De rol van PHF6 in acute T‐cel leukemie
advertisement
Faculteit Bio‐ingenieurswetenschappen Academiejaar 2014 – 2015 De rol van PHF6 in acute T‐cel leukemie Renate De Smedt Promotors: Prof. dr. ir. Winnok H. De Vos dr. Pieter Rondou Tutors: dr. Pieter Rondou Tom Sieprath Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de bio‐ingenieurswetenschappen cel‐ en genbiotechnologie De auteur en de promotors geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie. Promotors Prof. dr. ir. Winnok H. De Vos dr. Pieter Rondou Auteur Renate De Smedt Universiteit Gent juni 2015 i ii Voorwoord Het befaamde ‘thesisjaar’, het was werkelijk een jaar om U tegen te zeggen. Na een eerste kennismakend gesprek over het onderwerp met Pieter Rondou, mijn tutor en tevens promotor, was ik meteen verkocht: ik zou mijn thesisjaar doorbrengen in samenwerking met het CMGG, het Centrum Medische Genetica Gent, waar ik de functie zou onderzoeken van een tumorsuppressor in T‐ALL. Tien maanden lang heeft dit ene eiwit, PHF6, me weten te intrigeren. Uiteraard draait het niet enkel om dit ene eiwit, en is het net de interactie tussen verschillende pathways en de coöperativiteit tussen zowel genetische als epigenetische defecten die de zoektocht naar de ontbrekende puzzelstukken in het ziektebeeld van acute T‐cel leukemie zo boeiend maakt. Gedurende dit jaar heb ik heel wat bijgeleerd: zelfstandigheid, accuraatheid, een kritische geest en vooral ... GEDULD! Wetenschappelijk onderzoek is een proces van vallen en opstaan, dat kan ik na dit jaar beamen. Maar het gevoel van vreugde en voldoening bij een goed resultaat na een tijd van trial and error, was des te groter. Deze thesis kon niet verwezenlijkt worden zonder een heleboel mensen. Vooreerst wil ik mijn promotor en tutor Pieter Rondou bedanken. Hij heeft me veel bijgeleerd en stond steeds klaar met raad en daad, met de nodige schouderklop en met de occasionele motivational speech waar nodig. Ook professor Winnok De Vos, mijn promotor, wil ik bedanken, om altijd een oplossing te bieden bij problemen en om me steeds te laten streven naar betere resultaten. Graag wil ik ook Tobias Corne en Tom Sieprath van de vakgroep CSI bedanken, die steeds paraat stonden wanneer ik kwam aankloppen met een vraag over het labowerk. Ook Jolien De Wyn van het CMGG verdient een woordje van dank: bedankt voor de leuke gesprekken in het labo en de hulp bij het labowerk! Mijn ouders en broers mogen zeker niet in het rijtje ontbreken, bij hen kon ik steeds de nodige steun en toeverlaat vinden. Mijn kotgenoten Leen en Sophie wil ik bedanken voor hun steun, vriendschap en luisterend oor. De dagen die ik op kot kwam en niet over mijn thesis vertelde, waren eerder schaars. Ook mijn medestudente Marlies Verschuuren verdient een speciaal plaatsje in dit dankwoord. Bij haar kon ik steeds terecht voor de nodige babbel, het nodige duwtje in de rug en onvoorwaardelijke vrienschap. Ook wil ik graag de onbekende Nederlander bedanken die me bevrijdde uit de weefselkweek, toen de deur plots op slot werd gedaan wanneer ik nog in het labo aan het werk was. Zo ook bleek op een avond mijn badge niet langer te werken in het MRB, waardoor ik mezelf buitengesloten had en contactmiddelen zoals een GSM binnen had gelaten. Na wat ronddolen in de gangen van het MRB, kwam plots een tot nog toe niet‐geïdentificeerde Indiër uit een deur op de eerste verdieping: daar was mijn redding! Aan deze persoon dus ook: dank u! Tot slot wil ik ook de lezers van dit werkstuk bedanken, en ook aan iedereen die me dit jaar geholpen en gesteund heeft, zeg ik graag een welgemeende DANK U! iii iv Samenvatting T‐cel acute lymfatische leukemie (T‐ALL) is een agressieve bloedkanker die ontstaat door oncogene transformatie van voorloper T‐cellen. T‐ALL wordt veroorzaakt door een samenwerking tussen meerdere genetische en epigenetische defecten, die onder andere leiden tot differentiatie‐arrest, defecten in de celcycluscontrole en een ongelimiteerde zelfvernieuwingscapaciteit. In 2010 werd ‘plant homeodomain finger 6’ (PHF6) geïdentificeerd als een belangrijk X‐gelinkt tumorsuppressorgen in T‐ALL. De exacte functie van PHF6 is nog niet gekend, al wijzen preliminaire data op een mogelijke rol in DNA‐schadeherstel en in de celcyclus. In deze thesis werd onderzoek verricht naar de rol van PHF6 in deze belangrijke cellulaire processen aan de hand van drie onderzoeksluiken. Via immunofluorescentiemicroscopie werd inzicht verkregen in een mogelijke rol van PHF6 in DNA‐ schadeherstel, flowcytometrie verschafte informatie over een mogelijke rol in de celcyclus en via micro‐irradiatie experimenten werd onderzocht of PHF6 wordt gerekruteerd naar DNA‐schade. In een eerste luik werd onderzocht of PHF6‐inactivatie een invloed had op cellulaire DNA‐ schadeniveaus of DNA‐schadeherstel. DNA‐schade (basaal of geïnduceerd via genotoxische agentia) werd gevisualiseerd via immunofluorescente kleuring en microscopische analyse van ɣH2AX‐foci, een merker voor dubbelstrengige DNA‐breuken. Opdat schadeniveaus via ɣH2AX‐assays konden gekwantificeerd worden in T‐ALL cellen, diende het protocol voor de immunofluorescentiekleuring van T‐ALL suspensiecellen geoptimaliseerd te worden. Dit werd tijdens deze masterscriptie met succes volbracht. Met behulp van dit protocol werden ɣH2AX‐assays uitgevoerd in (PHF6‐wildtype) controle versus PHF6‐knockdown cellen, en dit voor verschillende cellijnen. In humane fibroblasten (NHDF) bleek de neerregulatie van PHF6 geen effect te hebben op het DNA‐schadeniveau na behandelen met een genotoxisch agens. In de T‐ALL cellijnen Jurkat en ALL‐SIL daarentegen werden in etoposide‐ behandelde cellen hogere schadeniveaus gekwantificeerd na neerregulatie van PHF6. In de ALL‐SIL cellijn werd tevens een trager DNA‐schadeherstel vastgesteld in PHF6‐neergereguleerde cellen ten opzichte van PHF6 wildtype cellen. Deze resultaten suggereren dat PHF6 inderdaad een rol speelt in DNA‐schade respons en/of herstel en mogelijks is deze functie cellijnspecifiek. Micro‐irradiatie experimenten in de HEK293T GFP‐PHF6 cellijn toonden aan dat PHF6 waarschijnlijk niet rechtstreeks deel uitmaakt van het DNA‐schadeherstelapparaat aangezien er geen relokalisatie van PHF6 naar plaatsen van DNA‐schade werd opgemerkt. In deze thesis werd tevens de mogelijke rol van PHF6 in de celcyclus bestudeerd via flowcytometrie. In deze experimenten kon geen verschil worden opgemerkt in celcyclusdistributie tussen PHF6‐wildtype en PHF6‐knockdown cellen. Wel was een lichte trend waar te nemen wanneer cellen behandeld werden met celcyclusverstorende compounds zoals etoposide en olaparib: de T‐ALL cellijnen ALL‐SIL en MOLT4 vertoonden na PHF6‐kncokdown een lichte stijging in de fracties cellen die aanwezig waren in de S‐fase en/of de G2/M‐fase van de celcyclus. PHF6 zou dus mogelijks een rol kunnen spelen in regulatie tijdens deze fasen. Tijdsgebonden opnames van HEK293T GFP‐PHF6 cellen toonden aan dat (GFP‐)PHF6 tijdens de mitose interageert met de chromosomen. Het zou dus kunnen dat PHF6 eveneens een rol speelt in epigenetische regulatie tijdens de mitose. v vi Abstract T‐cell acute lymphocytic leukemia (T‐ALL) is an aggressive blood cancer which is caused by oncogenic transformation of immature thymocytes. T‐ALL results from multiple cooperative genetic and epigenetic defects. These defects can lead to differentiation arrest, defects in cell cycle control and unlimited self‐renewal capacity. In 2010, the plant homeodomain finger 6 (PHF6) gene was identified as an important X‐linked tumor suppressor gene in T‐ALL. The exact functions of PHF6 and its link to T‐ ALL are not yet known, but preliminary data point to a possible role in DNA damage repair and cell cycle regulation. In this thesis, the role of PHF6 in these important cellular processes was investigated by means of three research parts. Via immunofluorescence microscopy insight was obtained in a possible role of PHF6 in DNA damage repair, flow cytometry provided information about a possible role in the cell cycle and through micro‐irradiation experiments, it was examined whether PHF6 is recruited to DNA‐damage. In the first part, we explored whether PHF6 inactivation had an effect on cellular DNA damage levels or DNA damage repair. DNA damage (basal or induced by genotoxic agents), was visualized by immunofluorescence staining and microscopic analysis of ɣH2AX foci, a marker for DNA double‐strand breaks. Before DNA damage levels could be quantified in T‐ALL cells, the protocol for the immunofluorescent staining of ɣH2AX foci in T‐ALL suspension cells needed to be optimized. This was successfully accomplished during this master thesis. Using this protocol, ɣH2AX assays were performed in both (PHF6 wildtype) control and PHF6 knockdown cells, and this in different cell lines. In human fibroblasts (NHDF), the downregulation of PHF6 appeared to have no effect on DNA damage levels after treatment with a genotoxic agent. In the T‐ALL cell lines Jurkat and ALL‐SIL, however, higher damage levels were quantified in etoposide‐treated cells following downregulation of PHF6. Moreover, in the ALL‐SIL cell line, the rate of DNA damage repair was slower in PHF6 downregulated cells relative to control cells. These results suggest indeed a role of PHF6 in DNA damage response and/or repair in T‐ALL cells and possibly this function is cell type specific. Micro‐irradiation experiments in the HEK293T PHF6‐GFP cell line showed that PHF6 is probably not directly involved in the DNA damage repair machinery, as no recruitment of PHF6 towards sites of DNA damage could be observed. In this thesis, the possible role of PHF6 in the cell cycle was studied using flow cytometry. These cell cycle experiments showed no difference in cell cycle distribution between PHF6 wildtype and PHF6 knockdown cells. However, a trend emerged when cells were treated with cell cycle disturbing compounds such as etoposide and olaparib: upon PHF6 knockdown, the T‐ALL cell lines ALL‐SIL and MOLT4 showed a slight increase in the fraction of cells present in the S phase and/or the G2/M phase of the cell cycle. PHF6 could therefore possibly play a role in regulation during these phases. Time‐ lapse imaging of HEK293T PHF6‐GFP cells showed that (GFP‐)PHF6 interacts with the chromosomes during mitosis. Therefore, it is possible that PHF6 also plays a role in epigenetic regulation during mitosis. vii viii Inhoudsopgave Voorwoord ..............................................................................................................................................iii Samenvatting............................................................................................................................................v Abstract .................................................................................................................................................. vii Lijst met afkortingen ............................................................................................................................... xi 1 Inleiding ........................................................................................................................................... 1 1.1 1.1.1 Hematopoëse .................................................................................................................. 1 1.1.2 T‐lymfocyten.................................................................................................................... 2 1.2 Leukemie ................................................................................................................................. 4 1.2.1 Soorten leukemie en hun incidentie ............................................................................... 4 1.2.2 T‐cel acute lymfatische leukemie .................................................................................... 5 1.3 PHF6 als nieuwe tumorsuppressor in T‐ALL .......................................................................... 12 1.3.1 Mutaties in PHF6 in T‐ALL en andere ziekten................................................................ 12 1.3.2 PHF6: structuur, functie en defecten ............................................................................ 12 1.3.3 De mogelijke rol van PHF6 in DNA‐herstelmechanismen ............................................. 13 1.3.4 Therapeutische perspectieven ...................................................................................... 17 1.4 2 Immuunsysteem ...................................................................................................................... 1 Doel van deze scriptie ........................................................................................................... 18 Materiaal en methoden ................................................................................................................ 19 2.1 Celcultuur .............................................................................................................................. 19 2.1.1 Karakterisatie cellijnen .................................................................................................. 19 2.1.2 Onderhoud .................................................................................................................... 19 2.2 Compound behandeling ........................................................................................................ 20 2.3 Immunofluorescentiekleuring ............................................................................................... 21 2.3.1 Adherente cellen ........................................................................................................... 21 2.3.2 Suspensiecellen ............................................................................................................. 22 2.4 PHF6‐neerregulatie ............................................................................................................... 23 2.4.1 Transfectie ..................................................................................................................... 23 2.4.2 Transductie .................................................................................................................... 25 2.4.3 Bepalen van het knockdown niveau .............................................................................. 25 2.5 Microscopie ........................................................................................................................... 26 2.6 Data‐analyse .......................................................................................................................... 27 2.7 Celcyclusanalyse via flowcytometrie..................................................................................... 27 2.7.1 Propidium iodide staining ............................................................................................. 28 2.7.2 FlowJo ............................................................................................................................ 29 ix 2.8 3 Resultaten...................................................................................................................................... 31 3.1 Validatie van ɣH2AX‐kwantificatie in adherente cellen ........................................................ 31 3.2 Translatie naar T‐ALL suspensiecellen ................................................................................... 33 3.2.1 Optimalisatie immunofluorescentiekleuringsprotocol voor T‐ALL suspensiecellen ..... 33 3.2.2 Validatie van ɣH2AX‐kwantificatie in T‐ALL suspensiecellen ........................................ 37 3.3 PHF6‐neerregulatie heeft geen effect op DNA‐schadeniveaus in fibroblasten ............ 38 3.3.2 PHF6‐neerregulatie induceert hogere schadeniveaus in T‐ALL cellen .......................... 39 Het effect van PHF6‐neerregulatie op celcycluspropagatie .................................................. 43 3.4.1 Celcyclusanalyse in onbehandelde cellen ..................................................................... 43 3.4.2 Celcyclusanalyse in cellen behandeld met celcyclusverstorende compounds ............. 44 3.5 5 Effect van PHF6‐inactivatie op DNA‐schadeniveaus en DNA‐schadeherstel ........................ 38 3.3.1 3.4 4 Micro‐irradiatie experimenten .............................................................................................. 30 Spatio‐temporele lokalisatie van (GFP‐)PHF6 ....................................................................... 49 3.5.1 Basale lokalisatie ........................................................................................................... 49 3.5.2 Tijdsgebonden lokalisatie .............................................................................................. 49 3.5.3 Lokalisatie na DNA‐schade inductie .............................................................................. 50 Discussie ........................................................................................................................................ 53 4.1 Invloed van PHF6‐neerregulatie op DNA‐schadeniveaus en herstel..................................... 53 4.2 Het effect van PHF6‐inactivatie op celcycluspropagatie ....................................................... 54 4.3 Spatio‐temporele lokalisatie van PHF6 ................................................................................. 55 Conclusies en toekomstperspectieven .......................................................................................... 57 Referenties ............................................................................................................................................ 59 Bijlage .................................................................................................................................................... 63 ɣH2AX‐kwantificatie in PHF6‐knockdown cellen ............................................................................... 63 Enkelvoudige transfectie in NHDF cellen ...................................................................................... 63 Herstelkinetiek in PHF6‐knockdown ALL‐SIL cellen ....................................................................... 64 Celcyclus experimenten .................................................................................................................... 65 Western blot data en knockdown niveaus .................................................................................... 65 x Lijst met afkortingen ALL AML APC ATM ATR B‐ALL BER BFLS CD CDK CLL CLSM CML DMEM DN / DP thymocyt DNA‐PKcs ETP‐ALL FBS FISH GSI HR IL‐2 MHC NHEJ NK‐cellen NLS NTC NuRD PARP PBS PEI PFA PHD PHF6 PI PIKK PRC2 ROS RPA RPMI RT‐PCR T‐ALL TBST TCR Th1 / Th2 UBF acute lymfatische leukemie acute myeloïde leukemie antigeenpresenterende cellen ataxia telangiectasia, mutated ATM and Rad3-related B‐cel acute lymfatische leukemie base excision repair Börjeson‐Forssman‐Lehman syndroom cluster of differentiation cyclin-dependent kinase chronische lymfatische leukemie confocale laser scan microscoop chronische myeloïde leukemie Dulbecco’s modified Eagle medium dubbel negatieve / positieve thymocyt DNA-dependent protein kinase, catalytic subunit early T-cell precursor acute lymfatische leukemie foetaal bovien serum fluorescent in situ hybridisation ɣ‐secretase inhibitoren homologe recombinatie interleukine 2 major histocompatibility complex non-homologous end joining Natural Killer-cellen nucleaire lokalisatie‐sequentie non targeting control nucleosome-remodeling and histone deacetylation poly‐ADP‐ribose‐polymerase phosphate buffered saline polyethyleenimine paraformaldehyde plant homeodomain plant homeodomain finger 6 propidium iodide phosphoinositide 3‐kinase related kinases polycomb repressive complex 2 reactive oxygen species replication protein A Roswell Park Memorial Institute reverse transcription polymerase chain reaction T-cel acute lymfatische leukemie tris-buffered saline and tween 20 T-cel receptor T‐helper 1 cel / T‐helper 2 cel upstream binding factor xi xii 1 Inleiding Leukemie is een verzamelnaam voor verschillende vormen van bloedkanker. De ziekte ontstaat wanneer bloedcellen zich op een ongecontroleerde manier beginnen te vermenigvuldigen. T‐cel acute lymfatische leukemie (T‐ALL) is een vorm van leukemie waarbij zowel genetische als epigenetische defecten bijdragen tot de transformatie van gezonde voorloper T‐cellen tot leukemische T‐cellen. De behandeling van T‐ALL bestaat nog voornamelijk uit chemotherapie, waarmee sterke neveneffecten gepaard gaan. Daarom is het belangrijk een beter inzicht in de genetica van T‐ALL te verwerven, om op deze manier doelgerichte therapieën te ontwikkelen. Een aantal jaar geleden werd ontdekt dat mutaties in ‘plant homeodomain finger 6 (PHF6)’ frequent voorkomen in T‐ALL patiënten. De specifieke rol van PHF6 is echter nog niet gekend en wordt in deze masterscriptie onderzocht. In dit eerste deel van de thesis wordt dieper ingegaan op de biologische achtergrond van leukemie. De bloedvorming en T‐celvorming worden uitgelegd, waarna wordt toegelicht waar het fout gaat bij het ontstaan van T‐cel acute lymfatische leukemie. Vervolgens worden aanwijzingen gegeven voor de mogelijke functies van PHF6 en worden een aantal pathways uitgelegd waarin PHF6 een rol zou kunnen spelen. 1.1 Immuunsysteem 1.1.1 Hematopoëse Het menselijk immuunsysteem is het geheel aan fysiologische mechanismen die ons lichaam verdedigen tegen indringers. Dit verdedigingsmechanisme valt op te delen in aangeboren en verworven immuniteit. Het aangeboren immuunsysteem zorgt voor snelle aspecifieke reacties tegen indringers, onafhankelijk van eventueel vorig contact. De verworven immuniteit daarentegen zorgt met behulp van lymfocyten, een type witte bloedcellen, voor zeer specifieke reacties tegen indringers. Deze specifieke herkenning gebeurt via oppervlaktereceptoren aanwezig op de lymfocyten 1. Alle bloedcellen ontstaan, via een proces dat hematopoëse wordt genoemd, uit een gemeenschappelijke voorlopercel in het beenmerg, nl. de pluripotente hematopoëtische stamcel. Hieruit ontstaan gemeenschappelijke myeloïde en lymfoïde voorlopercellen. Uit de myeloïde lijn ontstaan de granulocyten, dendritische cellen, macrofagen, mastcellen, bloedplaatjes en rode bloedcellen. De lymfoïde lijn geeft aanleiding tot B‐lymfocyten, Natural Killer‐cellen (NK‐cellen) en T‐ lymfocyten. Figuur 1 geeft een overzicht van de hematopoëse weer 2. 1 Figuur 1 Overzicht van de hematopoëse. Hematopoëtische stamcellen geven via een myeloïde en een lymfoïde lijn het ontstaan aan de cellulaire elementen van het bloed 2. 1.1.2 T‐lymfocyten 1.1.2.1 T‐lymfocyt ontwikkeling T‐lymfocyten (of T‐cellen) ontstaan uit voorlopercellen van het beenmerg die migreren naar en matureren in de thymus. Uit deze voorlopercellen kunnen intrathymische dendritische cellen ontstaan evenals α:β en ɣ:δ T‐cellen. De meeste progenitorcellen worden omgevormd tot α:β T‐cellen, wat hieronder wordt uitgelegd. De rijping van de lymfocyten gebeurt in de thymus van de cortex naar de medulla, zoals te zien is in Figuur 2. Differentiatie, proliferatie en expressie van de eerste T‐cel specifieke oppervlaktemoleculen zoals CD2 gebeurt na interactie met het stroma, het epitheliaal netwerk van de thymus. Aan het einde van deze fase ontstaan dubbel negatieve (DN) thymocyten. Deze thymocyten brengen noch CD4, noch CD8 tot expressie op hun oppervlak. Uit de DN cellen ontstaan de dubbel positieve (DP) thymocyten. Deze brengen CD4, CD8, de pre‐T‐cel receptor en later ook lage gehalten van de eigenlijke T‐cel receptor (TCR) tot expressie. Vervolgens gebeuren zowel een positieve als een negatieve selectie op hun vermogen om lichaamseigen peptiden in associatie met lichaamseigen major histocompatibility complex (MHC) moleculen te herkennen. Wanneer de receptoren van de T‐cel de lichaamseigen peptide:MHC‐complexen te goed herkennen ondergaan ze geprogrammeerde celdood (negatieve selectie). Positieve selectie zorgt ervoor dat rijpe T‐cellen bij voorkeur vreemde peptiden herkennen in associatie met lichaamseigen MHC‐moleculen. Ze zijn tolerant tegenover lichaamseigen peptide:MHC‐complexen. T‐cellen wiens receptoren op normale wijze binden, verliezen de expressie van ofwel CD4, ofwel CD8 en verhogen de expressie van de TCRα:β. Hierdoor ontstaan de enkelvoudig positieve thymocyten, die na rijping de thymus verlaten en migreren naar secundaire lymfoïde organen3. 2 Figuur 2 T-cel ontwikkeling in de thymus. Uit de lymfoïde progenitorcel ontstaan dubbel negatieve (DN) thymocyten (CD4-/CD8-). Deze worden verdeeld in vier stadia naargelang de expressie van de oppervlaktemerkers CD25 en CD44. Hieruit ontstaan dubbel positieve (DP) thymocyten (CD4+/CD8+). Deze matureren na selectie finaal in enkelvoudig positieve thymocyten (CD4+/CD8- of CD4-/CD8+). De mature naïeve thymocyten worden uiteindelijk in de medulla aangetroffen en verlaten de thymus, waarna ze migreren naar perifere lymfoïde organen 3. 1.1.2.2 T‐cel receptor ontwikkeling De structuur van T‐cel receptoren is vrij gelijkaardig aan deze van antilichamen (Figuur 3A). Beiden bezitten lichte en zware ketens en bindingsplaatsen voor antigenen. T‐cel receptoren bestaan uit een N‐terminaal variabel domein (V‐domein), een constant domein (C‐domein), een transmembranair domein en een C‐terminaal cytoplasmatisch domein. Twee peptideketens (α en β of ɣ en δ) worden met elkaar verbonden door een disulfidebrug in het C‐domein. Zo ontstaat een stabiel heterodimeer met een groeve gevormd door de twee V‐domeinen. Het V‐domein valt op te splitsen in een hypervariabel gebied, ook wel het complementariteitsbepalend gebied (CDR; complementaritydetermining region) genoemd, en de framework region (FR gebied), dat uit een meer constante aminozuursequentie bestaat. Ter hoogte van het CDR‐gebied binden de peptidefragmenten 4. De vier peptiden α, β, ɣ en δ worden gecodeerd door drie genenfamilies die lijken op deze van de lichte en zware ketens van immunoglobulinen. Er zijn drie loci: TCR‐locus ɣ, TCR‐locus β en TCR‐locus αδ. De TCR‐genen vertonen variabele (V) segmenten, diversity (D) segmenten, joining (J) segmenten en constante (C) segmenten. β‐ en δ‐keten loci bevatten V, D en J segmenten terwijl α‐ en ɣ‐keten loci enkel V en J segmenten bezitten 4, 5 . Om een grote antigene diversiteit te bekomen met relatief eenvoudige genetica, gebeurt tijdens de TCR‐ontwikkeling somatische recombinatie, zoals te zien is in Figuur 3B. Hierbij worden genen uit soortgelijke genenclusters herschikt om eiwitten te genereren met een verschillende antigene activiteit. Zo wordt in ontwikkelende T‐cellen het heterodimeer (α:β of ɣ:δ) gevormd door herschikkingen van V‐D‐J segmenten (bij vorming van de zware ketens TCRβ of TCRδ) of V‐J segmenten (bij vorming van de lichte ketens TCRα of TCRɣ) 6. 3 Figuur 3 (A) Vergelijking tussen een antilichaam en een T-cel receptor. Beiden bezitten variabele en constante regio’s. Antilichamen hebben twee bindingsplaatsen voor antigenen, terwijl T-cel receptoren er slechts een bezitten. T-cel receptoren zitten steeds verankerd aan hun celmembraan 4. (B) Somatische recombinatie tijdens TCRα:β ontwikkeling. Het bovenste gedeelte van de figuur stelt de vorming van de lichte α-keten voor. Een Vα segment wordt herschikt aan een Jα segment om een functioneel V-regio exon te creëren. Transcriptie en splicing van het VJα exon aan Cα genereren het mRNA dat vertaald wordt om een T-cel receptor α-keten eiwit te genereren. Het onderste gedeelte van de figuur toont de vorming van de zware β-keten. Het variabel domein wordt gecodeerd door drie gensegmenten, Vβ, Dβ en Jβ. Herschikkingen van deze gensegmenten genereren een functioneel VDJβ-regio exon dat wordt afgeschreven en gespliced om dit exon vervolgens te binden aan Cβ. Het resulterende mRNA wordt vertaald in de T-cel receptor β-keten. Na de biosynthese van de twee peptiden wordt de α:β receptor heterodimeer gevormd met behulp van een disulfidebrug 5. 1.1.2.3 Soorten T‐lymfocyten en functies Naïeve T‐cellen worden geactiveerd en differentiëren zich tot effector T‐cellen wanneer zij in het bloed hun specifiek antigeen tegenkomen in de vorm van een peptide:MHC‐complex op het oppervlak van professionele antigeenpresenterende cellen (APC) zoals B‐cellen, dendritische cellen en macrofagen. Er bestaan verschillende klassen effector T‐cellen: (1) cytotoxische T‐cellen, die geïnfecteerde cellen aanvallen en vernietigen en (2) T‐helpercellen, die de aanmaak van antilichamen door B‐cellen activeren. Naast effector T‐cellen zijn er ook regulatorische T‐cellen. Deze zorgen ervoor dat de afweerreactie niet uit de hand loopt via communicatie met andere cellen van het immuunsysteem zoals macrofagen en dendritische cellen. Tot slot zijn er nog T‐geheugencellen, die gevormd worden bij de eerste afweerreactie. Wanneer een organisme later dezelfde infectie krijgt, zal de immuunrespons sneller op gang gebracht kunnen worden 4, 5. 1.2 Leukemie 1.2.1 Soorten leukemie en hun incidentie Leukemie is een verzamelnaam voor verschillende vormen van bloedkanker en ontstaat wanneer mature of immature bloedcellen op een ongecontroleerde manier in het bloed of weefsels zoals het beenmerg of de thymus beginnen te vermenigvuldigen. Wereldwijd is leukemie de elfde meest voorkomende kanker en wordt het frequentst vastgesteld bij mensen met een leeftijd tussen 75 en 84 jaar 7. Jaarlijks krijgen 16,7 op 100000 mannen en 10,2 op 100000 vrouwen deze ziekte 8. 4 Leukemie kan enerzijds geclassificeerd worden naargelang het type bloedcel dat zich abnormaal vermenigvuldigt (lymfatisch of myeloïd) en anderzijds naargelang de snelheid waarmee de ziekte vordert (acuut of chronisch) 9. Op basis van deze indeling worden volgende groepen onderscheiden: acute lymfatische leukemie (ALL), chronische lymfatische leukemie (CLL), acute myeloïde leukemie (AML) en chronische myeloïde leukemie (CML). Figuur 4 geeft info over de percentages van voorkomen van deze verschillende types. Acute leukemieën worden gekenmerkt door een snelle stijging in het aantal immature bloedcellen (blastcellen) die niet verder differentiëren. Hierdoor kan het beenmerg niet langer gezonde bloedcellen produceren. Door de snelle progressie van de ziekte en een accumulatie van maligne cellen, is onmiddellijke behandeling vereist 10. De incidentie van AML stijgt met de leeftijd. ALL komt minder vaak voor en kent een bimodaal incidentieverloop, met een eerste incidentiepiek tussen de 4 en 14 jaar en een tweede piek bij volwassenen boven de 50 jaar oud 11. ALL kent een lagere incidentie dan AML, maar is de meest voorkomende vorm van leukemie bij kinderen 12. Chronische leukemieën worden gekenmerkt door ophoping van abnormale mature bloedcellen die onvoldoende worden afgebroken en bijgevolg prolifereren in het bloed en beenmerg 13 . CLL is de meest voorkomende leukemie in de westerse wereld. Personen die blootgesteld werden aan een hoge dosis straling hebben een grotere kans op het krijgen van CML 14. Andere 11% CML 10% ALL 13% AML 30% CLL 35% Figuur 4 Percentages van het voorkomen van verschillende types leukemie van alle leeftijden samen 15. ‘Andere’ leukemieën zijn de minder vaak voorkomende types leukemie zoals haarcelleukemie en grote granulaire lymfocytische leukemie. Verhoudingen van de incidentiecijfers van patiënten onder de 20 jaar zijn erg verschillend. In deze leeftijdscategorie ontwikkelt maar liefst meer dan 75% ALL 8. 1.2.2 T‐cel acute lymfatische leukemie ALL kan verder opgedeeld worden in twee groepen: B‐cel en T‐cel acute lymfatische leukemie (B‐ALL en T‐ALL). Deze vormen van leukemie worden gekenmerkt door zowel genetische als epigenetische aberraties in de differentiatie van B‐ en T‐voorlopercellen 16. In deze thesis wordt verder gefocust op T‐ALL. 1.2.2.1 Incidentie, symptomen en diagnose Jaarlijks ontwikkelen 1,5 op 100000 personen acute lymfatische leukemie 17. Van de pediatrische ALL‐ patiënten heeft 10‐15% T‐ALL. Bij volwassenen bedraagt dit 25% 18, 19. Er wordt een hogere incidentie 5 vastgesteld bij mannen dan bij vrouwen (ratio 3:1) 20, 21 . T‐ALL patiënten hebben een groot aantal blastcellen in het beenmerg en het bloed. Ook zijn vergrotingen van mediastinale lymfeknopen en betrokkenheid van het centraal zenuwstelsel waar te nemen. Andere symptomen zijn vermoeidheid, kortademigheid, bot‐ en gewrichtspijn, gewichtsverlies, koorts en bloedingen 18, 19. Diagnose van T‐ ALL kan gebeuren via chromosoomanalyse en flowcytometrie op bloed‐ en beenmergstalen. De vorm van bloedcellen wordt bekeken en het percentage blastcellen in het beenmerg wordt bepaald; patiënten met T‐ALL worden gekenmerkt door een hoog percentage blastcellen. RT‐PCR en fluorescence in-situ hybridisation (FISH) kunnen gebruikt worden om wijzigingen in het DNA en fusietranscripten te detecteren. Via genexpressie‐analyse kan info verkregen worden over aberrante genen of signaalwegen die bepalend zijn voor de klinische uitkomst 22. 1.2.2.2 Subtypes en hun (epi)genetische kenmerken T‐cel acute lymfatische leukemie is een ziekte die veroorzaakt wordt door zowel genetische als epigenetische alteraties in hematopoëtische precursorcellen die leiden tot diverse veranderingen. De genetische veranderingen kunnen onderverdeeld worden in vier grote klassen naargelang het proces dat ze verstoren: een aangetaste differentiatie, defecten in de celcyclus, mutaties die leiden tot immortalisatie en mutaties die een proliferatief en overlevingsvoordeel geven 19. De mutaties in de verschillende klassen werken coöperatief samen bij de transformatie van een normale thymocyt tot leukemische T‐cel in overeenstemming met het paradigma van meerstaps oncogenese volgens Vogelstein en Kinzler 23. Deze vier genetische subtypes en hun onderlinge samenwerking tonen aan dat T‐ALL een zeer heterogene ziekte is. Figuur 5 geeft de belangrijkste genotypes van B‐ALL en T‐ALL weer bij kinderen en volwassenen 24. De verschillende subtypes worden in onderstaande paragrafen meer in detail besproken. Figuur 5 Geschatte frequenties van de specifieke ALL-genotypes. Links worden de frequenties van de genetische aberraties in kinderen weergegeven, rechts zijn de cijfers voor volwassenen terug te vinden. De genetische laesies die enkel in T-ALL teruggevonden worden, zijn aangeduid in het paars. De andere genotypes worden geobserveerd in B-ALL 24. 6 1.2.2.2.1 Differentiatie-arrest door defecten in specifieke transcriptiefactoren Tijdens de ontwikkeling van T‐cellen vinden genomische herschikkingen in de TCR‐locus plaats (zie 1.1.2.2). Door illegitieme recombinatie kunnen promotor‐ en enhancerregio’s van TCR‐genen in de nabijheid geplaatst worden van belangrijke transcriptiefactor‐coderende genen. Daardoor kunnen transcriptiefactoren zoals TLX1, TLX3, TAL1,... tot overexpressie komen en een oncogeen effect veroorzaken door het induceren van differentiatie‐arrest in welbepaalde fasen van de T‐ celontwikkeling (zie Figuur 6). Early T-cell precursor (ETP)‐ALL is een type leukemie dat gekenmerkt wordt door een zeer vroeg stilvallen van de T‐cel ontwikkeling 25. Vroege T‐cel precursoren zijn cellen die nog steeds kunnen ontwikkelen tot zowel α:β of ɣ:δ T‐cellen en dus stamcel‐achtige eigenschappen vertonen 26 . De typische genetische afwijkingen die normaal voorkomen in T‐ALL, zoals CDKN2A/B‐deleties en activerende mutaties in NOTCH1 (zie 1.2.2.2.2 en 1.2.2.2.3) komen minder voor in ETP‐ALL 27. ETP‐ALL vertoont unieke genetische en transcriptionele kenmerken die overlappen met zowel de kenmerken van T‐ALL als met deze van AML en kent tot nu toe een slechtere prognose dan deze van andere T‐ALL subtypes 28. Figuur 6 Correlatie tussen overexpressie van subgroepspecifieke oncogenen en stadia van differentiatie-arrest. LYL1+ gevallen tonen maturatie-arrest in het dubbelnegatief stadium van de thymocyt-differentiatie. TLX1+ en TLX3+ gevallen stoppen de ontwikkeling in het vroeg-corticaal stadium. In TAL1+ gevallen differentiëren de leukemische cellen tot het laatcorticaal stadium 19. 1.2.2.2.2 Defecten in de celcyclus Progressie doorheen de celcyclus wordt strikt gecontroleerd. Defecten in deze controlepunten kunnen leiden tot tumorigenese of tot apoptose, afhankelijk van de ernst en oorzaak van de defecten 29. Figuur 7 toont een schematische voorstelling van de celcyclus. Mitogene signalen induceren interactie tussen cyclines en cycline‐afhankelijke kinases (CDK; cyclin-dependent kinases) waardoor actieve cycline‐CDK complexen gevormd worden. Deze complexen zullen eiwitten downstream (zoals RB1) fosforyleren waardoor de celcyclus kan verdergaan en worden geïnhibeerd door o.a. INK4 eiwitten 19. 7 Figuur 7 Schematische voorstelling van een aantal controlepunten in de celcyclus. Mitogene signalen zullen de interactie tussen cyclines en cycline-afhankelijke kinases (CDK) initiëren en activeren. Deze cycline-CDK complexen veroorzaken fosforylatie van de celcyclusinhibitor en tumorsuppressor RB1. Bijgevolg kan RB1 de celcyclus niet langer inhiberen. De INK4 eiwitten (p15, p16, p18, p19), de KIP eiwitten (p27 en p57) en CIP (p21) inhiberen de activiteit van cycline-CDK complexen. Bij DNA-schade zal de expressie van TP53 (wat codeert voor p53) opgereguleerd worden. Vervolgens zal p53 de transcriptionele activatie van CDKN1A activeren, dit codeert voor p21. Deze CDK-inhibitor zal celcyclus-arrest veroorzaken waardoor DNAherstel of apoptose kan plaatsvinden. Eiwitten die mogelijks aberrante expressie vertonen wegens genetische defecten in TALL zijn weergegeven in het zwart 30. In maar liefst meer dan 70% van de T‐ALL patienten werden deleties gedetecteerd in chromosoomregio 9p21 31‐33 . CDKN2A en CDKN2B liggen in deze regio en worden hierdoor geïnactiveerd. CDKN2A codeert voor de INK4 eiwitten p14 en p16. Dit zijn twee regulatoren van de celcyclus: p16 inhibeert fosforylatie van RB1 en p14 activeert TP53 (zie Figuur 7). Bij grote deleties kan ook CDKN2B gedeleteerd worden. Dit gen codeert voor p15, eveneens een INK4 proteine 30. 1.2.2.2.3 Mutaties die leiden tot ongelimiteerde zelfvernieuwingscapaciteit Ongeveer de helft van de T‐ALL patiënten vertonen activerende mutaties in het NOTCH1‐gen 34 . NOTCH1 is een eiwit dat de zelfvernieuwing van hematopoëtische stamcellen reguleert, alsook celproliferatie en apoptose 35 . Het proteïne speelt ook een belangrijke rol in de keuze of een pluripotente progenitorcel zal ontwikkelen tot α:β T‐cel of ɣ:δ T‐cel 36 . NOTCH1 is een heterodimeer transmembranair eiwit dat bij activering gekliefd wordt tot ICN1 (intracellulair NOTCH1). Het actief ICN1 migreert naar de kern en functioneert als transcriptiefactor die de expressie reguleert van genen zoals het MYC oncogen en de transcriptionele repressor HES137. De NOTCH1‐signaalweg wordt weergegeven in Figuur 8. Naast activerende mutaties in NOTCH1 zelf of translocaties van NOTCH1 naar de TCRβ‐loci, kunnen ook inactiverende mutaties in FBXW7 (dat instaat voor de proteasomale afbraak van NOTCH1) en PTEN (zie hieronder) hyperactivatie van de NOTCH1‐signaalweg veroorzaken 38. 8 Figuur 8 De NOTCH1-signaalweg. De NOTCH1-receptoren worden geactiveerd wanneer liganden van de Delta/Serrate/Lag2 eiwitfamilie binden aan het extracellulair gedeelte van de receptor. Deze interactie triggert een cascade van proteolytische klievingen, eerst door ADAM10 en vervolgens door ɣ-sectretase complex. Dit resulteert in de vrijstelling van het intracellulair domein van NOTCH1 (ICN1 of NICD). ICN transloceert naar de kern om een complex te vormen met het CSL DNA-bindend eiwit en de MAML1 transcriptionele activator. Dit leidt tot transcriptionele activatie van verschillende doelwitgenen, zoals het MYC oncogen en de transcriptionele repressor HES1 39. Constitutieve activatie van NOTCH1 zorgt voor ongelimiteerde zelfvernieuwingscapaciteit van de T‐ cellen doordat dit eiwit een rol speelt in allerhande pathways die te maken hebben met celgroei en proliferatie. Zo kan NOTCH1 zorgen voor de activatie van de PI3K‐Akt‐mTOR pathway. Deze pathway staat in voor celgroei, proliferatie en overleving van de cel en wordt tegengewerkt door PTEN. NOTCH1 kan zorgen voor directe activatie van deze pathway via het p65lck tyrosine kinase alsook indirect via de neerregulatie van PTEN door HES1. NOTCH1 bevordert ook G1/S celcyclus progressie door de opregulatie van o.a. CDK4 en CDK6. De overleving en proliferatie van DN progenitorcellen wordt ook verhoogd doordat NOTCH1 de expressie van interleukine‐7 reguleert 37‐39. 1.2.2.2.4 Mutaties die een proliferatief en overlevingsvoordeel geven Opdat T‐cellen kunnen prolifereren, overleven en vervolgens deelnemen aan de immuunrespons, hebben ze de stimulans nodig van o.a. interleukine‐2 (IL‐2) . Vooraleer IL‐2 gevormd wordt, moet een lange TCR‐signaalweg doorlopen worden (Figuur 9). De TCR zelf bezit geen kinase‐activiteit en dus is de rekrutering van o.a. tyrosine kinases zoals LCK, FLT3, ABL1, JAK1/2 nodig 19. Constitutieve activatie van deze kinases of defecten in andere signaalmoleculen geassocieerd met groei en overleving van T‐ cellen, zoals RAS en NF1, werden vastgesteld in 30 tot 40% van de T‐ALL patiënten. Cellen kunnen een proliferatief en overlevingsvoordeel krijgen doordat defecten in bovenstaande genen kunnen leiden tot constitutieve mitogene signalen of een defecte signalisatie van apoptose. Indien dit nog eens gepaard gaat met mutaties van genen die de controle van de celcyclus regelen, kan dit leiden tot een snelle expansie van leukemische klonen 30. 9 Figuur 9 Overzicht van TCR-afhankelijke signaalwegen. De betrokkenheid van T-cel receptoren en costimulatoire CD28receptoren bevorderen signaalcascades van kinases en adaptoreiwitten (geel). Deze zetten pathways aan die resulteren in de activatie van de transcriptiefactoren NFATc (rood), NF-κB (groen) en AP-1 (blauw). Deze transcriptiefactoren werken samen gedurende de activatie van een aantal genen, waaronder IL-2 40. 1.2.2.2.5 Epigenetische oorsprong van T-ALL DNA is omwonden rond een histon‐octameer, samengesteld uit een (H3‐H4)2‐tetrameer gebonden aan twee (H2A‐H2B)‐dimeren. Samen met het linker‐histon H1 vormt dit geheel het nucleosoom, wat op zijn beurt een bouwsteen van chromatine is 41 . Post‐translationele covalente modificatie (zoals methylatie, acetylatie, fosforylatie, sumoylatie en ADP‐ribosylatie) van histonen en DNA‐methylatie reguleren processen als genexpressie en DNA‐schade respons 42. Deze modificaties van histonen en DNA vormen het epigenoom. Veranderingen in het epigenoom leiden tot een verandering in chromatinestructuur. Zo wordt bijvoorbeeld de trimethylatie van lysine 4 in histon 3 (H3K4me3) geassocieerd met een open chromatinestructuur (euchromatine) en transcriptionele activatie. De trimethylatie van lysine 9 in histon 3 daarentegen (H3K9me3) zorgt voor een gesloten chromatinestructuur (heterochromatine) en gaat gepaard met gene silencing. Dit zijn dynamische en reversibele processen die gemedieerd worden door twee soorten enzymcomplexen, nl. writer en eraser eiwitten (Figuur 10). De histonmodificaties kunnen enerzijds tot een rechtstreekse structuurverandering in chromatine leiden door ladingsveranderingen, anderzijds kunnen ze ook indirect bindingsplaatsen vormen voor reader/effector‐eiwitten. Deze eiwitten bevatten vaak een chromo‐ of bromodomein die epigenetische markeringen kunnen herkennen en vertalen in biologische gevolgen via interagerende eiwitten 43. Figuur 10 Writer, eraser en reader enzymen. Schematisch model van writer, eraser en reader enzymen die epigenetische merkers respectievelijk kunnen aanbrengen, verwijderen of lezen 43. 10 Het ontstaan en de progressie van kanker is een gemengd proces van genetische en epigenetische veranderingen 44, 45 . In verschillende writer en eraser enzymen zijn reeds mutaties en dysregulaties geïdentificeerd in immunodeficiëntiesyndromen, vaste tumoren, bloedkankers en neurologische ziekten 46, 47. 25% van de T‐ALL patiënten vertonen inactiverende mutaties in EZH2 en SUZ12. Deze genen coderen voor cruciale componenten van het polycomb repressive complex 2 (PRC2). PRC2 is een writer‐complex dat zorgt voor de trimethylatie van lysine 27 in histon 3 (H3K7me3) 48. Er werd ook een coöperatie vastgesteld tussen NOTCH1‐activatie en verlies van PRC2‐functie in de pathogenese van T‐ALL 49 . Andere epigenetische aberraties gelinkt met T‐ALL zijn defecten in het X‐gelinkt UTX‐gen, wat codeert voor een H3K27me3 demethylase en fusiecomplexen met MLL1 50,51 . MLL1, dat codeert voor een 48 H3K4me3 histon methyltransferase, vormt complexen met o.a. ENL . ENL is een subeenheid van het SWI/SNF remodeling complex, een ATPase dat bijdraagt tot de regulatie van gentranscriptie door het hermodelleren van de chromatinestructuur 52 . Het fusiecomplex MLL1‐ENL werkt samen met dit hermodelleringscomplex om de transcriptie van HOXA7 te activeren 53. De activatie van HOXA‐genen kan geplaatst worden in de klasse van genetische defecten in transcriptiefactoren (zie 1.2.2.2.1). Dit is een mooi voorbeeld van hoe genetische en epigenetische mechanismen samenwerken tijdens het ontstaan van kankers. 1.2.2.3 Prognose en behandeling Van alle T‐ALL patiënten bereiken ongeveer 80% van de kinderen en slechts 50% van de volwassenen langdurige remissie 12, 22 . Dit lagere percentage is te wijten aan een grotere heterogeniteit van genetische defecten bij volwassenen in vergelijking met kinderen. Kinderen reageren vaak ook beter op chemotherapie en hun lichaam kan hogere dosissen chemotherapeutica aan. Er is echter nog steeds onvoldoende inzicht in de biologie van de ziekte waardoor de identificatie van betrouwbare prognostische factoren en een aangepaste behandeling verhinderd wordt 25. Momenteel wordt een patiënt op basis van prognostische factoren zoals leeftijd, geslacht, het aantal leukocyten en het immunofenotype ingedeeld in een bepaalde risicogroep 16. Aangezien leukemische cellen doorheen heel het lichaam circuleren, is operatie geen optie. Patiënten kunnen intensieve combinatie chemotherapie ondergaan. Ook radiotherapie en stamceltherapie zijn mogelijke behandelingen 12. De overlevingskans van patiënten is de laatste decennia erg gestegen door vooruitgang in chemotherapeutische protocols, maar herval komt vaak voor en de chemotherapeutica zorgen voor vele bijwerkingen, zowel op korte als op lange termijn 54, 55. Omwille van de heterogeniteit van T‐ALL, is de meest aantrekkelijke vorm van therapie een doelgerichte en gepersonaliseerde behandeling. Zo kan bijvoorbeeld NOTCH1 als therapeutisch doelwit gebruikt worden 56. ɣ‐secretase inhibitoren (GSI’s) interfereren met de proteolytische splitsing van NOTCH1, en inhiberen zo de vorming van ICN. Deze behandeling kent echter een aantal nadelen: GSI’s vertonen slechts gedeeltelijke respons in NOTCH1‐gemuteerde patiëntenstalen, de ontwikkeling van thymocyten wordt verstoord en er treedt gastro‐intestinale toxiciteit op door blokkage van NOTCH1‐receptoren in de darmen, waardoor een accumulerend effect op de intestinale bekercellen 11 ontstaat 57 . Als oplossing voor dit probleem kan geopteerd worden voor combinatietherapie van glucocorticoïden met GSI’s waarbij glucocorticoïden zorgen voor inductie van apoptose 58. Andere voorbeelden van targeted therapy zijn FLT3‐inhibitoren in patiënten met constitutief geactiveerd FLT3 en imatinib in patiënten met het BCR‐ABL fusiegen en kinase‐inhibitoren 55. 1.3 PHF6 als nieuwe tumorsuppressor in T-ALL 1.3.1 Mutaties in PHF6 in T‐ALL en andere ziekten Omwille van de grote genetische heterogeniteit die T‐ALL kenmerkt, wordt voortdurend gezocht naar voorheen niet gekende genetische aberraties die kunnen dienen als doelwit in nieuwe therapieën. Via X‐chromosoom mutatie‐analyse werden in 2010 door Van Vlierberghe et al. genetische afwijkingen in plant homeodomain finger 6 (PHF6) ontdekt in T‐ALL‐stalen. Deze studies identificeerden PHF6 als een X‐gelinkt tumorsuppressorgen dat in 16% van de pediatrische en in 38% van de volwassen T‐ALL patiënten gemuteerd is 20. Mutaties in PHF6 werden voor het eerst geassocieerd met het Börjeson‐Forssman‐Lehman syndroom (BFLS). Dit is een zeldzame X‐gebonden recessieve ziekte die gekenmerkt wordt door mentale retardatie, epileptische aanvallen, obesiteit, overdreven borstontwikkeling, hypogonadisme en grote vlezige oren. De ziekte komt veel vaker voor bij mannen dan bij vrouwen, deze laatsten vertonen ook veel mildere klinische kenmerken. Dit komt doordat in vrouwen het X‐chromosoom dat de mutatie in PHF6 draagt in de meeste gevallen geïnactiveerd wordt 59. Zoals vermeld in 1.2.2.1 komt T‐ALL voor bij mannen en vrouwen in een ratio van 3:1. Er blijkt ook een verschillende distributie in PHF6‐mutatie te zijn tussen mannen en vrouwen (32% versus 2,5%). Dit is een eerste aanwijzing voor de verstoorde genderverdeling in T‐ALL 20. In 2010 werd een geval beschreven van een kindje met BFLS dat ook T‐ALL ontwikkelde 60. Dit geeft aan dat BFLS mogelijk een predispositiesyndroom voor T‐ALL is. Niet enkel BFLS en T‐ALL worden gekenmerkt door genetische afwijkingen in PHF6. In 2,6% van de patiënten met hepatocellulair carcinoma en 3% van de AML‐patiënten werden PHF6‐mutaties gedetecteerd 61, 62. 1.3.2 PHF6: structuur, functie en defecten PHF6 is een tumorsuppressorgen dat op chromosoomregio Xq26.3 ligt, 11 exons bevat en codeert voor een 365 aminozuren lang eiwit 20, 59 . PHF6 is sterk geconserveerd in vertebraten, maar werd echter nog niet teruggevonden in niet‐vertebraten. Het eiwit PHF6 komt hoog tot expressie in de thymus en middelmatig in de schildklier, eierstokken, testis en vetweefsel functie van het eiwit is echter nog niet gekend 59, 64 63 . De exacte cellulaire . PHF6 bevat twee onvolmaakte plant homeodomain (PHD)‐zinkvingers en vier nucleaire lokalisatie‐ sequenties (NLS) die PHF6 zowel naar de kern als naar de nucleoli kunnen brengen (Figuur 11) 63. PHD‐ zinkvingers zijn componenten die vaak voorkomen in chromatine‐hermodelleringseiwitten, waar ze dienen als reader‐domeinen die interageren met posttranslationeel gemodificeerde histonen. Het 12 reader‐motief vormt vervolgens modules met effector (writer/erase) eiwitten. Op deze manier kunnen epigenetische merkers verspreid worden over het genoom 43. Sommige PHD‐domeinen kunnen binden aan H3K4me3, andere kunnen binden aan H3K4me0, H3K9me3 en zelfs aan geacetyleerde lysines 65‐ 68 . Verschillende PHD‐domeinen herkennen dus verschillende modificaties. Volmaakte PHD‐vingers (Cys4‐His‐Cys3) vergemakkelijken het targeten van chromatine‐hermodelleringseiwitten naar specifieke loci in het genoom, om daar genexpressie en chromatinestructuur te reguleren via DNA‐ methylatie, covalente histonmodificaties en ATP‐afhankelijke relocatie van nucleosomen 63. Tot nu toe zijn nog geen interacties tussen de twee onvolmaakte PHD‐vingers (Cys4‐His‐Cys‐His) van PHF6 en specifieke histon H3‐merkers gevonden 51. Wel werd recent ontdekt door Liu et al. dat de tweede PHD‐ zinkvinger van PHF6 kan binden aan dubbelstrengig DNA 69. Er werd reeds bevonden dat defecten in PHD‐vingers aanleiding geven tot immunodeficiënte syndromen, kankers en neurologische ziekten. Er zijn reeds enkele honderden PHD‐eiwitten gekend, waaronder bijvoorbeeld het leukemie‐geassocieerde MLL 70. Figuur 11 Structuur van PHF6. PHF6 bestaat uit 365 aminozuren. Het eiwit heeft 4 nucleaire lokalisatiesignalen die het PHF6 naar de kern brengen en 2 imperfecte PHD-domeinen, die mogelijk een rol spelen in transcriptionele regulering 20. Afhankelijk van waar de mutatie (deletie, insertie of puntmutatie) plaatsvindt in PHF6, komt het eiwit PHF6 hetzij niet tot expressie, hetzij afwijkend, waardoor het zijn tumorsuppressorfunctie kan verliezen 20. Een ander PHF6‐inactivatiemechanisme is hypermethylatie van de promotorregio van PHF6. Dit gebeurt in 10% van de T‐ALL patiënten 25. Er blijkt ook een genetische interactie te zijn tussen PHF6‐verlies en een afwijkend expressieniveau van TLX1 en TLX3, oncogenen die geactiveerd kunnen worden door chromosomale translocaties in T‐ALL 20. Over de gehele sequentie van PHF6 werden missense, nonsense en frameshift mutaties en kleine deleties teruggevonden. Opmerkelijk is dat PHF6‐ mutaties in leukemie voornamelijk resulteren in frameshift mutaties, terwijl in BFLS meer missense mutaties voorkomen 63. 1.3.3 De mogelijke rol van PHF6 in DNA‐herstelmechanismen Er zijn reeds enkele aanwijzingen voor een mogelijke rol van PHF6 in DNA‐schadeherstel. Daarom worden in onderstaande paragrafen de belangrijkste DNA‐schadeherstelmechanismen uitgelegd, waarna een aantal hypotheses voor de betrokkenheid van PHF6 in schadeherstel worden toegelicht. 1.3.3.1 DNA‐schade en herstelmechanismen DNA‐schade kan geïnduceerd worden door exogene factoren zoals UV‐stralen, ioniserende straling en genotoxische chemicaliën 71, 72 . Ook endogene factoren zoals reactieve zuurstofverbindingen (ROS ‐ reactive oxygen species) kunnen DNA‐schade aanrichten 73 . Tijdens DNA‐replicatie kunnen tevens DNA‐breuken ontstaan uit vastgelopen replicatievorken. Om genomische integriteit en bijgevolg een goede werking van de cel te behouden, is het belangrijk deze schade zo snel mogelijk te herstellen. Daarom zijn cellen voorzien van een aantal chromatine‐geassocieerde herstelmechanismen die sterk 13 gecontroleerd worden in tijd en ruimte 74. Afhankelijk van het type schade en van de fase in de celcyclus waarin de cel zich bevindt, zal herstel voornamelijk gebeuren via base excision repair (BER), homologe recombinatie (HR) of non-homologous end joining (NHEJ). Figuur 12 Overzicht van de DNA-schadeherstel pathway. Wanneer DNA-schade of replicatieve stress optreedt, zullen eiwitten van de Rad-groep deze schade detecteren en de info doorgeven aan de phosphoinositide 3-kinase related kinases (PIKKs) ATM en ATR. Deze zullen een fosforylatie cascadereactie in gang zetten, wat zal leiden tot de rekrutering van DNA-hersteleiwitten en transcriptieregulatoren. Wanneer de schade niet meer hersteld kan worden, treedt apoptose op 75. Figuur 12 toont een overzicht van de DNA‐schadeherstel pathway. Wanneer DNA‐schade of vastgelopen replicatievorken worden opgemerkt, worden controlepunten geactiveerd om progressie doorheen de celcyclus stop te zetten. Zo heeft de cel tijd om de schade te herstellen en zo te voorkomen dat deze schade wordt doorgegeven aan de dochtercellen. Wanneer de schade te groot is, zal de cel in apoptose gaan. De serine‐threonine kinases ATM (ataxia telangiectasia, mutated) en ATR (ATM and Rad3-related) zijn centrale componenten binnen deze controlepathway. ATM reageert voornamelijk op dubbelstrengige DNA‐breuken ontstaan door ioniserende straling. ATR levert slechts een kleine bijdrage tot herstel van dubbelstrengige breuken, maar reageert hoofdzakelijk op schade door UV‐stralen en vastgelopen replicatievorken. Targets van ATM en ATR zijn de checkpoint kinases Chk1 en Chk2, twee regulatoren van de celcyclus. ATM gaat naar de plaats van schade, waar de fosforylatie van het histon H2AX kan gebeuren. Gefosforyleerd H2AX (ɣH2AX) vormt een bindingsplaats voor effectoreiwitten zoals BRCA1 en Nbs1 die zullen deelnemen aan DNA‐ schadeherstel. Wanneer de schade niet hersteld kan worden zal een cascade van fosforylaties uiteindelijk leiden tot apoptose 75 . In onderstaande paragrafen worden de verschillende herstelmechanismen meer in detail besproken. 1.3.3.1.1 Herstel van enkelstrengige breuken Het base excision repair (BER) mechanisme is een herstelmechanisme van enkelstrengige DNA‐ breuken. Het herstelt basen met kleine chemische wijzigingen die de dubbele helixstructuur van DNA niet verstoren 76, 77 . DNA‐glycosylasen herkennen deze laesies en verwijderen ze. De hiaat wordt vervolgens opgevuld door DNA polymerase β en het XRCC1/Ligase III complex zorgt voor ligatie van de 14 nieuwe base 74 . Rekrutering van dit complex gebeurt nadat poly‐ADP‐ribose‐polymerase (PARP) geactiveerd wordt door enkelstrengige breuken en auto‐poly‐ADP‐ribosylatie veroorzaken 78. Dit zorgt voor de aantrekking van het ligatiecomplex evenals enzymen die instaan voor het vormen van ligeerbare DNA‐eindjes, zoals aprataxine en TDP1 (tyrosyl‐DNA‐phosphodiesterase) 79‐81. 1.3.3.1.2 Herstel van dubbelstrengige DNA-breuken Wanneer dubbelstrengige DNA‐breuken optreden, is er geen onbeschadigde DNA‐streng meer aanwezig die als template kan dienen. Toch hebben cellen, afhankelijk van hun fase in de celcyclus, een aantal herstelmechanismen die dit kunnen oplossen. Enerzijds is er homologe recombinatie, een zeer betrouwbaar herstelmechanisme, anderzijds is er de snelle, maar foutgevoelige non homologous end joining pathway. Homologe recombinatie is het belangrijkste herstelmechanisme wanneer cellen zich in de S‐fase en G2‐fase van de celcyclus bevinden. Tijdens deze fasen is een homologe zusterchromatide aanwezig die als template kan dienen om de beschadigde DNA‐strengen correct te herstellen 74. Figuur 13A toont het principe. HR wordt geïnitieerd door het binden van het Mre11/Rad50/Nbs1 (MRN) complex aan dubbelstrengige breuken. Dit complex, aangebracht door PARP, houdt de gebroken stukjes DNA aan elkaar en rekruteert gefosforyleerd CtIP. CtIP wordt gefosforyleerd door CDK2 (Cyclin-dependent kinase 2), wat actief is tijdens de G1/S transitie en in de S‐fase. Mre11 uit het MRN‐CtIP complex verwijdert een deeltje van een DNA‐streng en maakt korte 3’ enkelstrengige DNA‐staartjes. Exonucleasen Exo I en DNA2 verlengen deze resectie tot enkele duizenden baseparen 74, 82. Vervolgens bindt RPA (replication protein A) aan de nieuw‐gecreëerde enkelstrengige regio en vergemakkelijkt de zoektocht naar homologie en invasie van het enkelstrengig DNA in de homologe zusterchromatide 82. RPA wordt dan vervangen door Rad51. Dit eiwit is cruciaal voor strenginvasie in de homologe zusterchromatide. De tussenliggende sequentie wordt gesynthetiseerd, waarbij de intacte streng als template wordt gebruikt 74. Rad51 komt enkel tot expressie in S en G2. Het MRN complex rekruteert niet enkel gefosforyleerd CtIP, maar ook ATM, dat geactiveerd wordt door DNA‐schade. Dit kinase zal autofosforylatie ondergaan, fosforyleert het histon H2AX en vervolgens worden via sequentiële fosforylatie andere eiwitten gerekruteerd zoals MDC‐1, BRCA1 en BRCA2. BRCA2 zal binden aan Rad51 en brengt het naar de enkelstrengige regio 82. Ook BRCA1 komt enkel tot expressie in S en G2. Wanneer cellen postmitotisch zijn of in de G1‐fase van de celcyclus zitten, zullen dubbelstrengige DNA‐ breuken hersteld worden door de NHEJ pathway (Figuur 13B). Dit herstelmechanisme is echter ook actief tijdens de G2/S‐fase. Breuken worden snel herkend door het Ku70/Ku80 heterodimeer. Dit complex rekruteert DNA‐PKcs (DNA-dependent protein kinase, catalytic subunit). DNA‐PKcs ondergaat autofosforylatie, wat de verwerking van de DNA‐eindjes door Artemis begunstigt. Doordat de DNA‐ eindjes beschadigd werden door genotoxische stoffen, moeten ze eerst verwerkt worden door het eiwit Artemis vooraleer ligatie kan gebeuren. Artemis zal ‘blunt’ DNA‐eindjes creëren die geligeerd worden door het XRCC4/Ligase IV complex. Tijdens het verwerken van de DNA‐eindjes kan verlies van nucleotiden optreden, wat de NHEJ pathway een foutgevoelig herstelproces maakt 74. 15 Figuur 13 (A) HR. DNA-schadeherstel tijdens S en G2 fase gebeurt bij voorkeur via homologe recombinatie. PARP1 bindt aan dubbelstrengige breuken waardoor het MRN-complex (samen met CtIP en BRCA1/BARD1) gerekruteerd wordt. Hierdoor start de DNA-resectie. De resectie wordt verlengd door exconucleasen EXO1 en DNA2/BLM, wat resulteert in lange stukken enkelstrengig DNA. Hieraan bindt RPA, wat vervolgens vervangen wordt door Rad51 met de hulp van het BRCA2/PALB2/BRCA1-complex. Rad51 induceert strenginvasie in homologe DNA-sequenties. DNA-polymerisatie kan nu gebeuren met de zusterchromatide als template. (B) NHEJ. DNA-schade tijdens G1 wordt hersteld via non homologous end joining. Het Ku70/80 heterodimeer merkt schade op, bindt aan dubbelstrengige breuken en rekruteert DNA-PKcs (DNAdependent protein kinase, catalytic subunit). DNA-PKcs ondergaat autofosforylatie, waardoor Artemis naar de plaats van DNA-schade gehaald wordt en daar zorgt voor de verwerking van DNA-eindjes. Vervolgens gebeurt ligatie van de DNA-eindjes door het XRCC4/DNA ligase IV complex 82. 1.3.3.2 Aanwijzingen voor een rol van PHF6 in DNA‐schadeherstel Matsuoka et al. toonden in 2007 aan dat PHF6 gefosforyleerd wordt door de kinases ATM en ATR. Deze kinases worden, zoals reeds eerder besproken, geactiveerd bij DNA‐schade. Vervolgens fosforyleren ze andere proteïnen om zo signaalcascades te initiëren die resulteren in DNA‐schadeherstel of apoptose 83. Een tweede aanwijzing voor een rol van PHF6 in DNA‐schadeherstel is de bevinding dat PHF6 interageert met het nucleosome-remodeling and histone deacetylation (NuRD) chromatine‐ remodellerend complex 63. Het NuRD‐complex reguleert herstel van dubbelstrengige DNA‐breuken. Het is een epigenetische regulator die betrokken is bij ATP‐afhankelijke nucleosoom‐hermodellering, histondeacetylatie en H3K4‐demethylatie 84. De interactie van PHF6 met NuRD bevestigt dat PHF6 een chromatine‐interagerend proteïne is 63. De aanwezigheid van gefosforyleerd H2AX duidt op de aanwezigheid van dubbelstrengige DNA‐ breuken (zie 1.3.3.1) 85. Via ɣH2AX‐assays kan het schadeniveau in een cel gekwantificeerd worden. Op 16 deze manier kon in HEK293T‐cellen aangetoond worden dat inactivatie van PHF6 resulteert in een verhoogd aantal dubbelstrengige DNA‐breuken 20. PHF6 zou ook een rol spelen in de celcyclus. Zo leidt de inactivatie van PHF6 in HeLa‐cellen tot arrest van de celcyclus in de G2/M‐fase, wat suggereert dat afwezigheid van PHF6 de celcyclusovergangen kan beïnvloeden. Wang et al. toonden aan dat neerregulatie van PHF6 inderdaad leidde tot verhinderde celproliferatie 86. Recent werd door Kustatscher et al. gevonden dat na CDK2‐inhibitie door roscovitine de lokalisatie van PHF6 veranderde. Er werd een verschuiving van de nucleoli naar niet‐nucleolair chromatine waargenomen 87. PHF6 blijkt dus nodig te zijn voor normale progressie doorheen de celcyclus. Het onderzoek van Wang et al. toonde ook een verhoogde transcriptie van ribosomaal RNA (rRNA) en schade in de rDNA locus aan in 293T‐cellen en HeLa‐cellen na PHF6 inactivatie. De tumorsuppressorfunctie van PHF6 kan dus gelinkt zijn met een rol in de regulatie van rRNA‐synthese. Suppressie van rRNA‐transcriptie gebeurt via binding van het PHD‐domein van PHF6 aan upstream binding factor (UBF), een transcriptiefactor nodig voor de expressie van rRNA’s. Deze interactie beïnvloedt het eiwitniveau van UBF en resulteert in een onderdrukte transcriptie van rRNA. De afwezigheid van PHF6 zorgt voor een deregulatie in rRNA transcriptie. Dit veroorzaakt verhoogde schade ter hoogte van rDNA loci, wat de oorzaak kan zijn van celcyclusarrest 86. 1.3.4 Therapeutische perspectieven Bovenstaande bevindingen leiden tot de hypotheses dat verlies van PHF6 kan leiden tot verstoorde DNA‐schade herstelrespons en dat PHF6-deficiënte T‐ALL cellen mogelijk sensitiever zijn tegenover genotoxische agentia. Dit zou een therapeutisch voordeel kunnen opleveren, door gebruik te maken van bijvoorbeeld PARP‐inhibitoren. Het mechanisme gaat als volgt: als cellen enkelstrengige DNA‐ breuken hebben, wordt PARP geactiveerd en zal de breuk hersteld worden via BER. Wanneer PARP echter geïnhibeerd wordt, zal dit leiden tot de vorming van dubbelstrengige breuken. In ’normale’ cellen zal het HR‐herstelmechanisme geactiveerd worden en worden de dubbelstrengige breuken hersteld. Indien de hypothese klopt dat PHF6 verlies zou leiden tot HR deficiëntie, zullen de breuken niet kunnen hersteld worden in PHF6‐deficiënte T‐ALL cellen en zullen deze cellen uiteindelijk sterven. Dit principe wordt synthetische lethaliteit genoemd en PARP‐inhibitoren worden reeds gebruikt bij de behandeling van BRCA1‐deficiënte borstkankerpatiënten die HR‐incompetentie vertonen 88. Het is ook mogelijk dat PHF6 betrokken is in andere herstelmechanismen, zoals de NHEJ pathway. Om dit te testen, kunnen cellen beschadigd worden via andere DNA‐schade stimuli zoals bijvoorbeeld ioniserende straling. Indien PHF6 een rol zou spelen in replicatieve stress respons, zou na behandeling met hydroxyurea een sterker effect moeten te zien zijn bij PHF6‐deficiënte cellen in vergelijking met gezonde cellen. Er zijn dus heel wat mogelijke opties voor de rol van PHF6 in T‐ALL, maar ook heel wat mogelijke onderzoekswegen om de functie in detail te onderzoeken. 17 1.4 Doel van deze scriptie Deze thesis staat geheel in het teken van het eiwit PHF6. Verschillende aanwijzingen duiden op een rol in DNA‐schadeherstel en in de celcyclus, maar hoe PHF6 deze rol precies vervult en in welke pathways dit eiwit betrokken is, blijft tot nog toe onbekend. Daarom doelt deze thesis op het onderzoeken van de rol van PHF6, om zo een beter inzicht te verwerven in het ziektebeeld van T‐ALL wanneer het gen PHF6 gemuteerd is. Dit zal praktisch gebeuren door het bestuderen van drie onderzoeksvragen: Is er een verschil in schadeniveau tussen PHF6‐wildtype cellen en PHF6‐deficiënte cellen en is DNA‐schadeherstel aangetast in PHF6‐deficiënte cellen? Is er relokalisatie van PHF6 waar te nemen wanneer DNA‐schade wordt geïnduceerd? Heeft verlies van PHF6 invloed op het verloop van de celcyclus? Wanneer DNA‐schadeherstel aangetast is in PHF6‐deficiënte cellen, kan dit blijken uit een verhoogd schadeniveau vergeleken met PHF6‐wildtype cellen. Behandeling van cellen met genotoxische agentia zoals etoposide en doxorubicine, topoisomerase II‐inhibitoren die interfereren met de replicatie, leidt tot dubbelstrengige DNA‐breuken. Deze schadeniveaus zullen gekwantificeerd worden in PHF6‐ wildtype en PHF6‐knockdown cellen. Ook zal gekeken worden naar de snelheid van herstel. De hypothese stelt dat herstel in PHF6‐deficiënte cellen trager zal verlopen, wat indicatief zou zijn voor een rol van PHF6 in schadeherstel. Ook zal gekeken worden naar de lokalisatie van PHF6, wanneer DNA‐schade geïnduceerd wordt door een genotoxish agens. DNA‐schade kan ook toegebracht worden met behulp van een UV‐laserstraal die een zeer gefocust gebied van schade doorheen de cel zal creëren. Live cell imaging laat toe om in stabiele GFP‐PHF6 cellijnen de verplaatsing van PHF6 te volgen. De hypothese stelt hier dat, wanneer PHF6 betrokken is in DNA‐schadeherstel, het mogelijks zal gerekruteerd worden naar plaatsen van DNA‐schade om zijn specifieke functie uit te oefenen. Via flowcytometrie kan een idee verkregen worden over de rol van PHF6 in de celcyclus. Dit kan gebeuren door PHF6 uit te schakelen in celculturen en te kijken welk effect dit heeft op het celcyclusprofiel, nadat de cellen al dan niet behandeld werden met genotoxische agentia. Samengevat wordt in deze thesis getracht een globaal beeld te krijgen van de actie van PHF6 in DNA‐ schadeherstel en in de celcyclus. Dit onderzoek kan leiden tot een beter inzicht in de genetica en biologie van T‐ALL en kan eventueel bijdragen tot nieuwe therapeutische opportuniteiten voor T‐ALL. 18 2 Materiaal en methoden 2.1 Celcultuur 2.1.1 Karakterisatie cellijnen Doorheen de experimenten werden verschillende humane cellijnen gebruikt, zowel adherente als suspensiecellen. De gebruikte cellijnen zijn weergegeven in Tabel 1. Tabel 1 Gebruikte celtypes. Per cellijn wordt de oorsprong, groeiwijze, percentage foetaal bovien serum (FBS) waarin ze groeien en de aankoopfirma weergegeven. NAAM (AFKORTING) Normal human dermal fibroblasts (NHDF) Human embryonal kidney (HEK293T) HEK293T GFP-PHF6 Human bone osteosarcoma GFP-53BP1 (U2OS GFP-53BP1) Jurkat ALL-SIL MOLT4 CELTYPE EN OORSPRONG Normale dermale fibroblasten, geïsoleerd van volwassen huid (weefsels zoals gezicht, borst, buik of dijen) Humane embryonale niercellen; De oorspronkelijke cellijn is afkomstig uit het 293e experiment van Frank Graham. Zelfgemaakte stabiele cellijn waarin PHF6 gekoppeld aan GFP constitutief tot overexpressie komt De cellijn U2OS kwam in 1964 voort uit een scheenbeensarcoom van een 15‐jarig Kaukasisch meisje. U2OS 53BP1‐GFP is een stabiele cellijn waarin de herstelmerker 53BP1 gekoppeld aan GFP constitutief tot overexpressie komt. De cellijn werd afgeleid van het perifeer bloed van een 14‐jarig jongetje met T‐ALL. De cellijn kwam voort van het perifeer bloed van een 17‐jarige jongeman met T‐ALL, bij terugval De cellijn is afkomstig van een 19‐jarige man met T‐ALL en wordt gekenmerkt door een hypertetraploid chromosoom‐aantal. GROEIWIJZE %FBS FIRMA Adherent 10 PromoCell Adherent 10 DSMZ Adherent 10 CMGG Adherent 10 Marco Durante, GSI In suspensie 10 DSMZ In suspensie 20 DSMZ In suspensie 20 DSMZ 2.1.2 Onderhoud 2.1.2.1 Fibroblasten De adherente cellen werden opgegroeid in T75 weefselkweekflessen in advanced Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM, Gibco, 12491‐015), aangerijkt met 10% FBS en 1% penicilline‐streptomycine‐L‐ glutamine (PSL). Indien cellen confluentie bereikten, werden ze gesplitst als volgt: het medium werd afgehaald en cellen werden gespoeld met 3 ml Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS, Gibco, 14190‐094). Na verwijdering van DPBS werd 3 ml 0,05% Trypsine‐EDTA (Gibco, 25200‐072) toegevoegd om de cellen los te maken. Het enzym werd na één minuut incubatie bij 37°C en 5% CO2 geneutraliseerd met 6 ml advanced DMEM met supplementen. Na een paar keer spoelen, werden de 19 cellen overgebracht in een 15 ml falcon om 5 minuten te centrifugeren aan 1000 revolutions per minute (rpm). Het supernatans werd afgegoten en de cellen werden geresuspendeerd in de gewenste hoeveelheid medium. Een deel van de cellen werd overgebracht naar een nieuwe weefselkweekfles in een totaal volume van 12 ml. 2.1.2.2 HEK293T De adherente cellen werden opgegroeid in T75 weefselkweekflessen in Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI, Gibco, 25030024), aangereikt met 1% penicilline, streptomycine en kanamycine (Gibco, 15140‐148 en 15160‐047) en 10% FBS (Gibco, 26400‐036). Wanneer de cellen confluentie bereikten, werd het medium afgenomen. De cellen werden gespoeld met 5 ml versene (Gibco, 15040‐033). Na afnemen van versene werden de cellen getrypsiniseerd met 5 ml 0,05% Trypsine‐EDTA (Gibco, 25300054) en 2 minuten geïncubeerd bij 37°C in 5% CO2. Trypsine werd nadien geneutraliseerd met 5 ml medium. Na een aantal maal spoelen werd het gewenste deel cellen overgebracht naar een nieuwe T75 weefselkweekfles in een totaal volume van 10 ml. 2.1.2.3 Jurkat, ALL‐SIL, MOLT4 De suspensiecellen werden opgegroeid in RPMI 1640 medium, aangereikt met 1% penicilline, streptomycine en kanamycine en de aanbevolen hoeveelheid FBS (Gibco, 26400‐036) zoals aangeduid in bovenstaande tabel. Na homogeniseren van de cellen, werden deze geteld door 20 µl celsuspensie toe te voegen aan Cellometer Cell Counting chambers (Nexcelom Bioscience, Isogen Life Science, CHT4‐ SD100‐004). Cellen werden vervolgens automatisch geteld met behulp van de CellometerTM Auto T4 (Nexelcom Bioscience, Isogen Life Science). Wanneer de cellen een maximale densiteit (i.e. 1,5 x 106 cellen per ml voor Jurkat en MOLT4 en 2 x 106 cellen per ml voor ALL‐SIL) bereikten, werden ze gesplitst naar hun minimale densiteit (i.e. 0,5 x 106 cellen per ml voor Jurkat en MOLT4 en 1 x 106 cellen per ml voor ALL‐SIL). Dit gebeurde door de gewenste hoeveelheid celsuspensie samen met vers medium over te brengen naar een nieuwe weefselkweekfles in een totaal volume van 10 ml. 2.2 Compound behandeling Bij een compound behandeling worden genotoxische agentia toegevoegd aan de cellen. Gebruikte compounds gedurende de experimenten zijn etoposide, doxorubicine, olaparib en hydroxyurea. De werking van deze compounds en hun effect op de celcyclus zijn weergegeven in Tabel 2. Ter controle werd dimethylsulfoxide (DMSO, Life Technologies, D12345) meegenomen wanneer gewerkt werd met etoposide, doxorubicine of olaparib. Bij hydroxyurea werd water als controle meegenomen, dit telkens in een gelijk volume dan dit toegevoegd aan de well met de hoogste concentratie aan compound. Gebruikte concentraties van de compounds zijn celtype‐afhankelijk en werden afgeleid uit de half maximal inhibitory concentrations (IC50) uit voorgaand onderzoek en/of aangepast uit eigen bevindingen. De IC50 is de concentratie aan compound waarbij de viabiliteit van cellen tot de helft gedaald is. 20 Bij het behandelen van adherente cellen voor immunofluorescentiekleuringen werden deze cellen eerst opgegroeid op dekglaasjes in bv. een 12‐well plaat. Oud medium werd verwijderd en nieuw medium met de compound werd druppelsgewijs toegevoegd. Na zacht heen en weer schudden van de plaat om de cellen te verdelen over de dekglaasjes, werden de cellen geïncubeerd bij 37°C en 5% CO2 gedurende 2 uur, 24 uur of 48 uur, afhankelijk van het experiment. Uitwassen van de compound gebeurde door het medium af te nemen en de wells één maal te wassen met Dulbecco's phosphatebuffered saline (DPBS, Gibco, 14190‐094), waarna opnieuw medium (zonder compound) werd toegevoegd. Suspensiecellen werden eveneens uitgezaaid in well‐platen (zonder dekglaasjes) en de compound werd in de juiste concentratie toegevoegd waarna goed gehomogeniseerd werd met behulp van een P1000 micropipet. Incubatie gebeurde voor welbepaalde tijd bij 37°C en 5% CO2. De cellen werden nadien overgebracht in eppendorf tubes en vijf minuten gecentrifugeerd aan 1200 rpm. Supernatans werd afgenomen en cellen werden geresuspendeerd in DPBS. Deze wasstap werd nogmaals herhaald, waarna het experiment kon verdergaan. Tabel 2 Overzicht van gebruikte compounds. Per compound is de werking en aankoopfirma weergegeven. COMPOUND Doxorubicine Etoposide Olaparib Hydroxyurea WERKING Doxorubicine is een topoisomerase II inhibitor. Nadat topoisomerase II de DNA‐ supercoils ontwonden heeft, stabiliseert doxorubicine het topoisomerase II complex. Hierdoor wordt het opnieuw sluiten van de DNA dubbelhelix verhinderd en stopt de replicatie. Etoposide is eveneens een topoisomerase II inhibitor door vorming van complexen met topoisomerase II en DNA. Toediening van etoposide leidt tot blokkering van de celcyclus in S‐fase en G2‐fase. Olaparib is een PARP‐inhibitor. PARP is een eiwit dat een belangrijke rol speelt in het herstel van enkelstrengige breuken. Cellen behandeld met olaparib vertonen een arrest in de G2/M‐fase van de celcyclus. Hydroxyurea zorgt voor inactivatie van het enzyme ribonucleoside reductase via de vorming van vrije nitroxide‐radicalen. Deze radicalen binden vrije tyrosyl‐ radicalen in de actieve site van het enzyme. Dit blokkeert de synthese van deoxynucleotides, waardooor DNA‐synthese verhinderd wordt en synchronisatie in de S‐fase of celdood geïnduceerd wordt. AANKOOPFIRMA Sigma‐Aldrich (D1515) Sigma‐Aldrich (E1383) Selleck Chemicals (AZD2281) Sigma‐Aldrich (H8627) 2.3 Immunofluorescentiekleuring 2.3.1 Adherente cellen Bij volgend protocol werd telkens 1 ml vloeistof toegevoegd per well. Een wascyclus bestaat uit drie maal wassen met 1x PBS gedurende vijf minuten. Cellen werden opgegroeid op microscoop dekglaasjes (0.17 mm dikte, 18 mm diameter) in een 12‐well plaat. Na behandeling zoals beschreven in 2.2 werden cellen gedurende een kwartier gefixeerd in 4% paraformaldehyde (Alfa Aesar, 43368). Cellen werden na een wascyclus gedurende vijf minuten gepermeabiliseerd in 0,5% Triton X (Sigma‐Aldrich, T8787) bij kamertemperatuur. Na een volgende wascyclus werden de cellen gedurende dertig minuten geblokkeerd in 60 µl 50% FBS per dekglaasje. 21 Vervolgens werd gedurende één uur 60 µl primair antilichaam toegevoegd, verdund in 50% FBS. Na een wascyclus werden de cellen gedurende een half uur geïncubeerd met 60 µl secundair antilichaam waaraan een fluorofoor gekoppeld is, eveneens verdund in 50% FBS. Vanaf hier werd zoveel mogelijk in het donker gewerkt. Na een laatste wascyclus werd een druppel VectaShield (Vector laboratories, H‐1000) met 1 µg/ml DAPI (4,6‐diamidino‐2phenylindool, Invitrogen, D‐1306) aangebracht op een draagglaasje. Dekglaasjes werden met de cellen naar beneden op deze druppel gelegd en gemonteerd met transparante nagellak. Nadien konden de glaasjes bekeken worden onder de fluorescentie‐ microscoop (Eclipse Ti, Nikon instruments). 2.3.2 Suspensiecellen Aangezien suspensiecellen niet op dekglaasjes groeien, was het bovenstaande protocol geen optie. Een mogelijke oplossing was het gebruik van de Cytospin™ 4 Cytocentrifuge van Thermo Scientific™ (Figuur 14). Via centrifugatie worden cellen neergeslaan op een draagglaasje waarop eerst een dekglaasje geplaatst werd. Een doel van deze thesis was om het immunokleuringsprotocol voor suspensiecellen te optimaliseren. Hoe dit juist gebeurde, wordt uitgelegd in het hoofdstuk Resultaten. Figuur 14 Cytospin™ 4 Cytocentrifuge. (A) Cytocentrifuge waarin de cytofunnels worden geplaatst. In deze cytofunnels wordt de celsuspensie gebracht. (B) Draagglaasjes waarop dekglaasjes geplaatst worden. (C) Cytofunnels die de draagglaasjes dragen en waarin de celsuspensie gebracht wordt. (D) Schematische doorsnede van de cytocentrifuge. Tijdens het spinnen wordt de cytofunnel rechtop gekanteld (positie B) zodat de cellen op de juiste plaats worden neergespind. Hieronder wordt het geoptimaliseerde protocol voor suspensiecellen per onderdeel beschreven. Het protocol valt op te delen in drie stappen: de fixatie, het cytospinnen en de immunokleuring zelf. Fixatie Nadat de suspensiecellen behandeld werden met compound (of met DMSO of H2O ter controle), werden 100000 cellen gecollecteerd per eppendorf tubes. Standaard werd gewerkt met telkens drie herhalingen per conditie. Vervolgens werden de stalen gedurende vijftien minuten gefixeerd met 400 µl 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS bij 4°C. Gedurende dit kwartier kan de cytospin worden klaargezet. Dit houdt in dat de cytofunnels worden gemonteerd door draagglaasjes in de cytofunnel te leggen, met hierop twee dekglaasjes (diameter 18 mm) op de plaats waar de celsuspensie uiteindelijk zal neergespind worden. Na de fixatie werd PFA weggewassen door 5 minuten aan 1400 22 rpm te centrifugeren bij kamertemperatuur. Het supernatans werd afgenomen en de pellet werd geresuspendeerd in 200 µl koud PBS‐FBS 10%. Vervolgens werd nogmaals aan dezelfde snelheid gecentrifugeerd en de pellet werd in hetzelfde volume geresuspendeerd. Cytospin Per staal werden 200 µl celsuspensie toegevoegd in de cytofunnel. Gedurende 5 minuten werden de cellen neergespind aan 1000 rpm, bij kamertemperatuur. De dekglaasjes werden vervolgens in de wells van een 12‐well plaat geplaatst. Immunokleuring De cellen werden gedurende vijf minuten gewassen met 1x PBS. Vervolgens werd gedurende vijf minuten gepermeabiliseerd in 0,5% Triton X‐100, waarna opnieuw driemaal gewassen werd met 1x PBS. Vanaf hier konden de cellen behandeld worden zoals adherente cellen en kon het protocol beschreven in 2.3.1 gevolgd worden. Doorheen de experimenten werden verschillende antilichamen getest (Tabel 3). Er werd gekozen voor de antilichamenparen die de mooiste foci en/of het minst aspecifiek signaal gaven. Tabel 3 Geteste antilichamen met hun bijhorende kenmerken. Bij elk antilichaam zijn het dier van oorsprong, de verdunning en de aankoopfirma met catalogusnummer weergegeven. De antilichamenparen die goede resultaten gaven en in verdere experimenten werden gebruikt, zijn aangeduid in het vet. Antilichaam Primaire antilichamen anti‐ɣH2AX anti-ɣH2AX anti-PHF6 anti‐PHF6 Secundaire antilichamen anti‐konijn (Cy3) anti‐konijn (Cy3) anti‐konijn (555) anti-konijn Fab (Alexa Fluor 488) anti-muis Fab (Alexa Fluor 568) Dier van oorsprong Verdunning Firma (catalogusnummer) konijn muis konijn muis 1:1000 1:1000 1:1000 1:1000 Abcam (ab11174) Abcam (ab18311) Sigma (HPA001023) Santa Cruz (sc‐365237) geit ezel geit geit geit 1:600 1:300 1:600 1:600 1:600 Abcam (ab6939) Jackson (711166152) Anaspec (28176‐H555) Invitrogen (A11070) Invitrogen (A11004) 2.4 PHF6-neerregulatie 2.4.1 Transfectie Volgende siRNA’s werden gebruikt bij transfectie: als non targeting controles (NTC) werden de “non targeting ON TARGET control” van Dharmacon gebruikt (productnummer D0018101005) of de Ambion NTC controle (s56872). Om PHF6 uit te schakelen werden de siRNA’s van Ambion (s38848) en SMARTPOOL (L01486200, Dharmacon) gebruikt. 23 2.4.1.1 Elektroporatie PHF6‐knockdown van T‐ALL cellen gebeurde via elektroporatie (Bio‐Rad, Gene Pulser Xcell™ Electroporation Systems). De wells van een 6‐well plaat werden gevuld met 5 ml RPMI 1640 medium zonder antibioticum, aangerijkt met 20% FBS. De gewenste hoeveelheid cellen (16 x 106 cellen per elektroporatie bij ALL‐SIL, 8 x 106 cellen per elektroporatie bij Jurkat en MOLT4) werd in een 50 ml tube gebracht, waarna deze tien minuten gecentrifugeerd werd aan 1200 rpm bij kamertemperatuur. Het supernatans werd verwijderd en cellen werden geresuspendeerd in serumvrij medium zonder antibioticum aan een finale concentratie van 32 x 106 cellen per ml bij ALL‐SIL, 16 x 106 cellen per ml bij Jurkat en MOLT4. Vervolgens werd 500 µl celsuspensie per elektroporatie in een eppendorf tube gebracht, waaraan 10 µl siRNA toegevoegd werd (finale concentratie 0,4 µM). De celsuspensies met siRNA werden overgebracht in elektroporatie cuvettes van Bio‐Rad waarna elektroporatie gebeurde (300 kV, 1 mF). Na elektroporatie werd de celsuspensie overgebracht in een 6‐well plaat en geïncubeerd bij 37°C en 5% CO2. 72 uur later, wanneer minimaal 50% knockdown bereikt werd (bepaald zoals beschreven in 2.4.3), kon gestart worden met experimenten. 2.4.1.2 Lipofectamine RNAi MAX PHF6‐knockdown van fibroblasten gebeurde via lipofectaminetransfectie RNAi MAX (Invitrogen, Life Technologies). Cellen werden ofwel opgegroeid in T25 weefselkweekflessen in een totaalvolume van 6 ml ofwel op draagglaasjes in een 12‐well plaat tot ongeveer 70 à 80% confluentie, waarna transfectie gebeurde. Transfectie in een T25 weefselkweekfles gebeurde als volgt: eerst werd de siRNA‐mix gemaakt met 400 µl DMEM zonder supplementen en 4 µg siRNA, wat overeen komt met een eindconcentratie van 50 nM. De lipofectamine‐mix werd bereid door 400 µl DMEM medium zonder supplementen samen te voegen met 9,6 µl Lipofectamine RNAi MAX. Na twee minuten wachten werd het verdunde siRNA druppelsgewijs toegevoegd aan de Lipofectamine‐mix in een 1:1 verhouding. Na vijf minuten incubatie bij kamertemperatuur werd deze mix toegevoegd aan de cellen. Transfectie in een 12‐well plaat gebeurde als volgt. Per well werd aan 600 µl advanced DMEM met supplementen (10% FBS, 1% LPS) 100 µl transfectiemix toegevoegd. Deze mix werd analoog bereid zoals bij transfectie in een T25 weefselkweekfles. Voor één well werd siRNA verdund in 50 µl DMEM zonder supplementen zodanig dat de eindconcentratie siRNA 50 nM bedraagt. De siRNA‐mix werd na twee minuten wachten druppelsgewijs toegevoegd aan de lipofectaminemix (50 µl DMEM zonder supplementen met 1,2 µl Lipofectamine RNAi MAX per well). Na vijf minuten incubatie bij kamertemperatuur werd de gehele mix toegevoegd aan de well. 72 uur na transfectie, wanneer minimaal 50% knockdown bereikt werd, kon gestart worden met experimenten. Wanneer dubbele knockdown gewenst was, gebeurde dit door de getransfecteerde cellen na 72 uur te splitsen en het transfectieprotocol 24 uur later te herhalen. 24 2.4.2 Transductie Wanneer een stabielere knockdown gewenst was, werd geopteerd voor lentivirale transductie (vnl. bij Jurkat), wat werd uitgevoerd in een L3 labo. Het benodigde aantal cellen werd gedurende 5 minuten gecentrifugeerd aan 1500 rpm. Het supernatans werd afgenomen en de cellen werden geresuspendeerd in medium (met het aanbevolen percentage FBS) zodanig dat cellen aan 106 cellen per ml zaten. Om een hogere transductie‐efficiëntie te bereiken, werd 4 µl polybreen (Sigma‐Aldrich, H9268) toegevoegd per ml celsuspensie. Vervolgens werden de cellen uitverdeeld in een 48‐well plaat aan 100000 cellen per well. Hetzelfde volume aan virusstock werd toegevoegd aan de cellen. De 48‐ well plaat werd gedurende 90 minuten gecentrifugeerd aan 2300 rpm bij 32°C en werd nadien in de incubator geplaatst bij 37° C en 5% CO2. Voor het maken van de virusstock werden eerst de controlevector (Sigma, MISSION vector shc002) en shPHF6 vectoren (Sigma, MISSION vector 20122) getransfecteerd in de packaging cell line HEK293TN via de PEI (polyethyleenimine) methode. Puromycine in de oorpronkelijke vectoren werd vervangen door GFP. Na 48 uur werd het supernatans (de eigenlijke virusstock) gecollecteerd en ingevroren bij ‐ 80° C. 2.4.3 Bepalen van het knockdown niveau Het bepalen van het knockdown niveau gebeurde ofwel via Western blot, ofwel via immuno‐ fluorescentiekleuringen, waarna kwantificatie in Fiji gebeurde. De methoden worden hieronder beschreven. 2.4.3.1 Western blot PHF6‐neerregulatie werd bij T‐ALL suspensiecellen nagegaan via Western blot. Per conditie werden 500000 cellen gecollecteerd en gewassen met DPBS. Stalen werden gelyseerd met 250 µl SDS lysebuffer met volgende samenstelling: 2% SDS; 62,5 mM Tris pH 6,8; 20% glycerolstock (50% oplossing in H2O); 5% beta mercaptoethanol, aangevuld met protease inhibitor cocktail (7x stock) in water. Vervolgens werden de stalen gedurende 10 minuten in een heat block geplaatst bij 95°C onder constant schudden (900 rpm). Lysaten werden vervolgens gecentrifugeerd (10 minuten, 4°C, 10000 rpm) om cellulair debris te verwijderen, waarna 20 µl van het geklaarde lysaat werd overgebracht naar voorgekoelde eppendorf tubes. Aan 20 µl lysaat werd 5 µl Laemli denaturatiebuffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris‐HCl pH 7,5; 0,1% SDS; 1% NP‐40 in water) toegevoegd. De stalen werden 5 minuten geïncubeerd bij 95°C en geroteerd aan 900 rpm zodat denaturatie kon plaatsvinden. SDS‐PAGE gels (precast gels, Bio‐Rad) werden in de tank geplaatst, die gevuld werd met running buffer (100ml 10x Tris/glycine/SDS buffer van Bio‐Rad aangelengd met 900 ml gedestilleerd water). Aan de stalen werd 4 µl prestained protein marker (Bio‐Rad, 161‐0318) toegevoegd om het moleculair gewicht te visualiseren terwijl de gel aan het lopen was. Ook werd 1 µl biotinylated protein marker (Cell Signaling, 7727) toegevoegd die na latere immunoblotting met behulp van anti‐biotin HRP antilichaam (Cell Signaling, 7075P5) zichtbaar werd als ladder. 25 µl van het staal werd geladen in de laantjes en de gel werd gelopen aan 100 V en 250 mA gedurende één à twee uur. Vervolgens werd de blotting sandwich 25 gemaakt met een nitrocellulosemembraan. De cassette werd in de houder geplaatst, samen met een ijsblok en de transfer buffer (100 ml 10x Tris/Glycine buffer van Bio‐Rad, 200 ml methanol, 700 ml gedestilleerd water). De Western blot werd gedurende één uur gelopen aan 100 V en 250 mA. Na de blotting werd het membraan gedurende één uur geblokkeerd in melk/TBST (5% magere melkpoeder in TBS met 0,1% Tween‐20). Vervolgens werd het membraan één uur geïncubeerd met primair antilichaam, verdund in 5% melk/TBST. Na drie maal vijf minuten te wassen met TBST, werd het secundair antilichaam gekoppeld aan HRP toegevoegd (eveneens verdund in 5% melk/TBST). Hierbij werd telkens anti‐biotin HRP (1/4000 verdund in melkoplossing) toegevoegd om de gebiotinyleerde eiwitmerker zichtbaar te maken. Na een half uur werden de secundaire antilichamen afgewassen door nogmaals drie maal vijf minuten te wassen met TBST. Vervolgens werd de blot geïncubeerd met luminol/enhencer buffer (1:1 ratio). Opnames van de blot werden gemaakt met het ontwikkelingstoestel Chemidoc-it imaging system (UVP, 061010‐002). Wanneer meerdere eiwitten wilden bekeken worden, werd de blot na deze stap gestript met stripping buffer (Life Technologies, 21059), waarna terug drie maal gewassen werd met TBST. Het membraan werd vervolgens terug gedurende een half uur geblokkeerd met 5% melk/TBST en nadien kon opnieuw primair antilichaam toegevoegd worden. Als laatste antilichaam werd steeds gedurende 30 minuten geïncubeerd met een antilichaam voor ofwel het huishoudeiwit α‐tubuline (muis, Sigma, 072M4805) ofwel het huishoudeiwit β‐actine (muis, Sigma, 129K4753) ter controle van de hoeveelheid geladen eiwit per laan. Andere veelgebruikte antilichamen waren anti‐PHF6 (konijn, Sigma, HPA001023), anti‐ɣH2AX (konijn, Abcam, ab11174), anti‐konijn HRP (Cell Signaling, 7074S) en anti‐muis HRP (Cell Signaling, 7076S). Het niveau van PHF6‐neerregulatie werd nadien gekwantificeerd in Fiji aan de hand van pixelintensiteiten, waarbij normalisatie gebeurde tegenover het gebruikte huishoudeiwit. 2.4.3.2 Immunokleuring PHF6‐neerregulatie in fibroblasten werd nagegaan aan de hand van immunokleuring. Als primair antilichaam werd het konijn anti‐PHF6 antilichaam (Sigma, HPA001023, 1:1000 verdund in 50% FBS) toegevoegd, waartegen geit anti‐konijn Alexa Fluor 488 (Invitrogen, A11070, 1:600 verdund in 50% FBS) als secundair antilichaam gebruikt werd. Na opname werd verschil in intensiteit in het GFP‐kanaal bepaald tussen controle cellen en PHF6‐deficiënte cellen met behulp van Fiji. 2.5 Microscopie Opnames van de immunokleuringen werden gemaakt met een widefield fluorescentiemicroscoop (Eclipse Ti, Nikon instruments), met behulp van een 20x/0.75 Plan Apo droge lens, een 40x/1.3 Plan Apo olielens en een 60x/1.4 Plan Apo olielens. Hierbij stellen 40x en 60x de vergroting voor, 1.3 en 1.4 de numerieke apertuur. Deze laatste is de hoek waaronder het licht kan opgevangen worden en bepaalt tevens de resolutie. De lenzen zijn gecorrigeerd voor sferische en chromatische aberraties. Als camera werd geopteerd voor een Andor iXon EM‐CCD camera. Door gebruik te maken van filterkubussen kon de juiste golflengte uitgestuurd en opgevangen worden. Doorheen de experimenten werden drie filterkubussen gebruikt, weergegeven in Tabel 4. 26 Tabel 4 Gebruikte filterkubussen. Per filterkubus werden excitatie en emissie golflengtes weergegeven in nm. Voor de schuine streep staat de gemiddelde waarde, het tweede getal is de breedte van het interval van het golflengtebereik (bv. 377/50 heeft een bereik van 352 tot 402 nm). De waarde bij dichroïsche spiegel stelt de grenswaarde voor waaronder golflengten geblokkeerd worden en waarboven golflengten worden doorgelaten. Filterkubus DAPI GFP TRITC Excitatie golflengte (nm) 377/50 (UV) 472/30 (blauw) 540/25 (groen) Dichroïsche spiegel (nm) 409 495 565 Emissie golflengte (nm) 447/61 (blauw) 520/35 (groen) 605/55 (oranje) 2.6 Data-analyse Microscopische opnames werden geanalyseerd met de Open Source software Fiji (Fiji is just ImageJ). Via het homewritten INSCYDE script (geschreven door Professor De Vos, limid.ugent.be) gebeurde segmentatie van kernen en foci, waarna parameters zoals intensiteit, foci‐aantal en foci‐bezetting (i.e. de verhouding oppervlakte ingenomen door foci in de kern ten opzichte van de totale kernoppervlakte) gekwantificeerd werden. Het doel van deze experimenten was om te bepalen of een significant verschil tussen controle cellen en PHF6‐deficiënte cellen bepaald kon worden op basis van bovenvermelde parameters. Staalname gebeurde voor verschillende condities (al dan niet behandeld met een compound, gecollecteerd op verschillende tijdstippen), telkens voor drie technische replicaten. Op basis van deze variabelen werd volgend statistisch model opgesteld: Respons ~ Conditie + (1|Replicate) + ε, waarbij de respons een van bovenstaande parameters voorstelt. De conditie werd in het model geïntegreerd als vaste factor. De technische replicaten zijn geneste factoren en worden in het model verwerkt als random factoren. Er werd tevens een foutterm ε in rekening gebracht. Dit model werd ingevoerd in de software R door gebruik te maken van de package ‘lme4’. Via de ‘lmer’ functie werd een meervoudige vergelijking van gemiddelden uitgevoerd, waarbij de Tukey‐test als post hoc test gebruikt werd. 2.7 Celcyclusanalyse via flowcytometrie Wanneer cellen in suspensie in een flowcytometer gebracht worden, worden ze hydrodynamisch gefocust via een stromende vloeistof (zie Figuur 15). De cellen passeren één voor één een laser, waardoor scattering zal plaatsvinden. Een detector vóór de laser meet forward scatter (FSC), een maat voor de celgrootte. Er zijn tevens een aantal detectoren aan de zijkant die side scatter (SSC) meten, een maat voor de granulariteit van cellen. Ook fluorescentie uitgezonden door fluorescent gelabelde cellen kan gemeten worden via verschillende fluorescente kanalen. Het signaal van een partikel wordt gedetecteerd in de vorm van een voltage pulse, die gekenmerkt wordt door een bepaalde hoogte (‘height’), breedte (‘width’) en oppervlakte (‘area’). De hoogte van de voltage pulse is proportioneel aan de intensiteit van het signaal. De breedte geeft een idee over de tijd die een cel nodig heeft om de laserstraal te passeren en is dus bijgevolg een maat voor de grootte van de cel. De oppervlakte is het product van de hoogte en breedte van de voltage pulse. 27 Figuur 15 Schematische voorstelling van flowcytometrische principes. Links is te zien hoe single cells bestraald worden door een laserstraal, waarna scattering en fluorescentie gedetecteerd wordt. Rechts wordt visueel forward en side scatter voorgesteld, respectievelijk een maat voor de grootte en de granulariteit van partikels. 2.7.1 Propidium iodide staining Cellen werden opgegroeid (en eventueel behandeld met een compound) in een 12‐well plaat, waarna 106 cellen gecollecteerd werden in eppendorf tubes en vijf minuten gecentrifugeerd aan 1200 rpm (bij 4°C of kamertemperatuur). Supernatans werd verwijderd en cellen geresuspendeerd in 1 ml DPBS. Cellen werden nogmaals gecentrifugeerd, vervolgens geresuspendeerd in 300 µl koud DPBS, waarna de stalen op ijs werden geplaatst. Druppelsgewijs werd 700 µl ijskoud 70% ethanol toegevoegd, terwijl de eppendorf tubes gelijktijdig gevortexed werden. De stalen werden voor minimum één uur geïncubeerd bij ‐20°C. Vervolgens werd de ethanol uitgewassen door de cellen twee maal vijf minuten te centrifugeren aan 1200 rpm en te wassen met PBS. Finaal werden de cellen geresuspendeerd in 500 µl koud DPBS. RNAse A (Qiagen, 19101) werd toegevoegd aan een finale concentratie van 0,5 mg/ml en gedurende één uur geïncubeerd bij 37°C. Nadien werd propidium iodide (PI, Life Technologies, P1304MP) toegevoegd aan een finale concentratie van 40 µg/ml. Celcyclusanalyse werd uitgevoerd met de S3™ Cell Sorter van Bio‐Rad. Stalen werden steeds eerst gevortexed om clustering van de cellen te vermijden. Na calibratie via Proline Calibration Beads (Bio‐ Rad) werden de verschillende kanalen (FSC area, SSC area, FSC width en FL3) zodanig ingesteld dat enkel single cells geanalyseerd werden, terwijl doubletten en debris uit de analyse gehaald werden. Figuur 16 toont hoe de gating van cellen gebeurde. Er werden telkens 20000 events opgenomen per conditie aan een snelheid van 200 à 500 s‐1. PI heeft een maximum emissie bij 605 nm en werd gemeten in het fluorescentiekanaal FL3 (650 long pass filter). 28 Figuur 16 Gating van cellen bij celcyclusanalyse. Een eerste gating is het verwijderen van debris, wat zich in de linker benedenhoek bevindt van een FSC area vs SSC area plot. In dit gebied bevinden zich kleine partikels met een lage interne complexiteit, m.a.w. debris. Vervolgens worden doubletten verwijderd via een FSC area vs FSC width plot. De voltage pulse van doubletten vertoont een grotere breedte (width) dan singlets aangezien ze groter zijn en dus ook een langere reistijd doorheen de laserbeam kennen. Deze partikels dienen verwijderd te worden uit de analyse. De overblijvende populatie wordt uiteindelijk voorgesteld in een histogram, waarbij FL3-area de hoeveelheid propidium iodide voorstelt na intercalatie in het DNA van de cellen. 2.7.2 FlowJo De single cell analysis software FlowJo werd gebruikt om de flowcytometrische data te analyseren. In Figuur 17 is weergegeven hoe celcyclusanalyse uitgevoerd werd. Toppen van de celcyclusfasen G1 en G2/M werden visueel aangeduid, van waaruit respectievelijk de linker‐ en rechterhelft werden gemarkeerd. Per cellijn werden dezelfde gate‐breedtes gebruikt als deze bekomen bij de controlestalen. In het geval de G2/M‐piek niet duidelijk was als gevolg van behandeling met een compound, werd de breedte van de S‐fase bij controlestalen gebruikt om de G2/M‐piek te bepalen bij behandelde stalen. Figuur 17 Voorbeeld celcyclus analyse. De figuur stelt een histogram van het PI-kanaal voor. Eerst werden de twee donkere banden bepaald (0,5 G1 en 0,5 G2/M). Tussenliggend gedeelte omvat 0,5 G1 + S + 0,5 G2/M. Weergegeven percentages zijn berekend op basis van alle cellen weergegeven in het histogram en werden achteraf omgerekend zodanig dat %G1 + %S + %G2/M = 100% Om verschil tussen PHF6‐wildtype cellen en PHF6‐deficiënte cellen te testen, werden de data eerst getest op normaliteit via een Shapiro‐Wilk test. Vervolgens werd een gepaarde t‐test uitgevoerd. Deze statistiek gebeurde in R. 29 2.8 Micro-irradiatie experimenten Bij micro‐irradiatie experimenten worden cellen in een zeer gefocust gebied bestraald met een korte puls UV‐laserlicht (405 nm) om op deze manier dubbelstrengige DNA‐breuken te induceren. Via live cell imaging kan vervolgens gekeken worden in cellen naar de lokalisatie van fluorescent gelabelde eiwitten met behulp van de confocale laser scan microscoop (CLSM, A1R, Nikon instruments). Rond de microscoop is een behuizing geplaatst, waarbinnen de temperatuur kan geregeld worden. De cellen werden bekeken bij 37° C. Adherente cellen (U2OS GFP‐53BP1 en HEK293T GFP‐PHF6 cellen) werden uitgezaaid in glass bottom dishes. Vervolgens werd met de confocale microscoop gezocht naar cellen die voldoende fluorescent signaal vertoonden. Verschillende parameters (zoals vb. de airy unit) werden ingesteld om een zo hoog hoog mogelijke resolutie te verkrijgen. Binnen kernen werden stimulatieregio’s aangeduid, dit zijn de plaatsen die bestraald worden met een korte puls UV‐licht. Vervolgens werden een aantal scansnelheden getest, om te bepalen welke instellingen genoeg schade (maar niet teveel) induceren en een vlotte verplaatsing van het controle‐eiwit (in dit geval 53BP1 gelinkt aan GFP in U2OS cellen) tot gevolg heeft. Als optimale scan speed werd een snelheid van twee frames per seconde bekomen. Ook werd gewerkt met perfect focus om te corrigeren voor hoogteverschillen te wijten aan eventuele temperatuurverschillen. Er werd gewerkt in regio’s van 512 x 512 pixels, waarin vier maal werd ingezoomd. Opnames werden als volgt gemaakt met een 60x/1.4 Plan Apo olielens: eerst werden een aantal startbeelden gemaakt waarna DNA‐schade geïnduceerd werd ter hoogte van de stimulatieregio’s met een laserpuls met een golflengte van 405 nm en 100% power. Vervolgens werden gedurende ca. twintig minuten beelden gemaakt met een tijdsinterval van tien seconden met een laser met een golflengte van 488 nm. Bij deze golflengte wordt GFP geëxciteerd waarna het groen licht uitzendt. Deze laser werd bediend aan 75% van zijn power, om een te snelle bleking van het GFP‐signaal te voorkomen. 30 3 Resultaten In een eerste luik wensen we het effect van PHF6‐inactivatie op de hoeveelheid DNA‐schade en de snelheid van DNA‐schadeherstel te onderzoeken door DNA‐schade te induceren in controlecellen en in cellen waarin PHF6 werd neergereguleerd. Deze schade kan gekwantificeerd worden aan de hand van ɣH2AX, een merker voor dubbelstrengige DNA‐breuken die zichtbaar wordt als foci na immunofluorescentiekleuring. Alvorens gewerkt werd in PHF6‐neergereguleerde T‐ALL cellen, werd gevalideerd in adherente cellen of DNA‐schade geïnduceerd door een genotoxisch agens effectief kan gedetecteerd en gekwantificeerd worden (3.1). Het immunofluorescentiekleuringsprotocol werd reeds geoptimaliseerd voor adherente cellen in het labo van prof. De Vos, maar nog niet voor suspensiecellen. Aangezien T‐ALL cellijnen suspensiecellen zijn, was een volgende uitdaging in deze thesis het optimaliseren en vervolgens valideren van dit protocol voor suspensiecellen (3.2). Van zodra dit lukte, kon worden overgegaan tot het onderzoeken van een eventueel effect van PHF6‐inactivatie op schadeniveaus en schadeherstel in (3.3). Een tweede luik handelt over een mogelijk effect van PHF6‐neerregulatie op celcycluspropagatie. Dit gebeurde in drie T‐ALL cellijnen: Jurkat, ALL‐SIL en MOLT4, nadat ze al dan niet behandeld werden met celcyclusverstorende compounds (3.4). In een laatste luik tenslotte, wordt de lokalisatie van PHF6 onderzocht. Dit gebeurde onder andere via immunofluorescentiekleuringen en live cell imaging, waarbij PHF6 gekoppeld aan GFP in real time gevolgd wordt doorheen de kern na DNA‐schade inductie door middel van een UV‐laserstraal (3.5). 3.1 Validatie van ɣH2AX-kwantificatie in adherente cellen Om te valideren of DNA‐schade geïnduceerd door een genotoxisch agens wel degelijk detecteerbaar en kwantificeerbaar was, werd het standaard immunokleuringsprotocol (zie 2.3.1) voor adherente cellen getest in fibroblasten via een ɣH2AX‐assay. De cellen werden gedurende twee uur behandeld met etoposide (1, 2 en 5 µM) waarna de compound werd weggewassen en de immunokleuring werd uitgevoerd. Analyse van dit experiment toonde aan dat hogere concentraties etoposide tot hogere schadeniveaus leidden, zoals te zien is in Figuur 18. In Figuur 19 is te zien dat naarmate de concentratie aan etoposide stijgt, meer foci waar te nemen zijn. Doxorubicine, eveneens een topoisomerase‐inhibitor, kan net zoals etoposide gebruikt worden om dubbelstrengige DNA‐schade te induceren. Figuur 20 (A en B) toont aan dat ook met deze compound schadeniveaus kunnen gekwantificeerd worden. Vervolgens werd in de adherente HEK293T‐cellijn het immunokleuringsprotocol gevalideerd. Ook hier werd een significant hoger DNA‐schadeniveau gedetecteerd en gekwantificeerd na twee uur behandelen met 1 µM etoposide, zoals te zien is in Figuur 20 (C en D). 31 Figuur 18 Validatie-experiment in NHDF met etoposide. (A) Jitterplot. De mediane ɣH2AX-intensiteit is weergegeven in functie van de concentratie etoposide. Ter controle werd DMSO toegevoegd. Eén dot stelt één celkern voor. De grootte van de dots geeft het aantal foci weer die per kern te vinden zijn. De kleurenrange van de dots geeft info over de ɣH2AX-intensiteit: hoe lichter de kleur, hoe hoger de intensiteit. Deze plot toont dat tussen DMSO en etoposide 1 µM niet veel verschil te zien is, behandeling met 2 µM en 5 µM etoposide geven telkens hogere schadeniveaus. (B) Kwantificatie. Deze tabel geeft per conditie de mediane ɣH2AX-intensiteit in de kern ± de standaardafwijking weer. Paarsgewijze vergelijking van de behandelde stalen t.o.v. de controle via een Kruskal-Wallis test met Nemenyi als post-hoc test, toont aan dat behandeling met 2 µM en 5 µM leidt tot een significant (p < 0,05) hoger schadeniveau, aangeduid met (*). (C) Boxplot. Boxplot van de mediane ɣH2AXintensiteit in functie van de verschillende condities. Deze plot geeft hetzelfde weer als de jitterplot in (A), maar in boxplotformaat. Figuur 19 Microscopische opname van validatie-experiment in NHDF. De verschillende condities zijn per kanaal weergegeven. ‘Merged’ is de voorstelling van zowel DAPI (rood) als ɣH2AX (groen). Rechtsonder werd ingezoomd op een kern met DNA-schade geïnduceerd door behandeling met 5 µM etoposide, ɣH2AX-foci zijn duidelijk waar te nemen. 32 Figuur 20 Validatie-experimenten in NHDF en HEK293T cellen. (A) NHDF cellen behandeld met doxorubicine. De mediane ɣH2AX-intensiteit in de kern wordt weergegeven in functie van de conditie. Twee uur behandelen met 1 µM doxorubicine leidt tot een hoger schadeniveau. DMSO werd als controle gebruikt. (B) Kwantificatie van DNA-schade in NHDF cellen. ɣH2AXintensiteit, het aantal foci en de focibezetting in de kern van fibroblasten zijn weergegeven per conditie. Significantie ten opzichte van de controle (DMSO) wordt aangeduid met (*) (C) HEK293T cellen behandeld met etoposide. De mediane ɣH2AXintensiteit in de kern wordt weergegeven in functie van de conditie. Twee uur behandelen met 1µM etoposide leidt tot meer schade in de kern. (D) Kwantificatie van DNA-schade in HEK293T cellen. Overzicht van de mediane ɣH2AX-intensiteit, het aantal foci in de kern en de foci-bezetting in de kern van HEK293T cellen per conditie. Significantie ten opzichte van de controle (DMSO) wordt aangeduid met (*). 3.2 Translatie naar T-ALL suspensiecellen Aangezien het lukte om DNA‐schade te kwantificeren in adherente cellen, kon worden overgegaan tot DNA‐schade kwantificatie in T‐ALL suspensiecellen. Het immunofluorescentieprotocol voor T‐ALL suspensiecellen diende echter eerst geoptimaliseerd te worden. Hoe dit gebeurde, wordt uitgelegd in volgend deel. 3.2.1 Optimalisatie immunofluorescentiekleuringsprotocol voor T‐ALL suspensiecellen Alvorens de immunofluorescentiekleuring kan starten, dienen suspensiecellen neergespind te worden op een dekglaasje. Dit kan gebeuren met de Cytospin™ 4 Cytocentrifuge van Thermo Scientific (zie 33 2.3.2). Er werd gestart met volgend protocol: cellen werden behandeld met een compound, waarna de compound werd verwijderd en de cellen gecollecteerd. De cellen werden neergespind via de Cytospin, waarna ze vervolgens gefixeerd werden in 4% PFA gedurende een kwartier. Nadien werd het standaard immunokleuringsprotocol gevolgd zoals bij de adherente cellen (zie 2.3.1). Er doken echter een aantal problemen op. Het cytospinnen veroorzaakte stress bij de cellen, waardoor vervormde celkernen en DNA‐schade veroorzaakt door de mechanische stress optraden. Deze problematiek is te zien in Figuur 21, waarin beelden worden getoond van een experiment in Jurkat waarbij het startprotocol gevolgd werd. De cellen werden gedurende twee uur behandeld met 1 µM etoposide, een topo‐isomerase inhibitor die dubbelstrengige DNA‐breuken induceert. Vervolgens werden de cellen gecytospind, waarna fixatie in 4% paraformaldehyde (PFA) gebeurde. Kleuring van ɣH2AX met een muis anti‐ɣH2AX antilichaam (ab18311, Abcam) leverde zichtbare foci in de kern op, maar er waren een aantal zeer felle ɣH2AX‐signalen waar te nemen die niet van de etoposidebehandeling afkomstig leken te zijn. Optimalisatie was dus vereist. Figuur 21 Startprotocol in de T-ALL suspensiecellijn Jurkat: ɣH2AX-staining. (A) Experiment in Jurkat waarbij de kern en ɣH2AX gekleurd werden volgens het startprotocol nadat de cellen behandeld werden met 1 µM etoposide: er werd eerst gecytospind, vervolgens gefixeerd in 4% PFA. ‘Merged’ geeft in het rood de kern weer (DAPI) en in het groen het ɣH2AXsignaal. Wat opvalt zijn de zeer felle schadesignalen, afkomstig door stress veroorzaakt tijdens het cytospinnen. (B) Er werden zeer wazige en vervormde kernen waargenomen wanneer de cellen levend werden gecytospind. (C) In dit beeld werd ingezoomd op de felle ɣH2AX-signalen. 34 Een immunokleuring bij suspensiecellen bestaat uit drie grote delen: de fixatie, het cytospinnen en de eigenlijke immunokleuring. Er zijn een aantal parameters die kunnen aangepast worden, om op deze manier een optimale immunofluorescentiekleuring te bekomen. In Figuur 22 wordt het optimalisatieproces weergegeven. Figuur 22 Optimalisatieproces. Verschillende parameters werden aangepast ter optimalisatie van het protocol voor suspensiecellen: het tijdspunt van fixatie, het gebruikte fixatief, de cytospinsnelheid en de antilichamen. De condities die de beste resultaten gaven, werden aangeduid met een oranje kader. Door te spelen met de fixatiemethode, konden de grootste problemen worden opgelost. Er werd getest of immunokleuring lukte door de cellen eerst te fixeren en dan pas te cytospinnen. Dit lukte en bleek een goede oplossing te bieden: de celkernen zagen er niet langer vervormd of wazig uit en ook de felle ɣH2AX‐signalen waren verdwenen. Er werden ook een aantal fixatieven getest: 70% ethanol (gedurende één uur) en 4% PFA (gedurende vijftien minuten). Beide fixatieven gaven goede resultaten, in volgende experimenten werd gewerkt met 4% PFA. De resultaten worden weergegeven in Figuur 23. Vervolgens werd het cytospinproces geoptimaliseerd. Om een optimale celdensiteit en celkernvorm op het dekglaasje te bereiken, werden een aantal afdraaisnelheden en uitzaaiconcentraties getest. 100000 cellen per staal bleek een goede densiteit te zijn om genoeg cellen op het dekglaasje te verkrijgen. Een hogere uitzaaiconcentratie zorgde ervoor dat de cellen overlapten of opeenstapelden, wat een goede segmentatie van de kernen door Fiji, een specifieke software voor beeldverwerking, in de weg stond. Als centrigatiesnelheden werden 300, 600 en 1000 rpm getest. De snelheid bleek niet veel impact te hebben op de resultaten. Er werd voor 1000 rpm gekozen aangezien lymfocyten voor diagnostische doeleinden ook aan deze snelheid worden gecytospind. Tot slot werd de immunokleuring zelf geoptimaliseerd, waarbij verschillende antilichamen getest werden. De antilichamen die de mooiste foci en het minst aspecifiek signaal vertoonden, werden aangeduid in Figuur 22. 35 Figuur 23 Immunofluorescentiekleuring in Jurkat cellen: voor en na optimalisatie. (A) DAPI-kleuring van cellen die gefixeerd werden na (links) en voor (midden en rechts) het cytospinnen. De celkernvormen van de cellen die eerst gefixeerd werden, zien er minder vervormd en ‘uitgesmeerd’ uit. Beide fixatieven (4% PFA en 70% ethanol) bleken goed te werken. (B) ɣH2AX-kleuring in Jurkat: postfixatie vs prefixatie. Jurkat cellen werden gedurende twee uur behandeld met de topoisomerase-inhibitor etoposide. Bij de kleuring na prefixatie zijn de felle schadesignalen niet meer terug te vinden, enkel de foci geïnduceerd door etoposide. 36 3.2.2 Validatie van ɣH2AX‐kwantificatie in T‐ALL suspensiecellen Aangezien de werking van compounds via immunokleuring in adherente cellen kon aangetoond worden en het protocol voor de immunofluorescentiekleuring van T‐ALL suspensiecellen met succes geoptimaliseerd werd, kon overgegaan worden tot de validatie van dit protocol in suspensiecellen. Dit gebeurde in Jurkat cellen en MOLT4 cellen. Ook hier kon de werking van etoposide en doxorubicine aangetoond worden. In Figuur 24 (A en B) zijn de resultaten voor de behandeling van Jurkat cellen met 1 µM doxorubicine gedurende twee uur weergegeven. MOLT4 cellen zijn gevoeligere cellen dan Jurkat cellen en werden daarom behandeld aan een iets lagere concentratie etoposide, nl. 500 nM gedurende twee uur. De werking van de compound is te zien in Figuur 24 (C en D). Figuur 24 Validatie-experimenten in Jurkat en MOLT4 cellen. (A) Jurkat cellen behandeld met doxorubicine. De mediane ɣH2AX-intensiteit en het aantal foci per conditie worden weergegeven. Twee uur behandelen met 1 µM doxorubicine leidt tot meer DNA-schade. (B) Kwantificatie van DNA-schade in Jurkat cellen. De mediane ɣH2AX-intensiteit en het aantal foci in de kern bij Jurkat cellen worden per conditie weergegeven. Significantie ten opzichte van de controle wordt aangeduid met (*). (C) MOLT4 cellen behandeld met etoposide. Boxplots van de mediane ɣH2AX-intensiteit en het aantal foci per conditie, waarin aangetoond wordt dat twee uur behandelen met 500 nM etoposide leidt tot meer DNA-schade t.o.v. de controle (DMSO). (D) Kwantificatie van DNA-schade in MOLT4 cellen. Overzicht van de mediane ɣH2AX-intensiteit en het aantal foci in de kern bij MOLT4-cellen per conditie. Significantie ten opzichte van de controle wordt aangeduid met (*). 37 3.3 Effect van PHF6-inactivatie op DNA-schadeniveaus en DNAschadeherstel Nadat het kleuringsprotocol voor suspensiecellen geoptimaliseerd was en aangetoond werd dat de DNA‐schade geïnduceerd door compounds gedetecteerd en gekwantificeerd kon worden, kon gestart worden met experimenten waarbij het effect van PHF6‐inactivatie op DNA‐schadeniveaus en DNA‐ schadeherstel werd onderzocht. PHF6 werd neergereguleerd door middel van transductie of transfectie, zoals beschreven in 2.4. PHF6‐wildtype (controle) en PHF6‐knockdown cellen werden beiden op dezelfde manier behandeld en vervolgens werd gekeken of een verschil in schadeniveau op te merken was tussen deze twee populaties. Ook in dit deel werd eerst gewerkt met adherente cellen. 3.3.1 PHF6‐neerregulatie heeft geen effect op DNA‐schadeniveaus in fibroblasten PHF6 werd in fibroblasten neergereguleerd door middel van een lipofectamine‐gemedieerde transfectie. Er werd zowel een enkele als een dubbele transfectie uitgevoerd. De knockdown niveaus bedroegen respectievelijk 60% en 70%. In Figuur 25 zijn controle cellen en PHF6‐deficiënte cellen weergegeven. In de cellen getransfecteerd met siPHF6 is duidelijk te zien dat PHF6 nog nauwelijks tot expressie komt in de kern. Figuur 25 PHF6-neerregulatie in fibroblasten. Bovenaan zijn cellen weergegeven die getransfecteerd werden met een controle siRNA. PHF6 komt in deze cellen hoofdzakelijk tot expressie in de kern, waarin het voornamelijk in nucleoli gelokaliseerd zit. Onderaan zijn PHF6-neergereguleerde cellen te zien. Hierin is te zien dat PHF6 bijna niet meer tot expressie komt in de kern. Deze beelden zijn afkomstig van de dubbele transfectie in de fibroblasten. ‘Merged’ geeft in het rood de kern weer (DAPI) en in het groen het PHF6-signaal. 38 Cellen werden gedurende twee uur behandeld met 1 µM doxorubicine of met DMSO ter controle waarbij telkens gewerkt werd met drie technische replicaten. Na het uitwassen van de compound werd een immunofluorescentiekleuring uitgevoerd voor ɣH2AX. Opnames werden gemaakt met behulp van de widefield fluorescentiemicroscoop en beeldanalyse gebeurde met de plug‐in Inscyde waarna statistische verwerking gebeurde in R. De resultaten van de enkele en de dubbele transfectie waren zeer vergelijkbaar. In Figuur 26 zijn de resultaten weergegeven van de dubbele transfectie. De resultaten van de enkele transfectie zijn terug te vinden in de bijlage pagina 63. Tijdens deze experimenten werd telkens gekeken naar drie parameters: de mediane ɣH2AX‐intensiteit in de kern, het aantal foci in de kern en de foci‐bezetting in de kern. Wanneer gekeken wordt naar ɣH2AX‐ intensiteit in de kern, wordt zowel basaal als na behandeling minder schade gedetecteerd in PHF6‐ neergereguleerde cellen. De verschillen zijn significant, maar vrij klein. De resultaten tonen dat op vlak van het aantal foci en de foci‐bezetting geen onderscheid kan gemaakt worden tussen PHF6‐wildtype cellen en PHF6‐deficiënte cellen. In humane fibroblasten werden bijgevolg geen grote verschillen gedetecteerd in DNA‐schadeniveaus tussen beide populaties. Figuur 26 Doxorubicine-geïnduceerde DNA-schadeniveaus in controle en PHF6 knockdown fibroblasten. De boxplots geven de resultaten weer van de met doxorubicine behandelde cellen in fibroblasten die dubbel getransfecteerd werden. De mediane ɣH2AX-intensiteit, het aantal foci en foci-bezetting in de kern worden weergegeven. Er is geen verschil te zien in het aantal foci en de foci-bezetting tussen controlecellen en PHF6-deficiënte cellen. Wel is er verschil in intensiteit te zien, waarbij iets minder schade waarneembaar is in PHF6-deficiënte cellen. Het experiment waarbij een enkele transfectie gebeurde gaf dezelfde significantieresultaten (zie bijlage pagina 63). De verschillende significantieniveaus zijn: ‘n.s.’ niet significant, ‘*’ p < 0,001 en ‘***’ p < 0,05. 3.3.2 PHF6‐neerregulatie induceert hogere schadeniveaus in T‐ALL cellen Vervolgens werd overgegaan naar experimenten in T‐ALL cellen, waarbij eerst gewerkt werd in Jurkat cellen. PHF6 werd ofwel transiënt uitgeschakeld via elektroporatie van siRNA’s ofwel stabiele transductie van lentivirale shRNA vectoren. De cellen werden vervolgens gedurende twee uur behandeld met 5 µM etoposide of met DMSO ter controle en de immunofluorescentiekleuring in de suspensiecellen en opname en verwerking van de beelden gebeurden zoals hierboven beschreven. De resultaten van de elektroporatie worden weergegeven in Figuur 27, deze van de transductie in Figuur 28. Beide experimenten geven iets andere resultaten, maar algemeen kan worden afgeleid dat het behandelen van Jurkat cellen met etoposide tot een hoger schadeniveau leidt in PHF6‐deficiënte cellen. 39 Figuur 27 Effect van transiënte PHF6 knockdown op etoposide-geïnduceerde DNA-schadeniveaus in Jurkat cellen. (A) Boxplots. Uit de mediane ɣH2AX-intensiteit kan afgeleid worden dat PHF6-deficiënte significant meer schade oplopen in vergelijking met PHF6-wildtype cellen, zowel basaal als na behandeling. Ook op vlak van foci-aantal en foci-bezetting is basaal telkens meer schade gekwantificeerd in PHF6-deficiënte cellen. Na etoposidebehandeling is ook een significant grotere focibezetting aanwezig in de PHF6-neergereguleerde cellen, het aantal foci stijgt echter niet. De verschillende significantieniveaus zijn: ‘n.s.’ niet significant en ‘***’ p < 0,05. (B) Western blot data. De expressieniveaus van PHF6 voor controle cellen (‘siNTC’) en PHF6-neergereguleerde cellen (‘siPHF6’) werden weergegeven. De transfectie-efficiëntie werd berekend in Fiji, waarbij de pixel-intensiteiten van PHF6 genormaliseerd werden tegenover het huishoudeiwit actine. Er werd 62% knockdown bereikt. (C) Kwantificatie. De tabel geeft telkens het gemiddelde ± de standaardafwijking weer voor de drie beschouwde parameters per conditie. Figuur 28 Effect van stabiele PHF6 knockdown op etoposide-geïnduceerde DNA-schadeniveaus in Jurkat cellen. (A) Boxplots. Wanneer gekeken wordt naar de drie parameters, kan worden afgeleid dat etoposide behandelde PHF6-deficiënte significant meer schade oplopen in vergelijking met PHF6-wildtype cellen. Op vlak van foci-aantal en foci-bezetting is basaal geen significant verschil waar te nemen tussen beide populaties, in tegenstelling tot het vorig experiment. De verschillende significantieniveaus zijn: ‘n.s.’ niet significant en ‘***’ p < 0,05. (B) Western blot data. De expressieniveaus van PHF6 voor controle cellen (‘siNTC’) en PHF6-neergereguleerde cellen (‘siPHF6’) werden weergegeven. Er werd 60% knockdown bereikt. (C) Kwantificatie. De tabel geeft telkens het gemiddelde ± de standaardafwijking weer voor de drie beschouwde parameters per conditie. 40 Tot nu toe werden verschillende resultaten bereikt. In fibroblasten werd zo goed als geen verschil in doxorubicine‐geïnduceerde ɣH2AX‐signalen waargenomen tussen PHF6‐wildtype cellen en PHF6‐ deficiënte cellen, terwijl in de T‐ALL cellijn Jurkat een hoger schadeniveau werd waargenomen in PHF6‐ deficiënte cellen, zowel basaal als na behandelen met etoposide. Als argument hiervoor zou kunnen gegeven worden dat beide cellijnen behandeld werden met verschillende compounds, maar beide zijn topoisomerase II inhibitoren en hebben ongeveer dezelfde werking. Een meer plausibele verklaring zou kunnen zijn dat de effecten cellijnafhankelijk zijn. Om dit na te gaan werden experimenten uitgevoerd in een andere T‐ALL cellijn, nl. ALL‐SIL. Ook werd niet enkel gekeken naar het schadeniveau meteen na het behandelen met de compound, maar ook naar de resterende schade op een later tijdspunt na het wegwassen van de compound, om op deze manier een idee te verkrijgen over de herstelkinetiek van de cellen. ALL‐SIL cellen werden geëlektroporeerd met controle of PHF6‐specifieke siRNA’s en gedurende twee uur behandeld met 5 µM etoposide. In een eerste tijdsexperiment werden stalen gecollecteerd meteen na het uitwassen van de compound en na 24 uur herstel. De tijdsduur tussen deze twee staalnames bleek iets te groot te zijn: na 24 uur waren de cellen in de verschillende condities reeds volledig hersteld tot het basale schadeniveau (data weergegeven in de bijlage pagina 64). In een volgend experiment werden staalnames genomen meteen na uitwassen van de compound en na 6 uur herstel. Zoals bij elk ander experiment werden telkens drie technische replicaten meegenomen. De resultaten hiervan zijn weergegeven in Figuur 29. Net zoals in Jurkat cellen vertonen PHF6‐deficiënte ALL‐SIL cellen een hoger schadeniveau in vergelijking met de PHF6‐wildtype cellen. 6 uur na het uitwassen van etoposide bleek 62% van de PHF6‐wildtype cellen hersteld te zijn, terwijl de PHF6‐ neergereguleerde cellen slechts 42% herstel vertoonden. Deze percentages werden berekend op basis van de fold induction, dit is de verhouding tussen de ɣH2AX‐intensiteit in etoposide‐behandelde cellen ten opzichte van deze in controlecellen. Op deze manier werd gecorrigeerd voor de basale schade die de cellen reeds vertoonden. Uit dit experiment blijkt dus dat DNA‐schadeherstel trager verloopt wanneer PHF6 neergereguleerd is. Deze bevindingen konden reeds herhaald worden in een tweede onafhankelijk experiment. De resultaten hiervan zijn weergegeven in de bijlage pagina 64. 41 Figuur 29 Effect van PHF6 knockdown op etoposide-geïnduceerde DNA-schadeniveaus in ALL-SIL cellen. (A) Boxplots. Wanneer gekeken wordt naar de drie parameters, kan worden vastgesteld dat etoposide-behandelde PHF6-deficiënte cellen significant meer schade opliepen in vergelijking met PHF6-wildtype cellen. Na 6 uur herstel zijn de schadeniveaus reeds gedaald, waarbij te zien is dat het schadeniveau bij PHF6-deficiënte cellen minder sterk gedaald is. De verschillende significantieniveaus zijn: ‘n.s.’ niet significant en ‘***’ p < 0,05. (B) Kwantificatie. De tabel geeft telkens het gemiddelde ± de standaardafwijking weer voor de drie beschouwde parameters per conditie. (C) Western blot data. De expressieniveaus van PHF6 voor controlecellen (‘siNTC’) en PHF6-neergereguleerde cellen ‘siPHF6’ werden weergegeven. Er werd 54% knockdown bereikt. (D) Herstelkinetiek. Fold inductions (FI) werden berekend voor beide tijdspunten. Meteen na uitwassen van etoposide is de FI in PHF6-deficiënte cellen iets hoger dan deze van de wildtype cellen. Na zes uur is minder herstel waar te nemen in de cellen waarin PHF6 werd neergereguleerd. CONCLUSIES Tot nu toe werd het immunofluorescentiekleuringsprotocol voor T‐ALL suspensiecellijnen geoptimaliseerd en werd ɣH2AX‐ kwantificatie gevalideerd in zowel adherente als suspensiecellen. Vervolgens werd PHF6 neergereguleerd in fibroblasten en T‐ALL cellijnen (nl. Jurkat en ALL‐SIL) en werden ɣH2AX‐schadeniveaus gekwantificeerd na behandeling met een genotoxisch agens. Hieruit bleken cellijnspecifieke effecten te zijn: neerregulatie van PHF6 in fibroblasten had geen effect op DNA‐ schadeniveaus. Etoposide‐behandelde Jurkat en ALL‐SIL cellen daarentegen vertoonden hogere DNA‐ schadeniveaus na neerregulatie van PHF6. In ALL‐SIL kon worden vastgesteld dat DNA‐schadeherstel trager verloopt in PHF6‐deficiënte cellen. 42 3.4 Het effect van PHF6-neerregulatie op celcycluspropagatie Via flowcytometrische experimenten werd nagegaan of de neerregulatie van PHF6 een effect heeft op de celcyclusvoortgang in T‐ALL cellijnen. Eerst werd gekeken naar het effect in onbehandelde cellen. Vervolgens werden cellen behandeld met etoposide, olaparib of hydroxyurea om te onderzoeken of de inwerking van een compound in combinatie met het uitschakelen van PHF6 een al dan niet sterker celcycluseffect gaf. 3.4.1 Celcyclusanalyse in onbehandelde cellen Flowcytometrie en analyse van de data gebeurde zoals beschreven in 2.7. In Figuur 30 worden een aantal histogrammen ter voorbeeld weergegeven van onbehandelde cellen van verschillende cellijnen. Op de X‐as wordt de fluorescentie‐intensiteit van propidium iodide weergegeven, wat evenredig is aan de hoeveelheid DNA aanwezig in de cel. De eerste piek van het histogram stelt het aantal cellen voor in de G1‐fase van de celcyclus, in de tweede piek zitten cellen die zich in de G2/M‐fase bevinden. Tenslotte bevinden zich tussen beide pieken de cellen in de S‐fase. Er is weinig tot geen verschil te zien tussen histogrammen van PHF6‐wildtype cellen en histogrammen van PHF6‐deficiënte cellen. Tijdens de celcyclus experimenten werden knockdown‐efficiënties bereikt gaande van 50% tot 80%. De western blot data zijn weergegeven in de bijlage pagina 65. Figuur 30 Celcyclusanalyse in onbehandelde controle of PHF6 knockdown T-ALL cellijnen. Histogrammen zijn weergegeven van Jurkat, ALL-SIL en MOLT4, telkens voor PHF6-wildtype cellen (‘siNTC’) en PHF6-deficiënte cellen (‘siPHF6’). Op de x-as is de fluorescentie-intensiteit van propidium iodide weergegeven, de y-as stelt het aantal cellen voor. Er is geen verschil in distributie te zien tussen beide populaties (siNTC vs. siPHF6). De resultaten van verschillende celcyclus experimenten (met sample sizes voor Jurkat, ALL‐SIL en MOLT4 respectievelijk 6, 7 en 4) werden samengevat per cellijn en weergegeven in Figuur 31. Hierin 43 worden de percentages van de cellen in de verschillende fasen van de celcyclus getoond. Er is telkens een iets lager percentage cellen in G1 en een iets hoger percentage cellen in S waar te nemen in PHF6‐ knockdown cellen ten opzichte van controle cellen. In Tabel 5 worden ratio’s weergegeven van het percentage cellen in de S‐fase ten opzichte van het percentage in de G1‐fase (‘S/G1’), idem voor de G2/M‐fase ten opzichte van de G1‐fase (‘G2/G1’). Op deze dataset werden gepaarde t‐testen uitgevoerd. Op basis van deze testen konden echter geen significante verschillen aangetoond worden tussen PHF6‐wildtype cellen en PHF6‐deficiënte cellen. Figuur 31 Percentage cellen per celcyclusfase in onbehandelde cellen. Per cellijn worden de percentages cellen in de verschillende celcyclusfasen (G1, S en G2/M) weergegeven. De aan- of afwezigheid van PHF6 blijkt geen grote verandering in voortgang van de celcyclus weer te geven. Wel is telkens een iets lager percentage cellen aanwezig in de G1-fase, en een iets hoger percentage in de S-fase, hoewel deze trend niet significant bleek na statistische analyse. Tabel 5 Ratio’s van de percentages cellen in S-fase of G2/M-fase ten opzichte van het percentage cellen in G1-fase in onbehandelde cellen. Weergegeven zijn de gemiddelde ratio’s met bijhorende standaardafwijking per conditie (PHF6wildtype cellen = ‘siNTC’ en PHF6-deficiënte cellen = ‘siPHF6’) per cellijn. De p-waarden van een gepaarde t-test worden weergegeven om gelijkheid van de gemiddelden te bepalen tussen ‘siNTC’ en ‘siPHF6’. Er kon geen significantie aangetoond worden. T-ALL cellijn Jurkat ALL-SIL MOLT4 Ratio S/G1 G2/G1 S/G1 G2/G1 S/G1 G2/G1 siNTC 0,489 ± 0,077 0,297 ± 0,075 0,567 ± 0,110 0,293 ± 0,052 0,322 ± 0,114 0,149 ± 0,036 siPHF6 0,546 ± 0,072 0,304 ± 0,063 0,612 ± 0,095 0,325 ± 0,063 0,393 ± 0,072 0,154 ± 0,044 p-waarde 0,1759 0,8153 0,2098 0,1104 0,1122 0,8594 3.4.2 Celcyclusanalyse in cellen behandeld met celcyclusverstorende compounds In onbehandelde cellen werden geen sterke celcycluseffecten waargenomen na neerregulatie van PHF6, maar misschien kon meer inzicht verkregen worden in een mogelijke rol van PHF6 in de celcyclus na een behandeling met verschillende compounds die de celcyclus kunnen verstoren. Toediening van etoposide leidt tot blokkering van de celcyclus in de S‐fase en G2‐fase (wat zich vertaalt in een hogere G2/M‐piek in het histogram), terwijl behandeling met de PARP‐inhibitor olaparib leidt tot arrest in de G2/M‐fase. Hydroxyurea‐behandelde cellen ten slotte lopen vast in de S‐fase van de celcyclus. Cellen werden gedurende 48 uur behandeld met oplopende concentraties etoposide, olaparib of 44 hydroxyurea. De compound werd uitgewassen en celcyclus‐analyse gebeurde zoals beschreven in 2.7. In Figuur 32 worden een aantal histogrammen als voorbeeld getoond van verschillende cellijnen (waarin PHF6 al dan niet werd neergereguleerd) die behandeld werden met een compound. Jurkat cellen werden gedurende 48 uur behandeld met 0,25 µM etoposide. De PHF6‐deficiënte cellen vertonen een hogere G2/M‐piek, wat suggereert dat er meer cellen vast zitten in deze fase in vergelijking met de PHF6‐wildtype cellen. Hetzelfde fenomeen kan gezien worden bij de ALL‐SIL cellen die behandeld werden met 5 µM olaparib. Dit suggereert een sterker celcycluseffect in PHF6‐deficiënte cellen na behandeling met een compound. De resultaten van de verschillende biologische replicaten waren echter vrij variabel. Het effect werd niet elke keer waargenomen en ook de effecten bij andere concentraties etoposide en olaparib binnen hetzelfde experiment waren minder zichtbaar. Figuur 32 Celcyclusanalyse in behandelde controle en PHF6 knockdown cellen. Histogrammen zijn weergegeven van Jurkat, ALL-SIL en MOLT4, telkens voor PHF6-wildtype cellen (‘siNTC’) en PHF6-deficiënte cellen (‘siPHF6’). Zowel bij etoposidebehandelde Jurkat cellen als bij olaparib-behandelde ALL-SIL cellen is een hogere G2/M-piek waar te nemen wanneer PHF6 is uitgeschakeld. PHF6-deficiënte MOLT4-celllen behandeld met hydroxyurea vertonen een lagere G1-piek ten opzichte van de wildtype cellen. Om een beter beeld te verkrijgen van dit mogelijk celcycluseffect werden de drie cellijnen behandeld met de drie verschillende compounds in oplopende concentraties. Per concentratie werden minimum drie biologische replicaten meegenomen. Het percentage cellen per celcyclusfase werd berekend zoals in 2.7.2. Per concentratie werden gemiddelden berekend op basis van de replicaten en vervolgens werd net zoals bij de onbehandelde cellen gekeken naar de ratio’s S/G1 en G2/G1. Wanneer gekeken wordt naar deze ratio’s kan het effect van een compound duidelijk gevolgd worden bij oplopende concentraties aan compound. Tegelijkertijd kan gezien worden of het neerreguleren van PHF6 een 45 ander effect heeft op de celcyclus in vergelijking met controle cellen, wat zich vertaalt in het dalen of stijgen van de ratio’s S/G1 en G2/G1. Figuur 33 geeft een algemeen overzicht van de resultaten in Jurkat cellen. Hierin worden de beide ratio’s weergegeven per concentratie compound, voor etoposide, olaparib en hydroxyurea. De werking van etoposide en olaparib is waar te nemen door een stijging in de ratio’s S/G1 en G2/G1. De gebruikte concentraties bij hydroxyurea blijken iets te laag om een goed effect te kunnen zien, al is er toch een lichte stijging in S/G1. PHF6 perturbatie blijkt in de Jurkat cellijn niet erg veel effect te hebben, er werden geen significante verschillen waargenomen. Figuur 33 Celcyclusanalyse in controle en PHF6 knockdown Jurkat cellen na behandelen met compounds. Per compound worden de ratio’s S/G1 en G2/G1 weergegeven voor PHF6-wildtype cellen (‘siNTC’) en PHF6-deficiënte cellen (‘siPHF6’). Er is geen eenduidige trend waar te nemen tussen deze twee populaties. Uit gepaarde t-testen konden geen significante verschillen aangetoond worden tussen ‘siNTC’ en ‘siPHF6’. Figuur 34 toont de ratio’s S/G1 en G2/G1 van de celcyclusanalyse in ALL‐SIL per concentratie compound, voor etoposide, olaparib en hydroxyurea. De werking van etoposide en olaparib is net als bij de Jurkat cellen waar te nemen door een stijging in de ratio’s S/G1 en G2/G1. Deze keer werden hogere concentraties hydroxyurea (tot 100 µM) gebruikt. Bij deze concentratie is een duidelijke stijging te zien in de ratio S/G1, wat wil zeggen dat de cellen arrest vertonen in de S‐fase. Visueel is een lichte trend waar te nemen, vooral bij olaparib. Hier vertonen de PHF6‐deficiënte cellen hogere ratio’s S/G1 en G2/G1, deze cellen vertonen bijgevolg een iets sterker arrest in de S‐fase en G2/M‐fase. Ook etoposide‐behandelde PHF6‐deficiënte cellen vertonen een iets hogere S/G1‐ratio dan controle cellen. Er blijken significant meer cellen in de S‐fase te zitten in PHF6‐neergereguleerde cellen na behandeling met 10 µM olaparib. 46 Figuur 34 Celcyclusanalyse in ALL-SIL na behandelen met compounds. Per compound worden de ratio’s S/G1 en G2/G1 weergegeven voor PHF6-wildtype cellen (‘siNTC’) en PHF6-deficiënte cellen (‘siPHF6’). PHF6 knockdown cellen behandeld met olaparib of etoposide vertonen een lichte stijging in de ratio G2/G1 en/of de ratio S/G1. Significantie (p < 0,05) werd aangeduid met *. In Figuur 35 worden de resultaten van de celcyclusanalyse in MOLT4 weergegeven, wederom via de ratio’s S/G1 en G2/G1. De celcycluseffecten veroorzaakt door etoposide en olaparib zijn waar te nemen door stijgende S/G1 en G2/G1 ratio’s bij stijgende concentraties aan compound. Het celcycluseffect veroorzaakt door hydroxyurea is niet zo duidelijk, wat erop wijst dat behandeling met 100 µM een te lage concentratie is. Net zoals bij de ALL‐SIL cellen wordt een lichte trend waargenomen: de ratio’s S/G1 en G2/G1 stijgen in etoposide‐ en olaparib‐behandelde cellen waarin PHF6 werd neergereguleerd. Gepaarde t‐testen toonden aan dat na behandeling met etoposide significant meer cellen zich in de S‐fase en G2/M‐fase bevinden na neerregulatie van PHF6. 47 Figuur 35 Celcyclusanalyse in MOLT4 na behandelen met compounds. Per compound worden de ratio’s S/G1 en G2/G1 weergegeven voor PHF6-wildtype cellen (‘siNTC’) en PHF6-deficiënte cellen (‘siPHF6’). Ook hier stijgen de ratio’s S/G1 en G2/G1 in PHF6-deficiënte cellen na behandeling met etoposide of olaparib. Significantie (p < 0,05) werd aangeduid met *. CONCLUSIES Celcyclusanalyse in T‐ALL cellijnen gaf niet altijd eenduidige resultaten. Toch kon een algemene trend opgemerkt worden: ten opzichte van controle cellen is er een lichte stijging waar te nemen in de percentages cellen die zich in de S‐fase en/of G2/M‐fase van de celcyclus bevinden in PHF6‐ neergereguleerde cellen, vooral na behandeling met etoposide of olaparib. Deze trend kon opgemerkt worden in ALL‐SIL en MOLT4 cellen, echter niet in Jurkat cellen. 48 3.5 Spatio-temporele lokalisatie van (GFP-)PHF6 In een laatste deel van deze thesis werd de lokalisatie van PHF6 onderzocht. Eerst werd basaal (op een enkel tijdspunt) naar PHF6 gekeken. Vervolgens werd de lokalisatie van PHF6 gevolgd doorheen de tijd. Tot slot werd onderzocht of PHF6 naar plaatsen van DNA‐schade gerekruteerd wordt wanneer schade geïnduceerd wordt door middel van een genotoxisch agens, of door middel van bestraling met UV‐laserlicht. 3.5.1 Basale lokalisatie PHF6 komt tot expressie in de kern, waar het voornamelijk gelokaliseerd is in de nucleoli. Dit werd zowel waargenomen via immunofluorescentiekleuring voor endogeen PHF6 in fibroblasten, als via fluorescentiemicroscopische opname van overgeëxpresseerd GFP‐PHF6 in HEK293T cellen, zoals te zien is in Figuur 36. Deze resultaten bevestigen wat reeds in de literatuur werd beschreven 63. Figuur 36 Lokalisatie van PHF6. (A) NHDF. Fibroblasten na immunokleuring voor PHF6, waarbij het konijn anti-PHF6 antilichaam van Sigma (HPA001023) gebruikt werd. De opname werd gemaakt met de widefield fluorescentiemicroscoop. (B) HEK293T-PHF6. Met behulp van de confocale laser scan microscoop werd een opname gemaakt van HEK293T-PHF6 cellen. PHF6 bezit vier nucleaire lokalisatie-sequenties (NLS) die het eiwit zowel naar de kern als naar de nucleoli kunnen brengen. PHF6 zit voornamelijk gelokaliseerd in de nucleoli. 3.5.2 Tijdsgebonden lokalisatie Na het volgen van PHF6‐expressie in celculturen doorheen de tijd, werd opgemerkt dat PHF6 tijdens de mitose blijkt te interageren met de chromosomen. In Figuur 37 is een HEK293T cel met GFP‐PHF6 overexpressie te zien die mitose ondergaat. In cellen in de metafase tot en met de telofase, vertoont PHF6 interactie met het DNA. Via FRAP‐experimenten (resultaten niet weergegeven) werd gezien dat na een vlotte bleking ook snel herstel plaatsvond. Tijdens de interfase bindt PHF6 dus niet of zwakker aan DNA. Deze resultaten kunnen wijzen op een mogelijke regulatorische rol van PHF6 in de celcyclus. Na de deling van de cel zit PHF6 wederom gelokaliseerd in de nucleoli. 49 Figuur 37 GFP-PHF6 interageert met de chromosomen tijdens de mitose. Met behulp van de confocale microscoop werden opnames gemaakt van HEK293T-PHF6 cellen. PHF6 blijkt tijdens de mitose te interageren met de chromosomen. Na de deling zit PHF6 terug voornamelijk in de nucleoli gelokaliseerd. In de linkerbenedenhoek wordt de tijd weergegeven in uren. In fibroblasten kon een gelijkaardige lokalisatie van PHF6 tijdens de mitose ook aangetoond worden via immunofluorescentiekleuring, waarbij anti‐PHF6 (konijn, Sigma, HPA001023) gebruikt werd als primair antilichaam. In Figuur 38 is te zien dat de intensiteit van PHF6 verlaagt gedurende de metafase tot en met de telofase. Na de mitose, wanneer PHF6 terug gelokaliseerd zit in de nucleoli, stijgt de intensiteit terug. Figuur 38 Lokalisatie van PHF6 tijdens de mitose in fibroblasten. Immunofluorescentiekleuring voor PHF6 in fibroblasten. A tot en met D stellen cellen voor die zich respectievelijk in de interfase, metafase, telofase en opnieuw interfase bevinden. 3.5.3 Lokalisatie na DNA‐schade inductie Indien PHF6 een rol zou spelen in DNA‐schadeherstel, is het mogelijk dat het zijn functie op de plaats van DNA‐schade uitoefent. Door via immunofluorescentiekleuringen zowel PHF6 als ɣH2AX zichtbaar te maken, kan gekeken worden naar mogelijke colokalisatie. Ook kan naar de intensiteit van PHF6‐ expressie gekeken worden in onbehandelde en behandelde cellen. Mogelijks komt PHF6 hoger tot expressie in cellen die behandeld werden met een genotoxisch agens. In fibroblasten bleek dit inderdaad het geval te zijn na behandeling met doxorubicine, zoals te zien is in Figuur 39. Dit effect kan echter ook te maken hebben met celcycluseffecten veroorzaakt door de DNA‐schade inductie. Ook werd opgemerkt dat na DNA‐schade inductie PHF6 iets homogener verdeeld zit doorheen de kern. Dit wordt getoond in Figuur 40. Figuur 39 PHF6-intensiteit in fibroblasten. Fibroblasten werden gedurende twee uur behandeld met 1 µM doxorubicine. Na het wegwassen van de compound werd een immunokleuring uitgevoerd voor zowel ɣH2AX als PHF6. De linker boxplot toont aan dat DNA-schade geïnduceerd werd. Op vlak van PHF6-intensiteit vertonen doxorubicine-behandelde cellen een significant hogere PHF6-intensiteit ten opzichte van controle cellen. 50 Figuur 40 Relokalisatie van PHF6 na behandeling met doxorubicine. Nadat fibroblasten behandeld werden met doxorubicine, blijkt PHF6 minder in de nucleoli aanwezig te zijn, maar eerder homogeen verdeeld doorheen de kern. ‘Merged’ geeft in het blauw DAPI weer, in het rood ɣH2AX en in het groen PHF6. 51 Om een beeld te krijgen over een mogelijke rekrutering van PHF6 naar plaatsen van DNA‐schade, werden micro‐irradiatie experimenten uitgevoerd. U2OS GFP‐53BP1 cellen werden als positieve controle meegenomen. Deze cellen brengen constitutief de herstelmerker 53BP1 gekoppeld aan GFP tot expressie. Omwille van deze eigenschap kan 53BP1 in real time gevolgd worden doorheen de kern. Wanneer de cellen lokaal bestraald worden met UV‐licht (405 nm), wordt DNA‐schade geïnduceerd. Dit heeft tot gevolg dat de herstelmerker 53BP1 naar deze plaats gaat om zijn functie uit te kunnen oefenen. In Figuur 41A is deze verplaatsing duidelijk te zien. Vervolgens werden micro‐irradiatie experimenten uitgevoerd in HEK293T GFP‐PHF6 cellen. Dit is een cellijn waarin PHF6 gekoppeld aan GFP tot overexpressie komt, waardoor PHF6 in real time doorheen de cel kan gevolgd worden. De cellen werden met dezelfde lasercondities bestraald als deze gebruikt in de U2OS GFP‐53BP1 cellen. Na twintig minuten monitoring werd echter geen rekrutering van PHF6 vastgesteld naar de regio’s die blootgesteld werden aan bestraling, zoals te zien is in Figuur 41B. Figuur 41 Micro-irradiatie experimenten. Drie cellen werden met een korte laserpuls van 405 nm bestraald op de plaatsen aangeduid door de oranje rechthoeken. In de linkerbenedenhoek wordt de tijd weergegeven in minuten. (A) U2OS GFP-53BP1 cellen. De initiële bleaching van GFP in de regio die blootgesteld werd aan radiatie wordt snel gevolgd door lokale accumulatie van 53BP1-GFP. 53BP1 wordt dus gerekruteerd naar de plaats van bestraling. Na ca. twee à drie minuten is reeds accumulatie van 53BP1 waar te nemen op de plaats van schade. (B) HEK293T GFP-PHF6. De cellen werden gedurende twintig minuten gevolgd. Er werd geen verplaatsing van PHF6 naar plaatsen van schade waargenomen. CONCLUSIES PHF6 zit voornamelijk gelokaliseerd in de nucleoli. Tijdens de mitose interageert PHF6 met de chromosomen. Een rechtstreekse verplaatsing van PHF6 naar plaatsen van DNA‐schade werd niet opgemerkt. PHF6 lijkt dus niet rechtstreeks aanwezig in het DNA‐schadeherstel apparaat. Wel bleek de PHF6‐intensiteit in fibroblasten te verhogen na behandeling met doxorubicine. Ook leek er enige relokalisatie van PHF6 plaats te vinden, waarbij PHF6 homogener verdeeld zit in de kern na behandelen met een genotoxisch agens. 52 4 Discussie T‐cel acute lymfatische leukemie is een agressieve vorm van leukemie waarin meerdere genetische en epigenetische defecten samenwerken bij de transformatie van een normale voorloper T‐cel tot leukemische T‐cel. In 2010 werd door Van Vlierberghe et al. (verbonden aan het Centrum Medische Genetica Gent) PHF6 geïdentificeerd als een belangrijke X‐gebonden tumorsuppressor in T‐ALL. Zo vertonen maar liefst 16% van de pediatrische en 38% van de volwassen T‐ALL patiënten inactiverende mutaties of deleties in PHF6. De cellulaire functie en de rol van PHF6 in T‐ALL ontwikkeling is echter tot op heden onduidelijk. Op basis van een aantal studies in de literatuur en preliminaire data binnen de onderzoeksgroep waarin deze thesis werd uitgevoerd, zijn er reeds enkele aanwijzingen voor een mogelijke rol van PHF6 in DNA‐schadeherstel en in de celcyclus. Desondanks is de exacte functie van PHF6 in deze belangrijke cellulaire processen en de link met T‐ALL nog niet gekend. Daarom werd tijdens deze masterscriptie onderzoek gedaan naar de rol van PHF6 in DNA‐schadeherstel en de celcyclus in de context van T‐ALL. 4.1 Invloed van PHF6-neerregulatie op DNA-schadeniveaus en herstel In een eerste luik van deze thesis werd de invloed van PHF6‐inactivatie op cellulaire DNA‐ schadeniveaus en DNA‐schadeherstel onderzocht. Meer specifiek was het doel om deze DNA schade te visualiseren en te kwantificeren in T‐ALL suspensiecellen door middel van immunofluorescente kleuring van ɣH2AX, een merker voor DNA dubbelstrengige breuken. Eerst werd gevalideerd of DNA‐ schade geïnduceerd door genotoxische agentia, zoals bijvoorbeeld de topoisomerase II inhibitoren doxorubicine en etoposide, kon gekwantificeerd worden in adherente NHDF cellen. Er werd voor deze cellijn gekozen als modelcellijn omdat het protocol voor immunofluorescentiekleuring van NHDF cellen reeds geoptimaliseerd werd in het labo van professor De Vos. Ook in de adherente cellijn HEK293T werd ɣH2AX‐kwantificatie gevalideerd volgens dit protocol. Vervolgens werd overgegaan naar T‐ALL suspensiecellijnen. Tijdens deze thesis werd het protocol voor immunofluorescentiekleuring van T‐ALL suspensiecellen met succes geoptimaliseerd. Dit gebeurde door een aantal parameters zoals de fixatiemethode en de cytospinsnelheid te testen en te optimaliseren. Fixatie van de cellen vooraleer ze gecytospind werden op dekglaasjes bleek de grootste factor te zijn tot het verhogen van de kwaliteit van de immunokleuring. Nadat ɣH2AX‐kwantificatie gevalideerd werd in T‐ALL suspensiecellen, werd overgegaan tot het testen van schadeniveaus via ɣH2AX‐assays in verschillende cellijnen waarin PHF6 al dan niet neergereguleerd werd. DNA‐schade werd ook hier geïnduceerd door doxorubicine en etoposide. In NHDF cellen werd geen groot verschil in schadeniveaus waargenomen tussen (PHF6‐ wildtype) controle cellen en PHF6‐knockdown cellen. Ook in T‐ALL cellijnen verhoogde het basale schadeniveau over het algemeen niet significant in PHF6‐deficiënte cellen vergeleken met PHF6‐ wildtype cellen. Na voorafgaande behandeling met etoposide daarentegen, bleken T‐ALL cellijnen Jurkat en ALL‐SIL na neerregulatie van PHF6 hogere ɣH2AX‐niveaus te vertonen ten opzichte van 53 controles. Deze resultaten suggereren dat PHF6 een rol speelt in DNA‐schade respons en/of herstel en mogelijks is deze functie cellijnspecifiek. Dit is plausibel aangezien mutaties en deleties in PHF6 typische defecten zijn in acute T‐cel leukemie. Het is dus mogelijk dat de effecten van PHF6 inactivatie vooral tot uiting komen in T‐cel of T‐ALL context. Een specifiek mechanisme in T‐cellen zijn de V(D)J‐ herschikkingen tijdens vorming van de T‐cel receptoren. Hierin speelt de NHEJ DNA‐herstelpathway een cruciale rol. Een mogelijke denkpiste is daarom dat PHF6 een rol zou kunnen spelen in de DNA‐ schade respons en meerbepaald in het NHEJ herstelmechanisme. Mogelijks heeft PHF6‐inactivatie een negatief effect op de TCR‐ontwikkeling wat uiteindelijk zou kunnen leiden tot de vorming van T‐ALL. Deze hypothese is echter nog speculatief en verder onderzoek zal moeten uitwijzen of PHF6 inderdaad een rol speelt in NHEJ gedurende T‐celreceptor herschikkingen. In ALL‐SIL (T‐ALL) cellen werden bijkomende tijdsexperimenten uitgevoerd tijdens de ɣH2AX‐assays, waarbij de kinetiek van DNA schadeherstel na etoposide‐geïnduceerde DNA schade werd nagegaan in controle en PHF6 knockdown cellen. Uit deze experimenten kan geconcludeerd worden dat DNA‐ schadeherstel trager verloopt wanneer PHF6 wordt neergereguleerd. Verder onderzoek moet uitwijzen of deze bevindingen enkel gelden in ALL‐SIL cellen, of de trend globaal kan doorgetrokken worden naar andere T‐ALL cellijnen. Indien vertraagde herstelkinetiek specifiek zouden blijken voor ALL‐SIL, kan dit erop wijzen dat interactie vereist is tussen PHF6 met andere moleculaire kenmerken die deze cellijn typeren. Zo is ALL‐SIL bijvoorbeeld de enige T‐ALL cellijn die TLX1‐gedreven is, een van de oncogenen die geactiveerd kan worden na chromosomale translocaties in T‐ALL. Uit vorig onderzoek is ook duidelijk dat PHF6‐inactivatie significant vaker voorkomt in de TLX1‐subgroep van T‐ ALL, wat suggereert dat beide genen coöperativiteit vertonen in T‐ALL 20 . 4.2 Het effect van PHF6-inactivatie op celcycluspropagatie In een tweede luik van deze masterthesis werd onderzocht of PHF6 mogelijks een rol speelt in de celcyclus. Meer specifiek werd het effect van PHF6‐inactivatie op de celcyclusprofielen van T‐ALL celculturen onderzocht via flowcytometrische analyse. In de uitgevoerde celcyclus experimenten werden geen significante celcycluseffecten waargenomen na neerreguleren van PHF6 in basale (onbehandelde) T‐ALL cellen. Vervolgens werd gekeken of PHF6‐knockdown een al dan niet groter effect had op de celcyclus na behandelen van de cellen met celcyclusverstorende compounds, zoals etoposide, olaparib en hydroxyurea. Etoposide is een topoisomerase II inhibitor die een arrest in de G2/M‐fase veroorzaakt, olaparib is een PARP‐inhibitor en leidt eveneens tot arrest in G2/M. Hydroxyurea tot slot zorgt voor blokkering van de synthese van deoxynucleotides, waardoor DNA‐ synthese verhinderd wordt en bijgevolg arrest in de S‐fase plaatsvindt. Na voorafgaande celcyclus perturbatie met deze celcyclusverstorende compounds vertoonden controle en PHF6‐deficiënte cellen enkele significante verschillen: na behandeling met 10 µM olaparib bevond een grotere fractie PHF6‐deficiënte ALL‐SIL cellen zich in de S‐fase van de celcyclus, ten opzichte van (PHF6‐wildtype) controle cellen. In PHF6‐deficiënte MOLT4 cellen steeg de fractie cellen aanwezig in de S‐fase en de G2/M‐fase na behandeling met 0,05 µM etoposide. PHF6 zou dus mogelijks 54 een rol kunnen spelen in regulatie tijdens deze fasen. Wang et al. observeerden tijdens hun experimenten in 293T‐cellen en HeLa‐cellen een verhoogd percentage cellen in de G2/M‐fase na neerregulatie van PHF6, gepaard gaande met een verhoogde rRNA transcriptie en een verhoogde rDNA‐schade 86. Deze resultaten werden bekomen bij bijna volledige knockdown van PHF6. Mogelijks werden in onze experimenten te lage knockdown niveaus bereikt om een zeer duidelijk celcycluseffect te kunnen waarnemen. Een andere mogelijkheid is dat de effecten van PHF6 ook hier cellijnspecifiek en contextafhankelijk kunnen zijn. 4.3 Spatio-temporele lokalisatie van PHF6 In een laatste luik van deze thesis werd de lokalisatie van PHF6 onderzocht. Eerst werd geverifieerd wat in de literatuur reeds aangetoond werd; nl. dat PHF6 voornamelijk gelokaliseerd is in de kern met sterke aanrijking in de nucleoli. Dit werd bevestigd via immunofluorescente kleuring van PHF6 in NHDF cellen en via fluorescentiemicroscopische opnames van HEK293T GFP‐PHF6 cellen. In deze cellen komt GFP‐PHF6 constitutief tot overexpressie; de subcellulaire lokalisatie van GFP‐PHF6 kan bijgevolg in real time gevolgd worden doorheen de cel via fluorescentiemicroscopie. Een tijdsgebonden opname bracht aan het licht dat PHF6 interageert met de chromosomen tijdens de mitose, vanaf de metafase tot en met de telofase, terwijl tijdens de interfase geen of zwakkere binding plaatsvindt. Liu et al. toonden ook reeds aan dat PHF6 aan dubbelstrengig DNA kan binden via zijn tweede PHD‐zinkvinger, maar nog niet dat deze binding voornamelijk plaatsvindt tijdens de mitose 69. Een voorbeeld van een ander eiwit dat interageert met de chromosomen tijdens de mitose is het H3K4 histon methyl‐transferase MLL 89. Uit de studies bleek dat MLL bijdraagt tot een versnelde reactivatie van genen na exit uit de mitose. Op basis van deze voorgaande studies en onze eigen nieuwe bevindingen zou het dus kunnen dat PHF6 eveneens een rol speelt in epigenetische regulatie tijdens de mitose. Vervolgens werd onderzocht of PHF6 kan gerekruteerd worden naar plaatsen van DNA‐schade met behulp van de GFP‐PHF6 overexpresserende HEK293T cellijn. Dit gebeurde via micro‐irradiatie experimenten: met een korte UV‐laserpuls werd DNA‐schade toegebracht in een zeer gefocust gebied. Om de juiste belichtingscondities te bepalen die DNA‐schade induceren (en meerbepaald dubbelstrengige breuken), werden de parameters eerst gevalideerd in de U2OS GFP‐53BP1 cellijn. In deze cellijn komt de herstelmerker 53BP1 gebonden aan GFP constitutief tot overexpressie, waardoor deze herstelmerker in real time kan gevolgd worden wanneer DNA‐schade geïnduceerd wordt. Dezelfde belichtingsparameters die in de U2OS cellijn zorgden voor een duidelijke relokalisatie van GFP‐53BP1 naar de plaats van DNA‐schade, werden gebruikt in micro‐irradiatie experimenten in de HEK293T GFP‐PHF6 cellijn. Tijdens deze experimenten werd echter tot na twintig minuten geen duidelijke verplaatsing van PHF6 naar de plaatsen van DNA‐schade waargenomen. Mogelijks maakt PHF6 dus niet rechtstreeks deel uit van het DNA‐schadeherstelapparaat. Een andere mogelijkheid is dat rekrutering van PHF6 naar DNA‐schade cellijn‐ of context‐specifiek is. 55 56 5 Conclusies en toekomstperspectieven Uit de uitgevoerde experimenten tijdens deze thesis kunnen reeds een aantal conclusies getrokken worden omtrent de rol van PHF6: (1) in de T‐ALL cellijnen Jurkat en ALL‐SIL leidt neerregulatie van PHF6 tot hogere schadeniveaus, vooral na behandelen met een genotoxisch agens. (2) In ALL‐SIL cellen leidt PHF6‐inactivatie tot een trager DNA‐schadeherstel. Om te bepalen of deze veranderde kinetiek een algemeen concept is in T‐ALL, zullen gelijkaardige experimenten ook in andere T‐ALL cellijnen moeten uitgevoerd worden. (3) PHF6 is mogelijks niet rechtstreeks betrokken in het DNA‐schadeherstel‐ apparaat, aangezien geen rekrutering van PHF6 naar specifieke plaatsen van DNA‐schade werd vastgesteld. (4) Tijdens de mitose interageert PHF6 met de chromosomen. Hoewel deze thesis tot een aantal interessante bevindingen heeft geleid zal verder onderzoek nodig zijn om de gevonden resultaten te bevestigen en de exacte rol van PHF6 in DNA schadeherstel en/of celcyclus te ontrafelen. Zo wordt momenteel gewerkt aan knockout modellen via de CRISPR technologie. Van zodra dit op punt staat, zullen de experimenten die in deze theiss werden uitgevoerd met PHF6‐knockdown modellen herhaald worden in PHF6‐knockout Jurkat, ALL‐SIL en MOLT4 cellijnen. Indien hieruit sterkere effecten (zoals een hoger DNA‐schadeniveau na schade‐inductie en een vertraagde herstelkinetiek) waargenomen worden dan deze gezien bij ca. 50 à 60 % knockdown‐ efficiëntie, kan dit bevestigen dat de waargenomen effecten kunnen worden verklaard door PHF6 inactivatie. Vervolgens kan onderzocht worden in welke specifieke schadeherstelpathway(s) PHF6 exact een rol speelt. Dit kan op verschillende manieren gebeuren. Via immunofluorescentiekleuringen kan gekeken worden naar eventuele colokalisatie tussen PHF6 en specifieke herstelmerkers, zoals bijvoorbeeld Ku70 als merker voor DNA‐schadeherstel via NHEJ. Ook kan knockdown of knockout gebeuren van eiwitten die cruciaal zijn voor een bepaalde herstelpathway, waarna gekeken wordt naar het effect van de aan‐ of afwezigheid van PHF6 op de snelheid en efficiëntie van DNA‐schadeherstel. Bijkomend kan via genexpressie profilering, immunofluorescentiekleuring en western blot onderzocht worden of de expressie van bepaalde herstelmerkers verandert in PHF6‐deficiënte cellen. Om een beter idee te verkrijgen over de rol van PHF6 in de celcyclus, kan in volgende experimenten gekeken worden naar het expressieniveau van PHF6 tijdens de verschillende fasen van de celcyclus via voorafgaande celcyclus synchronisatie van de celculturen. Ook kan via immunokleuringen naar celcyclusmerkers (zoals bijvoorbeeld PCNA als merker voor de S‐fase) in combinatie met PHF6 gekeken worden. De knockout modellen zullen ook aantonen of er effectief een grotere fractie cellen aanwezig is in de S‐fase en/of G2/M‐fase na uitschakelen van PHF6. Een andere interessante onderzoekspiste is de volgende. Via micro‐irradiatie experimenten kan in cellijnen zoals U2OS GFP‐53BP1 gekeken worden naar de kinetiek van DNA recrutering van het hersteleiwit 53BP1 in aan‐ en afwezigheid van PHF6. Indien PHF6 een rol speelt in een bepaalde herstelpathway is het mogelijk dat de kinetiek waarmee hersteleiwitten naar en terug weg van de plaats van DNA‐schade gaat, verandert. 57 We besluiten dat deze masterthesis heeft bijgedragen tot interessante inzichten in de functie van PHF6. Toch zal bijkomend onderzoek nodig zijn om de gevonden resultaten te bevestigen en de exacte rol van PHF6 in specifieke processen zoals DNA‐schadeherstel en celcyclusregulatie duidelijk te bewijzen. 58 Referenties 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. Murphy, K. Janeway's immunobiology. (Garland Science, 2011). Häggström, M. (en.wikipedia.org; 2009). Germain, R.N. T‐cell development and the CD4–CD8 lineage decision. Nature Reviews Immunology 2, 309‐322 (2002). Parham, P. The immune system. (Garland Science, 2009). Janeway, C.A., Travers, P., Walport, M. & Shlomchik, M.J. Immunobiology: the immune system in health and disease, Vol. 2. (Churchill Livingstone, 2001). Petrie, H.T., Livak, F., Burtrum, D. & Mazel, S. T cell receptor gene recombination patterns and mechanisms: cell death, rescue, and T cell production. The Journal of experimental medicine 182, 121‐127 (1995). UK, C.R. (http://www.cancerresearchuk.org/; 2014). Howlader N, Noone AM, Krapcho M, Garshell J, Miller D, Altekruse SF, Kosary CL, Yu M, Ruhl J, Tatalovich Z,Mariotto A, Lewis DR, Chen HS, Feuer EJ, Cronin KA (eds). SEER Cancer Statistics Review, 1975‐2011, National Cancer Institute. Bethesda, MD, http://seer.cancer.gov/csr/1975_2011/, based on November 2013 SEER data submission, posted to the SEER web site, April 2014. Leonard, B. Leukemia: A Research Report. (1998). Rose‐Inman, H. & Kuehl, D. Acute Leukemia. Emergency medicine clinics of North America 32, 579‐596 (2014). Craddock, C. Acute leukaemias. Medicine 37, 190‐194 (2009). Pui, C.‐H. & Evans, W.E. Treatment of acute lymphoblastic leukemia. New England Journal of Medicine 354, 166‐178 (2006). Enright, H. & Bond, J. Chronic Leukemias. Disease-a-Month 54, 242‐255 (2008). Lavallade, H.d. Chronic myeloid leukaemia. Medicine 41, 275‐277 (2013). Siegel, R., Naishadham, D. & Jemal, A. Cancer statistics, 2012. CA: a cancer journal for clinicians 62, 10‐29 (2012). Inaba, H., Greaves, M. & Mullighan, C.G. Acute lymphoblastic leukaemia. The Lancet 381, 1943‐ 1955 (2013). Rodriguez‐Abreu, D., Bordoni, A. & Zucca, E. Epidemiology of hematological malignancies. Annals of Oncology 18, i3 (2007). Ferrando, A.A. et al. Gene expression signatures define novel oncogenic pathways in T cell acute lymphoblastic leukemia. Cancer cell 1, 75‐87 (2002). De Keersmaecker, K., Marynen, P. & Cools, J. Genetic insights in the pathogenesis of T‐cell acute lymphoblastic leukemia. haematologica 90, 1116‐1127 (2005). Van Vlierberghe, P. et al. PHF6 mutations in T‐cell acute lymphoblastic leukemia. Nature genetics 42, 338‐342 (2010). Goldberg, J.M. et al. Childhood T‐cell acute lymphoblastic leukemia: the Dana‐Farber Cancer Institute acute lymphoblastic leukemia consortium experience. Journal of Clinical Oncology 21, 3616‐3622 (2003). Pui, C.‐H., Robison, L.L. & Look, A.T. Acute lymphoblastic leukaemia. The Lancet 371, 1030‐ 1043 (2008). Vogelstein, B. & Kinzler, K.W. The multistep nature of cancer. Trends in Genetics 9, 138‐141 (1993). Pui, C.‐H., Relling, M.V. & Downing, J.R. Acute lymphoblastic leukemia. New England Journal of Medicine 350, 1535‐1548 (2004). Kraszewska, M.D., Dawidowska, M., Szczepański, T. & Witt, M. T‐cell acute lymphoblastic leukaemia: recent molecular biology findings. British journal of haematology 156, 303‐315 (2012). 59 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. 47. 48. 49. 50. 60 Coustan‐Smith, E. et al. Early T‐cell precursor leukaemia: a subtype of very high‐risk acute lymphoblastic leukaemia. The lancet oncology 10, 147‐156 (2009). Haydu, J.E. & Ferrando, A.A. Early T‐cell Precursor Acute Lymphoblastic Leukemia (ETP T‐ALL). Current opinion in hematology 20 (2013). Zhang, J. et al. The genetic basis of early T‐cell precursor acute lymphoblastic leukaemia. Nature 481, 157‐163 (2012). Wood, J.L. & Chen, J. DNA‐damage checkpoints: location, location, location. Trends in Cell Biology 18, 451‐455 (2008). Van Vlierberghe, P., Pieters, R., Beverloo, H.B. & Meijerink, J.P. Molecular‐genetic insights in paediatric T‐cell acute lymphoblastic leukaemia. British journal of haematology 143, 153‐168 (2008). Okamoto, A. et al. Mutations and altered expression of p16INK4 in human cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences 91, 11045‐11049 (1994). Merlo, A. et al. 5′ CpG island methylation is associated with transcriptional silencing of the tumour suppressor p16/CDKN2/MTS1 in human cancers. Nature medicine 1, 686‐692 (1995). Herman, J.G., Jen, J., Merlo, A. & Baylin, S.B. Hypermethylation‐associated inactivation indicates a tumor suppressor role for p15INK4B. Cancer research 56, 722‐727 (1996). Weng, A.P. et al. Activating mutations of NOTCH1 in human T cell acute lymphoblastic leukemia. Science 306, 269‐271 (2004). Duncan, A.W. et al. Integration of Notch and Wnt signaling in hematopoietic stem cell maintenance. Nature immunology 6, 314‐322 (2005). Washburn, T. et al. Notch Activity Influences the αβ versus γδ T Cell Lineage Decision. Cell 88, 833‐843 (1997). Ferrando, A.A. The role of NOTCH1 signaling in T‐ALL. ASH Education Program Book 2009, 353‐ 361 (2009). Grabher, C. & Harald von Boehmer, A. Notch 1 activation in the molecular pathogenesis of T‐ cell acute lymphoblastic leukaemia. Nature Reviews Cancer 6, 347‐359 (2006). Avila, J.L. & Kissil, J.L. Notch signaling in pancreatic cancer: oncogene or tumor suppressor? Trends in Molecular Medicine 19, 320‐327 (2013). Sieber, M. & Baumgrass, R. Novel inhibitors of the calcineurin/NFATc hub‐alternatives to CsA and FK506. Cell Commun Signal 7, 25 (2009). Probst, A.V., Dunleavy, E. & Almouzni, G. Epigenetic inheritance during the cell cycle. Nature reviews Molecular cell biology 10, 192‐206 (2009). Bernstein, B.E., Meissner, A. & Lander, E.S. The mammalian epigenome. Cell 128, 669‐681 (2007). Baker, L.A., Allis, C.D. & Wang, G.G. PHD fingers in human diseases: disorders arising from misinterpreting epigenetic marks. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis 647, 3‐12 (2008). Jones, P.A. & Baylin, S.B. The epigenomics of cancer. Cell 128, 683‐692 (2007). Ting, A.H., McGarvey, K.M. & Baylin, S.B. The cancer epigenome—components and functional correlates. Genes & development 20, 3215‐3231 (2006). Wang, G.G., Allis, C.D. & Chi, P. Chromatin remodeling and cancer, Part I: Covalent histone modifications. Trends in molecular medicine 13, 363‐372 (2007). Wang, G.G., Allis, C.D. & Chi, P. Chromatin remodeling and cancer, Part II: ATP‐dependent chromatin remodeling. Trends in molecular medicine 13, 373‐380 (2007). Van Vlierberghe, P. & Ferrando, A. The molecular basis of T cell acute lymphoblastic leukemia. The Journal of clinical investigation 122, 3398‐3406 (2012). Ntziachristos, P. et al. Genetic inactivation of the polycomb repressive complex 2 in T cell acute lymphoblastic leukemia. Nature medicine 18, 298‐303 (2012). De Keersmaecker, K. et al. Exome sequencing identifies mutation in CNOT3 and ribosomal genes RPL5 and RPL10 in T‐cell acute lymphoblastic leukemia. Nature genetics 45, 186‐190 (2013). 51. 52. 53. 54. 55. 56. 57. 58. 59. 60. 61. 62. 63. 64. 65. 66. 67. 68. 69. 70. 71. 72. 73. 74. 75. Van der Meulen, J., Van Roy, N., Van Vlierberghe, P. & Speleman, F. The epigenetic landscape of T‐cell acute lymphoblastic leukemia. The international journal of biochemistry & cell biology (2014). Peterson, C.L. & Workman, J.L. Promoter targeting and chromatin remodeling by the SWI/SNF complex. Current Opinion in Genetics & Development 10, 187‐192 (2000). Hake, S., Xiao, A. & Allis, C. Linking the epigenetic ‘language’of covalent histone modifications to cancer. British journal of cancer 90, 761‐769 (2004). Ramirez, L.Y. et al. Potential chemotherapy side effects: what do oncologists tell parents? Pediatric blood & cancer 52, 497‐502 (2009). Zhao, W. Targeted therapy in T‐cell malignancies: dysregulation of the cellular signaling pathways. Leukemia 24, 13‐21 (2009). Weerkamp, F., van Dongen, J. & Staal, F. Notch and Wnt signaling in T‐lymphocyte development and acute lymphoblastic leukemia. Leukemia 20, 1197‐1205 (2006). van Es, J.H. et al. Notch/γ‐secretase inhibition turns proliferative cells in intestinal crypts and adenomas into goblet cells. Nature 435, 959‐963 (2005). Real, P.J. & Ferrando, A.A. NOTCH inhibition and glucocorticoid therapy in T‐cell acute lymphoblastic leukemia. Leukemia 23, 1374‐1377 (2009). Lower, K.M. et al. Mutations in PHF6 are associated with Börjeson–Forssman–Lehmann syndrome. Nature genetics 32, 661‐665 (2002). Chao, M.M. et al. T‐cell acute lymphoblastic leukemia in association with Börjeson–Forssman– Lehmann syndrome due to a mutation in PHF6. Pediatric blood & cancer 55, 722‐724 (2010). Yoo, N.J., Kim, Y.R. & Lee, S.H. Somatic mutation of PHF6 gene in T‐cell acute lymphoblatic leukemia, acute myelogenous leukemia and hepatocellular carcinoma. Acta Oncologica 51, 107‐111 (2012). Van Vlierberghe, P. et al. PHF6 mutations in adult acute myeloid leukemia. Leukemia 25, 130‐ 134 (2010). Todd, M.A. & Picketts, D.J. PHF6 interacts with the nucleosome remodeling and deacetylation (NuRD) complex. Journal of proteome research 11, 4326‐4337 (2012). Voss, A.K. et al. Protein and gene expression analysis of< i> Phf6</i>, the gene mutated in the Börjeson–Forssman–Lehmann Syndrome of intellectual disability and obesity. Gene Expression Patterns 7, 858‐871 (2007). Li, H. et al. Molecular basis for site‐specific read‐out of histone H3K4me3 by the BPTF PHD finger of NURF. Nature 442, 91‐95 (2006). Shi, X. et al. ING2 PHD domain links histone H3 lysine 4 methylation to active gene repression. Nature 442, 96‐99 (2006). Wysocka, J. et al. A PHD finger of NURF couples histone H3 lysine 4 trimethylation with chromatin remodelling. Nature 442, 86‐90 (2006). Zeng, L. et al. Mechanism and regulation of acetylated histone binding by the tandem PHD finger of DPF3b. Nature 466, 258‐262 (2010). Liu, Z. et al. in J Biol Chem, Vol. 289 10069‐10083 (United States; 2014). Bienz, M. The PHD finger, a nuclear protein‐interaction domain. Trends in biochemical sciences 31, 35‐40 (2006). Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature 362, 709‐715 (1993). Friedberg, E.C. Suffering in silence: the tolerance of DNA damage. Nature Reviews Molecular Cell Biology 6, 943‐953 (2005). Sancar, A., Lindsey‐Boltz, L.A., Ünsal‐Kaçmaz, K. & Linn, S. Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints. Annual review of biochemistry 73, 39‐85 (2004). Giglia‐Mari, G., Zotter, A. & Vermeulen, W. DNA damage response. Cold Spring Harbor perspectives in biology 3, a000745 (2011). Zhou, B.‐B.S. & Elledge, S.J. The DNA damage response: putting checkpoints in perspective. Nature 408, 433‐439 (2000). 61 76. 77. 78. 79. 80. 81. 82. 83. 84. 85. 86. 87. 88. 89. 62 Almeida, K.H. & Sobol, R.W. A unified view of base excision repair: lesion‐dependent protein complexes regulated by post‐translational modification. DNA repair 6, 695‐711 (2007). Hegde, M.L., Hazra, T.K. & Mitra, S. Early steps in the DNA base excision/single‐strand interruption repair pathway in mammalian cells. Cell research 18, 27‐47 (2008). Schreiber, V. et al. Poly (ADP‐ribose) polymerase‐2 (PARP‐2) is required for efficient base excision DNA repair in association with PARP‐1 and XRCC1. Journal of Biological Chemistry 277, 23028‐23036 (2002). Gueven, N. et al. Aprataxin, a novel protein that protects against genotoxic stress. Human molecular genetics 13, 1081‐1093 (2004). Caldecott, K.W. Mammalian single‐strand break repair: mechanisms and links with chromatin. DNA repair 6, 443‐453 (2007). El‐Khamisy, S.F. et al. Synergistic decrease of DNA single‐strand break repair rates in mouse neural cells lacking both Tdp1 and aprataxin. DNA repair 8, 760‐766 (2009). De Lorenzo, S.B., Patel, A.G., Hurley, R.M. & Kaufmann, S.H. The elephant and the blind men: making sense of PARP inhibitors in homologous recombination deficient tumor cells. Frontiers in oncology 3 (2013). Matsuoka, S. et al. ATM and ATR substrate analysis reveals extensive protein networks responsive to DNA damage. Science 316, 1160‐1166 (2007). Smeenk, G. et al. The NuRD chromatin–remodeling complex regulates signaling and repair of DNA damage. The Journal of cell biology 190, 741‐749 (2010). Lowndes, N.F. & Toh, G.W.‐L. DNA repair: the importance of phosphorylating histone H2AX. Current Biology 15, R99‐R102 (2005). Wang, J. et al. PHF6 regulates cell cycle progression by suppressing ribosomal RNA synthesis. Journal of Biological Chemistry 288, 3174‐3183 (2013). Kustatscher, G. et al. in EMBO J, Vol. 33 648‐664 (England; 2014). Chen, A. PARP inhibitors: its role in treatment of cancer. Chinese journal of cancer 30, 463‐471 (2011). Blobel, G.A. et al. in Mol Cell, Vol. 36 970‐983 (2009 Elsevier Inc., United States; 2009). Bijlage ɣH2AX-kwantificatie in PHF6-knockdown cellen Enkelvoudige transfectie in NHDF cellen In humane fibroblasten (NHDF) werden zowel een enkelvoudige als een dubbele lipofectamine‐ gemedieerde transfectie uitgevoerd. In onderstaande afbeeldingen zijn de resultaten weergegeven van de enkelvoudige transfectie. PHF6‐wildtype en PHF6‐knockdown cellen werden gedurende twee uur behandeld met 1 µM etoposide, waarna DNA‐schadeniveaus bepaald werden. De neerregulatie van PHF6 bleek zo goed als geen effect te hebben op de hoeveelheid geïnduceerde DNA‐schade. Geïnduceerde DNA-schadeniveaus in controle en PHF6-knockdown fibroblasten. De boxplots geven de resultaten weer van de met doxorubicine behandelde cellen in fibroblasten die eenmalig getransfecteerd werden. De mediane ɣH2AX-intensiteit, het aantal foci en foci-bezetting in de kern worden weergegeven. Er is geen verschil te zien in het aantal foci en de focibezetting tussen controlecellen en PHF6-deficiënte cellen. Wel is er verschil in intensiteit te zien, waarbij iets minder schade waarneembaar is in PHF6-deficiënte cellen. De verschillende significantieniveaus zijn: ‘n.s.’ niet significant, ‘*’ p < 0,001 en ‘***’ p < 0,05. 63 Herstelkinetiek in PHF6‐knockdown ALL‐SIL cellen DNA‐schadeniveaus na 24 uur herstel In een eerste tijdsexperiment in ALL‐SIL werden op twee tijdstippen cellen gecollecteerd: meteen na twee uur behandeling met 5 µM etoposide en na 24 uur herstel. Dit tijdsinterval bleek te groot te zijn. De etoposide‐behandelde stalen waren reeds tot basale DNA‐schadeniveaus hersteld, zoals te zien is in onderstaande figuur. In volgende experimenten werd gecollecteerd op een vroeger tijdstip, nl. na 6 uur herstel. Effect van PHF6 knockdown op etoposide-geïnduceerde DNA-schadeniveaus in ALL-SIL cellen. PHF6 wiltype en PHF6 knockdown cellen werden gedurende twee uur behandeld met 5 µM etoposide. Etoposide bleek in de controle stalen niet gewerkt te hebben. Wel werd basaal een hoger schadeniveau vastgesteld in PHF6 knockdown cellen. Na 24 uur herstel zijn alle schadeniveaus tot een basaal niveau gezakt. DNA‐schadeniveaus na 6 uur herstel De resultaten die bekomen werden in 3.3.2, konden reeds in een onafhankelijk experiment herhaald worden. ALL‐SIL cellen werden gedurende twee uur behandeld met 5 µM etoposide. Er werd gekeken naar de DNA‐schade geïnduceerd na deze twee uur, en naar het herstel na zes uur. PHF6 wildtype cellen bleken reeds volledig hersteld te zijn na zes uur, PHF6 knockdown cellen vertoonden echter nog significant meer DNA‐schade. Effect van PHF6 knockdown op etoposide-geïnduceerde DNA-schadeniveaus in ALL-SIL cellen. (A) Wanneer gekeken wordt naar de mediane ɣH2AX-intensiteit, kan worden vastgesteld dat etoposide-behandelde PHF6-deficiënte cellen significant meer schade opliepen in vergelijking met PHF6-wildtype cellen. Na 6 uur herstel zijn de schadeniveaus reeds gedaald, waarbij te zien is dat het schadeniveau bij PHF6-deficiënte cellen minder sterk gedaald is. De verschillende significantieniveaus zijn: ‘n.s.’ niet significant en ‘***’ p < 0,05. (B) Er werd 50% knockdown bereikt via elektroporatie met siRNA’s. 64 Celcyclus experimenten Western blot data en knockdown niveaus Er werden celcyclus experimenten uitgevoerd in drie T‐ALL cellijnen: Jurkat, ALL‐SIL en MOLT4. De knockdown niveaus verkregen tijdens de verschillende experimenten worden in onderstaande figuur weergegeven. Behaalde knockdown niveaus tijdens de celcyclus experimenten. Per cellijn worden de knockdown niveaus weergegeven. In Jurkat cellen werd PHF6 uitgeschakeld via transductie met shRNA’s (A en C) of via elektroporatie met siRNA’s (B). In ALL-SIL en MOLT4 cellen gebeurde PHF6 neerregulatie eveneens via elektroporatie met siRNA’s (D – I). Er werden knockdown niveaus bereikt gaande van 58% tot en met 81%. 65
