18 – Recombinant –DNA

18 – Recombinant –DNA-technieken
18.1 Klonen met vectors
Gene cloning = het maken van vele kopieën van een gen.
Vector = een kleine DNA molecuul dat kan repliceren onafhankelijk van gastheercel DNA, en op die
manier veel identieke kopieën van een gen kan maken.
Het doel van een vector is het dragen van een DNA segment dat gekloond moet worden.
- Meeste vectors zijn kleine circulaire stukjes DNA(=plasmiden).
Plasmiden die resistentie ergens voor dragen = R factors.
Sommige plasmiden hebben origins of replication met een heel breed bereik, ze kunnen repliceren in
cellen van veel verschillende soorten.
Selectable marker = R factors die de cel de mogelijkheid geven om te overleven in een toxisch milieu.
- Andere vectoren maken gebruik van virussen en hun replicatie cyclus(=viral vector).
Chromosomaal DNA wordt geïsoleerd en om het te knippen behandeld met Restriction
endonuclease/enzymes. Deze binden aan een specifieke sequence en knippen de backbone op twee
bepaalde locaties, elk in één strand -> ‘sticky ends’= de enkel-stranded stukjes aan het eind van het
DNA maken waterbruggen met elkaar, wat niet heel stevig is -> DNA ligase maakt de backbones weer
aan elkaar.
Restrictie enzymen herkennen vaak een ‘palindromic’sequence(=de sequentie in een strand is
identiek aan die van de complementary strand, in omgekeerde richting gelezen)
Recircularized vector = wanneer de vector weer aan zichtzelf bind(Geen DNA erin dus)
Recombinant vector= wanneer er een stukje DNA in de vector is ingebouwd.
-> de bacteriën worden op een plaatje gezet -> miljoenen bacterie koloniën ontstaan.
Het doel is om zo veel mogelijk kopieën van een bepaald gen te krijgen(elke cel heeft meerdere
kopieën).
cDNA
Dmv reverse transcriptase wordt van RNA weer DNA gemaakt:
mRNA is gehaald uit cellen -> wordt gemixt met primers bestaande uit een rij
thyminen(=oligonucleatiode=> ply-dT primer) -> Reverse transcriptase en dNTP’s worden toegevoegd
-> mRNA + complementaire trand -> RNaseH, DNA polymerase, DNA ligase worden toegevoegd ->
cDNA(complemantary DNA)
Voordeel = geen introns.
Restriction mapping
= het bepalen van locaties van ristriction sites:
Een plasmide wordt geïsoleerd en uit een gastcel gehaald -> mosters hiervan worden genomen en in
verschillende reageerbuisjes gedaan die verschillende ristrictie ezymen (combinaties) hebben -> DNA
fragmenten worden dan gescheiden van elkaar door gel electrophoresis -> vergeleken met
standaard, al bekende markers.
18.2 Polymerase Chain Reaction (PCR)
= Het kopiëren van DNA zónder de hulp van vectors en gastcellen.
PCR maakt kopieën van gen geflankeerd door 2 primers(15-20bp lang).
Start product kan een mix zijn van DNA. De primers binden aan specifieke sites op het DNA. Deze
primers worden gekozen o.b.v. de al bekende sequence van het buur-gen van het gene of interest.
Template DNA= stuk DNA dat het gene of interest bevat.
Template DNA wordt gedenatureerd door verhitting -> de strand scheiden van elkaar -> temperatuur
wordt verlaagd -> oligonucleotiden binden aan het DNA(=annealing) -> temeratuur wordt verhoogd
-> Taq plymerase catalyseerd de synthese van het DNA, beginnend bij de primers(=primer extension)
-> verdubbeling van het template DNA -> cyclus wordt herhaald.
PCR wordt gedaan in een ‘thermocycler’, waarin de timing van elke cyclus is geautomatiseerd.
PCR kan ook gebruikt worden om te ontdekken hoeveel er van een bepaalde RNA aanwezig is in een
cel:
- reverse transcriptase PCR
RNA wordt geïsoleerd -> wordt gemixt met denucleotiden, reverse transcriptase en een primer ->
enkel-strengs cDNA -> deze cDNA wordt gebruikt als template DNA in een PCR
- real-time PCR
helpt onderzoekers om te bepalen hoe veel DNA er aanwezig was voordat de PCR begon. Dit wordt
uitgevoerd in een hermocyler die het fluorescerend niveau meet.
TaqMan detector is een oligonucleotide(complementair aan het gene of interest) met een:
‘reporter molecule’: zendt fluorescerend licht uit.
‘quencher molecule’: absorbeert het licht.
Een primer en een TaqMan binden aan het template DNA na denaturatie -> primer extension ->
reporter wordt gescheiden van de quencher -> Reporter kan nu zijn licht uitstralen -> deze straling
wordt gemeten. Hoe meer PCR producten zich verzamelen -> fluorescense niveau stijgt.
Om de hoeveelheid DNA aan het begin te bepalen, wordt er een grafiek gemaakt en deze vergeleken
met een standaard model.
18.3 DNA bibliotheken en Blotting
DNA libraby= collectie van recombinant vectors
Genomic library= wanneer het start materiaal chromosomaal DNA is.
Colony hybridization
Master plate heeft veel bacteriële kolonies. Elke kolonie bestaat uit bacteriën met een recombinant
vector met een verschillend stukje DNA -> een nylon membraan wordt op de master plate gelegd ->
deze wordt later weer opgetild -> enkele bacterien blijven hieraan kleven -> deze cellen worden
behandeld met detergent -> DNA wordt blootgelegd -> DNA wordt aan het nylon membraan
vastgemaakt en gedenatureerd met NaOH -> het membraan wordt ondergedompeld in een
substantie met een gelabelde ‘probe’(= stukje complementaire strand) -> de probe zal binden
(hybridize) aan het gene of interest -> ongebonden probe wordt weggespoeld -> membraan wordt
naast een X-ray apparaat gezet -> het probe gebonden gen zal donker oplichten op de X-ray film ->
de film wordt vergeleken met de master plate en zo weten onderzoekers waar de goede bacteriën op
de master plate zitten.
Southern blotting
Wordt gebruikt voor het zoeken van een bepaald gen in een mix van genen(DNA). Het kan:
- het copy number van een gen in het genoom bepalen
- kleine gen deleties opsporen
- gen families identificeren
- homologe genen in verschillende soorten identificeren(zoo blot)
- bepalen of transgenen daadwerkelijk het transgene gen bevatten
Chromosomaal DNA wordt geïsoleerd en bewerkt met ristrictie enzymen -> duizenden stukjes van
verschillende grootte -> worden gescheiden via gel electrophoresis -> DNA stukjes in de gel worden
gedenatureerd door NaOH -> DNA wordt op een nylon membraan gebracht ->
1) de gel wordt op blotting papier gelegd in de transfer solution, nylon membraan komt daarop, met
daar weer boven een additional blotting paper, droge papiere doeken, glas plaat, een gewicht.
De vloeistof van de transfer solution wordt omhoog getrokken -> DNA van gel wordt meegenomen
naar nylon membraan en blijft daar zitten.
OF
2) het geheel wordt in een elektrisch veld gezet. Nylon membraan wordt in een oven gezet of
blootgesteld aan UV-licht. -> er wordt bepaald of een van de ongelabelde fragmenten sequenties
hebben die complementair zijn met de gelabelde probe.
Wordt de procedure gedaan bij:
- hoge temp/ lage zout con, moeten de probe en het DNA vrijwel identiek zijn(=high stringency)
- lagere temp/ hoge zout con, hoeven ze niet zo complementair te zijn(=low stringency).
Northern blotting
Wordt gebruikt om RNA te identificeren in een mix van RNA’s.
Om te de transcriptie op moleculair niveau te onderzoeken; bepalen of een bepaald gen tot
expressie wordt gebracht in een bepaald cel type.
Het begin product is RNA, dat wordt gehaald uit levende cellen.
(de rest is hetzelfde als bij de southern variant)
Western blotting
Wordt gebruikt voor het vinden van een bepaald eiwit in een mix van eiwitten.
Eiwitten worden uit levende cellen gehaald -> opgelost in sodium dodecyl sulfate(SDS) ->
denatureerd eiwitten en geeft hen een negatieve lading -> gescheiden in een gel van polyacrylamide
(=SDS-PAGE). -> de eiwitten in de gel worden op een nylon membraan gebracht -> een
probe(antilichaam) herkent een bepaald eiwit van interesse.
Antilichamen binden aan bepaalde sites(=epitopes). Deze epitopes hebben een bepaalde 3Dstructuur die het antilichaam herkent.
Antigen is een molecuul die wordt herkend door het antilichaam en hebben meerdere
epitopes.
-> het eerste antilichaam bindt zich aan het eiwit van interesse -> rest wordt weggespoeld -> het
tweede antilichaam bindt aan het eerste antilichaam, deze geeft uiteindelijk aan waar het gezochte
eiwit zich dus bevindt.
18.4 Analyse van DNA- en RNA-binding eiwitten
Gel retardation assay(gel mobility assay shift), gebruikt voor het opsporen van interacties tussen
mRNA’s - RNA-binding proteins en transcriptie factoren – DNA regulatory elements.
Door electrophoresis, DNA fragmenten worden naar beneden getrokken door een volt gradiënt.
Gebonden stukken DNA of RNA zijn groter(hebben meer massa) en blijven dus hoger op de gel.
DNase I footprinting
geeft meer gedetailleerde informatie over interacties tussen eiwit en DNA. Het kan de regio
identificeren die met het eiwit samenwerkt.
18.5 DNA sequencing en site-directed mutagenesis
Dideoxy sequencing
is gebaseerd op de kennis van DNA replicatie, maar dan met een slimme draai.
Chemisten kunnen deoxyribose nucleotiden maken die hun –OH 3’ groep missen(= een ddNTP).
Wanneer een ddNTP wordt toegevoegd aan een groeidende DNAstreng, kan deze niet verder groeien
= chain termination.
Hiervoor moet het nieuw gemaakte DNA wel gelabeld zijn.
Automated DNA sequencing, elke dideoxyribose is gelabeld met een kleur:
Een sample met veel kopieën van enkel-strengs DNA wordt gemixt met veel primers -> Alle 4 typen
dideoxyribosen, DNA polymerase worden toegevoegd (de reageerbuis bevat ook kleine maten van
gefluoriscerend gelabeld ddG, ddA, ddC en ddT) -> DNA plymerase maakt complementaire strands
van het target DNA -> mix van DNA strands van verschillende grootten wordt gemaakt -> gescheiden
dmv een slab gel of een gel-filled capillary tube -> korte strands gaan verder naar beneden dan de
lange -> we weten de kleur en dus welke base er op elk eind van elke DNA strand is.
Deze methode heet ‘sequencing ladder’.
Site-directed mutagenesis
= het maken van mutaties in gekloond DNA of andere genen.
Dit wordt dan in een levend organisme ingebracht om te kijken of het een effect heeft op de
expressie van een gen, functie van een eiwit of het fenotype.