VORMING VAN BIOFILMS DOOR STAPHYLOCOCCUS AUREUS

UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
Academiejaar 2014-2015
VORMING VAN BIOFILMS DOOR STAPHYLOCOCCUS AUREUS
door
Christina RAHE
Promotoren: Prof. dr. Freddy Haesebrouck
Drs. Iris Bosschem
Literatuurstudie in het kader
van de Masterproef
© 2015 Christina Rahe
Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of
volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk
uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden.
Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor
enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig
vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.
UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
Academiejaar 2014-2015
VORMING VAN BIOFILMS DOOR STAPHYLOCOCCUS AUREUS
door
Christina RAHE
Promotoren: Prof. dr. Freddy Haesebrouck
Drs. Iris Bosschem
Literatuurstudie in het kader
van de Masterproef
© 2015 Christina Rahe
VOORWOORD
Bij deze wil ik de kans grijpen, om mijn dank uit te spreken aan mijn promotor Prof. dr. Freddy
Haesebrouck, om mij de mogelijkheid te geven dieper in te gaan op dit interessant onderwerp.
Bedankt ook voor de suggesties. Verder wil ik Drs. Iris Bosschem danken voor de vlugge
verbeteringen, de goede samenwerking en het waardevol advies. Van harte bedankt hiervoor.
INHOUDSOPGAVE
SAMENVATTING .................................................................................................................................... 1
INLEIDING............................................................................................................................................... 2
LITERATUURSTUDIE ............................................................................................................................. 3
1.
STAPHYLOCOCCUS AUREUS ................................................................................................... 3
1.1 Taxonomie en belangrijke eigenschappen van Staphylococcus aureus ................................... 3
1.2 Pathogeniciteit............................................................................................................................ 3
1.3 Virulentiefactoren ....................................................................................................................... 4
1.3.1 Toxines ................................................................................................................................ 4
1.3.2 Proteïne A............................................................................................................................ 6
1.3.3 Coagulasen.......................................................................................................................... 6
1.3.4 Adhesines ............................................................................................................................ 6
1.4 Antibioticaresistentie .................................................................................................................. 7
2.
BIOFILMS ..................................................................................................................................... 8
2.1 Voorkomen en betekenis ........................................................................................................... 8
2.2 Samenstelling............................................................................................................................. 9
2.3 De levenscyclus ....................................................................................................................... 10
2.4 Regulatie van biofilmvorming ................................................................................................... 12
2.5 Voordelen voor bacteriën in een biofilm................................................................................... 12
2.6 Antibiotica tolerantie en resistentie .......................................................................................... 13
2.7 Preventie en bestrijding............................................................................................................ 13
3.
BIOFILMS GEVORMD DOOR S. AUREUS ............................................................................... 15
3.1 Betekenis en voorkomen.......................................................................................................... 15
3.2 Samenstelling........................................................................................................................... 16
3.3 Moleculaire basis van de biofilm cyclus ................................................................................... 16
3.4 Quorum sensing ....................................................................................................................... 17
3.5 Regulatie van biofilmvorming ................................................................................................... 19
3.6 Gastheerreactie op infecties door S. aureus biofilms .............................................................. 19
3.7 Bestrijding en preventie van S. aureus biofilms ....................................................................... 20
BESPREKING ....................................................................................................................................... 22
REFERENTIELIJST .............................................................................................................................. 24
SAMENVATTING
Staphylococcus aureus (S. aureus) leeft als commensaal op de huid en mucosae. Bij een verlaagd
immuunsysteem als predisponerende factor kan een kolonisatie tot infectie leiden en een oorzaak van
diverse ziektes worden. Pneumonie, bovenste luchtweginfecties, endocarditis, bloedbaan infecties,
osteomyelitis, atopische dermatitis en het toxisch shock syndroom behoren hiertoe. Infecties door S.
aureus vertonen een hoge morbiditeit en mortaliteit. Van groot belang zijn de infecties veroorzaakt
door contaminaties van medische instrumenten.
S. aureus bezit verschillende virulentiefactoren, waarvan de expressie voor het grootste deel door de
accessory gene regulator (agr) gecontroleerd wordt. Door toxines, proteïne A, coagulasen en
adhesines wordt de gastheer aangetast of de bacterie voor de immuunrespons beschermd. Er
bestaan stammen die zeer resistent zijn tegenover antibiotica, waarbij vooral de methicilline-resistente
S. aureus (MRSA) een grote uitdaging voor behandeling is.
Een biofilm is een multicellulaire bacteriële gemeenschap, vastgehecht aan een oppervlak. Bacteriën
in een biofilm zijn ingebed in een zelf geproduceerde extracellulaire matrix (ECM). De belangrijkste
onderdelen van de ECM zijn exopolysacchariden, proteïnen, nucleïnezuren, lipiden, glycolipiden en
water. Biofilms worden in meerdere stappen gevormd: adhesie, structurering en verspreiding.
Kenmerkend voor de cellen zijn zowel een laag metabolisme en celdeling alsook de hoge resistentie
tegenover antibiotica en de inwerking van het immuunsysteem. De vorming van een biofilm wordt via
quorum sensing geregeld, maar ook verschillende andere molecules en factoren spelen een rol.
Infecties door S. aureus biofilms zijn van aanzienlijk belang. Zowel de hoge mate aan
antibioticaresistentie alsook hun vermogen om diverse weefsels te infecteren en de capaciteit om
uiteenlopende abiotische oppervlakten te koloniseren zijn daarvoor als reden te vermelden.
Osteomyelitis, chronische wondinfecties, chronische rhinosinusitis, endocarditis, ooginfecties,
paradontitis en infecties van medische instrumenten en implantaten zijn vaak voorkomende
aandoeningen veroorzaakt door S. aureus biofilms.
De bestrijding van biofilms door S. aureus is een uitdaging, aangezien behandeling met enkel
antibiotica weinig effect heeft. Verder onderzoek is vereist naar nieuwe behandelingsmethoden.
Trefwoorden: biofilm – pathogeniciteit – regulatie - Staphylococcus aureus - therapie
1
INLEIDING
Het onderwerp van deze literatuurstudie, de biofilmvorming door Stapyhlococcus aureus (S. aureus),
is een vrij recent en complex thema door het belang bij diverse ziektes en de moeilijke therapie en
preventie.
Infecties door S. aureus gaan gepaard met een groot aantal ziektes, dewelke ook levensbedreigend
kunnen zijn (Archer et al., 2011). Door hun capaciteit om diverse weefsels te infecteren en abiotische
oppervlakten te koloniseren en door hun lage gevoeligheid voor antibiotica zijn infecties door S.
aureus van groot belang (Mack et al., 2004; Periasamy et al., 2012). De vorming van een biofilm staat
de bacteriën bijzondere eigenschappen toe, die het overleven in de biofilm garanderen. Zowel de
resistentie tegenover antibiotica alsook tegen afbraak door het immuunsysteem zijn enkele voordelen
voor de bacteriën in de biofilm (Melchior et al., 2006). Van groot belang zijn infecties van medische
instrumenten en de daarmee gepaard gaande ziektes. S. aureus is daarbij de vaakst voorkomende
causale pathogeen (Archer et al., 2011). Vooral volgende ziektes worden geassocieerd met biofilms
door S. aureus: osteomyelitis, chronische wondinfecties, chronische rhinosinusitis, endocarditis,
paradontitis, ooginfecties en infecties van medische instrumenten en orthopedische implantaten
(Archer et al., 2011).
Ook in de veterinaire geneeskunde spelen biofilms door S. aureus een aanzienlijke rol. Terwijl echter
in de humane geneeskunde redelijk veel onderzoek over biofilm-geassocieerde infecties plaatsvindt,
bestaat omtrent biofilms in de diergeneeskunde nog weinig inzicht (Haesebrouck et al., 2007). Vooral
bij mastitis, veroorzaakt door S. aureus, wordt er van uitgegaan dat biofilms van belang zijn (Melchior
et al., 2006). Maar ook voor andere infecties bij dieren wordt een associatie met biofilms door S.
aureus verondersteld (Olson et al., 2002).
De hoge resistentie van S. aureus biofilms is door verschillende mechanismen te verklaren en
vertegenwoordigt een grote uitdaging voor therapie (Melchior et al., 2006; López et al., 2010;
Vanhommerig et al., 2014). Om goede resultaten te verkrijgen wat betreft de behandeling zijn
antibiotica alleen niet voldoende en is een combinatie van therapieën aangewezen. Hoewel er reeds
belangrijke stappen voorwaarts gemaakt zijn, bestaat er nog altijd de nood om verder inzicht in de
vorming van een biofilm te verkrijgen om doeltreffende therapieën te ontwikkelen (Archer et al., 2011;
Beloin et al., 2014).
In deze literatuurstudie wordt eerst ingegaan op de bacterie zelf, vervolgens op biofilms in het
algemeen en ten slotte op biofilms gevormd door S. aureus.
2
LITERATUURSTUDIE
1.
STAPHYLOCOCCUS AUREUS
1.1 Taxonomie en belangrijke eigenschappen van Staphylococcus aureus
Staphylococcen zijn op basis van hun DNA en RNA nauw verwant met zowel de Micrococcaceae als
met de Bacillaceaea familie van de Bacillus-Lactobacillus-Streptococcus cluster (Murray et al., 2007).
Er behoren meer dan 47 verschillende species in het genus Staphylococcus (Carter en Wise, 2004).
a
b
Fig. 1: (a) Microscopisch beeld van S. aureus (uit Gessner, 2012) (b) Kolonies van S. aureus (uit Rit, 2014)
Staphylococcen zijn gram-positieve, facultatief anaërobe en catalase-positieve coccen met een
diameter tussen 0,5-1,0 µm (Baird-Parker, 1974; Baron, 1996). Ze worden onderverdeeld in twee
groepen op basis van hun vermogen om bloedplasma te coaguleren. Staphylococcus aureus (S.
aureus) behoort tot de coagulase-positieve groep en dit wordt als merker voor de bacterie gebruikt
(Baron, 1996). Bij microscopisch onderzoek (Fig. 1a) is S. aureus te zien als kokvormige cellen,
gegroepeerd in trosvormige clusters. De bacterie is geel gepigmenteerd en zo te onderscheiden van
de niet-gepigmenteerde S.epidermis (Fig. 1b) (Madigan en Martinko, 2006). Een ander kenmerk is de
productie van alfa- en beta-haemolysines (Quinn et al., 2011). De niet-beweegbare (Le Loir et al.,
2003) bacterie vormt geen sporen maar is toch resistent tegenover droogte. De bacterie wordt
geïdentificeerd door de kolonies op verschillende eigenschappen te testen: coagulatie, hemolyse en
de thermostabiele deoxyribonuclease (Baron, 1996).
1.2 Pathogeniciteit
S. aureus veroorzaakt verschillende huidziektes en mucosa-infecties die levensbedreigend kunnen
zijn. Veel infecties veroorzaakt door S.aureus gaan gepaard met ettervorming (Madigan en Martinko,
2006). Het speelt onder andere een beduidende rol in het ontstaan van pneumonie, ernstige infecties
van de bovenste luchtwegen, endocarditis, bloedbaan infecties, osteomyelitis, atopische dermatitis en
het toxisch shock syndroom en wordt om deze reden intensief onderzocht (Vergara-Irigaray et al.,
2009; Derycke et al., 2010; Shin et al., 2013; Vandecandelaere et al., 2014). In vergelijking met
3
andere Staphylococcus infecties vertonen infecties met S. aureus een hogere morbiditeit en mortaliteit
(Cramton et al., 1999).
Infecties met S. aureus, zowel acuut als chronisch, komen bij een groot deel van de populatie
asymptomatisch voor (Cramton et al., 1999; Otto, 2008; Derycke et al., 2010). De bacteriën leven als
commensalen op huid en mucosae (Otto, 2008), waarbij vaak gekoloniseerde plekken de neus, mond,
genitalia en het rectum zijn (Toledo-Arana et al., 2005). Bij gevoelige en gepredisponeerde individuen
bestaat het risico dat kolonisatie in een infectie resulteert, waarbij de kiem zich naar andere
lichaamsdelen verspreidt en na het bereiken van de bloedbaan een biofilm gevormd wordt (Archer et
al., 2011; Vanhommerig et al., 2014). Predisponerende factoren zijn deze die de immuniteit van de
gastheer verlagen, zoals schommelingen van hormonen, erge ziektes of wonden en de behandeling
met steroïden of andere medicijnen (Madigan en Martinko, 2006).
S. aureus speelt een grote rol in de contaminatie van blijvende intravasculaire katheters,
endotracheale en tracheotomie tubes, peritoneale dialyse tubes en cornea infecties geassocieerd met
contactlenzen waarbij het hier om biofilm-geassocieerde contaminaties gaat (Cramton et al., 1999;
Otto, 2008; Derycke et al., 2010). Dergelijke contaminaties resulteren dikwijls in nosocomiale
Staphylococcus infecties van de patiënt (Otto, 2008; Vergara-Irigaray et al., 2009).
Naast Escherichia coli is S. aureus de meest voorkomende bacterie geassocieerd met klinische
mastitis bij het rund. Mastitis veroorzaakt door S. aureus is vaak een milde infectie die een chronisch
karakter aanneemt (Bannerman et al., 2004).
1.3 Virulentiefactoren
De virulentiefactoren van S. aureus zijn voor een groot deel gecodeerd op mobiele genetische
elementen, zoals plasmiden. De horizontale gentransfer speelt een beduidende rol bij het overdragen
van genen, waaronder fagen transductie, conjugatie en de directe opname van DNA (transformatie)
(Otto, 2014). De expressie van de meeste virulentiefactoren wordt gecontroleerd door de accessory
gene regulator (agr) locus en uitgaande van verschillen in deze locus wordt er een differentiatie
gemaakt tussen vier verschillende groepen van S. aureus (Derycke et al., 2010).
1.3.1 Toxines
Toxines zijn molecules die op directe wijze de gastheer aantasten. Ze kunnen in drie groepen
onderverdeeld worden: ten eerste de membraan aantastende toxines, die of receptor-gemedieerd of
receptor-onafhankelijk kunnen werken, ten tweede toxines die met de receptor-functie interfereren en
als laatste de gesecreteerde enzymen.
1.3.1.1 Membraan-aantastende toxines
Deze cytolytische toxines oefenen hun werking uit via poriënvorming in de membraan, wat leidt tot het
verlies van noodzakelijke celcomponenten en metabolieten. De toxines kunnen in twee groepen
opgedeeld worden afhankelijk van hun werkwijze; de receptorafhankelijke toxines die een hoge
celspecificiteit vertonen en deze die receptoronafhankelijk aan cellen adhereren en hun werking
uitoefenen (Otto, 2014).
4
De meeste receptorafhankelijke toxines zijn gericht op de lyse van rode bloedcellen (hemolysines) en
witte bloedcellen (leucotoxines) (Otto, 2014). Het α-toxine, één van de best onderzochte toxines, werkt
in op erythrocyten en leukocyten. De gevormde heptamere porie leidt tot de efflux van ionen en ATP.
Om hun cytolytische werking te kunnen uitoefenen, is een interactie met de ADAM10-receptor nodig,
wat leidt tot de storing van adhesies binnen de membraan (Berube en Wardenburg, 2013). Ook van
belang zijn de toxines, zoals het Panton-Valentine leucocidine, het gammatoxine en de leucocidines
LukDE en LukAB (Otto, 2014).
De receptoronafhankelijke toxines oefenen een detergentachtige werking uit waardoor ze
membraandesintegratie veroorzaken en een kortlevende porie vormen. De cytolytische phenol-soluble
modulins (PSMs) spelen een belangrijke rol in de pathogenese van S. aureus. Ze dragen bij tot de
lyse van neutrofielen na hun fagocytose, wat in beduidende mate bijdraagt tot de toxiciteit van S.
aureus. Naast hun cytolytische activiteit veroorzaken ze ook een inflammatoire reactie (Otto, 2014).
1.3.1.2 Toxines met invloed op de receptorfunctie
Enterotoxines zijn gesecreteerde toxines die met de normale darmfunctie interfereren en nausea en
diarree veroorzaken (Otto, 2014). Ze veroorzaken het toxisch-shock syndroom en spelen een rol in
voedselvergiftiging
(Ortega
et
al.,
2010).
De
Staphylococcus
enterotoxines
(SE)
worden
geclassificeerd als superantigenen, wat betekent dat ze het vermogen hebben om een groot aantal Tcellen te activeren en aanleiding geven tot cytokine productie (Pinchuk et al., 2010). De SE behoren
tot de familie van Staphylococcus en Streptococcus pyrogenen exotoxines (Ortega et al., 2010). SEA
en SEB zijn de best gekarakteriseerde enterotoxines (Pinchuk et al., 2010).
Wat betreft voedselvergiftigingen zijn de SE één van de belangrijkste oorzaken. Vergiftigingen treden
op na de consumptie van gecontamineerde melk- en vleesproducten, waarbij enkele microgrammen
toxine voldoende zijn om symptomen te veroorzaken (Krakauer en Stiles, 2013). Tot de symptomen
behoren nausea, overgeven, abdominale pijn, krampen en diarree (Pinchuk et al., 2010).
De toxines verantwoordelijk voor het toxic shock syndrome (TSS) zijn de toxic shock syndrome toxins1 (TSST-1) en de SE. Deze binden op de MHC-II receptor op T-cellen en leiden tot hun activatie
(Krakauer en Stiles, 2013) welke uiteindelijk de B-cellen activeren en een krachtige inflammatoire
reactie als resultaat opleveren (Derycke et al., 2010). Talrijke cytokines, waaronder IL-1, IL-2 en TNFα, worden vrijgesteld (Otto, 2014). Deze systemische ziekte veroorzaakt volgende symptomen: hoge
koorts, diffuse erythemateuze huiduitslag, huiddesquamatie, hypotensie en orgaanfalen (Ortega et al.,
2010).
1.3.1.3 Enzymen
Talrijke enzymen die gesecreteerd worden door S. aureus, leiden tot moleculeafbraak van de weefsels
van de gastheer of tot interferentie met signaalcascaden. Veel enzymen hebben een protease
activiteit. De proteasen hebben een grote marge aan substraten en werken aspecifiek in op
verschillende weefsels. Het aspecifiek protease aureolysine speelt een belangrijke rol en oefent
verschillende functies uit, onder andere het ontwijken van het complement-gemedieerd afdoden van
bacteriën. Ook van belang zijn de coagulasen, de sphingomyelinasen, de staphylokinasen en serine
proteasen (Otto, 2014).
5
1.3.2 Proteïne A
Proteïne A (SpA) is een aan het oppervlak van de bacterie gebonden molecule (Falugi et al., 2013;
Pauli et al., 2014), die met verschillende gastheermolecules interageert en zo tot de virulentie bijdraagt
(Fournier en Klier, 2004). SpA heeft vier of vijf immunoglobuline-bindende domeinen via welke zowel
de Fc van IgG´s gebonden kunnen worden alsook de Fab van Variable Heavy 3 (VH3) antilichamen
(Falugi et al., 2013; Pauli et al., 2014). De binding aan IgG´s leidt tot het voorkomen van opsonisatie
en fagocytose. Door binding aan de B-celreceptor VH3 wordt de receptor gecrosslinked wat tot
supraclonale expansie en apoptotische collaps van de geactiveerde B-cellen leidt (Falugi et al., 2013).
S. aureus beschermt zich op deze manier tegen het immuunsysteem van de gastheer (Falugi et al.,
2013). De synthese van SpA wordt door verschillende loci, onder andere de agr en sarA loci,
gereguleerd. Als antwoord op veranderingen in de groeicondities vindt er DNA supercoiling plaats, die
de loci reguleert en tot genexpressie aanzet. Vaak wordt de genexpressie door een tweecomponenten systeem gereguleerd waarvan er bij S. aureus vier verschillende de productie van
virulentiefactoren reguleren: agr, sae, srr, arl. Via een sensor worden er groeiomstandigheden
geregistreerd en doorgegeven aan een respons regulator welke tot genexpressie leidt. Het ArlS-ArlR
systeem is noodzakelijk in de regulatie van SpA (Fournier en Klier, 2004).
1.3.3 Coagulasen
Het door S. aureus gesecreteerde coagulase is een polypeptide die prothrombine activeert en zorgt
voor de vorming van fibrine uit fibrinogeen. Bijgevolg wordt het klonteren van bloed bevorderd. Er
wordt aangenomen dat het vastzitten in het fibrinenetwerk de kiemen toestaat om thrombo-embolische
lesies te vormen en aan de opsoniserend-fagocyterende actie van het immuunsysteem te ontduiken
(McAdow et al., 2012).
1.3.4 Adhesines
S. aureus is in staat om aan componenten van de extracellulaire matrix van gastheercellen te binden,
wat kolonisatie mogelijk maakt. Deze binding gebeurt via adhesines, de “microbial surface
components recognizing adhesive matrix molecules” (MSCRAMM´s). Deze proteïnen worden
gesecreteerd via het secretion system (Sec system) en covalent verankerd via de peptidoglycanen
van de celwand (Foster en Höök, 1998; Bartlett en Hulten, 2010). Tot nu toe werden 21 MSCRAMM´s
geïdentificeerd (Bartlett en Hulten, 2010) en worden naargelang hun bindingseiwit op de gastheercel
in drie types ingedeeld (Foster en Höök, 1998); fibronectin-binding protein A (FnBPA), collageenbinding protein (Cna), fibrinogen-binding protein (clumping factor (ClfA)). S. aureus maakt aldus
gebruik van verschillende gastheerweefsel adhesie mechanismen om het immuunsysteem tegen te
werken (Foster en Höök, 1998).
MSCRAMM´s oefenen naast hun adhesiefunctie ook een invasie-activiteit uit, via welke de bacterie
geïnternaliseerd wordt. Ze binden daarvoor aan dezelfde proteïnen als voor de gewone adhesie. Het
wordt aangenomen dat dit een rol speelt in het systemisch verspreiden van de bacterie (Bartlett en
Hulten, 2010).
Een recent ontdekte groep van adhesines zijn de “secretable expanded repertoire adhesive
molecules” (SERAM´s), die een vergelijkbare functie uitoefenen als de MSCRAMM´s. Ze binden aan
verschillende matrix proteïnen, waaronder fibrinogeen, fibronectine, prothrombine en vitronectine,
6
waarna ze terug aan S. aureus binden en derhalve een verbinding vormen tussen bacterie en
gastheercel (Bartlett en Hulten, 2010).
1.4 Antibioticaresistentie
Door het vermogen om genetisch materiaal op te nemen zijn de laatste eeuw nieuwe S. aureus
stammen ontstaan die resistent zijn tegen de gewone behandelingsmethoden. Zo vertegenwoordigen
de methicilline-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) en de hoog resistente hospital-acquired
(HA) MRSA een groot probleem betreffende de behandeling met antibiotica (Vanhommerig et al.,
2014).
S. aureus kan verschillende resistentiemechanismen tegenover antibiotica bezitten.
De resistentie tegenover penicilline kan te wijten zijn aan de productie van het extracellulair enzym
penicillinase. Door de hydrolyse van amidebinding in de ß-lactamring van pencilline en ampicilline
worden deze antibiotica geïnactiveerd. De genen die hiervoor verantwoordelijk zijn worden ingebracht
via extrachromosomaal plasmide DNA. De aanwezigheid van penicilline of een vergelijkbare molecule
zet de cel aan tot sterke penicillinase-productie. Methicilline-resistente S. aureus (MRSA) worden
aanzien als het belangrijkste nosocomiaal pathogeen. Methicilline resistentie impliceert de resistentie
tegenover alle ß-lactam antibiotica (Pantosti et al. 2007). De mogelijkheid om biofilms te vormen komt
de MRSA stammen ten goede wat betreft het doorbreken van de immuunbarrière en het ontsnappen
aan de antibiotica (Vanhommerig et al., 2014). Methicilline resistentie is mogelijk door de
aanwezigheid van het mecA-gen in S. aureus, welk codeert voor het gemodificeerde penicillinebindend proteïne (PBP2a). Vergeleken met het gewoon penicilline-bindend proteïne is bij de PBP2a
de affiniteit voor ß-lactam antibiotica gereduceerd. Bij inwerking van een ß-lactam antibioticum worden
de gewone PBP´s geïnhibeerd. In dit geval nemen de PBP2a´s de functie over zodat de
celwandproductie niet stopt. MRSA-infecties treden vooral in klinieken op. Een nieuwe vorm van
MRSA, de community-acquired (CA) MRSA, veroorzaakt voornamelijk infecties in kinderen en jong
volwassenen (Pantosti et al. 2007).
De laatste decennia zijn sommige S. aureus stammen ontstaan die eveneens resistent zijn tegenover
vancomycine. Naast volledig resistente stammen, de vancomycine resistent S. aureus (VRSA),
bestaan ook stammen met intermediaire resistentie, de vancomycine intermediate S. aureus (VISA).
VISA verkrijgt zijn resistentie door een verdikte celwand, waardoor vancomycine in de buitenste lagen
wordt gevangen en belet dat het tot in de binnenste celwand doordringt. VRSA stammen hebben het
resistentiemechanisme van de vancomycine-resistente Enterococci overgenomen. Via het vanA
operon worden gemodificeerde peptidoglycaan precursoren gecodeerd, welke een lagere affiniteit
voor vancomycine vertonen. Het substraat van vancomycine is aldus gewijzigd, waardoor het zijn
werking niet kan uitoefenen (Pantosti et al. 2007).
Resistentie tegenover fluoroquinolones is snel opgetreden sinds het veelvuldig gebruik van
ciprofloxacine. De resistentie is bij de meeste stammen ontstaan door een puntmutatie in twee
enzymes die noodzakelijk zijn voor DNA-replicatie, topoisomerase IV en DNA gyrase. Dit mechanisme
treedt bij de meeste MRSA stammen op die ook resistent zijn tegenover fluoroquinolones. Bij andere
stammen wordt de resistentie door een overexpressie aan effluxpompen verkregen (Pantosti et al.,
2007).
7
2.
BIOFILMS
Een biofilm is een multicellulaire bacteriële gemeenschap, vastgehecht aan een oppervlak en ingebed
in een extracellulaire matrix (ECM), geproduceerd door de bacteriën zelf. De bacteriën behorend tot
een biofilm kunnen een afwijkend fenotype vertonen wat betreft groeisnelheid, genexpressie en
proteïne syntese (López et al., 2010; Montanaro et al., 2011; Archer et al., 2011). Bacteriën in een
biofilm zijn resistenter tegenover antibiotica, desinfectantia en aan afbraak door het immuunsysteem
van de gastheer (Melchior et al., 2006). Biofilms vertegenwoordigen de sessiele fase van bacteriën:
door hun fysiologie aan te passen vormen ze een resistente gemeenschap en voorkomen het
koloniseren van deze niche door andere organismen (López et al., 2010; Garnett en Matthews, 2012).
Cellen in een biofilm onderscheiden zich van niet-sessiele cellen door hun laag metabolisme en een
bijna afwezige celdeling (Archer et al., 2011).
2.1 Voorkomen en betekenis
Bacteriën kunnen aan zo goed als iedere oppervlak vasthechten en aanleiding geven tot een biofilm.
Biofilms spelen een belangrijke rol in het ontstaan van chronische infecties, veelal uitgaande van
medische instrumenten (Fig. 2) (López et al., 2010). De infecties geassocieerd met de biofilms op
medische
instrumenten
omvatten
onder
andere
katheter-geassocieerde
urineweginfecties,
bloedbaaninfecties door centraalveneuze katheters en infecties op basis van orthopedische
implantaten (Francolini en Donelli, 2010; Römling et al., 2014). Andere medische objecten waarop
biofilms kunnen ontstaan zijn contactlenzen, endotracheale tubes, kunstmatige hartkleppen en
pacemakers en borstimplantaten (Römling et al., 2014). Tot de meest prevalente infecties
geassocieerd met biofilms behoren chronische otitis media en chronische sinusitis, endocarditis,
chronische tonsillitis, tandplaque, chronische laryngitis, longinfecties, nierstenen, galweginfecties,
urineweginfecties, vaginitis, osteomyelitis en chronische wonden (Francolini en Donelli, 2010; Römling
et al., 2014). De voornaamste chronische wonden geassocieerd met biofilms zijn drukulcera,
diabetische voetulcera en veneuze ulcera. Door hun hoge resistentie tegenover therapie en door de
negatieve invloed op de wondheling zijn biofilms van groot belang (Bradley en Cunningham, 2013).
Gram-positieve bacteriën die een belangrijke rol spelen bij infecties door een biofilm zijn onder andere:
S. epidermis, S. aureus, E. coli en verschillende Streptococcus species (Melchior et al., 2006). Ook
Klebsiella
pneumoniae,
Pseudomonas
aeruginosa,
coagulase-negatieve
staphylococcen
en
verschillende Enterococcus stammen worden geassocieerd met biofilms op medische instrumenten
(Donlan, 2002). Biofilm geassocieerde infecties zijn van groot belang bij hospital-acquired en
community-acquired infecties, waarbij tandcariës en paradontitis het meest voorkomen. Biofilmgeassocieerde infecties zijn meestal moeilijk te diagnosticeren en door hun hoge resistentie tegenover
antimicrobiële agentia moeilijk te behandelen (Römling et al., 2014).
Bij dieren werd er minder onderzoek gedaan over biofilms dan bij de mens. Er wordt toch van
uitgegaan dat ze ook bij dieren een belangrijke rol spelen bij verschillende bacteriële aandoeningen
(Olson et al., 2002; Haesebrouck et al., 2007).
Er wordt aangenomen dat biofilms gevormd door verschillende bacteriën ook een rol in mastitis
spelen. Door de hoge resistentie van de in biofilms groeiende bacteriën tegenover antimicrobiële
therapie zijn deze infecties moeilijk te behandelen. Volgende biofilm vormende bacteriën kunnen
8
verantwoordelijk zijn voor mastitis: S. aureus, Streptococcus dysgalactiae, S. aglactiae, S. uberis en E.
coli (Melchior et al., 2006). Ook andere ziektes wordt verondersteld geassocieerd te zijn met biofilms:
pneumonie, leverabcessen, lymfadenitis, enteritis en wondinfecties (Olson et al., 2002).
Terwijl biofilms tot hier toe enkel in een negatieve context bekeken werden, moet er op gewezen
worden dat de aanwezigheid van biofilms ook voordelig kan zijn. Biofilms van bacteriën die behoren
tot de normale microbiota van dieren of mensen, kunnen antagonistisch werken tegeover schadelijke
bacteriën en zodoende het voorkomen van ziektes (López et al., 2010).
In de natuur vormt een biofilm vaak een onderdeel van mutualistische symbiose (López et al., 2010).
a
b
c
Fig. 2: Voorbeelden van biofilms (a) E. coli biofilm op een urinaire katheter (uit Römling en Balsalobre, 2012) (b) Gramnegatieve biofilm op een ureter stent (uit Habash en Reid, 1999) (c) Biofilm op een stemprothese (uit Donelli, 2015)
2.2 Samenstelling
De ECM houdt de bacteriën in intens contact en staat interacties toe. De samenstelling is complex, het
bevat naast polysaccharide polymeren ook lipopolysacchariden, glycolipiden, lipiden, proteïnen en
nucleïnezuren. De respectievelijke compositie van de sterk gehydrateerde en extracellulaire polymere
substanties (EPS) kan verschillen afhankelijk van groeiconditie, medium en substraat (López et al.,
2010; Flemming en Wingender, 2010; Montanaro et al., 2011). De matrix is een driedimensionale
structuur en kan verschillende oppervlakte-eigenschappen vertonen, van effen tot vezelig en meer of
minder poreus zijn. Binnen de matrix wordt een netwerk gevormd met verschillende zones van
densiteit en biochemische kenmerken en vertoont poriën en kanalen (Flemming en Wingender, 2010).
Een hoofdbestanddeel van de EPS zijn polysacchariden (Flemming en Wingender, 2010). De
verschillende bacteriën bezitten uiteenlopende exopolysacchariden. Zo is een hoofdbestanddeel bij
staphylococcen
het
polysaccharide
I,
een
homoglycaan
bestaande
uit
ß-1,6-gelinkte
N-
acetylglucosamine, en het polysaccharide II, samengesteld uit niet-N-geacyteleerde D-glucosaminyl,
fosfaat en ester-gelinkt succinaat (Melchior et al., 2006). Bij gram-negatieve bacteriën spelen
colaanzuur, alginaat, glucose- en mannose-rijke componenten, cellulose en ß-1,6-gelinkte Nacetylglucosamine een belangrijke rol als matrixcomponenten (Montanaro et al., 2011).
9
Er zijn verschillende enzymen in de biofilm aanwezig welke biopolymeren afbreken en deze als
koolstof- en energiebron voor de cellen binnen de biofilm ter beschikking stellen. Andere enzymen
modificeren de structuur van de ECM en maken het mogelijk dat cellen hun binding met de biofilm
verbreken en na verspreiding aanleiding geven tot een nieuwe biofilm. Verder bestaan er enzymen die
als virulentiefactoren werken (Flemming en Wingender, 2010).
Recente studies hebben aangetoond dat extracellulair DNA (eDNA) ook onderdeel vormt van de ECM
en belangrijk is voor de integriteit van een biofilm (López et al., 2010). Voor S. epidermis werd ontdekt
dat eDNA in de eerste fase van biofilmvorming van belang is. Bovendien vormt eDNA een onderdeel
in gentransfer en heeft belang in de preventie van fagocytose en het verlagen van de immuunrespons
van de gastheer. Het eDNA wordt vrijgesteld via autolyse, waarbij de afzonderlijke bacteriën
uiteenlopende mechanismen vertonen (Montanaro et al., 2011).
Een ander bestanddeel van de ECM zijn de adhesie proteïnen. Deze verschillen eveneens tussen de
afzonderlijke bacteriën. S. aureus heeft “biofilm-associated proteins” (Bap) die, via hun verankering in
de celwand en vermoedelijk de interactie met oppervlakte proteïnen op andere cellen, de cellen
binnen de biofilm samen houden. Cellen in de biofilm vormen daarboven ook pili en fimbriae,
noodzakelijk voor de adhesie aan andere cellen en oppervlakten. Een vergelijkbare rol vervullen de
lectine-bindende proteïnen, die aan koolhydraten binden (López et al., 2010).
Door de cellen binnen de biofilm worden oppervlakte-actieve substanties gesecreteerd, welke zowel
een adhesie-functie vervullen alsook antibacterieel en antifungaal werken. Een voorbeeld hiervan zijn
de rhamnolipiden van Pseudomonas aeruginosa, die bij de vorming van de biofilm, zijn verspreiding
en migratie van bacteriën op oppervlakten helpen (Flemming en Wingender, 2010).
Een belangrijk bestanddeel van de ECM is water. Door het hoog watergehalte is de biofilm zeer
resistent aan uitdroging, wat er voor zorgt dat de bacteriën hun specifieke eigenschappen ook in een
droge omgeving behouden (Flemming en Wingender, 2010).
De stabiliteit van de ECM wordt vooral door de exopolysacchariden bewerkstelligd. Ook de
aanwezigheid van anorganische ionen draagt er toe bij (Flemming en Wingender, 2010).
De dikte van een biofilm kan variëren tussen één enkele laag tot een opmerkelijke gemeenschap
(Archer et al., 2011). Ook in een biofilm uitgaande van één enkele cel kan een diversiteit aan
fenotypes optreden, gebaseerd op een verschil in genexpressie. Zo kunnen fenotypisch verschillend,
maar genotypisch identieke subpopulaties binnen een biofilm optreden (López et al., 2010). De
verschillen in genexpressie zijn te wijten aan het aanbod aan zuurstof, nutriënten en
elektronenacceptoren (Archer et al., 2011).
2.3 De levenscyclus
De levenscyclus van een biofilm bestaat uit verschillende stadia (Fig. 3). De eerste stap is de adhesie
uitgaande van één enkele bacterie aan een oppervlak. De adhesie gebeurt door middel van
verschillende krachten, afhankelijk van de afstand tussen de bacterie en het oppervlak. Initieel wordt
de bacterie door aspecifieke van der Waals krachten aan het oppervlak gebonden. Bij een afstand
tussen 10 en 20 nm komen er elektrostatische krachten bij. Tot en met deze stap is de binding tussen
bacterie en oppervlakte reversibel (Habash en Reid, 1999; Garnett en Matthews, 2012). Als de
10
afstand minder dan 1,5 nm is, wordt de binding irreversibel door middel van specifieke receptorgemedieërde, aan de celwand verankerde adhesiemolecules (Habash en Reid, 1999; Melchior et al.,
2006).
De volgende stap is het vermenigvuldigen van de cellen. Als reactie op prikkels door hun naburige
cellen treedt een verandering van hun fenotype op en beginnen de cellen macromolecules te
secreteren welke een aantal cellen in microkolonies samenhouden. Bij verdere groei van de
microkolonies worden door de cellen zelf de componenten van de EPS gesecreteerd. Deze zorgen
voor de intercellulaire adhesie binnen de biofilm en de verankering van de biofilm op het oppervlak. In
de driedimensionale biofilm ontstaan vervolgens, gemedieerd door dispersinen, aquaporines (Habash
en Reid, 1999; Garnett en Matthews, 2012).
Fig. 3: Schematische weergave van de levenscyclus van een biofilm. (1) Vrij zwemmende bacteriën (2) Adhesie aan een
oppervlak (3) Celdeling en vorming van microkolonies (4) Groei van kolonies en vorming van de ECM (5) Aanleg van
kanalen binnen de biofilm (6) Loskomen van cellen om een nieuwe habitat te vinden (uit Garnett en Matthews, 2012)
De finale fase in de levenscyclus is de uitbreiding van de biofilm, door middel van het loskomen en
verspreiden van afzonderlijke cellen of celclusters. De cellen kunnen zowel door mechanische
krachten losgetrokken worden alsook als gevolg van nutriëntentekort of te veel afvalstoffen loskomen
(Donlan, 2002; Cassat et al., 2007; Garnett en Matthews, 2012). Verder kunnen dochtercellen
spontaan afgestoten worden (Donlan, 2002). De losgekomen cellen verspreiden zich en adhereren
aan nieuwe oppervlakten om hier aanleiding te geven tot een nieuwe biofilm (Melchior et al., 2006;
Garnett en Matthews, 2012).
11
2.4 Regulatie van biofilmvorming
De vorming van biofilms wordt door intercellulaire communicatie geregeld. De cellen produceren
signalen die extracellulair accumuleren en als autoinducers fungeren. Vanaf een bepaalde densiteit
aan autoinducers worden signaalcascaden in gang gezet dewelke aanleiding geven tot specifieke
genexpressie. Dit gedragspatroon treedt bijgevolg enkel op bij een voldoende populatiegrootte en
signaaldensiteit. Deze vorm van regulatie wordt quorum sensing genoemd (Sifri, 2008; López et al.,
2010).
In andere species echter, wordt biofilmvorming door quorum sensing geïnhibeerd (López et al., 2010).
Biofilmvorming kan ook door andere stoffen beïnvloed worden. Daartoe behoren antibiotica,
pigmenten en siderophoren. Bij een subinhibitorische concentratie van bepaalde antibiotica worden
bacteriën tot biofilmvorming aangezet of ook de synthese van matrixcomponenten geïnduceerd
(López et al., 2010).
De groei van een biofilm wordt door verschillende mechanismen gereguleerd. De toegankelijkheid van
de cellen tot nutriënten is een bepalende factor. Ook andere invloeden zijn van belang zoals de pH, de
aanwezigheid van zuurstof, koolstofbronnen en de osmolariteit. De aanwezigheid van deze
noodzakelijke factoren wordt vanaf een bepaalde biofilmgrootte beperkt. In dit geval komt het tot de
laatste stap van de biofilmcyclus, het loskomen van cellen om te verspreiden en nieuwe niches te
bezetten (López et al., 2010; Garnett en Matthews, 2012).
2.5 Voordelen voor bacteriën in een biofilm
De vorming van een biofilm verhoogt de overlevingskans van een bacterie. In de eerste plaats is het
een vorm van verdediging. Bacteriën in biofilms zijn beschermd tegen de inwerking van het
immuunsysteem, doordat de ECM fagocytose en opsonisatie voorkomt. Ook tegenover de invloed van
radicalen, proteasen, detergentia en chlorine zijn de bacteriën in de biofilm beschermd (Watnick en
Kolter, 2000; Archer et al., 2011). De cellen in de biofilm vertonen een hogere mate van resistentie in
vergelijking met de afzonderlijk groeiende cellen van hetzelfde species (Melchior et al., 2006).
Biofilms worden ter hoogte van voordelige plaatsen gevormd en dit staat de bacteriën toe langdurig
binnen goede condities te overleven (Madigan en Martinko, 2006). Zoals het ook voor plankton het
geval is, worden in de extracellulaire matrix verschillende nutriënten opgeslagen (Archer et al., 2011).
Bovendien zijn de cellen in de biofilm tegenover ongunstige omgevingsfactoren beschermd (pH
fluctuaties, de blootstelling aan UV-licht, droogte en antimicrobiële agentia) (Garnett en Matthews,
2012). Biofilmvorming laat een goede communicatie en genetische uitwisseling toe tussen de cellen
doordat ze zich dicht bij elkaar bevinden. Er is een verhoogde mate aan conjugatie vast te stellen,
waardoor voordelige eigenschappen zoals antibioticaresistentie, virulentiefactoren en gunstige
overlevingsmechanismen tussen de bacteriën kunnen worden uitgewisseld (Watnick en Kolter, 2000;
Madigan en Martinko, 2006).
Biofilms kunnen voor sommige bacteriën ook de normale levenswijze in de natuur zijn (Madigan en
Martinko, 2006).
12
2.6 Antibiotica tolerantie en resistentie
De verhoogde resistentie tegenover antimicrobiële middelen van bacteriën in biofilms kan op
verschillende manieren verklaard worden.
Als gevolg van de verhoogde stress op de bacteriën, door bijvoorbeeld een verlaagd zuurstof- en
nutriëntengehalte, verlaagt het metabolisme van de cellen. Zowel de traag groeiende cellen alsook de
persistercellen, cellen in een soort slaaptoestand met een sterk verlaagd metabolisme, vertonen een
sterk verlaagde gevoeligheid tegenover bepaalde antimicrobiële stoffen (Melchior et al., 2006; López
et al., 2010; Archer et al., 2011). Voor deze antibiotica bestaat een relatie tussen groeisnelheid en
celdood. Andere antibiotica hebben wel een vermogen om bacteriën met een verlaagd metabolisme af
te doden, maar leveren voor snel delende cellen betere resultaten op (Melchior et al., 2006). Voor de
persistercellen wordt de verhoogde resistentie door een gewijzigde fysiologie en de synthese van
toxines verklaard (Melchior et al., 2006; López et al., 2010).
Een andere verklaring zou kunnen zijn dat binnen de biofilm een zuurstofgradiënt wordt opgebouwd,
welke de werking van bepaalde antibiotica inhibeert (Römling en Balsalobre, 2012).
Als laatste wordt de bescherming door de ECM voorgesteld. Deze belet de diffusie van kleine
molecules en ook van antimicrobiële stoffen en beschermt de cellen tegenover invloeden van buiten
de biofilm (López et al., 2010; Archer et al., 2011). Zowel de reactie met de ECM alsook de absorptie
van de antibiotica binnen de ECM worden hiervoor als verklaring gegeven. Er werd eveneens een
relatie geconstateerd tussen de dikte van de biofilm en de resistentie tegenover antibiotica (Melchior
et al., 2006).
2.7 Preventie en bestrijding
Voor de preventie en bestrijding van biofilms bestaan verschillende strategieën die inwerken op de
verschillende onderdelen van biofilms en hun vorming (Fig.4) (Francolini en Donelli, 2010).
De eerste stap in de vorming van de biofilm is de adhesie van cellen aan een oppervlak. Strategieën
die deze adhesie beletten, gaan biofilmvorming tegen. De eigenschappen van het oppervlak spelen bij
het adhesieproces een belangrijke rol, waarbij hydrofobiciteit en oppervlaktelading de belangrijkste
eigenschappen zijn. Coaten van het oppervlak met hydrofiele polymeren zoals hyaluronzuur en polyN-vinylpyrrolidone verhinderen de adhesie van bacteriën. Ook andere aspecifieke polymeren die antiadhesief werken zoals polymere sulfobetaine, methyl-cellulose, hydrogel- en heparinecoating vertonen
een duidelijke reductie in adhesie van bacteriën (Francolini en Donelli, 2010; Beloin et al., 2014).
Naast
de
aspecifieke
adhesie
bestaat
een
ander
aangrijpingspunt
in
de
specifieke
adhesiemechanismen. Er werd aangetoond dat suikeranalogen in competitie gaan met lectine van de
type I-fimbriae en zo adhesie aan het oppervlak beletten (Beloin et al., 2014). Vergelijkbaar is de
werking van peptiden die aan de pili van de bacteriën binden en zo het adhesieproces inhiberen
(Yang et al., 2012). Ook succesvol is de werking van koolwaterstoffen, die zowel een surfactantfunctie
uitoefenen alsook de binding van adhesines aan hun receptoren tegengaan. Verder bestaan
molecules die de synthese van specifieke adhesines tegenwerken (Beloin et al., 2014). Om een
adhesie te reduceren kan het oppervlak ook met antimicrobiële agentia gecoat worden (Francolini en
Donelli, 2010).
13
Een andere manier is het verstoren van quorum sensing, wat nodig is voor de biofilmvorming. Dit kan
door drie verschillende mechanismen worden bereikt. Ten eerste kan de signaalproductie worden
voorkomen door het enzym te inhiberen om een autoinducing peptide te vormen (Han en Lu, 2009). In
een tweede strategie worden de signaalmolecules door enzymen afgebroken. Het derde en best
onderzochte mechanisme bestaat in het voorkomen van de binding tussen signaalmolecule en
receptor. Dit kan bereikt worden door moleculeanalogen, welke met de signaalmolecules in competitie
gaan voor de receptoren zoals analogen van homosiderine lacton (Francolini en Donelli, 2010; Beloin
et al., 2014).
Ook door het verstoren van intracellulaire signaalcascaden kan biofilmvorming worden geblokkeerd. In
de ontwikkeling van een biofilm is het secundair messenger cyclic-di-GMP van groot belang. Zowel
stikstofmonoxide alsook sulfathiazole en azathioprine hebben een inhiberende werking op cyclic-diGMP getoond (Römling et al., 2014; Beloin et al., 2014).
Een ander aangrijpingspunt is de ECM. Zowel de polysacchariden alsook het eDNA zijn twee
substraten om de matrixstabiliteit en –structuur te verstoren. Zowel Dnase I alsook dispersin B
vertonen deze werking (Beloin et al., 2014). Behandeling met proteasen geeft bij biofilms met Listeria
monocytogenes goede resultaten en de chelatie van zink bij Staphlococcus stammen door hun
noodzakelijkheid voor de functie van adhesines (Yang et al., 2012).
Fig. 4: De stappen van biofilmvorming en mogelijke preventie- en afbraakstrategieën (naar Römling et.al., 2014)
Om een bestaande biofilm af te breken volstaat een gewone behandeling met antimicrobiële agentia
niet. Daarentegen werd aangetoond dat combinaties van synergistisch werkende antibiotica
werkzaam kunnen zijn tegenover de vorming van biofilms alsook tegenover bestaande biofilms
(Francolini en Donelli, 2010). Ook het gebruik van antibiotica in combinatie met quorum sensing
verstorende stoffen, met producten die de ECM destabiliseren of die de effluxpompen inhiberen,
werken goed tegen biofilms. Andere strategieën om de werking van antibiotica te verhogen bestaan
uit een combinatie met een bepaalde stroomsterkte, met ultrasone trillingen of met licht in combinatie
14
met een gevoeligheidsverhogende stof tegenover zichtbaar licht. Recent werd een nieuwe strategie
ontdekt waarbij nanopartikels gebruikt worden (Francolini en Donelli, 2010; Yang et al., 2012).
Een andere mogelijkheid om biofilms te voorkomen en te vernietigen is het gebruik van lytische fagen.
Een aantal fagen produceren enzymen die de polysacchariden van de ECM afbreken en tot celdood
leiden. Daarboven werd aangetoond dat het gebruik van fagen de activiteit van antibiotica kan
verhogen (Francolini en Donelli, 2010; Yang et al., 2012).
Een meer biologische aanpak bestaat uit het gebruik van bacteriën die stoffen produceren die de
biofilmvorming door andere bacteriën inhiberen. Een voorbeeld hiervan is de productie van surfactant
(Yang et al., 2012).
De voornaamste reden voor de hoge resistentie tegenover antibiotica is waarschijnlijk de
aanwezigheid van persistercellen. Om de vorming van persisters de beperken worden strategieën
onderzocht welke het effector molecule ppGpp, nodig voor de persistervorming, als substraat hebben.
Ook tegenover bestaande persistercellen worden strategieën ontwikkeld (Beloin et al., 2014).
3.
BIOFILMS GEVORMD DOOR S. AUREUS
3.1 Betekenis en voorkomen
Biofilm-geassocieerde infecties door S. aureus zijn van beduidend belang (Mack et al., 2004).
Redenen hiervoor zijn de uitzonderlijke eigenschap van S. aureus om aan het oppervlak van
medische instrumenten aan te hechten (Periasamy et al., 2012), het vermogen om een diversiteit van
weefsels te infecteren en hun lage gevoeligheid tegenover antibiotica (Mack et al., 2004). Biofilmgeassocieerde infecties worden meestal door staphylococcen veroorzaakt (Otto, 2008).
S. aureus biofilms leiden tot een groot aantal ziektes en zijn verantwoordelijk voor infecties op
medische instrumenten en orthopedische implantaten. Bij een infectie is het vervangen van het
voorwerp de enige manier om de biofilm te verwijderen. Door zijn hoge prevalentie in de mondholte
vormen S. aureus biofilms een risicofactor voor recidiverende paradontitis en peri-implantitis. Een
merendeel van de osteomyelitis gevallen zijn te wijten aan biofilms door S. aureus. Ook bij chronische
wondinfecties is S. aureus en zijn biofilm de belangrijkste oorzaak voor vertraagde wondheling. In
gevallen van chronische rhinosinusitis werd S. aureus herhaaldelijk geïsoleerd en er bestaat vaak een
samenhang met een ernstig ziekteverloop. Infecties van de hartklep geassocieerd met S. aureus
biofilms, treden het vaakst op bij mensen boven de 50 jaar en treffen meestal het linker hart. Deze
gevallen van endocarditis zijn geassocieerd met hoge morbiditeit en mortaliteit. Bepaalde ooginfecties
zoals conjunctivitis, keratitis en endophthalmitis zijn te wijten aan S. aureus biofilms en vooral MRSA
heeft daarbij een hoge prevalentie (Archer et al., 2011).
15
3.2 Samenstelling
De fenotypisch veranderde cellen van de S. aureus biofilm worden als small colony variant (SCV)
fenotype aangeduid en deze vertonen zowel in hun metabolisme alsook in de genregulatie verschillen
tegenover de niet-sessiele cellen (Mack et al., 2004).
De biofilm gevormd door S. aureus bestaat uit meerdere lagen bacteriën omgeven door een
slijmachtige glycocalyx gemengd met verschillende proteïnen en eDNA (Vergara-Irigaray et al., 2009;
Archer et al., 2011). Voor het grootste deel bestaat de glycocalyx uit poly-N-acetylglucosamine
(PNAG), ook benoemd als “polysaccharide intercellular adhesin” (PIA). PIA´s bestaan voor het
merendeel uit ß-1,6-gelinkte N-actelyglucosamine en voor de rest uit niet-geacetyleerde Dglucosaminyl, welke fosfaat en ester-gelinkt succinaat bevat (Archer et al., 2011). Andere onderdelen
van de biofilmmatrix zijn teichoïnezuren, “staphylococcal surface protein” (SSP-I), “clumping factor A”
(ClfA), “accumulation associated protein” (AAP), “biofilm-associated protein” (Bap) en eDNA (Melchior
et al., 2006; López et al., 2010). Ondanks hun hoge prevalentie in de biofilms is aangetoond dat PIA´s
niet noodzakelijk zijn voor biofilmvorming en er ook een PIA-onafhankelijke biofilmmatrix bestaat. In dit
geval zijn het adhesieve proteïnen die de taak van intercellulaire interacties overnemen. Proteïnen die
hiervoor instaan zijn “biofilm-associated proteins” (Bap´s), “S. aureus surface proteins” (SasG´s),
“fibronectin-binding proteins” (FnBPA en FnBPB), proteïne A en “accumulation associated protein”
(Aap) (Otto, 2008; Vergara-Irigaray et al., 2009; López et al., 2010). Spa en FnBP´s behoren tot de
MSCRAMM´s (López et al., 2010). De verschillende onderdelen van de biofilm zijn niet alle ubiquitair
bestanddeel van de biofilm, maar worden naargelang de omgevingsomstandigheden gereguleerd en
staan de bacteriën afwijkende vaardigheden toe (Vergara-Irigaray et al., 2009).
De biofilm bestaat voor twee derde uit metabool inactieve cellen. Alleen gebieden die een goede
nutriëntentoegankelijkheid en zuurstoftoegang hebben, behouden hun metabole activiteit. Het
biofilmoppervlak bestaat uit aërobe cellen, de rest van de cellen zijn naar een anaëroob metabolisme
overgeschakeld (López et al., 2010).
3.3 Moleculaire basis van de biofilm cyclus
Zoals hierboven reeds beschreven, gebeurt de vorming van een biofilm in verschillende fasen.
De adhesie van S. aureus aan een oppervlak wordt mogelijk gemaakt door de binding van
MSCRAMM´s aan matrixproteïnen, gekatalyseerd door sortasen. De binding tussen MSCRAMM´s en
het oppervlak van de bacterie is nog niet volledig opgehelderd, maar gebeurt ogenschijnlijk door
middel van autolysinen die noncovalent aan teichoïnezuren binden. Ook lipase GehD wordt
verondersteld een adhesieve functie te vervullen (Otto, 2008). MSCRAMM´s die in deze fase een rol
spelen zijn de volgende: “clumping factor A” (ClfA) en “clumping factor B” (ClfB), welke fibrinogeen
binden, de twee fibronectin bindende proteïnen FnBPA en FnBPB (Garnett en Matthews, 2012) en
“collagen-binding protein” (Cna) (Barbu et al., 2014). Door hun vermogen om ook aan serum proteïnen
te binden, maken FnBP het mogelijk aan medische instrumenten te hechten die door zulke proteïnen
omgeven zijn (Garnett en Matthews, 2012).
Tijdens het rijpingsproces van de biofilm worden twee onderdelen onderscheiden: de intercellulaire
interactie en de structurering binnen de ontwikkelde driedimensionale biofilm.
16
De intercellulaire interactie wordt bij S. aureus grotendeels door PIA´s bereikt. Van belang hierbij is de
deacetylatie van de N-acetylglucosamineketen van de PIA´s omdat deze zo een positieve lading
verkrijgen die het mogelijk maakt aan de negatief geladen celwand van andere staphylococcen vast te
hechten. Teichoïnezuren vormen het verankeringspunt voor de PIA´s op het celoppervlak. Zoals
hierboven beschreven, vervullen adhesieve proteïnen de functie van intercellulaire adhesie in een
PIA-onafhankelijke celadhesie. Het wordt aangenomen dat gecontroleerde celdood door het vrijkomen
van DNA ook een rol speelt in de structurering van de biofilm. Door zijn polyanionische karakter kan
DNA andere molecules binden en zo onderdelen van de matrix aan elkaar linken (Otto, 2008).
De structurering van de driedimensionale biofilm bestaat uit de vorming van met vocht gevulde holtes
en kanalen door gecontroleerde cellyse en celspreiding (Otto, 2008; Garnett en Matthews, 2012). Men
vermoedt dat een uiteenlopende expressie van PIA mede verantwoordelijk is voor de structurering in
S. aureus biofilms. Verder zijn er quorum sensing gecontroleerde oppervlakte peptides, de “phenolsoluble modulins” (PSM) die een invloed uitoefenen op biofilmstructurering. PSM zijn amphipatische,
α-helicale peptiden. PSM leiden tot verstoring van de niet-covalente krachten binnen de matrix en
derhalve tot de modificatie van de biofilmstructuur waardoor de vorming van kanalen mogelijk wordt
(Otto, 2008; Garnett en Matthews, 2012; Le et al., 2014). Men vermoedt eveneens dat naast de PSM
ook proteasen zoals aureolysine en nucleasen een rol spelen in het proces van structurering. In vivo
werd daarentegen aangetoond dat proteasen in deze stap geen functie vervullen (Otto, 2013).
Het loskomen van cellen uit de biofilm is noodzakelijk voor de verspreiding om derhalve nieuwe
plekken te koloniseren. Zoals reeds beschreven, gebeurt deze stap zowel door puur mechanische
krachten maar ook door het inhiberen van verdere biofilmgroei en door factoren die het loskomen van
cellen promoten. De PSM spelen in deze stap ook een belangrijke rol (Otto, 2008).
3.4 Quorum sensing
Zoals reeds besproken, is quorum sensing een mogelijkheid tot intercellulaire communicatie om
genexpressie op basis van de celdensiteit bij te sturen. Dit gebeurt door middel van de detectie van
een signaalmolecule, geproduceerd door de nabij liggende cellen. Bij S. aureus bestaat deze
molecule uit een gemodificeerd oligopeptide, het “autoinducing peptide” (AIP).
Het quorum sensing systeem van S. aureus wordt gecodeerd door de ´accessory gene regulator´
(agr). Er zijn twee operons, die door de P2 en P3 promotor gestuurd worden. De operons coderen
voor twee transcripten. P2 codeert voor RNAII en omvat agrBDCA. Deze zijn van belang bij de
productie en detectie van het AIP. AgrD is de precursor van AIP en wordt door het
membraangebonden AgrB verder omgezet tot AIP en buiten de cel getransporteerd. AgrA-AgrC vormt
een
twee-componenten
signaaltransductie
systeem.
AIP
bindt
heel
specifiek
op
het
membraangebonden AgrC, een histidine kinase die een sensorfunctie vervult. Bij voldoende
concentratie van AIP wordt na autofosforylatie van AgrC het fosfaat op AgrA overgedragen waardoor
als antwoord de transcriptie van RNAII en RNAIII volgt. De specifieke binding tussen AIP en AgrC stelt
zeker dat enkel cellen van de zelfde groep door het quorum sensing geactiveerd worden (Fig. 5a)
(Sifri, 2008; Solano et al., 2014).
P3 codeert voor RNAIII. Dit vervult een regulatoire functie en codeert bovendien voor δ-hemolysine.
RNAIII leidt ook tot verlaagde expressie van bepaalde adhesines zoals proteïne A en FnBP (Yarwood
et al., 2004; Sifri, 2008).
17
Het agr systeem heeft invloed op de biofilmvorming. Het werd aangetoond dat agr mutanten een
verhoogde biofilmproductie vertonen. Studies hebben een complex systeem ontdekt welk, gestuurd op
basis van agr, verantwoordelijk is voor een modificatie in de biofilmproductie. Naast de productie van
extracellulaire proteasen wordt ook deze van bepaalde matrixonderdelen gereguleerd. Bij een
activatie van het quorum sensing systeem wordt AgrA via fosforylatie geactiveerd waardoor de
expressie van verschillende genen wordt beïnvloed. Terwijl de synthese van de adhesines, proteïne A
en FnBP geïnhibeerd wordt, worden PSM en proteasen in verhoogde mate gesynthetiseerd. Verder
wordt door AgrA activatie de expressie van luxS uitgelokt. Via een positieve invloed op de expressie
van IcaR wordt de synthese van PIA onderdrukt (Fig. 5b) (Sifri, 2008; López et al., 2010; Solano et al.,
2014).
Quorum sensing heeft in S. aureus een negatieve invloed op biofilmvorming. Zowel de verhoogde
synthese van PSM en proteasen alsook de vermindering van adhesieve proteïnen begunstigen biofilm
afbraak (Solano et al., 2014). Het agr-systeem lijkt een belangrijke functie te vervullen in biofilms. Er
werd zelfs aangetoond dat een fout in RNAIII-productie betrokken kan zijn bij chronische infecties door
S. aureus biofilms. Een gebrek van het agr-systeem blijkt verder invloed te hebben op vancomycineresistentie (Sifri, 2008).
Vooral in gebieden naast het biofilmoppervlak vindt een sterke activatie van het agr systeem plaats.
Dit zijn ook die gebieden die in het loskomen van cellen betrokken zijn. Het wordt daarom vermoed dat
quorum sensing niet enkel voor het beperken van biofilmgroei nodig is, maar ook noodzakelijk is voor
het loskomen en verspreiden van cellen (Sifri, 2008).
Ook de eerste stappen van de biofilmvorming staan onder invloed van het agr systeem. Enkel bij een
inhibitie van quorum sensing is de adhesie van de kiemen aan een oppervlak mogelijk (Sifri, 2008;
López et al., 2010).
a
b
Fig. 5: (a) Schema van de regulatoire cascade van quorum sensing (b) Schematische weergave van biofilm dispersie
door quorum sensing (uit Solano et al., 2014)
18
3.5 Regulatie van biofilmvorming
Zoals hierboven beschreven, is PIA het belangrijkste exopolysaccharide van een S. aureus biofilm, dat
nodig is voor de adhesie aan andere cellen en oppervlakten en belangrijk is voor de structuur van de
biofilm. De synthese van PIA is afhankelijk van enzymen gecodeerd door het icaADBC locus. Het
genproduct van icaA is een transmembranair proteïne betrokken in de omzetting van UDP-Nacetylglucosamine tot PIA oligomeren. Het product van icaD is nodig voor een optimale werking van
icaA. Slechts door gemeenschappelijke werking door icaAD worden oligomeren met een lengte van
meer dan 20 aminozuren gevormd. Door genexpressie van icaC ontstaat een proteïne dat nodig is
voor de translocatie van het icaAD product buiten de cel. Het proteïne geëxprimeerd vanuit icaB is
gebonden aan het celoppervlak en heeft deacetylerende functie. Enkel door deze laatste stap bereikt
PIA het vermogen tot adhesie (O´Gara, 2007; Arciola et al., 2015).
Voor de ica-locus bestaat het fenomeen van fasen-variatie. Via een inactivatie van de icagenexpressie wordt de biofilmproductie gemodificeerd. Dit gebeurt op basis van expansie
respectievelijk contractie van een tetranucleotide tandem herhaling binnen het locus. Via deze twee
processen wordt de expressie van ica geïnhibeerd, wat leidt tot een PIA-negatief fenotype (Arciola et
al., 2015).
3.6 Gastheerreactie op infecties door S. aureus biofilms
Het is tot nu toe nog niet volledig opgehelderd hoe het immuunsysteem op biofilms door S. aureus
reageert. Bij een gewone infectie met niet-sessiele S. aureus reageert het immuunsysteem vooral met
een activatie en het aantrekken van neutrofielen en macrofagen. Neutrofielen oefenen hun werking uit
via defensines, cathelicidines en lysozyme. Macrofagen produceren naast reactieve zuurstofradicalen
en stikstof vooral pro-inflammatoire cytokines. De fagocytose door macrofagen speelt verder een
belangrijke rol in de immuunrespons. Ook de activatie van het complementsysteem vervult een
beduidende functie in de immuunrespons tegen S. aureus (Scherr et al., 2014).
Bij een infectie met biofilms is deze immuunrespons niet voldoende. Biofilms door S. aureus leiden tot
immuno-evasie. Toch zijn er onderdelen van de immuunrespons die beschermend werken (Scherr et
al., 2014).
In een vroeg stadium van de infectie triggert de infectie met S. aureus biofilms de pro-inflammatoire
cytokines. Deze zijn in dit geval niet altijd goed werkzaam doordat ze de complementcascade in gang
zetten, tegen welke de kiemen intussen niet gevoelig zijn. Bovendien produceert S. aureus een
inhibitor voor de complementcascade, de staphylococcal complement inhibitor (SCIN), zodat
fagocytose door neutrofielen geïnhibeerd wordt (Archer et al., 2011). Aan Th17 cellen wordt een
beschermende functie toegeschreven. De productie van IL-17 blijkt bescherming te bieden tegen
biofilm-gerelateerde infecties (Gil et al., 2013).
In plaats van een beschermende rol vervult het immuunsysteem in het geval van infectie met biofilms
veeleer een destructieve functie waardoor een pro-fibrotische respons optreedt en de persistentie van
de staphylococcen ten goede komt (Scherr et al., 2014).
19
Het wordt bovendien vermoed dat inflammatoire mediatoren biofilmvorming ondersteunen en aldus de
afbraak van biofilms tegenwerken (Archer et al., 2011).
3.7 Bestrijding en preventie van S. aureus biofilms
Antibiotica hebben weinig effect van zodra een biofilm is gevormd. Preventie van de vorming is een
belangrijk aangrijpingspunt in de bestrijding van biofilms. Antibiotica zijn enkel zinvol wanneer ze
gebruikt worden in combinatie met andere therapieën. Om een biofilm te bestrijden is in veel gevallen
een chirurgische aanpak vereist. Voor aandoeningen zoals osteomyelitis, wordt veel gebruik gemaakt
van ß-lactam antibiotica hoewel ze geen post-antibiotische werking vertonen. Fluoroquinolones en
aminoglycosiden bezitten
daarentegen
wel een
post-antibiotische
werking, maar
vertonen
dosisafhankelijke toxische nevenwerkingen. Bij gentamicine wordt EDTA toegevoegd en wordt ook
een bestrijding van persistercellen bereikt. Glycopeptiden hebben een tijdsafhankelijke werking. Voor
biofilminfecties met MRSA stammen is het gebruik van vancomycine aangewezen. Door zijn effect
tegenover persistercellen en weinig nevenwerkingen is het gebruik van rifampicine een goede optie
voor spier- en skeletaandoeningen maar het moet in combinatie met een ander, tegen S. aureus
werkzaam antibioticum, gebruikt worden om resistentie te voorkomen (Archer et al., 2011; Garnett en
Matthews, 2012; Beloin et al., 2014). Om de cellen binnen de biofilm even vatbaar te maken voor
antibiotica als niet-sessiele cellen kan het RNAIII-inhiberende peptide (RIP) gebruikt worden. Het
werkt inhiberend op quorum sensing in en wordt succesvol in de bestrijding van biofilm-infecties op
medische instrumenten aangewend (Francolini en Donelli, 2010).
Preventie van biofilmvorming op geïmplanteerde medische instrumenten wordt bereikt door het
integreren van antimicrobiële stoffen. Op deze manier wordt een snelle vrijstelling van hoge
concentraties antibioticum lokaal mogelijk gemaakt (Archer et al., 2011). Preventie tegen de adhesie
van bacteriële cellen op oppervlakten kan bereikt worden door het aanbrengen van antimicrobiële
peptiden, maar heeft bij S. aureus weinig succes (Otto, 2008; Garnett en Matthews, 2012).
Daarentegen is het gebruik van verschillende ester- of koolwaterstof-houdende polymeren op
oppervlakten wel nuttig. Het coaten van veneuze katheters met methyl-cellulose is eveneens nuttig
(Beloin et al., 2014). Andere antimicrobiële stoffen zoals nanosilver, cytokines, stikstof en fagen zijn al
in gebruik, maar worden nog op hun werkzaamheid tegenover S. aureus biofilms onderzocht (Archer
et al., 2011). Er bestaan D-aminozuren die via integratie in de celwand het vrijstellen van amyloïd
TasA uit de matrix uitlokken. Ze voorkomen zo de vorming van biofilms en geven aanleiding tot hun
afbraak. Het quorum sensing systeem met zijn autoinducing factor vormt een negatieve regulator van
biofilmvorming (Garnett en Matthews, 2012).
Om de matrix van de biofilm te verstoren kan gebruik gemaakt worden van DnaseI of DispersinB, door
welke twee van de hoofdcomponenten van de matrix, exopolysacchariden en eDNA, worden
afgebroken (Beloin et al., 2014).
Een grote uitdaging bestaat uit de ontwikkeling van vaccins. Er bestaan twee mogelijke doelwitten: de
bacteriën zelf en onderdelen van de biofilmmatrix. Door het decoderen van het genoom is een
beduidende bijdrage geleverd om geschikte antigenen te detecteren. Reeds ontwikkelde vaccins
tegen PIA en FnBP´s waren succesvol in diermodellen, maar moeten nog verder getest worden op
hun werkzaamheid in de natuurlijke gastheren. Problematisch is het niet ubiquitair voorkomen van
PIA-expressie in stammen van S. aureus. Ook de fasen-variatie is een hindernis. De ontwikkeling van
20
vaccins, werkzaam tegenover biofilms, is over het algemeen ingewikkeld doordat de cellen binnen de
biofilm een uiteenlopende fysiologie vertonen en zowel een laag metabolisme alsook weinig celdeling
vertonen (Otto, 2008; Archer et al., 2011).
Een andere techniek is het opstellen van een proteoom profiel. Hierbij wordt het geheel aan proteïnen
naargelang de omgevingsomstandigheden bepaald. Op basis daarvan worden oppervlaktegeassocieerde proteïnen geïdentificeerd die op hun werkzaamheid als antigen worden getest (Archer
et al., 2011).
Desondanks de vooruitgang is de ontwikkeling van vaccins nog steeds een uitdaging en vereist verder
onderzoek. Zowel de biofilmvorming in vivo als de interactie met het immuunsysteem vergen verder
inzicht om adequate vaccins te ontwikkelen (Archer et al., 2011).
21
BESPREKING
Het is duidelijk waarom er recent veel onderzoek plaats vindt met betrekking tot S. aureus en zijn
biofilms. Nog steeds is dit één van de belangrijkste nosocomiale kiemen en door zijn hoge prevalentie
en hoge tolerantie tegenover antibiotica is er nood om erop in te grijpen. Zoals hierboven beschreven,
heeft biofilmvorming door S. aureus immense gevolgen. Hoewel het onderzoek naar deze biofilms al
veel resultaten heeft opgeleverd, bestaat er nog steeds veel onduidelijkheid. Het onderzoek dat tot nu
toe heeft plaats gevonden, heeft zijn beperkingen. De bevindingen van het in vitro onderzoek zijn niet
altijd te extrapoleren naar de situatie in vivo. Het is mogelijk dat er structurele verschillen bestaan
tussen de biofilm in vitro en in vivo. Ook ontbreken bij de in vitro situatie factoren, die in vivo wellicht
invloed uitoefenen op de vorming van de biofilm en zijn regulatie (Beloin et al., 2014).
Door het decoderen van het genoom is reeds een belangrijke stap gedaan, die nieuwe opties biedt
wat betreft het onderzoek. In de laatste jaren zijn er nieuwe inzichten verkregen in het mechanisme en
de regulatie van biofilmvorming, zoals de rol van het ica operon en PIA hierbij. Maar toch is hun
regulatie nog altijd niet volledig opgehelderd en vereist verder onderzoek. PIA vormt een belangrijk
doelwit wat betreft de preventie en behandeling, door zijn functie als voornaamste bestanddeel van de
ECM bij de meeste stammen. Ook de afzonderlijke stappen van de ECM-productie vereisen nog
verder onderzoek (López et al., 2010; Archer et al., 2011).
Wat de PIA-onafhankelijke biofilmvorming betreft, bestaat er reeds veel onderzoek. Maar hier blijft de
vraag of er nog andere proteïnen betrokken zijn dan deze die reeds ontdekt zijn (Otto, 2008; López et
al., 2010).
Over het algemeen vormt de heterogeniteit binnen de biofilm een uitdaging. De verschillen in proteïne
expressie vereisen een therapie met verschillende uitgangspunten.
Wat betreft antibioticatherapie worden er, afhankelijk van de infectie, verschillende producten gebruikt.
Voor de behandeling van osteomyelitis wordt vooral gebruik gemaakt van ß-lactam antibiotica, zoals
penicilline en oxacilline. Voor de behandeling van infecties met methicilline-resistente staphylococcen
is vancomycine door de lage graad van resistentie de eerste keuze. Door zijn vermogen om
persistercellen af te doden, wordt rifampicine, in combinatie met een ander antibioticum, voor infecties
van het bewegingsapparaat toegepast. Fluoroquinolones en aminoglycosiden vertonen een hogere
toxiciteit. Om deze reden worden deze antibiotica enkel gebruikt indien er geen andere alternatieven
zijn die even effectief en minder toxisch zijn.
Voor bestaande biofilms is de behandeling met uitsluitend antibiotica ontoereikend. Zoals besproken
bestaan er verschillende manieren van aanpak. Er bestaan zowel therapieën die in combinatie met
antibiotica worden toegepast alsook alleenstaande therapieën onafhankelijk van antibiotica (Archer et
al., 2011).
Voor de ontwikkeling van vaccins is het van belang om celwand-geassocieerde proteïnen te
identificeren die als antigen geschikt zijn. De uiteenlopende fysiologie en de diverse proteïne
expressie binnen de biofilm bemoeilijken de vooruitgang. Een alternatieve benadering voor preventie
en therapie is de modulatie van het immuunsysteem van de gastheer. Het doel daarbij is, een
verbeterde immuunrespons te induceren om biofilminfecties door S. aureus effectiever tegen te gaan
(Archer et al., 2011).
Als andere methode zou van het quorum sensing systeem kunnen gebruik gemaakt worden. In S.
aureus heeft quorum sensing een negatieve invloed op verdere biofilmgroei. Het doel zou kunnen zijn
22
om molecules te ontwikkelen die de signaalmolecules van het quorum sensing systeem nabootsen
(Solano et al., 2014).
De biofilms van S. aureus zijn van groot belang bij het gebruik van medische instrumenten en
implantaten. Hierbij zou de focus kunnen gelegd worden op de ontwikkeling van nieuwe materialen,
welke resistent zijn tegenover kolonisatie. Ook een snellere detectie van contaminatie van materialen
zou helpen om infecties te vermijden (Francolini en Donelli, 2010).
23
REFERENTIELIJST
1 Archer, N. K., Mazaitis, M.J., Costerton, J.W., Leid, J.G., Powers, M.E., Shirtliff, M.E. (2011).
Staphylococcus aureus biofilms, properties, regulation and roles in human diseases. Virulence 2(5),
445-459
2 Arciola, C. R., Campoccia, D., Ravaioli, S., Montanaro, L. (2015). Polysaccharide intercellular
adhesin in biofilm: structural and regulatory aspects. Frontiers in cellular and infection microbiology
5(7)
3 Baird-Parker, A.C. (1974). The basis for the present classification of Staphylococci and Micrococci
Annals of the New York academy of science 236, 7-14
4 Bannerman, D.D., Paape, M.J., Lee, J.-W., Zhao, X., Hope, J.C., Rainard, P. (2004). Escherichia
coli and Staphylococcus aureus elicit differential innate immune responses following intramammary
infection. Clinical and diagnostic laboratory immunology 11(3), 463-472
5 Barbu, E. M., Mackenzie, C., Foster, T. J., Höök, M. (2014). SdrC induces staphylococcal biofilm
formation through a homophilic interaction. Molecular Microbiology 94(1), 172-185
6 Baron, S. (1996). Medical microbiology. 4. Ed., University of Texas medical branch press,
Galveston, Chapter 12
7 Bartlett, A.H., Hulten, K.G. (2010). Staphylococcus aureus pathogenesis; secretion systems,
adhesins and invasins. Pediatric infectious diseases journal 29(9), 860-861
8 Beloin, C., Renard, S., Ghigo, J.-M., Lebeaux, D. (2014). Novel approaches to combat bacterial
biofilms. Current opinion in pharmacology 18, 61-68
9 Berube, B.J., Bubeck Wardenburg, J. (2013). Staphylococcus aureus α-toxin: nearly a century of
intrigue. Toxins 5(6), 1140-1166
10 Bradley, B.H., Cunningham, M. (2013). Biofilms in chronic wounds and the potential role of
negative pressure wound therapy: an integrative review. Journal of wound, ostomy, and continence
nursing: official publication of the wound, ostomy and continence nurses society (WOCN) 40(2), 143149
11 Carter, G.R., Wise, D.J. (2004). Essentials of veterinary bacteriology and mycology. 6. Ed., Iowa
State Press, Iowa, p. 193
12 Cassat, J.E., Lee, C.Y., Smeltzer, M.S. (2007). Investigation of biofilm formation in clinical isolates
of Staphylococcus aureus. Methods in molecular biology 391, 127-144
13 Cramton, S.E., Gerke, C., Schnell, N.F., Nichols, W.W., Götz, F. (1999). The intercellulair adhesion
(ica) locus is present in Staphylococcus aureus and is required for biofilm formation. Infection and
immunity 67(10), 5427-5433
24
14 Derycke, L., Pérez-Novo, C., Van Crombruggen, K., Corriveau, M.-N., Bachert, C. (2010).
Staphylococcus aureus and chronic airway disease. WAO Journal 3, 223-228
15 Donelli, G. (2015). Biofilm-based healthcare-associated infections. 11. Ed., Springer, Rom, p. 131
16 Donlan, R.M. (2002). Biofilms: microbial life on surfaces. Emerging infectious diseases 8(9), 881890
17 Falugi, F., Kim, H.K., Missiakas, D.M., Schneewind, O. (2013). Role of protein A in the evasion of
host adaptive immune responses by Staphylococus aureus.mBio 4(5)
18 Flemming, H.-C., Wingender, J. (2010). The biofilm matrix. Nature reviews.Microbiology 8(9), 623633
19 Foster, T.J., Höök, M. (1998). Surface protein adhesins of Staphylococcus aureus. Trends in
microbiology 6(12), 484-488
20 Fournier, B., Klier, A. (2004). Protein A gene expression is regulated by DNA supercoiling which is
modified by the ArlS-ArlR two-component system of Staphylococcus aureus. Microbiology 150, 38073819
21 Francolini, I., Donelli, G. (2010). Prevention and control of biofilm-based medical-device-related
infections. FEMS, Immunology&medical microbiology 59(3), 227-238
22 Garnett, J.A., Matthews, S. (2012). Interactions in bacterial biofilm development: a structural
perspective.Current protein & peptide science 13(8), 739-755
23 Gessner, C. (2012). Killerkeim schaltet die leukos aus. Internetreferentie: http://www.medicaltribune.de/home/news/artikeldetail/killerkeim-schaltet-die-leukos-aus.html
(geconsulteerd
op
14.3.2015)
24 Gil, C., Solano, C., Burgui, S., Latasa, C., García, B., Toledo-Arana, A., Lasa, I., Valle, J. (2013).
Biofilm matrix exoproteins induce a protective immune response against Staphylococcus aureus
biofilm infection. Infection and immunity 82(3), 1017-1029
25 Habash, M., Reid, G. (1999). Microbial biofilms: their development and significance for medical
device-related infections. Journal of clinical pharmacology 39, 887-898
26 Haesebrouck, F., Van Immerseel, F., Hermans, K., Martel, A., Ducatelle, R., Pasmans, F. (2007).
Biofilms: Betekenis voor de behandeling en bestrijding van bacteriële infecties bij huisdieren. Vlaams
diergeneeskundig tijdschrift 76, 331-336
27 Han, X., Lu, C. (2009). Biological activity and identication of a peptide inhibitor of LuxS from
Streptococcus suis serotype 2. FEMS Microbiology Letters 294, 16-23
28 Krakauer, T., Stiles, B.G. (2013). The staphylococcal enterotoxin (SE) family: SEB and siblings.
Virulence 4(8), 759-773
25
29 Le, K. Y., Dastgheyb, S., Ho, T. V., Otto, M. (2014). Molecular determinants of staphylococcal
biofilm dispersal and structuring. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology 4(167)
30 Le Loir, Y., Baron, F., Gautier, M. (2003). Staphylococcus aureus and food poisoning. Genetics and
molecular research 2(1), 63-76
31 López, D., Vlamakis, H., Kolter, R. (2010). Biofilms. Cold spring harbor perspect biology 2(7)
32 Mack, D., Becker, P., Chatterjee, I., Dobinsky, S., Knobloch, J. K.-M., Peters, G., Rohde, H.,
Herrmann, M. (2004). Mechanism of biofilm formation in Staphylococcus epidermis and
Staphylococcus aureus: functional molecules, regulatory circuits, and adaptive responses.
International Journal of Medical Microbiology 294, 203-212
33 Madigan, M.T., Martinko, J.M. (2006). Brock Mikrobiologie. 11. Ed., Pearson Studium, München, p.
421-422, p. 989-990
34 McAdow, M., Missiakas, D.M., Schneewind, O. (2012). Staphylococcus aureus secretes coagulase
and von Willebrand factor binding protein of modify the coagualtion cascade and establish host
infections. Journal of innate immunity 4(2), 141-148
35 Melchior, M.B., Vaarkamp, H., Fink-Gremmels, J. (2006). Biofilms: a role in recurrent mastitis
infections? The Veterinary Journal 171, 398-407
36 Montanaro, L., Poggi, A., Visai, L., Ravaioli, S., Campoccia, D., Speziale, P., Arciola, C.R. (2011).
Extracellulair DNA in biofilms. International Journal of Artificial Organs 34(9), 824-831
37 Murray, P.R., Baron, E.J., Jorgensen, J.H., Landry, M.L., Pfaller, M.A. (2007). Manual of clinical
microbiology. 9.Ed., ASM Press, Washington, p.390
38 O´Gara, J. P. (2007). Ica and beyond: biofilm mechanism and regulation in Staphylococcus
epidermis and Staphylococcus aureus. FEMS microbiology letters 270, 179-188
39 Olson, M.E., Ceri, H., Morck, D.W., Buret, A.G., Read, R.R. (2002). Biofilm bacteria: formation and
comparative susceptibility to antibiotics.The canadian journal of research 66, 86-92
40 Ortega, E., Abriouel, H., Lucas, R., Gálvez, A. (2010). Multiple roles of Staphylococus aureus
enterotoxins: pathogenicity, superantigenic activity, and correlation to antibiotic resistance. Toxins
2(8), 2117-2131,
41 Otto, M. (2008). Staphylococcal biofilms. Current topics in microbiology and immunology 322, 207223
42 Otto, M. (2013). Staphylococcal infections: mechanisms of biofilm maturation and detachment as
critical determinants of pathogenicity. Annual Review of Medicine 64, 175-188
43 Otto, M. (2014). Staphylococcus aureus toxins. Current opinion in microbiology 17, 32-37
26
44 Pantosti, A., Sanchini, A., Monaco, M. (2007). Mechanism of antibiotic resistance in
Staphylococcus aureus. Future micobiology 2(3), 323-334
45 Pauli, N.T., Keun Kim, H., Falugi, F., Huang, M., Dulac, J., Henry Dunand, C., Zheng, N.-Y., Kaur,
K., Andrews, S.F., Huang, Y., DeDent, A., Frank, K.M., Charnot-Katsikas, A., Schneeweind, O.,
Wilson, P.C. (2014). Staphylococcus aureus infection induces protein A–mediated immune evasion in
humans. The journal of experimental medicine 211(12)
46 Periasamy, S., Joo, H.-S., Duong, A. C., Bach, T.-H. L., Tan, V. Y., Chatterjee, S. S., Cheung, G.
Y. C., Otto, M. (2012). How Staphylococcus aureus biofilms develop their characteristic structure.
PNAS 109(4), 1281-1286
47 Pinchuk, I.V., Beswick, E.J., Reyes, V.E. (2010). Staphylococcal enterotoxins. Toxins 2(8), 21772197
48 Quinn, P.J., Markey, B.K., Leonard, F.C., Fitzpatrick, E.S., Fanning, S., Hartigan, P.J. (2011).
Veterinary microbiology and microbial disease. 2. Ed., Wiley-Blackwell, Iowa, p.179-186
49 Rit, K. (2014). A case report of small colony variant of Staphylococcus aureus isolated from a
patient with chronic oesteomyelitis in a tertiary care hospital of eastern India. Advances biomedical
research 3(32)
50 Römling, U., Balsalobre, C. (2012). Biofilm infections, their resilience to therapy and innovative
treatment strategies. Journal of internal medicine 272(6), 541-561
51 Römling, U., Kjelleberg, S., Normark, S., Nyman, L., Uhlin, B.E., Åkerlund, B. (2014). Microbial
biofilm formation: a need to act. Journal of internal medicine 276(2), 98-110
52 Scherr, T. D., Heim, C. E., Morrison, J. M. , Kielian, T. (2014). Hiding in plain sight: interplay
between staphylococcal biofilms and host immunity. Frontiers in immunology 5(37)
53 Shin, K., Yun, Y., Yi, S., Lee, H.G., Cho, J.-C., Suh, K.-D., Lee, J., Park, J. (2013). Biofilm-forming
ability of Staphylococcus aureus strains isolated from human skin. Journal of Dermatological Science,
71, 130-137
54 Sifri, C. D. (2008). Quorum Sensing: Bacteria Talk Sense. Clincal infectious diseases 47(8), 10701076
55 Solano, C., Echeverz, M., Lasa, I. (2014). Biofilm dispersion and qurorum sensing. Current opinion
in microbiology 18, 96-104
56 Toledo-Arana, A., Merino, N., Vergara-Irigaray, M., Débarbouillé, M., Penadés, J.R., Lasa, I.
(2005). Staphylococcus aureus develops an alternative ica-independent biofilm in the absence oft he
arlRS two-component system. Journal of bacteriology 187(15), 5318-5329
27
57 Vandecandelaere, I., Depuydt, P., Nelis, H.J., Coenye, T. (2014). Protease production by
Staphylococcus epidermis and its effect on Staphylococcus aureus biofilms.Pathogens en Disease,
70, 321-331
58 Vanhommerig, E., Moons, P., Pirici, D., Lammens, C., Hernalsteens, J.-P., De Greve, H., KumarSingh, S., Goossens, H., Malhotra-Kumar, S. (2014). Comparison of biofilm formation between major
clonal lineages of methicillin resistant Staphlococcus aureus. Plos one 9(8)
59 Vergara-Irigaray, M., Valle, J., Merino, N., Latasa, C., García, B., de loz Mozos, I.R., Solano, C,
Toledo-Arana, A., Penadés, J.R., Lasa, I. (2009). Relevant role of fibronectin-binding proteins in
Staphylococcus aureus biofilm-associated foreign-body infections. Infection and immunity 77(9), 39783991
60 Watnick, P., Kolter, R. (2000). Biofilm, city of microbes. Journal of bacteriology 182(10), 2675-2679
61 Yang, L., Liu, Y., Wu, H., Song, Z., Høiby, N., Molin, S., Givskov, M. (2012). Combating biofilms.
FEMS Immunology and medical microbiology 65(2), 146-157
62 Yarwood, J.M., Bartels, D.J., Volper, E.M., Greenberg, E.P. (2004). Quorum sensing in
Staphylococcus aureus biofilms. Journal of bacteriology 186(6), 1838-1850
28