroorzaakt (hierop was de concentratie gebaseerd). Voor CPA (grafiek 6) is 25µM de ideale concentratie (40% celdood veroorzaakt). Voor waterstofperoxide werd voor een derde maal (zie vorige twee experimenten, grafiek 7) bevestigd dat 50µM waterstofperoxide toegediend gedurende 1 uur een goed model is om celdood te veroorzaken (60%). PPAG heeft een verlagend effect op de celdood (10%, zie grafiek 8) veroorzaakt door CPA, wat overeenkomt met unpublished data waar ook een verlaging is van 10%. Twee grote problemen deden zich voor tijdens dit experiment. Aspalathine liet het medium verkleuren en eerst werd er aan verzuring van het medium gedacht, maar het is aspalathine die oxideert en zijn metabolieten zijn bruin. Deze metabolieten veroorzaken verkleuring van Page 70 of 73 het medium veroorzaakte. Cell Titer Glow-test is dus geen goede test voor aspalathine, want (we vermoeden) aspalathine gebruikt de zuurstof die nodig is om luciferine om te zetten naar oxyluciferine om zelf te gaan oxideren, waardoor er geen correcte hoeveelheid celviabiliteit bepaald kan worden. Bij alloxaan is er uit de concentratiereeks geen ideale concentratie bepaald kunnen worden: 0,3mM gaf bijna geen celdood en 5mM gaf te veel celdood (bijna alle cellen waren dood). Dit is in strijd met Sakuari et al (2001) waar 0,3mM voornamelijk apoptose induceert en 5mM meer necrose. Een mogelijke verklaring zou zijn dat bij de cellen in vroeg apoptose ATP aangemaakt hebben om de caspases te kunnen activeren en dit wordt gemeten met de Cell Titer Glow-kit. Ook JC-1 test werd gebruikt, maar wordt niet weergegeven want uit dit experiment is niets gekomen. In de toekomst moeten al de Cell Titer Glow-experimenten nogmaals uitgevoerd worden om betrouwbaardere resultaten te verkrijgen en statistiek erop te kunnen uitvoeren. Ook moet alles bevestigd worden met een andere test, Hoechst-Pi kleuring bijvoorbeeld (morfologisch op basis van picknotische kernen en rode en blauwe kleur onder de fluorescentiemicroscoop de cellen tellen en onderverdelen in apoptose, necrose en levende cellen. In vivo (experiment reeds uitgevoerd door mijn begeleider) werd enkel PPAG getest op muizen. Er werd STZ (200mg/kg) toegediend om diabetes te induceren bij de muizen. Aan een van de drie groepen (bestaande uit 5 muizen) werd 48 uur, 24 uur en juist voor toedienen van STZ en 24 uur erna, PPAG (10mg/kg) toegediend. In de positieve controle (enkel STZ toegediend gekregen en insult duurde 30 uur) is er een duidelijk effect waar te nemen: stijging van de glucose concentratie (grafiek 9), een vermindering van de β-cel massa (grafiek 10) en apoptose werden gedetecteerd (grafiek 11). Bij PPAG werd geen effect waargenomen op de glucose concentratie (grafiek 9), maar wel een verlagend effect (mindere daling) op de β-cel massa (grafiek 10) en ook op de hoeveelheid apoptose (grafiek 11). Dit model kan als in vivo model gebruikt worden om andere stoffen waaronder aspalathine te gaan testen, maar er moeten voor dit experiment nog extra cellen geteld worden (nieuwe coupes gemaakt en kleuringen) om de standaard error te verkleinen. Het in vivo experiment zal herhaald worden, maar dan behandeld met aspalathine in plaats van PPAG. Page 71 of 73 Binnenkort wordt er gestart met een nieuw in vivo experiment: PPAG gedurende zeven dagen toedienen na het geven van de insult en er zal weer gekeken worden naar de glucose concentratie en β-cel massa. Hopelijk is na 7 dagen de glycemie terug normoglycemisch en stijgt de glycemie niet terug als men stopt met PPAG. In dat geval bevat PPAG een langdurige effect, wat mogelijk zou maken om niet dagelijks een bepaalde hoeveelheid van PPAG te moeten innemen (wat natuurlijk nog onderzocht moet worden). Een gelijkaardige strategie zal gevolgd worden om aspalathine in vivo te bestuderen. Het enige verschil is dat aspalathine zal gegeven worden in het voedsel. Eerst zal er een gelijkaardig experiment uitgevoerd worden met 30 uur STZ waarna ook een langere termijn studie zal uitgevoerd worden. Page 72 of 73 6 Besluit We beschikken over een in vivo model dat al na 30 uur β-celdood induceert met streptozotocine (STZ) als celdood inducerende stof en over een in vitro model dat al na 1 uur celdood induceert met waterstofperoxide als stress-inducerende stof. In vitro zijn STZ 1mM en cyclopiazonic acid (CPA) 25µM de ideale concentratie om celdood te induceren in INS-1 cellen, maar deze moeten nog bevestigd worden door herhaling van de Cell Titer Glo-test en door een tweede test (met andere detectiemethode). Voor de ideale concentratie van alloxaan moet een andere concentratiereeks getest worden en ook met een andere methode of een andere tijdsduur waarop de insult toegediend wordt. PPAG verlaagt zowel in vitro als in vivo de celdood, maar het effect op de glucose concentratie moet nog verder onderzocht worden, zoals testen op lange termijn. Voor aspalathine moet een andere detectiemethode gebruikt worden om meer inzicht te krijgen in de mogelijke antidiabetische eigenschappen. Ook werd er opgemerkt dat aspalathine en PPAG de celviabiliteit terug brengen naar het basaal niveau in de niet gestimuleerde condities wat ook voor verder onderzoek vraagt, maar veelbelovend lijkt. Veel moet er nog getest of bevestigd worden, maar deze experimenten hebben de kennis over PPAG al weer een stukje vergroot en bepaalde zaken bevestigd. Page 73 of 73 Referenties Casteels, K. Diabetes Mellitus. KU Leuven. Geraadpleegd op 18 januari 2014 via http://www.kuleuven.be/uzschool/download/studiedag/casteels_tekst.pdf. Cnop, M.; Ladrière, L.; Igiollo-Esteve, M.; Moura, R.F. & Cunha, D.A. (2010, 5 mei). Causes and cures for endoplasmatic reticulum stress in lipotoxicβ cell dysfunction. Diabetes, Obesity & Metabolism, 2, nr. 2, pp. 76-82. De wereld onder de microscoop: exocriene pancreas (2012, 11 oktober). Geraadpleegd op 18 januari 2014 via http://www.ronaldschulte.nl/exocriene-pancreas--alvleesklier-.html. Diabetes Research Institute Foundation.What are Islet Cells?Geraadpleegd op 13 januari 2014 via http://www.diabetesresearch.org/islet-cells. Diakogiannaki, E. & Morgan, N.G. (2008). Differential regulation of ER-stress response by long-chain fatty acids in pancreatic β cells. Biochemical Society Transactions, 36, nr. 5, pp. 959-962. DIFF. Description of Research. Geraadpleegd op 18 januari 2014 via http://diff.vub.ac.be. Diffen. Apoptosis vs. Necrosis. Geraadpleegd op 11 mei 2014 via http://www.diffen.com/difference/Apoptosis_vs_Necrosis. Edmonds, M. What is apoptosis? Geraadpleegd op 14 januari 2014 via http://science.howstuffworks.com/life/cellular-microscopic/apoptosis.htm. Encyclopeadia Britannica (2003). Islet of Langerhans. Geraadpleegd op 28 april 2014 via http://www.britannica.com/EBchecked/media/101913/The-islets-of-Langerhans-areresponsible-for-the-endocrine-function. Ev. (2014, januari). Voorgoed verlost van diabetes?, Eos, 31, nr. 1, pp. 8. Genomicobject. Apoptosis Induced by Fas Ligand. Geraadpleegd op 14 januari 2014 via http://genomicobject.net/member3/GONET/apoptosis.html#fig:Apop. Gezginci-Oktayoglu, S. (2011, 11 maart). The apoptotic effects of Streptozotocin in different dose and administration time on pancreatic islet cells of rats. Journal of Biology, 70, nr. 2, pp. 43-51. Graham, M.L.; Janecek, J.L.; Kittredge, J.A; Hering, B.J. & Schuurman, H.J. (2004, augustus). The Streptozotocin-Induced Diabetic Nude Mouse Model: Differences between Animals from Different Sources. Comparative Medicine, 61, nr. 4, pp. 356-360. Hui, H.; Nourparvar, A.; Zhao, X. & Perfetti, R. (2003, april). Glucagon-Like Peptide-1 Inhibits Apoptosis of Insulin-Secreting Cells via a Cyclic 5-Adenosine Monophosphate-Dependent Protein Kinase A- and a Phosphatidylinositol 3-Kinase-Dependent Pathway. Endocrinology, 144, nr. 4, pp. 1444-1455. Lenzen, S. (2008, 18 december). The mechanisms of alloxan- and streptozotocin-induced diabetes. Diabetologia, 51, nr. 2, pp. 216-226. Lewis-Wambi, J.S. & Jordan, V.C. (2009, 29 mei). Estrogen regulation of apoptosis: how can one hormone stimulate and inhibit? Breast Cancer Research, 11, nr. 3, pp 206-217. Marthan, R. (2004, mei). Store-operated calcium entry and intracellular calcium release channels in airway smooth muscle. The American Physiological Society, 286, nr. 5, pp. 907908. Ma, Z.A; Zhao, Z. &Turk, J. (2011, 3 september). Mitochondrial Dysfunction and β-Cell Failure in Type 2 Diabetes Mellitus. Experimental Diabetes Research, 2012, pp. 1-11. Morgan, N.G.; Cable, H.C.; Newcombe, N.R. and Williams, G.T. (1994, 24 oktober). Treatment of Cultured Pancreatic B-cells with Streptozotocin Induces Cell Death by Apoptosis.Bioscience Reports, 14, nr. 5, pp. 243-250. Parenteau, W. (2011, 25 october). Identifying the Stages of Apoptosis. affymetrix Ebioscience. Geraadpleegd op 28 april 2014 via http://info.ebioscience.com/bid/76527/Identifying-the-Stages-of-Apoptosis. Pineau, L. & Ferreira, T. (2010, 25 augustus). Lipid-induced ER-stress in yeast and β cells: parallel trials to a common fate. FEMS 2010, nr. 10, pp. 1035-1045. Promega Corporation A (2012, december). CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay. Geraadpleegd op 19 maart 2014 via http://be.promega.com/~/media/Files/Resources/Protocols/Technical%20Bulletins/0/CellTit er%20Glo%20Luminescent%20Cell%20Viability%20Assay%20Protocol.pdf. Promega Corporation B (2012, november). Luciferase Assay System. Geraadpleegd op 19 maart 2014 via http://be.promega.com/~/media/Files/Resources/Protocols/Technical%20Bulletins/0/Lucife rase%20Assay%20System%20Protocol.pdf. Roche Diagnostics (2008). In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein.Geraadpleegd op 12 maart 2014 via http://www.roche-applied-science.com/shop/products/in-situ-cell-deathdetection-kit-fluorescein#tab-2. Rohilla, A. & Ali, S. (2012, april-juni). Alloxan Induced Diabetes: Mechanisms and Effects. International Journal of Research in Pharmaceutical and Biomedical Sciences, 3, nr. 2, pp. 819-823. Sakurai, K; Katoh, M.; Someno, K.& Fujimoto, Y. (2001, 8 mei). Apoptosis and Mitochondrial Damage in INS-1 Cells Treated with Alloxan. Biological Pharmaceutical Pulletin, 24, nr.8, pp. 876-882. Skelin, M; Rupnik, M & Cencic, A. (2010, 17 mei). Pancreatic Beta Cell Lines and their Applications in Diabetes Mellitus Research. Altex 27, 2, nr. 10, pp 105-113. Stages in Apoptosis (Cell Death), (2004). Geraadpleegd op 28 april 2014 via http://cellbiology.med.unsw.edu.au/units/science/project2004/Apoptosisstages.htm. Szkudelski, T. (2001, 20 maart). The Mechanism of Alloxan and Streptozotocin Action in β Cells of the Rat Pancreas.Physiological Research, 50, nr. 1, pp. 536-546. Taylor, T. (2012, oktober). Pancreas. Innerbody.com. Geraadpleegd op 13 januari 2014 via http://www.innerbody.com/image/endo03.html. Wali, J.A.; Masters, S.L. & Thomas, H.E. (2013, 26 april). Linking Metabolic Abnormalities to Apoptotic Pathways in Beta Cells in Type 2 Diabetes. Cells 2013, nr. 2, pp. 226-283. Wat doet de pancreas. Geraadpleegd op 18 januari 2014 via http://www.newsmedical.net/health/What-Does-The-Pancreas-Do-(Dutch).aspx. WHO. About diabetes. Geraadpleegd op 18 en 19 januari 2014 via http://www.who.int/diabetes/action_online/basics/en/index.html. Zhang, B.; Lu, Y.; Campbell-Thompson, M.; Spencer, T.; Wasserfall, C.; Atkinson, M. & Song, S. (2007, 14maart). α1-Antitrypsin Protects β-Cells From Apoptosis. Diabetes, 56, nr. mei, pp. 1316-1323.
