Bachelor proef Voorbereiding van Next Generation Sequencing van

Bachelor proef
Voorbereiding van Next Generation Sequencing
van mtDNA: Sanger sequencing van mt tRNA Leu
en Lys genen van DNA stalen.
Centrum Medische Genetica UZ Brussel
Laarbeeklaan 101, 1090 Brussel
Prof. Sara Seneca, PhD Molecular Geneticist
Elke Coeman
Departement GEZ-LA
Bachelor Biomedische Laboratoriumtechnologie
Afstudeerrichting Farmaceutische en Biologische
Laboratoriumtechnologie
2013-2014
Bachelor proef
Voorbereiding van Next Generation Sequencing
van mtDNA: Sanger sequencing van mt tRNA Leu
en Lys genen van DNA stalen.
Centrum Medische Genetica UZ Brussel
Laarbeeklaan 101, 1090 Brussel
Prof. Sara Seneca, PhD Molecular Geneticist
Elke Coeman
Departement GEZ-LA
Bachelor Biomedische Laboratoriumtechnologie
Afstudeerrichting Farmaceutische en Biologische
Laboratoriumtechnologie
2013-2014
Voorwoord
Beste lezers,
Deze bacherlorproef is geschreven met het oog op het behalen van een bachelor
Farmaceutische en Biologische laboratoriumtechnieken aan de Erasmus Hogeschool Brussel.
Met dit voorwoord wil ik de mensen van het Centrum Medische Genetica van UZ Brussel
bedanken die mee een bijdrage geleverd hebben bij de realisatie van mijn thesis.
In de eerste plaats wil ik hiermee mijn promotor Sara Seneca bedanken voor de raad en
nodige begeleiding bij het schrijven van mijn thesis.
Daarnaast wil ik ook al de laboranten in het bureau bedanken die mij direct opgenomen
hebben in hun midden en mij gedurende de volledige stage begeleid en opgeleid hebben.
Bedankt An en Ingrid voor de nodige opleidingen en hulp bij het 'sequencen'.
Dan wil ik ook Mia bedanken voor de nodige informatie over DGGE en het laten meevolgen
van de experimenten.
Ben, Bedankt voor de inleiding tot de wondere wereld van Next Generation Sequencing.
Als laatste wil ik nog mijn dank betuigen aan mijn ouders, die mij steeds gesteund hebben en
deze studies mogelijk gemaakt hebben.
Veel Leesplezier,
Elke Coeman
Organigram
Diensthoofd
Centrum voor Medische
Genetica
Administratieve
coördinatie
M. Cuvas
Voorzitter REGE
onderzoeksgroep
Karen Sermon
Stamcel labo
CRG
Kliniek
Laboratorium
Andere
Raadplegingen
Kwaliteits
coördinator
Labocoördinator
Kwaliteits
functionaris
Secretariaat Kliniek
Secretariaat labo:
Hoofdsecretaresse
PGD coördinatie
NGS platform
Secretaresse
1 en 2
Research
Laboranten
Staalbeheer:
Hoofdlaborant
Pschychosociaal
Laboranten
Biochemie:
Weternschappelijk
Medewerker 1
PGD:
Wetenschappelijk
Medewerker
DNA:
Wetenschappelijk
Medewerker 3
Cytogenetica:
Wetenschappelijk
Medewerker 2
Wetenschappelijk
Medewerker
Sequencing 1 en 10
Laboranten
Student: Elke Coeman
Wetenschappelijk
Medewerker
Analyse 1 en 10
Inhoudsopgave
Voorwoord ....................................................................................................................... 4
Organigram ...................................................................................................................... 5
Inhoudsopgave ................................................................................................................. 6
Lijst van Afkortingen ......................................................................................................... 8
Lijst van Figuren en Tabellen ........................................................................................... 10
Samenvatting ................................................................................................................. 11
Abstract .......................................................................................................................... 12
Inleiding ......................................................................................................................... 13
Literatuuronderzoek ....................................................................................................... 15
Mitochondriaal DNA? ............................................................................................................... 15
Mitochondriën ............................................................................................................................................ 16
Oxidatieve phosphorylatie keten(OXPHOS)....................................................................................... 18
Mitochondriale DNA Mutaties ................................................................................................. 18
Nomenclatuur ............................................................................................................................................. 20
Voorkomende Mitochondriale aandoeningen ......................................................................... 21
Behandeling ................................................................................................................................................. 22
MELAS ........................................................................................................................................................... 23
MERRF ........................................................................................................................................................... 25
LHON.............................................................................................................................................................. 27
Syndroom van Leigh .................................................................................................................................. 29
NARP .............................................................................................................................................................. 30
Screeningstesten voor Mitochondriale Afwijkingen ................................................................. 31
PCR ................................................................................................................................................................. 31
DGGE.............................................................................................................................................................. 34
Sanger Sequencing .................................................................................................................................... 37
NGS: Next Generation Sequencing ....................................................................................................... 40
Staalbereiding van DNA uit Bloed en Weefsel ......................................................................... 42
DNA bereiding uit Leukocyten ............................................................................................................... 42
DNA extractie uit fibroblasten (Huidbiopt), spierweefsel en urine. ........................................... 43
6
Experimenten ................................................................................................................. 46
PCR............................................................................................................................................ 47
Materiaal en methoden ........................................................................................................................... 47
Microchip elektroforese (Calliper) ............................................................................................ 49
Materiaal en methoden ........................................................................................................................... 49
Kolomzuivering ......................................................................................................................... 51
Materiaal en methoden ........................................................................................................................... 51
Bigdye Cycle Sequencing .......................................................................................................... 52
Materiaal en methoden ........................................................................................................................... 52
Xterminator/ Ethanol/EDTA/Natriumacetaat precipitatie ...................................................... 53
Materiaal en methoden Xterminator .................................................................................................. 53
Materiaal en methoden Ethanol/EDTA/Natriumacetaat precipitatie ....................................... 53
Sequencing + Analyse ............................................................................................................... 55
Materiaal en methoden ........................................................................................................................... 55
Resultaten................................................................................................................................. 56
Sanger Sequencing .................................................................................................................................... 56
Resultaat addendum: Next Generation Sequencing ....................................................................... 57
Discussie ................................................................................................................................... 59
Besluit ............................................................................................................................ 60
Referenties ..................................................................................................................... 61
Bijlagen .......................................................................................................................... 65
DNA fragmenten MERRF/MELAS met bijhorende primers + mutatie ..................................... 66
MERRF ........................................................................................................................................................... 66
MELAS ........................................................................................................................................................... 66
Voorbeeld controle van PCR fragmenten met microchip elektroforese. .................................. 67
Voorbeeld electroferogram van MERRF fragment – forward met een normaal patroon. ...... 68
Voorbeeld electroferogram van MERRF fragment –reverse met een normaal patroon. ........ 69
Voorbeeld electroferogram van MELAS fragment – forward met een normaal patroon. ....... 70
Voorbeeld electroferogram van MELAS fragment – reverse met een normaal patroon. ........ 71
7
Lijst van Afkortingen
A
ADP
ATP
bp
C
DGGE
ddATP
ddCTP
ddGTP
ddNTP
ddTTP
DNA
dNTP
EDTA
EtOH
FADH2
G
gDNA
HCl
HGVS
Leu
LHON
LOA
LS
Lys
MELAS
MERRF
MILS
mM
MPS
mtDNA
NaAC
NADH
NARP
NGS
NTC
OXPHOS
PCR
rCRS
RNA
rRNA
adenine
adenosinedifosfaat
adenosinetrifosfaat
basenparen
cytosine
denaturating gradient gel electroforese
dideoxyadenosine trifosfaat
dideoxycytidine trifosfaat
dideoxyguanosine trifosfaat
dideoxynucleotide trifosfaat
dideoxythymidine trifosfaat
deoxyribonucleïnezuur
deoxynucleotide
ethyleendiaminotetra-azijnzuur
ethanol
flavine adenine dinucleotide (onder gereduceerde vorm)
guanine
genomisch DNA
waterstofchloride
Human Genome Variation Society
leucine
Leber hereditary optic neuropathy
Leber’s opticus atrofie
Leigh Syndroom
lysine
Mitochondrial Encephalomyopathy with Lactic Acidosis and Stroke-like
episodes.
Myoclonic Epilepsy with Ragged-Red Fibers
Maternally Inherited Leigh Syndrome
mili molair, mmol/l
Massive Parallel Sequencing
mitochondriaal DNA
Natriumacetaat
nicotinamide adenine dinucleotide (onder gereduceerde vorm)
Neurogenic weakness with Ataxia and retinitis pigmentosa
Next Generation Sequencing
Negative Template Control
Oxidatieve fosforylatieketen
Polymerase Chain Reaction
revised Cambridge Reference Sequence
ribonucleïnezuur
ribosomaal ribonucleïnezuur
8
Rpm
T
tRNA
µL
rotations per minute (toeren per minuut)
thymine
transfer RNA
microliter
9
Lijst van Figuren en Tabellen
Figuur 1
Figuur 2
Figuur 3
Figuur 4
Figuur 5
Figuur 6
Figuur 7
Figuur 8
Figuur 9
Figuur 10
Figuur 11
Figuur 12
Figuur 13
Figuur 14
Figuur 15
Tabel 1
Tabel 2
Figuur 16
Figuur 17
Figuur 18
Tabel 3
Figuur 19
cel – mitochondrion – mtDNA. Geraadpleegd via
http://www.brusselsgenetics.be/dna
Circulair mtDNA. Geraadpleegd via
http://www.bing.com/images/search?q=mitochondriaal+DNA&FORM=HDRSC
2#view=detail&id=BEE8BD79BF51319CE64BBC091DC42DA2ED1830A1&select
edIndex=1
Mitochondrion. Geraadpleegd via
http://www.menschenzeit.de/serendipity_admin_image_selector.php?serend
ipity%5Bstep%5D=showItem&serendipity%5Bimage%5D=45
Structuur mitochondriën. Geraadpleegd via
http://micro.magnet.fsu.edu/cells/mitochondria/mitochondria.html
Mitochondriaal DNA – MT-TL1 gen. Geraadpleegd via
http://ghr.nlm.nih.gov/gene/MT-TL1
Ragged Red Fibers in spiercellen. Geraadpleegd via
http://www.bing.com/images/search?q=MERRF&qs=n&form=QBIR&pq=merr
f&sc=8-5&sp=1&sk=#view=detail&id=C60C7BF1D82868A505E0657432BC771487A27131&se
lectedIndex=1
Mitochondriaal DNA – MT-TK gen. Geraadpleegd via
http://ghr.nlm.nih.gov/gene/MT-TK
Zicht van gezond persoon en patiënt met LHON. Geraadpleegd via
http://lhon.org/lhon/LHON.html
Principe DGGE. Geraadpleegd via
http://www.milieumicrobiologie.nl/milieumicrobiologie/technieken/Techniek
en.htm
DGGE toestel dat een gel aan het runnen is.
Resultaat DGGE
3130Xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems)
Voorbeeld Electroferogram
Protocol Next Generation Sequencing. Geraadpleegd via
http://www.nature.com/jid/journal/v133/n8/full/jid2013248a.html
‘Multiprobe®II Plus EX + Gripper’ liquid Handling Robot en de Chemagic
Magnetic Separation Module I (Chemagic MSMI) van Perkin Elmer.
Geanalyseerde resultaten Sanger Sequencing.
Primermix MERRF (f13 fs/rs) – MELAS (MelasSEQf/r)
Microchip elektroforese – MERRF
Microchip elektroforese – MELAS
Voorbeeld van Ruwe data MELAS
Resultaten experimenten
Aantal geïdentificeerde reads met NGS voor MERRF/MELAS
10
Samenvatting
Tijdens mijn stage heb ik een validatie uitgevoerd met Sanger Sequencing, die noodzakelijk
was voor de omschakeling van de oudere (DGGE) methodologie naar een nieuwe
diagnostische test (Next Generation Sequencing).
Hiervoor heb ik 129 stalen die een normaal patroon vertoonden met de DGGE test
geanalyseerd met Sanger Sequencing.
Eerst heb ik een eerste PCR uitgevoerd die er voor gaat zorgen dat het gewenste fragment
van het DNA geamplificeerd zal worden zodat men genoeg DNA heeft als input. Deze PCR
fragmenten werden gecontroleerd via microchip elektroforese en werden dan opgezuiverd
van overtollige nucleotiden, ongebonden primers en overgebleven Taq DNA Polymerase.
Na opzuiveren heb ik dan een tweede PCR, een BigDye Cycle Sequencing, uitgevoerd. Bij
deze stap worden er deoxynucleotiden en fluorescent gelabelde dideoxynucleotiden in
gebracht op een enkelstrengige sequentie. Deze PCR producten zullen na opzuiveren dan
gesequencend worden en kan men zo de nucleotiden volgorde van het fragment gaan
bepalen.
De sequentie werden nagelezen ten op zichtte van de herziene Cambridge Reference
Sequence op homoplasmische en/of heteroplasmische veranderingen in hun
nucleotidenvolgorde.
Er werden geen discrepanties teruggevonden tussen resultaten afkomstig van DGGE en
Sanger Sequencing. Dit luik van de validatie is afgerond. In de nabije toekomst zullen deze
resultaten dan ook onderzocht worden met NGS.
11
Abstract
During my internship, I used Sanger Sequencing to perform an important part of a validation.
This validation was necessary for the replacement of an outdated (DGGE) test with a newer
diagnostic test (Next Generation Sequencing).
For this validation I have 129 samples analyzed with Sanger Sequencing that had previously
shown a normal pattern with the DGGE test.
First I carried out a first PCR that amplified the desired DNA fragment and to ensure that
there is enough of DNA to start the test. After this PCR I used microchip electrophoresis to
control the amplification of the DNA samples. Subsequently, the PCR fragments were
purified from an excess of nucleotides, primers and remaining Taq DNA polymerase.
A second PCR, after purification, was performed. Here we place the deoxynucleotides and
fluorescently labeled dideoxynucleotides in a single stranded DNA sequence. After
purification, these PCR products were sequenced to allow the determination of the
nucleotide sequence of the fragment under investigation.
The sequence was proofread in respect to the revised Cambridge Reference Sequence on
changes in their nucleotide sequence.
There were no discrepancies found between the results obtained with DGGE and those of
Sanger Sequencing. We can conclude that this part of the validation is complete. In the near
future, will these results also be analyzed with the newer diagnostic test NGS.
12
Inleiding
In het Centrum Medische Genetica van UZ Brussel wordt het mitochondriaal DNA van
patiënten met een klinische symptomatologie die compatibel kan zijn met een
mitochondriale aandoening onderzocht op veranderingen in dit genoom.
Dit DNA onderzoek wordt voor mitochondriale veranderingen in de tRNA lysine en leucine
genen nog steeds uitgevoerd met behulp van ‘denaturing gradient gel elektroforese (DGGE)’,
een techniek die in geval van afwijkende migratiepatronen gevolgd wordt door ‘Sanger
Sequencing’ en het bepalen van de mitochondriale load met ‘restriction fragment length
polymorphism’ (RFLP). Dit wordt vooral toegepast voor klinische aandoeningen zoals MELAS,
MERRF en CPEO.
DGGE is echter een wat oudere en zeer arbeidsintensieve techniek die enkel aangeeft dat er
een verandering in het onderzochte DNA fragment aanwezig is. Ter identificatie van deze
verandering moet de volledige nucleotiden sequentie van het afwijkend DNA fragment
bepaald worden met Sanger Sequencing. Maar dan nog weet men niet in welke percentage
de mutatie voorkomt ('mutation load') t.o.v. normaal mitochondriaal DNA.
Het is de bedoeling dat de huidige DGGE analyse al dan niet aangevuld met de Sanger
Sequencing, vervangen zal worden door een nieuw en aantrekkelijker alternatief: Massieve
Parallel Sequencing (MPS) of ook wel Next Generation Sequencing (NGS) genoemd.
Deze nieuwe technologie zal beide voorgaande analyses vervangen. Met de omschakeling
van de huidige diagnostische test naar NGS analyse, mag er niet vergeten worden rekening
te houden met het valideren van de nodige controles met behulp van Sanger Sequencing.
Voor de validatie van de mitochondriale NGS test zullen er a.d.h.v. Sanger Sequencing
gearchiveerde DNA stalen geanalyseerd worden die een normaal patroon gaven met DGGE
onderzoek. Abnormale migratiepatronen van DNA stalen worden steeds systematisch met
behulp van dideoxynucleotiden geanalyseerd na elke DGGE test, en dienen niet herhaald te
worden. Op deze manier kan de sensitiviteit (mogelijke vals negatieven) en specificiteit
(mogelijke vals positieven) van de test bepaald worden.
13
Literatuuronderzoek
14
Literatuuronderzoek
Mitochondriaal DNA?
Mitochondriaal DNA (mtDNA) is een ringvormige,
dubbelstrengige DNA molecule van 16.569kb
groot. We vinden deze DNA molecule niet terug
verpakt onder de vorm van chromosomen in de
celkern zoals het nucleaire DNA, maar in de
mitochondriën (Dimauro, S., & Davidzon, 2005).Er
zijn ongeveer 2-10 kopijen van het mitochondriaal
DNA aanwezig per mitochondrion. Mitochondriaal
DNA wordt dan ook polyploïd genoemd
(Neuromuscular, 2014).
Figuur 2 Cel – Mitochondrion - mtDNA
Het is een molecule die bewijs levert dat er biljoenen jaren geleden aan endosymbiose
gedaan werd. Protobacteriën hebben zich toen genesteld in de eukaryote cellen van de
mens. De mitochondriën zijn hiervan het resterende resultaat. MtDNA heeft door de jaren
heen zijn onafhankelijkheid grotendeels verloren, maar speelt nog altijd een cruciale rol, zij
het in nauwe symbiose met het nucleaire DNA (Dimauro, S., & Davidzon, 2005).
MtDNA bevat genetisch materiaal voor 37 genen die essentieel zijn voor een normale
mitochondriale activiteit. Onder deze 37 genen zijn 2 rRNA genen, 22 tRNA genen en 13
structurele genen. Deze 13 structurele genen coderen voor subeenheden van de
mitochondriale ademhalingsketen, ook wel de oxidatieve phosphorylatie keten (OXPHOS)
genoemd, het cellulair reactie pad verantwoordelijk voor de aanmaak van ATP vanaf ADP
(Dimauro, S.,& Davidzon, 2005).
Figuur 3 Circulair mtDNA
15
Mitochondriën
Mitochondriën, afgeleid van het Griekse mitos (draadvormig) en khondros (korrel), zijn
essentiële structuren van een cel (Schon, E.A., Dimauro, S. en Hirano, M., 2012).
Het zijn ovaalvormige organellen die energie
uit de voeding omzetten in ATP, een vorm
van energie die onze cellen kunnen
gebruiken voor biochemische en cellulaire
reacties. Mitochondriën worden dan ook
vaak ‘de energiecentrales’ van de
eukaryotische cel genoemd. Ze produceren
tot 90% van de ATP productie van een
gewone cel (Schon, E.A., Dimauro, S. en
Hirano, M., 2012). Een cel bevat in zijn
Figuur 4 Mitochondrion
cytoplasma, het vocht rond de nucleus,
tientallen tot duizenden mitochondriën. Het aantal mitochondriën hangt af van de cel
functie en/of het cel type. Dit kan sterk variëren, van 1 tot duizenden per cel (Genetic Home
Reference, 2014 en London Health Sciences Centre, 2010). Bijvoorbeeld bij levercellen, deze
cellen hebben veel energie nodig en bestaan dan ook voor 20 procent uit mitochondriën
(Menselijk lichaam).
Een mitochondrion leeft ongeveer tussen de 5 en 12 dagen. Deze korte levensduur zorgt
ervoor dat een mitochondrion vaak zal moeten delen, waardoor er echter fouten in het
mtDNA kunnen sluipen. Het is belangrijk dat deze fouten vermeden worden want indien er
iets mis gaat met het mtDNA kan dit leiden tot slechtwerkende zenuwen, spieren, versnelde
veroudering, … Het is gebleken dat het enzym aconitase, dat een belangrijke rol speelt bij de
energievoorziening van de cellen ook een belangrijke rol speelt bij het succesvol overerven
en onderhouden van het mtDNA.
Aconitase zal ervoor zorgen dat de (kleine) fouten in het DNA gerepareerd zullen worden en
dat de celdeling normaal zal verlopen (Kennislink, 2005).
Het is een goed voorbeeld van de samenwerking tussen het nucleair en mitochondriaal DNA.
Aconitase wordt gecodeerd door het DNA in de celkern en zal dan na de productie naar de
mitochondriën gevoerd worden om daar, in de mitochondriën zijn taak te vervullen
(Kennislink, 2005)
16
Mitochondriën worden omgeven door een dubbel
membraan bestaande uit een binnen en buiten
membraan, die de mitochondriën opdelen in een
intermembrane ruimte en de matrix. Het binnenste
membraan laat enkel de proteïnen door die
essentieel zijn voor de matrix en is veel selectiever
dan het buitenste membraan. Het binnenste
membraan maakt hiervoor gebruik van transport
proteïnen die enkel de gewenste proteïnen gaan
transporteren. In het binnenste membraam worden
er uitstulpingen terug gevonden, de cristae, die het
mitochondrion in verschillende compartimenten
Figuur 5 Structuur mitochondriën
verdeelt.
In de matrix vinden we het mtDNA terug samen met enzymen en ribosomen. Hierdoor kan
het mtDNA onafhankelijk van het nucleair DNA gerepliceerd worden (Molecular Expressions,
2004).
Naast hun rol bij de energieomzetting zijn de mitochondriën ook belangrijk bij andere
cellulaire reacties zoals apoptose, de zelfdestructie van een cel. Ze zijn ook nodig voor de
productie van bestanddelen zoals cholesterol en heem. (Genetic Home Reference, 2014) Ze
helpen ook bij het reguleren van de waterhuishouding en de ionen in een cel (Menselijk
lichaam).
In bepaalde cellen, de bèta cellen van de pancreas, hebben de mitochondriën nog een
andere functie naast het leveren van energie. Hier gaan ze helpen bij het controleren van het
glucose niveau in het bloed. Ze gaan er voor zorgen dat wanneer er hoge glucose niveaus
terug gevonden worden, er insuline vrijgegeven zal worden als antwoord hierop. Insuline zal
dan gaan bepalen hoeveel glucose er de cel binnengaat om omgezet te worden in energie
(Genetics Home Reference, 2014).
17
Oxidatieve phosphorylatie keten(OXPHOS)
De OXPHOS keten ook wel gekend als de cellulaire respiratie of cel ademhaling, is het proces
dat voedingstoffen gaat omzetten in energie waar het lichaam iets mee kan aanvangen. De
mitochondriën zullen hiervoor zuurstof, suikers en vetten omzetten ter vorming van
adenosine trifosfaat (ATP). Dit is de grootste bron van energie voor het menselijk lichaam.
De oxidatieve fosforylatieketen wordt uitgevoerd door een set enzym complexen genaamd
complex I tot en met complex V (Genetic Home Reference, 2014).
Energierijke elektronenparen (H+), dit kan zowel van NADH of FADH2 zijn, zullen af gegeven
worden aan zuurstof ter vorming van ATP.
De cellulaire respiratie is een proces opgebouwd uit biochemische reacties die men kan
onderverdelen in 2 grote categorieën. De eerste is de koolstofroute, hierbij zullen suikers
omgezet worden in waterstof en kooldioxide.
De volgende fase is de waterstofroute waarbij het waterstof omgezet zal worden in zuurstof
waardoor water en energie zullen vrijkomen. De waterstofelektronen (H+) volgen de
elektronentransportketen en geven hier hun energie af, die dan wordt opgeslagen in de
gevormde ATP moleculen.
Uit elke omgezette suikermolecule, ontstaan er 38 ATP moleculen (Menselijk lichaam).
Mitochondriale DNA Mutaties
Mitochondriale aandoeningen kunnen veroorzaakt worden door zowel een mutatie in het
mitochondriaal als in het nucleair DNA. Dit omdat vele structurele subeenheden van de
oxidatieve phosphorylatie keten gecodeerd worden door genen die op het nucleair DNA
liggen (Diaz, F., Kotarsky, H., Fellman, V. & Moraes,C., 2011). In dit werk zullen enkel mtDNA
mutaties besproken worden.
Vooraleer we verder ingaan op mtDNA afwijkingen en mitochondriale aandoeningen, lichten
we eerst 3 grote principes van de mitochondriale genetica nader toe. Deze zijn afwijkend
t.o.v. de Mendeliaanse overervingsregels (Dimauro, S., & Davidzon, 2005).
1. Heteroplasmie en drempeleffect
Elke cel bevat meerdere kopijen van het mtDNA (polyploïd), die bij deling willekeurig
verdeeld worden over de dochtercellen. In normale omstandigheden zijn al deze kopijen
identiek aan elkaar. Dit wordt homoplasmie genoemd. Dit staat in sterk contrast tot
heteroplasmie, een situatie waarbij niet alle kopijen van het mtDNA identiek zijn. De mate
waar in de verandering voorkomt ten opzichte van het wild type mtDNA sequentie (ook
‘mutation load’ genoemd) zal de klinische expressie (fenotype) bepalen van de pathogene
variant (mutatie). Er is een bepaald minimum aan niet of slecht functionerend mtDNA nodig
om te resulteren in een dysfunctie van de mitochondria in de betrokken organen of
weefsels. Dit wordt het drempel (treshold) effect genoemd (Dimauro, S., & Davidzon, 2005).
Het drempeleffect varieert afhankelijk van de mutatie, het betrokken orgaan of weefsel en
de leeftijd van de patiënt. Wanneer het drempeleffect zich boven de 90-95% bevind, is er
onafhankelijk van het mutatie type, deficiëntie in de OXPHOS keten waar te nemen.
18
Vaak met een slechte afloop. Door het drempeleffect heeft men een vertekend beeld van
het voorkomen van pathogene mtDNA mutaties in de algemene populatie. De incidentie is
nl. veel hoger dan eerst gedacht (Schon, E.A., Dimauro, S. en Hirano, M., 2012), zie ook punt
3.
2. Mitotische segregatie
Wanneer cellen delen, kan de verhouding tussen wild type en variant mtDNA in de
dochtercellen veranderen t.o.v. de moedercel. Hierdoor kan de fenotypische expressie van
de mutatie alterneren. Door dit fenomeen kunnen sommige patiënten eventueel evolueren
van een milder klinische fenotype naar een ernstigere vorm.
3. Maternale overerving
MtDNA wordt uitsluitend overgeërfd van de moeder. Het volgt dus de vrouwelijke lijn van
voortplanting en niet de mendeliaanse overervingsregels. Bij de bevruchting is het mtDNA
afkomstig van de eicel.
Een moeder met een mutatie in het mtDNA zal dit kunnen doorgeven aan al haar kinderen,
zowel zonen als dochters, maar enkel dochters zullen op hun beurt hun mtDNA doorgeven
aan hun kinderen. Wanneer een ziekte uitsluitend segregeert in de maternale lijn van een
familie, kan dit een sterke indicatie zijn dat de ziekte veroorzaakt word door een mtDNA
mutatie (Dimauro, S., & Davidzon, 2005).
MtDNA mutaties worden steeds geassocieerd met defecten in de oxidatieve phosphorylatie
keten, die zorgt voor de energie omzetting. Nu zouden mutaties in het mtDNA ook een
oorzaak kunnen zijn van neurodegeneratieve ziektes en kankers. In deze ziektes zoals
Alzheimer, ziekte van Parkinson en andere zou er geen twijfel meer mogelijk zijn van een
mitochondriale connectie. Toch zouden deze ziektes meer veroorzaakt worden door
problemen in mitochondriale dynamiek dan effectief het gevolg te zijn van een
mitochondriale mutatie.
Er zijn meerdere studies die het voorkomen van mutaties in het mtDNA van tumoren
bevestigen, maar er zijn weinig studies die zich gedetailleerd de vraag stellen of een specifiek
genotype de mitochondriale functie beïnvloed en zo een rol speelt in tumorgenese (Schon,
E.A., Dimauro, S. en Hirano, M., 2012).
De voorbije jaren is de identificatie van mtDNA mutaties parallel geëvolueerd met de
stijgende vooruitgang in detectiemethoden zoals sequencing en celbiologische technieken.
Studies hebben aangetoond dat mitochondriale aandoeningen niet enkel gevolg zijn van
mutaties in genen die coderen voor de structurele subeenheden van de oxidatieve
fosforylatieketen maar ook in genen die nodig zijn voor de translatie, de assemblage en de
stabiliteit en werking van deze proteïnen (Schon, E.A., Dimauro, S. en Hirano, M., 2012).
De mutatie kan een puntmutatie zijn of een herschikking van de basen zijn zoals een insertie,
deletie of duplicatie. Sinds 1988 zijn meer dan 270 puntmutaties alleen al in het mtDNA
beschreven. Deze mutaties kunnen in elk gen voorkomen maar toch kan men constateren
dat meer dan de helft van de mutaties terug gevonden worden in de tRNA genen hoewel
19
deze maar 10% van het totale mitochondriaal genoom uitmaken (Schon, E.A., Dimauro, S. en
Hirano, M., 2012).
1 op 5000 tot 10000 personen heeft een mitochondriale aandoening, veroorzaakt door o.a.
een mutatie in het mtDNA. Onderzoek van navelstrengbloed van pasgeborenen bracht aan
het licht dat 1 op 200 individuen drager is van een pathogene afwijking in het mtDNA. Dit
hoeft niet direct te resulteren in een aandoening. Voor het merendeel van deze onderzochte
DNA stalen bevindt de ‘mutation load’ zich ver onder het drempeleffect.
Nomenclatuur
De Human Genome Variation Society (HGVS) hebben richtlijnen en aanbevelingen opgesteld
voor de nomenclatuur van veranderingen in het DNA. Dit zowel voor het nucleair als het
mtDNA. Deze regels gelden zowel voor substitutie, insertie, deletie, etc. …
Het mtDNA wordt vergeleken met de herziene (revised) Cambridge Reference Sequence
(rCRS) NC_012920.1. Hieronder een voorbeeld.
Bv:
m.1997G>T
Dit is een verandering in het mitochondriaal DNA, op nucleotide positie 1997. De referentie
nucleotide is een G, maar is vervangen door een T in de gelezen sequentie.
(Dunnen, J.T. & Antonarakis, S.E., 2000)
20
Voorkomende Mitochondriale aandoeningen
Mitochondriale aandoeningen zijn de meest voorkomende aandoeningen van het
metabolisme die overgeërfd worden. Onder mitochondriale aandoeningen verstaat men
algemeen de aandoeningen waarbij men dysfunctie heeft in 1 of meerdere complexen van
de OXPHOS keten. (Ylikallio E. & Suomalainen A., 2012)
Er zijn verschillende soorten voorkomende mutaties.
De grootste 2 groepen van mtDNA mutaties die we terug vinden zijn:
1. De mutaties in rRNA en tRNA genen die een rol spelen bij het mitochondriale
translatieproces, zoals MERRF en MELAS. Daarnaast heb je nog
2. Mutaties in genen die coderen voor de proteïnes van de ademhalingsketen zoals bv. NARP
en MILS.
Zoals eerder vermeld, kunnen mitochondriale aandoeningen zowel veroorzaakt worden door
een mutatie in het mitochondriaal als in het nucleaire DNA.
De klinische verschijnselen kunnen vaak geen onderscheid maken tussen verschillende
aandoeningen. Er is geen duidelijke fenotype-genotype correlatie. Daarom zijn verdere
onderzoeken nodig zoals analytische testen, histologie, microscopische testen, DNA
onderzoek, … om een definitieve diagnose te stellen (Dimauro, S., & Davidzon, 2005).
Symptomen van mitochondriale aandoeningen kunnen voorkomen op iedere leeftijd en
veroorzaakt worden in ieder orgaan. Meestal zullen deze zich openbaren in weefsels of
organen van het lichaam die de meeste energie nodig hebben zoals hart, hersenen, spieren,
pancreas en nieren (Tachibana et al., 2012).
Mutaties in het mtDNA kunnen voorkomen in de vorm van puntmutaties, inserties, deleties
en duplicaties. Voorbeelden van puntmutaties zijn bijvoorbeeld m.3243A>G in het tRNA
leucine (MELAS), de m.8344A>G in het tRNA lysine gen (MERRF) of de m.8993T>G in het
ATP6 gen (NARP en MILS) (Schon, E.A., Dimauro, S. en Hirano, M., 2012).
In mijn thesis bestudeer ik de tRNA leucine en lysine genen die vnl. gerelateerd zijn met de
respectievelijke aandoeningen MELAS en MERRF. Deze zullen dan ook uitgebreid besproken
worden. Andere veel voorkomende mtDNA aandoeningen zal ik in het kort wat meer
toelichten.
21
Behandeling
Mitochondriale aandoeningen zijn niet te behandelen; Het is enkel mogelijk om de
symptomen te bestrijden en/of te verlichten. In sommige gevallen kan men met therapie het
ziekteverloop gaan afremmen.
Wetenschappers zijn al enkele jaren driftig op zoek naar een methode waarmee men kan
voorkomen dat mutaties in het mitochondriale DNA overgeërfd zullen worden van moeder
op kind. Men is er al in geslaagd om defect mitochondriaal DNA te vervangen door intact
materiaal bij resusaapjes. Amerikaanse wetenschappers hebben aangetoond dat men ook
menselijke eicellen op deze manier kunnen herstellen (Tachibana et al., 2012)
In 2009 slaagde Tachibana er in om bij resusaapjes het mtDNA dat een aandoening bevatte,
te vervangen door ‘gezond’ mtDNA van een donor cel. Hierbij bracht hij de celkern van de
patiënt in een kernloze donoreicel in. De kern van de patiënt zal dus coderen voor de
eigenschappen, maar met het mtDNA van de donoreicel, gelegen in het cytoplasma van de
cel. Bij de geboorte zal het kind dan ook de eigenschappen hebben van de patiënt maar niet
de mutaties van het mtDNA.
In theorie is het repareren van mtDNA in menselijke eicellen haalbaar, maar in de praktijk
worden problemen ondervonden met het vervroegd delen van de veranderde eicellen. Men
denkt dat door het uitwisselen van de celkernen bij menselijke eicellen er een activatie van
de celdeling plaatsvindt waardoor de cellen vervroegd zullen te beginnen delen.
Daarnaast vind men ook praktische problemen terug, daar Tachibana steeds gewerkt heeft
met zowel verse patiënten- en donoreicellen. De vraag hierbij is of men ook mtDNA kan
uitwisselen bij ingevroren eicellen van patiënt en/of donor.
Het is een veel belovende techniek, maar het is nog af te wachten of Tachibana de
toestemming krijgt om zijn techniek verder te ontwikkelen voor humane toepassingen
wegens de ethische bezwaren die hier aan vast hangen. Want je werkt nog steeds altijd met
mensen en men is niet zeker dat de gezondheid van de nakomelingen volledig gewaarborgd
is. Er kan een mismatch optreden tussen het DNA van de patiënt en het mtDNA van de
donor. Of er kan natuurlijk ook altijd een percentage van mtDNA van de patiënt mee
overgebracht worden (Tachibana et al., 2012).
22
MELAS
Mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis and stroke like episodes. Dit is een
multisysteem aandoening die meestal aanvangt in de kindertijd. De symptomen hebben
meestal onset op een leeftijd tussen 2 en 10 jaar. De diagnose van MELAS gebeurt meestal
op basis van een combinatie van klinische verschijnselen en moleculaire testen (Dimauro, S.
& Hirano, M., 2013).
Ziektebeeld
De meest voorkomende klinische symptomen zijn gehoorverlies en diabetes, gevolgd door
beroertes (stroke like episodes). Deze beroertes komen typisch voor op een leeftijd jonger
dan 40 jaar. Daarnaast zijn er nog andere klinische verschijnselen zoals cardiomyopathie,
migraine, ataxia, dementie, terugkerende hoofdpijn, terugkerend overgeven en geïsoleerde
myopathie. Het fenotype van de aandoening varieert naargelang het percentage
heteroplasmie dat aanwezig is. Korte gestalte is ook een normaal voorkomend kenmerk
(Mancuso et al., 2013).
Er bestaat geen specifieke behandeling voor MELAS, maar de symptomen apart kunnen
behandeld worden. Het gehoorverlies kan bijvoorbeeld gecompenseerd worden door het
gebruik van implantaten (Dimauro, S. & Hirano, M., 2013).
Mutaties
MELAS patiënten dragen doorgaans, in 80% van de gevallen, een puntmutatie m.3243A>G in
het tRNA Leucine (MT-TL1) gen dat een belangrijke rol speelt bij de proteïnesynthese. Dit is
één van de meest voorkomende puntmutaties in het mitochondriaal DNA.
Het MT-TL 1 gen, wordt ook wel het tRNA leucine of Mitochondrially encoded tRNA leucine 1
genoemd. Dit gen codeert voor een transfer RNA molecule die gaat helpen bij de aanmaak
van aminozuren.
Er gaat een specifieke tRNAleu aangemaakt worden, deze gaat bij de proteïnesynthese aan
het aminozuur Leucine hechten en ervoor zorgen dat leucine op de correcte plaats in de
proteïne ingebouwd zal worden. Deze specifieke tRNALeu is enkel terug te vinden in de
mitochondriën en is uitsluitend betrokken bij de synthese van proteïnes die instaan voor de
oxidatieve fosforylatieketen.
23
Het MT-TL1 gen is gelegen in het mitochondriaal DNA, nucleotide positie m.3229 tot m.3303
(Genetics Home Reference, 2014).
Figuur 6 Mitochondriaal DNA - MT-TL1 gen
Andere veel voorkomende mutaties mogelijk voor MELAS zijn mutaties in het MT-ND5 gen
dat codeert voor subunit 5 van het NADH-ubiquinone oxidoreductase. Daarnaast zijn er ook
nog mutaties gekend in andere tRNA genen van het mtDNA zoals MT-TC, MT-TK, MT-TV,
MT-TF, MT-TQ, MT-TS1, MT-TS2, en MT-TW en in proteïne coderende genen zoals MT-CO1,
MT-CO2, MT-CO3, MT-CYB, MT-ND1, MT-ND3, en MT-ND6. (Dimauro, S. & Hirano, M., 2013)
Er zijn vorderingen gemeld in de moleculaire diagnostiek van MELAS bij patiënten. Men is er
achter gekomen dat urinaire sedimentcellen gevoeliger zijn voor de detectie van de
m.3243A>G mutatie bij MELAS patiënten in vergelijking met leukocyten. De mutatie load is
bovendien doorgaans vergelijkbaar met deze van een spierbiopt. Daarnaast is ochtend urine
collectie een makkelijke, niet invasieve afname (Dimauro, S., & Davidzon, 2005).
24
MERRF
MERRF (Myoclonic Epilepsy with Ragged Red Fibers) is een eerder zeldzaam multisysteem
aandoening die meestal start in de vroege kindertijd tot adolescentie, na een eerder
normale ontwikkeling (Dimauro, S. & Hirano, M., 2009). De aandoening tast vele delen van
het lichaam aan, meestal de spieren en het zenuwstelsel (Genetics Home Reference, 2009).
Ziektebeeld
Een karakteriserend eerste symptoom is myoclonus, het onvrijwillig samentrekken van een
of meerdere spieren (Dimauro, S. & Hirano, M., 2009). Dit kan zowel een contractie zijn, dit
wordt een positieve myoclonus genoemd als een ontspanning, een negatieve myoclonus.
Deze samentrekkingen kunnen zowel alleen of in opeenvolgende groep voorkomen en
kunnen een bepaald patroon volgen. Wanneer dit in een grotere mate voorkomt kan de
beweging verstoord worden of het vermogen om te praten, te eten of te lopen aangetast
worden (National Institute of Neurological Disorders and Stroke, 2014).
Andere symptomen zijn epilepsie aanvallen, ataxie, zich zwak voelen, progressieve stijfheid
en dementie. Ataxie is een algemeen begrip voor verschillende storingen van het evenwicht.
Er is een stoornis in de coördinatie van de spierbewegingen die er voor zorgt dat de patiënt
een onregelmatige en onhandige beweging van ledematen krijgt (Genetics Home Reference,
2009 en Nederlandse Vereniging voor Neurologie, 2012).
De klinische diagnose van MERRF wordt dus gesteld door
de myoclonus, epilepsie aanvallen en ataxie. Dit zal dan
verder ondersteund worden door de aanwezigheid van
ragged red fibers in een spier biopsie. Ragged Red Fibers
(RRF) zijn spiercellen van aangetaste individuen die een
abnormaal patroon tonen onder de microscoop na
kleuring. In aangetaste spiervezels kunnen er aan de rand
van de spiercellen, duidelijke opeenhopingen van
mitochondriën terug gevonden worden.
Figuur 7 Microscopisch beeld van Ragged
Red Fibers in spiercellen.
25
Mutaties
BIJ MERRF is de moleculaire onderliggende oorzaak meestal een puntmutatie in het tRNA
lysine gen. Vier verschillende puntmutaties in het MT-TK gen karakteriseren samen 90% van
de patiënten met een MERRF aandoening.
- m.8344A>G
- m.8356T>C
- m.8363G>A
- m.8361G>A
Van deze vier mutaties is m.8344A>G de meest voorkomende. Deze wordt opgemerkt bij
80% van de gevallen. De andere 3 puntmutaties samen tellen voor een 10%.
Het mitondriaal gecodeerde tRNA lysine behoort net als het tRNA leucine (MT-TL1) tot de
familie van transfer RNA genen. MT-TK codeert zoals MT-TL1 voor een tRNA molecule die
helpt bij het correct inbouwen van aminozuren. In dit geval gaat tRNAlys ervoor zorgen dat
Lysine correct ingebouwd wordt. Ook in dit geval is MT-TK enkel terug te vinden in de
mitochondriën (Genetics Home Reference, 2014).
MT-TK gen vinden we terug van nucleotide positie m.8294 tot m.8363 in het mtDNA.
Figuur 8 Mitochondriaal DNA - MT-TK gen
26
LHON
Hereditaire opticusatrofie van Leber (Leber’s Hereditary Optic Neuropathy) ook wel gekend
als de ziekte van Leber of Leber’s opticus atrofie is een mitochondriale ziekte veroorzaakt
door een mutatie in het mtDNA. Het is een erfelijke aandoening waarbij de patiënt last krijgt
van plots en ernstig gezichtsverlies omdat de oogzenuw dun wordt en slecht zal
functioneren. De naam Leber komt voor van de oogarts die het syndroom eerst beschreven
heeft (Kinderneurologie, 2008).
Ziektebeeld
De aangetaste patiënten hebben meestal geen symptomen tot men plots in één oog, verlies
van het centrale zicht krijgt. Volgens het klassieke gekende patroon volgt binnen acht weken
het zicht verlies van het andere oog. Het centrale zicht blijft verder achteruitgaan. Lezen,
autorijden en herkennen van personen wordt nagenoeg onmogelijk. Het perifeer zicht blijft
onaangetast waardoor het individu nog zelfstandig zich kan verplaatsen (LHON 101). Dit
wordt de acute fase genoemd. Hierna volgt de atrofische fase, het afsterven van de optische
schijven binnen de zes weken.
Andere neurologische abnormaliteiten zoals
- een posturale tremor (het ondervinden van trillingen in een bepaalde
houding),(tremor.nl)
- perifere neuropathie (schade aan het perifere zenuwstelsel dat informatie
overbrengt van de hersenen en het ruggenmerg naar andere delen van het lichaam),
- bewegingsstoornissen
- atypische myopathie (niet specifieke spieraandoening)
hebben een grotere prevalentie bij patiënten met LHON dan bij de controle groep.
De aandoening ontwikkelt zich meestal voor bij jonge volwassenen. Mannen hebben tot 4 of
5 keer meer kans om aangetast te worden dan vrouwen (Yu-Wai-Man, P. en Chinnery, P.F.,
2013).
Figuur 9 zicht van gezond persoon en patiënt met LHON
27
Mutaties
Er zijn meerdere mutaties bekend die de oorzaak kunnen zijn van een LHON aandoening. De
3 meest voorkomende mutaties zijn mutaties in het mitochondriale DNA die elk een
subeenheid van de ademhalingsketen aantasten. Deze zijn samen verantwoordelijk voor
90% van de oorzaken. Dit wil niet zeggen dat alle mutaties verantwoordelijk voor LHON
geassocieerd worden met defecten in de ademhalingsketen.
De meest voorkomende mutatie is m.11778G>A in het MT-ND4 gen. Deze telt ongeveer voor
een 70% van de patiënten met LHON. De andere 2 meest gekende mutaties zijn m.14484T>C
in het MT-ND6 gen en de m.3460G>A mutatie in het MT-ND1 gen. In het centrum Medische
Genetica van het UZ Brussel worden de patiënten op deze 3 bekendste mutaties onderzocht
(Yu-Wai-Man, P. en Chinnery, P.F., 2013).
28
Syndroom van Leigh
Het mtDNA geassocieerde syndroom van Leigh of maternally inherited Leigh syndroom
(MILS) is een neurologische aandoening waarbij hersencellen beschadigd zijn door dat deze
onvoldoende energie krijgen. Een andere naam voor deze aandoening is subacute
necrotiserende encefalopathie. Subacuut staat voor het langzaam aan ontstaan van nieuwe
klachten, necrotiserend slaat op het afsterven van de cellen en encefalopathie is het slecht
functioneren van de hersenen (Kinderneurologie, 2007 en Genetics Home Reference, 2011).
Ziektebeeld
De klachten bij patiënten met het Syndroom van Leigh ontstaan meestal op zeer jonge
leeftijd, van 2 maand tot 2 jaar. Bij kinderen waar de eerste symptomen op jonge leeftijd
ontstaan, verloopt de ziekte sneller dan bij kinderen waar de eerste symptomen pas
ontwikkelen op een latere leeftijd. De aandoening wordt gekenmerkt door verlies van
mentale en motorische vaardigheden met meestal dood als gevolg door respiratoire
insufficiëntie.
De eerste symptomen zijn vaak overgeven, diarree en dysfagie (moeilijkheden bij slikken).
Deze symptomen leiden meestal tot een eetstoornis waardoor de patiënt groei- en
gewichtsproblemen kan krijgen. Andere symptomen zijn spierproblemen zoals een
verminderde spierspanning, het onwillekeurig samentrekken van spieren en
evenwichtsproblemen. Ook verliezen van gevoel in de ledematen komt vaak voor bij mensen
met het Leigh syndroom (Genetics Home Reference, 2011).
Er is geen verschil in prevalentie tussen meisjes en jongens (Kinderneurologie, 2007).
Mutaties
Het syndroom van Leigh kan als oorzaak mutaties hebben in meer dan 30 verschillende
genen. De meeste mutaties worden teruggevonden in het nucleair DNA maar er bestaan ook
mutaties in het mtDNA, deze beslaan ongeveer 20-25% van de patiënten met het syndroom
van Leigh. Deze mutaties leiden meestal tot de verstoring van complex I, II, IV of V van de
OXPHOS keten. De meest voorkomende mutatie (10-20% van alle patiënten) is de
m.8993T>G in het MT-ATP6 gen. Het MT-ATP6 gen staat in voor het proteïne ATP synthase,
ookwel gekend als complex V van de OXPHOS keten (Thorburn, D.R., Rahman, S., 2014).
29
NARP
Neuropathy, ataxia and retinitis pigmentosa is een aandoening dat het zenuwstelsel aantast.
Het is een verzameling van symptomen die meestal beginnen in de kindertijd of jonge
volwassenheid.
Ziektebeeld
Deze symptomen zijn
- gevoelloosheid,
- tintelingen,
- sensorische neuropathie (pijn in de armen en/of benen)
- spierzwakte,
- ataxia (evenwichts- en coördinatieproblemen)
- gezichtsverlies door veranderingen in de retina. Dit gezichtsverlies kan leiden tot
retinitis pigmentosa. Bij retinitis pigmentosa zullen de licht sensitieve cellen van het
retina achteruitgaan.
Daarnaast vind men ook vaak leerstoornissen terug bij kinderen die leiden aan NARP of
dementia bij oudere individuen. Andere kenmerken van de aandoening zijn epileptische
aanvallen, doofheid en cardiale geleidingsstoornissen (Genetics Home Reference, 2006).
Mutaties
NARP heeft enkel gekende mutaties in het MT-ATP6 gen. De meest voorkomende is de
m.8993 T> G of de m.8993 T>C verandering (Thorburn, D.R., Rahman, S., 2014).
30
Screeningstesten voor Mitochondriale Afwijkingen
PCR
De Polymerase Chain Reaction is een techniek die wordt gebruikt om een bepaald DNA
fragment te vermenigvuldigen. Het DNA (fragment) wordt gedenatureerd en 2
oligonucleotiden (ook primers genoemd) binden ('annealen') op het enkelstrengige DNA
fragment en zullen dit vervolgens repliceren.
Polymerase Chain Reaction is bij de meeste screeningstechnieken een verplichte
voorafgaande stap. De PCR reactie genereert dan voldoende input aan DNA nodig om de
betreffende test uit te voeren.
Een PCR reactie bestaat uit 3 grote stappen
- Denaturatie, het dubbelstrengige template DNA wordt uit elkaar getrokken omdat
de waterstofbruggen die zich tussen de basen bevinden bij een hoge temperatuur
(96°C) verbroken worden. Er wordt enkelstrengige DNA gevormd.
- Annealing, de oligonucleotiden hybridiseren aan het complementair enkelstrengige
DNA. Er is een forward en een reverse primer die elk binden op de antisense en de
sense streng. De annealing temperatuur is specifiek voor een primer set (en
gerelateerd aan de nucleotiden samenstelling).
- Elongatie, dNTP’s (dATP, dTTP, dGTP of dCTP) met behulp van het DNA polymerase
zal de DNA keten verlengen vanaf de primers, en van het 5' naar het 3' eind toe.
Deze drie stappen worden meermaals herhaald. Vaak word dit ook nog voorafgegaan door
een initiële denaturatie stap die ongepaarde loops in het template DNA en primers gaat
beperken. Finaal wordt de reactie afgesloten met een laatste elongatie stap zodat alle
strengen volledig zijn. De gevormde PCR producten worden bewaard op 10°C.
We maken gebruik van een 'touchdown' PCR programma, wat de vorming van aspecifieke
PCR producten beperkt. Tijdens het doorlopen van het PCR programma zal de annealing
temperatuur geleidelijk aan dalen. Bij hogere temperaturen zullen de primers specifiek
binden aan de target sequentie, en zal er enkel het gewenste PCR product geamplificeerd
worden. Dit nieuw gevormde DNA zal dan ook als template DNA dienen voor de volgende
cycli. Door de geleidelijke daling van de annealing temperatuur zal de efficiëntie van de PCR
reactie verbeteren, en zal men een grotere PCR opbrengst bekomen. Door de daling van de
annealing temperatuur, zal de ideale annealing temperatuur voor deze specifieke primer set
doorlopen worden.
In het Centrum Medische Genetica worden pre-PCR en post-PCR ruimte strikt van elkaar
gescheiden gehouden om cross over contaminatie te vermijden.
Bij elke PCR reactie wordt ook steeds een negatieve controle of een blanco meegenomen
om telkens opnieuw na te gaan of er geen contaminatie heeft plaatsgevonden tijdens de
uitvoering van de test (Caljon B., 2013).
31
Reagentia
Een PCR reactie moet steeds volgende reagentia bevatten:
-
Template DNA, Dit DNA bevat de target sequentie die je wenst te amplificeren.
-
Oligonucleotiden, Een primerset bestaat uit (meestal) 2 primers die complementair
zijn aan gebieden upstream en downstream van de target sequentie die je wilt
amplificeren. Je hebt een forward primer, deze is volgens een vaak gebruikte
conventie, complementair met de antisense streng en een reverse primer,
complementair aan de sense streng.
-
DNA (Taq) polymerase, dit is een hittebestendig enzym die de polymerisatie van
dNTP’s gaat katalyseren in een 5’-3’ richting vanaf een enkelstrengige DNA fragment.
Dit gaat als gevolg hebben dat er opnieuw een dubbelstrengige DNA fragment zal
ontstaan. De meeste DNA polymerase zijn voorzien van een hot start setup. DNA
polymerase kan immers gemodificeerd zodat het slechts actief wordt bij een hoge
temperatuur. Dit verlaagt ook de kans op het aspecifiek binden van de primers. De
initiële denaturatie stap zal er voor zorgen dat het polymerase geactiveerd zal
worden. Deze enzymen kunnen over een proofreading functie beschikken.
-
dNTP’s, de vier nucleotiden A, C, G of T zullen complementair binden aan de
enkelstrengige DNA streng.
-
Buffer, meestal is dit een Tris-HCl buffer, gemengd met een zout en additieven als
detergenten, stabilisatoren, … De buffer gaat ervoor zorgen dat er een optimale pH
gehandhaafd wordt, zodat er een maximale activiteit kan plaatsvinden van het DNA
polymerase. Indien de pH zou veranderen, zou de PCR reactie moeilijk heden kunnen
ondervinden.
-
Magnesium, Een DNA polymerase heeft als essentiële cofactor, kationen nodig om
actief te zijn, dit zijn meestal Mg2+ ionen die toegevoegd worden als MgCl2.
Magnesium is nodig om de PCR reactie te laten doorgaan.
(Caljon B., 2013)
Resultaat
Vooraleer er kan verder gewerkt wordt met de PCR producten, is het nodig de kwaliteit en
kwantiteit van de amplificatie reactie eerst te controleren aan de hand van een gel
electroforese of een microchip electroforese.
Men gaat na of er DNA geamplificeerd is, en of de grootte van de bandjes overeen komt met
wat verwacht wordt van het gewenste amplicon. Daarnaast word ook gekeken of de
negatieve controle niet gecontamineerd en effectief geen amplificatie product bevat.
32
Bij een agarose gel electroforese worden de PCR producten op een agarose gel geladen en
wordt er een spanningsveld aangelegd over de gel waardoor de DNA fragmenten doorheen
de gel zullen migreren van de negatieve naar de positieve pool, en er een scheiding zal
plaatsvinden op basis van de grootte van de DNA amplicons.
Bij de microchip electroforese zal men de DNA fragmenten scheiden op basis van de grootte
van de fragmenten op een microchip. Het staal wordt door een capillair opgezogen in een
well plaat en wordt gemengd met enkele moleculaire merkers. Het staal wordt dan via
electroforese gescheiden in een poly acrylamide matrix. Dit principe steunt er op het
principe dat kleine moleculen sneller door de matrix zullen migreren dan grotere moleculen.
De resultaten worden weergegeven in een digitale gel.
(Caljon B., 2013)
33
DGGE
DGGE, Denaturing Gradient Gel Electrophoresis is een moleculaire fingerprinting techniek
dat de PCR geamplificeerde DNA producten, homo- en heteroduplexen, scheidt op basis van
sequentie verschillen van het partieel gedenatuurd DNA. Deze sequentie verschillen zullen
ervoor zorgen dat de verschillende amplicons verschillende denaturerende kenmerken
vertonen.
Een scheiding door middel van agarose gel elektroforese zal geen nut hebben, aangezien de
amplicons even groot zijn. Je zou bandjes overal op dezelfde hoogte terug vinden.
(Laboratory for Microbial Ecology, 2004)
Naarmate dat de amplicons verder migreren doorheen een denaturerend polyacrylamide
gradiënt gel, zullen zij onder invloed van de hogere concentratie aan chemische denaturans
verder denaturen. De conformatie van het partieel gedenatureerde DNA zal veranderen in
functie van de concentratie aanwezig denaturant, en op zijn beurt de migratie van het
amplicon door de gel beïnvloeden. (Laboratory for Microbial Ecology, 2004)
Figuur 10 Principe DGGE
Praktisch
Bij DDGE komen de meeste moeilijkheden voor in de voorafgaande voorbereidende stappen.
Zo zal bij de eerste stap, het gewenste stuk DNA geamplificeerd worden met een eerste PCR
reactie. Dit wordt gedaan omdat de analyse een grote hoeveelheid DNA nodig heeft als
input. De primers gebruikt voor DGGE zijn een stuk langer dan de primers gebruikt voor een
gewone PCR amplificatie. Dit bevatten immers een GC clamp van ongeveer 60 bp lang.
Deze GC rijke gebieden zijn stabieler dan DNA fragmenten, waar meer AT paren in
voorkomen. Dit als gevolg van het aantal waterstofbruggen dat zich tussen de paren
bevinden. Tussen GC paren worden er 3 waterstofbruggen terug gevonden terwijl dit bij AT
paren slechts 2 waterstofbruggen zijn. Hoe meer waterstofbruggen zich tussen de paren
34
bevinden, hoe moeilijker en hoe meer energie er nodig zal zijn om te denatureren. Door dit
principe zullen de GC clamps zich dus zeer stabiel gedragen.
Vervolgens wordt er een gel gegoten, bestaande uit een mengsel van acrylamide en bis
acrylamide. Opgelet wanneer je met ongepolymeriseerde acrylamide werkt, deze stof kan
neurotoxisch zijn. Draag dus steeds handschoenen en werk voorzichtig. Tijdens het gieten
van de gel zullen er verschillende hoeveelheden ureum/formamide gemengd worden, zodat
er uiteindelijk een stijgende gradiënt doorheen de gel zal gevormd worden.
Terwijl de gel polymeriseert worden de stalen voorbereid op denaturatie. Voor
mitochondriale analyses zullen er heteroduplexen gevormd worden door een gelijke
hoeveelheid PCR product vanaf het patiënten staal te mengen met een zelfde hoeveelheid
PCR product van een gekend controlestaal (het fragment van dit controlestaal werd volledig
Sanger gesequencend, en vertoont geen polymorfismen t.o.v. de referentie rCRS sequentie).
Tijdens de denaturatiestap, in een PCR toestel, zullen de DNA strengen (ook de GC clamps)
volledig uit elkaar gaan. Hierna volgt een hybridisatiestap waardoor de strengen renatureren
en verschillende combinaties gevormd worden. Zo worden er homo- en heterodimere
fragmenten gevormd. Deze zullen in de gel op een andere manier migreren omdat ze een
verschillende nucleotiden samenstelling hebben, en dus op een verschillend moment
partieel zullen denatureren (op de GC clamps na). Zo ontstaan er verschillende bandje en
indien een nucleotide variant aanwezig is, zal deze gedetecteerd worden aan de hand van
een afwijkend migratiepatroon.
Bij DGGE analyse van het mtDNA is het ook nodig een tweede gel te runnen met het PCR
product van het patiënt DNA zonder toevoeging van controle DNA bij de vorming van homoen heteroduplexen. Dit wordt gedaan om mogelijke heteroplasmie van het DNA staal zelf op
te sporen. Wanneer het DNA van een patiënt (met heteroplasmie) dan met zichzelf
gedenatureerd en gerenatureerd wordt, zullen er ook heteroduplexen aangetoond kunnen
worden. Wanneer de patiënt homoplasmisch is, zullen er enkel homoplexen terug gevonden
worden.
Figuur 11 DGGE toestel dat een gel aan het runnen is.
35
Daarna worden de PCR producten op de gel aangebracht en ondergaan ze vervolgens een
gel electroforese. De gel zal na het runnen gekleurd worden met ethidiumbromide en
bekeken worden onder UV licht (Mia Vercammen).
Figuur 12 Resultaat DGGE
DGGE is een krachtige, maar oudere techniek die vroeger vaak in de moleculaire wereld
gebruikt werd. Daarnaast is het een zeer arbeidsintensieve techniek en wordt er enkel een
nucleotiden verandering gedetecteerd. DGGE toont het karakter van deze verandering niet.
Hiervoor is er verdere identificatie nodig met Sanger Sequencing (Green, S.J., Leigh, M. B. &
Neufeld, J.D, 2009).
36
Sanger Sequencing
Dideoxy Sanger Sequencing analyse is gebaseerd op de ontdekking van Fred Sanger. Met
behulp van Sanger Sequencing zal men de nucleotiden volgorde van DNA kunnen bepalen.
En indien zich een nucleotiden verandering (t.o.v. de referentie sequentie) voordoet, zal
men deze kunnen karakteriseren. Met behulp van Sanger Sequencing is het niet mogelijk om
de aanwezige hoeveelheid variant correct in te schatten. Deze kan, theoretisch, variëren
tussen 0 en 100%.
Het sequentie principe steunt op de ketenverlenging met behulp van een DNA polymerase in
aanwezigheid van dNTP’s (deoxy nucleotiden) en gelabelde ddNTPs (dideoxy nucleotiden).
De polymerase reactie van de DNA keten wordt bij inbouw van een ddNTPs gestopt. Verdere
verlenging door inbouw van een volgende complementair nucleotide is immers niet meer
mogelijk door de afwezigheid van de nodige hydroxylgroep. Op deze manier zal men door
een goede verhouding tussen dNTP’s en ddNTPs een cascade aan gelabelde fragmenten
bekomen, die telkens één base in grootte verschillen. Scheiding van de fragmenten op lengte
via capillaire electroforese zal toelaten om de ingebouwde ddNTPs te identificeren en zo de
nucleotiden opeenvolging van de DNA keten stap voor stap te reconstrueren.
Het Sanger Sequencing protocol is opgebouwd uit 6 stappen
- Een eerste PCR reactie
- Opzuiveren van de PCR producten
- BigDye Cycle Sequencing
- Opzuiveren BigDye Cycle Sequencing product
- Analyse van de BigDye Sequencing producten met capillaire electroforese
- Data analyse met specifieke software pakketten
(Caljon,B., 2013 & Cold Spring Harbor Laboratory)
Eerste PCR
Tijdens een eerste PCR wordt het DNA fragment met de gewenste target sequentie
geamplificeerd zodat er genoeg DNA input is. De PCR technologie werd hierboven al
beschreven.
Opzuiveren PCR producten
Na een PCR reactie vind je steeds overtollige ongebonden primers en dNTP’s terug. Deze
kunnen interfereren bij de BigDye sequencing stap en worden dus steeds verwijderd. Dit kan
met behulp van een enzymzuivering of met behulp van een kolomzuivering.
Bij een enzymzuivering wordt er gebruik gemaakt van een enzymen mix bestaande uit
exonuclease I en Antarctic fosfatase. Deze enzymen zullen de overtollige primers en dNTP’s
afbreken tot nucleosiden. Deze nucleosiden zullen niet interfereren tijdens volgende
stappen. Exonuclease I breekt de primers af tot nucleosiden en Antarctic phosfatase gaat
ervoor zorgen dat de dNTP’s gaan afgebroken worden tot nucleosiden.
37
Een tweede manier om een PCR product op te zuiveren is met behulp van een kolom
zuivering.
Deze kolommen bevatten glasvezels waaraan het DNA bindt in aanwezigheid van chaotrope
zouten (binding buffer). De primers en overgebleven dNTP’s zullen geëlueerd worden bij
hoge concentraties zouten (was buffer) terwijl het DNA gebonden blijft aan de glasvezels. Bij
een lagere concentratie zouten zal het DNA loskomen van de kolom in een laatste stap
(elutiebuffer) (Caljon B., 2013).
Bigdye Cycle Sequencing
Deze stap gaat de nucleotiden samenstelling van het fragment gaan bepalen. Er gaat een
mengsel gemaakt worden van dNTP’s, ddNTP’s, één primer (forward of reverse, deze gaat de
richting van de fragment analyse bepalen).
In het CMG maakt men gebruik van M13 primers die kunnen binden op de M13 tags
ingebouwd in de primer set gebruikt tijdens de eerste PCR reactie. Hierdoor kan men steeds
dezelfde M13 primers gebruiken bij de Bigdye reacties en de handelingen gemakkelijker
repeteren.
De ddNTP’s zullen naast de dNTP’s willekeurig ingebouwd worden op de enkelstrengige DNA
streng die ontstaat na denaturatie. Door het at random inbouwen van ddNTP’s zal de
ketenverlenging stop gezet worden op iedere positie. Hierdoor krijgen we een cascade aan
DNA ketens die één base variëren in grootte, en die door electroforese gescheiden kunnen
worden (Caljon B., 2013).
Opzuivering Bigdye Cycle Sequencing product
Na de Bigdye reactie stap bevat het mengsel opnieuw componenten die kunnen interfereren
met capillaire electroforese. Dit zijn vnl. resterende gelabelde ddNTP’s, overgebleven ionen,
ongebonden primers en andere.
Ook deze componenten moeten verwijderd worden om een optimaal resultaat te
garanderen. Dit kan door een Xterminator zuivering of een Ethanol/EDTA/Natriumacetaat
zuivering.
Bij een Xterminatorzuivering zal men gebruik maken van een Xterminator en een SAM
oplossing. De Xterminator oplossing zal binden met de overtollige componenten aanwezig in
het mengsel. De SAM oplossing zorgt ervoor dat het mengsel stabiel blijft (Applied
Biosystems, 2007).
Bij een Ethanolzuivering zal er EDTA toegevoegd worden aan het Bigdye product, dit gaat
zorgen voor stabiliteit doorheen de zuivering. Daarna zal een mengsel gemaakt worden van
100% ethanol met Natriumacetaat. Dit mengsel gaat ervoor zorgen dat het DNA zal binden
met de positief geladen natriumgroepen. Hierdoor zal het DNA precipiteren. Het DNA zal
gewassen worden met Ethanol 70% en opgelost worden in formamide (Caljon B., 2013).
38
Sequencing
Het CMG beschikt over een 3130Xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems); een 16 capillair
toestel en een 3730 DNA Analyzer met 48 capillairen (Applied Biosystems). Dit zijn
geautomatiseerde capillaire electroforese apparaten geschikt voor fragment analyse.
Figuur 13 3130Xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems)
Het staal wordt geïnjecteerd en in de eerste plaats gaan de Bigdye Cycle Sequencing
producten gescheiden worden op basis van hun grootte door electroforese doorheen een
capillair met gevuld met matrix. De beweging doorheen dit capillair wordt gedetecteerd
door laser die de emissie signalen van de fluorescente ddNTP’s zal opvangen en er een
multicomponent analysis op zal uitvoeren. De 4 fluorescente signalen zullen van elkaar
gescheiden worden. Na de analyse wordt er aan base calling gedaan, hier worden er basen
(G, A, T of Cs) toegekend aan een fluorescent signaal. Het verkregen eindresultaat is een
electroferogram (Caljon B., 2013).
Figuur 14 Voorbeeld Electroferogram
39
NGS: Next Generation Sequencing
Next Generation Sequencing (NGS), ookwel Second Generation Sequencing of Massive
Parallel Sequencing (MPS) genoemd. Ook met deze techniek zullen we de exacte volgorde
van de nucleotiden kunnen bepalen in een gegeven DNA of RNA streng. De vooruitgang is
dat men nu miljoenen DNA fragmenten van één (of zelfs meerdere) staal terzelfdertijd kan
sequencen. Dit ten opzichte van first generation sequencing waarbij men de nodige
fragmenten één per keer (dus achtereenvolgens) moet analyseren. Zo kan men met NGS het
volledige mitochondriale genoom analyseren in minder dan 1 dag.
Er zijn NGS toestellen op de markt van, onder andere, Life Technologies (Ion Torrent
Personal Genome Machine), van Illumina (HiSeq en MiSeq series) en van Roche (GS Junior).
Elk NGS platform is uniek in zijn methodologie. Er zijn wel overeenkomsten in de basis van
de analyse zoals staalpreparatie, sequencen en de analyse van de resultaten.
We zullen de methodologie bespreken aan de hand van de toestellen die in het CMG
aanwezig zijn. Dit zijn de Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM) (Life Technologies),
en de HiSeq 1500 (Illumina) (Caljon, B. 2013 - Grada A. & Weinbrecht K. ,2013).
Template Preparation
Bij de staalpreparatie wordt er een library of bibliotheek aangemaakt van DNA fragmenten.
Deze ‘library’ wordt dan geamplificeerd zodat men over voldoende input beschikt. Het DNA
wordt gefragmenteerd en er worden adapters, al dan niet voorzien van een barcode,
geligeerd aan deze DNA fragmenten. De DNA fragmenten worden geknipt door bijvoorbeeld
het enzym fragmentase of deze worden fysisch gefragmenteerd door het DNA te
behandelen met sonische golven. Bij het fysisch knippen met sonische golven is de lengte
van het DNA afhankelijk van de intensiteit van de golven en de behandelingstijd.
Daarna worden de DNA fragmenten clonaal geamplificeerd ter voorbereiding van het
sequencen. Bij PGM wordt er hiervoor gebruikt gemaakt van een emulsie PCR, de library
fragmenten zullen geamplificeerd worden in microbeads.
Terwijl men bij de MiSeq/HiSeq gebruik zal maken van Bridge amplification, waar men
clusters zal maken van de fragmenten op een flow cel (Grada A. & Weinbrecht K. ,2013)
Sequencing
De library fragmenten zullen dienen als template en hierop zal een nieuw DNA streng op
gesynthetiseerd worden. De nucleotiden worden één voor één ingebouwd worden op de
DNA template. Deze methode wordt 'sequencing by synthesis' genoemd.
Bij PGM zal de nucleotiden inbouw gedetecteerd worden op basis van de kleine
veranderingen in pH, afkomstig van het vrijkomen van een waterstof ion bij de inbouw van
een nucleotide in een groeiende DNA streng.
De MiSeq/HiSeq echter detecteert de nucleotiden aan de hand van fluorescentie. Er worden
immers fluorescent gelabelde nucleotiden in de DNA streng ingebouwd. (Caljon, B. 2013 Grada A. & Weinbrecht K. ,2013)
40
Analysis
De resulterende ruwe data verkregen na het doorlopen van voorgaande procedure
ondergaat vervolgens meerdere opeenvolgende analyse stappen. De informatie van de
adapter sequenties wordt verwijderd, barcodes (indien aanwezig) worden geïdentificeerd,
reads met een te lage kwaliteit of duplicate reads worden verwijderd. Daarna wordt de
verkregen data vergeleken met een referentie sequentie (Grada A. & Weinbrecht K. ,2013).
Figuur 15 Protocol Next Generation Sequencing
Ondertussen is er al een Third Generation Sequencing. Hier zou er geen voorafgaande
amplificatiestap meer nodig zijn. De nieuwe techniek zou een lagere treshold hebben
waardoor er minder input nodig is. De techniek zal zelf één molecule kunnen herkennen en
analyseren. Doordat er geen voorafgaande amplificatie nodig is, verkleint de kans op
contaminatie en 'amplificatie (PCR) fouten'. Bij PCR amplificatie kan immers nog steeds een
probleem geven met GC arme of rijke gebieden (Caljon, B., 2013).
41
Staalbereiding van DNA uit Bloed en Weefsel
Voor men analyses kan uitvoeren op DNA, moet natuurlijk dit DNA eerst vrijgemaakt worden
uit de cellen. Daarna moet het vrijgekomen DNA gezuiverd worden van al het overbodige
celmateriaal zoals proteïnen, membranen, ...
Het Centrum Medische Genetica van het UZ Brussel extraheert zelf DNA uit weefsel
(doorgaans fibroblasten, spier of lever) of leukocyten, dit gebeurt in de sector staalbeheer.
Na de DNA bereiding, word de DNA concentratie gemeten met het Nano drop toestel. De
concentratie DNA aanwezig na extractie moet hoger dan 200µg/ml zijn en de zuiverheid
moet groter zijn dan 1,80 (ratio A260/A280).
DNA bereiding uit Leukocyten
DNA extraheren uit een volume perifeer bloed volgens een geautomatiseerde magnetische
beads DNA isolatie techniek. Het gezuiverde genomische DNA (gDNA) bevat zowel
mitochondriaal als nucleair DNA.
Hiervoor wordt er gebruik gemaakt van een magnetische beads zuiveringssysteem. Na
toevoeging van lyse buffer zal het vrijgekomen DNA uit de leukocyten door het toevoegen
van een binding buffer hechten aan de beads. Deze beads zullen door in- of uitschakeling
van een magneet in suspensie zullen gebracht worden, of zullen adheren aan de roerstaven.
Men kan deze DNA isolatie ook manueel uitvoeren maar hier, in het Centrum Medische
Genetica is deze isolatie volledig geautomatiseerd en maakt men gebruik van de
‘Multiprobe®II Plus EX + Gripper’ liquid Handling Robot en de Chemagic Magnetic Separation
Module I (Chemagic MSMI) van Perkin Elmer. Dit voor een grotere througput en
betrouwbaarheid. De robot is momenteel uitgerust om tot 12 stalen terzelfdertijd te
behandelen. Op deze robot gebruikt men dan de chemagic DNA Blood Kit special (7ml),
tevens van Perkin Elmer. Deze Chemagic DNA Blood Kit Special is geschikt voor de
geautomatiseerde DNA isolatie van vers of bevroren EDTA- of Citraat perifeer bloed.
Praktisch
De eerste stap is het gewenste volume bloed overbrengen in Falcon tubes, minimaal wordt
er 5ml en maximaal 7ml perifeer bloed overgebracht. Wanneer je minder dan 5ml bloed
hebt voor DNA uit te isoleren wordt het volume aangelengd tot 5ml met Lyse buffer. De
volgende stap is de bloedstalen in de robot plaatsen. Zorg er voor dat de tubes steeds in de
juiste volgorde geplaatst zijn en dat het rekje correct in de robot staat.
Vervolgens wordt er eerst lyse buffer toegevoegd aan de bloedstalen die er zal zorgen dat de
celmembranen gelyseerd worden en dat de cel inhoud (waaronder DNA) zal vrijkomen.
Daarnaast zal er ook protease toegevoegd worden dat de overbodige celmaterialen zoals
eiwitten zal afbreken.
Als de lysebuffer en protease ingewerkt hebben wordt er bindingbuffer en magnetische
beads toegevoegd. De bindingbuffer zorgt dat het DNA en overgebleven contaminanten
binden op de magnetische beads. Het gebonden DNA zal nu zuiveringsstappen ondergaan
zodat alle overgebleven contaminanten weggewassen zullen worden; en dat men finaal
zuiver DNA heeft. Het DNA zal dan van de beads geëlueerd worden met een Elutiebuffer.
42
Figuur 16 ‘Multiprobe®II Plus EX + Gripper’ liquid Handling Robot en de Chemagic Magnetic Separation Module I
(Chemagic MSMI) van Perkin Elmer
DNA extractie uit fibroblasten (Huidbiopt), spierweefsel en urine.
De bereiding van DNA uit fibroblasten, spier en urine zal men doen aan de hand van een
fenol chloroform extractie. Dit is een techniek die nog volledig manueel uitgevoerd wordt.
DNA extractie uit Fibroblasten.
Er wordt gewerkt met gekweekte cellen, omdat men dan over een voldoende aantal cellen
beschikt om DNA uit te extraheren.
De DNA pellet word volledig opgelost in 445µL Tris-EDTA buffer pH 8.0. De TE buffer is het
oplosmiddel voor je DNA. De oplossing wordt nu overgebracht in een eppendorf buisje en er
wordt 50µL SDS toegevoegd. Het Natriumdodecylsulfaat is een detergent. Door oppervlakte
spanning zal het ervoor zorgen dat de cellen lyseren en dat het celmateriaal vrij zal komen.
Er wordt dan 5µL proteïnase K toegevoegd. Proteïnase K heeft dezelfde werking als protease.
Het zal de vrijgekomen contaminanten zoals eiwitten gaan afbreken. Dit mengsel zal men
onmiddellijk vortexen, en dan 2u incuberen in een warmwaterbad op 45°C.
Nu zal het DNA geëxtraheerd worden met een Fenol/Chloroformreactie. Men gaat 500µL
Fenol toevoegen en de oplossing goed schudden. Er zal nu een witte substantie gevormd
worden. Men gaat deze centrifugeren, de Fenol fase die zwaarder is, zal naar onderen
zakken, onder de waterige fase waar het DNA zich in bevindt. De bovenste (waterige) fase
zal over gepipetteerd worden in een nieuw eppendorf buisje en men zal opnieuw 500µL
Fenol toevoegen. Het mengsel wordt opnieuw geschud, gecentrifugeerd en men zal terug
verder werken met de bovenste waterige fase die het DNA bevat.
Men zal ook ‘wassen’ met chloroform om de overmaat aan fenol te verwijderen. Men voegt
500µL chloroform toe, goed schudden, dan centrifugeren en de bovenste laag over
pipetteren naar een nieuw eppendorf buisje. Chloroform is ook zwaarder, waardoor het ook
43
terug naar onderen zal zakken. Deze stap wordt 2 maal uitgevoerd. Men zal nu het DNA
precipiteren door bij de waterige fase een mengsel van 1ml 70% Ethanol en 45µL
Natriumacetaat toe te voegen. Wanneer het DNA aanwezig zal zijn in een grote concentratie
zal er een vlok gevormd worden.
Wanneer er geen vlok gevormd wordt, wordt het mengsel een nacht geïncubeerd bij -80°C,
en de volgende dag 10min bij 8900 rpm gecentrifugeerd. De vloeistof wordt weg
gepipetteerd en de pellet wordt droog gecentrifugeerd in een vacuümcentrifuge.
Wanneer er zich wel een vlok vormt, zal men deze opvissen, spoelen met 70% Ethanol en
laten drogen aan de lucht. Wanneer de vlok droog is, zal deze opgelost worden in een
volume TE buffer, dat afhankelijk is van de grootte van de vlok. Om er voor te zorgen dat de
vlok volledig oplost, zal men het mengsel een nacht al schuddend incuberen bij
kamertemperatuur.
DNA extractie uit Spierweefsel
Ook bij de DNA extractie uit spierweefsel wordt er gebruikt gemaakt van een
Fenol/Chloroform reactie. Het verschil zit hem bij de hoeveelheid TE buffer en proteïnase K
die toegevoegd zullen worden. Er wordt 425µL TE buffer toegevoegd en 25µL proteïnase K.
Alle volgende stappen zijn analoog aan het fibroblasten protocol.
Ook wordt er hier vertrokken van een stuk spierweefsel dat in kleine stukjes gesneden wordt
en niet van een pellet van opgekweekte cellen.
DNA extractie uit Urinaire epitheelcellen
Bij urine wordt er ook nog steeds gewerkt volgens de Fenol/Chloroform extractie. Het
protocol is volledig analoog aan de DNA extractie uit fibroblasten maar wordt vooraf gegaan
door enkele voorbereidende stappen, die de urinaire epitheelcellen pelleteren en ‘wassen’.
Verdeel de urine over Falcon tubes, centrifugeer deze 6 min, bij 3000 rpm op een
temperatuur van 18°C. Verwijder de bovenstaande vloeistof. Het sediment wordt
gevortexed, en er wordt fysiologisch water toegevoegd. Er wordt gecentrifugeerd en de
bovenstaande vloeistof wordt verwijderd. Dit is een zogenaamde was stap, deze wordt nog
een tweede maal herhaald. Het mengsel wordt overgebracht in een eppendorf buisje en
opnieuw gecentrifugeerd. De bovenste vloeistof fase wordt verwijderd en de pellet wordt
gebruikt in een protocol analoog aan het protocol DNA extractie uit fibroblasten.
44
Experimenten
45
Experimenten
Vooraleer de NGS analyse voor detectie van MERRF en MELAS gerelateerde mutaties in,
respectievelijk, het tRNA Lysine en Leucine gen kan geïmplementeerd worden in een
diagnostische setting, is het nodig deze methodologie uitgebreid te valideren.
Een validatie is het vergelijken van de nieuwe test resultaten van normale en afwijkende
DNA stalen met de resultaten van een (Gold) standaard techniek. In dit geval specifiek met
de resultaten van de DGGE en Sanger sequencing. Vermits de afwijkende DGGE patronen
systematisch worden gesequenced ter identificatie van de nucleotiden variant(en), was het
alleen nodig om de nucleotiden sequentie van DNA stalen met normale resultaten te
analyseren.
De stalen werden geamplificeerd in een (eerste) PCR reactie. Dit om over voldoende input
DNA materiaal te beschikken om vervolgens de Sanger Sequencing uit te voeren. De
amplificatie van de target sequentie werd gecontroleerd aan de hand van Microchip
Elektroforese met de LabChip GX van Perkin-Elmer.
Na de PCR reactie werden de DNA fragmenten opgezuiverd met behulp van een
kolomzuivering methode. PCR fragmenten kunnen ook opgezuiverd worden met behulp van
een enzymzuivering methode. Ervaring heeft geleerd om in het geval van PCR fragmenten
van mtDNA te werken met kolomzuivering, bij een enzymzuivering heeft men namelijk meer
last van interfererende slepende pieken die de diagnose van heteroplasmie kunnen
bemoeilijken.
Na de opzuivering wordt er een tweede PCR, een Bigdye reactie uitgevoerd, waarna
opnieuw een zuivering zal plaatsvinden. Deze (tweede) zuivering kan een
natrium/EDTA/Ethanol zuivering of een Xterminator zuivering zijn. De keuze van de
opzuiveringsmethode is meestal afhankelijk van het aantal DNA stalen dat verwerkt zal
worden.
Na de tweede opzuivering wordt de nucleotide sequentie van de DNA fragmenten
geanalyseerd met behulp van geautomatiseerde fragment analysers (ABI 3130Xl of de
ABI3730).
46
Ik heb tijdens de duur van mijn volledige stage een totaal van 129 controle DNA stalen
geanalyseerd. De DNA fragmenten werden geamplificeerd vanaf gDNA bereid uit weefsel
(vnl. spier), leukocyten of epitheel cellen van een urine staal. Vaak wordt er ook materiaal
door zusterlaboratoria doorgestuurd zonder expliciete vermelding van de oorsprong.
Alhoewel het hier dan vnl. ook om leukocyten gaat wordt dit door het CMG bij ontvangst
geregistreerd als ‘onbekend’.
Tabel 1 Geanalyseerde Stalen met Sanger Sequencing
Stalen MERRF - MELAS
Bloed
89
Weefsels
25
Urine
1
Onbekend
14
Totaal
129
PCR
Deze PCR amplificatie werd steeds uitgevoerd in de Pre-PCR ruimte.
Materiaal en methoden
Producten








Lichrosolv water – VWR International INC
AmpliTaq 360 Buffer 10x – Life Technologies Europe
25mM Magnesium Chloride – Life Technologies Europe
DNA polymerisation mix – VWR International INC
AmpliTaq 360 DNA Polymerase – Life Technologies Europe
DNA staal
MelasSEQf/r 2µM (primermix) – IDT
F13fs/rs 2µM (primermix) – IDT
Tabel 2 Primermix MERRF (F13fs/fr) – MELAS (MelasSEQf/r) analyse
PRIMERMIX
Naam
F13fs/rs
MelasSEQf/r
F13fs
F13rs
MelasSEQf
MelasSEQr
Sequentie (5’3’)
tgtaaaacgacggccagtTGCCCATCGTCCTAGAATTA
caggaaacagctatgaccTTGGGTGATGAGGAATAGTG
tgtaaaacgacggccagtGGTGCAGCCGCTATTAAAG
caggaaacagctatgaccGGTTGTAGTAGCCCGTAGG
Tag
M13f
M13r
M13f
M13r
Toestel

Veriti Thermal Cycler – Applied Biosystems
47
Reactiemengsel
Er werd steeds gewerkt in een eindvolume van 50µL. Voor 1 PCR reactie werd het volgende
reactiemengsel gebruikt:
Samenstelling
Lichrosolv water
AmpliTaq 360 Buffer
25mM Magnesium Chloride
DNA Polymerisation mix
AmpliTaq 360 DNA
Polymerase
Totaal
Volume (µL)
12.75
5.0
4.0
8.0
0.25
30
Er wordt een primermix gemaakt van de Forward en de Reverse primer met een
concentratie van 2 µM. Van deze mix wordt er 5 µL toegevoegd aan het reactiemengsel.
Er wordt een DNA verdunning gemaakt van 15 µL. Standaard wordt er in geval van mtDNA
PCR reacties 1 µL gDNA toegevoegd aan 14 µL water. Er wordt steeds een blanco reactie
meegenomen. Hieraan worden alle reagentia met uitzondering van DNA materiaal
toegevoegd. Het volume DNA wordt vervangen door15 µL water.
Aan de primers werd een M13tag gehangen zodat men bij de BigDye Cycle Sequencing van
meerdere stalen steeds dezelfde M13 primers kan gebruiken, en deze stap kan
uniformiseren.
Programma
Touchdown PCR
Denaturatie
1’
95°C
Denaturatie
Annealing
15"
15"
95°C
65-54°C
-0.5°C/cyclus
Extensie
30"
Denaturatie
Annealing
Extensie
15"
15"
30"
Finale
Extensie
Koeling
7’
72°C
x22
95°C
54°C
72°C
x10
72°C
∞
10°C
48
Microchip elektroforese (Calliper)
De PCR amplificatie producten van de eerste PCR reactie werden gecontroleerd aan de hand
van microchip elektroforese. Deze procedure werd altijd uitgevoerd in de Post-PCR ruimte.
Materiaal en methoden
Materiaal






PCR product van eerste PCR
Lichrosolv water – VWR International INC
96 Well plaat
Caliper LabChip GX, Perkin Elmer
HT-DNA 5K microchip – Perkin Elmer
Reagentiakits – Perkin Elmer
o Interne standaard: DNA Upper/Lower merker
o Externe standaard: DNA ladder
o DNA Matrix
o DNA gel Dye
De HT-DNA 5K microchip kan DNA fragmenten analyseren met een grootte tussen 1005000 bp.
Bij de microchip elektroforese werd er steeds gebruik gemaakt van een interne en externe
standaard. De interne standaard is een upper en lower merker met een gekende
concentratie die toegevoegd werd aan elk te analyseren staal. Met behulp van de interne
standaard kon, in samenspraak met de externe standaard (moleculaire ladder die om de 12
stalen geïnjecteerd werd), de fragment lengte en de concentratie van de geïnjecteerde PCR
amplicons bepaald worden.
Protocol
Er werd water in een 96 Well plaat gebracht. Daaraan werd 13 µL PCR product toegevoegd.
Er werd kort gecentrifugeerd en dan geanalyseerd met de Calliper LabChip GX van Perkin
Elmer. Het Caliper toestel zelf verzorgt het dispenseren van de interne en externe
standaarden.
49
Voorbeeld Resultaat
Figuur 16: Microchip elektroforese – 'MERRF' fragment
Figuur 17 Microchip elektroforese - 'MELAS' fragment
Er zijn unieke DNA fragmenten aanwezig met de verwachte fragment lengte. Er is geen
amplificatie van de NTC.
50
Kolomzuivering
Materiaal en methoden
Materiaal




High Pure PCR product Purification kit - Roche
 Was buffer
 Elutiebuffer
 Binding buffer
 Collection tube
 Kolom
PCR product
Lichrosolv water - VWR International INC
Eppjes Centrifuge - Hettich Universal
Protocol
De kolommen werden geplaatst in de bijhorende collectie tubes en overeenkomstig en
correct genummerd.
Het PCR product werd aangelengd met water tot 100 µL. Hieraan werd 500 µL binding buffer
toegevoegd. Dit werd vervolgens overgebracht op de correcte kolom.
De kolom werd gecentrifugeerd op 14000 rpm gedurende 1 min in een eppjes centrifuge.
Het eluaat werd verwijderd en er werd 500 µl wasbuffer toegevoegd.
De kolom werd gecentrifugeerd op 8000 rpm gedurende 1 min in een microtube centrifuge.
Het eluaat werd opnieuw verwijderd. De kolom werd een tweede keer gewassen met 200 µL
was buffer.
De kolom werd nog eens gecentrifugeerd op 8000 rpm gedurende 1 min in een microtube
centrifuge.Het eluaat werd verwijderd en de kolom werd nog een keer kort droog
gecentrifugeerd op 8000 rpm gedurende 30 seconden. Deze stap zorgt ervoor dat er geen
was buffer meer zal achterblijven op de randen van de kolom.
De kolom werd overgebracht in een nieuw eppendorf buisje en het DNA werd geëlueerd
met de elutiebuffer. Het gebruikte elutie volume is afhankelijk van de gebruikte hoeveelheid
DNA fragment. Deze hoeveelheid werd gemeten tijdens de Calliper LabChip GX
elektroforese.
51
Bigdye Cycle Sequencing
De Bigdye reactie werd steeds uitgevoerd in de Post-PCR ruimte.
Materiaal en methoden
Materiaal







BigDye Sequencing Buffer – Life Technologies Europe
BigDyeTerm v1.1 (Ready Reaction Premix) – Life Technologies Europe
M13 primer forward - IDT
M13 primer reverse - IDT
Lichrosolv Water – VWR International INC
Opgezuiverd PCR product
PCR toestel
Reactiemengsel
Er werd een mix gemaakt met de forward primer en een mix met de reverse primer.
Voor 1 BigDye reactie gelde het volgende reactiemengsel.
Samenstelling
BigDye Sequencing buffer (5x)
Ready Reaction Premix
M13 primer F
M13 primer R
Lichrosolv Water
Totaal
Volume
Forward
2
0.5
1
5.9
9.4
(µL) Volume (µL)
Reverse
2
0.5
1
5.9
9.4
Er werd 9.4 µL mix genomen en hieraan werd 0.6 µL opgezuiverd PCR product toegevoegd.
Programma
BigDye PCR
Denaturatie
1’
96°C
Denaturatie
Annealing
10"
5"
96°C
50°C
Extensie
1’15"
Koeling
∞
60°C
x25
10°C
52
Xterminator/ Ethanol/EDTA/Natriumacetaat precipitatie
Materiaal en methoden Xterminator
Materiaal






BigDye Xterminator Purification Kit – Life Technologies Europe
BigDye product
(Lichrosolv Water – VWR International INC)
96 Well Plaat – Life Technologies Europe (+ deksel + septum)
vortex
plaatcentrifuge
Reactiemengsel
Voor 1 staal:
Samenstelling Premix
Xterminator Solution
SAM solution
Totaal
Volume (µL)
7.5
35
42.5
Protocol
Er werd 42.5µL premix aangemaakt, die dan verdeeld werd over een 96 Well plaat. Aan elke
well werd er telkens 2 µL BigDye product toegevoegd.
De plaat werd gevortexed op maximale snelheid gedurende 32 minuten. Daarna werd de
plaat gecentrifugeerd 2 min op 1000 g en op de ABI 3130Xl geladen voor analyse. Er werd
steeds per 16 wells gewerkt. Aan de lege wells werd er 42.5 µL water toegevoegd.
Materiaal en methoden Ethanol/EDTA/Natriumacetaat precipitatie
Materiaal







125mM EDTA
3M Natriumacetaat pH 5.2
Ethanol 100% (diepvriezer)
Ethanol 70% (diepvriezer)
LichrosolvWater- VWR International INC
Formamide – Life Technologies Europe
BigDye product
Protocol
Er werd 1 µL 125 mM EDTA in de wells van een 96 microwell plaat gepipetteerd. Hieraan
werd het volledige BigDye product toegevoegd.
53
Er werd een NaAC/EtOH mengsel gemaakt (30 ml EtOH 100 % + 1200 µL 3M Na-Acetaat pH
5.2) en hiervan werd 26 µL toegevoegd aan het BigDye product/EDTA mengsel. Er werd goed
op en neer gepipetteerd om alles zorgvuldig te mengen. De plaat werd dan afgedekt met
een septum en 15 min op ijs geplaatst.
De plaat werd vervolgens gedurende 30 min gecentrifugeerd aan 2250 g, op 4°C. Na deze
stap werd de plaat omgedraaid gecentrifugeerd gedurende 1 min aan 185 g, op 4°C, om het
supernatans te verwijderen.
Daarna werd er 35 µL Ethanol 70 % toegevoegd om het pellet te wassen. De plaat werd 15
min gecentrifugeerd aan 1650 g op 4°C. Het supernatans werd opnieuw verwijderd door de
plaat omgekeerd te centrifugeren.
Deze pellet werd opgelost in 15 µL Formamide. De plaat werd kort gecentrifigeerd in een
plaatcentrifuge voor men deze in de geautomatiseerde sequenser plaatste.
54
Sequencing + Analyse
Materiaal en methoden
Materiaal

ABI Genetic Analyzer (ABI Xl3130 of ABI3730) – Applied Biosystems/Life Technologies
Protocol
Na de laatste zuivering (Xterminator of Ethanol/EDTA/Natriumacetaat precipitatie) werden
de stalen geanalyseerd met capillaire elektroforese met een ABI Xl3130 of ABI 3730 toestel.
Stalen die gezuiverd werden met Xterminator werden geladen op de ABI Xl3130 (16 capillair)
en gerund volgens het Xterminator 5sec protocol. De andere stalen werden geladen op de
ABI 3730 en gerund onder het EtOH standaard protocol.
De ruwe data werd geanalyseerd met GeneMapper Software van Applied Biosystems/Life
Technologies.
Figuur 18: Voorbeeld van ruwe data MELAS
Basecalling zorgt ervoor dat de correcte base toegekend wordt aan het fluorescentie signaal
opgevangen door het detectiesysteem van het fragment analyser toestel.
Het verkregen eindresultaat is een electroferogram dat zowel manueel als met het software
programma Seqpilot, nagelezen wordt op homoplasmische en/of heteroplasmische
veranderingen. De sequentie wordt vergeleken met de revised Cambridge Reference
Sequence (rCRS).
55
Resultaten
Sanger Sequencing
Tijdens mijn eindwerkstage heb ik 129 stalen geanalyseerd met behulp van de dideoxy
Sanger Sequencing technologie. Het gDNA van deze stalen werd geëxtraheerd uit bloed
(leukocyten), weefsel (spier) of urine (epitheel cellen).
Deze 129 patiënten stalen werden voorafgaand geanalyseerd met de DGGE methodologie
tussen juni 2013 en februari 2014, en resulteerden allen in een normaal elektroforese
patroon. Vervolgens werden deze DNA stalen geanalyseerd met Sanger Sequencing om de
nucleotidenvolgorde na te gaan. De Sanger sequencing analyse resulteert in een
electroferogram. Dit electroferogram werd manueel en/of met Seqpilot software nagelezen
ten op zichtte van de referentiesequentie. Als referentiesequentie werd er gebruik gemaakt
van NC_012920 (www.Mitomap.org). Deze referentie stemt overeen met de revised
Cambridge Reference Sequence (rCRS). De DNA fragmenten die werden geanalyseerd
kunnen terug gevonden worden in bijlage.
Het tRNALysine gen is gepositioneerd tussen positie m.8224 en m.8420 (fragment van
196bp). Voor MELAS werd het tRNA Leucine gen geanalyseerd, gelegen tussen positie
m.3031 en positie m.3430 (fragment van 391bp).
Tabel 3 Resultaten experiment
Gen
tRNALeu
tRNALys
# stalen
geanalyseerd
DGGE
129
129
# stalen
geanalyseerd
Sanger
Sequencing
129
129
Discrepantie
geen
geen
Sensitiviteit
Specifiteit
100%
100%
100%
100%
Er werden geen homoplasmische of heteroplasmische veranderingen terug gevonden in de
geanalyseerde stalen. Alle 129 normale resultaten, verkregen door DGGE, werden bevestigd
met behulp van een nucleotiden sequentie analyse.
Er werd aan de verwachtingen voldaan. Er is geen discrepantie terug te vinden met
voorgaande resultaten.
De specificiteit, een maat voor hoe specifiek een test is, komt overeen met het percentage
terecht negatieve resultaten bij de patiënten, of anders geformuleerd, met het aantal vals
positieven. Bij deze testen komt dit dus overeen met de resultaten waar men een
verandering in de nucleotide volgorde zou waarnemen. De specificiteit van de resultaten is
100%, er werden geen vals positieve resultaten terug gevonden.
De sensitiviteit vertelt iets meer over het percentage terecht positieven onder de resultaten,
of anders geformuleerd, de aanwezigheid van vals negatieve resultaten. We kunnen
concluderen dat er geen vals negatieve resultaten zijn en dus is de sensitiviteit van deze test
eveneens 100%
56
Resultaat addendum: Next Generation Sequencing
Tijdens mijn eindwerkstage op het Centrum Medische Genetica is men er niet in geslaagd
om het analyse protocol van de Next Generation Sequencing technologie te finaliseren. De
analyses worden uitgevoerd met een MiSeq toestel (Illumina) dat zich bevindt op de ULB
campus van het Erasmus Ziekenhuis, en met een HiSeq toestel (Illumina) aanwezig in het
centrum voor Medische Genetica
Ik heb de NGS experimenten zelf niet ‘hands on’ kunnen uitvoeren. Het betreft hier immers
een zeer dure technologie, die net geïntroduceerd werd op de werkvloer. Op dit moment is
een NGS analyse voorbehouden voor enkele vaste medewerkers. Ik heb natuurlijk wel de
experimenten van nabij mogen meevolgen.
Het is niet mogelijk om de mtDNA PCR fragmenten voor de NGS experimenten te genereren
met gebruik van de ‘DGGE’ primers. Deze primers binden ook aan de zogenaamde NUMT
sites. Dwz. aan mitochondriale DNA sequenties aanwezig in het nucleair DNA. Deze nucleaire
amplificatie producten interfereren niet met DGGE of Sanger sequencing analyses. In NGS
experimenten wordt er echter zo diep gesequenced dat er laag frekwente allelen kunnen
interfereren met het mtDNA materiaal en op deze manier een heteroplasmie kunnen
suggereren. Het was dus nodig om de primers te herdesignen. Bovendien werd de unieke
amplificatie van mtDNA gecontroleerd via het gebruik van gDNA bereid uit rho zero cellen.
Dit zijn cellen zonder mtDNA. Een positieve amplifcatie voor rho zero cellen kan dus alleen
van nucleair DNA afkomstig zijn.
In een eerste NGS trial run werden er 50 amplicons tRNA Lysine en 50 amplicons tRNA
Leucine geanalyseerd. De technische uitvoering van deze test was geslaagd. Maar er zijn nog
problemen met de verwerking van de ruwe data door de software (in huis ontworpen
pipeline) Er zijn discrepanties zijn met de mapping van de data ten opzichte van de
referentiesequentie, en er zijn waarschijnlijk problemen met de statistische berekeningen.
De fouten in verband met het mappen van de resultaten worden waarschijnlijk veroorzaakt
door de aanwezige repeats en homopolymerische stretches.
57
NTC’s, Rho Zero (zonder mtDNA) en 2 mislukkingen
Figuur 179 aantal geidentificeerde reads met NGS voor MERRF/MELAS
Een oplossing voor deze problemen kan het herdesignen van de primers zijn.
58
Discussie
De resultaten zijn zoals verwacht werd. De stalen die een ‘normaal’ patroon vertoonden op
DGGE, bevatten ook na Sanger Sequencing analyse geen homoplasmische en/of
heteroplasmische veranderingen ten opzichte van de referentiesequentie.
Er werden geen discrepanties gevonden tussen de resultaten van de DGGE analyse en deze
van de Sanger sequencing analyse.
De resultaten van de Next Generation Sequencing voor de tRNA Lysine en tRNA Leucine
fragmenten waren niet beschikbaar tijdens deze stage periode zodat de data niet kunnen
vergeleken worden.
59
Besluit
Ik heb tijdens mijn stage op het centrum Medische Genetica actief meegeholpen aan de
omschakeling van de gebruikelijke DGGE screening technologie naar Next Generation
Sequencing. Deze experimenten kaderen in een breed initiatief van het gebruik van Next
Generation Sequencing technologie voor de analyse van patiënten stalen, verdacht van een
mitochondriale aandoening, op de aanwezigheid van mtDNA mutaties.
Tijdens een validatie experiment moeten er minstens 100 patiënten stalen, zowel met
normale als afwijkende resultaten, geanalyseerd worden met behulp van DGGE, Sanger
sequencing en Next Generation sequencing. De delen Sanger sequencing en DGGE zijn nu
afgerond. Er rest nog de analyse van deze patiënten stalen met Next Generation Sequencing.
Het protocol voor de Next Generation Sequencing analyse is nog niet volledig
geoptimaliseerd. Deze eerste resultaten vertoonden, tegen de verwachtingen in, teveel
discrepanties. Deze problematiek is, hoogst waarschijnlijk, gerelateerd aan het algoritme van
de software analyse. Deze moet dus aangepast worden, opdat er geen problemen meer
kunnen ontstaan bij de mapping van de ruwe data. Vervolgens zal men (minstens) 100
normale en 100 afwijkende patiënten stalen (gekende variantie t.o.v. de referentiesequentie)
analyseren. Tenslotte zal men dan de resultaten van de 3 verschillende technieken met
elkaar onderling vergelijken en verwerken in een validatie rapport, zodat in een nabije
toekomst Next Generation Sequencing als nieuwe methodologie kan geïntroduceerd worden
voor diagnostische analyse van de tRNA Leucine en Lysine genen van het mtDNA van
patiënten stalen.
Het waren 3 toffe maanden in een toffe werkomgeving. Bij deze nog een laatste bedankje
aan de mensen van het Centrum Medische Genetica van UZ Brussel.
60
Referenties
Applied Biosystems. (2007). Applied Biosystems BigDye XTerminator Purification Kit:
Protocol. Geraadpleegd op 27 februari 2014 via
http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/mcb_support/documents/generaldocum
ents/cms_042772.pdf
Caljon B. (november 2013). Technologie: PCR – Polymerase Chain Reaction. Universitair
Ziekenhuis Brussel., pp 1-20.
Caljon B. (november 2013). Technologie – Sanger Sequencing. Universitair Ziekenhuis
Brussel., pp 1-40.
Chinnery P. F.,& Hudson G. (2013). Mitochondrial genetics. Brittish Medical Bulletin., pp135159. Oxford University Press.
Cold Spring Harbor Laboratory. Biology Animation Library. Geraadpleegd op 24 februari 2014
via http://www.dnalc.org/resources/animations/cycseq.html
Diaz, F., Kotarsky, H., Fellman, V. & Moraes, C. T. (Augustus 2011). Mitochondrial disorders
caused by mutations in respiratory chain assembly factors. National Institutes of Health
Public Acces, pp 197-204.
DiMauro S. & Davidzon G. (2005). Mitochondrial DNA and disease. Annals of Medicine., pp
222-230.
Dimauro, S. & Hirano, M. (2013). Melas. Gene Reviews. Geraadpleegd op 24 april 2014 via
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1233/
Dunnen, J.T. & Antonarakis, S.E. (2000). Mutation nomenclature extensions and suggestions
to describe complex mutations: a discussion. Geraadpleegd op 1 maart 2014 via
http://www3.interscience.wiley.com/cgi-bin/fulltext/68503056/PDFSTART
Genetics Home Reference. (2014). What is mitochondrial DNA? Geraadpleegd op 6 mei 2014
via http://ghr.nlm.nih.gov/handbook/basics/mtdna
Genetics Home Reference (2011). Leigh Syndrome. Geraadpleegd op 26 maart 2014 via
http://ghr.nlm.nih.gov/condition/leigh-syndrome
Genetics Home Reference (2014). MT-TL1. Geraadpleegd op 15 april 2014 via
http://ghr.nlm.nih.gov/gene/MT-TL1
Genetics Home Reference. (2014). MT-TK. Geraadpleegd op 15 april 2014 via
http://ghr.nlm.nih.gov/gene/MT-TK
61
Genetics Home Reference. (2014). Myoclonic epilepsy with ragged-red fibers. Geraadpleegd
op 17 maart 2014 via http://ghr.nlm.nih.gov/condition/myoclonic-epilepsy-with-ragged-redfibers
Genetics Home Reference. (2006). Neuropathy, ataxia and retinitis pigmentosa.
Geraadpleegd op 6 mei 2014 via http://ghr.nlm.nih.gov/condition/neuropathy-ataxia-andretinitis-pigmentosa
Grada, A. & Weinbrecht, K. (2013). Next Generation Sequencing: Methodology and
Application. Journal of Investigative Dermatology, 133. Geraadpleegd op 4 maart 2014 via
http://www.nature.com/jid/journal/v133/n8/full/jid2013248a.html
Green, S.J., Leigh, M.B. & Neufeld, J.D. (2009). Handbook of Hydrocarbon and Lipid
Microbiology: Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) for microbial community
analysis. Heidelberg: Springer
Homo Sapiens mitochondrion, complete genome. NCBI Reference Sequence: NC_012920.1.
Geraadpleegd via http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/251831106.
Schon E.A., DiMauro S. & Hirano M. (December 2012). Human Mitochondrial DNA: roles of
inherited and somatic mutations. Nature review. pp 878-890. Macmillan Publishers Limited.
Kinderneurologie. (2008). Geraadpleegd op 15 maart 2014 via
http://www.kinderneurologie.eu/ziektebeelden/gezicht/leber.php
Kinderneurologie. (2007). Geraadpleegd op 26 maart 2014 via
http://www.kinderneurologie.eu/ziektebeelden/stofwisseling/leigh.php
Laboratory for Microbial Ecology, Departement Earth, Ecological and Environmental
Sciences. University of Toledo.(2004). Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE).
Geraadpleegd op 15 februari 2014 via
http://www.eeescience.utoledo.edu/Faculty/Sigler/Von_Sigler/LEPR_Protocols_files/DGGE.
pdf
LHON. Leber’s Hereditary Optic Neuropathy. Geraadpleegd op 6 maart 2014 via
http://lhon.org/lhon/LHON.html
London Health Sciences Centre. (2010). Mitochondrial Learning Tool Homepage.
Geraadpleegd op 6 mei 2014 via
http://www.lhsc.on.ca/Patients_Families_Visitors/Genetics/Inherited_Metabolic/Mitochond
ria/index.htm
62
Mancuso M., Orsucci D., Angelini C., Bertini E, Carelli V., Comi G. P., Donati A., Minetti C.,
Moggio M., Mongini T., Servidei S., Tonin P., Toscano A., Uziel G., Bruno C. Caldarazzo Ienco
E., Filosto M., Lamperti C., Catteruccia M., Moroni I., Musumeci O., Pegoraro E., Ronchi D.,
Santorelli F. M., Sauchelli D., Scarpelli M. Sciacco M., Valentino M. L., Vercelli L., Zeviani M. &
Siciliano G., (mei 2013). Phenotypic heterogeneity of the 8344 A>G mtDNA “MERRF”
mutation. Neurology. pp 2049-2054
Mancuso M., Orsucci D., Angelini C., Bertini E, Carelli V., Comi G. P., Donati A., Minetti C.,
Moggio M., Mongini T., Servidei S., Tonin P., Toscano A., Uziel G., Bruno C. Caldarazzo Ienco
E., Filosto M., Lamperti C., Catteruccia M., Moroni I., Musumeci O., Pegoraro E., Ronchi D.,
Santorelli F. M., Sauchelli D., Scarpelli M. Sciacco M., Valentino M. L., Vercelli L., Zeviani M. &
Siciliano G., (december 2013). The m.3243A>G mitochondrial DNA mutation and related
phenotypes. A matter of gender? Journal of Neurology. Springer-Verlag Berlin Heidelberg
Menselijk lichaam. Mitochondrie. Geraadpleegd op 4 februari 2014 via
http://www.menselijk-lichaam.com/cel/mitochondrie
MITOMAP: A human mitochondrial genome database. Geraadpleegd via
http://www.mitomap.org/MITOMAP
Molecular Expressions. (2004). Mitochondria. Geraadpleegd op 22 januari 2014 via
http://micro.magnet.fsu.edu/cells/mitochondria/mitochondria.html
National Institute of Neurological Disorders and Stroke. (2014). Myoclonus Fact Sheet.
Geraadpleegd op 17 februari 2014 via
http://www.ninds.nih.gov/disorders/myoclonus/detail_myoclonus.htm
Nederlandse Vereniging voor Neurologie. (2012). Patiëntenvoorlichting
Geraadpleegd op 17 februari 2014 via
http://www.neurologie.nl/publiek/patientenvoorlichting/ataxie
Ataxia.
Neuromuscular.(2014). Mitochondrial DNA(mtDNA): General features. Geraadpleegd op 23
april 2014 via http://neuromuscular.wustl.edu/mitosyn.html#general
Sanne Jense. (2005). Kennislink: Mitochondriën zorgen voor zichzelf. Geraadpleegd op 2 mei
2014 via http://www.kennislink.nl/publicaties/mitochondrien-zorgen-voor-zichzelf
Schon, E. A., Dimauro, S. & Hirano M. (december 2012). Human mitochondrial DNA: roles of
inherited and somatic mutations. Nature, 13, pp.878-890.
Tachibana M., Amato P., Sparman M., Woodward J., Sanchis D.M., Ma H., Gutierrez N.M.,
Tippner-Hedges R., Kang E., Lee H.S., Ramsey C., Masterson K., Battaglia D., Lee D., Wu D.,
Jensen J., Patton P., Gokhale S., Stouffer R. &Mitalipov S. (2012). Towards germline gene
therapy of inherited mitochondrial diseases. Nature. Geraadpleegd op 6 mei 2014 via
http://www.nature.com/nature/journal/vaop/ncurrent/full/nature11647.html
63
Thorburn, D.R., Rahman, S. (2014). Mitochondrial DNA-Associated Leigh Syndrome and
NARP. GeneReviews. Geraadpleegd op 23 maart 2014 via
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1173/
Tremor.nl, Geraadpleegd op 4 maart 2014 via http://www.tremor.nl/introductie.html.
Ylikallio E., Suomalainen A. (2012). Trends in molecular medicine:
mitochondrial diseases. Annals of Medicine. pp 41-59.
Mechanism of
Yu-Wai-Man, P. & Chinnery, P.F. (2013). Leber Hereditary Optic Neuropathy. GeneReviews.
Geraadpleegd op 6 maart 2014 via http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1174/
64
Bijlagen
-
DNA fragmenten MERRF/MELAS met bijhorende primers + mutatie
Voorbeeld controle van PCR fragmenten met microchip elektroforese.
Voorbeeld electroferogram van MERRF fragment – forward met een normaal
patroon.
Voorbeeld electroferogram van MERRF fragment –reverse met een normaal patroon.
Voorbeeld electroferogram van MELAS fragment – forward met een normaal
patroon.
Voorbeeld electroferogram van MELAS fragment – reverse met een normaal patroon.
65
DNA fragmenten MERRF/MELAS met bijhorende primers + mutatie
MERRF
8161 ctacggtcaa tgctctgaaa tctgtggagc aaaccacagt ttcatgccca tcgtcctaga
8221 attaattccc ctaaaaatct ttgaaatagg gcccgtattt accctatagc accccctcta
8281 ccccctctag agcccactgt aaagctaact tagcattaac cttttaagtt aaagattaag
8341 agaaccaaca cctctttaca gtgaaatgcc ccaactaaat actaccgtat ggcccaccat
8401 aattaccccc atactcctta cactattcct catcacccaa ctaaaaatat taaacacaaa
8461 ctaccaccta cctccctcac caaagcccat aaaaataaaa aattataaca aaccctgaga
8521 accaaaatga acgaaaatct gttcgcttca ttcattgccc ccacaatcct aggcctaccc
Forward Primer MERRF
Reverse Primer MERRF
a
Gekende mutaties MERRF
MELAS
3001 ggacatcccg atggtgcagc cgctattaaa ggttcgtttg ttcaacgatt aaagtcctac
3061 gtgatctgag ttcagaccgg agtaatccag gtcggtttct atctacnttc aaattcctcc
3121 ctgtacgaaa ggacaagaga aataaggcct acttcacaaa gcgccttccc ccgtaaatga
3181 tatcatctca acttagtatt atacccacac ccacccaaga acagggtttg ttaagatggc
3241 agagcccggt aatcgcataa aacttaaaac tttacagtca gaggttcaat tcctcttctt
3301 aacaacatac ccatggccaa cctcctactc ctcattgtac ccattctaat cgcaatggca
3361 ttcctaatgc ttaccgaacg aaaaattcta ggctatatac aactacgcaa aggccccaac
3421 gttgtaggcc cctacgggct actacaaccc ttcgctgacg ccataaaact cttcaccaaa
3481 gagcccctaa aacccgccac atctaccatc accctctaca tcaccgcccc gaccttagct
3541 ctcaccatcg ctcttctact atgaaccccc ctccccatac ccaaccccct ggtcaacctc
Forward Primer MELAS
Reverse Primer MELAS
a Gekende mutatie MELAS
66
Voorbeeld controle van PCR fragmenten met microchip elektroforese.
MELAS
Blanco
MERRF
Blanco
67
Voorbeeld electroferogram van MERRF fragment – forward met een normaal patroon.
68
Voorbeeld electroferogram van MERRF fragment –reverse met een normaal patroon.
69
Voorbeeld electroferogram van MELAS fragment – forward met een normaal patroon.
70
Voorbeeld electroferogram van MELAS fragment – reverse met een normaal patroon.
71