Inleidingsles automatische celtellingen

Inleidingsles
automatische celtellingen
GASO-ASO Klinische Biologie
dr. apr.-biol. D. Kieffer
Automatische celtellingen
Algemeen
Siemens
Abbott
Sysmex
Beckman-Coulter
2
Automatische celtellingen
Algemeen
• celtellingen:
– grote aantallen te analyseren stalen
– meetfouten verbonden aan de manuele technieken
 volautomatische analysetoestellen.
• volautomatische analyse:
–
–
–
–
–
vertrekkend van 100-200 µL volbloed (K2EDTA),
zelfstandig uitvoeren van een aantal diluties,
simultane analyse van verschillende parameters
resultaten - al dan niet na elektronische verwerking – samengevoegd op rapport
doorsturen van deze resultaten naar een externe computer (LIS)
3
Automatische celtellingen
Algemeen
• naargelang complexiteit van analysetoestel:
 7 (Hb, Hct, RBC, WBC, MCV, MCH, MCHC) tot > 110 meetgegevens
 al dan niet inclusief volledige (5-diff) of partiële (3-diff) WBC formule
• staalname:
 manueel of automatisch,
 vanaf open of gesloten bloedstaal
• allemaal uitgerust met barcode-lezer, zodat de meest frequente en gevaarlijke
fouten, namelijk staalverwisselingen, theoretisch kunnen voorkomen worden
4
Automatische celtellingen
Algemeen
• monster volumina
–
–
–
–
capillair bloed
manueel/open
automatisch/gesloten
lichaamsvochten
Sysmex XE-5000
40 µL
130 µL
200 µL
130 µL
Sysmex XN
/
88 µL
88 µL
88 µL
5
Automatische celtellingen
Algemeen
• dilutorgedeelte  meestal twee hoofdsuspensies bereid
– 1 in functie van analysen i.v.m. WBC en hemoglobine
– 1 sterker verdunde in functie van analysen i.v.m. RBC en PLT.
– metingen ivm WBC worden uitgevoerd na voorafgaande lyse van de RBC.
• hoge precisie bij aanmaak diluties (CV < 0.5 % voor volumes van enkele mL)
– roterende klep (“shear valve” of “sample rotor valve”)
– 3 keramische elementen, 2 vaste en 1 bewegend, met uitsparingen bepaald volume
6
Automatische celtellingen
Algemeen
• werking:
– stap 1 : aanzuiging bloed; de verschillende uitsparingen worden met bloed gevuld
– stap 2 : rotatie van het bewegend gedeelte, waardoor één of meer welbepaalde
delen van de bloedlijn afgesneden worden
– stap 3 : terugspuiten afgesneden gedeelten van de bloedlijn met welbepaalde
volumes diluens, waardoor zeer nauwkeurige diluties worden verkregen
• van 100 tot 200 µL opgezogen staal: slechts de laatste tientallen µL gebruikt;
grootste deel van bloed om toestel te “decontamineren” van voorgaande staal.
7
Automatische celtellingen
Algemeen
8
Automatische celtellingen
Algemeen
Sysmex XE-5000
Bron: Sysmex Be/Nl
9
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes
•
•
•
•
colorimetrie
impedantie
lichtverstrooiing & fluorescentie
lichtverstrooiing & conductiviteit
Bijkomende principes
•
•
•
•
cytochemie
specifieke lyse
hoogfrequent wisselstroom
depolarizatie verstrooid licht
10
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes
•
•
•
•
colorimetrie
impedantie
lichtverstrooiing & fluorescentie
lichtverstrooiing & conductiviteit
Bijkomende principes
•
•
•
•
cytochemie
specifieke lyse
hoogfrequent wisselstroom
depolarizatie verstrooid licht
11
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: colorimetrie
• Hb referentie methode – manueel
– RBC lyseren in 1:500 verdunning
– stap 1: Hb met gebonden Fe2+ wordt geoxideerd door K3(Fe(CN)6  metHb (Fe3+)
– stap 2: MetHb reageert met KCN
 stabiel, rood cyaan-hb complex
 absorptie maximum bij 546 nm
– extinctie vh absorptie maximum is rechtstreeks evenredig met hoeveelheid Hb
• nadelen:
– toxisch KCN
– trage reactie (stabiel complex pas na 5-6 minuten)
– geen meting van sulfHb
12
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: colorimetrie
• cyanide-vrije (gemodificeerde) Hb-methoden: vb.: Sysmex SLS-methode
– SLS = Sodium Lauryl Sulphate = niet-toxisch detergens (~ zeep)
Bron: Sysmex Be/Nl
13
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: colorimetrie
• cyanide-vrije (gemodificeerde) Hb-methoden: vb.: Sysmex SLS-methode
– SLS = Sodium Lauryl Sulphate, niet toxisch, deel uitmakend van een zeep
• lysis RBC door absorptie van SLS aan de RBC membraan
Bron: CAT A. Vandermeersch
14
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: colorimetrie
• hydrofobe groep van SLS reageert met hemoglobine
– Fe2+ (hemo) wordt geoxideerd tot Fe3+ (hemi)
• hydrofiele groep van SLS bindt Fe3+
– vorming stabiel SLS-Hb
• fotometrische bepaling van SLS-Hb bij 540 nm
15
Bron: Sysmex Be/Nl
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: colorimetrie
• interferenties?
– lipemie
• SLS = detergens dus weinig interferentie met lipiden
– hoge WBC telling
• afzonderlijke meetkamer voor Hb
• lysis van WBC dus geringe interferentie
16
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes
•
•
•
•
colorimetrie
gemeten
impedantie
lichtverstrooiing & fluorescentie
lichtverstrooiing & conductiviteit
hemoglobine
Bijkomende principes
•
•
•
•
cytochemie
specifieke lyse
hoogfrequent wisselstroom
depolarizatie verstrooid licht
17
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: impedantie
• 1949: Wallace Coulter
• 1953: patent
18
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: impedantie
• ~ Coulter principe
– apparaat waarin glazen buis met een zeer kleine opening(= telbuis of aperture)
geplaatst is in een suspensie van bloedcellen
– door vacuüm wordt die suspensie in telbuis opgezogen
– tijdens dit proces: elektrische weerstand aangelegd tussen 2 elektroden: één in de
celsuspensie, de andere in de telbuis
– elektrolytenoplossing (met suspensie bloedcellen) zorgt voor geleiding van stroom
– owv vacuüm, passage van een cel door nauwe opening van telbuis
 verandering/verhoging elektrische weerstand (= impedantie)
– hoe groter de cel, hoe hoger de verandering in elektrische weerstand
– Histogram = 2-dimensionaal
19
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: impedantie
20
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: impedantie
21
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: impedantie
• impedantie: verandering van elektrische weerstand
• hoogte van het signaal (grafiek piek) is evenredig met het volume van de cel
Bron: Analis Be (Beckman/Coulter
22
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: impedantie  RBC histogram
• RBC veroorzaken impedantie pieken met volume tussen 35 en 120 femtoliter
Bron: Analis Be (Beckman/Coulter
23
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: impedantie  PLT histogram
• PLT veroorzaken impedantie pieken met volume tussen 2 en 20 femtoliter
Bron: Analis Be (Beckman/Coulter
24
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: impedantie  WBC (3-diff) histogram
• partiële leukocytendifferentiatie (3-diff) obv impedantie is mogelijk
• WBC suspenderen in hypotoon milieu
• selectieve opzwelling van de WBC
– granulocyten > mononucleairen
– lysis lymfocyten: detectie celkernen < mononucleairen < genulocyten
25
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: impedantie  WBC (3-diff) histogram
• partiële leukocytendifferentiatie (3-diff) obv impedantie is mogelijk
• WBC suspenderen in hypotoon milieu
• selectieve opzwelling van de WBC
LY
MO
EO
NE
Bron: Analis Be (Beckman/Coulter
BA
26
Automatische celtellingen
Bron: Analis Be (Beckman/Coulter
Hoofdprincipes: impedantie
27
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: impedantie & hydrodynamische focusering
29
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: impedantie & hydrodynamische focusering
• 2 concentriche vloeistofstromen
– via centraal kanaal: injectie vh staal
– omgeven door een snel stromende elektrolytenoplossing: mantelvloeistof
• beweging mantelvloeistof:
– centrale vloeistofstroom vernauwt
– snelheid midden centrale vloeistofstroom > rand centrale vloeistofstroom
 partikels (cellen) worden op 1 lijn gedwongen
 slechts 1 cel tegelijk passeert de opening
30
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: impedantie & hydrodynamische focusering
back sheath-flow
front sheath-flow
Bron: Sysmex Be/Nl
31
Automatische celtellingen
Bron: Sysmex Be/Nl
Hoofdprincipes: impedantie & hydrodynamische focusering
32
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: impedantie & hematocriet meting
• referentie methode
–
–
–
–
eenvoudige volume bepaling van de corpusculaire deeltjes in bloed
bloed wordt opgezogen in speciale capillairen (heparine coating)
capillairen worden afgesloten met speciale folie en in speciale centrifuge
speciale centrifuge: scheiding vaste en vloeibare delen tgv verschillende
specifiekgewicht van plasma en bloeddeeltjes
33
Bron: Sysmex Be/Nl
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: impedantie & hematocriet meting
• referentie methode
– waarden aflezen van schaal waarin tube in 10 gelijke fracties verdeeld wordt
– scheidingslijn doorheen de splitsing van de RBC zone en de WBC zone = Hct
34
Bron: Sysmex Be/Nl
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: impedantie & hematocriet meting
• methode Sysmex = cumulatieve pulsehoogte detectie
– sommatie van alle individuele pulsen in het RBC-kanaal
Bron: Sysmex Be/Nl
35
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: impedantie & hematocriet meting
• methode Sysmex = cumulatieve pulsehoogte detectie
– zelfs met maximale sedimentatie van de RBC in de centrifuge
 kleine hoeveelheid plasma tussen de cellen
– celtellers houden hiermee rekening dmv een constante
Ph = k x VRBC
Bron: Sysmex Be/Nl
36
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: impedantie & hematocriet berekening
• methode Beckman-Coulter, Siemens, Abbott
 berekening Hct (GEEN rechtstreekse meting) obv meting MCV (impedantie)
 MCV (fL) x RBC (10e6/µL)
 factor voor “trapped plasma”?
37
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: impedantie & RBC indices – berekend
Bron: Sysmex Be/Nl
38
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: impedantie & RBC indices – berekend (RDW)
• RDW (Red Cell Distribution Width) = variatiecoëfficient van erytrocytenvolume
• parameter afgeleid uit frequentiehistogram van RBC volume
• RDW is objectieve maat voor grootteverdeling van RBC populatie
 maat voor anisocytose.
• eenheid: %
• referentiewaarden: 11,5 - 14,5% (toestelafhankelijk)
39
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: impedantie & RBC indices – berekend (RDW)
40
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: impedantie & PLT indices – berekend (MPV)
• MPV (Mean platelet volume) = gemiddeld bloedplaatjesvolume
• parameter afgeleid uit het PLT frequentiehistogram
• term “mean” is misleidend : naargelang gebruikte apparatuur is MPV
– gemiddelde waarde van het bloedplaatjesvolume
– mediaanwaarde van het bloedplaatjesvolume
– modus van het bloedplaatjesvolume
• onderliggende oorzaak is dat het bloedplaatjesfrequentiehistogram geen
gausskromme is, maar een scheve populatie.
• eenheid : fL (femtoliter)
• referentiwaarden: 7 – 11 tot 9 – 13 fL (instrumentgebonden)
41
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: impedantie & PLT indices – berekend (MPV)
42
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes
• colorimetrie
• impedantie
gemeten
gemeten
berekend
• lichtverstrooiing & fluorescentie
• lichtverstrooiing & conductiviteit
hemoglobine
RBC, PLT, (WBC + 3-diff), Hct*
MCV*, MCH, MCHC, RDW, MPV
Bijkomende principes
•
•
•
•
cytochemie
specifieke lyse
hoogfrequent wisselstroom
depolarizatie verstrooid licht
43
* Afhankelijk van type toestel
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes
•
•
•
•
colorimetrie
impedantie
lichtverstrooiing & fluorescentie
lichtverstrooiing & conductiviteit
Bijkomende principes
•
•
•
•
cytochemie
specifieke lyse
hoogfrequent wisselstroom
depolarizatie verstrooid licht
44
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing
• ~ flow cytometrie = meting in een “flow”
• verstrooiing/afbuiging van licht/laserstraal
– cellen in oplossing komen door een “flow cell”
– mbv hydrodynamische focussering
– laserstraal (coherent, monochromatisch)
• voorwaartse lichtverstrooiing ~ cel volume/grootte
• zijwaartse lichtverstrooiing ~ interne structuur
(granulen, kernvorm)
45
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing
Voorwaartse lichtverstrooiing
Bron: Thesis C. Motmans KH LIM
46
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing
Meting voorwaartse lichtverstrooiing
Bron: Thesis C. Motmans KH LIM
47
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing
Intensiteit van verstrooid licht wordt omgezet in spanning
Bron: Thesis C. Motmans KH LIM
48
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing
Grootte van de spanning ~ grootte van de cel
Bron: Thesis C. Motmans KH LIM
49
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing
Zijwaartse lichtverstrooiing, hoe meer verstrooiing, hoe meer granulatie
Bron: Thesis C. Motmans KH LIM
50
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing
Bron: Thesis C. Motmans KH LIM
51
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & fluorescentie
• fluorescentie flow cytometrie
– reagens 1: verlaging oppervlaktespanning, lysis RBC en PLT en perforatie WBC
– reagens 2: polymethine kleurstof dringt geperforeerde WBC binnen
 kleuring DNA/RNA
 supravitale kleuring
– informatie over:
•
•
•
•
celvolume,
intracellulaire componenten
celactiviteit (delingsvermogen van de kern, DNA)
cytoplasma-activiteit (eiwitsynthese, RNA)
52
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & fluorescentie
• fluorescentie flow cytometrie
– na kleuring  detectie door laser (“flow cell”)
– hydrodynamische focusering om cellen 1 voor 1 te laten passeren
– de emissie van licht op de fluorescerende WBC
 productie licht met langere golflengte dan het originele licht
– intensiteit van fluorescerende licht stijgt met hogere concentratie van de kleuring
53
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & fluorescentie
54
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & fluorescentie
• wat is speciaal aan fluorescentie flow cytometrie?
– polymetine kleurt DNA/RNA = supravitale kleuring
– ook RNA wordt gekleurd (cytoplasma informatie)
• dus niet alleen informatie over
– celvolume (voorwaartse verstrooiing)
– intracellulaire componenten, nucleus en granulae... (zijwaartse verstrooiing)
• maar ook informatie over de celactiviteit
– duplicatie activiteit van de kern (hoog DNA)
– cytoplasma-activiteit (proteïne synthese, hoog RNA)
 4-delige differentiatie!!
55
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & fluorescentie
Bron: Sysmex Be/Nl
56
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & fluorescentie
Bron: Sysmex Be/Nl
57
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & fluorescentie
• 4-delige differentiatie (= 4-diff kanaal)
– reagens 1: verlaging oppervlaktespanning, lysis RBC en PLT en perforatie WBC
– reagens 2: polymethine kleurstof  kleuring RNA/DNA
Bron: Sysmex Be/Nl
58
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & fluorescentie
• 4-delige differentiatie (= 4-diff kanaal)
– reagens 1: verlaging oppervlaktespanning, lysis RBC en PLT en perforatie WBC
– reagens 2: polymethine kleurstof  kleuring RNA/DNA
59
Bron: Sysmex Be/Nl
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & fluorescentie
• 4-delige differentiatie (= 4-diff kanaal)
– reagens 1: verlaging oppervlaktespanning, lysis RBC en PLT en perforatie WBC
– reagens 2: polymethine kleurstof  kleuring RNA/DNA
Bron: Sysmex Be/Nl
• “scattergram”
60
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & fluorescentie
• 4-delige differentiatie (= 4-diff kanaal)
– reagens 1: verlaging oppervlaktespanning, lysis RBC en PLT en perforatie WBC
– reagens 2: polymethine kleurstof  kleuring RNA/DNA
Bron: Sysmex Be/Nl
• “scattergram”
61
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & fluorescentie
• 4-delige differentiatie (= 4-diff kanaal)
– reagens 1: verlaging oppervlaktespanning, lysis RBC en PLT en perforatie WBC
– reagens 2: polymethine kleurstof  kleuring RNA/DNA
• “normaal scattergram”
“abnormaal scattergram”
62
Bron: Sysmex Be/Nl
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & ACAS
• ACAS = Adaptive Cluster Analysis System
Bron: Sysmex Be/Nl
63
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & ACAS
• ACAS = Adaptive Cluster Analysis System
herkenning van de centrale positie van elke WBC populatie
berekening van lokatie en waarschijnljkheid van elk “dal” tussen celpopulaties
celpopulaties weergeven als wolken in scattergram
voor elk monster berekening van discriminatoren tussen elke individuele populatie
Bron: Sysmex Be/Nl
–
–
–
–
64
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & ACAS
• ACAS = Adaptive Cluster Analysis System
a. “centroïden”
Bron: Sysmex Be/Nl
• eerste en initiële centroïden beschikbaar
• start positie van centroïden werd bepaald uit duizenden monsters
• deze waarden als start positie voor cluster analyse
65
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & ACAS
• ACAS = Adaptive Cluster Analysis System
b. “Mahalanobis afstand”
cel gedetecteerd  berekening afstand tussen signaal en aangegeven centroïde
deze afstand geeft aan tot welke populatie het signaal behoort
Bron: Sysmex Be/Nl
•
•
66
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & ACAS
• ACAS = Adaptive Cluster Analysis System
c. “vorming van celpopulaties”
signaal identificatie en nieuwe bepaling van centroïden
dit proces wordt uitgevoerd met 500 celsignalen
telkens worden centroïden voor lymfocyten, monocyten en granulocyten herberekend
Bron: Sysmex Be/Nl
•
•
•
67
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & ACAS
• ACAS = Adaptive Cluster Analysis System - procedure
1. analyse eerste 500 signalen met verplaatsbare centroïden
2. bepaling clusters lymfocyten, monocyten, granulocyten en ghost door analyse van
1000 signalen
3. herhaling stap 1 en 2 tot de waarden stabiel blijven  centroïden vaste positie
4. indien geen stabilisatie: geen scheiding van WBC
5. Adaptive Cluster Analysis System wordt uitgevoerd voor alle WBC
6. resultaat: zeer nauwkeurige differentiatie in vgl met manuele microscopie
7. conclusie: goede differentiatie, zelfs voor pathologische en/of oudere monsters
(48u)
68
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes
•
•
•
•
colorimetrie
impedantie
lichtverstrooiing & fluorescentie (vervolg)
lichtverstrooiing & conductiviteit
Bijkomende principes
•
•
•
•
cytochemie
specifieke lyse
hoogfrequent wisselstroom
depolarizatie verstrooid licht
dr. apr. D. Kieffer
69
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & fluorescentie
• NRBC bepaling
– lyse RBC
– reagens:
• WBC doorlaatbaar maken
• kernen NRBC blijven intact
– SFL/FSC
– automatische correctie WBC
70
Bron: Sysmex Be/Nl
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & fluorescentie
• RET bepaling
–
–
–
–
perforatie membranen RBC en WBC
fluorochroom (polymethine, RNA)
hydrodynamische focussering
SFL/FSC
• fluorescentie negatief: RBC (geen RNA)
• toenemende SFL: RET
• kleine FSC/SFL: PLT
– maturiteit (hoeveelheid RNA):
• LFR (Low Fluorescence Rate)
• MFR (Medium Fluorescence Rate)
• HFR (High Fluorescence Rate
– IRF (Immature Reticulocyte Fraction):
• (MFR + HFR) / (LFR + MFR + HFR)
• Fe-therapie/EPO/BM-transplantatie
Bron: Sysmex Be/Nl
71
Automatische celtellingen
Advanced training Sysmex XE-5000
Meet- en detectieprincipes
Marc De Schinckel | Academy-Senior Product Specialist
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & fluorescentie
Reticulocyten kanaal
• RET bepaling
dr. apr. D. Kieffer
Bron: Sysmex Be/Nl
138
72
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & fluorescentie
• RET bepaling  geautomatiseerde erythropoïese
Bron: Sysmex Be/Nl
dr. apr. D. Kieffer
73
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & fluorescentie
• RET bepaling  geautomatiseerde erythropoïese (Ret-He)
dr. apr. D. Kieffer
Bron: Sysmex Be/Nl
74
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & fluorescentie
• RET bepaling  optische meting PLT & immature PLT fractie (IPF)
–
–
–
–
perforatie membranen RBC en WBC
fluorochroom (polymethine, RNA)
hydrodynamische focussering
SFL/FSC
• fluorescentie negatief: RBC (geen RNA)
• toenemende SFL: RET
• kleine FSC/SFL: PLT
– optische meting PLT
– IPF : hogere RNA-inhoud
• DD/ thrombopenie
• BM transplantatie
75
Bron: Sysmex Be/Nl
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & fluorescentie
• RET bepaling  optische meting PLT & immature PLT fractie (IPF)
–
–
–
–
perforatie membranen RBC en WBC
fluorochroom (polymethine, RNA)
hydrodynamische focussering
SFL/FSC
• fluorescentie negatief: RBC (geen RNA)
• toenemende SFL: RET
• kleine FSC/SFL: PLT
– optische meting PLT
– IPF : hogere RNA-inhoud
• DD/ thrombopenie
• BM transplantatie
76
Bron: Sysmex Be/Nl
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & fluorescentie
Bron: Sysmex Be/Nl
77
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & fluorescentie
• RET bepaling  optische meting PLT & immature PLT fractie (IPF)
– klinische bruikbaarheid IPF  onderscheid oorzaken thrombopenie
• toegenomen vernietiging/verbruik: hoog IPF
• afgenomen productie: laaf IPF
dr. apr. D. Kieffer
78
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes
•
•
•
•
colorimetrie
impedantie
lichtverstrooiing & fluorescentie
lichtverstrooiing & conductiviteit
Bijkomende principes
•
•
•
•
cytochemie
specifieke lyse
hoogfrequent wisselstroom
depolarizatie verstrooid licht
dr. apr. D. Kieffer
79
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & conductiviteit
A differential cell count is obtained
through VCS Technology by the
interrogation of 8162 cells using the 3
separate and simultaneous probes:
- Direct Current,
- Radio Frequency Alternating Current
- Laser Light Scatter
The value of each of these measurements
positions it within the three-dimensional
array we term the 3D Dataplot.
dr. apr. D. Kieffer
80
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & conductiviteit
A differential cell count is obtained
through VCS Technology by the
interrogation of 8162 cells using the 3
separate and simultaneous probes:
- Direct Current (impedantie)
- cel volume
- RF electromagnetic current
(conductiviteit)
- interne structuur van de cel
- “opaciteit”
- Laser Light Scatter (voorwaartse
lichtverstrooiing 10 – 70°)
- vorm
- reflectie
- structuur
- “rotated light scatter”
dr. apr. D. Kieffer
81
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & conductiviteit
volume vs “discriminant functions”
(2D-plots):
- volume vs light scatter
- neutro
- eo
- mono
- lymfo + baso
- volume vs conductiviteit
- lymfo
- mono
- granulo
- volume vs “gating out neutro + eo”
- baso
- lymfo
- mono
dr. apr. D. Kieffer
82
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & conductiviteit
volume vs “discriminant functions”
(2D-plots):
volume
- volume vs light scatter (DF1)
- neutro
- eo
- mono
- lymfo + baso
- volume vs conductiviteit (DF2)
- lymfo
- mono
- granulo
- volume vs “gating out neutro/eo” (DF3)
- baso
- lymfo
- mono
DF1
83
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & conductiviteit
3D-plot: Cell location and color coding:
Lymphocytes (normal and many of the
abnormals) are colored in Blue
Monocytes (normal and many of the
abnormals) are colored in Green.
Neutrophil population (normal and many of
the abnormals) are colored in Violet.
Eosinophils (normal and many of the
abnormals) are colored in Orange.
Basophils (normal and many of the
abnormals) are colored in White/Gray.
dr. apr. D. Kieffer
84
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & conductiviteit
dr. apr. D. Kieffer
85
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes
•
•
•
•
colorimetrie
impedantie
lichtverstrooiing
fluorescentie
Bijkomende principes
•
•
•
•
cytochemie
specifieke lyse
hoogfrequent wisselstroom
depolarizatie verstrooid licht
dr. apr. D. Kieffer
86
Automatische celtellingen
Bijkomende principes: cytochemie
Advia – Siemens:
-
WBC differentiatie gebaseerd op
• peroxidase kanaal (mono, neutro, eo: peroxidase + 4-chloro-1-naphtol)
 mono, lymfo + baso, neutro en eo
• baso/lobulariteit kanaal (na zure lyse)
 baso
dr. apr. D. Kieffer
87
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes
•
•
•
•
colorimetrie
impedantie
lichtverstrooiing
fluorescentie
Bijkomende principes
•
•
•
•
cytochemie
specifieke lyse
hoogfrequent wisselstroom
depolarizatie verstrooid licht
dr. apr. D. Kieffer
88
Automatische celtellingen
Bijkomende principes: specifieke lyse
+ diff-kanaal = 5-delige (volledige differentiatie)!
dr. apr. D. Kieffer
Bron: Sysmex Be/Nl
89
Automatische celtellingen
Bijkomende principes: specifieke lyse
Bron: Sysmex Be/Nl
dr. apr. D. Kieffer
90
Automatische celtellingen
Bijkomende principes: specifieke lyse
91
Bron: Sysmex Be/Nl
Automatische celtellingen
Bijkomende principes: specifieke lyse
+ diff-kanaal = 5-delige (volledige differentiatie)!
Bron: Sysmex Be/Nl
92
Automatische celtellingen
Bijkomende principes: specifieke lyse
dr. apr. D. Kieffer
Bron: Sysmex Be/Nl
93
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes
•
•
•
•
colorimetrie
impedantie
lichtverstrooiing
fluorescentie
Bijkomende principes
•
•
•
•
cytochemie
specifieke lyse
hoogfrequent wisselstroom  eigenlijk ook hoofdprincipe!
depolarizatie verstrooid licht
dr. apr. D. Kieffer
94
Automatische celtellingen
Bijkomende principes:hoogfrequent wisselstroom
RF/DC-methode ~ VCS Coulter
RF
( impedance)
dr. apr. D. Kieffer
95
Automatische celtellingen
Bijkomende principes:hoogfrequent wisselstroom  IMI-kanaal
dr. apr. D. Kieffer
96
Automatische celtellingen
Hoofdprincipes
•
•
•
•
colorimetrie
impedantie
lichtverstrooiing
fluorescentie
Bijkomende principes
•
•
•
•
cytochemie
specifieke lyse
hoogfrequent wisselstroom
depolarizatie verstrooid licht
dr. apr. D. Kieffer
97
Automatische celtellingen
Bijkomende principes: depolarizatie verstrooid licht
dr. apr. D. Kieffer
98
Automatische celtellingen
Bijkomende principes: depolarizatie verstrooid licht
dr. apr. D. Kieffer
99
Automatische celtellingen
SYSMEX: samenvatting verschillende kanalen
dr. apr. D. Kieffer
100
pecificaties
Automatische celtellingen
Bron: Sysmex Be/Nl
SYSMEX: verschillende kanalen samenvatting
dr. apr. D. Kieffer
101
Automatische celtellingen
Advanced training Sysmex XE-5000
Meet- en detectieprincipes
Marc De Schinckel | Academy-Senior Product Specialist
SYSMEX: verschillende kanalen samenvatting
Specificaties
detector
HGB
RBC/PLTdetector
methode, dilutie
SLS-methode,
fotometrie
1:500
HDF/ DCdetectie methode
impulse sommatie
1:500
parameters
HGB
MCH, MCHC
RBC, HCT,
PLT-I, MCV,
RDW-SD,
RDW-CV,
PDW, MPV,
P-LCR, PCT
Bron: Sysmex Be/Nl
102
25
Automatische celtellingen
Advanced training Sysmex XE-5000
Meet- en detectieprincipes
Marc De Schinckel | Academy-Senior Product Specialist
SYSMEX: verschillende kanalen samenvatting
Specificaties
A
detector
WBC / BASO
4 DIFF
methode, dilutie
parameters
Flowcytometrie
diode laser - 1:50
WBC, B SO #‚ BASO %
Flowcytometrie
diode laser - 1:51
LYMPH #, LYMPH %,
MONO#,
MONO %,
EO #, EO%,
NEUT+BASO%
NEUT+BASO#
IG#, IG%
Bron: Sysmex Be/Nl
dr. apr. D. Kieffer
103
Automatische celtellingen
Advanced training Sysmex XE-5000
Meet- en detectieprincipes
Marc De Schinckel | Academy-Senior Product Specialist
SYSMEX: verschillende kanalen samenvatting
Specificaties
detector
methode, dilutie
NRBC
Flowcytometrie diode
laser - 1:51
IMI
RF/DC – detectie
methode - 1:250
parameters
NRBC #
NRBC %
IMI #, HPC #,
HPC %
Bron: Sysmex Be/Nl
dr. apr. D. Kieffer
104
Automatische celtellingen
Advanced training Sysmex XE-5000
Meet- en detectieprincipes
Marc De Schinckel | Academy-Senior Product Specialist
SYSMEX: verschillende kanalen samenvatting
Specificaties
detector
methode, dilutie
RET / PLT-O
Flowcytometrie
diode laser 1:204
parameters
RET #, RET %,
PLT-O
HFR, MFR, LFR,
IRF, Ret-He,
IPF%
Bron: Sysmex Be/Nl
dr. apr. D. Kieffer
105
28
Automatische celtellingen
Automatisatie: voor- en nadelen
Microscoop
• pro: kwalitatief: alle cellen geïdentificeerd
• contra: kwantitatief: statistisch onnauwkeurig
• contra: trage analyse , één voor één
• contra: expertise noodzakelijk (duur?)
Automaat
• contra: kwalitatief: alle cellen in 5 populaties
• pro: kwantitatief: statistisch nauwkeurig
• pro: snelle analyse
• pro: verwerking meerdere stalen
• pro: moduleerbaarheid
dr. apr. D. Kieffer
106
Automatische celtellingen
Automatisatie: voor- en nadelen: statistiek
dr. apr. D. Kieffer
107
dr. apr. D. Kieffer
108
Automatische celtellingen
Automatisatie: voor- en nadelen: moduleerbaarheid
• voorbeeld: BC 2 DXH’s (celtellers) en SMS (uitstrijktoestel)
dr. apr. D. Kieffer
109
Automatische celtellingen
Automatisatie: voor- en nadelen: moduleerbaarheid
• voorbeeld: 2x Sysmex XE-2100 en 2x uitstrijktoestellen
dr. apr. D. Kieffer
110
Automatische celtellingen
Automatisatie: voor- en nadelen: moduleerbaarheid
• voorbeeld: BC SMS (uitstrijktoestel)
dr. apr. D. Kieffer
111
Automatische celtellingen
Praktisch voorbeeld
dr. apr. D. Kieffer
112
Automatische celtellingen
Praktisch voorbeeld
dr. apr. D. Kieffer
113
Automatische celtellingen
Praktisch voorbeeld
dr. apr. D. Kieffer
114
Automatische celtellingen
Praktisch voorbeeld
dr. apr. D. Kieffer
115
Automatische celtellingen
Praktisch voorbeeld
dr. apr. D. Kieffer
116
Automatische celtellingen
Praktisch voorbeeld
dr. apr. D. Kieffer
117
dr. apr. D. Kieffer
118
dr. apr. D. Kieffer
119
Automatische celtellingen
Automatisatie: efficiëntie
•
•
•
•
•
CBC (complete blood count) + diffferentiatie + reticulocyten
uitstrijktoestel + automatische kleuring
moduleerbaarheid (koppeling verschillende toestellen)
“reflex testing”  staal opnieuw of met extra analyse
link met microscopie
dr. apr. D. Kieffer
120
Automatische celtellingen
Automatisatie: efficiëntie
• link met microscopie: manuele of automatische microscopie
dr. apr. D. Kieffer
121