Methode-optimalisatie voor metabolomics en DNA
advertisement
UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Vakgroep Veterinaire Voedselveiligheid en Volksgezondheid Laboratorium voor Chemische Analyse Academiejaar 2014-2015 Methode-optimalisatie voor metabolomics en DNA-adductomics in de studie naar de relatie tussen rood vlees en colorectale kanker met behulp van de HT29-cellijn. Simon BOS Eerste Master in de Geneesmiddelenontwikkeling Promotor Prof. Dr. L. Vanhaecke Commissarissen Prof. Dr. S. De Saeger Dr. J. Vanden Bussche AUTEURSRECHT “De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef.” 28 mei 2015 Promotor Prof. Dr. L. Vanhaecke Auteur Simon Bos Samenvatting Bij het onderzoek naar het verband tussen de consumptie van rood vlees en het ontstaan van colorectale kanker wordt op verschillende wetenschappelijke domeinen gewerkt. Zo wordt onder andere gebruik gemaakt van cellijnen om de toxiciteit van rood vlees na te gaan. Twee onderzoeksdomeinen die hierbij ingezet kunnen worden zijn metabolomics en DNA-adductomics. In deze masterproef werd voor de toepassing van metabolomics een optimalisatie uitgevoerd voor de extractie van metabolieten uit de HT29-cellijn. De optimalisatie gebeurde aan de hand van statistische analyse met behulp van Modde 5.0. Door de uitgevoerde optimalisatie van het extractieprotocol is de meest efficiënte extractie van metabolieten uit de cellijn verzekerd en kunnen eventuele veranderingen in metabolietexpressie, door welbepaalde experimentele behandelingen in de context van het onderzoek naar de al dan niet toxische invloed van rood vlees op de colorectale cellen, diepgaander onderzocht worden. Voor het DNA-adductomicsluik van deze masterproef werden diezelfde HT29-cellijn gebruikt om een geschikte methode te vinden om DNA en vervolgens ook DNA-adducten te extraheren. Hierbij werd ook een experiment opgezet met de genotoxische stoffen crotonaldehyde, malondialdehyde en kaliumdiazoacetaat. Uit deze proef is gebleken dat het toedienen van deze stoffen via het groeimedium van de HT29-cellen kan leiden tot een meetbare stijging in DNA-adductvorming. De concentratie van het DNA-adduct α-methyl-γhydroxy-1,N2-propanoguanine (CroG) is gecorreleerd (R2 = 0,95) met de concentratie van het toegediende crotonaldehyde. Er zijn dus aanwijzingen dat de HT29-cellijn kan ingezet worden voor verder onderzoek naar de vorming van DNA-adducten onder invloed van bepaalde genotoxische componenten. Bijkomende testen zijn echter nog nodig om deze hypothese te bevestigen. Dankwoord Graag had ik even de tijd en witte bladruimte (in)genomen om de personen te bedanken die hebben bijgedragen aan mijn masterproef. Eerst en vooral zijn er mijn twee begeleiders die altijd klaar stonden om mij bij te staan met raad en daad. Ook voor het nalezen van al mijn teksten wil ik jullie bedanken. Caroline en Lieselot, jullie zijn twee toffe personen die ik graag als mijn thesisbegeleiders heb gehad, waarvoor nogmaals dank. Eveneens wil ik ook Prof. Vanhaecke bedanken voor het openstellen van een masterproefplaats in het labo. Ik heb hier een aangename tijd beleefd en kijk met veel plezier terug op deze periode. Bedankt dat ik voor even deel mocht uitmaken van het team. Ook voor de input tijdens de verslagsessie en het nalezen van mijn masterproef zou ik u willen bedanken. Verder wil ik ook nog Kaat bedanken. Ik kon steeds bij haar terecht voor de kleine dingen des thesislevens alsook voor een frisse kijk op sommige dilemma’s en problemen die zich voordeden. Bedankt voor het geduld en de toffe babbels die we hadden. Ook alle andere personen waarbij ik terecht kon voor raad of een leuk gesprek wil ik bedanken waaronder Anneleen, Beata, Jella, Julie, Lieven, Nathalie en vele anderen. Als laatste wil ik nog mijn ouders bedanken die mij steunen bij de keuzes die ik maak en omdat ik dankzij hen de kans heb gekregen om deze studies te volgen Inhoudsopgave 1. INLEIDING 1 1.1 C OLORECTALE KANKER IN B ELGIË EN DE WERELD 1 1.2 I NVLOED VAN ROOD VLEES OP COLONKANKER 2 1.2.1 MOGELIJKS CARCINOGENE VERBINDINGEN DIE GEVORMD WORDEN BIJ DE BEREIDING VAN ROOD VLEES: HCA’S EN PAK’S 3 1.2.2 MOGELIJKS CARCINOGENE STOFFEN EIGEN AAN ROOD VLEES 3 1.2.2.1 Vet en vetperoxidatie 3 1.2.2.2 Proteïnen 5 1.2.2.3 Haemijzer 5 1.2.3 NOC’S 6 1.2.3.1 Exogene blootstelling aan NOC’s 7 1.2.3.2 Endogene vorming van NOC’s 8 1.3 A ANTASTING VAN DNA IN GENMUTATIES EN CRC 9 1.3.1 DNA-ADDUCTEN IN DE RELATIE TUSSEN ROOD VLEES EN CRC 9 1.3.2 MODULATIE VAN GENEN EN DE GEVOLGEN ERVAN OP COLORECTAAL NIVEAU 10 1.4 M ETABOLOMICS 12 1.5 V LOEISTOFCHROMATOGRAFIE EN MASSASPECTROMETRIE 13 2. OBJECTIEVEN 16 3. M ATERIAAL EN M ETHODEN 17 3.1 O NDERHOUD CELCULTUUR 3.1.1. CELLEN IN MEDIUM 3.1.2 GROEIEN EN SPLITSEN VAN CELLEN 3.1.3 TELLEN EN HEROPLOSSEN VAN CELLEN 3.2 O PTIMALISATIE EXTRACTIE METABOLIETEN HT29- CELLEN 3.2.1 AANMAAK INTERNE STANDAARD 3.2.2 PROEFEXTRACTIE VOOR DE KEUZE VAN DE REFERENTIEMETABOLIETEN 3.2.3 OPTIMALISATIE VAN DE EXTRACTIE IN MODDE 5.0 3.2.4 VERDERE OPTIMALISATIE VAN DE EXTRACTIE IN MODDE 5.0 3.2.5 UHPLC-HRMS, DATAVERWERKING EN DATA-ANALYSE 3.2.5.1 UHPLC-HRMS 3.2.5.2 Dataverwerking en data-analyse 3.3 DNA EN DNA- ADDUCTEN 3.3.1 EXTRACTIE VAN DNA UIT HT29-CELLEN 3.3.2 AANMAKEN VAN WERKOPLOSSINGEN 3.3.3 AANMAKEN INTERNE STANDAARD 3.3.4 DNA-ADDUCTEXTRACTIE 3.3.5 OPSTELLEN IJKLIJN 3.3.6 GENOTOXICITEITSTEST/POSITIEVE CONTROLE DNA-ADDUCTEN 3.3.7 DNA-ADDUCTANALYSE VIA UHPLC-HRMS 3.3.8 DATA-INTERPRETATIE DNA-ADDUCTANALYSE Q-EXACTIVE™ 17 17 17 17 19 19 19 20 21 22 22 23 24 24 24 25 25 26 26 28 28 4. RESULTATEN 30 4.1 O PTIMALISATIE EXTRACTIE METABOLIETEN HT29- CELLEN 4.1.1 PROEFEXTRACTIE VOOR DE KEUZE VAN REFERENTIEMETABOLIETEN 4.1.2 OPTIMALISATIE VAN DE EXTRACTIE IN MODDE 5.0 4.1.2.1 Interpretatie van de coëfficiëntenplots 4.1.2.2 Bespreking voor alle referentiemetabolieten 4.1.2.3 Algemeen resultaat 30 30 32 32 34 35 4.1.3 VERDERE OPTIMALISATIE VAN DE EXTRACTIE IN MODDE 5.0. 4.1.3.1 Coëfficiënten- en ‘contour’plots 4.1.3.2 Bespreking voor alle referentiemetabolieten 4.1.3.3 Algemeen resultaat 4.2 DNA- EN DNA- ADDUCTEXTRACTIE 4.2.1 DNA-EXTRACTIE 4.2.2 TOXICITEITSTESTEN OP DE HT29-CELLIJN 35 35 36 39 39 39 41 5. DISCUSSIE 44 5.1 5.2 5.3 5.4 44 45 46 47 HT29- CELLEN O PTIMALISATIE PROTOCOL VOOR METABOLIETEXTRACTIE UIT HT29- CELLEN DNA- EXTRACTIE DNA- TOXICITEITSTEST 6. CONCLUSIE 49 7. BIBLIOGRAFIE 51 BIJLAGE 1: DNA-EXTRACTIEPROTOCOL NUCLEOSPIN TISSUE KIT VAN M ACHEREY NAGEL BIJLAGE 2: FINAAL PROTOCOL (VOOR CELLEN GEKW EEKT IN 6 W ELLPLAAT) BIJLAGE 3: I@H LEZINGEN I VI VII R ESEARCH ON THE CAUSE OF HUMAN CANCER AND SCIENTIFIC STRATEGIES FOR CANCER PREVENTION AND CONTROL VII DR. INGE HUYBRECHTS VII RNA THERAPEUTICS : OPPORTUNITIES & CHALLENGES VIII PROF. RAYMOND SCHIFFELERS VIII T HE EVOLUTION OF MICROBIOLOGY IN CYSTIC FIBROSIS . IX PROF. JOHN LIPUMA IX Afkortingen 4-HNE 4-hydroxynonenal A Adenine APC Adenomatous Polyposis Coli ATNC Apparent Total N-nitroso Compounds CIS Chromosome Instability Pathway CRC Colorectale Kanker CRO Crotonaldehyde Cro(d)G α-methyl-γ-hydroxy-1,N2-propanoguan(osine)ine Cro(d)G-13C,15N2 isotoop van α-methyl-γ-hydroxy-1,N2-propanoguan(osine)ine CT-DNA Kalfthymus-DNA DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium DNA Deoxy Nucleïne Zuren EGF Epidermal Growth Factor EQC Extern Quality Control FA Mierenzuur FBS Foetaal Bovien Serum FWHM Full Width Half Maximum G Guanine HAc Azijnzuur HCA Heterocyclische Aromatische Amines HESI Heated Electro Spray Ionisation HRMS High Resolution Massa Spectrometer IQC Intern Quality Control ISTD Interne Standaard KDA Kalium Diazoacetaat LC Liquid Chromatography m/z Massa op Lading Verhouding M1dG pyrimidol[1,2-a]purin-10(1H)-one M1dG-13C3 isotoop van pyrimidol[1,2-a]purin-10(1H)-one MDA Malondialdehyde NDMA N-nitrosodimethylamine NOC N-nitrosocomponenten NP Normal Phase O6-CMdG Carboxymthylguan(osine)ine O6-d3-Me(d)G Gedeutereerd Methylguan(osine)ine O6-Me(d)G Methylguan(osine)ine PAK Polycyclische Aromatische Koolwaterstoffen PBS Phosphate Buffered Saline ROS Reactieve Zuurstof Radicalen RP Reversed Phase RT Retentie Tijd S/N Signal to Noise verhouding SBA Secundaire Galzouten SHIME Simulation of Human Intestinal Microbial Ecosystem SPE Solid Phase Extraction TBARS Thiobarbituric Acid Reactive Substances TNM Tumor Node Metastase UHPLC Ultra High Performance/Pressure Liquid Chromatography UP H20 Ultra Puur Water 1. Inleiding 1.1 Colorectale kanker in België en de wereld Colorectale kanker (CRC) staat qua meest voorkomende tumoren in België (2012) op de 2de plaats bij vrouwen (na borstkanker) en op de 3de plaats bij mannen (na prostaat- en longkanker)(1). De prevalentie van CRC is het hoogst bij oudere personen (cat. 70+), maar ook de jongere leeftijdscategorieën krijgen er mee te maken (2). Op globaal niveau wordt dezelfde trend, waarbij de oudere bevolking het meest wordt getroffen door CRC, waargenomen. Tevens valt op dat Zuid-Korea het hoogste aantal colonkankergevallen registreert per 100.000 inwoners, België staat voor beide geslachten samen op de 11de plaats. De hoogste CRC-incidentie wordt waargenomen in Oceanië en Europa, de laagste in Afrika en Azië (3)(4). Uit deze laatste bevindingen zou kunnen worden afgeleid dat de meeste gevallen van CRC voornamelijk voorkomen in landen met een goede welvaartstatus. Een gevolg van deze goede welvaartsstatus is onder meer een betere toegang tot allerlei voedingsbronnen voor alle sociale klassen van de bevolking. Vlees is in de meeste landen een dure voedingsbron, zeker in minder ontwikkelde landen. Hierdoor zal de consumptie van vlees dan ook hoger zijn in Europa en Oceanië dan in Afrika en Azië, waar de consumptie van rood vlees veelal beperkt is door o.a. economische en religieuze redenen (5). Het duidelijkst is een mogelijke correlatie tussen consumptie van (rood) vlees en het voorkomen van colonkanker in de populatie te zien bij de bevolking van Japan en ZuidKorea. Voor 1975 was er in Japan een zeer lage colonkankerincidentie. Echter, na 1975 ziet men een duidelijke stijging tot zelfs verdubbeling van de incidentie in de daaropvolgende 20 jaar. Bij de mortaliteitscijfers is deze trend eveneens merkbaar (figuur 1.1). Een denkpiste die aangewend wordt om dit fenomeen te verklaren, baseert zich op het feit dat er in de jaren na 1975 een grote import van varkens- en rundvleesproducten op gang kwam en de consumptie van deze voedselwaren steeg. Voor Zuid-Korea worden dezelfde feiten waargenomen, maar dan 20 jaar later, vanaf 1995 (5). 1 Figuur 1.1: Mortaliteit voor colorectale en anale kanker per 100.000 inwoners Bron: (6) De mogelijke causale invloed van rood vlees op de ontwikkeling van CRC werd reeds in verschillende studies onderzocht en werd meestal uitgedrukt als een relatief risico voor de incidentie van CRC. Hierbij wordt een vergelijking gemaakt tussen de consumptie van rood vlees (bvb. rundsvlees) en de consumptie van wit vlees (bvb. kip) of het volgen van een vegetarisch dieet. Zo kwam men, door een meta-analyse uit te voeren op 13 verschillende correlatiestudies, tot een verhoogd risico van 12-17% bij een toename van de consumptie van rood vlees met 100 g per dag. Voor bereid vlees was dit een stijging van het risico met 49% per 25 g dat bijkomend geconsumeerd werd per dag (7). Andere en recentere metaanalyses geven een verhoogd relatief risico van 21-28% bij een hoge inname van rood en bereid vlees (8). Het ‘second expert report’ (SER) van 2007, uitgevoerd door het World Cancer Research Fund, geeft een stijging van 21% aan per inname van 50 g aan rood en bereid vlees per dag (9). Verder onderzoek naar de onderliggende basis voor de geobserveerde relatie tussen rood vlees en colonkanker kan daarom zeker nuttig zijn voor de verdere aanpak en preventie van de ziekte (10). 1.2 Invloed van rood vlees op colonkanker Onder de term rood vlees wordt voornamelijk het vlees afkomstig van het rund bedoeld, zowel rauw als bereid, maar ook varkensvlees valt onder deze noemer. Over de mogelijke 2 mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de relatie tussen de consumptie van rood vlees en colonkanker zijn al verschillende theorieën naar voor geschoven en onderzocht. 1.2.1 Mogelijks carcinogene verbindingen die gevormd worden bij de bereiding van rood vlees: HCA’s en PAK’s Door het bereiden (bvb. braden) en bewerken (bvb. additie van nitriet) van vlees wordt de productie van bepaalde carcinogene stoffen zoals de heterocyclische aromatische amines (HCA’s) verhoogd. In diermodellen werd de carcinogeniteit van HCA’s reeds duidelijk aangetoond. In humane modellen daarentegen, zijn de resultaten wat betreft het ontstaan van verschillende kankers onder invloed van HCA’s niet zo eenduidig. De HCA’s worden voornamelijk gevormd bij het sterk verhitten of grillen van vlees en het is ook bij deze bereidingswijze dat een verhoogd risico op CRC in de verschillende studies het meest uitgesproken was (11,12) . PAK’s of polycyclische aromatische koolwaterstoffen zijn tevens procarcinogene stoffen die kunnen ontstaan bij het bereiden (o.a. zeer uitgesproken bij BBQ) en bewerken van vlees. Echter, het merendeel van de PAK’s aanwezig in onze dagelijkse voeding is afkomstig van granen, groenten en fruit in ons dieet, wat voornamelijk komt door omgevingscontaminatie (door o.a. opname via de bodem of lucht) van deze levensmiddelen (13). Het is dus minder waarschijnlijk dat PAK’s, afkomstig uit de bereiding van vlees, een grote invloed hebben bij het ontstaan van colonkanker. Een uitzondering kan optreden bij het frequent eten van gegrild of BBQ-bereid vlees. Algemeen kan er besloten worden dat de PAK-concentraties die worden teruggevonden in vlees laag zijn in vergelijking met de totale inname via andere voedingsmiddelen in het dieet (13). 1.2.2 Mogelijks carcinogene stoffen eigen aan rood vlees Elke voedingsbron bestaat uit verschillende voedingselementen, zo ook rood vlees. Deze voedingselementen moeten in rekening gebracht worden bij het onderzoeken van mogelijke invloeden van voedsel op het lichaam. De belangrijkste componenten van rood vlees die mogelijk gelinkt zijn aan de ontwikkeling van CRC worden hierna beschreven. 1.2.2.1 Vet en vetperoxidatie Zoals in de meeste dierlijke producten is vet van nature in aanwezig in vlees, zo ook in rood vlees zoals rundsvlees en varkensvlees. Zeker in de bereide vormen van rund- en varkensvlees, zoals gehakt, is vet in grotere proporties aanwezig; tot wel 50% (14,15). De producten gevormd door vetperoxidatie, waaronder reactieve zuurstofradicalen en 3 aldehyden, zijn cyto- en genotoxisch en kunnen zo bijdragen tot het ontstaan van colorectale kanker. Door een hogere inname van vet wordt de vetperoxidatie en de vorming van meer secundaire galzouten (SBA’s) tijdens de vertering bevorderd. Uiteraard kan ook vet dat afkomstig is van andere voedingsbronnen bijdragen tot de verhoging van deze SBA’s en de mogelijke gevolgen ervan (8). Het zijn in bijzonder de polyonverzadigde vetzuurresiduen die gevoelig zijn aan oxidatie. De eerste stap bij oxidatie van vet is de aanval van deze lipiden door een vrij radicaal. Deze stap wordt gekatalyseerd door de aanwezigheid van haemijzer: vethydroperoxide zal reageren met haemijzer en zo vethydroperoxide-ijzerliganden vormen. Deze laatsten zullen uiteenvallen in een alkoxyradicaal en een haemoxyradicaal (16). VOOH + Fe-ligand à VOOFe VOOFe à VO + OFe De gevormde radicalen kunnen dan verdere oxidatie initiëren, wat leidt tot een oxidatieve kettingreactie. De oxidaties zorgen voor biochemische en cellulaire schade. Oxidatieve biochemische schade werd reeds bij verschillende ziektes aangetoond, wat de mogelijke rol van oxidatieve stress in het ontstaan en onderhouden van bepaalde ziekten benadrukt (16). Bij deze oxidatieve kettingreacties ontstaan niet alleen radicalen maar ook aldehyden, zoals in volgende studies werd aangetoond. Zo vond men in de ontlasting van personen op een dieet met een hoog haemgehalte namelijk relatief veel ‘thiobarbituric acid reactive substances’ (TBARS) terug. Deze TBARS zijn een algemene parameter voor de aanwezigheid van aldehydemoleculen gevormd door vetperoxidatie (17). De belangrijkste aldehydeproducten die gevormd kunnen worden, zijn malondialdehyde (MDA) en 4-hydroxynonenal (4-HNE). Deze eindproducten zijn bevestigde risicofactoren voor verscheidene ziekten waaronder CRC (18,19). Malondialdehyde (MDA) wordt gevormd bij de oxidatie van polyonverzadigde vetzuren met 2 of meer dubbele bindingen. MDA kan o.a. reageren met macromolecules zoals DNA en zo adducten vormen (20). 4-hydroxynonenal (4-HNE) is slechts zwak mutageen maar heeft daarentegen wel sterke effecten op de signaaltransductiereactiepaden. Zo werd reeds aangetoond dat 4-HNE in fecaal water aanleiding kan geven tot de inductie van apoptose en necrose van humane coloncarcinomacellen. Bij cellen met een mutatie in het APC-gen (zie verder) gebeurt dit 4 niet. Deze selectieve toxiciteit zou dus ook de tumorpromotie kunnen verklaren aangezien colonkankercellen op deze manier kunnen weerstaan aan de inductie van apoptose. (17,18). 1.2.2.2 Proteïnen Vlees is van nature rijk aan proteïnen en is voor de mens dan ook een belangrijke proteïnebron. Proteïnen die niet verteerd werden tijdens het enzymatisch verteringsproces in de dunne darm kunnen via bacteriële degradatie in de dikke darm zorgen voor de aanmaak van stikstofcomponenten zoals ammmoniak, fenolen en waterstofsulfide. Voorgaande stoffen kunnen inflammatie veroorzaken en de mucosa schade toebrengen. Voornamelijk vrij ammoniak is zeer schadelijk doordat het door de colonocyten geabsorbeerd kan worden en vervolgens de proliferatie kan versnellen (8). Ook de pH in het intestinaal lumen zal hierdoor dalen, wat de zuurstofconcentratie in de mucosa en de colonocytenfunctie zal beïnvloeden. Tevens zal de aanwezigheid van stikstof de aanmaak van N-nitrosocomponenten (NOC’s) bevorderen (zie verder) (8). 1.2.2.3 Haemijzer Haemijzer is ijzer dat interactie aangaat met een grote heterocyclische ring, een porfyrine, en zo een haemgroep vormt (zie figuur 1.2). Deze haemgroepen maken in dierlijk voedsel deel uit van de haemproteïnen waartoe o.a. hemoglobine en myoglobine, 2 belangrijke fysiologische eiwitten, behoren. Hemoglobine helpt in het bloed met de verdeling van zuurstof naar de weefsels toe en zorgt voor de typische rode kleur van bloed. Myoglobine is een eiwit dat voornamelijk in de spieren wordt teruggevonden en daar helpt met het vervoeren van de zuurstofmoleculen van de celmembraan naar de mitochondriën toe (18,21). Rood vlees dankt zijn donkerrode kleur aan de aanwezigheid van myoglobine. Myoglobine is dan ook de belangrijkste bron van haemijzer in rood vlees. Zo is de concentratie van myoglobine in rood vlees ongeveer 10 keer zo hoog als deze in wit vlees (18). Figuur 1.2: Structuurformule van haem b Bron: (22) 5 Bij bereid rood vlees kan het haemijzer in genitrosyleerde vorm voorkomen doordat het vlees soms wordt bewerkt met nitrieten die dienen als antibacterieel middel tegen onder andere Clostridium botulinum. De roze-rode kleur van bewerkt vlees ontstaat door de interactie van nitrieten en nitraten met myoglobine (7,18). In bepaalde studies werd geconstateerd dat genitrolyseerd haemijzer aanleiding kan geven tot het ontstaan van colonkanker in ratten en dit waarschijnlijk door de bevordering van Nnitrosatiereacties (zie verder; N-nitrosocomponenten). Men veronderstelt dat nitrosylhaem toxischer is dan niet genitrolyseerd haem (23). Daarnaast kan ijzer actief optreden in de reactiepaden van de vetperoxidatie, waarbij het ijzer zowel gereduceerd en geoxideerd kan worden in een zogenaamde redoxcyclus. Hierbij zullen andere stoffen kunnen gereduceerd en geoxideerd worden, ook wel de fentonreactie genoemd (24,25): Fe2+ + H2O2 -> Fe3+ + HO + HOFe3+ + H2O2 -> Fe2++ HOO + H+ 2 H2O2 -> HO + HOO + H2O 1.2.3 NOC’s NOC’s worden tot de groep van de meest krachtige carcinogenen gerekend. Bij verschillende dierproeven werd steeds een positieve correlatie opgetekend betreffende de inductie van tumoren. Tot de NOC’s behoren de N-nitrosamides en de N-nitrosamines (zie Fig. 1.3). Zo’n 85% van de N-nitrosamines en 92% van de N-nitrosamides zou carcinogeen zijn (26). Figuur 1.3: NOC structuren (27) NOC’s zijn alkylerende agentia die met verschillende moleculen kunnen interageren, waaronder ook DNA. Bij alkylatie van DNA zullen de nucleobasen gewijzigd worden, waardoor er o.a. een verandering kan optreden in de werking van het corresponderende eiwit (zie verder) dat vertaald wordt vanuit het aangetaste stuk DNA. Zo is een veel 6 voorkomende verandering door methylatie van het DNA de G à A transitie in codon 12 of 13 van het K-ras gen. Deze mutatie kan aanleiding geven tot kankerontwikkeling, waaronder de ontwikkeling van CRC (7). N-nitrosamides geven spontaan aanleiding tot alkylerende agentia en zullen dus snel inwerken op de plaats van blootstelling. De Nnitrosamines daarentegen moeten eerst geactiveerd worden via een metabolisch proces vooraleer ze macromoleculen kunnen alkyleren. Het enzym dat instaat voor dit proces behoort tot de familie van de CYP450-enzymen. Van deze CYP450-enzymen is geweten dat de activiteit kan verschillen van persoon tot persoon, waardoor de toxiciteit van de Nnitrosamines persoonafhankelijk is. Bij het onderzoek naar haemijzer en de katalysatie van N-nitrosaties met de vorming van NOC’s tot gevolg, wordt de hoeveelheid gevormde NOC’s meestal nagegaan d.m.v. thermische energie-analyse. Bij deze thermische energie-analyse worden niet enkel nitrosamines en nitrosamides gemeten, maar ook nitrosylijzer en S-nitrosothiolen. Naar deze verzameling van stoffen wordt gerefereerd als de ‘apparent total N-nitroso compounds’ of ATNC’s. Als men enkel de vorming van de NOC’s zelf wil bepalen, kan men gebruik maken van bijkomende technieken zoals bijvoorbeeld massaspectrometrie (18,26). Met behulp van deze technieken werd o.a. aangetoond dat er bij een dieet rijk aan rood vlees soms tot 60 keer zoveel ATNC’s in de fecale massa worden teruggevonden in vergelijking met een vegetarisch dieet (18,28). 1.2.3.1 Exogene blootstelling aan NOC’s Men wordt voornamelijk blootgesteld aan exogene NOC’s door roken en de consumptie van geconserveerd of bewerkt vlees. In voedsel dat gerookt of gedroogd werd door directe blootstelling aan vuur, was er voldoende warmte aanwezig om moleculair stikstof om te zetten in stikstofoxides die op hun beurt in staat zijn om amines in voedsel zoals rood vlees te nitrosyleren (21). Ook bij vlees dat behandeld werd met nitriet kunnen er zich exogene NOC’s vormen. Als nitriet zich in zure omstandigheden bevindt, kunnen distikstof-, tri- en tetraoxides worden gevormd. Deze distikstof-, tri- en tetraoxides zijn potentiele nitrosylatie-agentia (21). In een studie van Knekt et al. werd onderzoek verricht naar de inname van Nnitrosodimethylamine (NDMA) via voeding waaruit bleek dat NDMA vooral terug te vinden is in gerookte vis en vleesbereidingen zoals worst. De studie van Knekt et al. was de eerste waarin een direct verband kon worden aangetoond tussen de inname van grote 7 hoeveelheden N-nitrosamines en een verhoogd risico op CRC, dit op basis van een cohortstudie waarbij de eetgewoonten werden bijgehouden (29). 1.2.3.2 Endogene vorming van NOC’s Endogene NOC-productie is waarschijnlijk het resultaat van een reactie tussen nitrosylerende agentia en (voornamelijk) secundaire amines. De vorming kan echter via verschillende mechanismen gebeuren; met name door zuur gekatalyseerde, bacteriële of celgemedieerde mechanismen. Door de variëteit aan de mechanismen die kunnen leiden tot NOC-vorming, wordt verondersteld dat endogene NOC’s de grootste bron van blootstelling van NOC’s aan het lichaam zijn. Zure katalyse vindt voornamelijk plaats in aanwezigheid van een lage pH zoals in de maag, waar vrij salpeterzuur inwerkt als nitrosylerende stof. Desondanks is het gehalte aan NOC’s verkregen uit maagvloeistoffen na vertering 10 keer lager dan het uiteindelijke gehalte aan NOC’s dat wordt teruggevonden in het fecaal materiaal (7,30). Er wordt verondersteld dat de endogene NOC-productie voornamelijk te danken is aan chemische en bacteriële katalyse. Van verschillende facultatief anaërobe en obligatoir anaërobe bacteriën is geweten dat ze de katalyse tot NOC’s kunnen uitvoeren bij neutrale pH (vb. E. coli, P. Stutzeri). De enzymen verantwoordelijk voor de katalyse door bacteriën zijn nitraat- en nitrietreductase. Er wordt aangenomen dat de omzetting naar NOC’s voornamelijk in de dikke darm plaatsvindt, waar er door de fermentatie van proteïnen nitrosyleerbare substraten ontstaan. Amines en amides worden door bacteriën in de dikke darm gevormd via decarboxylatie van aminozuren die dan genitrolyseerd kunnen worden tot NOC’s (7). In een studie met 8 gezonde proefpersonen die elk een ander rood-vleesdieet voorgeschoteld kregen, werden duidelijke verschillen in fecale ATNC-concentraties opgemerkt. Het was zelfs zo dat er een duidelijke dosis-responsrelatie bestond tussen de inname van rood vlees en de productie van ATNC’s (31). In een andere studie werd bovendien de specifieke rol van haemijzer bij de endogene vorming van NOC’s aangetoond (32). Zoals reeds vroeger vermeld, kunnen NOC’s verantwoordelijk zijn voor alkylatie van het DNA waardoor er promutagene en toxische DNA-adducten zoals O6-methylguanine en O6carboxymethylguanine (Fig 1.4) kunnen ontstaan. Zo zou er bijvoorbeeld een correlatie bestaan tussen het aantal adducten en de hoeveelheid ATNC’s in de stoelgang van personen die rood vlees consumeren (18). 8 Figuur 1.4: Schema van een pathway die de mogelijke adductvorming weergeeft; Glycine wordt ge-N-nitrosyleerd met vorming van O 6 -methylguanine en O 6 -carboxymethylguanine. Bron: (33) 1.3 Aantasting van DNA in genmutaties en CRC 1.3.1 DNA-adducten in de relatie tussen rood vlees en CRC Zoals reeds meerdere malen vermeld werd, kunnen DNA-adducten onder meer gevormd worden bij het eten van rood vlees, en dit via verschillende reactiepaden. NOC’s zijn alkylerende agentia die het DNA kunnen alkyleren en zo het ontstaan van DNA-adducten kunnen induceren. De aanwezigheid van DNA-adducten door toedoen van exogene alkylerende agentia in humaan colorectaal weefsel werd dan ook reeds aangetoond (34). Tevens werd er ontdekt dat het aantal DNA-adducten in geëxfolieerde coloncellen van patiënten die op een dieet rijk aan rood vlees werden geplaatst, toeneemt (28). In een andere studie werd ook een verband aangetoond tussen de inname van rood vlees, het ATNC-gehalte en het voorkomen van het DNA-adduct O6-carboxymethylguanine in geëxfolieerde colloncellen (figuur 1.5) (33). De adducten die het meest worden geassocieerd met NOC’s zijn N7- en O6-alkylguanine-adducten. Deze laatste werden bovendien reeds gelinkt aan de inductie van tumoren (35). 9 Figuur 1.5: De correlatie tussen ATNC-concentratie en het percentage geëxfolieerde cellen dat positief testte voor O 6 -carboxymethylguanine na isolatie uit feces. Bron: (33) Ook de eerder besproken HCA’s en PAK’s kunnen DNA-adducten vormen. De vorming van DNA-adducten in het colon onder invloed van HCA’s is dosisafhankelijk (7). Niet enkel de NOC’s, maar ook vetperoxidatieproducten zoals MDA zijn in staat om te reageren met DNA. Het adduct dat hierbij het vaakst gevormd wordt is 1,N2malondialdehyde-deoxyguanosine (M1dG) (18). 1.3.2 Modulatie van genen en de gevolgen ervan op colorectaal niveau CRC ontstaat door een aantasting van regulatoire genen, waardoor de homeostase van de cel niet correct kan verlopen. Veel van bovengenoemde gevormde chemische stoffen kunnen er voor zorgen dat er mutaties optreden in het DNA. Het samenspel van de chromosome instability pathway (CIS) (zie onder), omgevingsfactoren en de condities in het lumen kunnen samen zorgen voor het ontstaan van kanker (8). De CIS-pathway is de traditionele adenoma-carcinoma pathway. In deze pathway zijn verschillende mutaties in sleutelgenen opgenomen die de celcyclus kunnen verstoren en zo chromosoominstabiliteit en celgroei in de hand werken. In 85% van de gevallen is CRC ontstaan via deze pathway. Belangrijke genen in deze pathway zijn K-ras, APC en TP53 (8). Het K-ras gen is een proto-oncogen dat door mutatie kan omgezet worden in een oncogen en op die manier zal bijdragen aan de carcinogenese. Het overeenkomstige K-ras eiwit heeft als functie de transductie van mitogene signalen uit te voeren tussen de EGF-receptor op het celoppervlak en de celkern (36). Een mutatie in het K-ras gen op zich zorgt meestal niet voor de maligne transformatie van de cel aangezien hiervoor nog bijkomende aandrijvende krachten vereist zijn (Fig. 1.6) (8). 10 Figuur 1.6: Schematische voorstelling van de CIS-pathway Bron: (37) Het APC of ‘adenomatous polyposis coli’ gen is een belangrijk tumorsuppressorgen dat een rol kan spelen in de ontwikkeling van CRC. Soms wordt er ook naar gerefereerd als “the gatekeeper gene” aangezien een mutatie in dit gen wordt gezien als de “gate” naar maligne transformatie van de cel. De CIS-pathway zou bijna zo goed als zeker niet doorgaan zonder een mutatie in het APC-gen. Het APC-eiwit zorgt immers voor de goede werking van de cadherines (calcium dependent adhesion molecules). Deze cadherines staan in voor een groot deel van de intercellulaire communicatie. Het APC-eiwit bindt op het cytoplasmatische domein van de cadherinemoleculen en verzekert zo de goede werking ervan. Bij niet goed functionerende APC-eiwitten zal dit interfereren met de normale mitose van cellen, waardoor fouten in het genoom minder snel worden opgemerkt en de celcyclus doorgaat met de mutaties die op dat moment aanwezig zijn in het genoom (8,38). Mutaties in het APC-gen worden gezien als een van de vroegste gebeurtenissen in de aanloop naar het ontwikkelen van CRC (39). Tot slot is er het TP53-gen dat codeert voor het p53-eiwit, tevens een tumorsuppressoreiwit. Het p53-eiwit waakt over de stabiliteit van het genoom en het goede verloop van de celcyclus. Bij een fout tijdens de replicatie zal p53 er voor zorgen dat de snelheid van de celcylcus wordt vertraagd in de G1/S-fase. Het zal er ook voor zorgen dat de DNA-schade extra onder de aandacht wordt gebracht van de herstelmechanismen. P53 kan apoptose bewerkstelligen via de caspasepathway die de mitochondriale functie vermindert. Een mutatie in het TP53-gen wordt aanzien als een cruciale mutatie die de ziekte (de kanker) van non-invasief naar invasief laat overslaan (8,40). 11 1.4 Metabolomics Metabolieten zijn de eindproducten van alle regulatoire celprocessen. Door deze metabolieten te monitoren, kunnen ze zo informatie prijsgeven over de celrespons bij veranderende genetische en omgevingsomstandigheden. De tak van de wetenschap die onder andere naar dit soort verbanden op zoek gaat noemt men metabolomics (41). Metabolomics en DNA-adductomics worden meer en meer gebruikt om antwoord te bieden op onderzoeksvragen aangaande de relatie tussen ziekte en bepaalde voedingsgewoonten. Deze complexe relatie wordt meestal onderzocht via bevragingen naar voedingsgewoonten en de aanwezigheid van een zekere aandoening (41,42). Bij deze aanpak kunnen de resultaten echter makkelijk beïnvloed worden door verkeerde herinneringen of vergetelheid van de proefpersonen (= ‘bias’). Deze bias zal zo dus ook een grote onzekerheid op de resultaten met zich meebrengen. Met metabolomics kan dit probleem voor een groot deel verholpen worden. Bij de metabolomics-aanpak wordt namelijk de uitkomst van een proces geanalyseerd waarbij, in het geval van voeding en ziekte, rekening wordt gehouden met het daadwerkelijk ingenomen voedsel. Met behulp van deze aanpak wordt ook rekening gehouden met de aanwezigheid van bestanddelen die niet van nature aanwezig zijn in ons voedsel. Voorbeelden hiervan zijn pesticiden of producten gevormd bij het bereiden van voedsel die dus niet in het voedsel als dusdanig aanwezig zijn, maar erin terechtgekomen zijn door menselijke manipulatie van de voedselwaren. Met metabolomics kan er dus dieper ingegaan worden op de onderliggende mechanismen die een bepaald dieet linken aan een welbepaalde ziekte (42). Bij metabolomics zal men zich richten tot de metabolieten die in het lichaam worden geproduceerd. Deze metabolieten worden meestal bestudeerd in relatie tot voedingsgewoonten. Zo kan men nagaan wat de exacte invloed is van de inname van een bepaald voedingsmiddel op ons lichaam, wat in de praktijk onderzocht wordt aan de hand van de aangemaakte metabolieten die terug te vinden zijn in de lichaamsvloeistoffen of secreten van personen. In de beste omstandigheden kunnen de teruggevonden metabolieten gelinkt worden aan een bepaalde pathway in het lichaam om zo de link tussen een zeker voedingspatroon en een ziekte of een bepaald afwijkende fysiologisch proces verder te ontrafelen (43). Bij metabolomics kan men op zoek gaan naar gekende metabolieten waarvan men weet dat ze aanwezig zouden moeten zijn bij een bepaalde aandoening of opgelegd dieet. Dit heet dan ‘targeted’ metabolomics omdat men weet wat men zoekt (44). ‘Untargeted’ 12 metabolomics wordt eerder gebruikt als men niets wil uitsluiten en dus zo veel mogelijk betrokken metabolieten wil terugvinden (45). Er is meer en meer interesse in metabolomics als een screeningstool voor verschillende ziekten, en dan voornamelijk ziekten van het gastro-intestinaal stelsel. Men is daarbij op zoek naar relevante surrogaatbiomerkers voor bijvoorbeeld CRC of voor bepaalde chronische ziekten zoals de ziekte van Crohn (41,46,47). 1.5 Vloeistofchromatografie en massaspectrometrie Bij het onderzoek naar metabolieten kan er gebruik gemaakt worden van verschillende technieken waaronder nucleaire magnetische resonantie en massa spectrometrie. De methodiek die gebruikt zal worden in deze masterpreof is de koppeling van UHPLC en MS. UHPLC staat voor ‘Ultra High Performance Liquid Chromatography’. Bij vloeistofchromatografie bestaat het toestel meestal uit een vloeistofpomp, een autosampler, een chromatografische kolom en een detector. De chromatografische kolom realiseert de chromatografische scheiding van componenten. De vaste fase van de kolom kan verschillen naargelang de te scheiden componenten. Zo heb je ‘normal phase’ (NP) chromatografie, waarbij de kolom bezet is met polaire groepen en het eluens (vloeibare fase) apolair is. Het tegenovergestelde kan ook, dit heet dan ‘reversed phase’ (RP) chromatografie. Hierbij is de kolom geladen met apolaire groepen, meestal koolstofketens, en is het eluens polair. De NP wordt gebruikt om apolaire stoffen te scheiden en de RP om polaire stoffen te scheiden. Er bestaan nog veel andere soorten kolommen, maar deze zijn hier minder van belang (48). Bij ‘Ultra High Performance LC’ zijn de deeltjes waarop de vaste fase is gebonden kleiner dan bij de gewone vloeistofchromatografie. Dit zal enerzijds zorgen voor een groter contactoppervlak waardoor een betere en snellere scheiding mogelijk is. Anderzijds ontstaat er een grotere tegendruk wanneer het eluens over de kolom wordt gestuurd (49). Vandaar wordt bij UHPLC dan ook een sterkere pomp, die hogere tegendrukken aankan, aangesloten dan bij de gewone vloeistofchromatografie. Het eluens kan qua samenstelling constant worden gehouden (isocratisch) of kan gradueel verschillen qua samenstelling. Indien dit laatste gewenst is, is tevens een mengkamer voorzien die de verschillende vloeibare fasen kan mengen om zo tot de gewenste verhoudingen van het eluens te komen. De detector dient om de tijd waarop een component van de kolom elueert waar te nemen, zodat men de component in kwestie kan gaan karakteriseren (48). In het kader van dit onderzoek zal de uiteindelijke karakterisatie gebeuren met behulp van een massaspectrometer (48). 13 In de massaspectrometer zullen de reeds gescheiden componenten van het (on)bekende staal worden onderzocht in functie van hun massa over lading verhouding (m/z). Massaspectrometrie is een techniek waarbij moleculen met een gelijkaardige massa toch te onderscheiden zijn door de hoge gevoeligheid van de analysator. Deze hoge resolutie is in het veld van de metabolomics zeker gewenst aangezien we zoveel mogelijk informatie willen verzamelen over zo veel mogelijk verschillende metabolieten. Bij de massaspectrometer zijn volgende componenten zeker aanwezig: een ionisatiebron, een lenzensysteem om de ionen te focussen en in de juiste baan te leiden, en een analysator. Er bestaan verscheidene ionisatiebronnen die elk voor een ander soort staal of te analyseren component beter geschikt zijn. Afhankelijk van wat men wil analyseren, kan men dus een andere ionisatiebron gebruiken. Ook de analysator kan verschillende vormen aannemen, en ook hier is de keuze afhankelijk van het doel van de analyse (48). Voor het luik van de metabolomics zal gebruik gemaakt worden van de Exactive™ (figuur 1.8) waar HESI-II ionisatiebron aan gekoppeld is. HESI staat voor ‘Heated ElectroSpray Ionisation’. Bij het gebruik van HESI zal het staal (dat uit de UHPLC-kolom komt) worden verneveld in een verwarmde kamer. Het kegelvormig onderdeel waaruit de vloeistof komt, staat onder een elektrische spanning waardoor er een redoxreactie plaatsvindt en de componenten geïoniseerd raken. Eens de vloeistof als druppelvorm in een nevel aanwezig is, zal het eluens verdampen door de verhoogde temperatuur en zullen de ladingen binnenin de druppel dichter bij elkaar komen te liggen, waarbij ze elkaar zullen gaan afstoten. Bij voldoende afstoting spat wat overblijft van de druppel uiteen in geïoniseerde moleculen die dan verder via een lenzensysteem richting de analysator worden geleid (figuur 1.7) (50). Figuur 1.7 Schematische voorstelling van ESI/HESI Bron: (50) 14 In de Exactive™ wordt gebruik gemaakt van de “orbitrap”-technologie. Net voor de orbitrap zit een C-trap die ervoor zorgt dat de ionen hun kinetische energie verliezen door de botsing met stikstofatomen. De ionen worden vanuit deze C-trap in pakketjes doorgestuurd naar de orbitrap onder invloed van spanningsimpulsen. Ionen met dezelfde m/z waarde zullen dus samen bij de orbitrap aankomen. De orbitrap zal deze pakketjes laten circuleren tussen een centrale spilelektrode en een buitenste elektrode. Door de cirkelvormige en harmonische oscillatiebeweging die de ionen afleggen rond de spilelektrode zal een stroom opgewekt worden en op basis hiervan kan de m/z verhouding worden bepaald. Deze opgewekte stroom resulteert in een massaspectrum (na implementatie van de gegevens via een fourier transformatie) (51). Voor het DNA-adductomics luik wordt een Q-Exactive™ (Fig. 1.9) massaspectrometer gebruikt. In deze MS is een quadrupool geplaatst tussen het lenzensysteem en de C-trap. Door deze aanpassing kan je al op voorhand de gewenste m/z verhouding bepalen die doorgelaten mag worden naar de C- en orbitrap, waardoor men selectiever op zoek gaat naar de gewenste m/z waarden (48). Figuur 1.8: Schematische voorstelling Exactive™ opbouw Bron: (52) Figuur 1.9: Schematische voorstelling Q-Exactive™ opbouw Bron: (53) 15 2. Objectieven Bij het onderzoek naar de invloed van de consumptie en vertering van rood vlees in de darm op het ontstaan en de evolutie van colorectale kanker, wordt gewerkt in verschillende onderzoeksdomeinen die relatief recent in het leven geroepen werden. In deze masterproef werd vooropgesteld om 2 methodes te optimaliseren die in 2 verschillende wetenschappelijke domeinen hun toepassing vinden, namelijk deze van de DNA-adductomics en de metabolomics. De geoptimaliseerde methodes kunnen dan gebruikt worden als tool bij het onderzoek naar het carcinogene effect van rood vlees. Voor het metabolomicsdomein was het de bedoeling om een geoptimaliseerd protocol te verkrijgen dat toeliet om de metabolieten uit HT29-cellen zo goed mogelijk te extraheren om ze vervolgens te kunnen bestuderen in welbepaalde cellijntesten in het kader van onderzoek naar het effect van de consumptie van rood vlees. Voor de optimalisatie van het metabolomicsluik dienden referentiemetabolieten geselecteerd te worden om zo verschillende parameters van het protocol te testen. Hierbij werd Modde 5.0 aangewend om de optimalisatieopzet met statistische modellen te onderbouwen en de resultaten te analyseren. Voor het domein van de DNA-adductomics, dat handelt over de vorming van DNA-adducten door genotoxische agentia, werd gezocht naar de beste manier om DNA te extraheren uit de HT29-cellen. Om de toepasbaarheid van het protocol en de bestaande methode aan te tonen, werd eveneens een experiment uitgevoerd. In deze test werd nagegaan wat het effect was van crotonaldehyde, kaliumdiazoacetaat en malondialdehyde op de HT29-cellijn. Van voorgaande genotoxische stoffen is immers bekend dat deze DNA-adducten veroorzaken in zuiver DNA. Aan de hand van deze test werd dan ook nagegaan of er een verband kon aangetoond worden tussen de toevoeging van een stijgende concentratie van de betreffende component aan de cellen en de schade aan het DNA onder de vorm van DNAadducten om de betrouwbaarheid van deze methode in verder onderzoek te garanderen. Deze masterproef beoogde met andere woorden het optimaliseren en wetenschappelijk onderbouwen van ‘tools’ die kunnen gebruikt worden in verder onderzoek bij een metabolomics- en DNA-adductomicsbenadering van het onderzoek naar de carcinogene effecten van rood vlees in de cellijn. 16 3. Materiaal en Methoden 3.1 Onderhoud celcultuur 3.1.1. Cellen in medium Voor het uitvoeren van de experimenten werd er gebruik gemaakt van een HT29-cellijn (Sigma-Aldrich, St-Louis, USA); een humane colorectaal adenocarcinomacellijn. Om de cellen te onderhouden, werden deze op regelmatige tijdstippen gesplitst zodat deze opnieuw konden vermenigvuldigen in vers groeimedium. Dit groeimedium bestaat uit Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) High Glucose met L-Glutamine (Lonza, Bazel, Zwitserland). Uit een fles van 500 ml DMEM werd 55 ml weggenomen en werd 50 ml FBS (foetaal bovien serum) en 5 ml penicilline/streptomycine (100 U en 100 μg per ml; Lonza, Bazel, Zwitserland) toegevoegd voor gebruik. 3.1.2 Groeien en splitsen van cellen De cellen werden bewaard in een incubator bij 37 °C met 5% CO2 in de atmosfeer. Het splitsen van de cellen gebeurde door de cellen eerst te trypsineren met een 0,05% trypsineoplossing (Lonza, Bazel, Zwitserland) zodat deze loskwamen, waarna ze konden worden gecollecteerd. De cellen werden afgecentrifugeerd en in nieuw medium geresuspendeerd waarna ze in bepaalde verhoudingen terug werden uitgeplaat, rekening houdende met een HT29-celpopulatieverdubbelingstijd van ongeveer 23 uur. De cellijn werd in stand gehouden door slechts een deel ervan te gebruiken voor de proeven en het andere deel terug uit te zetten in flesjes met groeimedium. 3.1.3 Tellen en heroplossen van cellen Voor de verschillende experimenten was telkens een zeker aantal cellen vereist. Het aantal cellen aanwezig in een groeiflesje (T25, zie verder Fig. 3.4) moest daarom steeds geteld worden om vervolgens te verdunnen naar het gewenste aantal cellen per ml. De beoordeling van confluentie van de cellen in de groeiflesjes onder de microscoop gaf ook al een relatieve indicatie weer van de hoeveelheid aanwezige cellen. Om de levende cellen te tellen, werden deze eerst losgeweekt met 0,05% trypsine-oplossing om nadien te centrifugeren tot een celpellet, net zoals bij het splitsen. Voorafgaand aan de centrifugatie werd het aantal cellen per ml bepaald met behulp van een telkamer volgens Bürker. Voor deze telling werd 20 μl van de celsuspensie en 20 μl 0,4% 17 trypaanblauwoplossing (Invitrogen, Paisley, UK) samengevoegd. De suspensie werd vervolgens onder het dekglaasje van de Bürker telkamer aangezogen. Het trypaanblauw zorgt er voor dat er onderscheid mogelijk is tussen de te tellen levende cellen en de niet te tellen dode, blauwe cellen. Er worden steeds 5 vierkanten geteld per kamer en volgende formule werd aangewend bij het berekenen van het aantal cellen/ml. 𝐴𝑎𝑛𝑡𝑎𝑙 𝑐𝑒𝑙𝑙𝑒𝑛/𝑚𝐿 = 𝑔𝑒𝑚𝑖𝑑𝑑𝑒𝑙𝑑𝑒 10 𝑔𝑟𝑜𝑡𝑒 𝑉𝐾 𝑥 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑡𝑖𝑒𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑥 10^4 Met dilutiefactor = 2 VK = een vierkant met volume = 0,1mm3 = 0,0001mL Figuur 3.1 Links op de afbeelding zie je de bürker telkamer in zijn geheel en in het midden een opname zoals de telkamer te zien is onder de microscoop. Met een vierkant uit de formule wordt een kleiner vierkant uit het dun omlijnde grote vierkant bedoeld. Het resultaat, na implementatie in de formule, is het aantal cellen per ml van de oorspronkelijke celsuspensie. Na telling van de cellen werden de celsuspensies gedurende 5 min gecentrifugeerd bij 1000 rpm zodat een celpellet werd bekomen. Deze celpellet werd in een op voorhand bepaalde hoeveelheid groeimedium terug opgelost, afhankelijk van de gewenste concentratie cellen per ml. Deze celsuspensie werd vervolgens uitgezet in wells. Voor een 6-well plaat was dit 2 ml en voor een 12-well plaat was dit slechts 1 ml, aangezien deze verschillende multiwellplaten verschillen qua grondoppervlak per well (zoals te zien is in fig 3.2). De hoeveelheid medium per well diende, met een verdubbeling van het aantal wells per plaat, steeds gehalveerd te worden. 18 Figuur 3.2 Foto van een 6-well, 12-well, 24-well, 48-well en 96-well plaat. 3.2 Optimalisatie extractie metabolieten HT29-cellen 3.2.1 Aanmaak interne standaard Als interne standaard (ISTD) werd gekozen voor d8-D-valine die werd aangemaakt vanuit de poedervorm (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA). Van dit poeder werd een stockoplossing gemaakt van 10 mg/ml in ultrapuur water (UP water) (Millipore, Brussel, België). De stockoplossing werd verder verdund tot een werkoplossing met een concentratie van 25 ng/μl. 3.2.2 Proefextractie voor de keuze van de referentiemetabolieten Om te kunnen monitoren hoe verschillende extractiemethoden zich ten opzichte van elkaar verhouden, is het nodig om bepaalde referentiemetabolieten te selecteren. Een bruikbare lijst met hoofdzakelijk polaire metabolieten was reeds in het labo aanwezig. HT29-cellen werden opgekweekt tot goede confluentie in een 6-wellsplaat, waarna de intracellulaire metabolieten door middel van een eerste protocol werden geëxtraheerd. Het protocol wordt hieronder besproken en is gebaseerd op een reeds bestaand protocol (54). Als eerste stap werd het medium van de cellen afgenomen waarna deze werden gewassen met ijskoud 0,9% NaCl in UP water om het celmetabolisme stil te leggen (=quenchen). Vervolgens werden de cellen behandeld met 400 µl van het polair solvent methanol bij 20°C. De wells werden hierna dadelijk op ijs gezet en er werd eenzelfde hoeveelheid water aan toegevoegd. Tevens werd hierbij 16 μl ISTD toegevoegd aan de wells. In een volgende stap werd gebruik gemaakt van een celschraper om de cellen los te schrapen in de wells. Hierna kon het celextract volledig worden overgebracht naar epjes waarin zich 400 μl chloroform bij -20°C bevond. Nadien werden de epjes twee maal 10 sec. gesonificeerd met 19 de Soniprep 150 (Beun- de Ronde, LA Abcoude, Nederland) om een goede lyse van de cellen te bewerkstelligen. Deze stap werd gevolgd door een centrifugatiestap van 5 min aan 16200 g bij 4°C. Door de centrifugatie vormden er zich 3 fasen in het epje, namelijk een polaire, apolaire en interfase zoals in figuur 3.3 te zien is. Nadien werd van de bovenste polaire fase 300 μl afgenomen en overgebracht in een nieuw epje. Er werd gekozen om niet de volledige polaire fase af te nemen om zo het risico dat er ook interfase werd meegenomen te verkleinen. De interfase bevat voornamelijk proteïnen en nucleïnezuren. Na de extractie werd de polaire fase aangelengd met een hoeveelheid UP water gelijk aan deze van het polair solvent, reeds aanwezig in het epje. Dit had als doel om het polaire solvent te laten verdampen totdat de vloeistof in het epje terug zijn oorspronkelijke volume had bereikt, maar waarbij er dus enkel UP water overblijft. Het verdampen gebeurde onder een constante stikstofstroom (Turbovap LV, Caliper Life Sciences, Mountain View, USA) die over de epjes werd gestuurd. De verkregen fase met voornamelijk polaire metabolieten werd vervolgens geanalyseerd met behulp van UHPLC-HRMS. Na evaluatie van de ruwe data met behulp van Xcalibur 2.0 (Thermo Scientific, San José CA, USA) werden uiteindelijk de geschikte referentiemetabolieten geselecteerd (zie 3.2.5). Figuur 3.3 Foto van een epje met de bovenstaande polaire fase, de onderste apolaire fase en in het midden de dunne interfase. 3.2.3 Optimalisatie van de extractie in Modde 5.0 Modde 5.0 (Umetrics, San Jose CA, USA) is een programma dat helpt bij het opstellen van proefopstellingen om op een statistisch verantwoorde manier de mogelijke invloed van kwalitatieve en kwantitatieve factoren op de resultaten van een welbepaald extractieproces te beoordelen. Hierbij dienen de verschillende factoren samen met de verschillende mogelijkheden te worden ingegeven in het programma. Het programma stelt vervolgens een lijst op met de verschillende stappen die gevolgd moeten worden. Deze lijst werd 20 opgesteld op basis van het D-optimal statistisch model voor interacties. Zo kon Modde 5.0 met behulp van de piekoppervlakteverhouding van de gevonden referentiemetabolieten de efficiëntie van de verschillende factoren in het vooropgestelde protocol vergelijken. Er werd als basisprotocol gekozen voor het protocol dat reeds werd gebruikt in de proefopzet voor de bepaling van de referentiemetabolieten (zie 3.2.2). Volgende parameters werden gewijzigd (tabel 3.1): Tabel 3.1: Extractieparameters en de mogelijke instellingen Parameter Polair solvent Hoe drogen Verhouding van polair solvent:water: chloroform Mogelijkheden ethanol, methanol, acetonitrile Volledig droog, aanlengen met water en drogen tot beginvolume 1:1:1, 7:2:1 Er werden door Modde 5.0 ook 3 centrale punten in de lijst opgenomen. Deze punten dienden om na te gaan in welke mate 3 gelijk behandelde stalen een gelijkaardig, en met andere woorden herhaalbaar, resultaat opleverden. Modde 5.0 had vervolgens op basis van deze mogelijkheden een proefopzet opgesteld met daarbij ook de volgorde waarin de stalen moesten geanalyseerd worden via UHPLC-HRMS. 3.2.4 Verdere optimalisatie van de extractie in Modde 5.0 Eens de eerste optimalisatie van de parameters afgerond was, konden sommige parameters nog verder gefinetuned worden. Dit kon met behulp van een ander statistisch model, het ‘response surfacing’ model of RSM, dat ook via Modde 5.0 werd gegenereerd. Hierbij konden we voor de kwantitatieve parameters het optimum voor de instellingen bepalen binnen de geteste range. Aan de hand van de eerste optimalisatie was duidelijk geworden welke parameters verder kwantitatief konden geoptimaliseerd worden. De gebruikte parameters en mogelijkheden zijn terug te vinden in tabel 3.2. Het basisprotocol is nog steeds hetzelfde als initieel, maar dit keer rekening houdende met de beste resultaten die voortkwamen uit het eerste optimalisatie-experiment. Na deze laatste optimalisatie bekwamen we een gefinaliseerd extractieprotocol dat voor de geteste parameters en in het geteste bereik het beste resultaat leverde wat betreft de metabolietextractie. Tabel 3.2: Extractieparameters voor verdere optimalisatie Parameter Verhouding methanol:ultra puur water Hoeveelheid heroplosmiddel Mogelijke waarden 3:1, 2:1, 1:1, 1:2 125, 250, 500, 750, 1000 21 3.2.5 UHPLC-HRMS, dataverwerking en data-analyse 3.2.5.1 UHPLC-HRMS Voor de UHPLC-HRMS analyse werd gebruik gemaakt van de Exactive™ Benchtop Orbitrap HRMS (Thermo Scientific, San José CA, USA). Als kolom werd gekozen voor de Acquity Waters HSS T3 kolom (150mm*2,1mm, 1,8 μm), daar deze in het labo reeds gebruikt werd voor analyse van metabolieten. Als solventen werden acetonitrile en water gebruikt, beide aangezuurd met 0,1% mierenzuur. Het Accela-HPLC pompsysteem (Thermo Scientific, San José CA, USA) werd aangewend om de solventen in de juiste verhoudingen over de kolom te sturen. Het gradiëntprogramma is terug te vinden in tabel 3.3. Van 0 min tot 1,5 min was er een dode tijd waarmee rekening werd gehouden in het gradiëntprogramma. Hierna startte de elutie van de metabolieten. Deze periode werd gevolgd door een herconditioneringsdeel van 4 minuten. Ook de ‘autosampler’ en kolomoven waren verwerkt in het Accelasysteem. De Accelaautosampler (Thermo Scientific, San José CA, USA) zorgde voor de injectie van 10 µl van het staal op de kolom. Alvorens de Exactive™ te kunnen gebruiken, dienen er verschillende opstartprotocols te worden gevolgd. Zo is er een evaluatie- en kalibratiestap die de juistheid van de gemeten m/z waarden moet garanderen. Ook moeten de solventen gepurgeerd worden zodat de leidingen gespoeld zijn met het juiste solvent en dient de kolom geconditioneerd te worden met de begincondities. Tabel 3.3: Gradiëntprogramma solventen voor UHPLC-HRMS Tijd (min.) 0,1% mierenzuur in H2O(%) 0,0 1,5 7,0 8,0 12 14 14,1 18 98 98 75 40 0 0 98 98 0,1% mierenzuur ACETONITRILE 2 2 25 60 100 100 2 2 in μl/min 400 400 400 400 400 400 400 400 Voor de ionisatie werd gebruik gemaakt van een HESI-II bron die afwisselend in positieve en negatieve ionisatiemodus werd gebruikt. De HESI bron werd gepositioneerd op diepte C. Verdere instellingen van de ionisatiebron waren: voltage bron: 5 kV; temperatuur bron: 350°C; scanrange tussen 50-800 m/z; temperatuur van capillair: 250°C; voltage capillair: 90 (+/-); voltage tubelens: 50 (+/-); voltage ‘skimmer’: 20 (+/-); ‘auxillary flow rate’: 25 arbitraire 22 eenheden; ‘sweep gas flow rate’: 5 arbitraire eenheden; ‘sheat gas flow rate’: 50 arbitraire eenheden; ‘heater’ temperatuur: 350°C en ‘AGC-target’: gebalanceerd. Het toegelaten verschil tussen de theoretische en gemeten massa werd vastgelegd op 10 ppm. Volgende vergelijking geeft de berekening van deze ppm-waarde weer: (𝑡ℎ𝑒𝑜𝑟𝑒𝑡𝑖𝑠𝑐ℎ𝑒 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 – 𝑔𝑒𝑚𝑒𝑡𝑒𝑛 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎)/𝑡ℎ𝑒𝑜𝑟𝑒𝑡𝑖𝑠𝑐ℎ𝑒 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 ∗ 10! = 𝑥 𝑝𝑝𝑚. Bij de batch van stalen die geanalyseerd werd, werd ook steeds een standaardmengsel van metabolieten geanalyseerd, en dit zowel in het begin als op het einde van de analyse. Dit mengsel stelde ons in staat om de stabiliteit van de retentietijden van de (gekozen standaard)metabolieten gedurende de UHPLC-HRMS-analyse te monitoren. Het standaardmengsel werd reeds aangemaakt in voorgaand onderzoek (55) en bestond uit 115 componenten met onder meer 19 aminozuren, 10 monocarboxylzuren, 21 fenolen/hydroxylzuren, 11 multicarboxylzuren, 7 amines, 7 koolhydraten, 5 polyolen, 4 korte keten vetzuren, 1 anorganisch zuur, 6 galzouten en 8 andere N-componenten. Ook de interne standaard, zijnde d8-D-valine werd aan dit mengsel toegevoegd. Deze interne standaard werd echter niet gebruikt om kwalitatieve vergelijkingen mogelijk te maken maar om de efficiëntie van het extractieprotocol tussen de verschillende stalen te kunnen evalueren. Van alle stalen werd steeds een vaste hoeveelheid gecollecteerd om samen te ‘poolen’. Deze ‘pool’ diende als interne en externe kwaliteitscontrole (QC-stalen = ‘quality control’ stalen). Deze QC’s werden in het begin en na elke 10 stalen in duplo geanalyseerd. Aan de hand van de QC’s kan dan de gevonden piekoppervlakte van een staal voor een metaboliet worden genormaliseerd via de oppervlakte van dezelfde metaboliet uit het daaropvolgende QC-staal (het gemiddelde van deze 2 QC-stalen). Zo werd er gecorrigeerd voor eventuele schommelingen in de gevoeligheid van de Exactive gedurende de analyse van meerdere stalen. 3.2.5.2 Dataverwerking en data-analyse Nadat de UHPLC-HRMS analyse was uitgevoerd, kon er overgegaan worden tot de analyse van de resultaten via Xcalibur 2.0. In de eerste proefopzet werd gezocht naar metabolieten die het meest abundant voorkwamen in alle stalen en daarnaast ook een mooie piekvorm vertoonden met gelijkaardige piekoppervlakten. Er werden tevens referentiemetabolieten gekozen uit zo veel mogelijk verschillende klassen metabolieten. Dit had als doel zo veel 23 mogelijk componenten te vertegenwoordigen die mogelijks aanwezig kunnen zijn in de cellen. De gekozen metabolieten werden gebruikt als referentiemetabolieten voor de optimalisering van het extractieproces op de HT29-cellen. Via de Quan Browser in Xcalibur werden de verkregen pieken van de referentiemetabolieten gecontroleerd op een goede integratie. Waar nodig, kon de integratie dan manueel aangepast worden. De verkregen piekoppervlakten werden na integratie geëxporteerd naar Modde 5.0, waar deze als resultaat geïmplementeerd werden in de proefopzet, dit na normalisatie van de waarden via Xcalibur 2.0. De normalisatie gebeurde aan de hand van de QC-stalen. De bekomen piekoppervlakte van een bepaalde component in elk staal werd gedeeld door de gemiddelde piekoppervlakte van dezelfde component in de daaropvolgende 2 QC-stalen, dit gebeurde in Excel. In Modde 5.0 werd met deze relatieve waarden verder gewerkt voor de analyse. Via Modde 5.0 werd voor de verschillende referentiemetabolieten nagegaan welke parameters een duidelijke positieve of negatieve invloed hadden op de extractie van de metabolieten. Zo kon uiteindelijk een globaal besluit genomen worden over de toe te passen stappen in het extractieprotocol. 3.3 DNA en DNA-adducten 3.3.1 Extractie van DNA uit HT29-cellen Voor de extractie van DNA uit de HT29-cellen werd eerst gezocht naar de meest geschikte DNA-extractiekit. Hierbij werden 2 kits getest, de DNeasy Blood & Tissue kit van Qiagen (Qiagen GmbH, 40724 Hilden, Duitsland) en de NucleoSpin Tissue kit van Macherey-Nagel (Macherey-Nagel GmbH & Co., 52355 Düren, Duitsland). We kozen voor 2 volledig verschillende kits aangezien deze andere producten bevatten die verschillend kunnen interageren met het medium waarin de cellen werden aangeleverd. Met de beste kit werd dan verder gewerkt bij de volgende DNA-extracties. De DNA-extracties werden uitgevoerd zoals beschreven in het protocol van de fabrikant dat bij de kits werd meegeleverd (zie bijlage 1 voor NucleoSpin kit). Om te controleren hoeveel DNA er telkens werd geëxtraheerd, werd er gebruik gemaakt van een spectrofotometer (NanoDrop ND1000, Isogen Life Science, De Meern, Nederland). 3.3.2 Aanmaken van werkoplossingen Gedeutereerd methyldeoxyguanosine (O6-d3-MedG) en methyldeoxyguanosine (O6-MedG) werden aangekocht bij Sigma-Aldrich (St. Louis, USA). Pyrimidol[1,2-a]purin-10(1H)-one 24 (M1dG), α-methyl-γ-hydroxy-1,N2-propanodeoxyguanosine (CrodG), een isotoop van αmethyl-γ-hydroxy-1,N2-propanoguanosine (CrodG-13C,15N2) en een isotoop van pyrimidol[1,2-a]purin-10(1H)-one (M1dG-13C3) werden gekocht bij Toronto Research Chemicals (Toronto, Canada). O6-carboxymethylguanosine (O6-CMdG) werd verkregen via Prof. S. Moore (John Moores University, Liverpool, UK). Deze deoxyguanosines (nucleotiden) werden omgezet in guanines (nucleobasen) door deze op te lossen in 0,1 M mierenzuur (FA) en gedurende 30 min te verwarmen bij 80 °C (56). Om werkoplossingen aan te maken werden de guanines verder aangelengd met methanol tot 500 ng/μl en 5 ng/μl, waarna deze oplossingen bij -20°C werden gestockeerd. 3.3.3 Aanmaken interne standaard Om te kunnen werken met relatieve piekoppervlakten, die zo corrigeren voor eventuele onnauwkeurigheden tijdens extractie en analyse, werd er steeds een interne standaard (ISTD) toegevoegd aan de DNA-stalen voor de aanvang van het DNA-adductextractieproces. Ook kon de retentietijd van de interne standaard gebruikt worden als referentie indien er tijdens de analyse van een staal een verschuiving plaatsvond in de verwachtte retentietijd. Deze ISTD bestond uit d3-MeG, M1G-13C3 en CroG-13C,15N2. Het gedeutereerde methylguanine had een concentratie van 20 ng/μl in de ISTD-oplossing en de 2 andere componenten hadden een concentratie van 2 ng/μl. 3.3.4 DNA-adductextractie Na de extractie van DNA uit de cellijnstalen, werd het verkregen DNA-staal verder bewerkt om de DNA-adducten te extraheren. Het gebruikte protocol was gebaseerd op een reeds beschreven en gevalideerd protocol (56). Bij de aanvang van de extractie werden de eerder verkregen DNA-stalen overgebracht naar glazen proefbuizen, waarna 50 μl interne standaard toegevoegd werd (zie 3.2.3) samen met 2 ml van 0,1M FA in UP water. Na vortexen, werden de proefbuizen in een ‘heater block’ op 80 °C gezet gedurende exact 30 min. Hierdoor onderging het DNA hydrolyse en werden de nucleotiden omgezet in hun respectievelijke nucleobasen. Na 30 min werden de glazen proefbuizen afgekoeld in ijswater om het hydrolyseproces te stoppen. Hierna kon de vaste fase extractie (SPE) van start gaan, waarvoor gebruik gemaakt werd van Oasis HLB 1cc/30 mg kolommen (Waters, Asse, België). Deze SPE-kolommen werden eerst geconditioneerd met 2 ml methanol, gevolgd door een equilibratiestap met 2 ml water. Vervolgens werden de stalen integraal vanuit de glazen buizen overgebracht op de SPE-kolommen met behulp van een pasteurpipet, waarna de 25 kolommen droog getrokken werden. Als volgende stap werden nieuwe falconbuizen onder de kolommen gezet en werden de DNA-adducten geëlueerd met 2 ml methanol. Het eluens dat werd opgevangen in de falconbuizen werd daarna drooggedampt met behulp van een vacuümevaporator (Speed Vac Plus Savant, Thermo Scientific, San José CA, USA) gedurende 110 min. Het heroplossen van de stalen gebeurde in 100 μl 0,05% azijnzuur (HAc) in UP water. De DNA-adductstalen werden gevortext en de oplossing werd overgebracht in HPLCvials, klaar voor analyse. Als de analyse niet onmiddellijk kon plaatsvinden, werden de DNAadductstalen in tussentijd bewaard bij -20°C . 3.3.5 Opstellen ijklijn Om de adducten kwantitatief te kunnen bepalen, werd een ijklijn aangemaakt waarbij de ijklijnstalen hetzelfde DNA-adductextractieprotocol ondergingen als de te analyseren stalen. Hiervoor werd er een ijklijnoplossing aangemaakt met volgende standaarden: O6MeG, O6-CMG, M1G en CroG. De matrix waarin de ijklijn werd opgesteld, bestond uit 100 μl van 1 mg/ml kalfthymus DNA (CT-DNA) waaraan eveneens 50 μl ISTD werd toegevoegd. Afhankelijk van de gewenste concentratie werd ook een zekere hoeveelheid van de op voorhand aangemaakte ijklijnoplossing met O6-MeG, O6-CMG, M1G en CroG toegevoegd, waarna dit alles werd aangelengd tot 500 μl met UP water. De volgende concentraties werden op die manier aangemaakt; 0 ng/ml; 0,05 ng/ml; 0,1 ng/ml; 0,2 ng/ml; 0,4 ng/ml; 0,6 ng/ml; 0,8 ng/ml en 1,0 ng/ml. De aanwezigheid van DNA-adducten in de ijklijnmatrix werd gecorrigeerd aan de hand van de DNA-adductconcentraties in het blanco staal (=ijklijnstaal waar geen enkel DNA-adduct was aan toegevoegd door middel van de ijklijnoplossing en die dus enkel DNA-adducten eigen aan het CT-DNA bevat), en dit door de bekomen piekoppervlakteverhouding van de andere ijklijnstalen te verminderen met deze van de blanco voor elk ‘targeted’ DNA-adduct. Na UHPLC-HRMS-analyse werd de ratio van het gedetecteerd DNA-adduct t.o.v. de interne standaard bepaald en werd een ijklijn uitgezet met deze gedetecteerde oppervlakteratio op de y-as en de gekende toegevoegde DNAadductconcentratie op de x-as. 3.3.6 Genotoxiciteitstest/positieve controle DNA-adducten Voor het testen van de mogelijkheid tot het toepassen van de recent ontwikkelde DNAadductmethode (56) op de HT29-cellen, werd een toxiciteitstest opgestart. Op deze manier werd de mogelijkheid tot de analyse van de aanwezige DNA-adducten in de HT29-cellen via de DNA-adductmethode gegarandeerd. De genotoxiciteitstest werd uitgevoerd met behulp 26 van de genotoxische stoffen kaliumdiazoacetaat (KDA), malondialdehyde (MDA) en crotonaldehyde (CRO). KDA werd verkregen door alkalische hydrolyse van ethyldiazoacetaat (EtDA, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA). Na verdere verdunning met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), werd een werkoplossing van 20 mM KDA verkregen (57). Crotonaldehyde werd aangekocht bij Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) en eveneens aangelengd met PBS tot een stockoplossing van 20mM. De werkoplossingen werden bewaard bij -80°C in donkere glazen flesjes. Voor de aanmaak van MDA werd vertrokken van de precursormolecule 1,1,3,3tetramethoxypropaan (Sigma-Aldrich, St/ Louis, USA). De precursormolecule werd opgelost in UP water dat met HCl werd aangezuurd tot pH 2. De oplossing werd gedurende 1 uur in een warmwaterbad van 45 °C geplaatst zodat MDA gevormd kon worden. Werkoplossingen van MDA (20 mM) werden steeds vers aangemaakt vlak voor elk nieuw experiment. Voor de toxiciteitstest op de HT29-cellen werd de hierna beschreven proefopstelling uitgevoerd met T25-celcultuurflesjes (zie fig. 3.4). Voor KDA werd gekozen om de cellen te behandelen met 1 mM, 2,5 mM en 5 mM; voor MDA was dit 0,2 mM, 0,5 mM en 1mM en voor CRO werden volgende concentraties verkozen: 0,1 mM, 0,25 mM en 0,5 mM. Alles werd in drievoud uitgevoerd. Ook werd er een blanco aangemaakt in drievoud; deze cellen werden niet behandeld met een toxische stof maar volgden wel alle andere stappen van het protocol. In een T25-fles werd 6 ml medium toegevoegd aan de cellen die een confluentie van 80-90% hadden. De toxische stoffen waren reeds in het medium verdund volgens bovenstaande concentraties alvorens ze werden toegediend aan de cellen. De cellen werden vervolgens gedurende 24 uur blootgesteld aan de toxische stoffen, waarna de cellen losgemaakt werden met een celschraper. De cellen werden daarna samen met het medium overgebracht in falconbuizen en afgecentrifugeerd. De vloeibare fase werd verwijderd en aan de celpellet werd 2 ml PBS toegevoegd. Deze celsuspensie werd bij -80°C bewaard tot de verdere DNA- en DNA-adductextractie zoals hierboven reeds werd beschreven (58). Figuur 3.4 Afbeelding van een T25-celcultuurflesje dat een grondoppervlak van 25 cm 2 heeft. 27 3.3.7 DNA-adductanalyse via UHPLC-HRMS De DNA-adducten in de stalen werden geanalyseerd d.m.v. de Q-Exactive™. De Q-Exactive™ kan zowel in targeted MS/MS als in full MS-modus scannen, afhankelijk van de gewenste toepassing. Bij de targeted MS/MS benadering werd gezocht naar de 4 gekende DNAadducten die voor ons van belang waren: O6-MeG, O6-CMG, M1G en CroG. Bij de full MS-scan werden alle mogelijke geïoniseerde componenten in het staal gedetecteerd. Het pompsysteem, de ‘autosampler’ en de kolomoven die bij de Q-Exactive werden gebruikt, behoren tot de Ultimate 3000-serie (Thermo Scientific, San José CA, USA). De gebruikte softwareprogramma’s voor het besturen van de UHPLC-HRMS(/MS) zijn Chromeleon Xpress (Thermos Scientific, San José CA, USA) en Xcalibur 3.0 (Thermo Scientific, San José CA, USA). Ook hier werd als ionisatiebron gebruik gemaakt van de HESI-II. De instellingen die werden gehanteerd zijn terug te vinden in tabel 3.4. Bij MS/MS werd er per component een andere ‘normalized collision energy’ en resolutie gehanteerd. Zo was de NCE voor O6CMG en CroG gelijk aan 40%, terwijl dit voor O6-MeG en M1G gelijk was aan 60%. De resolutie was 17500 bij full width half maximum (FWHM) voor O6-CMG en 70000 (FWHM) voor de drie andere componenten. Alvorens de Q-Exactive te kunnen gebruiken, dienen er verschillende opstartprotocols te worden gevolgd. Zo is er een evaluatie- en kalibratiestap die de juistheid van de gemeten m/z waarden moet garanderen. Ook moeten de solventen gepurgeerd worden zodat de leidingen gespoeld zijn met het juiste solvent en dient de kolom geconditioneerd te worden met de begincondities. Het gradiëntprogramma voor de gebruikte solventen, nl. 0,05% azijnzuur en methanol, is in tabel 3.5 weergegeven. In het gradïentprogramma was rekening gehouden met het feit dat er een dode tijd is van iets minder dan een minuut. Na deze minuut werd het aandeel van de methanol steeds groter om de DNA-adducten van de kolom te elueren. Na elutie van de DNA-adducten, werd de kolom steeds 2 minuten geherconditioneerd met een verhouding van 95% azijnzuur en 5% methanol. 3.3.8 Data-interpretatie DNA-adductanalyse Q-Exactive™ Net zoals bij de metabolieten voor de Exactive, moesten ook hier de verkregen chromatogrammen voor de DNA-adducten van de Q-Exactive™ worden gecontroleerd op een goede integratie via de Quan Browser van Xcalibur. Hierbij konden de pieken van de DNA-adductenstandaard gebruikt worden als referentiemiddel voor de retentietijd van de pieken van de targeted DNA-adducten en hun interne standaarden. Eens alle pieken correct waren geïntegreerd voor zowel de onbekende stalen als voor de ijklijnen, konden de data 28 geëxporteerd worden naar een Excel-file. Via de toegevoegde interne standaard kon dan de relatieve oppervlakte van een component berekend worden door diens piekoppervlakte te delen door de piekoppervlakte van de overeenstemmende interne standaard. Op die manier werd er gecorrigeerd voor eventuele onnauwkeurigheden tijdens de extractie en analyse. Na deze correctie via de interne standaard, konden de bekomen oppervlakteverhoudingen via de vergelijking van de ijklijn worden omgezet in de overeenstemmende concentratie. De statistiek die werd toegepast bij het vergelijken van gemiddelden was een One Way ANOVA test met SPSS 22.0. Tabel 3.4 Instellingen voor HESI-II en Q-Exactive Naam instelling Polariteit Spray Voltage (kV) Capillaire temperatuur (°C) Sheath gas (Arbitraire eenheden) Auxiliary gas (Arbitraire eenheden) Sweep gas (Arbitraire eenheden) Heather temperature (°C) S-lens RF level Bereik Full MS (Da) Bereik MS/MS (Da) Resolutie (voor full MS, FWHM) AGC Target Injectietijd (ms) Injectievolume (μl) Tabel 3.5 Tijd (min) 0 0,85 4 4,010 5 7 Waarde +/3,700 280 25 10 0 330 90 70-700 50-250 140.000 3E6 500 10 Gradiëntprogramma UHPLC-HRMS(/MS) 0,05% HAc in H 2 O (%) 95 95 50 0 95 95 Methanol (%) 5 5 50 100 5 5 Flow (μl/min) 300 300 300 300 300 300 29 4. Resultaten 4.1 Optimalisatie extractie metabolieten HT29-cellen 4.1.1 Proefextractie voor de keuze van referentiemetabolieten In de Quanbrowser van Xcalibur werden de pieken van 115 gekende metabolieten, die reeds eerder in de methode voor fecale metabolieten van het labo waren opgenomen (55), geëvalueerd. In vier HT29-geëxtraheerde stalen werden de pieken voor eenzelfde intracellulaire metaboliet bekeken en geanalyseerd op basis van aanwezigheid van de piek in elk staal, de piekvorm en de piekoppervlakte. Er werd getracht om uit verschillende klassen metabolieten (zoals aminozuren, koolhydraten, enz.) 1 of 2 componenten te selecteren die konden gebruikt worden als referentiemetaboliet. Een voorbeeld van de referenitepieken met mooie piekvorm en een goede piekoppervlakte is te zien in figuur 4.1. Figuur 4.1: Chromatogram van de 10 gekozen referentiemetabolieten en de interne standaard 30 Daarnaast waren er ook verscheidene pieken die niet goed te onderscheiden waren van de omliggende pieken of de ruis, dit was dan ook te zien aan de lage (tot zelfs 0) S/N verhouding. Een voorbeeld hiervan is te zien in figuur 4.2. Pieken met soortgelijke problemen waren dus geen goede kandidaten als keuze voor referentiemetaboliet. Figuur 4.2: Chromatogram van cytosine; de piek is niet goed te onderscheiden van de andere pieken aangezien de S/N=0. Eveneens werden de chromatografische pieken van de interne standaard d8-D-valine beoordeeld, en deze voldeden aan de eisen. Een voorbeeld van de piek voor d8-D-valine is eveneens figuur 4.1 afgebeeld. Na interpretatie van alle data kon een algemeen besluit geformuleerd worden. Er werden in de stalen echter geen goede referentiemetabolieten teruggevonden voor volgende groepen: aldehyden, monocarboxylzuren, nitrosoverbindingen, galzuren en korte keten vetzuren. De gekozen metabolieten die zouden dienen als referentiemetaboliet voor de volgende twee experimenten zijn in tabel 4.1 weergegeven. Tabel 4.1: Gekozen referentiemetabolieten opgelijst per klasse Klasse Metabolieten Aminozuren L-threonine L-proline Koolhydraten D-fructose Amines Putrescine Spermidine Hydroxylzuren Saccharinezuur Polyolen Glycerol 1,3-propaandiol N-componenten Pantotheenzuur Multicarboxylzuren Dodecaandizuur Interne standaard d8-D-Valine 31 4.1.2 Optimalisatie van de extractie in Modde 5.0 4.1.2.1 Interpretatie van de coëfficiëntenplots de In een 2 proefopzet werd voornamelijk geoptimaliseerd op de wasstap, het solventtype en de manier van drogen. Na het analyzeren van de extractiestalen werden de bekomen chromatografische pieken van de referentiemetabolieten gecontroleerd op een goede integratie via de Quan Browser. De bekomen piekoppervlakken werden dan na correctie via de QC-stalen, overgezet als resultaat in Modde 5.0. Modde 5.0 verwerkt deze resultaten vervolgens in het gekozen statistisch model, in dit geval D-Optimal. Eens de resultaten verwerkt waren, konden er per gekozen referentiemetaboliet verschillende plots worden opgevraagd. Zo heb je de coëfficïentenplot die per metaboliet weergeeft wat de invloeden van de instellingen waren. Een voorbeeld hiervan, waarin alle instellingen voor de parameters zijn opgenomen voor 1,3-propaandiol, is afgebeeld in figuur 4.3. In figuur 4.3 worden de interacties tussen de parameters niet weergegeven. Uit deze plot kon er besloten worden dat voor het drogen ‘volledig droog’ significant beter (p=0,008) was dan ‘aanlengen met water en drogen tot beginvolume’, dit is ook uit de figuur af te leiden aangezien de nulwaarde niet in de foutenbalk is opgenomen en de balk voor ‘volledig droog’ aan de positieve kant van de y-as ligt wat wijst op een positieve invloed op de extractie van de metaboliet. De andere significant betere instelling was dat een 1:1:1 verhouding voor de solventen (polair:water:chloroform) significant beter was (p=0,00413) dan de verhouding 7:2:1. Voor de andere parameters is geen significant resultaat te vinden aangezien de pwaarde groter is dan 0,05. Ook kan je dit zien doordat de nul hier wel is geïncorporeerd in de foutenbalk. Figuur 4.3 De gedeeltelijk afgebeelde coëfficiëntenplot voor 1,3 -propaandiol 32 Uit figuur 4.4, die de coëfficiëntenplot voor pantotheenzuur weergeeft, kon er besloten worden dat de solventverhouding 1:1:1 significant beter was (p<0,001) voor de extractie van pantotheenzuur in vergelijking met de 7:2:1 verhouding. Voor het solvent is te zien dat acetonitrile de extractie van pantotheenzuur significant negatief beïnvloedde (p=0,036). Figuur 4.4 De gedeeltelijk afgebeelde coëfficiëntenplot voor pantotheenzuur De volgende figuur (Fig. 4.5) geeft de coëfficiëntenplot weer voor spermidine. Hier was een significant (p<0,001) merkbaar verschil te vinden bij de keuze omtrent de verhoudingen van de solventen. Zo was de 1:1:1 verhouding significant beter dan de 7:2:1 verhouding. Een andere bijna significante positieve invloed (p=0,0555) was te vinden bij het aantal keer wassen, zo leek hier twee keer wassen beter. Figuur 4.5 De gedeeltelijk afgebeelde coëfficiëntenplot voor spermidine 33 4.1.2.2 Bespreking voor alle referentiemetabolieten Bij de groep van de aminozuren werd voor L-threonine geen significant verschil gevonden voor de verscheidene parameters (p>0,05). Wel werd er een trend waargenomen dat de solventverhouding 1:1:1 een positief effect had in tegenstelling tot de 7:2:1 verhouding. Ook was er een voordeel voor ethanol tegenover acetonitrile, echter niet significant (p>0,05). Voor L-proline werd de 1:1:1 verhouding significant beter bevonden (p=0,001) dan de 7:2:1 verhouding. Op niet-significante wijze werd gezien dat acetonitrile eerder een negatieve invloed zou kunnen hebben op de extractie van L-proline. Bij de koolhydraten werd D-fructose gekozen als referentiemetaboliet. Er werden hier geen significante verschillen waargenomen voor de verschillende instellingen. Wel kon er eventueel geconcludeerd worden dat ethanol de voorkeur zou krijgen op de andere extractiesolventen, maar dit was niet significant (p>0,05). Voor de multicarboxylzuren werd dodecaandizuur geanalyseerd. Methanol was significant beter (p= 0,003) als solvent en acetonitrile significant slechter (p= 0,002). Verder werd, voor de klasse van de amines, putrescine onder de loep genomen. Bij putrescine werd een significant verschil gevonden voor de solventverhouding (p<0,001), waarbij de 1:1:1 verhouding beter was dan de 7:2:1 verhouding. Op niet significante wijze (p>0,05) werd gezien dat NaCl eventueel beter zou kunnen zijn dan PBS als wasmedium. Daarbovenop leken methanol en ethanol onderling even goed te zijn en beide waren beter dan acetonitrile. Ook spermidine behoort tot de groep van de amines maar werd eerder reeds besproken (zie Fig. 4.5). De hydroxylzuren werden vertegenwoordigd door saccharinezuur. Significant (p=0,0171) werd er waargenomen dat acetonitrile een negatieve invloed had op de extractie van deze component. Wassen met PBS zou hier ook negatief kunnen zijn en NaCl positief. Voor de polyolen werden glycerol en 1,3-propaandiol gekozen als vertegenwoordigers. Voor glycerol werd gezien dat de 7:2:1 verhouding beter zou kunnen zijn, maar dit was niet significant (p>0,05). 1,3-propaandiol werd reeds eerder besproken (zie Fig. 4.3). Bij de andere-N-componentenfractie werd pantotheenzuur uitgekozen als referentie. Ook pantotheenzuur werd reeds hierboven besproken aan de hand van de coëfficiëntenplot (zie Fig. 4.4). Voor de interne standaard d8-D-valine werd de 1:1:1 verhouding significant beter bevonden (p<0,001). 34 4.1.2.3 Algemeen resultaat Over alle referentiemetabolieten heen werd als algemene trend waargenomen dat volledig droogdampen net iets beter zou kunnen zijn dan aanlengen en drogen tot beginvolume, hoewel er niet echt een statistisch significante voorkeur was voor één van beide wat betreft de gekozen referentiemetabolieten. Verder werd besloten dat 2 keer wassen met 0,9% NaCl, het solvent methanol of ethanol en de solventverhouding 1:1:1 (in vergelijking met de 7:2:1 verhouding) de geprefereerde instellingen zijn. Voor het drogen kan voor zowel het volledig drogen als het aanlengen en drogen tot beginvolume geopteerd worden, al is het volledig drogen praktisch gezien handiger ( in bijlage 2). 4.1.3 Verdere optimalisatie van de extractie in Modde 5.0. 4.1.3.1 Coëfficiënten- en ‘contour’plots Nadat de beste instellingen voor elk van de geoptimaliseerde parameters bekend waren door de uitvoering van een eerste optimalisatie, werd er gezocht naar kwantitatieve parameters die verder verbeterd konden worden. Zo werd gekozen om de solventverhouding van methanol en water verder kwantitatief te onderzoeken, evenals de hoeveelheid water waarin het volledig gedroogde extractiestaal terug zou worden opgelost. Na het uitvoeren van de proefopzet en de analyse via het UHPLC/HRMS-toestel werd terug overgegaan naar de controle van een goede integratie van de chromatografische pieken via de Quan Browser van Xcalibur 2.0. De piekoppervlakte werd eveneens gecorrigeerd voor de QC-stalen en deze waarden werden terug overgezet naar Modde 5.0 en gefit in het Respons Surface Modeling (RSM) statistisch model. Bij het RSM-model kan eveneens een ander soort plot gegenereerd worden, namelijk een ‘contour’-plot. Dit kon in voorgaande proefopzet niet, maar hier wel omdat er minstens 2 kwantitatieve parameters aanwezig waren. Dit soort plot geeft een driedimensionale weergave van de variabele parameters per referentiemetaboliet, hier 2. De beste instellingen voor de parameters worden met kleuren aangeduid. Zo is donkerrood te verkiezen voor het beste resultaat, de groenblauw gekleurde instellingen zijn minder geschikt. 35 4.1.3.2 Bespreking voor alle referentiemetabolieten Volgende bespreking gebeurt aan de hand van de coëfficiëntenplots en de contourplots. De mate waarin een resultaat significant is, kan niet afgeleid worden uit de contourplot maar wel uit de coëfficiëntenplot. Belangrijk om te vermelden is dat de ‘verhouding’-as op de contourplot staat voor de verhouding methanol:UP water waarbij 0,5=1:2; 1=1:1; 2=2:1 en 3=3:1. Verder staat de concentratie-as voor de hoeveelheid UP-water die na volledig drogen werd toegevoegd. Zo betekent 200 dat er 200 μl werd toegevoegd en er dus een hogere concentratie van de metabolieten aanwezig is dan wanneer er 1000 μl (1000 op as van contourplot) werd toegevoegd na het drogen. Bij de aminozuren werd enkel voor L-threonine een significant beter (p<0,001) resultaat verkregen als er in een grotere hoeveelheid UP-water werd heropgelost. Op de contourplot (Fig. 4.6) is wel te zien dat de 1:2 verhouding voor beide aminozuren een betere uitkomst zal bieden, hoewel dit niet significant (p>0,05) aangetoond kon worden. Figuur 4.6 ‘Contour’ plot voor L-proline (links) en L-threonine (rechts) De volgende klasse is deze van de koolhydraten. Voor D-fructose werd geen significant verschil opgemerkt tussen de verschillende instellingen. Volgens de contourplot (Fig. 4.7) was de 1:2 verhouding wel beter, binnen het geteste bereik. Echter ziet men ook een rodere kleur verschijnen als men richting de 3:1 verhouding gaat. Bij de multicarboxylzuren werd dodecaandizuur geanalyseerd en werd er gezien dat het heroplossen in een grotere hoeveelheid UP-water significant beter was (p=0,028). Verder is er uit de contourplot (Fig. 4.7) af te leiden dat een verhouding aanleunend bij 3:1 beter kan zijn. 36 Figuur 4.7 ‘Contour’plot voor D-fructose (links) en dodecaandizuur (rechts) Voor de amines werd gevonden dat er bij spermidine significant betere resultaten (p<0,001) bekomen werden als het staal opnieuw werd opgelost in een kleinere hoeveelheid UPwater. De verhouding speelt bij deze component geen concrete rol (Fig. 4.8). Putrescine daarentegen gaf significant betere resultaten (p<0,001) wanneer er werd heropgelost in een grotere hoeveelheid UP-water. Verder is op de contourplot te zien (Fig. 4.8) dat een verhouding van 1:2 beter blijkt. Figuur 4.8 ‘Contour’plot voor spermidine (links) en putrescine (rechts) Bij de hydroxylzuren werd de extractie van saccharinezuur beoordeeld en werd gezien dat het resultaat beter was (p<0,001) wanneer meer UP-water gebruikt werd bij het heroplossen (1000 μl was het beste). Aan de hand van de contourplot (Fig. 4.9) kon ook besloten worden dat de 1:2 verhouding beter was. Voor pantotheenzuur die de N-componenten vertegenwoordigt, was het resultaat significant beter (p=0,003) wanneer minder UP-water werd gebruikt bij het heroplossen. Uit de contourplot (Fig. 4.9) is er, wat betreft de solventenverhouding, niet veel af te leiden. 37 Figuur 4.9 ‘Contour’plot voor saccharinezuur (links) en pantotheenzuur (rechts) Tot slot resteert er voor de metabolieten nog de groep van de polyolen. Voor glycerol werd er geen significant verschil waargenomen (p>0,05). Al is uit de contourplot (Fig 4.10) wel op te maken dat een 1:2 verhouding geprefereerd kan worden. Het statistisch model voor 1,3propaandiol bracht wel een significant resultaat (p<0,001) op, namelijk dat de hoeveelheid UP-water bij het heroplossen liefst niet zo groot is. Op basis van de contourplot (Fig. 4.10) blijkt dat de 1:2 verhouding ook hier de voorkeur krijgt. Figuur 4.10 ‘Contour’plot voor 1,3-propaandiol (links) en glycerol (rechts) Als laatste hebben we d8-D-valine. Hier werd gevonden dat een kleinere hoeveelheid UPwater beter is om te heroplossen (p<0,001). Uit de contourplot (Fig. 4.11) blijkt verder dat de verhouding der solventen geen verschil maakt. Figuur 4.11 Contourplot voor d8-D-valine 38 4.1.3.3 Algemeen resultaat Over het algemeen kon besloten worden dat de bevindingen wat betreft de solventverhouding nergens significant waren, maar dat in de contourplots wel een beter resultaat werd verkregen wanneer de methanol:UP water verhouding bij 1:2 aanleunt. In het gefinaliseerde extractieprotocol wordt echter aangeraden om de solventverhouding 1:1 te kiezen, dit doordat sommige componenten toch liever de 3:1 verhouding verkiezen en we zo veel mogelijk metabolieten zo goed mogelijk willen extraheren. Wat betreft de concentratie of hoeveelheid UP water voor het heroplossen van de metabolieten na het volledig drogen, zijn er voor de verschillende metabolieten evenveel significante waarden die voor een grotere als een kleinere hoeveelheid pleiten. Daarom is hier geopteerd om voor 500 μl UP water te kiezen. 4.2 DNA- en DNA-adductextractie 4.2.1 DNA-extractie Initieel werden DNA-extracties uitgevoerd op HT29-cellen afkomstig uit een 6-wellplaat. De hierbij verkregen DNA-concentratie werd vervolgens gemeten aan de hand van de NanoDrop ND-1000. Om zeker te zijn dat zuiver DNA werd bekomen, is het belangrijk om steeds op 2 controlepunten te letten die gebaseerd zijn op het bekomen spectrum van het staal. Zo moet de verhouding van de absorbantie bij 260nm/280nm minstens gelijk zijn aan 1,8 om er zeker van te zijn dat het DNA is dat gemeten wordt en geen andere, interfererende, moleculen. Hoe dichter de waarde bij 2 aanleunt, hoe zuiverder het DNA. De verhouding van de absorbantie bij 260nm/230nm is een secundair controlepunt voor de zuiverheid van het DNA in het staal. De waarden worden verwacht van 2,0 tot 2,2. In figuur 4.12 is een spectrumopname van een staal te zien met correcte waarden voor de 2 controlepunten. Voor dit staal is het zeker dat DNA gemeten werd en de bekomen concentratie voor DNA is in dit geval 141,3 ng/μl. 39 Figuur 4.12 Schermopname van het verkregen spectrum van een DNA-staal met de NanoDrop ND-1000. In eerste instantie werd enkel de DNeasy Blood & Tissue kit van Qiagen getest voor de extractie van DNA uit de cellen van de 6-well plaat. Bij deze test kon echter geen DNA gemeten worden. Ook de 2 controlepunten voor de waarden waren slecht. Door dit tegenvallende resultaat werd beslist om verschillende 6-wellplaatcelstalen te poolen om zo het aantal cellen, en de hoeveelheid DNA, op te krikken. Na een nieuwe DNA-extractie en nieuwe meting met de NanoDrop ND-1000 voldeed het resultaat nog steeds niet aan de vooropgestelde eisen. Bij de meerderheid van de stalen bleek er geen meetbare DNAconcentratie aanwezig. Bij de andere stalen werd wel een lage concentratie DNA gemeten, maar voldeden de controlepunten niet aan de vooropgestelde eisen. Aangezien DNAextractie met de DNeasy Blood & Tissue kit van Qiagen niet de verwachte resultaten opleverde, werden de DNA-extracties nogmaals uitgevoerd op gepoolde celstalen met behulp van een andere DNA-extractiekit, zijnde de NucleoSpin Tissue kit van MachereyNagel. Na de extracties en de meting van de DNA-concentratie te hebben uitgevoerd, kon besloten worden dat het NucleoSpin Tissue kit van Macherey-Nagel wel een DNAconcentratie opleverde die voldeed aan de eisen qua zuiverheid, terwijl de DNeasy Blood & Tissue kit van Qiagen nog steeds geen goede resultaten gaf. Na het verkrijgen van DNA uit de initiële celstalen, werd de reeds eerder beschreven DNAadductextractie uitgevoerd. Het is belangrijk om aan te halen dat DNA-adducten ook gevormd worden onder invloed van fysiologische processen in het lichaam (59). De concentratie van deze endogene DNA-adducten is echter relatief laag ten opzichte van het ‘gezond’ DNA. Het aantal HT29-cellen voor de analyse diende dus relatief hoog te zijn opdat er zeker voldoende DNA en DNA-adducten geëxtraheerd konden worden. Enerzijds was dit 40 om de gevoeligheid van de analyse te verhogen, anderzijds omdat er gezien werd dat de extractie van DNA logischerwijs succesvoller was bij een groter aantal cellen. Er werd daarom gekozen om de HT29-cellen te kweken in een T25-celcultuurflesje, wat een grotere celoogst oplevert dan de 6-wellplaten. 4.2.2 Toxiciteitstesten op de HT29-cellijn Het effect van verschillende concentraties MDA, KDA en CRO werden getest op de HT29cellijn. Na de DNA-extractie volgde de DNA-adductextractie (zie 3.3.4), waarna de aanwezige DNA-adducten konden geanalyseerd worden met behulp van UHPLC-HRMS/MS. Hiervoor werd, zoals beschreven in het hoofdstuk materiaal en methode, ook een ijklijn opgesteld om een correcte kwantificatie van de DNA-adducten mogelijk te maken. Vervolgens werd de verkregen concentratie van het DNA-adduct in elk staal gedeeld door de concentratie DNA die gemeten werd door de NanoDrop ND-1000 (Tabel 4.2) om te corrigeren voor de variabele hoeveelheid DNA in elk staal. (In de tabel staat KDA 1 voor de laagste, KDA 2 voor de middelste en KDA 3 voor de hoogste concentratie, dit voor alle stoffen. Suffix .1 t.e.m. .3 staat voor de nummer van het staal.) Het resultaat kon uitgezet worden in een grafiek om het effect van de verschillende toxische stoffen op de vorming van DNA-adducten in de HT29-cellen te vergelijken. Daar er, zoals reeds eerder werd aangehaald, ook endogene DNA-adducten voorkomen in cellulair DNA, werden er blanco stalen gebruikt om te kijken of de DNA-adductconcentraties bij behandelde cellen al dan niet beduidend hoger lagen dan bij de onbehandelde cellen. Tabel 4.2: tabel met de gemeten DNA-concentratie per staal Staal DNA (ng/μl) Staal DNA (ng/μl) Staal DNA (ng/μl) KDA 1.1 KDA 1.2 KDA 1.3 KDA 2.1 KDA 2.2 KDA 2.3 KDA 3.1 KDA 3.2 KDA 3.3 Blanco Blanco 132,5 36,2 70,4 34 55,7 122,7 11 11,5 20,6 15,6 173,8 MDA 1.1 MDA1.2 MDA 1.3 MDA 2.1 MDA 2.2 MDA 2.3 MDA 3.1 MDA 3.2 MDA 3.3 Blanco Blanco 141,3 138,1 109,8 94,6 98,7 18,2 5,3 66,9 67,8 115,9 178,9 CRO 1.1 CRO 1.2 CRO 1.3 CRO 2.1 CRO 2.2 CRO 2.3 CRO 3.1 CRO 3.2 CRO 3.3 Blanco Blanco 39,7 30,2 35,2 12,5 26,8 29,4 11,9 16,1 16,3 33,4 132,5 De ijklijnen opgesteld voor de 4 geanalyseerde DNA-adducten zijn in figuur 4.13 afgebeeld. 41 A y = 20,646x + 0,0043 R² = 0,99382 0,02 0,04 Conc adduct (ng/ml) Conc adduct (ng/ml) 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0,00 0,06 B 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 y = 2,1476x + 0,0031 R² = 0,99193 0 C 1,0 0,8 0,6 y = 0,1717x + 0,0092 R² = 0,9984 0,4 0,2 0,0 0,0 2,0 4,0 Piekoppervlakteratio 0,2 0,4 0,6 Piekoppervlakteratio 6,0 Conc adduct (ng/ml) Conc adduct (ng/ml) Piekoppervlakteratio D 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 y = 0,1643x + 0,0016 R² = 0,99868 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 Piekoppervlakteratio Figuur 4.13 De O 6 -CMG (A), O 6 -MeG (B), M1G (C) en Cro-G (D) ijklijn Bij de behandeling van de HT29-cellen met crotonaldehyde werd een duidelijke en significante stijging waargenomen (p=0,007) van de DNA-adducten/DNA ratio voor Cro-G (fig. 4.14). De blanco vs. de 0,1 mM behandeling en de blanco vs. de 0,25mM behandeling waren onderling echter niet significant verschillend van elkaar (p>0,05). De andere 3 DNA-­‐adduct/DNA ratio targeted DNA-adducten werden niet bijkomend gevormd door toedoen van crotonaldehyde. 0,0005 0,0004 0,0003 0,0002 0,0001 0 blanco 0,1 mM 0,25 mM 0,5 mM concentratie CRO toegediend Figuur 4.14 De Cro-G DNA-adduct/DNA ratio in functie van de toegevoegde concentraties crotonaldehyde 42 Voor de behandeling met MDA werd geen significant verband gevonden tussen de toegevoegde MDA-concentratie en de vorming van M1G DNA-adducten in de HT29-cellijn (p=0,421). Er is daarentegen wel een mogelijk stijgende trend te zien, hoewel deze dus niet DNA-­‐adduct/DNA ratio statistisch bevestigd kan worden (Fig. 4.15) 0,002 0,0015 0,001 0,0005 0 Blanco 0,1 mM 0,25 mM 0,5 mM concentratie MDA toegediend Figuur 4.15 De M1G DNA-adduct/DNA ratio in functie van de toegevoegde concentraties crotonaldehyde Verder werd voor de behandeling van de HT29-cellijn met KDA geen significant stijgend verband aangetoond tussen de vorming van de DNA-adducten O6-MeG (p=0,268) (Fig. 4.16) en O6-CMG (p= 0,175) (Fig. 4.17) en de verschillende concentraties KDA. Ook hier is echter wel een zekere trend merkbaar naarmate de cellen met een hogere concentratie KDA behandeld werden. DNA-­‐adduct/DNA ratio 0,0005 0,0004 0,0003 0,0002 0,0001 0 Blanco 1 mM 2,5 mM 5 mM concentratie KDA toegediend DNA-­‐adduct/DNA ratio Figuur 4.16 De O 6 -MeG DNA-adduct/DNA ratio in functie van de toegevoegde concentraties KDA 0,02 0,015 0,01 0,005 0 Blanco 1 mM 2,5 mM 5 mM concentratie KDA toegediend Figuur 4.17 De O 6 -CMG DNA-adduct/DNA ratio in functie van de toegevoegde concentraties KDA 43 5. Discussie Tijdens deze masterproef werd getracht om de protocollen van verscheidene basishandelingen, die nodig zijn voor het verdere onderzoek naar de carcinogene invloed van rood vlees via de toepassing van metabolomics- en DNA-adductomicsbenadering op cellijnniveau, te optimaliseren en controleren op toepasbaarheid. Er wordt in het Labo voor Chemische Analyse onderzoek gevoerd naar de relatie tussen rood vlees en colorectale kanker omdat er een sterk vermoeden bestaat dat de consumptie van rood vlees een belangrijk aandeel kan hebben in het sterk gestegen aantal colonkankergevallen in Westerse en recent welvarende landen (9). Bij de aangewende cellijntesten worden dan ook cellen gebruikt die zo dicht mogelijk aanleunen bij de in vivo cellen van het humane colon. Om deze redenen werd er gewerkt met HT29-cellen; premature colonkankercellen (= getransformeerd) die oorspronkelijk geïsoleerd werden uit de darm van een 44-jarige vrouw. 5.1 HT29-cellen De cellen die gebruikt werden voor de optimalisatie, en die ook in aansluitende proeven met vleesdigesten zullen gebruikt worden, zijn HT29-cellen. Deze HT29-cellen zijn afkomstig van een primaire colontumor. Een primaire, graad I, colontumor komt volgens de TNM-classificatie (tumor, lymfeklieren en metastase) overeen met een tumor die als classificatie T1 N0 en M0 heeft. T1 wil zeggen dat de tumor reeds de submucosa begint binnen te dringen. N0 en M0 wijzen er op dat er nog geen sprake is van kankercellen in de lymfeklieren of metastase (60). Het feit dat in de proeven gewerkt wordt met coloncellen die reeds kankercellen zijn, betekent dat de cel reeds een transformatie heeft ondergaan. Het is echter gemakkelijker om kankercellen te kweken en te onderhouden dan primaire, niet-getransformeerde celculturen (= gezonde coloncellen geïsoleerd uit de darm). Bij kankercellen is de rem op de celdeling immers niet meer aanwezig en gaat het delen vlot, waardoor de cellen in principe onbeperkt in cultuur gehouden kunnen worden. Hierdoor kan een kankercel niet meer beschouwd worden als een normale cel die aanwezig zou zijn in gezond weefsel. Door dit feit is het ook zo dat er reeds een verschil is in vergelijking met gezonde cellen wat betreft groeitempo, celcyclus en geproduceerde cellulaire metabolieten (61,62). Zo is vastgesteld dat kankercellen in het algemeen sneller delen. Daardoor zijn kankercellen echter ook gevoeliger voor mutaties die kunnen plaatsvinden bij de 44 blootstelling aan toxische stoffen (63). Het is zo dat er meer cellen zullen gevormd worden binnen eenzelfde tijdspanne in vergelijking met een goedaardige cel, waardoor veranderingen in het genetisch materiaal ook sneller optreden. Deze genetische aantastingen hoeven niet altijd negatief te zijn voor de kankercel. Ook de cellulaire metabolieten zullen een ander profiel hebben dan bij goedaardige cellen, dit komt onder andere doordat een kankercel veel meer glucose zal verbruiken via de glycolyse en ook de novo meer vrije vetzuren biosynthetiseert. Het zullen dan ook de metabolieten, afgeleid van deze pathways, zijn die reeds op basaal niveau meer zullen voorkomen dan bij goedaardige cellen (61,64). Deze bevindingen wijzen er op dat bij de interpretatie van de resultaten bij de HT-29 cellen er toch niet zomaar een eventuele extrapolatie van deze gegevens naar normale, niet-getransformeerde coloncellen in situ, mag uitgevoerd worden. 5.2 Optimalisatie protocol voor metabolietextractie uit HT29-cellen Bij de optimalisatie van het metabolietextractieprotocol werd gebruik gemaakt van een reeds bestaand extractieprotocol voor metabolieten in celculturen. Uiteraard zijn in de literatuur nog veel protocollen terug te vinden die beschrijven hoe een dergelijke extractie kan uitgevoerd worden. Zo zijn er protocollen die werken met solventen bij andere temperaturen (65), met andere solventoplossingen (zoals een methanoloplossing met 0,85% bicarbonaat (66)) of zelfs met totaal andere solventen zoals perchloorzuur (67). Deze mogelijkheden konden onmogelijk allemaal opgenomen worden in de proefopzet, daar deze op die manier te complex zou worden. De voornaamste mogelijkheden werden uitgekozen en uitgewerkt in de verschillende experimenten. Het is echter aangewezen om steeds rekening te houden met de concrete doelstelling van de extractie, in ons geval een zo ruim mogelijk spectra aan hoofdzakelijk polaire metabolieten extraheren. Bij andere extractievereisten zouden indien nodig de andere beschreven methoden ge(re)ëvalueerd kunnen worden. Zoals werd gezien bij de analyse in Modde 5.0, kon niet voor elke parameter de beste instelling aangeduid worden. Als er bijvoorbeeld vluchtige moleculen gevonden moeten worden, kan er misschien geprobeerd worden om toch via het aanlengen-en-drogen-totbeginvolume-principe te gaan werken in plaats van het volledig drogen. In het finale protocol werd gekozen voor volledig drogen omwille van praktische redenen. Ook de aangewende methode voor cellyse (door sonificatie) kan eventueel vervangen worden door een andere geschikte manier van cellyse indien geen sonificator beschikbaar zou zijn. 45 Als de vergelijking wordt gemaakt tussen het basisprotocol waarvan gestart werd en het verkregen protocol na optimalisatie, dan valt het op dat geen grote veranderingen zijn doorgevoerd in het geoptimaliseerde protocol. Wel is het zo dat het geoptimaliseerde protocol het beste is voor de geteste parameters (bij sommige parameters is er niet één instelling de beste, maar kan er gekozen worden voor verschillende instellingen met een gelijkaardig resultaat). Het finale protocol is in bijlage terug te vinden. Er werd uiteindelijk ook beslist om chloroform niet meer in het finale protocol op te nemen aangezien dit geen echte meerwaarde had omwille van de focus op polaire metabolieten in de gebruikte UHPLC–methode. Door chloroform kunnen de polaire en apolaire metabolieten beter gescheiden worden. Het toevoegen van chloroform kan aangewezen zijn als er interesse is in de apolaire componenten. Iets wat opviel in de laatste optimalisatieproef was dat het soms voordeliger was om in een grotere hoeveelheid water op te lossen. Dit lijkt tegenstrijdig met de verwachtingen aangezien een kleiner volume een hogere concentratie van de metabolieten inhoudt en dus ook makkelijker te detecteren is, met eveneens grotere piekoppervlakten. Het zou kunnen dat er in een kleiner volume meer kans is op interacties tussen de metabolieten onderling, of sprake is van matrixinterferentie, waardoor deze niet correct gedetecteerd kunnen worden, wat door Mushtaq MY reeds kort gesuggereerd werd (68). Anderzijds kan het ook zo zijn dat de detector ietwat overbeladen wordt door de hogere concentraties van metabolieten en hierdoor andere metabolieten minder nauwkeurig gemeten kunnen worden. Een heruitvoering van de proef met een grotere bereik aan hoeveelheden wat het heroplossen betreft zou kunnen helpen bij de analyse van deze waarneming. Het finale gekozen compromis voor de hoeveelheid water voor het heroplossen (nl. 500 μl) na volledig drogen van het extractiesolvent dat de metabolieten bevat, moet aangepast worden naargelang het gebruikte kweekmedium. In de proefopzet werd gewerkt met confluente T25-flesjes (bodemoppervlak 25 cm2). Als er daarentegen gewerkt zou worden met een 6-wellplaat (bodemoppervlak 9,61 cm2), dan wordt dit 192 μl UP water. 5.3 DNA-extractie De reden waarom de NucleoSpin Tissue kit beter geschikt was dan de DNeasy Blood & Tissue kit kan liggen in het feit dat het PBS-medium waarin de cellen zich bevonden mogelijk interfereerde met de producten die gebruikt worden in de kit. Het is mogelijk dat PBS 46 rechtstreeks interfereert of dat resten aanwezig zijn van het gebruikte celkweekmedium. Aangezien geen verdere problemen werden waargenomen bij de NucleoSpin kit werd hier niet verder op ingegaan in het kader van deze masterproef. 5.4 DNA-toxiciteitstest Bij de DNA-extracties werd gezien dat de DNA-concentratie binnen eenzelfde behandeling niet altijd dezelfde grootte-orde had. Een mogelijke verklaring hiervoor kan te vinden zijn bij de variatie in de groei van de cellen; niet elk T25-flesje bevat namelijk exact evenveel cellen en DNA. Een andere mogelijke verklaring is dat grote aantallen cellen afgedood werden door de toxische invloed van KDA, MDA of CRO, zeker bij de hogere concentraties, en het DNA bijgevolg reeds vrij aanwezig was in het medium na lyse van de afgedode cel. Dit vrije DNA zal bij centrifugatie moeilijker een pellet vormen en zo verloren gaan bij het wassen. Doordat bij de kwantificatie van de DNA-adducten gecorrigeerd wordt voor de hoeveelheid DNA dat in het staal aanwezig was voor de DNA-adductextractie, vormt dit verschil in DNA-concentratie echter geen probleem bij de interpretatie van de analyseresultaten. Bij de behandeling van de cellen met crotonaldehyde werd gezien dat enkel het DNA-adduct CroG duidelijk steeg bij een stijgende concentratie aan toegevoegd crotonaldehyde. Deze bevinding was ook te verwachten aangezien crotonaldehyde normaal gezien enkel aanleiding geeft tot de vorming van CroG DNA-adducten (69) en niet van O6-MeG, O6-CMG of M1G. Bij de behandeling van de HT29-cellen met MDA werd de aanmaak van het M1G DNA-adduct verwacht. De vorming van het M1G DNA adduct in cellen na behandeling met MDA werd immers reeds eerder beschreven in de literatuur (20). Bij de zelf uitgevoerde genotoxiciteitsproef kon dit verband echter niet significant aangetoond worden. Ook bij de KDA-behandeling werd geen significante trend vastgesteld. Bij de toediening van KDA aan de cellijn werd een stijging van de concentratie van O6-CMG en O6-MeG verwacht naarmate de concentratie van KDA opgedreven werd (70). De resultaten van de genotoxische behandeling van de HT29-cellijn, waarbij de vorming van DNA-adducten werd verwacht, vertoonden geen significante trend voor de behandeling met KDA en MDA. Daarentegen was er wel een significante trend waar te nemen voor de CRO 47 behandeling. Een eerste mogelijke verklaring hiervoor kan zijn dat er te weinig DNAadducten werden aangemaakt, waardoor de detectielimiet van de analyse niet werd gehaald en de aanwezigheid van het DNA-adduct niet gemeten kon worden. Een andere verklaring kan liggen bij het feit dat niet alle celflesjes even confluent begroeid waren en de daardoor ontstane variatie op het aantal cellen per flesje ook een invloed had op het aantal DNAadducten dat aanwezig was per flesje. Aangezien er voor de behandeling met CRO wel een significante trend werd gezien, zou het kunnen dat een hogere concentratie van de genotoxische stoffen KDA en MDA een groter aantal DNA-adducten induceert en de hoeveelheid aanwezige DNA-adducten bijgevolg wel boven de detectielimiet komt te liggen. Een dergelijke proefopzet en de hierbij verkregen resultaten kunnen mogelijk bijdragen tot een beter en significant resultaat wat betreft het terugvinden van een trend tussen de concentratie van de genotoxische stof en de aanmaak van DNA-adducten. Een groter aantal stalen per behandeling kan de fout op de gemeten concentraties voor DNA-adducten doen dalen. Hierdoor kan het verschil tussen de behandelingsgroepen groter worden en vergroot zo de kans op een significante trend wat betreft de concentratie van de genotoxische stof en het aantal DNA-adducten dat daaruit gevormd wordt. Tijdens deze masterproef werd reeds gestart met een nieuwe proefopzet (waarbij o.a. de concentratie van MDA werd verhoogd) om de resultaten beschreven in de literatuur te kunnen bevestigen voor de HT29-cellijn, en dit voor zowel CroG, M1G, O6-CMG als O6-MeG. Door technische problemen was het echter niet meer mogelijk om de resultaten van deze proef te analyseren en verwerken in deze masterproef. De resultaten van de nieuwe proef zullen moeten uitwijzen of het bestaande protocol voor DNA-adductextractie weldegelijk toepasbaar is op de HT29-cellijn. 48 6. Conclusie In deze masterproef werd het extractieprotocol voor metabolieten geoptimaliseerd en de toepasbaarheid van het protocol voor DNA-adductomics getest in het kader van het rood vlees-kankeronderzoek. Voor het metabolietenextractieprotocol werd voor verschillende parameters de optimale instelling(en) gevonden. Zo werd na de eerste optimalisatie duidelijk dat methanol en ethanol significant beter waren dan acetonitrile als polair solvent. Eveneens werd besloten dat de solventenverhouding tussen ethanol, water en chloroform significant beter was als deze 1:1:1 bedroeg, dit tegenover de 7:2:1 verhouding die duidelijk mindere resultaten gaf. Naast deze significante resultaten werden ook niet-significante tendensen waargenomen zoals deze waarbij wassen met 0,9% NaCl de voorkeur krijgt op wassen met PBS. De wasstap werd ook het best twee keer uitgevoerd. Anderzijds waren er ook resultaten die niet eenduidig waren. Zo was dit het geval bij de manier van drogen, waarbij beide mogelijkheden (aanlengen en terug tot beginvolume drogen tegenover volledig drogen en heroplossen) gelijkwaardige resultaten opleverden. Er kan in dit geval best gekeken worden naar het beoogde type metaboliet (vluchtig of minder vluchtig) om te beslissen welke mogelijkheid zal toegepast worden bij de extractie. Eenzelfde onbeslist resultaat werd bekomen bij de verdere optimalisatie, waarbij zowel heroplossen in een groter volume als in een kleiner volume evenwaardige significant resultaten gaven. In dit geval werd gekozen om herop te lossen in een volume dat het midden van de 2 geteste uitersten benaderde, namelijk in 500 μl voor cellen gekweekt in een T25 flesje. Dezelfde tweestrijd was ook terug te vinden bij de verhouding van de solventen als chloroform werd weggelaten bij de verdere optimalisatie. Zo was soms de ethanol-water verhouding 1:2 beter, soms de 3:1 verhouding. Ook hier werd geopteerd om een compromis te zoeken en werd besloten om de verhouding vast te leggen op 1:1. Als deze aanbevelingen worden opgevolgd bij de uitvoering van het extractieprotocol, zal men de best mogelijke extractie van metabolieten uit HT29-cellen bekomen. Bij de DNA-adductexperimenten werd vastgesteld dat de NucleoSpin Tissue kit van Macherey Nagel (Düren, Duitsland) voldoet om DNA te extraheren uit HT29-cellen. Verder werd er in de toxiciteitstest gezien dat het aantal CroG DNA-adducten evenredig steeg met de concentratie van crotonaldehyde dat werd toegevoegd aan het celgroeimedium. 49 Daarentegen kon dit niet met zekerheid gesteld worden voor de M1G, O6-MeG en O6-CMG DNA-adducten. De toepasbaarheid van het DNA-adductomics protocol kan met andere woorden nog niet bevestigd worden op basis van de resultaten bekomen in deze masterproef. Verdere testen zijn nodig om voor de andere DNA adducten (O6-CMG, O6-MeG en M1G) een besluit te kunnen vormen. Als ook hier het resultaat van de relatie tussen de toegevoegde concentratie genotoxische stof en het gevormde aantal DNA-adducten kan bevestigd worden, kan er bij verdere proeven gewerkt worden met het beschreven DNAadductomicsprotocol. Zo kan men in het vlees-kankeronderzoek bijvoorbeeld de (geno)toxiciteit van verschillende vleesdigesten nagaan aan de hand van de eventueel gevormde DNA-adducten. 50 7. Bibliografie 1. Stischting Kankerregister. Tien meest frequente tumoren per geslacht in België 2012 [Internet]. 2014 [cited 2015 Feb 16]. Available from: http://www.kankerregister.org/media/images/cijfersoverkanker/tienmeestfrequen tetumorenpergeslacht2012_orig.jpg 2. Francart J, Emmerechts K, Eycken L Van. Cancer prevalence in Belgium in 2010. 2014; 3. WCRF. Colorectal cancer statistics | World Cancer Research Fund International [Internet]. [cited 2015 Feb 16]. Available from: http://www.wcrf.org/int/cancerfacts-figures/data-specific-cancers/colorectal-cancer-statistics 4. IARC. Fact Sheets by Cancer; colorectum [Internet]. [cited 2015 Feb 16]. Available from: http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_cancer.aspx 5. Zur Hausen H. Red meat consumption and cancer: Reasons to suspect involvement of bovine infectious factors in colorectal cancer. Int J Cancer. 2012;130:2475–83. 6. IARC. Mortaliteitsdatabase van het International Agnecy for Research on Cancer op 05.03.2015. 2015; Available from: http://www.who.int/healthinfo/mortality_data/en/ 7. Cross AJ, Sinha R. Meat-Related Mutagens / Carcinogens in the Etiology of Colorectal Cancer. 2004;55(December 2003):44–55. 8. Raskov H. Colorectal carcinogenesis-update and perspectives. World J Gastroenterol [Internet]. 2014;20(48):18151. Available from: http://www.wjgnet.com/10079327/full/v20/i48/18151.htm 9. World Cancer Research Fund, American Institute for Cancer Research. Cancers. Food, Nutr Phys Act Prev Cancer A Glob Perspect. 2007;244–321. 10. Superior Health Council Belgium. Red meat, processed red meats and the prevention of colorectal cancer. Publication of the Superior Health Council No. 8858. 2013;(8858):1–98. Available from: http://www.health.fgov.be/internet2Prd/groups/public/@public/@shc/documents /ie2divers/19091480_en.pdf 11. Sinha R. An epidemiologic approach to studying heterocyclic amines. Mutat Res Fundam Mol Mech Mutagen. 2002;506-507:197–204. 12. Sinha R, Chow WH, Kulldorff M, Denobile J, Butler J, Garcia-Closas M, et al. Well-done, grilled red meat increases the risk of colorectal adenomas. Cancer Res. 1999;59:4320– 4. 51 13. Phillips DH. Polycyclic aromatic hydrocarbons in the diet. Mutat Res. 1999;443:139– 47. 14. Rundvlees | Voedingscentrum [Internet]. [cited 2015 Feb 17]. Available from: http://www.voedingscentrum.nl/encyclopedie/rundvlees.aspx#blok14 15. Nubel. Vetgehalte per 100 g vlees. Belgische voedingsmiddelentabel. 2009;(5):6–7. 16. Tappel A. Heme of consumed red meat can act as a catalyst of oxidative damage and could initiate colon, breast and prostate cancers, heart disease and other diseases. Med Hypotheses. 2007;68:562–4. 17. Corpet DE. Red meat and colon cancer: Should we become vegetarians, or can we make meat safer? Meat Sci [Internet]. Elsevier B.V.; 2011;89(3):310–6. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.meatsci.2011.04.009 18. Bastide NM, Pierre FHF, Corpet DE. Heme iron from meat and risk of colorectal cancer: A meta-analysis and a review of the mechanisms involved. Cancer Prev Res. 2011;4:177–84. 19. Kanner J. Dietary advanced lipid oxidation endproducts are risk factors to human health. Mol Nutr Food Res. 2007;51:1094–101. 20. Niedernhofer LJ, Daniels JS, Rouzer C a., Greene RE, Marnett LJ. Malondialdehyde, a product of lipid peroxidation, is mutagenic in human cells. J Biol Chem. 2003;278(33):31426–33. 21. Santarelli RL, Pierre F, Corpet DE. Processed meat and colorectal cancer: a review of epidemiologic and experimental evidence. Nutr Cancer. 2008;60(2):131–44. 22. Heemverbinding - Wikipedia [Internet]. [cited 2015 Mar 11]. Available from: http://nl.wikipedia.org/wiki/Heemverbinding 23. Santarelli RL, Vendeuvre JL, Naud N, Taché S, Guéraud F, Viau M, et al. Meat processing and colon carcinogenesis: Cooked, nitrite-treated, and oxidized highheme cured meat promotes mucin-depleted foci in rats. Cancer Prev Res. 2010;3(July):852–64. 24. Kanner J. Oxidative processes in meat and meat products: Quality implications. Meat Sci. 1994;36:169–89. 25. Fentons Reagent General Chemistry | Hydrogen Perox | H2O2.com - US Peroxide Technologies for Clean Environment [Internet]. [cited 2015 Mar 5]. Available from: http://www.h2o2.com/pages.aspx?pid=143&name=General-Chemistry-of-Fenton-sReagent 26. Mirvish SS. Role of N-nitroso compounds (NOC) and N-nitrosation in etiology of gastric, esophageal, nasopharyngeal and bladder cancer and contribution to cancer of known exposures to NOC. Cancer Lett. 1995;93:17–48. 52 27. Habermeyer M, Roth A, Guth S, Diel P, Engel K-H, Epe B, et al. Nitrate and nitrite in the diet: How to assess their benefit and risk for human health. Mol Nutr Food Res [Internet]. 2015;59(1):106–28. Available from: http://doi.wiley.com/10.1002/mnfr.201400286 28. Joosen a. MCP, Kuhnle GGC, Aspinall SM, Barrow TM, Lecommandeur E, Azqueta A, et al. Effect of processed and red meat on endogenous nitrosation and DNA damage. Carcinogenesis. 2009;30(8):1402–7. 29. Knekt P, Järvinen R, Dich J, Hakulinen T. Risk of colorectal and other gastro-intestinal cancers after exposure to nitrate, nitrite and N-nitroso compounds: a follow-up study. Int J Cancer. 1999;80(September 1998):852–6. 30. Pignatelli B, Malaveille C, Rogatko a, Hautefeuille a, Thuillier P, Muñoz N, et al. Mutagens, N-nitroso compounds and their precursors in gastric juice from patients with and without precancerous lesions of the stomach. Eur J Cancer. 1993;29A(14):2031–9. 31. Hughes R, Cross a J, Pollock JR, Bingham S. Dose-dependent effect of dietary meat on endogenous colonic N-nitrosation. Carcinogenesis. 2001;22(1):199–202. 32. Bingham SA, Hughes R, Cross AJ. Effect of white versus red meat on endogenous Nnitrosation in the human colon and further evidence of a dose response. J Nutr. 2002;132(16):3522S – 3525S. 33. Lewin MH, Bailey N, Bandaletova T, Bowman R, Cross AJ, Pollock J, et al. Red meat enhances the colonic formation of the DNA adduct O6-carboxymethyl guanine: implications for colorectal cancer risk. Cancer Res. 2006;66(16):1859–65. 34. Hall CN, Badawi a F, O’Connor PJ, Saffhill R. The detection of alkylation damage in the DNA of human gastrointestinal tissues. Br J Cancer. 1991;64(October 1990):59–63. 35. Saffhill R, Margison GP, O’Connor PJ. Mechanisms of carcinogenesis induced by alkylating agents. Biochim Biophys Acta. 1985;823:111–45. 36. Dobre M, Comănescu M, Arsene D, Iosif C, Bussolati G. K-ras gene mutation status in colorectal cancer: comparative analysis of pyrosequencing and PCR-RFLP. Rom J Morphol Embryol [Internet]. 2013;54(3):567–74. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24068405 37. Genetische pathway CRC. Available from: http://syscol-project.eu/about-syscol/ 38. Draviam VM, Shapiro I, Aldridge B, Sorger PK. Misorientation and reduced stretching of aligned sister kinetochores promote chromosome missegregation in EB1- or APCdepleted cells. EMBO J. 2006;25(12):2814–27. 39. Powell SM, Zilz N, Beazer-Barclay Y, Bryan TM, Hamilton SR, Thibodeau SN, et al. APC mutations occur early during colorectal tumorigenesis. Nature [Internet]. 1992 Sep 17 [cited 2015 Feb 10];359(6392):235–7. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1528264 53 40. Bahnassy AA, Zekri A-RN, Salem SE, Abou-Bakr AA, Sakr MA, Abdel-Samiaa AG, et al. Differential expression of p53 family proteins in colorectal adenomas and carcinomas: Prognostic and predictive values. Histol Histopathol [Internet]. 2014 Feb [cited 2015 Feb 26];29(2):207–16. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23996743 41. Whitfield PD, German AJ, Noble P-JM. Metabolomics: an emerging post-genomic tool for nutrition. Br J Nutr [Internet]. 2007;92(04):549. Available from: http://www.journals.cambridge.org/abstract_S0007114504002053 42. Guertin K a., Moore SC, Sampson JN, Huang WY, Xiao Q, Stolzenberg-Solomon RZ, et al. Metabolomics in nutritional epidemiology: Identifying metabolites associated with diet and quantifying their potential to uncover diet-disease relations in populations. Am J Clin Nutr. 2014;100:208–17. 43. Sullivan AO, Gibney MJ, Brennan L. Dietary intake patterns are reflected in metabolomic profiles : potential role in dietary assessment studies 1 – 3. Am J Clin Nutr. 2011;314–21. 44. Abdel Rahman AM, Pawling J, Ryczko M, Caudy A a., Dennis JW. Targeted metabolomics in cultured cells and tissues by mass spectrometry: Method development and validation. Anal Chim Acta [Internet]. Elsevier B.V.; 2014;845:53–61. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.aca.2014.06.012 45. Silva LP, Lorenzi PL, Purwaha P, Yong V, Hawke DH, Weinstein JN. Measurement of DNA concentration as a normalization strategy for metabolomic data from adherent cell lines. 2014;85(20). 46. Kristensen M, Engelsen SB, Dragsted LO. LC-MS metabolomics top-down approach reveals new exposure and effect biomarkers of apple and apple-pectin intake. Metabolomics. 2012;8:64–73. 47. Goedert JJ, Sampson JN, Moore SC, Xiao Q, Xiong X, Hayes RB, et al. Fecal metabolomics: assay performance and association with colorectal cancer. Carcinogenesis [Internet]. 2014;00(00):1–8. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25037050 48. Thienpont L. Cursus Instrumentele Analytische Chemie. 2014 p. 1–4. 49. Roge a. B, Firke SN, Dhane RM, Gunjkar VJ, Vadvalkar SM. Novel achievement of HPLC: UPLC. Int J PharmTech Res. 2011;3(3):1423–9. 50. Hoffmann E De, Stroobant V. Mass Spectrometry - Priniples and Applications. [Internet]. Mass spectrometry reviews. 2007. 945-61 p. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21057935 51. Makarov A. Electrostatic axially harmonic orbital trapping: A high-performance technique of mass analysis. Anal Chem. 2000;72(6):1156–62. 54 52. Thermo Fisher :: Orbitrap :: Exactive Plus [Internet]. [cited 2015 May 28]. Available from: http://planetorbitrap.com/exactive-plus#tab:schematic 53. Michalski A, Damoc E, Hauschild J-P, Lange O, Wieghaus A, Makarov A, et al. Mass spectrometry-based proteomics using Q Exactive, a high-performance benchtop quadrupole Orbitrap mass spectrometer. Mol Cell Proteomics [Internet]. 2011 Sep [cited 2015 Feb 28];10(9):M111.011015. Available from: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3284220&tool=pmcentr ez&rendertype=abstract 54. Sapcariu SC, Kanashova T, Weindl D, Ghelfi J, Dittmar G, Hiller K. Simultaneous extraction of proteins and metabolites from cells in culture. MethodsX [Internet]. 2014 [cited 2015 Feb 10];1:74–80. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2215016114200586 55. Opsteyn I. Optimalisatie van de metabole profilering van het darmfenotype met behulp van hoge resolutie MS en NMR. 2014; 56. Vanden Bussche J, Moore S a., Pasmans F, Kuhnle GGC, Vanhaecke L. An approach based on ultra-high pressure liquid chromatography-tandem mass spectrometry to quantify O6-methyl and O6-carboxymethylguanine DNA adducts in intestinal cell lines. J Chromatogr A [Internet]. Elsevier B.V.; 2012;1257:25–33. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.chroma.2012.07.040 57. Gottschalg E, Scott GB, Burns P a., Shuker DEG. Potassium diazoacetate-induced p53 mutations in vitro in relation to formation of O6-carboxymethyl- and O6 -methyl2???-deoxyguanosine DNA adducts: Relevance for gastrointestinal cancer. Carcinogenesis. 2007;28(2):356–62. 58. Hemeryck LY, Decloedt AI, Vanden Bussche J, Geboes KP, Vanhaecke L. High Resolution Mass Spectrometry Based Profiling of Diet-Related Deoxyribonucleic Acid Adducts / under review. Analytica Chimica Acta; 2015. 59. De Bont R, van Larebeke N. Endogenous DNA damage in humans: A review of quantitative data. Mutagenesis. 2004;19(3):169–85. 60. Obrocea F, Sajin M, Marinescu EC, Stoica D. Colorectal cancer and the 7th revision of the TNM staging system: Review of changes and suggestions for uniform pathologic reporting. Rom J Morphol Embryol. 2011;52(2):537–44. 61. Dakubo GD. Mitochondrial Genetics and Cancer. Grana [Internet]. 2010. p. 39–67. Available from: http://www.springerlink.com/index/10.1007/978-3-642-11416-8 62. Cairns R a, Harris IS, Mak TW. Regulation of cancer cell metabolism. Nat Rev Cancer [Internet]. Nature Publishing Group; 2011;11(2):85–95. Available from: http://dx.doi.org/10.1038/nrc2981 63. Ekwall B, Silano V, Zucco F. Chapter 7 - Toxicity Tests with Mammalian Cell Cultures. Short-term Toxic Tests Non-genotoxic Eff. 1990;75–98. 55 64. The Role of Carbohydrate Restriction in Cancer: Conclusions [Internet]. [cited 2015 May 13]. Available from: http://www.medscape.com/viewarticle/757713_6 65. Ser Z, Liu X, Tang NN, Locasale JW. Extraction parameters for metabolomics from cell extracts. Anal Biochem [Internet]. 2015 Jan 19 [cited 2015 Jan 25]; Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S000326971500007X 66. Danielsson APH, Moritz T, Mulder H, Spégel P. Development and optimization of a metabolomic method for analysis of adherent cell cultures. Anal Biochem [Internet]. Elsevier Inc.; 2010;404(1):30–9. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.ab.2010.04.013 67. Dietmair S, Timmins NE, Gray PP, Nielsen LK, Krömer JO. Towards quantitative metabolomics of mammalian cells: Development of a metabolite extraction protocol. Anal Biochem [Internet]. Elsevier Inc.; 2010;404(2):155–64. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.ab.2010.04.031 68. Mushtaq MY, Choi YH, Verpoorte R, Wilson EG. Extraction for metabolomics: Access to the metabolome. Phytochem Anal. 2014;25(4):291–306. 69. Islam BU, Moinuddin, Mahmood R, Ali A. Genotoxicity and immunogenicity of crotonaldehyde modified human DNA. Int J Biol Macromol [Internet]. Elsevier B.V.; 2014;65:471–8. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2014.01.065 70. Anderson D, Hambly RJ, Yu T, Thomasoni F, Shuker DEG. The Effect of Potassium Diazoacetate on Adenocarcinoma Colon Caco-2 Cells , and Rat Primary Colon Cells in the Comet Assay. 1999;146:137–46. 56 Bijlage 1: DNA-extractieprotocol NucleoSpin Tissue kit van Macherey Nagel I II III IV V Bijlage 2: Finaal protocol (voor cellen gekweekt in 6 wellplaat) 1. Neem het medium van de cellen af en was de cellen met ijskoud 0,9% NaCl in UP water, dit om het celmetabolisme stil te leggen (=quenchen). 2. Voeg aan de cellen 400 microliter van het polair solvent methanol toe, bij -20°C, en zet de wells dadelijk op ijs (verhouding ethanol:water = 1:1). 3. Voeg 16 μl ISTD toe aan de wells. 4. Schraap met behulp van een celschraper de cellen in de wells en breng het celextract volledig over in een epje. 5. Sonificeer de epjes met het celextract om een goede lyse van de cellen te bewerkstelligen, doe dit 2 maal 10 s. 6. Centrifugeer het epje voor 5 min aan 16200g bij 4°C. 7. Neem na centrifugatie 300 μl van de bovenste polaire fase af en breng dit over in een nieuw epje. 8. Na de extractie wordt de polaire fase verdampt, dit gebeurd d.m.v. een vacuümevaporator . 9. Als al het polaire solvent verdampt is dan worden de metabolieten heropgelost in 192 microliter ultrapuur water. 10. Analyse kan dadelijk volgen of de stalen kunnen bij -80°C gestockeerd worden tot verder gebruik. Zie materiaal en methode voor bron van oorspronkelijk protocol VI Bijlage 3: I@H lezingen Research on the cause of human cancer and scientific strategies for cancer prevention and control Dr. Inge Huybrechts Als inleiding werd de prevalentie van de verschillende kankers in de verschillende delen van de wereld met elkaar vergeleken. De prevalentie van verschillende kankertypes verschilt namelijk sterk van gebied tot gebied, zodat het onmogelijk is om over een algemene kankerproblematiek te spreken. De kankerproblematiek wordt daarom het best per gebied bekeken en geanalyseerd. De oorzaken van de kanker zijn daarentegen wel gelijkend. Zo kan bijvoorbeeld het roken van tabak globaal zeer goed met het ontstaan van allerlei kankers in verband gebracht worden. In de lezing werd voornamelijk dieper ingegaan op de werking van het International Agency for Research on Cancer (IARC). 1 van de taken van het IARC is het opstellen van lijsten van mogelijks carcinogene stoffen. Er werd ons duidelijk gemaakt dat het lang niet zo eenvoudig is om stoffen te classificeren en dat er geen algemene grens bestaat waarbij een stof carcinogeen wordt. Men moet daarbij de risico’s voor en invloed op de mens stof per stof gaan analyseren. De bevindingen van het IARC worden vervolgens in een monografie gegoten die voor iedereen toegankelijk is. Deze monografieën handelen niet enkel over moleculen, maar ook levensstijl-­‐factoren worden hierin opgenomen. Verder werd ook uitleg gegeven over de landen die deel uitmaken van het IARC en hoe de interne structuur van het IARC in elkaar zit. Er werd o.a. gewezen op het feit dat het IARC zo onafhankelijk mogelijk tewerk gaat, zonder invloed van mogelijke lobby’s, industriële takken/landen of andere politieke inmengingen. Tijdens de lezing werd eveneens een woordje uitleg gegeven over de studies die momenteel lopen. Zo is er bijvoorbeeld de cohortstudie “EPIC” die per jaar 6,5 miljoen mensen opvolgt en zo één van de grootste studies is in Europa op het gebied van kankeronderzoek. Het doel van deze studie is om nog méér en betere informatie te verzamelen in verband met de talloze kankertypes die kunnen ontstaan in een populatie. Tijdens de lezing werd ook gesproken over de “European Code Against Cancer” waarin VII 12 manieren staan opgesomd hoe je het risico op kanker kan beperken. De grootste factor daarbij is je levensstijl en alles wat hierbij komt kijken zoals een gezond gewicht, voldoende lichamelijke activiteit en een gezonde voeding. RNA therapeutics: opportunities & challenges Prof. Raymond Schiffelers RNA heeft in het lichaam onder andere een functie bij de aanmaak van proteïnen, met een onderscheid tussen o.a. messenger-­‐RNA (mRNA) dat wordt afgelezen door de ribosomen en transfer-­‐RNA (tRNA) dat de aminozuren naar de ribosomen brengt. Aangezien RNA noodzakelijk is bij de productie van eiwitten, zou het nuttig kunnen zijn om ziektes verbonden aan een proteïnemalfunctie via het RNA te behandelen. Dit kan door interferentie met de proteïnesynthese door directe binding aan het RNA, maar ook door specifieke interferentie met het RNA (inhibitie of stimulatie) om zo de productie van specifieke proteïnen te blokkeren of te activeren. Zo is er het Rnase-­‐H dat gerekruteerd kan worden en het mRNA zal afbreken, waardoor de proteïneproductie wordt geïnhibeerd. Daarnaast kan ook ingespeeld worden op het “splicing” mechanisme door bepaalde intronen en exonen wel dan niet te laten opnemen in het mRNA. Onderzoek naar dit soort producten wordt momenteel gevoerd voor de ziekte van Duchène (spierziekte). Bij tests op honden lijkt het geneesmiddel effect te hebben, hoewel het belangrijk is om hierbij op te merken dat er zeer hoge dosissen aangewend werden. Ook small interference RNA (siRNA) zou in de toekomst ingezet kunnen worden als mogelijke behandeling voor verschillende ziekten. Dit siRNA kan binden op zijn complementair stuk van het mRNA, waardoor deze site niet meer kan gebruikt worden voor de productie van eiwitten. Aangezien het volledige menselijke genoom reeds gekend is, is het relatief eenvoudig om de sequentie te vinden waarop het siRNA zou moeten binden voor de behandeling van een bepaalde aandoening. Testen met deze geneesmiddelen zouden dan binnen enkele weken rond kunnen zijn (volgens de Prof. Schiffelers althans). Het grootste obstakel is echter om het siRNA op de juiste plaats te krijgen in het lichaam. Momenteel wordt dit siRNA in proeven via elektroporatie in de gewenste cellen binnengebracht, maar om het VIII geneesmiddel op grote schaal te gebruiken zijn eenvoudigere methoden gewenst. Onderzoek naar dergelijke methoden is dan ook volop bezig. Een negatieve kant aan de behandeling van tumoren met RNA-­‐medicijnen is het probleem dat de tumor soms agressiever is na de behandeling dan voor de behandeling, indien deze niet aanslaat. Ook is het zo dat er bij gebruik van niet volledig complementair RNA meerdere bindingsites mogelijk zijn, maar deze zijn nog niet allemaal gekend. Van vele andere RNA-­‐vormen is de functie in het menselijk lichaam nog niet volledig opgehelderd. Onder andere deze 2 bevindingen maken het ontwikkelen van een goed RNA-­‐medicijn er niet makkelijker op, waardoor de zoektocht naar het perfecte RNA-­‐medicijn zeker nog niet ten einde is. The evolution of microbiology in cystic fibrosis. Prof. John LiPuma Mucoviscidose of cystische fibrose (CF) is een ziekte die wordt veroorzaakt door een defect in het ‘Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator’ gen waardoor het overeenkomstige eiwit, dat de functie van een ionenkanaal vervult, niet meer naar behoren functioneert. Voornamelijk de ΔF508 mutatie zorgt in 70% van de gevallen voor het ontstaan van de ziekte. CF komt niet enkel voor in de longen, maar o.a. ook in de pancreas, lever en teelballen. Vroeger werden kinderen met deze ziekte die genetisch overdraagbaar is, niet veel ouder dan enkele weken of een paar jaar. Door de optimalisatie van de behandelingen is de levensverwachting van deze patiënten echter enorm toegenomen, waardoor er een nieuwe groep patiënten is ontstaan; nl. de jongvolwassenen. Door onderzoek bij kinderen werd er op de plaatsen waar CF actief is, zeer regelmatig Staphylococcus aureus aangetroffen terwijl dit, na verder onderzoek, bij volwassenen eerder Pseudomonas aeruginosa is. Bij de patiënten waar Pseudomonas aeruginosa duidelijk aanwezig is, bestaat er nog een onderverdeling in 2 vormen; de mucoïde en de niet-­‐mucoïde vorm. De mucoïde vorm heeft de slechtste overlevingsprognose. In centra die patiënten met CF behandelden werd gezien dat deze patiënten soms dezelfde Pseudomonas, die al immuniteit had opgebouwd tegen antibiotica (AB), overdroegen op elkaar; wat veelal resulteerde in een slechte afloop. In andere studies werd gezien dat er niet altijd een direct verband was tussen de gezondheidstoestand IX van de patïent en de aanwezigheid van bepaalde bacteriën. Hierdoor werd afgestapt van het principe om de behandeling met AB, om resistentie te vermijden, zoveel mogelijk in te perken en geeft men voortaan het liefst een combi van verschillende AB. Deze aanpak lijkt momenteel wel te werken, maar voor hoe lang nog is echter de vraag. Bij CF-­‐ patiënten worden verscheidene bacteriën aangetroffen en de laatste jaren zijn er steeds meer soorten in kaart gebracht. Zo zijn er in deze context studies verricht naar de onderlinge invloed van verschillende bacteriën bij fruitvliegen. Hieruit is gebleken dat de resistentie tegen AB kan doorgegeven worden tussen bacteriën via onderlinge communicatie. Wetenschappers uit dat onderzoeksdomein proberen deze onderlinge bacteriële interacties momenteel in kaart brengen. Uit deze resultaten kunnen dan eventueel nieuwe, gerichtere, behandelingen voortkomen. De behandeling van CF wordt samengevat in 3 periodes: Het pre-­‐Pseudomonas tijdperk tot ongeveer 1975 waarbij vnl. Staphylococcus aureus werd behandeld, dan het Pseudomonas tijdperk van 1975-­‐2005 waarbij vnl. op de AB-­‐behandeling van Pseudomonas werd gefocust en dan van 2005 tot heden: het Pseudomonas 2.0 tijdperk, waarbij wordt gekeken welke andere bacteriën zoal nog kunnen betrokken zijn bij CF en of de behandeling hiervoor gefinetuned kan worden. X
