DNA-schade - Steunpunt Milieu en Gezondheid

DNA-schade
Genotoxiciteit
Waarom willen we DNA-schade vaststellen?:
DNA is een molecule die alle erfelijke informatie bevat. Bij de mens zit dit DNA in de
vorm van chromosomen in de celkern van iedere cel. De genetische informatie ligt er
gerangschikt op 46 chromosomen. Fouten (mutaties) in het DNA kunnen verschillende
gevolgen hebben, waaronder overerfbare aandoeningen, premature veroudering of
kanker. Het is daarom belangrijk te weten welke milieu-invloeden het DNA van onze
cellen kunnen aantasten of welke bevolkingsgroepen gevoeliger zijn voor DNA-schade
of meer DNA-schade vertonen.
Bij biomonitoring in de mens kijken we naar schade ter hoogte van het DNA in witte
bloedcellen. Bloed kan immers op een vrij eenvoudige manier bekomen worden.
Bovendien circuleert bloed overal in het lichaam, en komt het daardoor ook in contact
met schadelijke stoffen. Het aantonen van DNA-schade in bloedcellen is daarom
geschikt als ‘biomerker’ om blootstelling aan zogenaamde ‘genotoxische’ stoffen (en
mogelijk toegebrachte schade) aan te tonen. Er bestaan vele technieken om
genetische schade op te sporen. In de humane biomonitoringscampagnes van het
Steunpunt Milieu & Gezondheid worden de komeettest en de micronucleustest
uitgevoerd op bloed. Daarnaast meten we ook 8-hydroxydeoxyguanosine in urine.
Deze stof is een maat voor de hoeveelheid herstelde oxidatieve schade in het lichaam.
Waarom de komeettest:
Deze methode wordt gekozen omdat het een vrij eenvoudige, weinig tijdrovende en
tegelijk gevoelige methode is om schade aan het DNA aan te tonen. Het gaat om
schade die niet noodzakelijk blijvend en dus niet per se gevaarlijk is. DNA-schade
bestaat voornamelijk uit tijdelijke (transiënte) herstelbare fouten (laesies) en
reflecteert een dynamische “steady state” tussen schade inductie en herstel. De
meeste, bijna alle, schade wordt correct hersteld. Dit betekent dat een toename in
DNA-schade, zoals gemeten met de komeettest, kan wijzen op een blootstelling aan
een genotoxische stof of t.g.v. een suboptimale fysiologische toestand, maar niet
noodzakelijk op een stijging van het kankerrisico.
Hoe werkt de komeettest?:
In de komeettest wordt DNA, in dit geval uit witte bloedcellen, geïsoleerd en in een gel
op een glaasje aangebracht. Vervolgens wordt de gel onder een elektrische spanning
gebracht. De DNA-fragmenten zijn negatief geladen, wat betekent dat ze in de gel naar
de positieve pool van het elektrisch veld zullen migreren. Als DNA beschadigd is,
ontstaan er meer fragmenten of losse uiteinden. Deze losse stukjes zijn lichter en
zullen dus sneller migreren. Na kleuring van het DNA kan men onder de microscoop
1
DNA-schade
Genotoxiciteit
voor elke cel een ‘DNA-komeet’ zien. Indien de DNA structuur losser wordt door
breuken in het DNA zal een belangrijk gedeelte van het DNA in de komeetstaart
migreren. De lengte en inhoud van de komeetstaart kunnen via automatische
beeldanalysesystemen zeer nauwkeurig worden gemeten. Het resultaat van de
komeettest geeft aan hoeveel % van het DNA zich in de komeetstaart bevindt. Bij nietbeschadigd DNA vindt men zo goed als geen DNA-fragmenten of losse uiteinden en zal
er weinig of geen afzonderlijke migratie optreden. Dit wordt in onderstaande figuur
geïllustreerd. Links zien we DNA van een niet-beschadigde cel; rechts DNA van twee
cellen die genetische schade hebben opgelopen. Hier is een aanzienlijke ‘komeetstaart’
zichtbaar. Na evaluatie van 300 cellen per individu wordt het mediaan percentage
DNA-migratie berekend voor elk individu. Gemiddeld meer cellen met toegenomen
DNA-migratie wijst op een verhoogde blootstelling aan genotoxische stoffen. De
merker is dus een indicator voor mogelijke blootstelling aan verontreinigende stoffen
die een gezondheidseffect kunnen hebben.
DNA van een niet beschadigde cel:
er migreren zo goed als geen losse
fragmenten
DNA van 2 beschadigde cellen:
DNA strengen vertonen een lossere
structuur en migreren
(komeetstaart)
Wat zijn micronucleï?:
De in vitro micronucleustest is een genotoxiciteitstest die op witte bloedcellen in het
bloed wordt toegepast. In het cytoplasma van delende cellen (interfase) worden
fragmenten van DNA, die gegroepeerd worden in een kleine afzonderlijke
‘micronucleus’ (= extra kleine kernen), opgespoord. Deze test wordt uitvoerig gebruikt
in moleculair epidemiologische studies om de aanwezigheid en de mate van
chromosomale schade te bestuderen. In de mens wordt de micronucleustest o.a.
toegepast bij individuen blootgesteld aan genotoxische stoffen en deficiëntie en/of
overmaat hebben aan micronutriënten.
2
DNA-schade
Genotoxiciteit
Cel zonder micronucleus
Cel met micronucleus
Hoe werkt de micronucleustest?:
In de test worden cellen (bv. humaan bloed) gekweekt en geblokkeerd in de telofase
(het binucleair celstadium) van de celdeling. Dit is het stadium net voor de eigenlijke
celdeling of cytokinese, wanneer twee volledig gevormde dochterkernen aanwezig
zijn. Het stimuleren en het blokkeren in de telofase gebeurt m.b.v.
phytohaemagglutinine (PHA) en cytochalasine B (cytoB). Micronucleï ontstaan als
tijdens de mitose volledige chromosomen of chromosoomfragmenten achterblijven en
niet migreren naar de polen van de spoelfiguur. Een nucleaire enveloppe vormt zich
rond deze chromosomen en/of fragmenten, gekend als respectievelijk aneugene en
clastogene schade. Daardoor ontstaan er structuren, micronucleï, die morfologisch
gelijken op een nucleus. De test behelst het bepalen van het aantal tweekernige cellen
(binucleaire cellen) met of zonder micronucleï wat via microscopisch onderzoek
gebeurt.
Wat is 8-hydroxydeoxyguanosine?:
8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG) is een biomerker voor oxidatieve stress. Het
molecule 8-OHdG wordt gevormd wanneer actieve vormen van zuurstof het DNA
beschadigen. De oxidatieve schade wordt hersteld door intracellulaire mechanismen.
Dit resulteert in wateroplosbare 8-OHdG-moleculen die via de urine uit het lichaam
verwijderd worden. De concentratie van 8-OHdG in urine blijkt een gevoelige maat te
zijn voor de graad van oxidatieve beschadiging van het DNA, die het risico op mutaties
kan verhogen. Blootstelling aan toxische verbindingen en stresstoestanden kunnen
bijdragen aan een toename van oxidatieve stress. Daarnaast kan er potentieel een
invloed zijn van inname van 8-OHdG via de voeding en kan het aanwezig zijn in de
urine afkomstig van afstervende cellen.
3
DNA-schade
Genotoxiciteit
Hoe wordt 8-hydroxydeoxyguanosine gemeten?:
8-OHdG wordt kwantitatief gemeten in de urine d.m.v. een competitieve in vitro
immunosorbent assay (ELISA). Op een microtiterplaat, waarvan de bodem bedekt is
met 8-OHdG, wordt een anti-8-OHdG antilichaam toegevoegd samen met het
urinestaal. Het antilichaam gaat competitief reageren met zowel 8-OHdG dat
vastgehecht is op de bodem van de plaat en 8-OHdG dat aanwezig is in het urinestaal.
Hogere concentraties 8-OHdG in het urinestaal zorgen voor een verminderde binding
van het antilichaam aan 8-OHdG dat gebonden is op de bodem van de plaat. Via
binding van een secundair antilichaam, een substraat en enzymes kan de hoeveelheid
van het gebonden 8-OHdG antilichaam aan de plaat bepaald worden a.d.h.v. de
intensiteit van de kleur. Door deze te vergelijken met standaarden (met een gekende
hoeveelheid 8-OHdG en dus bepaalde kleurintensiteit) kan vervolgens de hoeveelheid
8-OHdG in het urinestaal bepaald worden.
4