moleculaire biologie

PROEFPRACTICUM
MOLECULAIRE
BIOLOGIE
Plasmiden komen van nature voor in bacteriën en bevatten vaak genen
die coderen voor eiwitten die resistentie geven tegen bepaalde
antibiotica. Deze plasmiden worden in de Moleculaire Biologie veel
gebruikt omdat het plasmide DNA makkelijk uit bacteriën geïsoleerd
kan worden en kan worden overgebracht naar andere organismen.
Hieronder is het kaartje te zien van een plasmide dat uit een bacterie
(Escherichia coli) is geïsoleerd. Het circulaire plasmide ziet er als volgt
uit:
PvuII (5914) PstI (138)
Ampicillin
resistance gene
XhoI (694)
1
Dit plasmide hebben we
geknipt met telkens 1
restrictie enzym:
XhoI (1076)
PvuII
pAN8.1
of
6089bp
PstI
PvuII (2100)
PvuII (3550)
Phleomycin
resistance gene
of
XhoI
Zoals op het kaartje te zien is, is het totale plasmide 6089 baseparen
lang. Plasmiden kunnen `geknipt` worden met restrictie enzymen. Dit
zijn enzymen die heel specifiek een korte DNA sequentie herkennen (bv
6 basenparen) en deze enzymen knippen dan het DNA molecuul op die
plaats. Het knippen van een plasmide met verschillende enzymen levert
fragmenten op die verschillend zijn van grootte. De positie waar de
verschillende restrictie enzymen knippen staat aangegeven in de figuur.
Deze DNA fragmenten gaan we tijdens het proefstuderen op een
agarose gel analyseren en bekijken.
Het geknipte DNA wordt in de slotjes van de agarose gel gepipetteerd
en er wordt een elektrische spanning over de gel aangebracht.
Omdat DNA negatief geladen is, zal het DNA zich naar de positieve pool
bewegen. De snelheid waarmee het DNA zich door de gel beweegt is
afhankelijk van de grootte van het DNA. Kleine DNA moleculen bewegen
sneller door de gel dan grote moleculen.
De grootte van een onbekend DNA fragment kan je afleiden als je een
zogenaamde molecuulgewichtmarker mee laat lopen. Dit is een
verzameling DNA moleculen met bekende groottes.
Huiswerkopdracht
- Voorspel aan de hand van het restrictiekaartje de groottes van de
DNA fragmenten die je verwacht na het knippen van het plasmide met
de verschillende restrictie enzymen (PvuII, PstI and XhoI).