diermodellen voor de studie van de ziekte van crohn en colitis
advertisement
UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar 2015-2016 DIERMODELLEN VOOR DE STUDIE VAN DE ZIEKTE VAN CROHN EN COLITIS ULCEROSA door Robin TEMMERMAN Promotoren: Prof. dr. F. Van Immerseel K. Vermeulen Literatuurstudie in het kader van de Masterproef © 2016 Robin Temmerman Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden. Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef. UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar 2015-2016 DIERMODELLEN VOOR DE STUDIE VAN DE ZIEKTE VAN CROHN EN COLITIS ULCEROSA door Robin TEMMERMAN Promotoren: Prof. dr. F. Van Immerseel K. Vermeulen Literatuurstudie in het kader van de Masterproef © 2016 Robin Temmerman VOORWOORD In dit voorwoord zou ik graag Karen Vermeulen van harte willen bedanken voor de begeleiding, hulp en de uitgebreide verbetering die zij mij gegeven heeft voor het tot stand brengen van dit werk. Ook Prof. Dr. Filip Van Immerseel zou ik willen bedanken voor het lezen en het verbeteren van het werk. INHOUDSOPGAVE SAMENVATTING ................................................................................................................................................ p. 1 INLEIDING........................................................................................................................................................... p. 2 LITERATUURSTUDIE ......................................................................................................................................... p. 3 1. PATHOGENESE EN PATHOFYSIOLOGIE VAN DE ZIEKTE VAN CROHN EN COLITIS ULCEROSA .... p. 3 1.1 DE IMMUUNRESPONS ........................................................................................................................ p. 3 1.2 LUMINALE MICROBIËLE ANTIGENEN EN ADJUVANTIA (DE INTESTINALE MICROBIOTA) .......... p. 5 1.2.1 Adjuvantia ...................................................................................................................................... p. 5 1.2.2 Antigenen ...................................................................................................................................... p. 6 1.3 GENETICA ........................................................................................................................................... p. 7 1.4 OMGEVINGSFACTOREN .................................................................................................................... p. 7 2. DIERMODELLEN VOOR DE STUDIE VAN DE ZIEKTE VAN CROHN EN COLITIS ULCEROSA ............. p. 9 2.1 INLEIDING EN HISTORIEK .................................................................................................................. p. 9 2.2 CLASSIFICATIE VAN IBD DIERMODELLEN EN OVERZICHT ........................................................... p. 9 2.3 BESPREKING VAN DE VOORNAAMSTE IBD DIERMODELLEN ..................................................... p. 11 2.3.1 Antigeen-specifieke vormen van colitis en colitis geïnduceerd door microbiële agentia .............. p. 11 2.3.2 Andere induceerbare vormen van IBD diermodellen ................................................................... p. 13 2.3.2.1 Chemische modellen ............................................................................................................ p. 13 2.3.2.2 Immunologische en fysische modellen ................................................................................. p. 16 2.3.3 Genetische modellen ................................................................................................................... p. 17 2.3.3.1 Gen knock-out (KO) modellen .............................................................................................. p. 17 2.3.3.2 Transgene (Tg) modellen ..................................................................................................... p. 21 2.3.4 Adoptieve transfer modellen ........................................................................................................ p. 22 2.3.5 Spontane modellen ...................................................................................................................... p. 23 BESPREKING ................................................................................................................................................... p. 24 REFERENTIELIJST .......................................................................................................................................... p. 27 SAMENVATTING De chronische, idiopathische inflammatoire darmaandoeningen (IBD) uiten zich bij de mens voornamelijk in 2 hoofdvormen: de ziekte van Crohn (CD) en colitis ulcerosa (UC). De pathogenese van deze aandoeningen is zeer complex en multifactorieel. De meest aanvaarde hypothese van de pathogenese van IBD is dat er een te agressieve verworven (T cel) immuunrespons tegen commensale darmbacteriën ontwikkelt in genetisch vatbare personen en dat omgevingsfactoren meespelen in het ontstaan of reactiveren van de ziekte. Er kunnen dus 4 hoofdspelers onderscheiden worden die een rol spelen in de pathogenese: de immuunrespons, de intestinale microbiota, genetica en omgevingsfactoren. Daar de pathogenese nog niet volledig opgehelderd is, wordt er volop onderzoek gedaan naar mogelijke mechanismen die de ziekte veroorzaken en naar eventuele therapeutische doelwitten en middelen. Diermodellen spelen hierin een cruciale rol. In de loop van de jaren zijn er veel diermodellen ontwikkeld, waarvan vele de muis als proefdier gebruiken. Om het overzicht te bewaren worden de modellen ingedeeld volgens bepaalde kenmerken. De indeling van het “German Competence Network on IBD” deelt de modellen in 5 klassen: antigeen specifieke en bacteriële modellen, andere induceerbare modellen (chemisch, immunologisch, fysisch), genetische modellen (transgeen, knock-out), adoptieve transfer modellen en spontane modellen. Deze 5 klassen worden elk apart besproken en van elke klasse worden de voornaamste voorbeelden aangehaald. De werking, bevindingen (macroscopisch, microscopisch) en de voor- en nadelen zullen voor de meeste van deze voorbeelden worden besproken. Het chemisch-geïnduceerd DSS model wordt in extenso besproken daar het één van de meest gebruikte modellen is. De bespreking en vergelijking van de diermodellen tracht zo een duidelijk beeld te geven van de types van modellen in omloop en aan te wijzen welk type van model geschikt is voor een bepaald type onderzoek. Sleutelwoorden: Colitis ulcerosa – Diermodellen – Inflammatory bowel disease – Pathogenese – Ziekte van Crohn 1 INLEIDING “Inflammatory bowel disease”, kortweg aangeduid met IBD, representeert een groep van idiopathische chronische inflammatoire darmziekten die geassocieerd zijn met verschillende delen van het spijsverteringsstelsel. Vanuit humaan perspectief zijn de 2 belangrijkste aandoeningen de ziekte van Crohn (Crohn’s disease, CD) en colitis ulcerosa (ulcerative colitis, UC). Beide ziekten zijn gekenmerkt door alternerende fasen van klinische relaps en remissie en de duur van de ziekte is variabel. Bij UC start de inflammatie in het rectum en strekt zich uit op een continue manier over het hele colon. Deze inflammatie geeft aanleiding tot oedeem, ulceraties en bloedingen. Hierbij is enkel de mucosa aangetast. Bloederige diarree en abdominale krampen zijn karakteristieke symptomen. Bij CD daarentegen kan elk gedeelte van het spijsverteringsstelsel aangetast worden, van de mond tot de anus. In tegenstelling tot UC waar de ontsteking beperkt blijft tot de mucosa, is de ontsteking bij CD transmuraal. Typische symptomen zijn abdominale pijn, diarree, braken en gewichtsverlies. Ook bij dieren komen er gelijkaardige aandoeningen voor, die ook worden aangeduid als IBD. Naar analogie met de mens zijn er bij dieren verschillende vormen. Bij het paard spreekt men van granulomateuze enteritis (GE), lymfocytische-plasmocytische-enterocolitis (LPE), multisystemische eosinofiele epitheliotrope ziekte (MEED) en idiopathische focale eosinofiele enterocolitis (IFEE). Bij hond en kat is de bekendste vorm de lymfocytische-plasmocytische (gastro)enteritis, een andere vorm is de eosinofiele ontsteking. In deze literatuurstudie wordt enkel gefocust op de humane vormen van IBD, namelijk CD en UC. Hoewel men het erover eens is dat UC en CD (en IBD in het algemeen) multifactoriële ziekten zijn, is de exacte etiologie niet volledig gekend. Verschillende factoren kunnen bijdragen tot de pathogenese van de ziekte. Voorbeelden van deze factoren zijn: dysregulatie van het het immuunsysteem, commensale bacteriën, oxidatieve stress en inflammatoire mediatoren (1). Daarnaast zijn er nog andere omgevingsinvloeden en genetische factoren. Aangezien de etiologie van IBD nog niet volledig gekend is, wordt de pathogenese onderzocht door gebruik te maken van humane in vitro studies en in vivo studies gebruikmakend van de passende diermodellen. Het doel van deze diermodellen is het identificeren van verschillende mechanismen die aanleiding geven tot ziekte en zo nieuwe therapeutische doelwitten aan het licht brengen. De meeste diermodellen maken gebruik van muizen, maar ook andere diersoorten kunnen fungeren als proefdier (bv. ratten, cavia’s, honden). In de loop van de tijd zijn er vele modellen naar voor gebracht met elk hun eigen karakteristieken. Ondanks het hoge aantal diermodellen in omloop, is geen van deze het “perfecte” model (2). Er moet dus rekening gehouden worden met verschillende aspecten wanneer men een model kiest voor een bepaald onderzoek. In deze literatuurstudie wordt de pathogenese van CD en UC besproken, inclusief de voornaamste factoren die de ziekten beïnvloeden. Vervolgens wordt een overzicht gemaakt van de verschillende diermodellen. Daarna worden de voornaamste diermodellen besproken. Hun bijzonderheden en vooren nadelen worden aangekaart met als doel de verschillende modellen met elkaar te vergelijken en zo te bepalen welk model geschikt is voor een bepaald type studie. 2 LITERATUURSTUDIE 1. PATHOGENESE EN PATHOFYSIOLOGIE VAN DE ZIEKTE VAN CROHN EN COLITIS ULCEROSA Zoals eerder aangehaald is de etiologie van deze 2 hoofdvormen van IBD bij de mens niet volledig gekend. Het zijn multifactoriële ziekten, waarbij er zowel genetische als omgevingsinvloeden van belang zijn. De meest aanvaarde hypothese van de pathogenese van IBD is dat er zich een te agressieve verworven (T cel) immuunrespons tegen commensale darmbacteriën ontwikkelen in genetisch vatbare personen en dat omgevingsfactoren meespelen in het ontstaan of reactiveren van de ziekte (3). Dit is een complexe theorie en omvat vier aparte componenten die met elkaar interageren en zo leiden tot het klinisch beeld (Figuur 1). Figuur 1. Interactie van verschillende factoren die aanleiding geven tot chronische intestinale inflammatie in een genetisch vatbare gastheer. Genetische vatbaarheid wordt beïnvloed door de luminale microbiota, die antigenen en adjuvantia voorzien die zowel pathogene als protectieve immuunresponsen stimuleren. Omgevingsfactoren fungeren als trigger voor initiatie of reactivatie van de ziekte (naar Sartor, 2006). 1.1 DE IMMUUNRESPONS Het immuunsysteem kan worden onderverdeeld in een aspecifiek of aangeboren deel en een adaptief of verworven deel. De aspecifieke of aangeboren immuunrespons fungeert als een eerste lijn van verdediging en zorgt voor aspecifieke bescherming, terwijl de adaptieve immuunrespons specifiek is en geactiveerd wordt door de aspecifieke immuunreactie (4). De aangeboren, aspecifieke immuniteit bestaat uit de epitheliale barrière, neutrofielen, macrofagen, dendritische cellen, natural killer (NK) cellen, enz. Ze wordt geactiveerd door microbiële agentia die herkend worden door pattern recognition receptoren (PRR), zoals Toll-like receptoren (TLR) en NODlike receptoren (NRL) (5). Normaal hebben de intestinale epitheelcellen weinig TLRs en zijn deze basolateraal gelokaliseerd zodat er weinig reactie ontstaat op de hoge bacteriële concentratie in het distale ileum en colon. 3 Neutrofielen en andere cellen zetten de immuunrespons in gang door het vrijstellen van proinflammatoire cytokines zoals TNF (tumor necrosis factor) -alfa, IL (interleukine) -1, IL-6 en IL-8, die op hun beurt de adaptieve immuniteit gaan activeren (4) (Figuur 2). Op basis van de aangeboren immuunrespons kan men geen onderscheid maken tussen UC of CD. Figuur 2. De aspecifieke immuniteit in de darm. De intestinale epitheliale barrière is voorzien van verschillende verdedigingsmechanismen om de translocatie van luminale bacteriën te verhinderen. Slijmbekercellen, Paneth cellen en de enterocyten produceren mucines en antimicrobiële peptides die de mucuslaag vormen. Macrofagen en dendritische cellen detecteren invaderende bacteriën door TLRs en NLRs en beginnen een snelle inflammatoire respons gemedieerd door de secretie van cytokines en chemokines. Innate lymphoid cells (ILC) bevinden zich in de lamina propria en doen aan cytokine productie en recrutering van inflammatoire cellen (naar Wallace et al., 2014). Het adaptief, verworven immuunsysteem bestaat uit T-cellen en B-cellen en deze cellen secreteren cytokines en antilichamen (door B-cel). Een subgroep van T-cellen zijn de T-helpercellen (Th-cellen) en deze worden verder onderverdeeld in Th1- en Th2-cellen. Th1-cellen worden geïnduceerd door IL-12 en produceren grote hoeveelheden van interferonen (IFNs). Het zijn deze cellen die verantwoordelijk zijn voor de pathogenese van CD. IFN-gamma zet de weefselmacrofagen aan tot additionele productie van TNF (tumor necrosis factor) -alfa, wat leidt tot apoptose van de epitheelcel en differentiatie van stromale cellen tot myofibroblasten. Geactiveerde myofibroblasten produceren metalloproteïnasen (MMPs) die aanleiding geven tot weefseldegeneratie. Th2-cellen produceren IL-4, IL-5 en IL-13 en zijn voornamelijk verantwoordelijk voor de pathogenese van UC. Er kan dus worden gesteld dat CD voornamelijk een Th1-respons vertoond en UC eerder een Th2-respons. Recent is er aangetoond dat er nog een 3de type helpercel een rol speelt in de pathogenese van IBD, namelijk de Th-17-cel. Deze cellen produceren IL-17, IL-21 en IL-22. Dit zijn pro-inflammatoire cytokines die lokale weefseldestructie kunnen veroorzaken (6). IL-17A speelt een rol in de recrutering van neutrofielen en IL-21 speelt een rol in de inductie van MMP productie. Door onderbreking van de intestinale epitheliale barrière onstaat er een toename in darmpermeabiliteit en dit leidt tot ongecontroleerde inflammatie. Daarnaast zijn er nog regulatorische T-cellen (Tregs), welke voornamelijk een rol spelen in immunosuppressie (Figuur 3). 4 Figuur 3. Adaptieve immuniteit in de darm. Gedurende actieve inflammatie differentiëren naïeve Tcellen (Th0) naar T-helper cellen (Th1, Th2, Th17) door stimulatie van verschillende cytokines. Th1cellen produceren IFN-gamma. IFN-gamma zet de weefselmacrofagen aan tot additionele productie van TNF-alfa, wat leidt tot apoptose van de epitheelcel en differentiatie van stromale cellen tot myofibroblasten. Geactiveerde myofibroblasten produceren metalloproteïnasen (MMPs) die aanleiding geven tot weefseldegeneratie. Th2-cellen produceren IL-13 die zorgt voor een toename in intestinale permeabiliteit en een inductie van apoptose. Th17-cellen produceren IL-17A en IL-21 (naar Wallace et al., 2014). 1.2 LUMINALE MICROBIËLE ANTIGENEN EN ADJUVANTIA (DE INTESTINALE MICROBIOTA) De commensale bacteriële flora speelt vermoedelijk een grote rol in het onstaan van IBD. Er ontstaat geen intestinale inflammatie in dieren die gehouden worden in een steriele omgeving (germ-free). Dit gegeven heeft geleid tot de theorie van “no bacteria, no IBD” (7, 8). De flora kan zowel functioneren als adjuvants of als antigeen. Als adjuvant activeren ze de aangeboren immuniteit, als antigeen stimuleren ze de klonale expansie van T-cellen die selectief het antigeen herkennen via hun T-cel receptor (TCR) (3). 1.2.1 Adjuvantia Voorbeelden van bacteriële adjuvantia zijn lipopolysaccharide (LPS), peptidoglycaan, flagelline en nietgemethyleerd DNA. Deze binden op TLRs die gelokaliseerd zijn op cellen van het aangeboren immuunsysteem, intestinale epitheliale cellen en mesenchymale cellen. Ligatie van de receptor activeert NFκB en mitogen-activated protein kinase (MAPK), deze stimuleren de transcriptie van verschillende pro-inflammatoire en regulatorische genen (3) (Figuur 4). 5 Figuur 4. Ligatie van microbiële adjuvantia aan extracellulaire en intracellulaire pattern recognition receptoren. Toll-like receptoren binden selectief aan verscheidene bacteriële, virale of fungale componenten. Deze ligatie activeert pathways die op hun beurt NFκB en MAPK activeren. Dit leidt tot vrijstelling van transscriptiefactoren die de expressie van zowel pro- als anti-inflammatoire genen stimuleren (uit Sartor, 2006). 1.2.2 Antigenen Ondanks een omvangrijke aanwezigheid van bacteriën in het spijsverteringsstelsel, is de intestinale mucosa (relatief) vrij van aangehechte bacteriën door de aanwezigheid van een protectieve mucuslaag boven op het epitheel (9). In IBD patiënten is er nauwer contact tussen de bacteriën en de mucosa doordat er veranderingen aanwezig zijn in de mucuslaag. De commensale darmbacterie zal dan ageren als een pathogeen en een inflammatoire respons uitlokken door op antigeen-presenterende cellen (APC) te binden. Een studie van Frank et al. (10) toonde aan dat meer dan 99% van de microbiële flora kan onderverdeeld worden in 4 phyla: Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria en Actinobacteria. De Firmicutes zijn de meest dominante en bestaan voornamelijk uit Clostridium species. De Enterobacteriaceae zoals bv. E. coli zijn een relatief kleine component van de Proteobacteria. Deze studie toonde eveneens aan dat er een deel van patiënten met IBD is met een gewijzigde microflora. De flora van deze patiënten werd gekenmerkt door een depletie in aantallen Firmicutes (voornamelijk de families Lachnospiraceae en Ruminococcaceae, die boterzuur produceren en zo een protectieve functie uitoefenen in de darm) en Bacteroidetes en een toename in aantallen Proteobacteria (zoals E.coli) en Actinobacteria. Door de stijging van het aantal pathogene bacteriën krijgen deze de kans de mucosa te invaderen en inflammatie te veroorzaken. Een voorbeeld van een pathogene E.coli groep is de AIEC (adherent-invasive E. coli). Deze bacteriën werden geïsoleerd uit het ileum bij CD patiënten (11). Verschuivingen in de microbiota spelen dus een belangrijke rol in de pathogenese van IBD. Evenwel is verder onderzoek nodig naar het onderscheid tussen UC en CD met betrekking tot veranderingen in de microbiële flora en of deze veranderingen primair dan wel secundair zijn (3). Daarnaast kunnen commensale darmbacteriën bijdragen tot lokale en systemische complicaties bij IBD patiënten (3). Secundaire bacteriële invasie van mucosale ulcera in CD zorgen voor een onderhoud van de inflammatie en zorgen voor lokale abcessen en fistels. Tevens kan de infectie ook systemische effecten veroorzaken zoals leverabcessen, sepsis en endocarditis. 6 1.3 GENETICA R. Balfour Sartor geeft een overzicht van de meest voorkomende gendefecten die geassocieerd zijn met UC en CD (Tabel 1). Wat deze genen gemeenschappelijk hebben, is het feit dat ze een rol spelen in verschillende belangrijke biologische functies zoals immunoregulatie, mucosale integriteit en homeostase (3). Tabel 1. Enkele genen met functies geassocieerd met IBD en experimentele colitis (naar Sartor, 2006). Gen Chromosoom Functie CARD15 16 SLC22A4 en SLC22A5 5 DLG5 10 NFκB activatie en/of regulatie, afdoden van intracellulaire pathogenen, Paneth cel functie, (αdefensine productie) Organische kation transporters OCTN1 en OCTN2, carnitine transporters, mogelijk transport van xenobiotische stoffen Epitheliale structuur proteïne PPARG 3 Intracellulaire inhibitor van NFκB 7 Efflux transporter voor medicatie en mogelijks voor xenobiotische stoffen Ziekte van Crohn Colitis ulcerosa MDR1 Een recente studie brengt het aantal genloci geassocieerd met IBD tot 163. Daarvan zijn er 110 geassocieerd met zowel UC als CD, 30 zijn CD specifiek en 23 zijn UC specifiek (12). Hieruit blijkt dat de genetische component bij CD meer uitgesproken is dan bij UC. Veel van de informatie over de genen werd bekomen door gebruik te maken van (knock-out) muismodellen. Bij deletie van het CARD15 gen in muizen werd er een vermindering gezien van de αdefensineproductie en een verhoogde gevoeligheid voor Listeria monocytogenes infectie (na orale toediening) (13). Deletie van het MDR1 gen in muizen leidde tot colitis (14). Zoals reeds hoger vermeld, zijn er nog tal van andere genen geassocieerd met IBD. Enkele voorbeelden: autofagie gerelateerde genen ATG16L1 en IRGM, het IL23R gen, CARD9, IL1R2, REL, SMAD3 en PRDM1 (9). De ontdekking van de vele genen die geassocieerd zijn met ziekte doen vermoeden dat genetische gevoeligheid een kritische component is in de pathogenese. Daartegenover zijn de gekende genen maar verantwoordelijk voor 20-25 % van de erfelijkheid. 1.4 OMGEVINGSFACTOREN Een studie van Silvio Danese et al. geeft een overzicht van de voornaamste omgevingsfactoren die een invloed hebben op de pathogenese van IBD (7). Deze zijn: roken, dieet, medicatie, geografie, stress, microbiële flora, darmpermeabiliteit en appendectomie (Figuur 5). 7 Figuur 5. Impact van omgevingsfactoren op de pathogenese van IBD. Het gecombineerde resultaat van de verschillende invloeden resulteert in abnormale en persisterende inflammatie ter hoogte van de darm (naar Danese et al., 2004). Roken Roken heeft een paradoxaal effect. In CD is het een risicofactor, in UC een beschermende factor. In diermodellen werd aangetoond dat het effect van roken enerzijds een vermindering van de mucosale cytokine productie teweeg brengt, terwijl het anderzijds de adhesie van leukocyten aan endotheliale cellen promoot (7). Nicotine, CO en hypoxie zijn gesuggereerd als mediatoren voor het effect van roken op IBD (3, 15). Medicatie De meest bestudeerde geneesmiddelen zijn orale contraceptiva en NSAID (nonsteroidal antiinflammatory drugs) (7). Een studie van Godet et al. vond een matig positieve associatie tussen IBD en orale contraceptiva, maar geen direct causaal verband (16). Het gebruik van NSAID daarin tegen is een duidelijke risicofactor. Wanneer bij IL-10 knockout muizen die spontane colitis ontwikkelen NSAID worden gegeven, wordt er een ergere inflammatie van het colon gezien (17). De rol van antibiotica is complex (18): enerzijds worden ze effectief gebruikt als onderdeel van de behandeling van IBD, anderzijds heeft een epidemiologische studie aangetoond dat het antibiotica gebruik van CD patiënten 2 tot 5 jaar voor de diagnose gesteld werd groter was dan bij controle individuen (19). Of dit reeds te maken heeft met behandeling van IBD-geassocieerde symptomen is niet duidelijk. Stress De rol van stress is waarschijnlijk meer modulerend dan initiërend (7). De specifieke mechanismen zijn niet gekend, maar een interactie tussen het zenuwstelsel, het endocrien stelsel en het immuunstelsel wordt geïmpliceerd (20). 8 2. DIERMODELLEN VOOR DE STUDIE VAN DE ZIEKTE VAN CROHN EN COLITIS ULCEROSA 2.1 INLEIDING EN HISTORIEK Zoals hoger aangehaald is de etiologie en de pathogenese van IBD zeer complex en voor een groot deel nog onbekend. Daarom werden er in de loop der jaren verschillende diermodellen vooropgesteld die als doel hebben zowel de vele mechanismen en factoren die de ontwikkeling van de inflammatie beïnvloeden te ontrafelen als het ontwikkelen van nieuwe medicatie (therapeutisch en preventief) voor de behandeling van IBD. Een diermodel voor IBD wordt gekarakteriseerd door chronische of terugkerende inflammatie van het spijsverteringsstelsel met kenmerken die gelijken op humane IBD (2). Het eerste model gebruikt voor de studie van colitis werd beschreven in 1961, het zogenaamde “immuuncomplex colitis model”, gepubliceerd als de studie “Experimental "colitis" with particular reference to hypersensitivity reactions in the colon” van Kirsner J.B (2, 21). Vanaf 1993 is het aandeel van genetische modellen enorm gestegen. Deze toename is te wijten aan de grote doorbraak op het gebied van cytokine knock-out diermodellen (22). In 2002 zijn er 63 diermodellen beschreven (2). Ondertussen zijn er nog modellen bijgekomen. 2.2 CLASSIFICATIE VAN IBD DIERMODELLEN EN OVERZICHT Verschillende auteurs hebben verschillende classificatiesystemen naar voor gebracht. In deze literatuurstudie wordt het classificatiesysteem gevolgd dat werd voorgesteld door het “German Competence Network on IBD” (2) (Tabel 2). Zij groeperen de diermodellen in 5 groepen (Tabel 2) : Antigeen specifieke en bacteriële modellen Andere induceerbare modellen (chemisch, immunologisch en fysisch) Genetische modellen (transgenetisch en knock-out) Adoptieve transfer modellen Spontane modellen Voor de meeste diermodellen wordt gebruik gemaakt van muizen, maar ook andere diersoorten worden gebruikt (honden, cavia’s, primaten, biggen, ratten en konijnen). De modellen kunnen eveneens worden ingedeeld op basis van de aandoening die ze simuleren. Goyal et al. groeperen de modellen volgens specificiteit voor CD of UC (1) (Tabel 3). Er dient opgemerkt te worden dat de auteurs 8 klassen gebruiken in plaats van 5, maar deze zijn gebaseerd op de classificatie van het “German Competence Network on IBD”. Let wel: Tabel 2 dateert van 2002 en is incompleet. Tabel 3 is van een recentere publicatie (2014), maar ook incompleet. Er zijn nog meerdere modellen beschreven die niet in de tabellen opgenomen zijn. 9 Tabel 2. Classificatie van IBD modellen (naar Hoffmann et al., 2002). Antigen-specifiek Peptidoglycaanpolysaccharider Carageenm,c,k Induceerbaar Genetisch Adoptieve transfer Spontaan Chemisch Acetaatr,d Transgenetisch Cytochroom c TCR tgm HGF tgm CD4+CD45RBhigh/SCIDm C3H/HeJBirm DNBS/ethanolm, r CD4+CD45RBhigh/RAG-2 kom Compleet Freund adjuvantr DSSh,m, r HLA B27 / ß2-MG CD4+CD62Lhigh/SCIDm tgr Helicobacter hepaticus (rag-2 Indomethaciner HSV tyrosine CD4+CD45RBhighYit/SCIDm ko)m kinase tg/gancyclovirm Helicobacter hepaticus Lactulosem HTF tgm CD4+/SCIDm (p50–/– p65+/–)m Oxazolonem IL-7 tgm CD4+ con A blasts/SCIDm Hsp60m Sulfhydryl N-Cadherin CD4+ con A blasts/RAG-1 blokkersr dominant neg. tgm kom Lymphogranuloma venereum TNBS/ethanolr,m, STAT4 tg/TNPBeenmerg/CD3ε Tg26m k KLHm Immunologisch TGF-ß receptor-II HSP60-CD8 kloon/TCRßproctitisp Cyclosporin Am dominant neg. tgm kom Ovalbumine in OVA TCR tg MuLV splenocyten/naaktm Immuun muizenm k, r Knock-Out Ovalbumine/transfercolitis/OVA complex A20 kom tg muizenm Fysisch Iκβα kom TNBS/transfer/TCR kom Radiatie (MHC II Gi-2α kom ko)m Gpx 1 ko / Gpx 2 kom IL-2 receptor-ß kom IL-2 receptor kom IL-2 ko ß2-MG kom IL-2 kom IL-10 kom CRF2-4 kom Mdr1a kom MHC klasse-II kom Myloïd STAT 3 kom TCR-α kom TCR-ß kom TGF-ß kom TNF ΔARE m WASP kom katoenen-top tamarinp Grower/finisherb HistiocytischUCh Samp1/Yitm Aangeduid zijn de categorie en de species (h = hond; c = cavia m = muis; p = primaat; b = biggen; r = rat; k = konijn). DSS = dextrane sulfonic acid; HGF = hepatocyte growth factor; HTF = human fucosyl transferase; mdr = multiple drug resistance gene; tg = transgenetisch; TGF = transforming growth factor. 10 Tabel 3. Classificatie van Categorie IBD modellen volgens specificiteit voor CD of UC (naar Goyal et al., 2014). Chemisch geïnduceerde modellen Immunologisch model Bacterieel geïnduceerde modellen Specificiteit UC CD DSS TNBS/DNBS TNBS/DNBS Oxazolone Acetaat Carrageen Iodoacetamide 2, 4Dinitrochlorobenzeen(DNCB) Salmonella-geïnduceerd Adherent invasieve E. coli Indomethacin Spontane modellen Genetisch gemanipuleerde TGF-b-/modellen IL-2 -/- NOD2 -/- MDR1A -/- A20 -/- Gai2 -/- IL-23 -/- TCRa-/XBP1 /NEMO -/Transgene muis modellen IL-7 Tg muizen HLA-B27 Mutatie knock-in modellen Adoptieve transfer modellen C3H/HejBir muis model SAMP1/4it muis model IL-10 -/- NEMO -/- STAT 4 HLA-B27 DNN Cadherin Tg muizen TNFDARE CD45RB hoog-transfer model CD45RB hoog-transfer model 2.3 BESPREKING VAN DE VOORNAAMSTE IBD DIERMODELLEN 2.3.1 Antigeen-specifieke vormen van colitis en colitis geïnduceerd door microbiële agentia Peptidoglycaan-polysaccharide (PG-PS) colitis model Intramurale injectie van de bacteriële celwandcomponent PG-PS (afkomstig van streptococcen) in het distale colon van ratten (Sprague-Dawley) induceert een transmurale enterocolitis (23). Alvorens men overgaat tot de injectie van PG-PS wordt eerst de colonwand beschadigd door injectie van acetaat 4% (1.5 ml). Deze inflammatie is gekenmerkt door een chronisch, granulomateus proces met verdikking van de colonwand en infiltratie van lymfocyten, macrofagen en neutrofielen. Het proces ontwikkelt zich 3 tot 4 weken na de injectie. De effecten van PG-PS zijn te wijten aan een toename van de mucosale permeabiliteit, een toename van de myeloperoxidase activiteit, een verhoogde NO productie en een verhoogde collageensynthese. 11 Data bekomen uit dit model tonen duidelijk aan dat de celwandcomponenten van niet-pathogene residentiële commensale flora voldoende zijn om een acute en chronische colitis te veroorzaken in gevoelige gastheren wanneer ze penetreren in de colonwand (24). Interessant te vermelden is ook dat dit model gepaard gaat met extra-intestinale manifestaties, zoals arthritis en hepatitis (zoals ook gezien wordt bij de mens) (25). Carrageen colitis model Carrageen is een gecompliceerd mengsel van polysacchariden, gewonnen uit bepaalde soorten zeewier. Meestal wordt er voor dit model gebruikt gemaakt van gedegradeerd carrageen. In een studie van Kitsukawa et al. (26) werd dit gedegradeerd carrageen toegediend in het drinkwater en vervolgens oraal opgenomen door cavia’s. Er ontstonden gelokaliseerde ulceraties in het cecum met infiltratie van mononucleaire fagocyten. Carrageen heeft een effect op de epitheliale cellen en verstoort de mucosale barrière. Verschillende studies hebben aangetoond dat de aanwezigheid van anaërobe bacteriën (vnl. Bacteroides spp. zoals Bacteroides vulgatus) van belang is voor de ontwikkeling van ulceraties en mucosale letsels (24, 27). Ovalbumine (OVA)-specifiek T-cel receptor transgeen model DO11 Dit model maakt gebruik van een specifieke muizenlijn (Rag2 Knockout/Transgenic DO11.10 T Cell Receptor lijn) die homozygoot is voor een transgen dat codeert voor een TCR die specifiek is voor het ovalbumine peptide afkomstig van kippen. Deze lijn is tevens deficiënt voor het RAG2 gen (recombinase activating gene 2), waardoor de muizen geen endogene mature T- of B-cellen ontwikkelen. OVA-specifieke T-cellen werden getransfereerd naar RAG-2−/− recipiënten. Vervolgens werden de muizen gekoloniseerd door E.coli bacteriën die OVA tot expressie brachten. De bevindingen waren als volgt: transfer van antigen-naïeve DO11.RAG-2−/− T cellen in dieren gekoloniseerd met E.coli die OVA tot expressie brachten leidde niet tot ziekte. Transfer van gepolariseerde T cellen (Th1 of Th2) in dieren gekoloniseerd met E.coli die OVA tot expressie bracht leidde hier wel tot colitis. Histopathologisch was er een duidelijk onderscheid tussen Th1-geïnduceerd of Th2-geïnduceerd: Th1-gepolariseerde T cellen gaven aanleiding tot transmurale inflammatie met occasionele granuloma vorming, Th2-gepolariseerde T cellen induceerden inflammatie met een meer hyperplastische epitheliale respons en meer neutrofielen dan mononucleaire cellen (28). De resultaten bevestigen het feit dat een enkel bacterieel antigen de progressie van de ziekte van voortstuwen, gemedieerd door zowel Th1- als Th2-responsen. Een groot voordeel van dit model is dat er verder onderzoek mogelijk is naar hoe Th1- of Th2-responsen colitis induceren. Het model geeft de basis voor het begrijpen van immunoregulatorische interacties van T cellen die reageren op de commensale flora aanwezig in de darm (2, 28). Afhankelijk van welk type gepolariseerde T-cellen gebruikt worden kan ofwel een CD (Th1) model bekomen worden ofwel een UC model (Th2). Modellen geïnduceerd door Helicobacter hepaticus In een eerste model werden RAG2-deficiënte muizen geïnoculeerd met Helicobacter hepaticus. Ondanks hun achtergrond (RAG-2-/-) vertoonden de muizen zowel lokale als systemische tekenen van colitis (29). 12 In een volgende stap werden muizen gebruikt deficiënt in zowel IL-7 als RAG2. Opnieuw werden de dieren geïnoculeerd met H. hepaticus. De dieren ontwikkelden geen colitis, wat er op wijst dat IL-7 betrokken is bij het inflammatoire proces, zelfs in de afwezigheid van T cellen (29). Een tweede model werd beschreven door Erdman et al. (30). Er werd gebruikt gemaakt van een muizen die deficiënt waren in de p50 eenheid van de transcriptiefactor NF-κB en heterozygoot deficiënt voor p65 (p50(-/-)p65(+/-)). Na inoculatie met H. hepaticus werd zware colitis waargenomen. Dit wijst er op dat de p50 en p65 subunits een rol spelen in de inhibitie van colitis. 2.3.2 Andere induceerbare vormen van IBD diermodellen Dit type van diermodellen kan worden onderverdeeld in 3 subgroepen, namelijk: Chemische modellen Immunologische modellen Fysische modellen 2.3.2.1 Chemische modellen Dit type van modellen wordt veelvuldig toegepast (2). Voornamelijk DSS (dextran sulfate sodium) colitis (muizen, hamsters en ratten) en hapteen-geïnduceerde colitis (DNBS (dinitrobenzene sulfonic acid) / TNBS (trinitrobenzene sulfonic acid) of oxazolone zijn globaal gezien het meest gebruikt, mede dankzij het feit dat ze onmiddellijke inflammatie geven en dat deze inflammatie relatief eenvoudig kan worden geïnduceerd (2). Daarnaast hebben de twee types van chemische modellen ook een belangrijk nadeel: hun gelijkenis met IBD is eerder beperkt (31, 32). Daarnaast zijn er ook diersoortverschillen: in het TNBS model ontwikkelen ratten een distale colitis met fibrose en stenose en muizen eerder een pancolitis (2). DSS (Dextran sulfate sodium) colitis model Het DSS colitis model is het meest gebruikte model voor onderzoek naar IBD en werd in 1990 ontwikkeld door Okayasu et al. (33). DSS is een synthetisch polysaccharide dat bestaat uit dextraan en gesulfateerde anhydroglucose eenheden (34). Het is een chemisch colitogeen met anticoagulerende eigenschappen, een negatieve lading en een moleculair gewicht variërend van 5 tot 1400 kDa (kilodalton) (35). Toediening gebeurt via het drinkwater. De meest ernstige vorm van colitis, sterk gelijkaardig aan humane UC, wordt bekomen door orale administratie van DSS met een moleculair gewicht van 40-50 kDa. De effectiviteit van het model is afhankelijk van verschillende factoren (37): o Moleculair gewicht (5 kDa voor milde colitis en 40 kDa voor uitgebreide colitis) o Dosage (meestal 1-5%) o Duur van behandeling o o Muizenlijn (C3H/HeJ en Balb/c muizen zijn meer gevoelig) Microbiële omgeving van de dieren (germ-free(GF) of specific pathogen-free (SPF)) Naargelang de dosis en de duur van toediening kan acute of chronische colitis geïnduceerd worden (1,34). De klinische eigenschappen van DSS colitis in de acute fase zijn gewichtsverlies, diarree, bloed in de stoelgang, pilo-erectie, anemie en zelfs sterfte. 13 Op autopsie worden een verkorting van de darm en een vergroting van de milt waargenomen (Figuur 6). Daarentegen zijn de klinische manifestaties van de chronische fase van colitis geen reflectie van de ernst van de inflammatie (36). De histologische veranderingen kunnen geclassificeerd worden als acuut en chronisch. Typische histologische kenmerken van acute colitis zijn mucine depletie, epitheliale degeneratie en necrose met het verdwijnen van de epitheelcellen. Verder wordt er een infiltratie van neutrofielen in de lamina propria en submucosa gezien, cryptitis (transepitheliale migratie van neutrofielen naar het mucosaal epitheel), abcessen van de crypten en een flegmoneuze inflammatie van de mucosa en submucosa (figuur 6). Chronische tekenen verschijnen pas na enkele weken. Deze zijn: infiltratie van mononucleaire leukocyten, verstoorde architectuur van de crypten, toename in de afstand tussen de basis van de crypten en de muscularis mucosae, diepe mucosale lymfocytose en transmurale inflammatie (hoewel van deze laatste bevinding wordt aangenomen dat deze eerder uitzonderlijk is). De histologische bevindingen van dit model worden ook terug gevonden in humane IBD. Sommige van deze bevindingen zijn eerder geassocieerd met UC (rectale lokalisatie), andere eerder met CD (transmurale infectie met verstrooide lymfefollikels, focale letsels) (36). Figuur 6. Voorbeeld van DSS-geïnduceerde intestinale inflammatie in muizen. Aan 8 weken oude C57BL6 muizen werd via het drinkwater 2.5% DSS toegediend gedurende 7 dagen. Controle muizen kregen enkel water. Op de achtste dag werden de muizen opgeofferd en onderzocht. A. Macroscopische foto van colons. B. Endoscopische examinatie van colons. C. H&E gekleurde secties van colons. 1. Verkorte en bloedende colons. 2. Vergrote milt. 3. Superficiële inflammatie. 4. Epitheliale erosie en infiltratie van immuuncellen (naar Chassaing et al., 2014). TNBS (2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid) colitis model TNBS is een hapteen, wat wil zeggen dat wanneer deze stof bindt met weefselproteïnes met een hoog moleculair gewicht, deze worden omgezet naar antigenen (1). Dit model kan zowel gebruikt worden voor onderzoek naar CD als naar UC, maar het heeft meer gelijkenis met CD (37). Een belangrijk onderscheid tussen het DSS model en het TNBS model is dat de DSS colitis resulteert uit veranderingen van de epitheliale barrière, terwijl TNBS overgevoeligheidsreactie van het uitgestelde type op haptenen (38). colitis ontwikkelt als een 14 De klinische eigenschappen van dit model gelijken op deze van DSS, namelijk progressief gewichtsverlies en bloederige diarree. Daarnaast kan er ook rectumprolaps optreden (1, 34). Op endoscopische biopsieën van muizen werden cryptitis en een verstoorde architectuur van de darmwand waargenomen. Histologische evaluatie van het hele colon demonstreerde regeneratieve veranderingen, ulceratie en transmurale inflammatie (38). De voordelen van het model zijn de eenvoud van het proces, korte duur van het experiment en de langdurige schade die vergezeld wordt van infiltratie van immuuncellen en ulceratie (39). Tevens kan het model zowel de acute als de chronische fase van inflammatie nabootsen doordat de geïnduceerde colitis gekarakteriseerd wordt door zowel een Th1- als Th2-respons (1). Nadelen van het model zijn de afwezigheid van het wederkerend karakter die een typisch verschijnsel is in humane IBD en het gebruik van ethanol tijdens de procedure omdat ethanol ook schade en inflammatie aanricht waardoor moeilijk het onderscheid kan gemaakt worden tussen ethanol-geïnduceerde inflammatie en TNBS (hapteen)geïnduceerde inflammatie (1). Recurrent TNBS colitis model Dit is een variant van het vorige model waarbij herhaaldelijk TNBS intrarectaal wordt toegediend. Dit leidt tot de ontwikkeling van chronische colitis, welke wel het wederkerend karakter typisch aan humane UC (en IBD in het algemeen) nabootst (40). DNBS (dinitrobenzene sulfonic acid) colitis model DNBS is net zoals TNBS een hapteen en de klinische eigenschappen van de colitis die deze stof teweegbrengt zijn zeer gelijkaardig aan deze van het TNBS model (bloederige diarree en gewichtsverlies) (1). DNBS en TNBS binden beiden aan proteïnen, maar TNBS heeft een additionele nitro-groep in zijn moleculaire structuur, waardoor deze molecule sneller bindt aan eiwitten bij lagere concentraties. DNBS is meer selectief en bindt enkel aan amino groepen van lysine (34). De colitis wordt geïnduceerd in licht geanestheseerde muizen door intra-rectale injectie van DNBS (opgelost in ethanol), via een polyethyleen katheter (1, 34). Macroscopisch kunnen mucosale congestie, erosie, hemorrhagische ulceraties en erge inflammatie in het colon, caecum en rectum worden waargenomen. Histologische kenmerken zijn transmurale necrose met uitgebreide morfologische disoriëntatie, oedeem en diffuse leukocyten infiltraties (41). De modellen kunnen zowel gebruikt worden in ratten als muizen: ratten zijn makkelijker te hanteren en hun darmstructuur vertoont een grotere similariteit met die van de mens. Muizen daarentegen zijn dan weer beter genetisch gekarakteriseerd (42). Oxazolone colitis model Oxazolone (4-ethoxymethyleen-2-fenyl-2-oxazoline-5-one) is ook een hapteen. Veel van de ontwikkelde experimentele muismodellen vertonen een Th1-respons (43). Het oxazolone model is hierop een uitzondering aangezien het voornamelijk een Th2-respons (gemedieerd door IL-13 –producerende NK (Natural Killer)-T-cellen en IL-4) waardoor het sterke gelijkenissen vertoont met humane UC. De methode voor inductie is beschreven door Heller et al. (44). Muizen worden geïmmuniseerd onder anesthesie (enfluraan of pentobarbital (1)) en vervolgens wordt een 1 tot 3% oxazolone oplossing topicaal aangebracht op de geschoren abdominale huid. Vijf dagen later worden de dieren opnieuw blootgesteld aan oxazolone, deze maal intra-rectaal toegediend (opgelost in 50% ethanol). 15 Recentelijk werd een chronisch model beschreven door waarbij oxazolone herhaaldelijk intra-rectaal werd toegediend aan Balb/c muizen (45). De klinische manifestaties van de colitis zijn gewichtsverlies, dunne stoelgang met pus en bloed, verdikking van de darmwand, erosies, oedeem en ulceraties. De histologische kenmerken zijn: neutrofielen infiltratie, afzetting van fibrine, submucosale neutrofielen migratie, submucosaal oedeem, epitheliale necrose, epitheliale ulceratie met verlies van villi, een toename in de myeloperoxidase (MPO) activiteit en een afname in het aantal slijmbekercellen (46). Wang et al. (43) halen enkele belangrijke verschillen aan met TNBS-geïnduceerde colitis: o De inflammatie bij oxazolone-geïnduceerde colitis is gelimiteerd tot het distale colon, bij TNBS wordt inflammatie gezien over het hele colon (pan-colitis). o Op microscopisch niveau is het oxazolone model gekenmerkt door superficiële inflammatie, bij TNBS colitis is de volledige dikte van de wand ontstoken. o Oxazolone-geïnduceerde colitis wordt gedreven door een IL-4- gemedieerde Th2-respons in tegenstelling tot TNBS-geïnduceerde colitis, die gekenmerkt wordt door een IL-12-gemedieerde Th1-respons. De voordelen van dit model zijn: het is simpel uitvoerbaar en zeer reproduceerbaar, de inflammatie duurt 2 weken (wat toelaat potentiële therapeutische agentia te screenen) en het model lijkt sterk op humane UC (43). Acetaat colitis model Acetaat geeft een acute inflammatie die gelimiteerd blijft tot het colon en bootst de effecten na van humane UC (1). Ratten worden daarvoor onder lichte anesthesie gebracht waarna een oplossing van 4% acetaat (pH 2.3) traag in het colon wordt aangebracht. Voorzichtigheid is geboden daar te hoge concentraties aan acetaat colon perforaties kunnen veroorzaken (47). Klinische kenmerken van dit model zijn gewichtsverlies, verminderde mucus productie en toename in het gewicht van het colon (1). Uitgebreide bloedingen, ulceraties en wandverdikking worden ook vermeld in sommige studies (1, 48). Histologisch worden de volgende veranderingen waargenomen: verwijding van de ruimte tussen de intestinale klieren, verstoorde architectuur van de crypten, vasodilatatie van bloedvaten in de submucosa, multipele foci met verlies van epitheel, reductie in de densiteit van slijmbekercellen en sterke infiltratie van ontstekingscellen in de lamina propria en de submucosa (49). De voordelen van dit model zijn de lage kost en het gemak van administratie (1). Belangrijk te vermelden is dat de epitheliale schade die gezien wordt de eerste 24 uur niet immunologisch van aard is, dus studies die medicatie onderzoeken die specifiek immunologische processen als doelwit hebben moeten pas getest worden 24 uur post-inductie (47). 2.3.2.2 Immunologische en fysische modellen Het eerste IBD model ontwikkeld door Kirshner, het “immuun complex colitis model”, is een voorbeeld van een immunologisch geïnduceerd model (2, 21). Een ander voorbeeld is het “Cyclosporine Ageïnduceerde colitis model (50). Het immunosuppressieve geneesmiddel Cyclosporine A zorgt voor een verstoring in de ontogenie en selectie van T-cellen in de thymus en geeft zo aanleiding tot ziekte. 16 Het “radiatie-geïnduceerde colitis model” (51) is een fysisch model gebruikmakend van MHC (major histocompatibility complex) klasse 2–deficiënte muizen. Dit type model wordt eerder zelden gebruikt (2). 2.3.3 Genetische modellen Dit is de snelst groeiende categorie van modellen en kan verder ingedeeld worden in 2 grote groepen (2, 24, 52): Transgene modellen Knock-out (KO) modellen In deze categorie van modellen wordt bijna uitsluitend gebruik gemaakt van muizen (2) (Tabel 2). Naast de opsplitsing in knock-out en transgeen, kunnen de genetische modellen verder onderverdeeld worden in 5 groepen (2): Modellen met deficiënties in IL-2 of verschillende ketens van de IL-2 receptor Modellen met deficiënties in IL-10 of IL-10 signalisatie Modellen met deficiënties in T-cel receptor (TCR) of MHC klasse II molecule Modellen met deficiënties in TGF-β (transforming growth factor beta) Modellen met alteraties in signaal transductie moleculen Daarnaast zijn er nog modellen die andere aangrijpingspunten hebben buiten deze 5 (bv. IL-7). 2.3.3.1 Gen knock-out (KO) modellen Dit zijn modellen waarbij een bestaand gen wordt geïnactiveerd (“knocked-out”) en vervangen wordt door een artificieel stuk DNA. Dit zijn conventionele KO modellen. Daarnaast is er nog een andere manier mogelijk waarbij het specifieke gen slechts in één orgaan wordt gedeleteerd in tegenstelling tot het hele lichaam. Dit worden conditionele KO modellen genoemd (1). Interleukine-2 (IL-2) KO/IL-2 receptor (R)α KO muis model IL-2 is een zeer belangrijk regulatorisch cytokine met verscheidene functies: activatie van T-cellen, macrofagen, lymfokine-geactiveerde killer (LAK) cellen (groep van witte bloedcellen die tumorcellen kan afdoden) en natural killer (NK) cellen, differentiatie van B-cellen en activatie-geïnduceerde celdood (activation-induced cell death, AICD) (24). In 1993 rapporteerde Sadlack et al. (53) dat ongeveer 50% van de muizen met een verstoord IL-2 gen stierf tussen week 4 en 9. Op autopsie werden splenomegalie, lymfadenopathie en auto-immune hemolytische anemie gevonden. De rest van de muizen ontwikkelde chronische colitis tussen week 6 en 15. De dunne darmen bleven intact. Deze colitis werd gekenmerkt door abcedatie van de crypten, mucine depletie, dysplasie van de epitheelcellen, infiltratie van geactiveerde T- en B-cellen, een toename in IgG1 (immunoglobuline G1), IgE (immunoglobuline E) en anticolon antistoffen en een toename in de MHC klasse II expressie. Studies met dubbele KO muizen (muizen met zowel een deletie van het IL-2 gen als van andere genen zoals RAG2 -/-, JH (joining) -/- en β2m (beta-2-microglobuline) -/-) toonden aan dat CD4+ T-cellen, maar geen B-cellen of CD8+ T-cellen, essentieel zijn voor de activatie van colitis. In dit model werden verhoogde concentraties van IL-12 en IFNγ (interferon gamma) waargenomen, wat er op wijst dat de geïnfiltreerde CD4+ T-cellen een deel zijn van de Th1-respons (24). 17 Er wordt verondersteld dat de pathogenese van de colitis in de dit model te maken met de afname in AICD en thymus agenesie. T-cel activatie heeft, naast antigen stimulatie door antigeen-presenterende cellen (APC), ook co-stimulatorische signalen nodig (zoals B7-1/B7-2-CD28). Antigen stimulatie zonder co-stimulatorische signalen induceert apoptose van de T-cellen. Dit wordt AICD genoemd. De verlengde inflammatie in dit model wordt dus verondersteld veroorzaakt te zijn door een verstoring in AICD. Dit betekent dat er een incomplete depletie is van geactiveerde CD4+ T-cellen. Toediening van anti-CD 40L antistoffen en anti-IL-12 antistoffen werkt preventief voor de ontwikkeling van colitis in dit model. Deze bevindingen kunnen van groot belang zijn voor de behandeling van humane IBD (31). IL-10 KO muis model IL-10 speelt een belangrijke rol in de fysiologie van de darm door het inperken van een pro-inflammatoire respons op normale antigenen en goedaardige bacteriën (1, 54). Dit interleukine wordt geproduceerd door T-cellen (meer bepaald de regulatorische T-cellen), B-cellen, macrofagen, thymuscellen en keratinocyten (24). Het IL-10 KO model is één van de meest gebruikte genetische modellen waarbij de inflammatie zich uitstrekt over de gehele darm (2). Het model wordt gekenmerkt door een activatie van CD4+ Th1-cellen en een depletie van Treg-cellen. Er werd aangetoond dat er een verschil is in mediatoren in de vroege (10 tot 24 weken) en de late vorm van colitis (langer dan 25 weken) van dit model: de vroege fase wordt vooral gemedieerd door IL-12, de late fase wordt gekenmerkt door afwezigheid van IL-12 en toenamen in de synthese van IL-4 en IL-13 (55). Vanuit klinisch standpunt zijn 2 aspecten belangrijk (2): o o IL-10-deficiënte muizen ontwikkelen osteoporose, net zoals UC patiënten (56). IL-10-deficiënte muizen ontwikkelen colon kanker, net zoals patiënten met UC of CD (57). Er wordt gesteld dat het IL-10 KO muis model het beste model is voor onderzoek naar secundaire colon kanker omdat 65% van alle muizen een carcinoma ontwikkelt binnen de 30 weken (2). T-cel receptor (TCR) mutant muis model Een studie van Mombaerts et al. (58) toonde aan dat colitis zich ontwikkelde in TCR mutante muizen. Dit effect werd gezien in T-cel receptor (TCR) α mutante, TCR β mutante, TCR β × δ dubbele mutante, of klasse II major histocompatibility complex (MHC) mutante muizen. Mutante (TCR α -/-) muizen vertoonden op een leeftijd van 16 weken een zachte stoelgang, consistente inflammatie en een hypertrofie van het colon. Histologisch konden hyperplasie van het epitheel, vermindering van het aantal crypten en slijmbekercellen, infiltratie van lymfocyten, plasmacellen en neutrofielen worden waargenomen. B-cellen zijn polyklonaal geactiveerd en produceren een aantal auto-antilichamen. Eén daarvan is tropomyosine-auto-antistof, welke ook gedetecteerd wordt in humane UC. Mogelijks werken deze antistoffen inflammatie eerder tegen dan dat ze inflammatie promoten. Ze hebben namelijk de mogelijkheid om apoptotische cellen, welke auto-antigenen tot expressie brengen, op te ruimen. Van dit proces wordt gedacht dat het een rol speelt in de heling van auto-immune inflammatie (24). 18 Dit model vertoont eerder een Th2-respons (IL-4 en IL-5 zijn dominant aanwezig) (59). Het is nog niet duidelijk welke componenten de respons in deze richting sturen, maar de hoeveelheid antigen, de bindingsaffiniteit tussen TCR en MHC en de aanwezigheid van co-stimulatorische molecules en cytokines zijn vermoedelijke oorzaken (24). Mogelijks wordt de Th2-respons gemedieerde colitis geïnduceerd door een afname in de bindingsaffiniteit tussen TCR en MHC en de secretie van IL-4. Dit model wordt ingedeeld als specifiek voor UC, mede door de distributie van de letsels (colon), de pathologische bevindingen en de Th2-respons (24). Transforming growth factor-beta (TGF-β) -/- model TGF-β is een klassiek anti-inflammatoir cytokine (zoals IL-10) en wordt geproduceerd door een aantal cellen, zoals macrofagen. De TGF-β -/- muizen vertonen ernstige colitis, systemische aandoeningen en sterven binnen de 4-5 weken (1, 60). Bij autopsie worden ernstige inflammatoire lesies gezien met massieve infiltraties van lymfocyten en macrofagen. Voornamelijk darm en longen worden aangetast. De precieze werking van TGF-β is niet gekend, maar TGF-β lijkt een rol te spelen in de toename van de IL-10 productie en de neerwaartse regulatie van de IL-12 receptor expressie (1, 61). TGF-β heeft verschillende punten van inwerking (62) (figuur 7): o Het cytokine TGF-β zorgt voor de differentiatie van naïeve T-cellen naar Tregs, die antiinflammatoire cytokines produceren. o TGF-β heeft ook een pro-inflammatoire werking: indien IL-6 aanwezig is (zoals bij infecties), zal TGF-β er voor zorgen dat naïeve T-cellen differentiëren naar Th17-cellen (63). Deze cellen produceren IL-17 en dit leidt tot de expressie van chemokines, andere pro-inflammatoire cytokines en matrix metalloproteasen (MMP). IL-13 speelt ook een rol in de Th17-cel functie. o Het cytokine speelt ook een rol in het helingsproces van de intestinale mucosa en de ontwikkeling van fibrose en stricturen (64). o TFG-β speelt ook een rol in de carcinogenese van colitis-geïnduceerde colorectale kanker. Vreemd genoeg kan het cytokine fungeren als tumor suppressor en als tumor promotor (62). Figuur 7. De differentiatie eindpunten van precursor T-cellen varieert afhankelijk van het cytokinemilieu. In de aanwezigheid van TFG-β kunnen ze differentiëren naar Tregs. In aanwezigheid van inflammatoire cytokines zoals IL-12 en IL-4 kunnen ze diffentiëren naar pro-inflammatoire effector T-cellen. In aanwezigheid van zowel TFG-β als IL-6 kunnen de cellen diferentiëren naar Th17-cellen, welke een kritische rol lijken te spelen in de chronische inflammatie van IBD (naar Feagins et al., 2010). 19 Signal transducer and activating transcription (STAT) 3 KO muis model Takeda et al. (65) beschreven een muis model met specifieke knock-out van STAT3 in macrofagen en neutrofielen. STAT3 behoort tot de familie van STAT-moleculen, die cytoplasmatische proteïnen zijn die geactiveerd worden wanneer een bepaald cytokine bindt met zijn specifieke receptor. De activatie bestaat uit een tyrosine fosforylering door het receptor-geassocieerde JAK (janus kinase). Na activatie vormen ze hetero- of homodimeren en gaan ze naar de nucleus waar ze genexpressie induceren. STAT3 specifiek speelt onder andere een rol in de pathway van de IL-10 expressie. A20 -/- muis model A20 of TNFAIP3 (tumor necrosis factor alpha induced protein 3) is een “zinc finger” proteïne (aanwezigheid van zinkionen die zorgen voor de stabiliteit van de molecule). Het wordt, zoals de naam aangeeft, geïnduceerd door TNF en inhibeert NFκB activiteit en TNF-gemedieerde geprogrammeerde celdood (PCD) (1, 66). Muizen deficiënt voor A20 ontwikkelen ernstige inflammatie (in multipele organen) en cachexie, zijn hypersensitief voor lipopolysaccharide (LPS) en TNF en sterven prematuur. MDR1A (multiple drug resistance gene) -/- muis model MDR1A codeert voor een 170-kDa ATP-bindend, transmembranair glycoproteïne dat tot expressie komt in intestinale epitheelcellen en mucosale lymfocyten (1, 14). Het overeenkomstige proteïne fungeert als een effluxpomp die xenobiotica (bijvoorbeeld toxines of medicatie) terug naar het lumen van de darm pompt. De MDR1A KO muizen hebben de mogelijkheid verloren om bacteriële afbraakproducten in de intestinale epitheelcellen te verwijderen waardoor er een toegenomen abnormale antigenpresentatie aan naburige T-cellen ontstaat met als gevolg een activatie van T-cellen die de ontsteking voortstuwen (1, 67). De colitis in dit model treedt spontaan op. De pancolitis wordt histologisch gekarakteriseerd door vergrootte crypten, immuuncel infiltratie, cryptabcessen en ulceraties. Deze bevindingen zijn gelijkend op de letsels die teruggevonden worden bij humane UC (68). Verder werd aangetoond dat MDR1A -/- muizen gevoeliger zijn voor experimenteel geïnduceerde colitis (DSS). De studie van Tanner et al. (67) toonde ook nog aan dat er bij deze KO muizen een verminderd aantal Foxp3+ Treg-cellen aanwezig waren. Giα2 -/- muis model Giα2 is een subeenheid van het G-proteïne die de productie van cAMP (cyclisch adenosine monofosfaat) (uit ATP, adenosine trifosfaat) verhindert (69). Het is een lid van signaal transductie moleculen die tot expressie worden gebracht in vele celtypes, onder andere intestinale epitheelcellen, myofibroblasten en intestinale B- en T-cellen. Deficiëntie van dit gen in muizen resulteert in een spontane colitis rond 8 tot 12 weken ouderdom. Deze colitis heeft veel gelijkenissen met humane UC, met de ergste inflammatie ter hoogte van het distale colon (1). Klinische en histopathologische eigenschappen zijn: verdikking van het colon, lymfocyten en neutrofielen infiltratie, verlies van crypten en slijmbekercellen, cryptabcessen en zelfs adenocarcinoma’s (70). 20 XBP1 (X-box binding protein 1) -/- model Dit is een voorbeeld van een conditioneel KO model (1). XBP1 is een transciptiefactor die een belangrijke rol in de ontwikkeling van secretorische cellen (1). In dit model wordt enkel in intestinale epitheelcellen (IEC) het gen gedeleteerd. De deletie zorgt voor een verlies van panethcellen en slijmbekercellen en veroorzaakt een hyperreactief epitheel. Daardoor ontstaat er een verhoogde gevoeligheid voor het ontwikkelen van colitis, gelijkaardig aan UC (1, 71). TNF ΔARE muis model TNFα speelt een belangrijke rol in de pathogenese van IBD. Verschillende studies hebben het therapeutisch effect van anti-TNFα-antistoffen aangetoond en deze antistoffen zijn al op de markt in Europa en de Verenigde Staten voor de behandeling van CD (31). Dit model maakt gebruik van specifieke deleties van AU (adenylaat uridylaat) -rijke elementen van het TNF-gen in muizen. Deze muizen tonen een overproductie van TNFα die leidt tot colitis die zeer sterk gelijkt op humane CD en arthritis (1). Dit is één van de weinige modellen die aanleiding geeft tot inflammatie van het terminale ileum (heterozygoot) en arthritis (homozygoot) (2). De inflammatie ontwikkelt zich tussen 4 en 8 weken ouderdom, zoals aangehaald meestal gelimiteerd tot het terminale ileum (soms is ook het proximale colon betrokken) en is histopathologisch gekenmerkt door het afplatten van de villi, infiltratie van neutrofielen, macrofagen en lymfocyten, transmurale inflammatie en de vorming lymfoïde aggregaten en rudimentaire granuloma’s (72). 2.3.3.2 Transgene (Tg) modellen De methodologie van deze modellen houdt in dat men van het gen waar men in geïnteresseerd is meerdere kopieën maakt. Dit zorgt aldus voor een overexpressie van het gen. Ook hier kan een onderscheid gemaakt worden tussen conventionele en cel-specifieke conditionele transgenetische modellen (1). IL-7 Tg muis model Eind de jaren ’90 werd aangetoond dat IL-7 de stof was in het serum van UC patiënten die een invloed had op de differentiatie en proliferatie van T-cellen in de thymus en dat dit interleukine bovendien ook door de intestinale epitheelcellen geproduceerd werd (24, 73, 74). Het “epitheliale cel-afgeleide IL-7” is essentieel voor de proliferatie en functie van de epitheelcellen, intra-epitheliale lymfocyten en intramucosale lymfocyten (24). IL-7 transgene muizen, waarbij IL-7 tot overexpressie wordt gebracht, ontwikkelen een acute colitis die wordt gekenmerkt door infiltratie van neutrofielen, CD4+ T-cellen en γδT-cellen in de darmwand. Later wordt proctoptose (prolaps van het rectum) met anale bloeding waargenomen. Pathologische kenmerken zijn: infiltratie van monocyten, vermindering van slijmbekercellen en cryptabcessen. Dit is een chronische colitis met sterke gelijkenis met humane UC. In tegenstelling met de acute fase van de colitis wordt de chronische fase gekenmerkt door een afname in het IL-7-proteïne (24). Dit chronische colitis model met sterke gelijkenissen met humane UC is bruikbaar voor onderzoek naar de T-cel-gemedieerde pathogenese van colitis en naar therapeutische interventies die voornamelijk Tcel functies als doelwit hebben (1). 21 HLA (Human leukocyte antigen) B27 Tg model Dit model kan zowel toegepast worden op muizen als ratten (1). Overexpressie van het humaan MHC klasse I allel HLA B27 geeft aanleiding tot spontane IBD (aantasting van de maag, ileum en colon) (1, 24). STAT4 Tg muis model De STAT-familie werd reeds hoger besproken. STAT4 is specifiek geassocieerd met IL-12 signalisatie en de differentiatie van naïeve T-cellen naar Th1-cellen (75). De transgene muizen vertonen een colitis gemedieerd door Th1-cellen die gekenmerkt is door een transmurale inflammatie. Deze transmurale, Th1-cel-gemedieerde inflammatie wordt ook teruggevonden bij humane CD (24). 2.3.4 Adoptieve transfer modellen In dit type modellen wordt colitis geïnduceerd door een selectieve transfer van bepaalde celtypes in gastheren (muizen) met een gecompromitteerd immuunsysteem. CD4+/CD45RBhigh T-cel transfer colitis model CD45 is een algemene merker van lymfocyten en wordt onderverdeeld in verschillende isotypes. Het isotype CD45RB wordt gebruikt om het onderscheid te maken tussen naïeve T-cellen en memory Tcellen. De eerstgenoemde heeft namelijk een hoge expressie van deze molecule (CD45RBhigh), de laatst genoemde een lage expressie (CD45RBlow) (76). Er wordt gesteld dat CD45RBhigh betrokken is in een Th1-respons en dat CD45RBlow zou betrokken zijn bij een Th2-respons omdat cellen met een hoge expressie van CD45RB vooral Th1-cytokines produceren (IFNγ, TNFα, IL-2) en cellen met een lage expressie van CD45RB vooral Th2-cytokines produceren (IL-4) (24, 76, 77). Treg-cellen worden ook verondersteld een lid te zijn van de CD45RBlow-familie (24). CD45RBhigh of CD45RBlow CD4+ T-cellen worden geïnjecteerd in SCID (severe combined immunodeficiency) muizen. Ook RAG1 of RAG2 KO muizen kunnen gebruikt worden (2). Administratie van T-cellen met een hoge expressie van CD45RB leidt tot colitis en gewichtsverlies met extreme verdikking van de colonwand, hyperplasie van het epitheel en infiltratie van lymfocyten in de lamina propria. Er worden geen ulcera waargenomen en de inflammatie in de dunne darm is mild (24). Een interessante bevinding is dat administratie van CD45RBlow CD4+ T-cellen net het omgekeerde effect heeft: het heeft een suppressief effect op colitis. Dit en andere bevindingen (bv. toedieningen van anti-IL-10 of anti-TFGβ antistoffen inhiberen het suppressief effect op colitis) suggereren dat bij deze CD45RBlow CD4+ T-cellen een netwerk van Treg-cellen zit. Deze produceren IL-10 en TFGβ en hebben een grote invloed op de inflammatie (31). Data gegenereerd uit verschillende onderzoeken suggereren dat de colitis in dit model voornamelijk gemedieerd wordt door een Th1-respons (31). De voordelen van het model zijn (2): o Technisch gemakkelijk uitvoerbaar o o Hoge reproduceerbaarheid De vele gelijkenissen met humane IBD Een belangrijk nadeel van het model (en alle modellen die gebruik maken van adoptieve transfer) is de onderliggende immunodeficiëntie van de receptormuizen (2). 22 Heat shock proteïne (hsp)60-specifiek CD8+ T cel transfer colitis model Hsp60-specifieke CD8+ T-cellen (cytotoxische T-cellen) die zowel reageren met mycobacterieel hsp60 als murien hsp60 (kruisreactiviteit) worden toegediend aan TCRβ -/- of SCID muizen. De muizen ontwikkelen inflammatoire letsels in de dunne darm en occasioneel worden focale infiltraties van leukocyten waargenomen in de lever. De dieren sterven binnen de 2 tot 6 weken na de transfer. Histologische kenmerken zijn: infiltratie van leukocyten in de lamina propria en het epitheel, degeneratie van het epitheel (voornamelijk de villustoppen) en bloedingen (78). Wanneer bacterie-vrije TCR β -/muizen gebruikt worden, wordt hetzelfde resultaat gezien als wanneer conventionele muizen gebruikt worden. Dit toont aan dat de intestinale inflammatie in dit model onafhankelijk is van de residentiële bacteriële flora (78). In tegenstelling tot vele andere IBD modellen wordt er in dit model geen ulceratie of prominente influx van macrofagen waargenomen (78). 2.3.5 Spontane modellen Zoals eerder aangehaald in de inleiding kunnen ook dieren, voornamelijk paard (GE, LPE, MEED, IFEE) en de gezelschapsdieren, IBD ontwikkelen. Het voorkomen van de aandoeningen bij dieren is evenwel een zeldzaamheid. Histiocytische ulceratieve colitis (HUC) is een aandoening die voornamelijk voorkomt bij Boxer honden (79). Ook bij een bepaalde species van Tamarins (Saguinus oedipus), een geslacht van klauwaapjes, is IBD beschreven. Deze uit zich als een recidiverende UC-achtige mucosale inflammatie die ook aanleiding kan geven tot colonkanker (80). Spontane modellen zijn zeer attractieve tools voor de studie van IBD omdat, net zoals bij de humane ziekten, de inflammatie tot ontwikkeling komt zonder enige exogene manipulatie (1). Bij muizen zijn er 2 modellen beschreven (2): het SAMP/Yit model en het C3H/HeJBir model. C3H/HeJBir muis model De C3H/HeJBir muizenlijn is een afgeleide van de C3H/HeJ muizenlijn die bekomen werd door selectief kweken voor een fenotype van spontane colitis (81). De muizen ontwikkelen colitis op een ouderdom van 3-4 weken en de colitis verdwijnt meestal na 10-12 weken ouderdom. De transmurale inflammatie is voornamelijk gelokaliseerd in het caecum en het rechter colon. Ulcera, cryptabcessen en regeneratie van het epitheel kunnen histologisch waargenomen worden, maar verdikking van intestinale wand en granuloma’s worden niet gezien (52). Het model vertoont een Th1-respons (verhoogde concentraties IL-2 en IFN-γ in de lymfocyten aanwezig in de lamina propria) (52). Dit model wordt vaak gecombineerd met induceerbare colitis modellen en heeft al bewezen waardevol te zijn voor onderzoek naar factoren die genetische gevoeligheid beïnvloeden (52). SAMP/Yit muis model Dit model is een zeer goed experimenteel systeem voor onderzoek naar CD, omdat inflammatie spontaan gebeurt en het één van de weinige modellen is waar erge inflammatie wordt waargenomen in het terminale ileum, wat zeer karakteristiek is voor humane CD (1). De inflammatie ontwikkelt zicht rond 10 weken ouderdom en geeft discontinue letsels. Tevens wordt ook caecitis waargenomen (82). Histologische bevindingen zijn transmurale ontsteking, granuloma’s en alteraties in de morfologie van het epitheel (1). Een zeer interessante bevinding is het feit dat wanneer de T-cellen van dit model getransfereerd worden naar andere SCID muizen, deze dieren peri-anale fistula ontwikkelen, wat een typisch klinisch verschijnsel is van CD (83). 23 BESPREKING De pathogenese van IBD is een zeer complex gegeven en daardoor ook een moeilijk behandelbare aandoening. Diermodellen spelen een prominente rol in zowel het ontrafelen van de vele mechanismen en factoren die de ontwikkeling van de inflammatie beïnvloeden als het ontwikkelen van nieuwe medicatie voor de behandeling van IBD. Algemeen kan gesteld worden dat er tenminste 4 belangrijke aspecten zijn ontdekt door het gebruik van IBD diermodellen (2). Deze zijn: 1. “Germ-free” dieren ontwikkelen meestal geen inflammatie 2. Inflammatie vereist een zeker genetische achtergrond 3. T-cellen zijn betrokken in de meeste diermodellen 4. De interactie tussen T-cellen en dendritische cellen lijkt cruciaal voor de initiatie en het onderhoud van de inflammatie Er zijn grote gelijkenissen in de pathologische bevindingen tussen experimentele IBD en humane IBD. Mechanismen van weefselschade, effector cel activeit, T-cel afhankelijkheid, chronisch worden van de inflammatie door resistente luminale bacteriën, respons op farmacologische agentia alsook de genetische heterogeniteit en primaire defecten in de mucosale barrière zijn sterk bevestigd in experimentele diermodellen (1). In de loop der jaren zijn er vele modellen ontwikkeld met elk hun specifieke karakteristieken (voor- en nadelen, specificiteit voor CD of UC, acuut of chronische inflammatie, enzovoort), maar toch is geen enkel van de beschikbare modellen het perfecte model (2). Het doel van deze literatuurstudie was een overzicht te maken van de belangrijkste diermodellen die vandaag gebruikt worden en bij de meeste modellen een korte toelichting te geven over hun eigenschappen. Dit geheel van informatie kan vervolgens gebruikt worden om onderzoekers een richtlijn te verschaffen in hun keuze naar het model die het beste aanleunt bij hun onderzoek. Wanneer men overweegt een bepaald IBD model te gebruiken bij een studie, is het essentieel om rekening te houden met het type van interventie dat gebruikt wordt om de eigenschappen van humane IBD te reproduceren samen met de therapeutische strategie welke tot doel heeft deze te genezen (wanneer dit van toepassing is, sommige studies onderzoeken enkel de pathogenese) (42). De opzet van een diermodel kan voorgesteld worden als een systeem waarin 3 elementen met elkaar interageren (42) (Figuur 8): Intrinsieke factoren (diersoort, lijn, geslacht, genetische achtergrond) Extrinsieke factoren (methodologie, inductoren, omgeving) Therapeutische strategie die één of meerdere pathofysiologische mechanismen als doelwit heeft (wanneer van toepassing) 24 Diermodel voor IBD Intrinsieke factoren Extrinsieke factoren Pathofysiologie Omgeving Inductie van de intestinale inflammatie Genetische achtergrond Genetische modificatie s Immuuncel transfer Immunologisch fenotype Chemische stoffen Tekenen en symptomen van ziekte Effect Interacties van de te testen stof met het diermodel TE TESTEN STOF Gekende interactie: Niet gekende / niet gewilde interactie: Figuur 8. Opzet van een IBD diermodel. De pathofysiologie van het model is het resultaat van de interactie tussen intrinsieke en extrinsieke factoren. Alle verwachte interacties worden aangegeven met blauwe volle lijnen. Inductie van inflammatie kan ook onverwachte effecten geven (blauwe onderbroken lijnen). Deze onverwachte/niet gewilde interacties zorgen ervoor dat de resulterende inflammatie niet goed gedefinieerd is. Wanneer men proeven doet naar de werking van een mogelijks therapeutische stof, is er ook een farmacologische evaluatie van deze stof noodzakelijk. De stof kan de inductor van inflammatie negatief beïnvloeden (rode pijlen) (naar Dothel et al., 2013). 25 Om zeker te zijn dat men een betrouwbaar model heeft, is het noodzakelijk dat men alle overlappen en gelijkenissen van deze intrinsieke en extrinsieke factoren met humane IBD verifieert en alle hypothetische interacties die de test kunnen beïnvloeden evalueert (50). De meeste beschreven modellen lokken meestal een inflammatie uit ter hoogte van de dikke darm (colitis). Dit is gunstig voor de studie van UC, maar niet CD, want bij deze aandoening zijn meestal de dunne darmen aangetast. Toch wordt er in veel van de modellen een Th1 / Th17 – respons waargenomen, wat dan weer wel wordt geassocieerd met CD (84). Het is op dit moment nog niet duidelijk waarom deze modellen geen dunne darm inflammatie (ileitis) geven en in sommige aspecten hebben deze modellen dan ook een gelimiteerde waarde voor de studie van de etiopathogenese van CD. Het beste model voor de studie van de ziekte van Crohn is waarschijnlijk het SAMP1/YitFc muis model omdat de inflammatie daar het ergst is in het terminale ileum en omdat de inflammatie spontaan ontwikkelt zonder exogene manipulatie (84). Daartegenover staat dat de aanvang en de ernst van de inflammatie in spontane (en genetische) modellen zeer sterk varieert (weken tot maanden). Dit maakt dit soort modellen weinig geschikt voor grootschalige screeningstesten voor de evaluatie van de efficaciteit van een bepaald product. Modellen die voor deze testen wel geschikt zijn, zijn de acute induceerbare modellen (bv. het DSS model of het TNBS model). Bijkomende voordelen van deze modellen zijn hun hoge kost-efficiëntie en hoge reproduceerbaarheid. Nadelig is hun geringe gelijkenis met humane IBD. Wat zeer belangrijk is inzake de spontane en induceerbare modellen, is dat de genetische achtergrond van de muizenlijn in rekening wordt gebracht. Deze kan namelijk een invloed uitoefenen op de bekomen resultaten (Figuur 8, intrinsieke factoren) (84). Wanneer men onderzoek doet naar de ontwikkeling van secundaire colonkanker ten gevolge van inflammatie, is het IL-10 KO muis model het meest aangewezen model (2). Hoewel diermodellen onze kennis over IBD enorm heeft doen toenemen en ze nog steeds een grote rol spelen in verder onderzoek, zal de grootste substantiële vooruitgang pas geboekt worden wanneer de IBD diermodellen worden gecombineerd met humane in vitro studies en eventuele applicatie in klinische trials (2). Om te concluderen kan gesteld worden dat diermodellen een grote rol zullen blijven spelen in het onderzoek naar IBD indien de maatregelen die gepostuleerd worden door Dothel et al. (50) in acht worden genomen: 1. Een meer strenge toepassing van de standaarden die gebruikt worden in klinische studies op de pre-klinische experimenten (steekproefgrootte berekening, randomisatie, blinding). 2. Selectie van een diermodel pas na zorgvuldig pathofysiologisch onderzoek en indachtig aan de inherente limitaties van het model (acuut zelflimiterend versus chronisch, diersoort, rol van het immuunsysteem, rol van de intestinale flora). 3. Een experimentele opzet die het farmacologisch profiel van de te onderzoeken stof mee in rekening brengt (biologische beschikbaarheid, route van administratie, spectrum). 26 REFERENTIELIJST (1) Goyal N., Rana A., Ahlawat A., Bijjem K. R. V., Kumar P. (2014). Animal models of inflammatory bowel disease: a review. Inflammopharmacol 22, 219-233. (2) Hoffmann J. C., Pawlowski N. N., Kühl A. A., Höhne W., Zeitz M. (2002). Animal models of inflammatory bowel disease: an overview. Pathobiology 70, 121-130. (3) Sartor R. B. (2006) Mechanisms of disease: pathogenesis of Crohn’s disease and ulcerative colitis. Nature Clinical Practice Gastroenterology & Hepatology 3, 390-407. (4) Wallace KL., Zheng LB., Kanazawa Y., Shih DQ. (2014). Immunopathology of inflammatory bowel disease. World J Gastroenterol. 20 (1), 6-21. (5) Pastorelli L., De Salvo C., Mercado J. R., Vecchi M., Pizarro T. T. (2013). Central role of the gut epithelial barrier in the pathogenesis of chronic intestinal inflammation: lessons learned from animal models and human genetics. Front Immunol 4, 1-22 (6) Siegmund B., Zeitz M. (2011). Innate and adaptive immunity in inflammatory bowel disease. World J Gastroentero 17 (27), 3178-3183. (7) Danese S., Sans M., Fiocchi C. (2004). Inflammatory bowel disease: the role of environmental factors. Autoimmunity Reviews 170, 394-400. (8) Taurog J.D., Richardson J.A., Croft J. T., Simmons W. A., Zhou M., Fernandez-sueiro J. L., Balish E., Hammer R. E. (1994). The germfree state prevents development of gut and joint inflammatory disease in HLA-B27 transgenic rats. J. Exp. Med 180, 2359-2364. (9) Zhang Y. Z., Li Y. Y. (2014). Inflammatory bowel disease: pathogenesis. World J Gastroentero 20, 91-99. (10) Frank D.N., St. Amand A.L., Feldman R.A., Boedeker E.C., Harpaz N., Pace N.R. (2007). Molecular-phylogenetic characterization of microbial community imbalances in human inflammatory bowel diseases. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 13780-13785. (11) Martinez-Medina M., Aldeguer X., Lopez-Siles M., González-Huix F., López-Oliu C., Dahbi G., Blanco J.E., Blanco J., Garcia-Gil L.J., Darfeuille-Michaud A. (2009). Molecular diversity of Escherichia coli in the human gut: new ecological evidence supporting the role of adherent-invasive E. coli (AIEC) in Crohn’s disease. Inflamm Bowel Dis. 15, 872–882 (12) Jostins L, Ripke S, Weersma RK, Duerr RH, McGovern DP, Hui KY, Lee JC, Schumm LP, Sharma Y, Anderson CA, et al. (2012). Host-microbe interactions have shaped the genetic architecture of inflammatory bowel disease. Nature 491, 119–124. (13) Kobayashi K.S., Chamaillard M., Ogura Y., Henegariu O., Inohara N., Nuñez G., Flavell R.A. (2005). Nod2-dependent regulation of innate and adaptive immunity in the intestinal tract. Science 307, 731734. (14) Panwala C.M., Jones J.C., Viney J.L. (1998). A novel model of inflammatory bowel disease: mice deficient for the multiple drug resistance gene, mdr1a, spontaneously develop colitis. J Immunol 161, 5733-5744. (15) Cosnes J. (2004). Tobacco and IBD: relevance in the understanding of disease mechanisms and clinical practice. Best Prac Res Clin Gastroenterol 18, 481-496. (16) Godet P.G., May G.R., Sutherland L.R. (1995). Meta-analysis of the role of oral contraceptive agents in inflammatory bowel disease. Gut 37, 668-673. (17) Berg D.J., Zhang J., Weinstock J.V., Ismail H.F., Earle K.A., Alila H., et al. (2002). Rapid development of colitis in NSAID-treated IL-10-deficient mice. Gastroenterology 123, 1527-1542. (18) Triantafillidis J.K., Triantafidillis A. (2008). The role of antibiotics in inflammatory bowel disease. Annals of gastroenterology 21 (1), 17-26. (19) Card T., Logan R.F., Rodrigues L.C., Wheeler J.G. (2004). Antibiotic use and the development of Crohn’s disease. Gut 53, 246-250. (20) Hart A., Kamm M.A. (2002). Review article: mechanisms of initiation and perpetuation of gut inflammation by stress. Aliment. Pharmacol. Ther. 16, 2017-2028. (21) Kirsner J.B. (1961). Experimental "colitis" with particular reference to hypersensitivity reactions in the colon. Gastroenterology 40, 307-312. (22) Kühn R., Löhler J., Rennick D., Rajewsky K., Müller W. (1993). Interleukin-10-deficient mice develop chronic enterocolitis. Cell 75 (2), 263-74. 27 (23) Sartor R.B., Bond T.M., Schwab J.H. (1988). Systemic uptake and intestinal inflammatory effects of luminal bacterial cell wall polymers in rats with acute colonic injury. Infection and immunity 56, 21012108. (24) Hibi T., Ogata H., Sakuraba A. (2002). Animal models of inflammatory bowel disease. J Gastroenterol 37, 409-417. (25) Zimmermann E.M., Sartor R.B., McCall R.D., Pardo M., Bender D., Lund P.K. (1993). Insulinlike growth factor I and interleukin 1 beta messenger RNA in a rat model of granulomatous enterocolitis and hepatitis. Gastroenterology 105 (2), 399-409. (26) Kitsukawa Y., Saito H., Suzuki Y., Kasanuki J., Tamura Y., Yoshida S. (1992). Effect of ingestion of eicosapentaenoic acid ethyl ester on carrageenan-induced colitis in guinea pigs. Gastroenterology 102, 1859-1866. (27) Breeling J.L., Onderdonk A.B., Cisneros R.L., Kasper D.L. (1988). Bacteroides vulgatus outer membrane antigens assoiciated with carrageenan-induced colitis in guinea pigs. Infect Immun 56, 17541759. (28) Iqbal N., Oliver J.R., Wagner F.H., Lazenby A.S., Elson C.O., Waever C.T. (2002). T helper 1 and T helper 2 cells are pathogenic in an antigen-specific model of colitis. J Exp Med 195, 71-84. (29) von Freeden-Jeffry U., Davidson N., Wiler R., Fort M., Burdach S., Murray R. (1998). IL-7 deficiency prevents development of a non-T cell non-B cell-mediated colitis. J Immunol 161, 5673-5680. (30) Erdman S., Fox J.G., Dangler C.A., Feldman D., Horwitz B.H. (2001). Typhlocolitis in NF-kappa Bdeficient mice. J Immunol 166 (3), 1443-1447. (31) Dieleman L.A., Ridwan B.U., Tennyson G.S., Beagley K.W., Bucy R.P., Elson C.O. (1994). Dextran sulfate sodium-induced colitis occurs in severe combined immunodeficient mice. Gastroenterology 107 (6), 1643-1652. (32) Hoffmann J.C., Peters K., Henschke S., Herrmann B., Pfister K., Westermann J., Zeitz M. (2001). Role of T lymphocytes in rat 2,4,6-trinitrobenzene sulphonic acid (TNBS) induced colitis: increased mortality after gammadelta T cell depletion and no effect of alphabeta T cell depletion. Gut 48 (4), 489495. (33) Okayasu I., Hatakeyama S., Yamada M., Ohkusa T., Inagaki Y., Nakaya R. (1990). A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology 98 (3), 694-702. (34) Tran C.D., Katsikeros R., Abimosleh S.M. (2012). Current and novel treatments for ulcerative colitis. In: Shennak M (ed) Ulcerative colitis from genetics to complications, InTech, ISBN: 978-953307-853-3. (35) Chassaing B., Aitken J.D., Malleshappa M., Vijay-Kumar M. (2014). Dextran Sulfate Sodium (DSS)Induced Colitis in Mice. Curr Protoc Immunol 104, unit 15-25. (36) Perše M., Cerar A. (2012). Dextran Sodium Sulphate Colitis Mouse Model: Traps and Tricks. Biomed Res Int. doi: 10.1155/2012/718617. (37) Motavallian-Naeini A., Andalib S., Rabbani M., Mahzouni P., Afsharipour M., Minaiyan M. (2012). Validation and optimization of experimental colitis induction in rats using 2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid. Res Pharm Sci 7 (3), 159-169. (38) Brenna O., Furnes M.W., Drozdov I., Granlund A.B., Flatberg A., Sandvik A.K., Zwiggelaar R.M., Marvik R., Nordrum I.S., Kidd M., Gustafsson B.I. (2013). Relevance of TNBS-Colitis in Rats: A Methodological Study with Endoscopic, Histologic and Transcriptomic Characterization and Correlation to IBD. PLoS ONE 8 (1):e54543. (39) Zheng L., Gao Z.Q., Wang S.X. (2000). A chronic ulcerative colitis model in rats. World J Gastroentero 6, 150-152. (40) Wang Y.H., Ge B., Yang X.L., Zhai J., Yang L.N., Wang X.X., Liu X., Shi J.C., Wu Y.J. (2011). Proanthocyanidins from grape seeds modulates the nuclear factor-kappa B signal transduction pathways in rats with TNBS-induced recurrent ulcerative colitis. Int Immunopharmacol 11 (10), 16201627. (41) Joshi S.V., Vyas B.A,. Shah P.D., Shah D.R., Shah S.A., Gandhi T.R. (2011). Protective effect of aqueous extract of Oroxylum indicum Linn. (root bark) against DNBS-induced colitis in rats. Indian J Pharmacol 43 (6), 656-661. (42) Dothel G., Vasina V., Barbara G., Ponti F.D. (2013). Animal models of chemically induced intestinal inflammation: predictivity and ethical issues. Pharmacol ther 139 (1), 71-86. (43) Wang X., Ouyang Q., Luo W.J. (2004). Oxazolone-induced murine model of ulcerative colitis. Chinese Journal of Digestive Diseases 5, 165-168. 28 (44) Heller F., Fuss I.J., Nieuwenhuis E.E., Blumberg R.S., Strober W. (2002). Oxazoline colitis, a Th2 colitis model resembling ulcerative colitis, is mediated by IL-13-producing NK-T-cells. Immunity 17, 629638. (45) Schiechl G., Bauer B., Fuss I., Lang S.A., Moser C., Ruemmele P., Rose-John S., Neurath M.F., Geissler E.K., Schlitt H.J., Strober W., Fichtner-Feigl S. (2011). Tumor development in murine ulcerative colitis depends on MyD88 signaling of colonic F4/80+CD11b(high)Gr1(low) macrophages. J Clin Invest 121 (5), 1692-1708. (46) Patel S.H., Rachchh M.A., Jadav P.D. (2012). Evaluation of anti-inflammatory effect of anti-platelet agent-clopidogrel in experimentally induced inflammatory bowel disease. Indian J Pharmacol 44 (6), 744-748. (47) Low D., Nguyen D.D., Mizoguchi E. (2013). Animal models of ulcerative colitis and their application in drug research. Drug Des Devel Ther 7, 1341-1357. (48) Sotnikova R., Nosalova V., Navarova J. (2013). Efficacy of quercetin derivatives in prevention of ulcerative colitis in rats. Interdiscip Toxicol 6 (1), 9-12. (49) Darwish I.E., Hala M.M., Amany S.O. (2012). Study of Possible Colonic Mucosal and Motility Changes in Experimental Acetic Acid Induced Colitis in Male Albino Rats under the effect of Oral Barley Administration in Comparison with Venlafaxine. J Phys Pharm Adv 2 (9), 319-329. (50) Bucy R.P., Xu X.Y., Li J., Huang G. (1993). Cyclosporin A-induced autoimmune disease in mice. J Immunol 151 (2), 1039-1050. (51) Marguerat S., MacDonald H.R., Kraehenbuhl J.P., van Meerwijk J.P. (1999). Protection from radiation-induced colitis requires MHC class II antigen expression by cells of hematopoietic origin. J Immunol 163, 4033-4040. (52) Jurjus A.R., Khoury N.N., Reimund J. (2003). Animal models of inflammatory bowel disease. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods 50 (2), 81-92. (53) Sadlack B. Merz H., Schorle H., Schimpl A., Feller A.C., Horak I. (1993). Ulcerative colitis-like disease in mice with a disrupted interleukin-2 gene. Cell 75 (2), 253-261. (54) Unutmaz D., Pulendran B. (2009). The gut feeling of Treg cells: IL-10 is the silver lining during colitis. Nat Immunol 10 (11), 1141-1143. (55) Spencer D.M., Veldman G.M., Banerjee S., Willis J., Levine A.D. (2002). Distinct inflammatory mechanisms mediate early versus late colitis in mice. Gastroenterology 122 (1), 94-105. (56) Dresner-Pollak R., Gelb N., Rachmilewitz D., Karmeli F., Weinreb M. (2004). Interleukin 10-deficient mice develop osteopenia, decreased bone formation, and mechanical fragility of long bones. Gastroenterology 127 (3), 792-801. (57) Sturlan S., Oberhuber G., Beinhauer B.G., Tichy B., Kappel S., Wang J., Rogy M.A. (2001). Interleukin-10-deficient mice and inflammatory bowel disease associated cancer development. Carcinogenesis 22 (4), 665-671. (58) Mombaerts P., Mizoguchi E., Smith R.N., Mizoguchi A. (1999). Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice. Cell 75, 1-20. (59) Takahashi I., Kiyono H., Hamada S. (1997). CD4+ T-cell population mediates development of inflammatory bowel disease in T-cell receptor alpha chain-deficient mice. Gastroenterology 112 (6), 1876-1886. (60) Kulkarni A., Huh C.G., Becker D., Geiser A., Lyght M., Flanders K.C., Roberts A.B., Sporn M.B., Ward J.M., Karlsson S. (1993). Transforming growth factor beta 1 null mutation in mice causes excessive inflammatory response and early death. Proc Natl Acad Sci U S A 90 (2), 770-774. (61) Boismenu R., Chen Y. (2000). Insights from mouse models of colitis. J Leukoc Biol 67 (3), 267-278. (62) Feagins L.A. (2010). Role of transforming growth factor-β in inflammatory bowel disease and colitisassociated colon cancer. Inflamm Bowel Dis 16(11), 1963-1968. (63) Bettelli E., Carrier Y., Gao W., Korn T., Strom T.B., Oukka M., Weiner H.L., Kuchroo V.K. (2006). Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells. Nature 441 (7090), 235-238. (64) Burke JP.., Mulsow J.J., O'Keane C., Docherty N.G., Watson R.W., O'Connell P.R. (2007). Fibrogenesis in Crohn's disease. Am J Gastroenterol 102 (2), 439-448. (65) Takeda K., Clausen B.E., Kaisho T., Tsujimura T., Terada N., Förster I., Akira S. (1999). Enhanced Th1 activity and development of chronic enterocolitis in mice devoid of Stat3 in macrophages and neutrophils. Immunity 10 (1), 39-49. 29 (66) Lee E.G., Boone D.L., Chai S., Libby S.L., Chien M., Lodolce J.P., Ma A. (2000). Failure to regulate TNF-induced NF-kappaB and cell death responses in A20-deficient mice. Science 289 (5488), 23502354. (67) Tanner S.M., Staley E.M., Lorenz R.G. (2013). Altered generation of induced regulatory T cells in the FVB.mdr1a−/− mouse model of colitis. Mucosal Immunology 6, 309-323. (68) Wilk J.N., Bilsborough J., Viney J.L. (2005). The mdr1a-/- mouse model of spontaneous colitis: a relevant and appropriate animal model to study inflammatory bowel disease. Immunol Res 31 (2), 151159. (69) Edwards R.A., Smock A.Z. (2006). Defective arachidonate release and PGE2 production in Gi alpha2-deficient intestinal and colonic subepithelial myofibroblasts. Inflamm Bowel Dis 12 (3), 153-165. (70) Rudolph U., Finegold M.J., Rich S.S., Harriman G.R., Srinivasan Y., Brabet P., Boulay G., Bradley A., Birnbaumer L. (1995). Ulcerative colitis and adenocarcinoma of the colon in G alpha i2-deficient mice. Nat Genet 10 (2), 143-150. (71) Kaser A., Lee A.H., Franke A., Glickman J.N., Zeissig S., Tilg H., Nieuwenhuis E.E., Higgins D.E., Schreiber S., Glimcher L.H., Blumberg R.S. (2008). XBP1 links ER stress to intestinal inflammation and confers genetic risk for human inflammatory bowel disease. Cell 134 (5), 743-756. (72) Kontoyiannis D., Boulougouris G., Manoloukos M., Armaka M., Apostolaki M., Pizarro T., Kotlyarov A., Forster I., Flavell R., Gaestel M., Tsichlis P., Cominelli F., Kollias G. (2002). Genetic dissection of the cellular pathways and signaling mechanisms in modeled tumor necrosis factor-induced Crohn's-like inflammatory bowel disease. J Exp Med 196 (12), 1563-1574. (73) Watanabe M., Watanabe N., Iwao Y., Ogata H., Kanai T., Ueno Y., Tsuchiya M., Ishii H., Aiso S., Habu S., Hibi T. (1997). The serum factor from patients with ulcerative colitis that induces T cell proliferation in the mouse thymus is interleukin-7. J Clin Immunol 17 (4), 282-292. (74) Watanabe M., Ueno Y., Yajima T., Iwao Y., Tsuchiya M., Ishikawa H., Aiso S., Hibi T., Ishii H. (1995). Interleukin 7 is produced by human intestinal epithelial cells and regulates the proliferation of intestinal mucosal lymphocytes. J Clin Invest 95 (6), 2945-2953. (75) Wirtz S., Finotto S., Kanzler S., Lohse A.W., Blessing M., Lehr H.A., Galle P.R., Neurath M.F. (1999). Cutting edge: chronic intestinal inflammation in STAT-4 transgenic mice: characterization of disease and adoptive transfer by TNF- plus IFN-gamma-producing CD4+ T cells that respond to bacterial antigens. J Immunol 162 (4), 1884-1888. (76) Lee W.T., Tin X.M., Vitetta E.S. (1990). Functional and ontogenetic analysis of murine CD45RBhi and CD45RBlo CD4+ T cells. J Immunol 144, 3288-3295 (77) Bottomly K., Luqman M., Greenbaum L., Carding S., West J., Pasqualini T., Murphy D.B. (1989). A monoclonal antibody to murine CD45R distinguishes CD4 T cell populations that produce different cytokines. Eur J Immunol 19 (4), 617-623. (78) Steinhoff U., Brinkmann V., Klemm U., Aichele P., Seiler P., Brandt U., Bland P.W., Prinz I., Zügel U., Kaufmann S.H. (1999). Autoimmune intestinal pathology induced by hsp60-specific CD8 T cells. Immunity 11 (3), 349-358. (79) German A.J., Hall E.J., Kelly D.F., Watson A.D., Day M.J. (2000). An immunohistochemical study of histiocytic ulcerative colitis in boxer dogs. J Comp Pathol 122 (2-3), 163-175. (80) Chalifoux L.V., Bronson R.T. (1981). Colonic adenocarcinoma associated with chronic colitis in cotton top marmosets, Saguinus oedipus. Gastroenterology 80, 942-946. (81) Cong Y., Brandwein S.L., McCabe R.P., Lazenby A., Birkenmeier E.H., Sundberg J.P., Elson C.O. (1998). CD4+ T cells reactive to enteric bacterial antigens in spontaneously colitic C3H/HeJBir mice: increased T helper cell type 1 response and ability to transfer disease. J Exp Med 187 (6), 855-864. (82) Matsumoto S., Okabe Y., Setoyama H., Takayama K., Ohtsuka J., Funahashi H., Imaoka A., Okada Y., Umesaki Y. (1998). Inflammatory bowel disease-like enteritis and caecitis in a senescence accelerated mouse P1/Yit strain. Gut 43 (1), 71-78. (83) Rivera-Nieves J., Bamias G., Vidrich A., Marini M., Pizarro T.T., McDuffie M.J., Moskaluk C.A., Cohn S.M., Cominelli F. (2003). Emergence of perianal fistulizing disease in the SAMP1/YitFc mouse, a spontaneous model of chronic ileitis. Gastroenterology 124 (4), 972-982. (84) Wirtz S., Neurath M.F. (2007). Mouse models of inflammatory bowel disease. Advanced Drug Delivery Review 59, 1073-1083. 30
