Bachelorproef Validatie van een Tissue Processor AZ Nikolaas labo Pathologische Anatomie Moerlandstraat 1, 9100 Sint-Niklaas Mevr. Evy Janssens Kimberley Wuytack Departement GEZ-LA Bachelor Biomedische Laboratoriumtechnologie Afstudeerrichting Farmaceutische en Biologische Laboratoriumtechnologie 2013-2014 Voorwoord Mijn dank gaat uit aan mijn promotor en tevens hoofdlaborante Evy Janssens en het Medische Diensthoofd Dr. S. Deprez die mijn stage mogelijk maakten. Dr. E Beerens voor het nalezen en verbeteren van mijn eindwerk. De pathologen Dr. H. Woestenborghs, Dr. A. De Pauw en alle laboranten van het labo Pathologische Anatomie die mij hebben bijgestaan bij het verwezenlijken van mijn eindwerk en het wegwijs maken in het labo. Mijn dank aan Els Jordens vertegenwoordiger van Klinipath die mij geholpen heeft bij het begrijpen van het toestel en geholpen heeft bij het oplossen van problemen. Mijn dank gaat ook uit naar mijn contactpersoon mevr. Elke Vanneste en stage coördinator mevr. Brisaert van de Erasmus Hogeschool Brussel. Organigram Medisch Diensthoofd Dr. S. Deprez Pathologen Dr. H. Woestenborghs Hoofdlaborante E. Janssens laboranten secretariaat W. De Clercq B. De Wree Dr. E. Beerens D. Waterschoot W. Kandouch Dr. A. De Pauw E. Sleebus E. Van den Abbeele M. Vanclooster S. Bertrand M. Six M. van Voren Inhoud 1. Inleiding ......................................................................................................................... 1 2. Literatuurstudie .............................................................................................................. 2 3. 4. 2.1. Van biopt tot resultaat ............................................................................................. 2 2.2. Immunologische Histochemische (IHC-) kleuringen ...............................................15 2.3. Speciale kleuringen ................................................................................................15 2.4. Macroscopische beoordeling / Vriescoupes ...........................................................15 2.5. Interview laboratorium Pathologische Anatomie Ieper ............................................16 Materiaal en methode ....................................................................................................18 3.1. Validatie SOP .........................................................................................................18 3.2. Validatieplan...........................................................................................................21 3.3. Validatie .................................................................................................................22 Resultaten .....................................................................................................................25 4.1. Routine...................................................................................................................25 4.2. Validatie .................................................................................................................27 5. Bespreking ....................................................................................................................35 6. Besluit ...........................................................................................................................37 Bibliografie ...........................................................................................................................40 Bijlage Figuren Figuur 1: Het schema van het proces dat het staal doorloopt in het labo. .............................. 2 Figuur 2: De Logos (Medical Expo, z.d.) ................................................................................ 4 Figuur 3: De 2 baden: links bad 1, rechts bad 2 met paraffine (Medical Expo, z.d.) ............... 5 Figuur 4: Containerschuif (Medical Expo, z.d.) ...................................................................... 5 Figuur 5: Condensatievaten (Medical Expo, z.d.) .................................................................. 9 Figuur 6: Grafiek van de meest frequente tumoren per geslacht, België 2011 (Stichting kankerregister, 2011)............................................................................................................14 Figuur 7: Paraffineblok 1: gesneden van afgewerkt staal, placenta weefsel .........................25 Figuur 8: Paraffineblok 1: gesneden van afgewerkt staal, placenta weefsel .........................25 Figuur 9: Paraffineblok 2: gesneden van afgewerkt staal, placenta weefsel .........................26 Figuur 10: Patiënten staal: paraffineblok gesneden, synovium/gewrichtsweefsel .................26 Figuur 11: Patiënten staal: paraffineblok gesneden, huidweefsel .........................................26 Figuur 12: Eerste H&E coupe ...............................................................................................38 Figuur 13: Opnieuw aangevraagde H&E coupe ....................................................................39 Tabellen Tabel 1: Kleurprogramma ‘biopsie’ .......................................................................................13 Tabel 2: Weefselstalen .........................................................................................................22 Tabel 3: Dagrun tijdsschema ................................................................................................28 Tabel 4: Bekeken weefsels in fase 1 ....................................................................................28 Tabel 5: Beoordeelde H&E-kleuring coupes in fase 2; S= Dr. Deprez, E= Dr. Beerens, H= Dr. Woestenborghs, A= Dr. De Pauw .........................................................................................28 Tabel 6: Verschillende weefsels beoordeeld in fase 2 ..........................................................29 Tabel 7: Beoordeelde IHC-kleuring coupes in fase 2; S= Dr. Deprez, E= Dr. Beerens, H= Dr. Woestenborghs, A= Dr. De Pauw .........................................................................................29 Tabel 8: Verschillende beoordeelde IHC-kleuringen ............................................................31 Tabel 9: Beoordeelde H&E-kleuring coupes in fase 3; S= Dr. Deprez, E= Dr. Beerens, H= Dr. Woestenborghs, A= Dr. De Pauw .........................................................................................32 Tabel 10: Verschillende weefsels beoordeeld in fase 3 ........................................................33 Tabel 11: Beoordeelde IHC-kleuring coupes in fase 3; S= Dr. Deprez, E= Dr. Beerens, H= Dr. Woestenborghs, A= Dr. De Pauw ...................................................................................33 Tabel 12: Verschillende beoordeelde IHC-kleuringen ..........................................................34 Afkortingen HP IHC- kleuringen IQ OQ PA PAS- amylase PQ PSA SOP TAT TUR Helicobacter pylori Immunologische Histochemische kleuringen Installation Qualification Operating Qualification Patholoog Anatoom Periodic acid Schiff reactie met amylase Product Qualification Prostaat Specifiek Antigen Standard Operating Procedures Turn around time Trans Urethrale Resectie Samenvatting/abstract De Logos Microwave Hybrid Tissue Processor werd aangekocht door het laboratorium Pathologische Anatomie van het AZ Nikolaas, omwille van capaciteitsuitbreiding en om ook overdag te kunnen doorvoeren. Alvorens de ingebruikname moet het toestel worden gevalideerd. De validatie houdt in dat verschillende stalen in tweevoud worden verwerkt. Het ene staal volgt de klassieke verwerking in de Citadel. Het andere staal gaat in het nieuwe toestel de Logos. Er wordt ook getest of het versneld doorvoeren overdag invloed heeft op de kwaliteit van de stalen. Verschillende weefsels werden getest op zowel H&E kleuring, Immunologisch Histochemische kleuringen als moleculaire kleuringen. We kunnen besluiten dat H&E kleuring en Immunologische Histochemische kleuringen niet significant verschillend zijn. De moleculaire testen moeten nog verder onderzocht worden tot er genoeg weefselstalen zijn om te vergelijken. Het toestel voldoet aan de criteria voor de validatie van de Logos voor de H&E kleuring en Immunologische Histochemische kleuringen. The Logos Hybrid Microwave Tissue Processor was purchased by the Laboratory of Pathological Anatomy of the AZ Nikolaas, so it can also run during the day. Before commissioning the device must be validated. The validation means that different samples are taken in duplicate. One cartridge is in the Citadel and the other in the Logos. It is also tested whether the accelerated implementation during daytime affects the quality of the samples. Different tissues were tested for both H&E staining, Immunological Histochemical staining as a molecular stainings. We can conclude that H&E staining and Immunological Histochemical stains are not significantly different. The molecular tests should be further explored until enough tissue samples to compare. The device measure up to the criteria for the validation of the Logos for H & E staining and Immunological histochemical staining. 1. Inleiding Mijn onderzoeksvraag is de validatie van een toestel om weefsel door te voeren. Dit toestel is de Logos Microwave Hybrid Tissue Processor. Dit moet gebeuren voor zowel overnacht doorvoeren als versneld overdag doorvoeren, zodat er een ‘continue workflow’ kan worden opgestart. Het Laboratorium Pathologisch Anatomie van het AZ Nikolaas heeft een nieuw doorvoertoestel aangekocht nl. de Logos Microwave Hybrid Tissue Processor van de firma Milestone. Deze moet gevalideerd worden voor ingebruikname. Hoe de validatie verloop kan teruggevonden worden in hoofdstuk 3: Materiaal en methode. Momenteel is het doorvoertoestel THERMO-SHANDON / Citadel 2000 in gebruik. Nu zijn er twee toestellen in gebruik, die samen niet de capaciteit kunnen leveren die verwacht wordt. Ze zullen vervangen worden door de Logos, een zal in gebruik blijven als back up. Er wordt geopteerd voor een nieuwe workflow genaamd lean werken. Lean werken houdt in dat alle overtollige handelingen vermeden worden en heeft als doel de werkdruk te verminderen. Het versnijden van biopten moet gebeuren tot 18u, vlak voor het doorvoertoestel wordt opgestart. Dit zou ook verminderen als er overdag een tweede run is. Er kunnen dan ’s morgens kleine biopten worden ingebed, die dan in de voormiddag in de dagrun gaan. Het laboratorium situeert zich in de beginfase van de erkenning voor Laboratoria Pathologische Anatomie. Men is volop bezig met het opstellen van het kwaliteitshandboek met SOP’s, SLA, ... Er moeten nog steeds SOP’s opgesteld worden o.a. de SOP voor de validatie van een toestel. Voor de Logos gevalideerd kan worden moet er een validatie SOP worden opgesteld deze is terug te vinden in hoofdstuk 3 materiaal en methode. Dit zal in samenwerking met de stage mentor opgesteld worden. Als deze opgesteld is moet er een validatieplan opgesteld worden, dit wil zeggen hoe gaan we valideren. Het toestel wordt gevalideerd volgens het validatieplan. Dit om de kwaliteit van de stalen te garanderen. Na het valideren zal er een validatie rapport worden opgesteld. Dit zal alle informatie bevatten over hoe het toestel werd gevalideerd, welke problemen werden vastgesteld en hoe deze werden opgelost. In de literatuurstudie staat er beschreven welk proces het biopt doorloopt. Er wordt een gedocumenteerde uitleg gegeven over de logos. Het interview met het Laboratorium Pathologische Anatomie Ieper dat gehouden werden i.v.m. de Logos wordt weergegeven in de literatuurstudie. 1 2. Literatuurstudie 2.1. Van biopt tot resultaat Een biopt is een stuk weefsel dat tijdens een ingreep bij de patiënt is weggenomen. Dit kan een zeer groot stuk zijn bv een darmresectie tot een zeer kleine stuk bv. een maagbiopt van een kijkonderzoek. Figuur 1: Het schema van het proces dat het staal doorloopt in het labo. Autopsies worden niet meer uitgevoerd in het Laboratorium Pathologische Anatomie van het AZ Nikolaas. 2.1.1. Ontvangst en registratie De weefselstalen worden binnen gebracht of worden op afgesproken tijdstip en plaats afgehaald door medewerkers van het laboratorium. Vervolgens wordt op het secretariaat vergeleken of het aanvraagformulier en de ontvangen recipiënten overeenkomen. De stalen worden geregistreerd en een nummer toegewezen, onregelmatigheden worden eveneens geregistreerd. 2.1.2. Fixeren Een biopt wordt na de afname meestal gefixeerd in het fixatief formol 4% (uitz.: vriescoupes, macroscopische beoordelingen,…). Een klein biopt moet minstens 6u fixeren. Grotere resectiestukken worden 24u tot 72u gefixeerd. Sommige grote stukken worden gelamelleerd en d.m.v. papieren tussenschotten van elkaar gescheiden zodat de formol beter kan doordringen in de lamellen om zo een optimale fixatie te verkrijgen. Het macroscopische 2 onderzoek wordt deels vooraf en deels achteraf uitgevoerd, mits door het lamelleren en de fixatie er een vormafwijking optreedt. 2.1.3. Macroscopie en biopsiename (Inbedden) Na de fixatie volgt macroscopische analyse en het uitsnijden van weefselblokken. Hier wordt een onderscheid gemaakt tussen de grote en de kleine macroscopie. De kleine macroscopie kan door alle opgeleide laboranten gebeuren. Kleine macroscopie is alle kleine puncties, huidjes, maagbiopten, prostaat TUR, … De afmetingen en het aantal biopten wordt genoteerd. Wanneer het weefselfragment te groot is om in zijn totaliteit in te bedden in één cassette, wordt het versneden en representatieve doorsneden worden ingebed. De grote macroscopie wordt enkel door de hiervoor opgeleide laboranten uitgevoerd. Grote macroscopie houdt in alle resectiestukken zoals borstresecties, schildklierresecties,… Soms wordt advies van de pathologen gevraagd indien er iets merkwaardig of onduidelijk is. Er wordt gebruik gemaakt van gestandaardiseerde protocollen. Er wordt steeds begonnen met alle afmetingen en gewicht te noteren. Vervolgens zichtbare en voelbare letsels. Vorm, diameter, aspect, worden opgeschreven. Het is van belang dat er representatieve weefselsneden worden genomen: o.a. chirurgische snederanden, elke gevonden tumor of verdacht weefsel, lymfeknopen, zodat de patholoog een duidelijk beeld krijgt van het gehele resectiestuk. Men plaatst alle weefselsneden in cassettes, dewelke duidelijk genummerd zijn. Vervolgens worden de cassettes terug in formol geplaatst. De cassettes kunnen verschillende kleuren hebben naargelang het staal bv. voor Helicobacter pylori (HP’s) (Dit zijn micro-organismen die o.a. Maagontsteking veroorzaken. Met d.m.v. antilichaam gemedieerde immuunhistochemische testen kan men deze bacterie opsporen in een maagbiopt. (Maag Lever Darm stichting, z.d.)): geel, bijsneden: roze, dringende stalen: blauwe, snederanden die anders moeten worden aangesneden worden: oker, 2.1.4. Doorvoeren Dit gebeurt d.m.v. het doorvoertoestel (tissue processor). Het toestel haalt het water uit de weefsels en vervangt dit door paraffine. Dit proces gebeurt stapsgewijs omdat de waterige fase in het weefsel niet mengbaar is met de apolaire fase van paraffine. Er wordt gebruik gemaakt van het schema A. zie bijlage 2 voor het oude toestel. Huidig doorvoertoestel Eerst moest er begrip verkregen worden van de twee huidige doorvoertoestellen. (Janssens, Toestellen: werkwijze en onderhoud: doorvoertoestel Thermo-Shandon, 2013) Merk/Nummer toestel: THERMO-SHANDON / Citadel 2000 Serie n° 5539180001 Serie n° 5539180002 De werkwijze en onderhoud van dit toestel is te vinden in bijlage 4. 3 Logos Microwave Hybrid Tissue processor Waarom moet de parameter veranderen? - - De huidige doorvoertoestellen zijn verouderd en er wordt een hogere capaciteit verwacht. De Logos maakt het mogelijk dat er maar één toestel i.p.v. twee nodig zijn. Het nieuwe toestel kan LEAN werken bevorderen. Dit houdt in dat er een continue workflow is. Er zullen twee runs, een versnelde dagrun en een nachtrun, uitgevoerd worden. Er zal vlugger een diagnose kunnen gesteld worden en in het labo zal er een gedaalde werkdruk zijn. Het toestel is makkelijker in onderhoud, er is ook minder contact van de producten met de laborant mits deze niet moeten in- en uitgegoten worden. Er wordt geen xyleen meer gebruikt in dit toestel en wordt door een minder schadelijke product vervangen genaamd ultra clear. Dit is een isoparaffine. Figuur 2: De Logos (Medical Expo, z.d.) Werkwijze en onderhoud Er wordt een werkwijze opgesteld zodat ieder persoon het toestel kan bedienen. Het onderhoud moet ook volgens richtlijnen verlopen, zodat er een vlotte routine kan aangehouden worden. (Janssens, Toestellen: werkwijze en onderhoud doorvoertoestel Logos, 2014) Toestel: Doorvoertoestel/ Logos Microwave Hybrid Tissue Processor Merk/Nummer toestel: Milestone / Serie n° 5506260003 4 Voorbereiding en benodigdheden Het toestel werkt met microwaves dus plaats er geen metalen voorwerpen in! Voorbereiding: Het toestel bestaat uit twee baden. Figuur 3: De 2 baden: links bad 1, rechts bad 2 met paraffine (Medical Expo, z.d.) Bad 1 wordt door een vacuümsysteem gevuld en leeggepompt met de verschillende reagentia. Figuur 4: Containerschuif (Medical Expo, z.d.) De containers bevinden zich in de schuif deze staan op een logische wijze geordend. 5 1 4 7 2 5 8 3 6 9 Bad 1: staat in verbinding met 9 containers van 5 liter. Deze containers staan op een vaste plaats onderaan in het toestel in een lade. Container 1: 5L Formol 4% Container 2: 5L Flush oplossing (60% alcohol/ 40% water) Container 3: 5L Ethanol 99,1% Container 4: 5L Ethanol 99,1% Container 5: 5L Isopropanol Container 6: 5L Isopropanol Container 7: 5L Ultra Clear Container 8: 5L Ethanol 99,1% Container 9: 5L (kraan)water Bad 2: vloeibare paraffine Bad 2 wordt met microwave en conventioneel verwarmd op 65°C, zodat de paraffine steeds in vloeibare toestand is. Benodigdheden: • Formaldehyde 4 % Klinipath (dit is gebufferde formaldehyde) • Ethanol 99,1% Klinipath • Isopropanol Klinipath • Ultra Clear Klinipath • (Kraan)water • Paraffinekorrels VWR • Het aantal biopsies worden bijgehouden in logboek van het toestel + schriftelijk in het logboek. • Lijst voor onderhoud + verversingslijst producten. • Handschoenen • Tissues Mogelijke programma’s: Nachtprogramma’s • • • Overnight 5mm fatty 1 layer Overnight 5mm fatty 2 layer Overnight 5mm fatty 3 layer Dagprogramma’s • • • UP TO 1mm 1 layer UP TO 3mm 1 layer UP TO 5mm 1 layer Het nieuwe toestel kan meerdere programma’s draaien o.a. de meeste gebruikte zie bijlage 2. Overnight zijn de langere programma’s. Fatty wilt zeggen dat deze lang genoeg worden doorgevoerd zodat het vetweefsel beter snijdt. Er zal geen test uitgevoerd worden wat het verschil is tussen fatty en een standaard overnight programma. De verschillende layers is afhankelijk van hoeveel cassettes er zijn. 1layer kan 70 cassettes dragen. 6 De programma’s kunnen vervolgens ofwel in ‘AUTOMATIC’ of ‘DUAL RUN’ mode worden geplaatst Automatisch is wanneer de paraffine van bad 2 naar bad 1 wordt gepompt. Dual run is wanneer het rek handmatig wordt overgeplaatst in bad 2. Dit moet binnen de 3 minuten gebeuren, zo niet, start het automatische programma. Hierna kan er voor ‘GO’ of ‘GO DELAY’ gekozen worden. Bij een overnachtprogramma is een uitgestelde start aangewezen. Men kan de eindtijd bepalen en de starttijd bekijken. Bij het automatische programma moet er achteraf steeds een ‘cleaning’ gebeuren alvorens een volgende run kan starten. 4.Werkwijze Log steeds in met de persoonlijke code! Wrijf steeds de randen van de baden proper! Om het vacuüm trekken van de vaten te voorkomen. • Start toestel: • Druk ‘USER icoontje’ (vrouw) Log in: druk code en druk ‘ENTER’ Druk rechtsonder op het icoontje wanneer de programma’s niet weergegeven zijn. - Kies het gewenste programma. - Vul het aantal cassettes in. Nachtrun: - Druk ‘INCLUDE’ fixation phase, (‘INCLUDE’ is standaard!). Druk ‘AUTOMATIC’. Druk ‘GO DELAY’. Stel de eindtijd in en druk ‘START RUN’ na controle van de parameters. • In het weekend pas zondag starten! - Druk ‘OK’ na het plaatsen van het rek en het sluiten van het bad. - Log uit druk ‘NACHTSCHERM icoontje’. Einde cyclus - - Druk ‘UNLOAD REAGENT’. - Wacht tot ‘EXTRACT THE RACK’ verschijnt. - Druk ‘EXTRACT THE RACK’. - Haal het rek eruit en sluit het deksel. - Druk ‘OK’ na controle van het paraffine niveau. - Druk ‘START CLEANING’. - Log uit, druk ‘NACHTSCHERM icoontje’. Einde cleaning - Druk ‘OK’. Druk ‘EXIT’ (het deurtje). Druk ‘HUIS icoontje’ Log uit druk ‘VROUW icoontje’ 7 • Dual run (versneld doorvoeren): - Druk ‘INCLUDE’ fixation phase, (‘INCLUDE’ is standaard!). - Druk ‘DUAL RUN’. - Druk ‘GO’. - Druk ‘START RUN’ na controle van de parameters. - Druk ‘OK’ na het plaatsen van het rek en het sluiten van het bad. - Log uit druk ‘ NACHTSCHERM icoontje’. Einde cyclus bad 1 - Druk ‘OK’. - Wacht enkele minuten. - Druk ‘OK’. - Haal het rek eruit en plaats dit in bad 2. Sluit beide baden. - Druk ‘OK’ om de wax cyclus te starten. - Log uit druk ‘NACHTSCHERM icoontje’. Verplaats het rek binnen 3minuten van bad 1 naar bad 2. Plaats een timer naast je ter herinnering! De eindtijd wordt aangegeven door het toestel. Einde wax cyclus - Druk ‘EXTRACT THE RACK’. - Druk ‘OK’ en controleer het paraffine niveau. - Haal het rek eruit en sluit het deksel. - Druk ‘EXIT’ (het deurtje). - Druk ‘HUIS icoontje’. - Log uit druk ‘VROUW icoontje’. 5.Onderhoud: 5.1 Dagelijks onderhoud: A. Producten: Controleer dagelijks de icoontjes van het toestel. Groen betekent dat alle producten bruikbaar zijn en een run mogelijk is. Oranje betekent dat er 1 of meer producten moeten vervangen worden na een van de volgende runs. Wanneer er een rood stopteken staat kan je geen nieuwe run starten. • • • • Kijk bij het menu bij ‘REAGENTS’ naar de reagentia die vervangen moeten worden. Druk ‘REPLACE REAGENT’ wanneer je op het icoontje staat v/h product dat vervangen moet worden. Druk ‘DONE’ wanneer de container is weggehaald. Plaats de juiste nieuwe container op de juiste plaats. Druk ‘DONE’. B. Paraffine: • • • Ga naar het menu ‘CLEANING’ en druk ‘WAX CLEANING’. Doe dit twee maal per week op maandag en woensdag na de dagrun. Controleer na elke run of het paraffine niveau nog steeds tussen de twee strepen valt in bad 2, vul anders bij. 8 5.2 Periodiek onderhoud: Wekelijks onderhoud Controleer de schuif met reagens op residueel vocht op de bodem. Maak de buitenkant van het toestel paraffine vrij. Figuur 5: Condensatievaten (Medical Expo, z.d.) De condensatievaten bevinden zich onder het voorpaneel van het toestel. Controleer de condensatie opvangbakjes dagelijks, dat deze niet over de aangeduide limiet komen. Dit d.m.v. het voorste paneel omhoog te draaien. Leeg de bakjes door deze los te draaien en uit te gieten in de correcte afvalcontainer. Vul de lijst voor onderhoud in. Maandelijks onderhoud Eenmaal per maand moet de paraffine ververst worden, hiervoor moet het voorste paneel alsook omhoog. • • • • • Bevestig de slang aan de kraan. Plaats een opvang container onder de slang. Open de kraan en laat het vat leeglopen. Sluit de kraan en haal de slang weg, kuis de slang met Ultra Clear. Sluit het paneel en vul het bad met +/- 4kg paraffine. Duid uitgevoerde acties aan op de lijst van onderhoud. Jaarlijks Onderhoud door firma (onderhoudscontract). 9 Principe Het doel van het toestel is om het water dat aanwezig is in het weefsel stapsgewijs te vervangen door paraffine, zodat van de biopten paraffineblokken kunnen gemaakt worden. Het bad met de weefselstalen vult en leegt zichzelf stap voor stap met solventen (formaldehyde, flush, ethanol, isopropanol, ultra clear) van de waterige fase tot de gesmolten paraffine. Er wordt simultaan gewerkt met conventionele verwarming en microwave. De techniek zorgt voor een sneller turn around time(TAT’s). De microwave zal er voor zorgen dat er geen xyleen meer moet gebruikt worden. Ultra clear vervangt deze stap. Het is aangetoond dat dit veiliger en gezonder is. Er werd door het laboratorium Pathologische Anatomie in Nijmegen (Afdeling Pathologie Nijmegen, 2010) ook een studie uitgevoerd. Deze bewijst dat xyleen kan vervangen worden door ultra clear. Er worden twee runs per dag uitgevoerd één versnelde run overdag en een tweede nachtrun. In meerdere artikels wordt bewezen dat doorvoeren met microwaves geen invloed heeft op de kwaliteit van de weefselstalen en de TAT’s verkleind worden. (Joris P. Bulte, et al., 2012) (Amanda Bond, 2013) (Richard J. Zarbo, et al., z.d.) (Hafajee Z.A., 2004) (Marales A.R., 2004) Er werden testen uitgevoerd om het effect van microwave doorvoeren op vriescoupes te bekijken. (W & Erichsen, 1991) De verspreiding Het toestel is nog maar enkele jaren op de markt. In Nederland zijn er al veel bedrijven, ziekenhuizen die dit toestel gebruiken. In België zijn er nog maar enkele te vinden o.a. in het laboratorium Pathologische Anatomie Ieper. Voor- en nadelen Een van de grote voordelen was dat dit toestel specifiek gemaakt is om een versnelde dagrun uit te voeren. Een ander voordeel is dat er in de toekomst een systeem op de markt zal komen dat de weefsels automatisch als paraffineblok uit het toestel laten komen. Dit bespaard veel tijd, de coupes kunnen sneller gesneden worden en zo komen de stalen veel sneller bij de PA terecht. Het toestel bevat de capaciteit van 210 stalen per run dit maakt het mogelijk met 1 toestel te werken i.p.v. twee Citadels van elk 100 blokken. Vergelijking Er werden in totaal drie toestellen bekeken enerzijds de Logos van Klinipath en anderzijds de VIP van Sakura en de Excelsior van Thermo Fisher. De toestellen werden vergeleken op hun functie, kostprijs, service na service, toekomst, kwaliteit, Er kan besloten worden dat de functie van de twee andere toestellen vooral is gefocust op nachtrun. 10 Histosmate Er moest ook een werkwijze en onderhoud uitgeschreven worden voor het toestel dat de paraffine van de rekken haalt. (Janssens, Toestellen: werkwijze en onderhoud Histosmate, 2014) Toestel: HistosMATE Merk/Nummer toestel: MILESTONE/ Serie n° 5506260002 1.Toepassingsgebied Het doel van het toestel is om de paraffine op te lossen van cassetterekken, pincetten en mallen, zodat deze opnieuw kunnen worden gebruikt. 2.Principe In het toestel wordt de Ultra Clear continu geroerd en verwarmd op 60°C gedurende de 7min van de cyclus. 3.Voorbereiding en benodigdheden Het toestel omvat één groot bad met een Max. volume van 10L. Het bad is steeds gevuld met 10L Ultra Clear. Een lege container wordt gebruikt om de afval Ultra Clear op te vangen bij het verversen. 4.Werkwijze • • • Het toestel wordt opgestart door de ‘groene knop’ links te drukken. Kijk nu naar het Touch screen. ‘s Morgens: Druk ‘START HEATING’ • • Plaats het rek of het mandje op de houder en laat deze weer dalen. Druk ‘START CYCLE’ • Einde: druk ‘OK’ Haal het rek of mandje eruit en maak het proper of laat het uitdruppen op de opvanghouder naast het toestel. • • Na laatste cyclus: Druk ‘STOP HEATING’ In weekend: Schakel het toestel uit met de ‘groene knop’ links. 5.Onderhoud: 5.1 Onderhoud na 12 cycli: • • • • • • Zet het toestel uit en open het luik onderaan het toestel door te drukken op ‘PUSH’. Sluit de slang aan op de kraan en neem een lege container. Open de kraan en laat de vloeistof in de lege container lopen. Sluit de kraan en haal de slang eraf. Sluit het luik. Vul het bad met nieuwe Ultra Clear 10L, (volledige container ingieten). 11 5.2 Periodiek onderhoud: Driemaandelijks onderhoud Reiniging het toestel uitwending. Jaarlijks Onderhoud door firma (onderhoudscontract). 2.1.5. Uitbedden Nadat het staal is doorgevoerd in paraffine, moet dit worden uitgebed in een paraffine blok. De cassette wordt geopend en de gewenste mal wordt gevuld met paraffine en het staal wordt geplaatst in de vorm. Het is uiterst belangrijk dat de stalen correct georiënteerd worden en goed worden aangedrukt. Vervolgens wordt de cassette met de onderkant, zonder het deksel, op de vorm geplaatst en gevuld met paraffine zodat deze goed aan elkaar hangen. Deze worden op een koude plaat van +/- -14°C geplaatst zodat de paraffine vlug stolt. Tenslotte worden de blokken ontvormd en vervolgens op nummer gestockeerd. 2.1.6. Snijden van coupes De blokken worden aangesneden met een microtoom. Eerst wordt er getrimd zodat het gehele oppervlak van het weefsel is aangesneden. Na het trimmen wordt de dikte aangepast naar 0,5-0,4µm. Twee of meer coupes naargelang de vorm, worden opgevangen op een draagglaasje, onmiddellijk gevolgd door druppels water. Het glaasje wordt zo op een warmteplaat gelegd zodat de coupes kunnen strekken. De coupes moeten zo egaal mogelijk zijn. Wanneer de coupes gestrekt zijn wordt het water weg gedept met papier, zodat de coupe blijven strekken en niet vervormen en hechten aan het glaasje. 2.1.7. Kleurtoestel De coupes worden eerst gedurende een half uur in de broedstoof geplaatst om de paraffine te laten verdampen zodat de weefsels zich vasthechten aan het glaasje. De glaasjes worden vervolgens in rekjes geplaatst en in het kleurtoestel geplaatst. Het programma ‘biopsie’ wordt ingesteld en wordt gestart. Bakje 17 tot 19 zijn was stappen om de eosine die niet opgenomen is te ontkleuren. 12 Tabel 1: Kleurprogramma ‘biopsie’ Bakje in toestel S* 1 2 3 4 WASH* 5 WASH* 6 WASH* 20 WASH* 19 18 17 End* Reagentia Start Xyleen Xyleen Ethanol (deparaffineren) Ethanol (deparaffineren) Kraanwater Hematoxyline Gill III Kraanwater Methanol zuur Kraanwater Eosine Kraanwater Ethanol (eosine) Ethanol (eosine) Ethanol (eosine) Tissue Clear Tijd 05’00” 05’00” 03’00” 03’00” 01’00” 01’40” 02’30” 00’05” 03’00” 02’30” 00’15” 01’00” 01’00” 01’00” Het kleurproces duurt een half uur. De coupes worden d.m.v. een draagarm verplaatst van bakje naar bakje volgens bovenstaande volgorde. 2.1.8. Coupes monteren en labelen De coupes worden afgedekt door een dekglaasje dat d.m.v. het kleeftoestel wordt gemonteerd. Nadien worden ze gelabeld met stickertjes voorzien van een biopsienummer en verdeeld onder de aangegeven pathologen. 2.1.9. Patholoog Anatoom (PA) De PA beoordeelt de coupes door microscopisch onderzoek en tracht zo, rekening houdend met het macroscopische onderzoek, tot een diagnose te komen. Hiervan wordt een verslag opgesteld en doorgegeven aan de aanvragende arts. Er kan na microscopisch onderzoek een diepere coupe aangevraagd worden. Dit wil zeggen dat de laboranten extra trimmen en dan terug coupes snijden. Dit kan om eventueel meer duidelijkheid te scheppen in de histologische analyse. Er kunnen ook speciale kleuringen en immunologische histochemische kleuringen aangevraagd worden. 13 2.1.10. Weefsels Figuur 6: Grafiek van de meest frequente tumoren per geslacht, België 2011 (Stichting kankerregister, 2011) De voornaamste tumoren die terug worden gevonden zijn: borsttumoren bij vrouwen, prostaattumoren bij mannen. Het is van belang dat de diagnose vlug kan worden gesteld en er een behandeling kan beginnen. De organen in Figuur 6 zijn de meest voorkomende organen in het labo. Er worden zowel biopten, zoals puncties binnengebracht, maar ook partiële en totale resectie stukken. Borsttumoren Borstkanker is de meest voorkomende kanker, deze komt voornamelijk voor bij vrouwen maar mannen kunnen dit ook krijgen. De stalen die binnen worden gebracht zijn: puncties, partiële/totale mastectomie, klierevidement, sentinelklier. Klierevidement zijn de okselklieren, deze staan rechtstreeks in verbinding met de borst. Een sentinelklier is de eerste lymfeklier beginnende van de borst, die opgespoord worden met een laag radioactieve stof. (Stichting Tegen Kanker, 2013) Prostaattumoren Prostaatkanker is een ouderdomsziekte bij mannen. De gemiddelde leeftijd is negenenzestig wanneer dit wordt vastgesteld. (Stichting Tegen Kanker, 2013) De stalen die binnen worden gebracht zijn: prostaatpuncties, prostaat TUR, prostatectomie. Deze worden routine H&E gekleurd en bekeken. Soms worden hierop ook IHC aangevraagd. Darmtumoren Er kan zowel dikke darm (colon/rectum) kanker voorkomen als dunne darm (duodenum/jejunum) kanker. Colonkanker komt voornamelijk voor. De stalen die binnen worden gebracht: duodenumbiopsie, colonbiopten, darmresectie. Duodenumbiopsie komen meestal samen met maagbiopten binnen. Deze zijn bij gastroscopie genomen en colonbiopsie bij coloscopie. (Stichting Tegen Kanker, 2014) (mlds, z.d.) (Darmkanker, 2011) 14 2.2. Immunologische Histochemische (IHC-) kleuringen IHC- kleuringen zijn antilichamen met een kleur of een fluorescerend substraat aan gebonden (labpon, 2013). IHC- kleuringen worden standaard uitgevoerd voor maagbiopten waarbij de aanvragende dokter een HP-kleuring aanvraagt, alsook voor Barrett (Een ziekte waarbij de slokdarmwand een andere slijmvlieslaag heeft, deze gelijkt op het maag /dunne darm slijmvlies. Barrett ontstaat door langdurige blootstelling aan maagzuur door reflux (AstraZeneca, 2014)) (erasmusmc, z.d.) Op een sentinelklier weefselblok zal er standaard meerdere IHC op uitgevoerd worden. IHCkleuringen worden door de PA aangevraagd om geïsoleerde tumorcellen op te sporen. Er kunnen meerdere IHC uitgevoerd worden in bijlage 3 bevindt zich een lijst met de gebruikte antilichamen. 2.3. Speciale kleuringen Sommige weefsels worden met een histochemische kleuring aangekleurd zodat er bepaalde eigenschappen beter worden weergegeven. Er worden zes verschillende kleuringen uitgevoerd in het labo. (erasmusmc, z.d.) • • • • • • Congorood (Bio Optica milano s.p.a., 2010): kleurt amyloïde rood, nuclei blauw PAS-Amylase (Bio Optica milano s.p.a., 2010): PAS positieve deeltjes: koolhydraten kleuren dieprood: magenta rood, nuclei blauw. Perls (Bio Optica milano s.p.a., 2010): kleurt reactief Fe3+ blauw, nuclei rood. Van Gieson (Bio Optica milano s.p.a., 2009): collageenvezels paarsrood; nuclei zwart; cytoplasma, gladde spierweefsels, verhoornd epitheel, erytrocyten geel. Ziehl – Neelsen (Bio Optica milano s.p.a., 2011): kleurt (pathogene) mycobacteriën zoals Koch’s bacillus rood. Zilverkleuring/ reticuline kleuring (Bio Optica milano s.p.a., 2013): kleurt reticuline vezels aan in bindweefsel en collageen vezels van bindweefsel. Kleurt collageen vezels geel, bindweefsel bruin en reticuline en zenuwvezels zwart. 2.4. Macroscopische beoordeling / Vriescoupes Wanneer een staal voor peroperatoir onderzoek wordt ingestuurd bv. een borst, sentinel, zal dit macroscopisch beoordeeld worden en het resultaat wordt doorgegeven aan de chirurg. Het beoordelen van de snederanden o.a. van belang bij een tumor zodat men zeker is dat er geen tumor weefsel is achtergebleven in de patiënt anders zal de chirurg een extra weefselstuk moeten wegnemen. Bij een vriescoupe zal het weefsel snel ingevroren worden i.p.v. te fixeren. Met de vriesmicrotoom zal een coupe worden gemaakt en deze coupe zal manueel gekleurd worden. Deze methode levert een snelle H&E coupe op met inboeten aan kwaliteit. Nadien zal het weefsel alsnog gefixeerd worden in formol en verwerkt worden in een paraffine blok. Zodanig kan er een definitieve coupe gemaakt worden en vervolgens wordt de normale H&E-kleuring uitgevoerd. Op deze manier kan het weefsel ook lang bewaard worden. (Labpon, 2013) 15 2.5. Interview laboratorium Pathologische Anatomie Ieper Om het toestel te valideren werden er enkele vragen gesteld aan een ander laboratorium dat werkt met hetzelfde toestel. I.v.m. voorgevallen problemen, oplossingen en algemene informatie. Dit kan helpen bij de validatie om problemen te voorkomen, begrijpen en oplossen. Het laboratorium in Ieper heeft vastgesteld dat borstpuncties beter in een nachtrun worden geplaatst zodat deze optimaal gefixeerd zijn voor de moleculaire SISH test. Zij hadden ook enkele probleem met de software, die verholpen zijn . Er werd een vervangtoestel aangeboden zodat zij geen vertragingen ondervonden. I. • II. • • • III. • IV. • V. • VI. • VII. • VIII. Vanaf welke datum gebruikt u al de Logos? Startdatum: 20/06/2012 Hoe gebruikt u het toestel? - een korte run van 1mm, 3mm en/of 5mm? En voor welke weefsels? - een lange (nacht)run? En voor welke weefsels? Een korte run van 1mm tot 3mm voor colon/maag, huidje, galblaas, appendix, amandelen, nierpuncties, leverpuncties kleinere weefsels zonder veel vet. Een lange run voor borstpuncties, alle andere weefsels. Vetweefsel wordt eerst een nacht in aceton geplaatst en dan terug in formol om 's avonds te laten meegaan. Het belangrijkste is om je weefsel zo dun mogelijk te versnijden, zo kan je bepaalde weefsels sneller verwerken in je korte run. Gebruikt u enkel Logos of wordt er nog een ander toestel gebruikt? Enkel de Logos wordt gebruikt. Wij hebben wel een oude carrousel als back-up staan. Hebben jullie al problemen ondervonden met het snijden van coupes? Zo ja welke problemen en hoe werden deze opgelost? Kwamen de problemen voor bij de korte run, lange (nacht)run of beide? Er waren vooral problemen met vetweefsel, zoals bij huidjes die te veel vet hebben. Deze worden in een lange run verwerkt (alsook de acetonstap en dun versnijden). Hebben jullie al problemen ondervonden met de H&E kleuring? Zo ja welke problemen en hoe werden deze opgelost? Kwamen de problemen voor bij de korte run, lange (nacht)run of beide? Er waren geen problemen met de H&E kleuring. Hebben jullie al problemen ondervonden met de IHC kleuring? Zo ja welke problemen en hoe werden deze opgelost? Kwamen de problemen voor bij de korte run, lange (nacht)run of beide? Er waren geen problemen met de IHC kleuring. Hebben jullie al problemen ondervonden met de moleculaire pathologie? Zo ja welke problemen en hoe werden deze opgelost? Kwamen de problemen voor bij de korte run, lange (nacht)run of beide? Voor de SISH werden vooral problemen bij de borstpuncties ondervonden, daarom is een lange run nodig voor optimale fixatie. Punctie in formol voor 6 à 48/72 uur. Zeker niet in een korte run tussen mousses verwerken( geeft slecht signaal). Hebben jullie al technische problemen gehad? Zo ja welke problemen en hoe werden deze opgelost? 16 • De leidingen waren verstopt door klein stukjes papier van celblokken, ’s anderendaags kwam de technieker al langs. Er was ook nog een probleem met de pc van het toestel, hier konden wij niets aan doen we kregen een vervangtoestel. 17 3. Materiaal en methode Het toestel moet gevalideerd worden en dit gebeurt a.d.h.v. een SOP voor de validatie. Deze zal moeten opgesteld worden mits deze nog niet bestaat. 3.1. Validatie SOP Er moet allereerst een duidelijk validatie SOP worden opgesteld voor er een validatie kan gebeuren. Doelstelling/principe : Wanneer in een procedure een parameter verandert die een invloed kan hebben op het resultaat moet er eerst voor ingebruikname een validatie gebeuren. De verschillende validatiestappen moeten uitgevoerd worden, alsook de controles hierop. Na het volledige validatierapport en mits goedkeuring van het Medisch Diensthoofd mag deze parameter gewijzigd en uitgevoerd worden in de routine. Deze vrijgave, zal de PA de zekerheid geven dat een verandering van een welbepaalde parameter geen invloed zal hebben op resultaat. Toepassingsgebied : Deze procedure is van toepassing op alle parameters die een invloed kunnen hebben op het resultaat van een staal. Het invoeren van een nieuw toestel, een nieuw product maar ook voor voor een nieuwe werkwijze waar er een kans bestaat dat dit een invloed kan hebben op het resultaat. Verantwoordelijkheden: Het medische diensthoofd en de leidinggevende zijn verantwoordelijk voor de beslissing om een nieuwe methode, kleuring, antilichaam of apparaat te valideren. Het personeelslid die in opdracht v/d leidinggevende de validatietest uitvoert is verantwoordelijk voor de juiste uitvoering en het registreren van de bevindingen. De leidinggevende is verantwoordelijk voor het beoordelen v/d validatieresultaten (samen met een PA) en het opstellen v/h validatierapport. Aan de hand v/d conclusies i/h validatierapport wordt besloten of het nieuwe apparaat/de nieuwe methode in gebruik wordt genomen. De kwaliteitscoördinator is verantwoordelijk voor het archiveren v/h validatierapport. Benodigdheden : Validatieplan • • • • • • Evaluatieformulieren (afhankelijk de soort validatie zijn er verschillende documenten.) Validatierapport waarin volgende aspecten beschreven worden: Titel, uitvoerder validatietest, betrokken leidinggevende, betrokken SOP, doel van de validatie. Beschrijving van de test en de condities waaronder de test plaatsvindt. Documentatie. Resultaat test, reproduceerbaarheid, resultaat huidige methode, vergelijking met huidige methode. 18 • • Veiligheidsaspecten. Beoordeling en conclusie. Werkwijze : Wanneer er beslist wordt om een nieuwe parameter in te voeren, zal er een studie worden gevoerd. Er wordt een duidelijk rapport opgesteld met volgende vragen: • • Waarom moet de parameter veranderen? o Voldoet deze parameter niet meer aan de eisen? o Is het toestel stuk en wordt dit vervangen? o Is er een andere product dat veiliger en beter is voor gebruik? Zijn er meerdere bedrijven met deze parameter? o Dewelke parameter voldoet aan de eisen van de functie of zijn er meerdere? o Is deze parameter prijs/kwaliteit verhouding goed? Wanneer de keuze gemaakt is wat de nieuwe parameter is moet er een validatie plan op gesteld worden. • • • • • • Hoe lang zal de validatie duren? Welke fases zullen er plaatsvinden in de validatie? Welke soorten controles zullen er worden uitgevoerd? Hoeveel stalen zullen er vergeleken worden, welk weefsel zal gebruikt worden en hoeveel? Zal er een positieve en/of negatieve controle worden ingebracht? Validatie van apparatuur: IQ fase = Installation Qualification Deze fase wordt meestal uitgevoerd door het bedrijf. Het toestel wordt geïnstalleerd. Er zal getest worden of het toestel in alle technische aspecten werkt. OQ fase = Operation Qualification Er zal in deze fase getest worden of het toestel functioneert naar behoren. Er wordt getest of het toestel bij de juiste instellingen, de correct procedures uitvoert. De alarmfuncties worden getest of deze op de correcte manier reageren wanneer ze moeten reageren. PQ fase = Product Qualification Dit onderdeel bestaat uit meerdere fases. Er wordt gecontroleerd of het toestel functioneert naar de gestelde eisen. Dit deel wordt door het labo getest en beoordeeld. Fase 1 Er moet getest worden of de procedure werkt met de nieuwe parameter namelijk het nieuwe toestel. De test wordt uitgevoerd met reeds afgewerkte stalen. Enkel de procedure wordt bekeken. Het resultaat wordt door 2 PA beoordeeld en goedgekeurd door het Medische Diensthoofd alvorens fase 2 kan gestart worden. 19 Fase 2 Er zal in tweevoud gewerkt worden. Enerzijds het oorspronkelijke toestel, anderzijds het nieuwe. Heel de procedure moet exact hetzelfde blijven. Deze procedure is de normale routine procedure. Er zal een vooraf bepaald aantal stalen worden getest. Deze fase zal door 2 PA blind gescoord worden. Na goedkeuring van het Medische Diensthoofd zal fase 3 kunnen gestart worden. Fase 3 In deze fase zal men naast de routine procedure, die enkel nog op het nieuwe toestel verloopt, ook andere procedures beoordelen waarop het toestel invloed heeft en dit in tweevoud. Ook hier moet een vooraf bepaald aantal stalen worden getest. Deze fase kan langer duren mits niet alle procedures dagelijks worden uitgevoerd. Opnieuw zullen 2 PA moeten scoren. Deze fase eindigt met de goedkeuring van het Medische Diensthoofd. Het nieuwe apparaat kan volledig in gebruik worden genomen. Validatie van methoden: Met een methodevalidatie wordt aangetoond dat de methode geschikt is voor de beoogde toepassing, dat ze voldoet aan de eisen die er met betrekking tot de toepassing aangesteld worden. Indien er wordt gebruik gemaakt van een methode volgens het voorschrift van de fabrikant volstaat een implementatievalidatie. Voor een implementatievalidatie worden een vooropgesteld aantal stalen getest. Er wordt gekeken naar reproduceerbaarheid en de juistheid van een resultaat. Hiervoor kan men steunen op de specificaties opgegeven door de fabrikant, maar ook op meer objectieve criteria uit de literatuur/studies. Alle gegevens en resultaten worden verwerkt in een validatiedossier. Indien wordt afgeweken van de voorschriften opgelegd door de fabrikant of methoden uit de literatuur is een volledige validatie noodzakelijk en een validatierapport moet worden opgesteld. Indien uit de conclusie blijkt dat niet wordt voldaan aan de gestelde specificaties, dan moet er argumentatie toegevoegd worden waarom deze methode toch zal gebruikt worden. 20 3.2. Validatieplan Volgens de SOP van de validatie 3.2.1. Installation Qualification (IQ) Dit werd opgesteld en uitgevoerd door de firma Klinipath. Zie bijlage 5 3.2.2. Operating Qualification (OQ) Dit werd opgesteld en uitgevoerd door de firma Klinipath. Zie bijlage 5 3.2.3. Product Qualification (PQ) Dit werd deels opgesteld en uitgevoerd door de firma Klinipath. Zie bijlage 5 De validatie zal duren tot alle fases zijn afgewerkt en goedgekeurd. Er zal in tweevoud gewerkt worden. Enerzijds cassettes in het citadel toestel en anderzijds cassettes in de logos. Er zullen weefselblokken, van alle gangbare en kritische weefsels, in tweevoud genomen en beoordeeld worden, tot de bevestiging dat de resultaten van gelijkwaardige kwaliteit zijn. Dit geldt voor zowel de H&E-kleuring, IHC-kleuring als de moleculaire testen. De moleculaire testen zullen gevalideerd worden door het UZA en Augustinus omdat de testen daar worden uitgevoerd. De 3 fases zijn de volgende: I. II. III. I. II. III. IV. V. VI. I. II. III. IV. V. VI. Fase 1 Conventioneel doorvoeren van diverse weefsels met THERMO-SHANDON Citadel(referentie). Conventioneel doorvoeren van overgefixeerde diverse weefsels met LOGOS. Vergelijken van morfologie, aankleuring van contrast van H&E-kleuring. Fase 2 Conventioneel doorvoeren van diverse weefsels met THERMO-SHANDON Citadel(referentie). Conventioneel/microwave doorvoeren en diverse weefsels met LOGOS. Vergelijken van morfologie, aankleuring van contrast van H&E-kleuring. Vergelijken van aankleuring in diverse IHC-kleuringen van een selectie van weefsels. Vergelijken van aankleuring in diverse histochemische kleuringen van een selectie van weefsels. Vergelijken van eindresultaat in Moleculaire testen van weefsels. Fase 3 Conventioneel doorvoeren van diverse kleine weefsels met THERMO-SHANDON Citadel(referentie). Microwave versneld doorvoeren van diverse kleine weefsels met LOGOS. Vergelijken van morfologie, aankleuring en contrast van H&E-kleuring. Vergelijken van aankleuring in diverse IHC- kleuringen van een selectie van weefsels. Vergelijken van aankleuring in diverse histochemische kleuringen van een selectie van weefsels. Vergelijken van eindresultaat in Moleculaire testen van weefsels. 21 3.3. Validatie 3.3.1. Klinipath Er werd uitleg door Klinipath gegeven over het doorvoertoestel en de manier waarop de validatie het best aangepakt kan worden. De gebruikte producten zijn van Klinipath, deze zijn door strenge zuiverheidstesten uitgekozen. Het is bv. belangrijk dat het product niet als eerste of laatste uit een verdeeltank van +/- 1000l wordt gehaald. In dit deel zijn er geen oppervlakte- of bodem vervuilingen aanwezig. Dit helpt de vuilafzetting in de slangen, te verminderen. Er zal ethanol worden gebruikt i.p.v. methanol mits deze zuiverder is. Isopropanol zal ook gebruikt worden. Voor de veiligheid van het labopersoneel zal er i.p.v. xyleen ultra clear (isoparaffine) gebruikt worden dit is een veiligere stof. De werking van het toestel werd uitgelegd en de favoriete programma’s en gebruikers werden geïnstalleerd. 3.3.2. Staalname Er werden stalen genomen van verschillende weefsels zodat er een duidelijke weergave is, of er algemene problemen voorkomen of deze specifiek zijn voor een bepaalde weefsel. Tabel 2: Weefselstalen Registratie Afname Staalname Soort weefsel nummer biopt bij de patiënt 14T237 27/1/’14 29/1/’14 Schildklierresectie Aantal In Fase cassettes doorvoertoestel geplaatst 3 4/2/’14 1 14B987 14B1029 14B1063 27/1/’14 29/1/’14 28/1/’14 30/1/’14 29/1/’14 30/1/’14 3 3 2 4/2/’14 4/2/’14 4/2/’14 1 1 1 14B1090 14T226 14B1120 14B1121 14B961 14T293 14T288 14B1240 14B1096 14B1253 14B1339 14T302 14B1311 14B1315 14B1404 14B1431 14B1430 14T317 14B1482 29/1/’14 27/1/’14 30/1/’14 30/1/’14 27/1/’14 31/1/’14 31/1/’14 3/2/’14 30/1/’14 3/2/’14 4/2/’14 3/2/’14 4/2/’14 3/2/’14 6/2/’14 6/2/’14 6/2/’14 4/2/’14 7/2/’14 2 2 2 2 2 2 3 2 3 5 5 2 2 2 2 10 8 4 2 4/2/’14 4/2/’14 5/2/’14 5/2/’14 5/2/’14 5/2/’14 5/2/’14 5/2/’14 5/2/’14 5/2/’14 5/2/’14 7/2/’14 7/2/’14 7/2/’14 7/2/’14 7/2/’14 7/2/’14 7/2/’14 10/2/’14 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 30/1/’14 30/1/’14 31/1/’14 31/1/’14 31/1/’14 3/2/’14 3/2/’14 3/2/’14 3/2/’14 5/2/’14 5/2/’14 6/2/’14 6/2/’14 7/2/’14 7/2/’14 7/2/’14 7/2/’14 7/2/’14 10/2/’14 Schildklierresectie Hysterectomie Mastectomie/tumorectomie+ okselklier(en) Ovaria (uterus) Darmresectie Mastectomie (R) Mastectomie (L) Darmresectie TUR prostaat Hysterectomie TUR prostaat Darmresectie Schildklierresectie Totale prostatectomie Maagresectie Hysterectomie Placenta TUR prostaat Hysterectomie Hysterectomie Darmresectie Prostatectomie 22 14B1474 14B1460 14B1550 14T377 14T378 14B1602 14B1657 14B1672 14B1668 14B1737 14B1750 14B1755 14B1773 14B1775 14B1776 14B1777 14B1778 14T418 14B1794 14B1779 14B1780 14B1781 14B1797 14T435 14T444 14B1809 14B1824 14B1841 14B1829 14B1830 14B1834 14B1827 14B1804 14B1793 14B1795 7/2/’14 7/2/’14 7/2/’14 7/2/’14 7/2/’14 11/2/’14 12/2/’14 13/2/’14 12/2/’14 14/2/’14 14/2/’14 14/2/’14 17/2/’14 17/2/’14 14/2/’14 14/2/’14 14/2/’14 13/2/’14 17/2/’14 14/2/’14 14/2/’14 17/2/’14 17/2/’14 17/2/’14 17/2/’14 17/2/’14 17/2/’14 17/2/’14 17/2/’14 17/2/’14 17/2/’14 17/2/’14 17/2/’14 17/2/’14 17/2/’14 10/2/’14 10/2/’14 11/2/’14 11/2/’14 11/2/’14 12/2/’14 13/2/’14 14/2/’14 14/2/’14 14/2/’14 17/2/’14 17/2/’14 17/2/’14 17/2/’14 17/2/’14 17/2/’14 17/2/’14 14/2/’14 17/2/’14 17/2/’14 17/2/’14 17/2/’14 18/2/’14 18/2/’14 18/2/’14 18/2/’14 18/2/’14 18/2/’14 18/2/’14 18/2/’14 18/2/’14 18/2/’14 18/2/’14 18/2/’14 18/2/’14 Hysterectomie Darmresectie Schildklier Mastectomie Ovarium(tumor) Nierresectie Mastectomie Longresectie Nierresectie Colontumor Huid Huid Borstpunctiebiopsie Maagbiopsie/duodenum Colonbiopsie Colonbiopsie Colonbiopsie Pancreastumor Huid Mondbiopsie Huid Vasectomie Colonbiopsie Colonbiopsie Colonbiopsie Colonbiopsie Borstpunctiebiopsie Maag+ HP Colonbiopsie Colonbiopsie Colonbiopsie Huid + VC Testisresectie Klierevidement Huid + VC 14B1797 14B1840 14T456 14T453 14B1795 17/2/’14 17/2/’14 18/2/’14 18/2/’14 17/2/’14 18/2/’14 18/2/’14 18/2/’14 18/2/’14 18/2/’14 Colonbiopsie Bijnierresectie Vasectomie Prostaatpunctiebiopsie Huid + VC 14B1848 14B1853 14B1874 14B1878 14B1881 14B1882 14B1884 14T457 14T447 18/2/’14 18/2/’14 18/2/’14 18/2/’14 18/2/’14 / 18/2/’14 18/2/’14 18/2/’14 19/2/’14 19/2/’14 19/2/’14 19/2/’14 19/2/’14 19/2/’14 19/2/’14 19/2/’14 19/2/’14 Vulvabiopsie Endometrium/curettage Sinuscomplex/poliepen Peescyste Maag+ HP Colonbiopsie Maag + HP Darmresectie Mastectomie 4 4 P+3 P+8 1 P P P P P 1 3 1 2 2 1 1 P 2 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1 2 1 P 1 1 (+1dag) 1 1 1 2 1 (+1 nacht) 1 1 1 1 1 2 1 P P 10/2/’14 10/2/’14 11/2/’14 11/2/’14 11/2/’14 12/2/’14 13/2/’14 14/2/’14 14/2/’14 14/2/’14 17/2/’14 17/2/’14 17/2/’14 17/2/’14 17/2/’14 17/2/’14 17/2/’14 17/2/’14 18/2/’14 18/2/’14 18/2/’14 18/2/’14 18/2/’14 18/2/’14 18/2/’14 18/2/’14 18/2/’14 18/2/’14 18/2/’14 18/2/’14 18/2/’14 18/2/’14 18/2/’14 18/2/’14 18/2/’14 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2 2 2 18/2/’14 18/2/’14 19/2/’14 19/2/’14 19/2/’14 2 2 3 3 3 19/2/’14 19/2/’14 19/2/’14 19/2/’14 19/2/’14 19/2/’14 19/2/’14 19/2/’14 19/2/’14 3 3 3 3 3 3 3 2 2 23 14B1842 14B1858 14B1930 14B1933 14B1936 14B1938 14B1941 14B1942 14B1943 14B1944 14B1946 14B1948 14B2093 14B2094 18/2/’14 18/2/’14 19/2/’14 20/2/’14 19/2/’14 19/2/’14 19/2/’14 19/2/’14 19/2/’14 19/2/’14 19/2/’14 19/2/’14 24/2/’14 24/2/’14 19/2/’14 19/2/’14 20/2/’14 20/2/’14 20/2/’14 20/2/’14 20/2/’14 20/2/’14 20/2/’14 20/2/’14 20/2/’14 20/2/’14 24/2/’14 24/2/’14 Mastectomie Endometrium carcinoom Mastectomie Borstpunctiebiopsie Maag + HP Colonbiopsie Lipbiopsie Maag + HP Huid Maag + HP Maagbiopsie/ slokdarm Maagbiopsie borstpunctiebiopsie borstpunctiebiopsie P P P+3 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 19/2/’14 19/2/’14 20/2/’14 20/2/’14 20/2/’14 20/2/’14 20/2/’14 20/2/’14 20/2/’14 20/2/’14 20/2/’14 20/2/’14 24/2/’14 24/2/’14 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2 2 24 4. Resultaten 4.1. Routine De routine procedure werd van registratie tot afleveren aan de PA uitgelegd en aangeleerd. Er werd bij onderstaande figuren gebruikt gemaakt van het citadel doorvoertoestel. Er werden afbeeldingen gemaakt van de gesneden coupes als bewijs dat deze correct zijn gesneden.( Figuren 7-11) De eerste dag werd er gewerkt met afgewerkte placenta stalen, dit weefsel snijdt vlot. Wanneer deze goed waren, werden er patiënten stalen versneden die alsook vlot snijden. Het is belangrijk dat het snijden goed gaat zodat er geen afwijking is met de andere laboranten. Figuur 7: Paraffineblok 1: gesneden van afgewerkt staal, placenta weefsel Figuur 8: Paraffineblok 1: gesneden van afgewerkt staal, placenta weefsel 25 Figuur 9: Paraffineblok 2: gesneden van afgewerkt staal, placenta weefsel Figuur 10: Patiënten staal: paraffineblok gesneden, synovium/gewrichtsweefsel Figuur 11: Patiënten staal: paraffineblok gesneden, huidweefsel 26 4.2. Validatie 4.2.1. Nachtrun Het toestel werd geplaatst en de volgende dag in de voormiddag (dag 1) gevalideerd voor de IQ en OQ fases door Klinipath. De eerste 15 stalen (overgefixeerd weefsel) werden op dag 1 in het toestel geplaatst onder begeleiding van de verantwoordelijke van Klinipath. Het programma was een overnight fatty 1 layer met een delay: het toestel begon om 18u en eindigde rond 8u. De 2de run werd op dag 2 uitgevoerd (15 stalen) met het overnight fatty 1 layer programma met een delay. Tijdens de delay hebben we extra cassettes toegevoegd (10 stalen). Hierdoor gaf het toestel een foutmelding, wat niet zou mogen. Het toestel was niet gestart dit werd ’s morgens op dag 3 duidelijk, na contact met de verantwoordelijke hebben we het programma afgebroken en werd het nachtprogramma zonder delay aangezet dit was rond 21u klaar de stalen bleven overnacht in de paraffine zitten. De oplossing is op dag 4 gevonden men moet eerst de cassettes bijvullen en nadien pas het aantal cassettes ingeven, zo komt er geen foutmelding meer. De 3de run werd het toestel aangezet op dag 4 met delay. De delay werd zo ingesteld dat deze op dag 7 om 9u30 klaar zou zijn, mits dit een weekend was. Het programma was overnight fatty 1 layer er gingen 30 cassettes in. In de 2de week werden er al een gedeelte van de stalen rechtstreeks in de Logos geplaatst zonder dubbele controle. In de 3de week werden alle grote stalen in de overnacht gestoken enkel een P- blok (dit is een weefselstaal van de tumor in een vers weefsel) en een borstpunctie werden nog dubbel genomen. Zodat de moleculaire testen nog kunnen gevalideerd worden. Er moet rekening gehouden worden dat het toestel ’s morgens om +/-7u30 klaar is zodat de laborant die om 7u54 begint zeker dan kan beginnen en eventueel vroeger kan starten met uitbedden. 4.2.2. Dagrun De 1ste dagrun werd aangezet op dag 12, dus de 2de week van de validatie. De dagrun werd na 5dagen validatie gestart voor de routinestalen. De tijden werden bijgehouden zodat er een uur kon vast gelegd worden, wanneer de dagrun ten laatste moet gestart worden. Er moet rekening gehouden worden met meerdere factoren: • • • • De tijd nodig om uit te bedden, snijden en kleuren. Het kleurtoestel moet worden uitgekuist ‘s avonds. De werkuren lopen van 8u24 tot 16u30 en er blijft altijd één iemand tot 18u. Er moet een Lean workflow zijn. 27 Tabel 3: Dagrun tijdsschema 17/2/’14 Cleaning 10u15 Opgestart 11u12 Overgeplaatst 13u25 Klaar 14u30 Uitgebed 15u Oven 15u35 Kleurtoestel 16u05 Patholoog 17u 18/2/’14 10u17 10u30 12u43 13u48 14u15 15u15 15u55 16u45 19/2/’14 9u59 10u40 12u53 13u57 14u30 15u05 15u45 16u30 20/2/’14 10u06 11u08 13u34 14u40 14u55 15u23 15u53 16u45 4.2.3. Fase 1 Er werden 41 coupes bekeken. Tabel 4: Bekeken weefsels in fase 1 Weefsel Schildklierresectie Mastectomie Hysterectomie Ovaria Darmresecties Prostaat TUR Prostaatresectie Aantal coupes beoordeeld 11 6 6 2 7 2 5 4.2.4. Fase 2 H&E- kleuring Er werden 57 coupes bekeken waarvan 53 beoordeeld werden. Tabel 5: Beoordeelde H&E-kleuring coupes in fase 2; S= Dr. Deprez, E= Dr. Beerens, H= Dr. Woestenborghs, A= Dr. De Pauw Registra Aantal Aantal tie blokken coupes nummer in Logos beoordeeld PA 1 14T 2 2 302 14B 2 1 1311 14B 2 2 1315 14B 2 2 1404 14B 10 10 1431 14B 8 8 1430 14T 4 4 317 Aantal coupes beoordeeld PA 2 2 PA 1 PA 2 Opmerking S E 1 A S 1 S E Zachtere kleur (maagwand) / donkerdere kernen (galblaas) Beter detail/ meer contrast / scherper beeld / blauwer Licht grijzer/blauwer / E / 10 A S Minder roze/ blauwer 8 A S 4 S E Scherpere morfologie/zachter beeld/ minder roze Licht grijzer/blauwer / minder roze 28 14B 1482 14B 1474 14B 1460 2 2 2 A S 4 4 / E / 4 4 3 S E 14B 1550 14T 377 14T 378 14B 1602 14B 1737 14B 1793 Totaal P+3 4 4 E S P+8 6 / E / 1 1 1 S E P 1 / E / P 1 1 S E 1 1 1 S H 57 53 45 Minder roze/ zachter beeld/ scherper Zachter Lymfeknopen vergelijkbaar Coloncarcinoom licht grijzer/blauwer Iets donkerder/ blauwer/grijzer Blauwer/paarser, grijze schijn (nl borstweefsel) Grijzer/ blauwer Tabel 6: Verschillende weefsels beoordeeld in fase 2 Weefsel Aantal coupes beoordeeld 1 8 2 2 2 6 1 1 23 2 1 4 Colontumor Darmresectie Maagresectie Prostaat TUR Prostatectomie Mastectomie Klierevidement Ovarium (tumor) Hysterectomie Placenta Nierresectie Schildklier Totaal 53 IHC- kleuring Er werden 60 IHC-kleuringen beoordeeld. Tabel 7: Beoordeelde IHC-kleuring coupes in fase 2; S= Dr. Deprez, E= Dr. Beerens, H= Dr. Woestenborghs, A= Dr. De Pauw Registratie nummer 14B1430/2 IHC-kleuring PA 1 PA 2 Opmerkingen Ker7 A E Weinig achtergrond 29 14B1550/P 14B1431/2 14T378/2 14B1672/P 14B1765/1 14B1765/2 14B1460/4 14B1315/2 14B1482/1 14T317 14B1858/P 14B1668/P PR ER A A E E Desmine Vimentin Thyroglobuline TTF1 ER PR Vimentin CD10 ER PR Ker7 P40 Ker7 TTF1 A A A A H H H H H H H A A A E E E E S S S S S S S S S S EGFR Ker34Be12 P504S P63 P504S CD3 CD20 Bcl2 Ki67 PLAP PSA Ker34Be12 P63 Ker20 Synapto Chromogranin A A H H H H S S S S S E E E E E E S S S S S E E E E E S S S S S S ER PR Ki67 P53 CD10 Melan A Vimentin Ker7 S S S S S S S S A A A A H H H H Matige, voldoende aankleuring bij Logos Weinig achtergrond bij beide Vergelijkbare resultaten “ “ “ “ “ “ Weinig achtergrond bij beide Licht verstoring morfologie bij Citadel Grotendeels niet te evalueren Vergelijkbaar “ “ “ “ Weinige achtergrond Vergelijkbaar “ “, matig, voldoende aankleuring “ Matig aankleuring stromaal compartiment (E), weinig achtergrond bij Logos Vergelijkbaar “ “ “ “ “ “ “ 30 14T447/P 14B1930/P 14B1842/P 14B2094 ER PR C-erbB-2 ER PR C-erbB-2 S S A A A E E E E E E E-Cadherine Ker5/6 Ker14 Ker17 P63 ER PR C-erbB-2 ER PR C-erbB-2 E-Cadherine A A A A A H H H E E E E E E E E E S S S H H H H Vergelijkbaar “ enkele cellen zwak membraan+ (E) Vergelijkbaar “ Kleuring neg. (interne controle positief) Vergelijkbaar “ “ “ “ Neg. In tumor 17 blokken 60 kleuringen Tabel 8: Verschillende beoordeelde IHC-kleuringen IHC-kleuring Ker7 PR ER Vimetin TTF1 C-erbB-2 P63 Ker5/6 Ker34Be12 CD10 P504S Ki67 E-Cadherine P40 EGFR CD3 CD20 Bcl2 Desmine Aantal getest 4 8 8 3 2 4 3 1 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 31 Thyroglobuline PLAP PSA Ker20 Synapto Chromogranin A P53 Melan A Ker14 Ker17 totaal 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 60 4.2.5. Fase 3 H&E- kleuringen Er werden 29 coupes bekeken waarvan 28 beoordeeld zijn. Tabel 9: Beoordeelde H&E-kleuring coupes in fase 3; S= Dr. Deprez, E= Dr. Beerens, H= Dr. Woestenborghs, A= Dr. De Pauw Registra Aantal Aantal tie blokken coupes nummer in Logos beoordeeld PA 1 14B 1 1 1750 14B 3 3 1755 14B 2 2 1775 14B 2 2 1776 14B 1 1 1777 14B 1 1 1778 14B 2 1 1794 14B 1 1 1779 14B 1 1 1780 14B 1 1 1781 14B 1 1 1797 14T 1 1 435 14T 1 1 Aantal coupes beoordeeld PA 2 1 PA 1 PA 2 Opmerking S A Zachter en rustiger beeld bij Logos 3 S A Kleurintensiteit iets harder 2 S A Iets minder contrast 2 S A Donkerder; meer contrast 1 S A Beter bij Logos minder wazig 1 S A donkerder 2 S E 1 S E 1 S E 1 S E 1 S E Donkerder: blauw/paars 1 S E Feller roze 1 S E blauwer 32 444 14B 1809 14B 1829 14B 1830 14B 1834 14B 1827 14T 456 14T 453 14B 1795 Totaal 2 2 2 S E 1 1 1 S H 1 1 1 S E 2 2 2 S E 1 1 1 S H 1 1 1 S H 2 1 1 S H 1 (+1 nacht) 1 1 S H 29 27 28 Feller roze / blauwer, minder roze, donkerder Rozer Tabel 10: Verschillende weefsels beoordeeld in fase 3 Weefsel Aantal coupes beoordeeld 13 2 2 1 1 9 Colonbiopsie Maagbiopsie Vasectomie Prostaatpunctie Mondbiopsie Huid Totaal 28 IHC- kleuringen 13 kleuringen werden er beoordeeld van weefselblokken uit de dagrun. Er werd nog een beoordeling op H&E-kleuring gegeven mits deze bij een HP hoort. Tabel 11: Beoordeelde IHC-kleuring coupes in fase 3; S= Dr. Deprez, E= Dr. Beerens, H= Dr. Woestenborghs, A= Dr. De Pauw Registratie nummer 14B1773 14B1824 14B1841 14T453 IHC-kleuring PA 1 PA 2 Opmerkingen ER PR S S H H C-erbB-2 P63 Ker5/6 HP P63 S S S S S / H H A A vergelijkbaar Matig, voldoende aankleuring Citadel, vergelijkbaar Iets sterker in Logos Geen aankleuring HP negatief Vergelijkbaar 33 14B1942/1 14B1944 14B1946 7 blokken Ker34Be12 P504S HP H&E HP HP 12 kleuringen S S S S A A A E E E “ “ geen aankleuring, neg. Citadel: maag/ logos: slokdarm HP + Tabel 12: Verschillende beoordeelde IHC-kleuringen IHC-kleuring PR ER C-erbB-2 P63 Ker5/6 Ker34Be12 P504S HP totaal Aantal getest 1 1 1 2 1 1 1 4 12 4.2.6. Producten Er werd een lijst van verbruik van de producten opgesteld zodat er een vast contract kan worden opgesteld i.v.m. de aankoop van producten. Hoeveel zal er besteld worden en om de hoeveel tijd. product bestelling februari rest totaal verbruik bestelling tussen totaal maart rest totaal 26/3/'14 verbruik isopropanol ethanol formol ultra clear klein 21 21 5 16 14 4 ultra clear groot 5 2 10 9 5 0 16 6 7 10 24 11 1 5 9 6 3 10 12 8 1 0 9 6 10 13 3 4 3 34 5. Bespreking 5.1. Toestel 5.1.1. Installation Qualification (IQ) De installatie is correct uitgevoerd en er werden geen problemen vastgesteld. 5.1.2. Operating Qualification (OQ) Het toestel functioneert naar behoren. 5.1.3. Product Qualification (PQ) Fase 1 Er werden 41 coupes van overgefixeerd weefsel bekeken. Er werden geen evaluatieformulieren ingevuld, omdat in deze fase beoordeeld werd of het inbed proces correct verloopt en of de coupes algemeen vergelijkbaar zijn. Er kon vastgesteld worden dat de Logos naar behoren werkt en fase 1 werd goedgekeurd door het medische diensthoofd. Fase 2 Er werden 57 H&E coupes bekeken waarvan 53 beoordeeld werden. Er kon vastgesteld worden dat er geen significante verschillen zijn op morfologisch vlak en contrast. Er was een klein globaal verschil in aankleuring. Er werden 60 IHC-kleuringen beoordeeld. Er werden geen significante verschillen waargenomen. Deze fase werd goedgekeurd voor de H&E- kleuringen en IHC- kleuringen door het medische diensthoofd. Fase 3 Fase 3 is het versneld doorvoeren van kleine weefsels in de dagrun: deze mogen een maximale dikte van 3mm hebben. Er werden 29 H&E coupes bekeken waarvan 28 beoordeeld zijn. Er waren geen significante verschillen te bemerken bij de morfologie en het contrast. Bij de aankleuring werd ook hier een globaal verschil in kleur waargenomen. 13 IHC- kleuringen werden er beoordeeld. Er werden geen significante verschillen waargenomen. Deze fase werd goedgekeurd voor de H&E- kleuringen en IHC- kleuringen door het medische diensthoofd. 5.1.4. Nachtrun De nachtrun zal gestart worden om 17u mits deze dan tegen 7u30 zeker klaar is, er kunnen eventueel nog cassettes worden toegevoegd voor het begin van de cyclus als deze dringend zijn. 5.1.5. Dagrun De dagrun zal standaard het programma ‘up to 3mm 1layer’ zijn. De dagrun moet gestart worden om 10u30, zo is er tijd om deze te vullen met cassettes en is deze in de namiddag klaar rond 14u. Het uitbedden en de dringende stalen snijden en kleuren is mogelijk voor 16u30. De andere stalen kunnen gesneden worden en gekleurd worden voor 17u à 17u30 afhankelijk van de drukte. 35 De laborant die begint om 10u zal het toestel meteen controleren en producten verversen indien nodig. Het is belangrijk dat de persoon de verversingslijst dagelijks invult, voor het kwaliteitssysteem. De persoon moet dan ook de producten in het oog houden zodat deze indien nodig ook na de dagrun ververst kunnen worden. De producten verbruikt in de maand februari zijn veel minder mits er nog niet de grote hoeveelheden stalen werden doorgevoerd en er in de beginfase nog geen dagrun werd uitgevoerd. De maand maart is een betere weergave van het verbruik. Er zal nog een optekening van de maand april nodig zijn, zodat er een correcter beeld kan geschetst worden voor de nodige bestellingen. Dit zal door het labo zelf nog gebeuren, daarom zijn deze gegevens niet aanwezig in dit eindwerk. 5.2. Uitbedden De weefsels bedden vlot uit. Het is enkel moeilijk voor de puncties en maagbiopten uit te bedden: deze zijn vaak doorzichtig/ melkachtig. Vroeger werden kleine biopten gekleurd door eosine toe te voegen in de formol. De gebufferde formol zal er voor zorgen dat de eosine niet kleurt. Vooraf eosine toevoegen is dus onnodig omdat de kleur er weer uit gaat. Er is momenteel een experiment bezig rond het toevoegen van eosine. Er zal eosine worden toegevoegd aan tank 4 ethanol. Te veel eosine zal een neerslag vormen en dit kan verstoppingen veroorzaken, daarom wordt er voor elke volumeverhoging contact opgenomen met Klinipath. Wanneer zij toestemming geven kunnen we het volume verhogen. Er werd al een lichte aankleuring bij 2 ml in een container van 5l vastgesteld, maar er is verschil in de eerste run met een nieuwe container en de laatste run. Hier kan eventueel nog op verder worden in gegaan om dit probleem op te lossen. 5.3. Snijden De paraffine van de coupes splitst wanneer deze niet lang genoeg gekoeld zijn. Hier is soms ook het probleem dat de puncties en maagbiopten niet aangekleurd zijn en het dus ook niet altijd zichtbaar is of het diep genoeg getrimd is. Te koud kan ook problemen geven. Er moet bij het versnijden zeer goed opgelet worden dat huidjes die in de dagrun gaan zeker niet te veel vet bevatten mits dit dan zeer moeilijk snijdt. Er werd opgemerkt dat de dagrun na het uitbedden best kan gekoeld worden op de koelplaat en de nachtrun zal gewoon in de diepvriezer worden geplaatst in bakjes. Door de wax cleaning tweemaal per week en de paraffine maandelijks te verversen is er een verbetering in de kwaliteit van de paraffine, hierdoor snijden de paraffineblokken beter. 5.4. Microscopisch De H&E-kleuring is meestal een beetje grijzer, blauwer en dus iets minder roze. De morfologie is scherper te zien en er is een iets zachter beeld. Het contrast is soms een beetje scherper. Bij de immunologische histochemische kleuringen (IHC) is er een vergelijkbaar resultaat globaal. Af en toe is er een weinige achtergrond te bemerken. 36 6. Besluit Het is een minder vermoeiend beeld voor de PA. Het lichte kleur verschil is te wijten aan de opname van de eosine in het weefsel, tijdens het kleurproces. Omdat de kleurintensiteit positief wordt ontvangen door de PA zal niets veranderd worden aan het kleurprogramma. Algemeen kunnen we besluiten dat de kwaliteit van de H&E-kleuring gelijkwaardig is aan het oude toestel. De IHC- kleuringen zijn algemeen vergelijkbaar van resultaten. De weinige achtergrond die af en toe op te merken is, is niet afhankelijk van de soort IHC- kleuring. De moleculaire testen zijn nog niet afgerond deze zijn nog steeds bezig. Er zullen nog steeds dubbele tumorblokken en borstpunctie blokken worden genomen waarvan enerzijds één in het oude toestel moet en één in de Logos. Het inwerken van een lean workflow heeft tijd nodig, maar door geleidelijk aan veranderingen door te voeren lukt het voor iedereen om zich aan te passen. 6.1. Validatie document Uitvoerders Kimberley Wuytack en Evy Janssens, Onder leiding van het Medische Diensthoofd Dr. S. Deprez. Begin validatie: 06/01/2014 Betrokken SOP’s: 6.4 Validatie; 6.4.1 evaluatieformulier H&E kleuring; 6.4.2 evaluatieformulier Immuno’s; 7.4.1.6 doorvoertoestel; 7.4.1.18 doorvoertoestel Logos; 7.4.1.19 Histosmate Doel van de validatie: Validatie van het doorvoertoestel Milestone Logos Microwave Hybrid Tissue Processor Beschrijving test in bijlage: aantal bijlage: 2 bijlage: 1 + 2 Documentatie in bijlage: aantal bijlage: 2 bijlage: 2 + 3 Resultaten in bijlage: aantal bijlage: 2 bijlage: 2 + 4 Bijlage 1: Validatie SOP Bijlage 2: Eindwerk Validatie Logos Kimberley Wuytack Bijlage 3: Artikels over de Logos Bijlage 4: Evaluatie formulieren Eventuele opm./ herhaling testen/ extra controles: Troubleshooting Er werden enkele problemen vastgesteld tijdens het valideren en het routine gebruik van Logos. Zoals vermeld, in het onderdeel Resultaten: 4.2. Onderzoek 4.2.1. Nachtrun, werd er vastgesteld dat de nachtrun, die we de avond er voor hadden gestart, niet was gestart. Er 37 had zich een foutmelding voor gedaan wanneer er cassettes werden toegevoegd. Er moet duidelijk opgelet worden dat men ‘add cassettes’ drukt en dan de cassettes plaatsen in het rek alvorens het aantal wordt ingegeven en weer wordt gestart met de cyclus. Er werd een fout in het systeem opgemerkt wanneer container 4 moest vervangen worden gaf het een rood bolletje aan maar de melding dat het product moest vervangen worden kwam op het icoontje van container 3. De paraffine gaf nooit aan dat deze volledig moest ververst worden. Dit komt omdat deze telkens zichzelf reset wanneer de paraffine cleaning wordt uitgevoerd. Dit werd opgelost door op een vaste datum maandelijks de paraffine te verversen. Het (kraan)water moest ook nooit ververst worden. Dit kwam omdat men de verkeerde selectie maakte bij de main cavity cleaning: dit moest gebeuren met isopropanol, ultra clear en water. De meeste weefsels moeten zeer koud zijn, sommige mogen dan weer niet te koud zijn. Weefsel met veel vet snijden zeer moeilijk. Hiervoor wordt een ander mesje gebruikt en een andere snijdikte als ze niet vlot snijden. Hardere weefsels hebben ook een ander mesje nodig en mogen niet te dik getrimd worden zodat het weefsel er niet uitspringt. De laboranten hadden het gevoel dat de weefselblokken uit Logos niet zo makkelijk sneden, dit was voornamelijk een psychische idee. Er werd namelijk een test uitgevoerd zonder het op de hoogte stellen van de laboranten. Deze wijst uit dat het weefsel ook goed kan gesneden worden. Er is een duidelijk verschil waarneembaar de tweede coupe is een vlakke gestrekte coupe waar meteen zichtbaar is welk weefsel dit is, voor de patholoog. Bij de eerste coupe is dit niet meteen zichtbaar. Figuur 12: Eerste H&E coupe 38 Figuur 13: Opnieuw aangevraagde H&E coupe Veiligheidsaspecten Ultra clear is minder schadelijk dan xyleen. Het verversen van producten gebeurd veilig er is bijna geen contact tussen producten en personeel. Er worden geen producten in- en uitgegoten, enkel de flush-oplossing moet aangemaakt worden maar zal na gebruik met container en al verwijderd worden. Conclusie Het toestel is goedgekeurd voor de H&E- kleuringen en IHC- kleuringen in de drie verschillende fasen. 39 Bibliografie Afdeling Pathologie Nijmegen. (2010). Validatie PATHOS Delta. Nijmegen: afdeling Pathologie UMC Radboud. Amanda Bond, J. C. (2013). Microwave processing of gustatory tissues for immunohistochemistry. Journal of Neuroscience Methods, Elsevier , 1-8. AstraZeneca. (2014, april). Wat is een Barrett slokdarm. Opgeroepen op april 2014, van Barrett.nl: http://www.barrett.nl/?page_id=6 Bio Optica milano s.p.a. (2010, maart). PAS- Amylase. Opgeroepen op maart 2014, van Bio Optica: www.bio-optica.it Bio Optica milano s.p.a. (2010, November). Congo Rood. Opgeroepen op maart 2014, van Bio Optica: www.bio-optica.it Bio Optica milano s.p.a. (2010, juli). Perls. Opgeroepen op maart 2014, van Bio Optica: www.bio-optica.it Bio Optica milano s.p.a. (2009, November). Van Gieson Trichrome. Opgeroepen op maart 2014, van Bio Optica: www.bio-optica.it Bio Optica milano s.p.a. (2011, april). Ziehl Neelsen. Opgeroepen op maart 2014, van Bio Optica: www.bio-optica.it Bio Optica milano s.p.a. (2013, juni). Zilver impregnatie. Opgeroepen op maart 2014, van Bio Optica: www.bio-optica.it Darmkanker. (2011). Dikke Darmkanker. Opgeroepen op maart 2014, van Darmkanker: http://www.darmkanker.info/pages/view.php?page_id=23 erasmusmc. (2014). histochemische kleuringen. Opgeroepen op januari 2014, van erasmusmc: http://coo.erasmusmc.nl/genetica/Atlas_Microscopie/1-2-3.htm erasmusmc. (2014). histologische kleuringen. Opgeroepen op januari 2014, van erasmusmc: http://coo.erasmusmc.nl/genetica/Atlas_Microscopie/1-2-2.htm Janssens, E. (2014). Toestellen: werkwijze en onderhoud doorvoertoestel Logos. SintNiklaas: AZ Nikolaas Labo Pathologische Anatomie. Janssens, E. (2014). Toestellen: werkwijze en onderhoud Histosmate. Sint-Niklaas: AZ Nikolaas Labo Pathologische Anatomie. Janssens, E. (2013). Toestellen: werkwijze en onderhoud: doorvoertoestel Thermo-Shandon. Sint-Niklaas: AZ Nikolaas Labo Pathologische Anatomie. Joris P. Bulte, et al. (2012). One-day core needle biopsy in a breast clinic: 4 years experience. Springer Science+ Business Media Ney York , 1-8. labpon. (2013). immunopathologie. Opgeroepen op januari 2014, van labpon: http://www.labpon.nl/informatie/immunopathologie 40 Labpon. (2013). Vriescoupe. Opgeroepen op januari 2014, van Labpon: http://www.labpon.nl/informatie/vriescoupe Maag Lever Darm stichting. (2014). Maagproblemen. Opgeroepen op januari 2014, van maagproblemen: http://www.maagproblemen.info/maagaandoeningen/helicobacter-pylori/). Medical Expo. (2014). Automatic microwave hybrid tissue processor: LOGOS. Opgeroepen op april 2014, van Medical Expo: http://www.medicalexpo.com/prod/milestone/automaticmicrowave-hybrid-tissue-processors-69428-527251.html mlds. (2014). Dunne Darmkanker. Opgeroepen op maart 2014, van mlds: http://www.mlds.nl/ziekten/147/dunne-darmkanker/ Richard J. Zarbo, et al. (2014). Validation of histology tissue processing and stain quality of Logos rapid-cycle... Detroit, michigan: Department of Pathology, Henry Ford Health System. Stichting kankerregister. (2011). Kankerregister. Opgeroepen op februari 2014, van Kankerregister: http://www.kankerregister.org/Statistieken Tegen kanker. (2013, mei 31). borstkanker. Opgeroepen op januari 2014, van tegen kanker: http://www.tegenkanker.be/borstkanker Tegen Kanker. (2014, februari 4). Dikkedarmkanker. Opgeroepen op maart 2014, van Tegen Kanker: http://www.tegenkanker.be/dikkedarmkanker Tegen Kanker. (2014). Onderzoeken. Opgeroepen op januari 2014, van Tegen Kanker: http://www.tegenkanker.be/content/onderzoeken tegen kanker. (2013, februari 4). prostaatkanker. Opgeroepen op januari 2014, van tegen kanker: http://www.tegenkanker.be/prostaatkanker 41 Bijlagen Bijlage 1 Bijlage 2 Doorvoertoestel: THERMO-SHANDON / Citadel 2000 B. kort dagprogramma (voor zeer kleine biopsies of na probleem met nachtprogramma) A. nachtprogramma positie solvent 1 formaldehyde (evt. + eosine) 2 formaldehyde (evt. + eosine) 3 methanol 4 methanol 5 methanol 6 methanol 7 methanol 8 xyleen 9 xyleen 10 xyleen 11 vloeibare paraffine 12 vloeibare paraffine tijd 1:00 1:00 1:00 1:00 1:00 1:00 1:00 1:00 1:00 1:00 1:00 1:00 u u u u u u u u u u u u positie solvent 1 formaldehyde (evt. + eosine) 2 formaldehyde (evt. + eosine) 3 methanol 4 methanol 5 methanol 6 methanol 7 methanol 8 xyleen 9 xyleen 10 xyleen 11 vloeibare paraffine 12 vloeibare paraffine tijd 0:01 0:01 0:30 0:30 0:30 0:30 0:30 0:30 0:30 0:30 0:30 0:30 u u u u u u u u u u u u Doorvoertoestel: Milestone/ Logos Microwave Hybrid Tissue Processor Dagrun 1LAYER Eth – Iso UP TO 3 mm: 15 x 10 x 3mm LOGOS (70 cassettes) Program*: 3h5min Total**: 3h19min (2rinsings) Total**: 3h17min (1rinsings) *The program time doesn’t include reagent pump in/out times. **The total time includes reagent pump in/out times. PROGRAM METHOD 1. FIXATION 2. ETHANOL STEP No. 1 2 1 2 3. ISOPROPANOL 1 2 4. VAPORIZATION 5. WAX 1 1 TIME (minutes) 15min 15min 15min PRESS./VAC. (mBar) N/A N/A N/A TEMPERATURE (Centigrade) 50°C 50°C 65°C 5min 15min 50min 1min30sec 30sec N/A N/A N/A 600 mBar 995 mBar 65°C 68°C 68°C N/A 70°C IMPREGNATION 2 3 4 5 6 7 10min 10min 2min 2min 2min 37min 500 mBar 400 mBar 300 mBar 200 mBar 150 mBar 150 mBar 70°C 70°C 70°C 70°C 70°C 65°C Nachtrun 1LAYER Eth – Iso Overnight 5mm fatty: 30 x 25 x 5 mm LOGOS (70 cassettes) Program*: 13h21min Total**: 13h38min (2rinsings) Total**: 13h36min (1rinsing) *The program time doesn’t include reagent pump in/out times. **The total time includes reagent pump in/out times. PROGRAM METHOD 1. FIXATION STEP No. 1 2 3 4 2. ETHANOL 1 2 1 2 1 2 1 1 2 3 4 5 6 7 3. ISOPROPANOL 4. ISOPROPANOL2 5. VAPORIZATION 1. WAX IMPREGNATION TIME (minutes) 20min 40min 10min 50min 10min 50min 15min 1h35min 15min 3h50min 1min30sec 30sec 25min 15min 15min 15min 2h50min 19min30sec PRESS./VAC. (mBar) N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A 600 mBar 995 mBar 500 mBar 400 mBar 300 mBar 200 mBar 150 mBar 800 mBar TEMPERATURE (Centigrade) 37°C 37°C 50°C 50°C 55°C 55°C 55°C 55°C 65°C 65°C N/A 70°C 70°C 70°C 70°C 70°C 65°C 65°C 2LAYERS Eth – Iso Overnight 5mm fatty: 30 x 25 x 5 mm LOGOS (140 cassettes) Program*: 3h26min Total**: 3h46min (2rinsings) Total**: 3h43min (1rinsing) *The program time doesn’t include reagent pump in/out times. **The total time includes reagent pump in/out times. PROGRAM METHOD 1. FIXATION STEP No. 1 2 3 4 2. ETHANOL 1 2 1 2 1 2 1 1 2 3 4 5 6 7 3. ISOPROPANOL 4. ISOPROPANOL2 5. VAPORIZATION 6. WAX IMPREGNATION TIME (minutes) 20min 40min 15min 50min 15min 45min 20min 1h30min 20min 3h45min 1min30sec 30sec 25min 15min 15min 15min 2h50min 19min30sec PRESS./VAC. (mBar) N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A 600 mBar 995 mBar 500 mBar 400 mBar 300 mBar 200 mBar 150 mBar 800 mBar TEMPERATURE (Centigrade) 37°C 37°C 50°C 50°C 55°C 55°C 55°C 55°C 65°C 65°C N/A 70°C 70°C 70°C 70°C 70°C 65°C 65°C 3LAYERS Eth – Iso Overnight 5mm fatty: 30 x 25 x 5 mm LOGOS (210 cassettes) Program*: 13h31min Total**: 13h56min (2rinsings) Total**: 13h53min (1rinsing) *The program time doesn’t include reagent pump in/out times. **The total time includes reagent pump in/out times. PROGRAM METHOD 1. FIXATION STEP No. 1 2 3 4 2. ETHANOL 1 2 1 2 1 2 1 3. ISOPROPANOL 4. ISOPROPANOL2 5. VAPORIZATION TIME (minutes) 20min 40min 20min 50min 20min 40min 25min 1h25min 25min 3h40min 1min30sec PRESS./VAC. (mBar) N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A 600 mBar TEMPERATURE (Centigrade) 37°C 37°C 50°C 50°C 55°C 55°C 55°C 55°C 65°C 65°C N/A 6. WAX IMPREGNATION 1 2 3 4 5 6 7 30sec 25min 15min 15min 15min 2h50min 19min30sec 995 mBar 500 mBar 400 mBar 300 mBar 200 mBar 150 mBar 800 mBar 70°C 70°C 70°C 70°C 70°C 65°C 65°C Bijlage 3 Kappa Lambda c-erbB-2 oncoprot. (HER2) Ker34Be12 (=cytokeratine, = CK) HMB 45 Ker AE1-AE3 TTF1 CD 99 Inhibine E-Cadherine P504S (= AMACR) CD 15 PR (progesteron receptor) CD 1a GCDFP-15 (= Gross cystic disease fluid protein 15) CD 5 Cycline D1 ( =Bcl-1) ER (estrogen receptor) Alfa-1-FP (fetoproteïne) Chromogranin A CD 3 S-100 Beta-HcG Thyroglobuline IgA MPO IgG IgM PSA Calcitonine HP (HLO) GFAP CD 30 CD 20 Desmine NF CD 31 SMA NSE CD 68 Bcl-2 Ker 19 P53 Ker 18 Ker 7 Ker 17 CD 79alfa CEA Ki-67 Calretinin Von Willebrand Factor CD 56 EMA Vimentin CD 34 Melan-A CD 43 CD 138 CD 57 CD 10 MSA CA125 Beta-Catenine CMV Synapto Ker 20 PLAP Ker 5-6 AEC + Subtrate Chromogeen CD 45 (RO) CA 19-9 HPV P40(P) Tag 72 Cytokeratin 14 Factor XIIIa Bijlage 4 Labo Pathologische Anatomie Toestellen: Werkwijze en onderhoud. Toestel: Doorvoertoestel Merk/Nummer toestel: THERMO-SHANDON / Citadel 2000 Serie n° 5539180001 Serie n° 5539180002 1.Toepassingsgebied Het doel van het toestel is om het water dat aanwezig is in de weefselcellen stapsgewijs te vervangen door paraffine, zodat van de biopsies paraffineblokken kunnen gemaakt worden. 2.Principe De weefselstalen worden door het toestel stap voor stap overgebracht van de waterige fase naar gesmolten paraffine. Deze twee fases zijn niet onderling mengbaar. De stalen doorlopen in het toestel een cyclus gaande over onderling mengbare solventen (formaldehyde, alcohol, xyleen, vloeibare paraffine) in oplopende concentraties. 3.Voorbereiding en benodigdheden Voorbereiding Het toestel bestaat uit 12 baden van 2 liter, die in een cirkel staan opgesteld op het toestel. De baden worden gevuld als volgt: - Bad 1: formol 4 % Bad 2: formol 4 % Bad 3: methanol Bad 4: methanol Bad 5: methanol Bad 6: methanol Bad 7: methanol Bad 8: xyleen Bad 9: xyleen Bad 10: xyleen Bad 11: paraffine Bad 12: paraffine Bad 11 en 12 worden elektrisch verwarmd op 56-58°C, zodat de paraffine steeds in vloeibare toestand is. De baden worden ververst volgens het schema ‘onderhoud’ Benodigdheden: - Formaldehyde 4 % - Methanol, technisch - Xyleen, technisch - Paraffinekorrels - Verversingslijst (lijst dagelijks onderhoud) - Lijst aantal biopsies per run (boek ligt tegenover het toestel op schap) - Eosine - Handschoenen - Tissues - Trechter - Afvalbussen Mogelijke programma’s: B. kort dagprogramma (voor zeer kleine biopsies of na probleem met nachtprogramma) A. nachtprogramma positie solvent 1 formaldehyde (evt. + eosine) 2 formaldehyde (evt. + eosine) 3 methanol 4 methanol 5 methanol 6 methanol 7 methanol 8 xyleen 9 xyleen 10 xyleen 11 vloeibare paraffine 12 vloeibare paraffine tijd 1:00 1:00 1:00 1:00 1:00 1:00 1:00 1:00 1:00 1:00 1:00 1:00 u u u u u u u u u u u u positie solvent 1 formaldehyde (evt. + eosine) 2 formaldehyde (evt. + eosine) 3 methanol 4 methanol 5 methanol 6 methanol 7 methanol 8 xyleen 9 xyleen 10 xyleen 11 vloeibare paraffine 12 vloeibare paraffine tijd 0:01 0:01 0:30 0:30 0:30 0:30 0:30 0:30 0:30 0:30 0:30 0:30 A is het standaardprogramma dat steeds in de routine gebruikt wordt. 4.Werkwijze Start toestel: - Verifieer of het toestel in de startpositie staat. Zo niet: druk GO TO 1. - Verifieer of het juiste programma op de display staat: bv. programma A, stap1. - Open de deur. u u u u u u u u u u u u - Bevestig de houder met de weefselmandjes aan de haak. De haak dient in de bovenste positie te staan, zo niet druk RAISE. - Druk op LOWER: de mand zakt in de vloeistof. - Controleer vóór het starten steeds volgende toetsen: • • • CLOCK (indien nodig juist zetten met +/- toetsen) START TIME (moet op 18.10u staan) DELAY: 0 tijdens de week. Voor een weekend of feestdag aantal dagen aanpassen. • DELAY ON: deze toets wordt aangezet als de weefselmand wordt aangehangen vóór de starttijd. Als deze toets aanstaat, zal het toestel automatisch starten op de ingestelde starttijd (18.10u). - Je kan ook het toestel onmiddellijk doen starten door op AUTO START te drukken. Dit kan je bv. doen als de starttijd (18.10u) reeds voorbij is. Einde cyclus: - Verifieer of de mandhouder zich ter hoogte van de eindpositie bevindt (stand 12). Op de display is terug de beginsituatie te zien (bv. programma A, stap 1). - Open de deur. - Druk op RAISE en wacht even tot de meeste paraffine van de houder is gedrupt. - Neem de houder voorzichtig uit het toestel terwijl je een opvangbakje (nierbekken) onder het geheel(houder met mandjes) houd zodat er geen paraffine lekt op de grond. - Sluit de deur. - Druk op GO TO 1. Het toestel plaatst zich terug in de beginpositie. 5.Onderhoud: 5.1 Dagelijks onderhoud: - Formol: op maandag, woensdag en vrijdag bad 1 leeggieten. Bad 2 doorschuiven naar positie 1. Bad 1 vullen tot aan de streep met formol 4 % en terugplaatsen op positie 2. - Methanol: dagelijks bad 3 leeggieten. Bad 4 tot en met 7, elk 1 positie naar voor opschuiven. Bad 3 vullen tot aan de streep met methanol en terugplaatsen op positie 7. - Xyleen: op maandag, woensdag en vrijdag, bad 8 leeggieten. Bad 9 en 10, elk 1 positie naar voor opschuiven. Bad 8 vullen tot aan de streep met xyleen en terugplaatsen op positie 10. - Paraffine: dagelijks bad 11 en 12 aanvullen tot aan de streep met paraffinekorrels. 5.2 Periodiek onderhoud: Maandelijks onderhoud: - Beide paraffinebaden volledig leeggieten en vullen met paraffinekorrels tot bovenaan. - Niveau controleren na smelten (eventueel bijvullen). - Smelttijd 5-tal uren. Driemaandelijks onderhoud - Volledige reiniging van alle uitwendige onderdelen/verwijderen paraffineresten. - Verversen/aanvullen baden volgens routine schema dagelijks/maandelijks onderhoud. - Testen verbinding tussen de weefseltoestellen en de bewakingscomputer door genereren van alarm. Jaarlijks Onderhoud door firma (onderhoudscontract). Bijlage 5 Bijlage 6