De auteur en de promotor geven de toelating deze scriptie
advertisement
“De auteur en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te
stellen en delen van de scriptie te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt
onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de
verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze
scriptie.”
“The author and the promoter give the permission to use this thesis for consultation and to
copy parts of it for personal use. Every other use is subject to the copyright laws, more
specifically the source must be extensively specified when using the results from this thesis”.
Datum: 29/05/2015
Handtekening Student
Handtekening Promotor
Voorwoord
Reeds van kinds af aan ben ik geïnteresseerd in planten en hun diversiteit. Deze interesse
heeft sterk doorgewogen in bepaalde keuzes die ik gedurende mijn leven gemaakt heb. Mijn
studiekeuze zowel in het middelbaar onderwijs en in het hoger onderwijs zijn beïnvloed door
deze interesse. Daar ik in het verleden reeds stages heb gelopen en rapporten heb
geschreven in verband met raszuiverheid en resistentieveredeling wou ik zeker in dezelfde
zin doorgaan met de masterproef. Een verruiming van ervaring naar alternatieve
veredelingsmethodes bracht me bij de ploïdieveredeling, een fascinerend onderwerp
boordevol met potentieel naar de sector toe. Bijzondere dank gaat uit naar Prof. Dr. Ir.
Stefaan Werbrouck en Ir. Hanne Denaeghel voor hun professionele hulp en begeleiding
gedurende het academiejaar. Daarnaast wil ik ook alle personeel van het Instituut voor
Landbouw- en Visserijonderzoek bedanken voor het gebruik van laboratoria, groeikamers en
apparatuur.
Abstract
In de boom- en sierplantensector staan in het huidige economische klimaat duurzaamheid en
rendabiliteit centraal. Op lange termijn is het invoeren van aangepaste cultivars uit
veredelingsprogramma’s een duurzame oplossing voor problemen waar men vandaag de
dag mee kampt. In deze thesis wordt de in vitro ploïdieveredeling van Escallonia rubra
behandeld. Voordelen van polyploïde cultivars zijn: dikker en grotere bladeren, gewijzigde
planthabitus (compactere groei), gewijzigde pigmentatie van bladeren of bloemen en hogere
tolerantie ten opzichte van abiotische stress. In een eerste onderdeel van deze thesis wordt
de in vitro cultuur van verschillende Escallonia species bestudeerd. Na het testen van
verschillende media en groeihormonen komen Murashige&Skoog medium en Woody Plant
medium naar voren als geschikte media. De gebruikte groeihormonen zijn benzyladenine en
1-naftylazijnzuur. Een tweede onderdeel onderzoekt de mogelijkheid om tetraploïden te
bekomen met behulp van verschillende oryzaline en trifluraline behandelingen. Men opteert
voor axillaire meristemen als explantaat. Zowel chronische als acute behandelingen zijn
efficiënt om polyploïdie te induceren bij Escallonia rubra. Beworteling werd in vitro geïnitieerd
om vervolgens de tetraploïden te acclimatiseren. Tot slot volgt een morfologische vergelijking
tussen tetraploïde en diploïde individuen. Hieruit blijkt dat tetraploïde planten een breder en
langer blad bezitten ten opzichte van hun diploïde tegenhangers.
Escallonia, in vitro cultuur, ploïdieveredeling, flow cytometrie, tetraploïden
In the current economic climate, sustainability and profitability are very important within
orchards and floriculture. In the long term, the introduction of new cultivars with improved
characteristics offer a sustainable solution for many problems plant propagators are faced
with today. This thesis studies the in vitro ploidy breeding of Escallonia rubra. Benefits of
polyploid cultivars are: thicker and larger leaves, altered plant habitus (compact growth),
altered pigmentation of leaves or flowers and higher tolerance to abiotic stress. The first part
of this thesis investigates the in vitro culture of different Escallonia species. After testing
different media and growth hormones, Murashige&Skoog and Woody Plant medium are
found to be appropriate for in vitro shoot culture. The growth hormones that were used are
benzyl adenine and 1-naphthaleneacetic acid. A second part examines the possibility to
obtain tetraploid plants using different oryzalin and trifluralin treatments. The explant type of
choice are axilary meristems. Both chronic and acute treatments are effective to induce
polyploidy in Escallonia rubra. Rooting was initiated in vitro in order to transfer tetraploid
plants in vivo. This thesis concludes with a morphological comparison of tetraploid and
diploid individuals. This shows that tetraploid plants have broader and longer leaves with
respect to their diploid counterparts.
Escallonia, in vitro culture, ploidy breeding, flow cytometry, tetraploids
Inhoudsopgave
Voorwoord .............................................................................................................................................. 2
Abstract ................................................................................................................................................... 3
Inhoudsopgave ........................................................................................................................................ 1
Lijst met figuren en tabellen ................................................................................................................... 3
1
Inleiding ........................................................................................................................................... 5
2
Literatuurstudie ............................................................................................................................... 6
2.1
Botanische beschrijving van Escallonia spp. ........................................................................... 6
2.2
Micropropagatie van houtachtige gewassen ........................................................................ 10
2.2.1
Inleiding ......................................................................................................................... 10
2.2.2
Eisen van houtachtige gewassen ................................................................................... 11
2.3
3
4
Ploïdie veredeling .................................................................................................................. 13
2.3.1
Terminologie.................................................................................................................. 13
2.3.2
Voorkomen in de natuur en effecten op plantengroei ................................................. 14
2.3.3
Ontstaan van polyploïden ............................................................................................. 17
2.3.4
Vaststellen van de ploïdiegraad van planten ................................................................ 23
Algemene materialen en methoden ............................................................................................. 25
3.1
Opbouwen van een startpopulatie Escallonia spp. ............................................................... 25
3.2
Bereiden van een medium .................................................................................................... 27
3.2.1
Murashige&Skoog medium ........................................................................................... 28
3.2.2
Woody Plant medium .................................................................................................... 28
3.3
Protocol in vitro initiatie ........................................................................................................ 29
3.4
Bepalen van de ploïdiegraad met behulp van flowcytometrie ............................................. 30
3.4.1
Principe .......................................................................................................................... 30
3.4.2
Protocol ......................................................................................................................... 30
Experimenten ................................................................................................................................ 32
4.1
Genoomgrootte van Escallonia soorten................................................................................ 32
4.1.1
Protocol ......................................................................................................................... 32
4.1.2
Resultaten en bespreking .............................................................................................. 33
4.2
In vitro initiatie ...................................................................................................................... 36
4.2.1
Doel ............................................................................................................................... 36
4.2.2
Specifieke materialen en methoden ............................................................................. 36
1
4.2.3
Resultaten en bespreking .............................................................................................. 37
4.2.4
Besluit ............................................................................................................................ 39
4.3
Scheutregeneratie van Escallonia rubra uit bladmateriaal en callusweefsel ....................... 40
4.3.1
Doel ............................................................................................................................... 40
4.3.2
Specifieke materialen en methoden ............................................................................. 40
4.3.3
Resultaten en bespreking .............................................................................................. 41
4.3.4
Besluit ............................................................................................................................ 43
4.4
In vitro polyploïdisatie: efficiëntie van verschillende mitoseremmers bij Escallonia rubra . 44
4.4.1
Doel ............................................................................................................................... 44
4.4.2
Specifieke materialen en methoden ............................................................................. 44
4.4.3
Resultaten en bespreking .............................................................................................. 45
4.5
Acute polyploïdisatie Escallonia rubra .................................................................................. 46
4.5.1
Doel ............................................................................................................................... 46
4.5.2
Specifieke materialen en methoden ............................................................................. 46
4.5.3
Resultaten en bespreking .............................................................................................. 48
4.6
Chronische polyploïdisatie Escallonia rubra.......................................................................... 49
4.6.1
Doel ............................................................................................................................... 49
4.6.2
Protocol ......................................................................................................................... 49
4.6.3
Resultaten en bespreking .............................................................................................. 51
4.6.4
Besluit ............................................................................................................................ 55
4.7
Morfologie van de tetraploïden (Escallonia rubra) ............................................................... 56
4.7.1
Doel ............................................................................................................................... 56
4.7.2
Specifieke materialen en methoden ............................................................................. 56
4.7.3
Resultaten en bespreking .............................................................................................. 57
4.7.4
Besluit ............................................................................................................................ 57
5
Algemeen besluit ........................................................................................................................... 58
6
Literatuurlijst ................................................................................................................................. 59
Bijlage 1: Meetresultaten bepaling van de genoomgrootte ................................................................... 1
Bijlage 2: Aantal gevormde scheuten na regeneratie: Escallonia rubra ................................................. 1
Bijlage 3: Resultaten Escallonia rubra ..................................................................................................... 1
2
Lijst met figuren en tabellen
Figuur 1: Natuurlijke verspreidingsgebied van Escallonia spp. (Angiosperm phylogeny website) ......... 6
Figuur 2: Bloeiwijze en vruchten van Escallonia 'Donard Seedling' (Denaeghel, H., 2014) .................... 8
Figuur 3: USDA winterhardheidszones van West-Europa gebaseerd op de mogelijkheid van een soort
om de minimumtemperaturen van deze zone te weerstaan (Vanderhoeven & Branquart, 2010) ....... 9
Figuur 4: Schematische weergave van de grote domeinen binnen plantenweefselteelt met enkele
toepassingsgebieden (Neumann, Kumar, & Imani, 2009) .................................................................... 10
Figuur 5: Oorsprong van ongereduceerde gameten (links, first division restitution (FDR); midden,
normale verloop van de reductiedeling; rechts, second division restitution (SDR)) (Köhler, Scheid, &
Erilova, 2010)......................................................................................................................................... 17
Figuur 6: Schematische weergave van mitose in een cel (vb. 2n= 2x= 4) (Acquaah, 2009).................. 19
Figuur 7: Schematische voorstelling van een flowcytometer (Macey, 2007) ....................................... 24
Figuur 8: Escallonia pendula (links: zes weken na initiatie; rechts: tien weken na initiatie) ................ 38
Figuur 9: Geregenereerde scheuten gevormd op bladschijf explantaten (links: vier weken na initiatie;
rechts: negen weken na initiatie, op hormoonvrij medium) ................................................................ 41
Figuur 10: Gemiddelde aantal scheuten op geregenereerde planten van Escallonia rubra in functie
van de mediumsamenstelling (letter boven elke balk staat voor een significant verschillende
behandeling).......................................................................................................................................... 42
Figuur 11: Mortaliteit per chronische behandeling (legende: aantal weken.mitoseremmer; ORY=
Oryzaline; TRI= Trifluraline) ................................................................................................................... 52
Figuur 12: Mortaliteit per acute behandeling (legende: aantal dagen.mitoseremmer; ORY= Oryzaline;
TRI= Trifluraline) .................................................................................................................................... 53
Figuur 13: Percentage tetraploïden per chronische behandeling (legende: aantal
weken.mitoseremmer; ORY= Oryzaline; TRI= Trifluraline) ................................................................... 54
Figuur 14: Percentage tetraploïden per acute behandeling (legende: aantal dagen.mitoseremmer;
ORY= Oryzaline; TRI= Trifluraline) ......................................................................................................... 54
Figuur 15: Verschil in bladmorfologie (links: vergelijking van het blad; rechts: volledig tetraploïde
plant) ..................................................................................................................................................... 57
Tabel 1: Taxonomische indeling van Escallonia spp. (ITIS Standard Report Page: Escallonia rubra)...... 7
Tabel 2: Indeling van polyploïdie (Acquaah, 2009) ............................................................................... 13
Tabel 3: Voor- en nadelen van polyploïdie (Comai, 2005) .................................................................... 15
Tabel 4: Overzicht van technieken voor het overwinnen van genetisch vastgelegde kruisingsbarrières
(Van Tuyl & De Jeu, 1997) ..................................................................................................................... 22
Tabel 5: Escallonia soorten in het veredelingsprogramma ................................................................... 25
Tabel 6: Initiatieschema MS medium met verschillende concentraties benzyladenine (BA) en 1naftylazijnzuur (NAA) ............................................................................................................................ 28
Tabel 7: Initiatieschema WPM met verschillende concentraties benzyladenine (BA) ......................... 29
Tabel 8: Genoomgrootte per genotype op FL4 (ES = Escallonia)(in picogram) .................................... 34
Tabel 9: Genoomgrootte per genotype op FL3 (ES = Escallonia)(in picogram) .................................... 35
Tabel 10: Geïnitieerde genotypen in vitro............................................................................................. 37
Tabel 11: Overzicht mediumsamenstelling proef scheutregeneratie ................................................... 40
3
Tabel 12: Samenvattende tabel proef scheutregeneratie .................................................................... 41
Tabel 13: Overzicht van de verschillende behandelingen ..................................................................... 44
Tabel 14: Percentage verkregen polyploïden in functie van de mitoseremmer (behandelingen met
een * verschillen significant van elkaar (Tukey-test, p=0,05)) .............................................................. 45
Tabel 15: Overzichtschema acute polyploïdisatie ................................................................................. 47
Tabel 16: Overzichtschema chronische polyploïdisatie ........................................................................ 49
Tabel 17: Overzicht van de mortaliteit per behandeling (ORY= oryzaline, TRI= trifluraline) ................ 51
Tabel 18: Verdeling tetraploïden per mitoseremmer en type behandeling ......................................... 55
Tabel 19: Morfologische vergelijking op basis van bladlengte en -breedte (gemiddelde waarden ±
standaardafwijking) ............................................................................................................................... 57
Tabel 20: Overzicht piekposities per genotype op FL4 (interne standaard: T = tomaat; M = maïs; S =
soja)(ES = Escallonia; IS = interne standaard).......................................................................................... 1
Tabel 21: Overzicht piekposities per genotype op FL3 (interne standaard: T = tomaat; M = maïs; S =
soja)(ES = Escallonia; IS = interne standaard).......................................................................................... 2
Tabel 22: Aantal gevormde scheuten na regeneratie van bladschijfexplantaten .................................. 1
Tabel 23: Overzicht aantal geregenereerde planten per behandeling polyploïdisatie Escallonia rubra
(mixoploïden worden niet weergegeven) ............................................................................................... 1
Tabel 24: Overzicht mortaliteit polyploïdisatie Escallonia rubra ............................................................ 2
Tabel 25: Overzicht percentage verkregen polyploïden per chronische behandeling ........................... 4
Tabel 26: Overzicht percentage verkregen polyploïden per acute behandeling .................................... 4
4
1 Inleiding
In de boom- en sierplantensector staan in het huidige economische klimaat duurzaamheid en
rendabiliteit centraal. De telers zijn steeds op zoek naar innovatie, zowel op vlak van
teelttechniek als dynamiek van het assortiment. Teelttechnisch zal men steeds meer
productie moeten kunnen halen uit eenzelfde hoeveelheid oppervlakte, wil men rendabel
kunnen telen. Compactere cultivars zijn hier een oplossing. Maar ook de consument is op
zoek naar compactere planten. De wil van de consument is wet, in die zin dat men steeds
meer aan hogere kwaliteitseisen dient te voldoen. Ook naar de hedendaagse tuinen toe, die
steeds kleiner worden, is innovatie zeer belangrijk. Duurzaamheid speelt hierin een
belangrijke rol, zoals de introductie van geïntegreerde gewasbescherming (IPM= Integrated
Pest Management) in 2014. Volgens Dent, et al. (1995) is IPM in essentie een
bestrijdingssysteem dat gebruik maakt van de geassocieerde omgeving en de
populatiedynamiek van de plantbelager, waarin bestrijdingstechnieken toegepast worden van
verschillende aard met het oog op het voorkomen van schadelijke populatieniveaus van een
zekere plantbelager en aldus een economisch verlies aan opbrengst te voorkomen. In het
kader van IPM zal men opteren voor minder milieubelastende teelt- en
bestrijdingsmaatregelen, het hedendaagse gebruik van chemische groeibeheersing en
gewasbescherming komt hierbij als laatste hulpmiddel, indien de schade boven een
drempelwaarde uitstijgt. Op lange termijn is het invoeren van aangepaste cultivars uit
veredelingsprogramma’s een duurzame oplossing voor problemen waar men vandaag de
dag mee kampt.
Deze thesis wordt toegespitst op de ontwikkeling van nieuwe cultivars van Escallonia rubra
die beter aangepast zijn aan gematigde klimaatzones of beschikken over een specifieke
planthabitus waardoor een commerciële teelt interessant zou worden.
In een eerste deel wordt een botanische beschrijving gegeven van het geslacht Escallonia.
Vele alternatieve veredelingsmethoden zoals polyploïdisatie en het induceren van mutaties
maken sterk gebruik van plantenweefselteelt als basistechniek. Mits correct gebruik kan
plantenweefselteelt leiden tot een sterke verkorting van een dergelijk veredelingsprogramma,
alsook het tot stand brengen van een continue productie van plantmateriaal (Murashige,
1990). In de literatuurstudie wordt een overzicht gegeven van micropropagatie bij
houtachtige gewassen, gevolgd door een overzicht van gebruikte terminologie en methoden
binnen de ploïdieveredeling. Het bepalen van de genoomgrootte en in vitro initiatie van de
verschillende Escallonia species worden voorafgegaan en gevolgd door technieken voor het
verdubbelen van het chromosoomaantal.
5
2 Literatuurstudie
2.1 Botanische beschrijving van Escallonia spp.
Escallonia is een genus binnen de familie van de Escalloniaceae. Deze familie bevat negen
genera (Escalloniaceae - The Plant List):
Anopterus;
Chalepoa;
Eremosyne;
Escallonia;
Forgesia;
Platyspermation;
Polyosma;
Tribeles;
Valdivia.
Het genus is genaamd naar Antonio Escallon, een Spaans botanicus en plantenverzamelaar
uit de achttiende eeuw. Het genus Escallonia bevat een volgens Zielinski een 50-tal species
(Zielinski, 1955). Meer recent stellen Sede et al. dat het genus slechts 39 soorten bevat,
gebaseerd op DNA analyse van chloroplasten en geografische verspreiding. Het natuurlijke
verspreidingsgebied van de verschillende soorten bevindt zich in Zuid-Amerika met name het
Andes gebergte, het zuiden van Brazilië en grote delen van Chili (Angiosperm phylogeny
website)(Figuur 1). Een groot aantal soorten binnen het geslacht Escallonia zijn diploïden
met een basisgenoom van 7 chromosomen: 2n=2x=24 (Zielinski, 1955).
Figuur 1: Natuurlijke verspreidingsgebied van Escallonia spp. (Angiosperm phylogeny
website)
6
In Tabel 1 wordt de volledige taxonomie van het genus weergegeven. Voordat Escallonia
spp. geklasseerd werden in de familie van de Escalloniaceae, kon men deze terugvinden
binnen de familie van de Saxifragaceae (Rendle, 1938).
Tabel 1: Taxonomische indeling van Escallonia spp. (ITIS Standard Report Page:
Escallonia rubra)
Kingdom
Plantae
Subkingdom
Viridaeplantae
Infrakingdom
Streptophyta
Division
Tracheophyta
Subdivision
Spermatophytina
Infradivision
Angiospermae
Class
Magnoliopsida
Superorder
Asteranae
Order
Escalloniales
Family
Escalloniaceae
Genus
Escallonia
De taxonomische en fylogenetische indeling van Escallonia spp. is een zeer dynamisch
gegeven. Sinds de komst van Angiosperm Phylogeny Group III (APG III, 2009) werd de orde
van de Escalloniales als nieuwe orde erkend binnen de clade van de campanuliden. Een
clade is geen officieel toegepaste taxonomische term, maar duidt eerder op fylogenetische
relaties tussen bepaalde plantensoorten onderling (Chase & Reveal, 2009). Dergelijke
fylogenetische stambomen laten toe om de meest nauw verwante plantensoorten te
identificeren. Economisch interessante verwante families, in dalende volgorde van
verwantschap zijn: Asteraceae, Apiaceae, Cornaceae, Hydrangeaceae, Berberidaceae,
Saxifragaceae, Vitaceae (APG III, 2009). De soorten binnen het genus Escallonia kunnen
fenotypisch sterk verschillen (groeiwijze, bloeiwijze, bloemkleur), maar enkele fenotypische
kenmerken zijn gemeenschappelijk zoals het meerjarige karakter, type van stomata,
alternerende bladstand en de wijze waarop bladeren ontluiken (Metcalfe & Chalk,
1950)(Gledhill, 2008). Dankzij hun sierwaarde, werden enkele soorten, zoals Escallonia
rosea, meegenomen terug naar het Europese continent, waar zij vooral door de Engelse
adel steeds ter plaatse in stand gehouden werden door middel van zomerstek. Het zijn
planten die goed gedijen op arme zand-leem gronden en worden bij voorkeur opgekweekt op
een beschutte, zonnige standplaats (Bean, 1919). Het gebruik van Escallonia species in het
zuiden van de Verenigde Staten is meer ingeburgerd. Wegens de compacte groei, het fris
groen blad en de rijke bloei worden Escallonia’s vooral aangewend als haag- of
vakbeplanting.
7
Volgende typerende kenmerken kunnen vermeld worden (Krüsmann, 1960) (Bean, 1919).
Oudere takken zijn houtachtig en beschikken al of niet over afschilferende schors. De
bladeren zijn enkelvoudig en staan gerangschikt in clusters rondom de takjes op
alternerende wijze. Deze clusters zijn heel korte takjes die in de oksels van de grotere
bladeren staan. De bladrand is meestal getand. Zeer kenmerkend voor sommige soorten is
de aanwezigheid van harskliertjes op de bladeren en bladstelen. Deze scheiden een
kleverige was uit, die de plant beschermt tegen uitdroging en eventuele belagers. Een
aantal soorten bezitten steunblaadjes. De bloemen van Escallonia species variëren in kleur
van wit tot rood en staan verzameld in eindstandige trossen (Figuur 2). Het bloeitijdstip
verschilt sterk tussen de soorten, men vindt zowel vroeg- als laatbloeiers. Een bloem bestaat
uit een koker met vijf vergroeide petalen. Binnen deze koker vindt men vijf meeldraden en
één stamper terug, de bloemen zijn dus tweeslachtig. Onderin de calyx bevindt zich het
vruchtbeginsel. In de regel vindt zelfbestuiving plaats. Indien de bloemen bestoven en
bevrucht worden, zal het embryo ontwikkelen. De vrucht die ontstaat is een doosvrucht
waarin de zaden zich bevinden. Deze zaden zijn zeer fijn en slechts enkele millimeter groot.
Figuur 2: Bloeiwijze en vruchten van Escallonia 'Donard Seedling' (Denaeghel, H.,
2014)
8
Escallonia species zijn verhoutte (half)heesters met beperkte wintervastheid. Alle soorten
zijn groenblijvend, behalve Escallonia virgata. Winterhardheid wordt als planteigenschap
gescoord door middel van een USDA winterhardheidsscore (USDA Plant Hardiness Zone
Map). Verschillende geografische gebieden worden ingedeeld op basis van de gemiddelde,
jaarlijkse wintertemperatuur ingedeeld in verschillende intervallen. Elk interval krijgt een
afzonderlijk nummer toegekend: hoe kleiner het nummer, hoe lager de temperatuur. De
gebieden waar Escallonia spp. van nature voorkomen, vallen in de zones 7a tot en met 10
(Di Castri & Hajek, 1976) (Hoffman & Revesloot, 1998).
Figuur 3: USDA winterhardheidszones van West-Europa gebaseerd op de
mogelijkheid van een soort om de minimumtemperaturen van deze zone te weerstaan
(Vanderhoeven & Branquart, 2010)
Figuur 3 duidt aan dat België een score van 7 tot en met 8 toegekend krijgt.
Uitgedrukt in temperatuur geeft dit het volgende (Hop, 2008) (Cathey, 1990):
Verspreidingsgebied Escallonia spp.: -18°C tot +4°C;
Grondgebied België: -17°C tot -7°C.
Het verspreidingsgebied van Escallonia is echter zeer heterogeen wat betreft hoogteligging,
grondsoort en microklimaat (Dexter, 1956). Deze factoren zijn bepalend voor hoe planten de
winter doorkomen. Algemeen stelt men vast dat de planten in het Belgische klimaat toch
slecht recupereren van nachtvorst met symptomen zoals bladval en taksterfte tot gevolg
(Pearce, 2001). In België worden Escallonia species niet vaak commercieel vermeerderd,
hoofdzakelijk vanwege de beperkte winterhardheid. Naar de toekomst toe hoopt men dan
ook tot meer aangepaste cultivars te komen via veredeling, waardoor een commerciële teelt
mogelijk zou kunnen zijn.
9
2.2 Micropropagatie van houtachtige gewassen
2.2.1 Inleiding
Een definitie van micropropagatie of plantenweefselteelt werd door George et al. (2008)
voorgesteld als: "Plant tissue culture is the science of growing plant cells, tissues or organs
isolated from the mother plant, on artificial media".
De micropropagatie van planten is in zijn meest eenvoudige vorm, het initiëren van plantexplantaten op kunstmatig samengestelde bodems onder aseptische omstandigheden. Op
deze manier tracht men een stabiele cultuur op te bouwen waaruit men nieuwe individuen
kan voortbrengen. Weefselteelt kan onder andere dienen om bepaalde gewenste genotypen
vegetatief in stand te houden. Na de Tweede Wereldoorlog werd er veel vooruitgang geboekt
in weefselteelt door de ontdekking van plantenhormonen. Mede hierdoor konden
betrouwbare en efficiënte in vitro technieken uitgewerkt worden met vergaande land- en
tuinbouwkundige toepassingen (Pierik, 1987).
Figuur 4: Schematische weergave van de grote domeinen binnen plantenweefselteelt
met enkele toepassingsgebieden (Neumann, Kumar, & Imani, 2009)
10
Daar het begrip plantenweefselteelt zeer ruim is, maakt men een opdeling in verschillende
domeinen naargelang de praktische toepassingen. In Figuur 4 kan men de opdeling
terugvinden (Neumann, Kumar, & Imani, 2009)
2.2.2 Eisen van houtachtige gewassen
De houtachtige gewassen omvatten in ruime zin alle planten met verhoutte stengels in
tegenstelling tot bijvoorbeeld de kruidachtigen. In deze thesis wordt dieper ingegaan op het
genus Escallonia. Plantenweefselteelt van houtachtige planten is mogelijk maar voor vele
soorten ontbreekt een praktisch en efficiënt hanteerbare methode. Nochtans is in vitro
vermenigvuldiging van houtachtige gewassen een passend antwoord op de toenemende
vraag naar bos- en sierbomen (Jain, 1997). Houtachtige gewassen kampen met een aantal
problemen in vitro (Kozai, 1991):
Lange cultuurfase;
Lage vermeerderingsfactor;
Afsterven van explantaten ten gevolge van contaminatie of abiotische stress;
Het doel in elke stap van de weefselteelt is sterk verschillend. Een belangrijk gegeven is de
optimalisatie van regeneratie en vermenigvuldiging. Om deze optimalisatie te bekomen dient
men volgens Minocha & Jain (2000) rekening te houden met biologische factoren,
mediumsamenstelling en de groeiomstandigheden tijdens de in vitro cultuur.
Een voorname biologische factor is de keuze van explantaat. De oorsprong van het
explantaat bepaalt immers de potentiële regeneratiekracht en draagt op die manier bij aan
de efficiëntie van de vermeerdering. Voor het bekomen van explantaten, zijn er gezonde enstressvrije moederplanten met voldoende juveniele groei nodig. Waar dit niet het geval is, zal
men te maken krijgen met ongewenste neveneffecten zoals verminderde groei, verlies van
het vermogen tot wortelvorming of plagiotrope uitgroei van het explantaat (Pierik,
Rejuvenation and micropropagation, 1990). Bovendien speelt het tijdstip waarop men de
explantaten neemt een belangrijke rol. Het in vitro initiëren van een houtachtig gewas dat
zich onder eender welke vorm van (a)biotische stress bevindt verloopt moeilijker, bovendien
is deze stress sterk afhankelijk van het seizoen en de heersende omgevingsfactoren
(Gaspar, et al., 2002). Scheuten die uitlopen in het voorjaar leunen zich uitstekend als
uitgangsmateriaal (Srivastava, Narula, & Srivastava, 2005).
11
Na de initiatie tracht men vermeerdering te bekomen. Vaak is hiervoor een wijziging in
samenstelling van het medium nodig omdat er geen ondersteuning van het moederweefsel
meer is (Minocha & Jain, 2000). Gamborg & Phillips (1995) stellen dat een groot aantal
houtachtige gewassen beter groeien bij lagere zoutconcentraties. Typisch voor het WPM is
de lage zoutconcentratie in vergelijking met MS, vele protocols voor houtachtige planten
steunen hierdoor op het gebruik van WPM medium (Lloyd & McCown, 1980). Moura, et al.
(2009) maakten gebruik van WPM medium voor de in vitro initiatie van Viburnum treleasei.
Naar optimalisatie toe, worden tevens modificaties aangebracht in het standaard WPM of
MS. Thies, et al. (1992) verhoogden de concentraties myo-inositol en dextrose in WPM,
waardoor de overlevingskans van Vitis rotundifolia explantaten significant steeg. Het type
cytokinine of auxine dat wordt toegepast is bovendien ook afhankelijk van het doel van de
weefselcultuur. In bepaalde gevallen worden wortels gekweekt, voor andere toepassingen
wil men eerder scheuten of callusweefsel. Karami et al. (2008) slaagden erin om
callusweefsel te induceren op explantaten van Elaeagnus angustifolia met behulp van
thidiazuron op MS, andere cytokinines brachten geen reacties teweeg bij de explantaten
Hieruit blijkt dat planten verschillend reageren op het toegepaste groeihormoon (Karami, Piri,
& Bahmani, 2009). Siddique & Anis (2009) brachten Balanites aegyptiaca L. in vitro na het
uitvoerig testen van verschillende cytokinines (BA, TDZ, kinetine) en auxinen (IAA). Lobna,
et al. (2008) slaagden erin voor Pauwlonia kowakamii een passend protocol op te stellen. In
deze studie werd gewerkt met enkel BA in het medium bij de scheutcultuur en een medium
met enkel auxinen bij de bewortelingsfase. Volgens Huetteman & Preece (1993) is
thidiazuron (TDZ) een krachtig en zeer actieve verbinding met cytokinine eigenschappen bij
houtachtige planten. Een exogene toepassing van dit hormoon zal leiden tot een accumulatie
en/of synthese van purine cytokinines, die op zich groei, expansie of regeneratie kunnen
bewerkstelligen. Dit werd onder andere vastgesteld door Thomas & Katterman (1986). Met
behulp van TDZ aan lage concentraties (<1µM) is het mogelijk een betere in vitro
scheutvorming te bekomen. TDZ kan echter te krachtig werken waardoor het
scheutelongatie zal inhiberen. In dit geval worden de planten op een medium gebracht met
een lagere concentratie TDZ ofwel met een minder sterk cytokinine om elongatie te
bewerkstelligen (Huetteman & Preece, 1993).
12
2.3 Ploïdie veredeling
2.3.1 Terminologie
Het grootste deel van het erfelijk materiaal van een organisme komt in de celkern voor in
lineaire structuren genaamd chromosomen (Freeling, 1985). De chromosomen vormen de
functionele eenheid van het genoom, welke onderling kunnen verschillen in zowel vorm,
grootte, positie van de centromeer als in geneninhoud. Elke plantensoort wordt gekenmerkt
door een standaard chromosomenset, ook wel het basisgenoom van de plant waarin elk
chromosoom slechts eenmaal voorkomt (Doebley, 1993). Op basis van het aantal keer een
dergelijk basisgenoom voorkomt in een cel, maakt men een opdeling in somatische cellen en
gameten. Het somatische chromosoomgetal duidt men aan met de term (2n) dit in
tegenstelling tot bij een gameet waarbij men de term (n) hanteert. Naargelang het type
celdeling dat plaatsvindt, mitose of meiose, zal ofwel een nieuwe somatische (2n) cel of een
gameet (n) ontstaan respectievelijk (Götz, 2008). Het aantal chromosomen in de celkern is
bovendien ook functie van de ploïdiegraad. Ploïdie is een begrip dat verwijst naar het aantal
kopieën van het basisgenoom per cel. De toestand waarbij somatische cellen een meervoud
van het basisgenoom bevatten, bovenop het diploïde aantal, duidt men aan met de term
polyploïdie (Acquaah, 2009). Een set van chromosomen wordt aangeduid met het
voorvoegsel 'x'. Veel organismen bevatten somatische cellen welke één chromosoomset
hebben per ouder en worden aldus diploïd genoemd (2n = 2x in somatische cellen, n = x in
gameten). Sommige soorten hebben een hogere ploïdiegraad, men spreekt dan van
polyploïden, waarvan de somatische cellen een chromosoomaantal bevatten groter dan 2x
(Ramsey & Schemske, 1998).
Tabel 2: Indeling van polyploïdie (Acquaah, 2009)
Ploïdiegraad
Genoom
Beschrijving
Diploïd
AA, BB
Bevat tweemaal hetzelfde basisgenoom.
Euploïd
Autoploïdie
AAA, BBB
Meervoud van een basisset van één
specifiek genoom.
Meervoud van een basisset van
verschillende genomen.
Meervoud van een basisset van
genomen met gelijkaardige delen.
Alloploïdie
AAB, AABB
Segmentele alloploïdie
AA'B, AB'B'
Aneuploïd
AA
2n ± 1,2..., k
13
In Tabel 2 vind men een indeling van de polyploïden. Voor de even veelvouden van het
basisgenoom spreekt men van orthoploïden; voor de oneven veelvouden van anorthoploïden
(Zimmering, 1955) (Beatty & Fischberg, 1951). Orthoploïden vormen euploïde gameten
(veelvoud van 'x'); anorthoploïden vormen aneuploïde gameten. In geval van aneuploïdie
bevat het organisme onvolledige sets van chromosomen welke gelijkaardig kunnen zijn aan
een euploïd aantal plus of min één of meerdere specifieke chromosomen. Een belangrijk
onderscheid kan men maken in auto- en allopolyploïden (Parisod, Holderegger, &
Brochmann, 2010). Autopolyploïden bezitten meer dan tweemaal eenzelfde basisgenoom
afkomstig van dezelfde soort, dit houdt in dat tijdens reductiedeling zowel homologe als de
homeologe chromosomen paren (Thomas H. , 1993). Allopolyploïden bezitten basisgenomen
van meerdere soorten welke in de regel niet kruisbaar zijn, doch in de natuur spontaan
kruisen of door de mens geïnduceerd worden. Bij een reductiedeling paren hier slechts de
homologe chromosomen (chromosomen uit eenzelfde genoom) (Udall, Quijada, & Osborn,
2005) (Soltis & Soltis, 1990). Een andere vorm van euploïdie vooropgesteld door Stebbins
(1947) is de segmentele alloploïdie. Dit is een intermediaire vorm van euploïdie waarbij
synapsis van de homologe chromosomen tijdens een reductiedeling in een allopolyploïd niet
volledig over alle loci plaatsvindt door behoud van residuele affiniteit tussen de homeologe
chromosomen (Chester, et al., 2012) (Stebbins, 1947).
2.3.2 Voorkomen in de natuur en effecten op plantengroei
Het voorkomen van polyploïden is een natuurlijk verschijnsel. Reeds in 1943 beschrijven
Löve & Löve (1943) het natuurlijke voorkomen van polyploïden, met name in gebieden met
meer extreme klimaatsomstandigheden. Kenmerkend is dat bij stijgende breedtegraad het
aandeel polyploïden in de aanwezige vegetatie stijgt (Adams & Wendel, 2005). Het wijzigen
van de ploïdiegraad binnen een soort is een belangrijke genomische eigenschap van
planten. Bovendien wijst het frequent voorkomen van dit verschijnsel op een mogelijk
evolutionair voordeel. Chen (2007) stelt dat door het bezitten van meerdere sets van een
basisgenoom de plant in staat is zich sneller aan te passen, evolutionair gezien, aan
wijzigende omstandigheden (Chen, 2007). Genen welke na polyploïdisatie meerdere keren
voorkomen, kunnen een gewijzigd niveau van genexpressie kennen (Adams & Wendel,
2005). Men spreekt ook wel van 'Gene Silencing', een epigenetische wijziging van
genexpressie ten gevolge van polyploïdisatie (Depicker & Van Montagu, 1997). De invloed
van de polyploïdisatie op het fenotype van de plant is afhankelijk van het type polyploïdie.
Een autopolyploïde plant vertoont morfologisch sterke gelijkenissen met de ouderplant. De
allopolyploïde plant daarentegen zal een fenotype vertonen welke eigenschappen vertoont
van beide oudersoorten (Acquaah, 2009).
14
Tabel 3: Voor- en nadelen van polyploïdie (Comai, 2005)
Voordelen
Nadelen
Heterosis effect (hybride groeikracht).
Wijzigingen in celstructuur en complicaties in
celregulatie.
Gen redundantie.
Verminderde fertiliteit.
Verlies aan zelfincompatibiliteit of verhoogde Wijzigingen
in
genexpressie
aseksuele reproductie ten gevolge van epigenetische instabiliteit.
apomixis.
en
Tabel 3 geeft een beknopt overzicht over een aantal voor- en nadelen die planten kennen bij
hogere ploïdiegraad. Het heterosis effect staat voor de sterkere groeikracht, overlevingskans
en fertiliteit die men in het nakomelingschap terugvindt na het kruisen van specifieke
ouderlijnen (Chen Z. J., 2010). Dit heterosis effect treft men aan in bepaalde hybriden alsook
in bepaalde allopolyploïden zoals Triticum spp. (Zhao, Deng, Shan, Steudle, Zhang, & Ye,
2005) vanwege het feit dat allopolyploïden interspecifieke hybriden zijn. Dergelijke planten
genieten extra van het heterosis effect daar onder normale omstandigheden er een
uitgesproken verlies optreedt aan heterozygotie en aldus ook aan hybride groeikracht, dit
geldt echter enkel voor zelfbestuivende gewassen. In een allopolyploïde plant wordt
hetzelfde niveau van heterozygotie aangehouden door 'preferential / selective pairing'
(gedwongen synapsis van homologe chromosomen) (Comai, 2005) (Acquaah, 2009)
(Zawierta, Biecek, Waga, & Cebrat, 2007). Mutaties die ontstaan in essentiële genen kunnen
bij polyploïden gemaskeerd worden vanwege het feit dat er meerdere sets van
chromosomen aanwezig zijn (Lawrence & Pikaard, 2003). Dit fenomeen wordt aangeduid
met de term 'gene redundancy' en houdt onder andere in dat polyploïdie het genoom beter
beschermt tegen negatieve mutaties (de Mitchell, Lambert, Burden, Sunderland, Porter, &
Carlton, 1995). Zelfincompatibiliteit is een genetisch bepaald systeem dat zelfbevruchting en
inteelt voorkomt (Takayama & Isogai, 2005). Stebbins (1957) stelt dat een hogere
ploïdiegraad tevens gepaard gaat met een groter aandeel aan zelfcompatibele individuen
(Stebbins, Self fertilization and population variability in the higher plants, 1957). Naast
zelfcompatibiliteit bestaat ook de mogelijkheid tot apomixis. Apomixis is een vorm van
aseksuele reproductie door middel van zaden, een embryo wordt gevormd zonder dat er
bevruchting plaatsvindt (Ozias-Akins & van Dijk, 2007). Het optreden van apomixis vereist
een expressie van specifieke genen betrokken bij seksuele reproductie van de plant, waar
polyploïdie kan voor zorgen (Grimanelli, Leblanc, Perotti, & Grossniklaus, 2001). De
ploïdiegraad staat met andere woorden in voor een gewijzigde genexpressie waardoor
apomixis mogelijk wordt (Bicknell, Borst, & Koltunow, 2000). De meeste apomictische
planten zijn polyploïd, echter polyploïdie leidt niet noodzakelijk tot apomixie (Otto & Whitton,
2000).
15
Uit het voorgaande blijkt dat gewijzigde genexpressie kan leiden tot enkele voordelen.
Daarnaast kan een gewijzigde genexpressie ook leiden tot schadelijke effecten. Bepaalde
genen worden in hun expressie beïnvloedt door regulerende factoren welke op zich niet
beïnvloedt worden door de ploïdiegraad (Comai, 2005). Paun, Fay, Soltis & Chase (2007)
stellen dat polyploïden vaak epigenetisch instabiel zijn. Bovendien verschilt de ontstane
instabiliteit voor auto- en allopolyploïden (Comai, 2005). Bij nieuw gevormde allopolyploïden
ligt synapsis tussen homeologe chromosomen aan de basis van instabiliteit (Comai, genetic
and epigenetic interactions in allopolyploid plants, 2000). Als laatste groot nadeel kan men
de moeilijkheden aanhalen in celdeling, met name bij meiose. Dergelijke meiotische
instabiliteit zorgt uiteindelijk voor een verminderde fertiliteit van de plant (Acquaah, 2009).
Indien een polyploïde plant meiose ondergaat, bestaat de kans op vorming van aneuploïde
gameten welke sterk afhankelijk is van zowel plantensoort als ploïdietype. Aneuploïdie op
zich, kan aanleiding geven tot epigenetische instabiliteit (Birchler, Riddle, Auger, & Veitia,
2005) (Birchler, Aneuploidy in plants and flies: The origin of studies of genomic imbalance,
2013).
Samengevat kan men stellen dat de voor- en nadelen van hogere ploïdiegraad aanleiding
geven tot specifieke fenotypische effecten (Acquaah, 2009) (Otto & Whitton, 2000) (Bass &
Birchler, 2012):
Effecten op celgrootte en groeisnelheid: verhoogd
plantenorganen vormen (zaden, vruchten, bloemen...);
Grootte van de stomata vertoont een positief verband met ploïdiegraad: hoe hoger de
ploïdiegraad, hoe groter de stomatale cellen (tot de optimale ploïdiegraad);
Polyploïdie is soms geassocieerd met een positief effect op de grootte en vorm van
de plant: in het Engels aangeduid met de term 'gigas features' (Acquaah, 2009);
Mogelijkheid tot apomixis bij sommige soorten, indien dit niet het geval is kampt men
met een lagere fertiliteit.
celvolume
die
grotere
Voor veredeling van siergewassen, zoals Escallonia, is het induceren van autoploïdie zeer
interessant. Men kan immers op dergelijke wijze tot cultivars komen met grotere bloemen of
bloeiwijzen (Segraves & Thompson, 1999). Bovendien laat autoploïdie het aantal genotypen
enorm toenemen waardoor nieuwe eigenschappen bekomen kunnen worden (Acquaah,
2009). Takamura & Miyajima (1996) beschrijven een gewijzigde bloemkleur van Cyclamen
persicum van tetraploïde planten ten opzichte van diploïden. Polyploïdisatie kan aldus een
techniek zijn binnen de veredeling om te komen tot commerciële rassen met gewijzigde
bloemkleur (Takamura & Miyajima, Colchicine induced tetraploids in yellow-flowered
cyclamens and their characteristics, 1996). Dit in het bijzonder voor vegetatief
vermeerderbare gewassen, men kan immers elk bekomen genotype vegetatief in stand
houden.
16
2.3.3 Ontstaan van polyploïden
Algemeen stelt Harlan (1975) dat de meeste natuurlijk ontstane polyploïden het gevolg zijn
van ongereduceerde gameetvorming (Harlan, 1975). Polyploïde organismen maken gebruik
van verschillende genetische, structurele en mechanische processen waardoor chromosoom
recombinatie en segregatie tijdens celdeling goed verlopen (Chapman & Kimber, 1992).
A. Autopolyploïden
Meiotische polyploïdisatie
Tijdens de reductiedeling kunnen ongereduceerde (2n) gameten ontstaan, in plaats van
gereduceerde (n) gameten (Veilleux, 1985). Dergelijke fouten heet men de 'first division
restitution' (FDR) tijdens de eerste meiotische deling en de 'second division restitution' (SDR)
tijdens de tweede meiotische deling (Acquaah, 2009).
Figuur 5: Oorsprong van ongereduceerde gameten (links, first division restitution
(FDR); midden, normale verloop van de reductiedeling; rechts, second division
restitution (SDR)) (Köhler, Scheid, & Erilova, 2010)
17
Figuur 5 toont de manier waarop ongereduceerde gameetvorming plaatsvindt. In een
normale meiose worden homologe chromosomen gesplitst in meiose I, terwijl
zusterchromatiden gescheiden worden in meiose II (Bass & Birchler, 2012). Aldus ontstane
gameten zijn haploïd en bevatten gerecombineerd genetisch materiaal. Het standaard
verloop gaat echter niet door bij FDR en SDR. FDR zorgt ervoor dat er geen splitsing is van
homologe chromosomen tijdens meiose I, scheiding van zusterchromatiden gebeurt wel. Het
resultaat geeft het ontstaan van (2n) gameten welke gerecombineerde nietzusterchromatiden bevatten. SDR verstoort de tweede meiotische deling, (2n) gameten
ontstaan met gerecombineerde zusterchromatiden (Köhler, Scheid, & Erilova, 2010)
(d'Erfurth, Jolivet, Froger, Catrice, Novatchkova, & Mercier, 2009). Dit fenomeen is echter
vrij zeldzaam in de natuur maar kan beïnvloedt worden door bepaalde omgevingsfactoren
zoals hoge temperaturen en genotypische verschillen (van Tuyl & Stekelenburg, 1989).
Dergelijke gameten kunnen geïdentificeerd worden met behulp van flowcytometrie (van
Tuyl, de Vries, Bino, & Kwakkenbos, 1989). Ongereduceerde gameten geven na bestuiving
en bevruchting aanleiding tot het ontstaan van een triploïd embryo met een (3n) of (4n)
endosperm (Ramsey & Schemske, 1998). Of het triploïd embryo tot verdere ontwikkeling
komt is afhankelijk van de aanwezigheid van bepaalde reproductieve barrières genaamd
'triploid block' (Köhler, Scheid, & Erilova, 2010). Triploid block zorgt ervoor dat een embryo
niet kan uitgroeien door een verstoord evenwicht in ploïdiegraad tussen embryo en
endosperm (Husband, 2004).
Mitotische polyploïdisatie
Het principe bij mitotische polyploïdisatie is een somatische chromosoomverdubbeling. Deze
wordt geïnduceerd door het toedienen van mitose inhiberende stoffen op specifieke
plantendelen (Brodsky & Uryvaeva, 1978). Inductie van autoploïdie op deze wijze is
uitermate interessant bij gewassen met een vegetatief economisch interessant deel vanwege
'gigas features' (Acquaah, 2009) alhoewel men dient rekening te houden met een mogelijke
gereduceerde fertiliteit. Een frequent toegepaste mitoseremmer is colchicine, een giftig
alkaloïde gewonnen uit Colchicum autumnale (Pei, 1985). Enkele voorname eigenschappen
van het colchicine zijn (Dhooghe, Van Laere, Eeckhaut, Leus, & Van Huylenbroeck, 2011):
Hittebestendig: behoud van biologische activiteit na autoclaveren;
Acute giftigheid: door de hoge bindingsaffiniteit met dierlijke en menselijke
microtubuli (LD50 = 26mg/kg bij orale inname, rat) (Caraco, Putterman, Rahamimov,
& Ben-Chetrit, 1992) (Wiesenfeld, Garthoff, Sobotka, Suagee, & Barton, 2007);
Veroorzaken van neveneffecten: steriliteit, abnormale groei en inductie van mutaties
(Luckett, 1989);
Lagere bindingsaffiniteit met plantaardige microtubuli: succesvolle toepassing vereist
relatief hoge concentraties.
18
Ondanks de nadelen van het gebruik van colchicine vind men in de literatuur studies terug
welke met succes polyploïden hebben verkregen. Zo verkregen Liu, et al. (2007) tetraploïde
Platanus acerifolia planten na behandeling met colchicine.
Andere mitoseremmers worden tegenwoordig aangewend als vervanger van colchicine
(Acquaah, 2009). Zoals bepaalde carbamaatherbiciden (chloorprofam, profam en
carbeetamide) en dinitroanilinen (oryzaline, trifluraline en pendimethalin) (Dhooghe, Van
Laere, Eeckhaut, Leus, & Van Huylenbroeck, 2011) (Haesaert, 2014) (Brinkley, 1985)
(Promkaew, Soontornchainaksaeng, Jampatong, & Rojanavipart, 2010). Oorspronkelijk
voerde men mitotische polyploïdisatie uit in vivo, deze methode is echter gevaarlijk inzake
blootstelling voor de veredelaar alsook omslachtig (Blakeslee & Avery, 1937). Tegenwoordig
wordt somatische chromosoomverdubbeling gekoppeld aan een in vitro systeem, hierdoor
kunnen grote aantallen explantaten op uniforme wijze blootgesteld worden aan de
mitoseremmer. De werkingswijze situeert zich in het verstoren van de metafase van de
mitotische deling zoals aangegeven op Figuur 6.
Figuur 6: Schematische weergave van mitose in een cel (vb. 2n= 2x= 4) (Acquaah,
2009)
19
Doordat het mitosegif interfereert met de tubuline bouwstenen van de microtubuli zal er geen
spoelfiguur gevormd worden tijdens de metafase. De zusterchromatiden worden hierdoor in
de anafase niet gesplitst, men bekomt een cel met het dubbel aantal chromosomen.
Diverse behandelingstechnieken en protocollen zijn beschreven in de literatuur (Jensen,
1974). Grote verschillen onderling treft men aan in volgende zaken: type explantaat,
concentratie, tijdsduur van de behandeling en toedieningsmethode (Leus, Eeckhaut,
Dhooghe, Van Labeke, Van Laere, & Van Huylenbroeck, 2011). De keuze van het type
explantaat bepaalt mede de kans op succes. Algemeen stelt men dat jonge meristematische
weefsels het meest vatbaar zijn voor polyploïdisatie door een mitoseremmer (Otto & Whitton,
2000). Toch zal men in een eerste fase verschillende types van explantaten testen
(Petersen, Hagberg, & Kristiansen, 2003).
Verschillende explantaat types zijn:
Zaden: zowel niet gekiemde als gekiemde zaden kunnen te weken gelegd worden in
een oplossing met mitosegif (Rubulusa, Nikolova, Smith, & Hannweg, 2007);
Vegetatieve scheuten: volledige scheutjes ontdaan van bladeren, delen van de
scheut of enkel de scheuttip (Gu, Yang, Meng, & Zhang, 2005) (Kadota & Niimi,
2002) (Van Duren, Morpurgo, Dolezel, & Afza, 1996);
Callusweefsel (Wu & Mooney, 2002);
Ondergrondse plantendelen: plantendelen welke van nature ondergronds groeien,
doch in vitro opgegroeid zoals delen van knollen en schubben van bollen (Takamura
& Miyajima, 1996) (Takamura, Lim, & Van Tuyl, Effect of a new compound on the
mitotic polyploidization of Lilium longiflorum and oriental hybrid lilies, 2001);
Bladschijven: zowel volledige als versneden bladschijven kunnen aangewend worden
(Sun, Sun, Bell, Li, & Xin, 2011);
Somatische embryo's (Eeckhaut, Werbrouck, Leus, Van Bockstaele, & Debergh,
2004).
Een ander facet van de behandeling is concentratie van de mitoseremmer. Deze is echter
sterk gekoppeld met de blootstellingsduur (Jensen, 1974). Te hoge concentraties verlagen
de overlevingskans van de explantaten, terwijl te lage concentraties geen effect uitoefenen.
Hogere concentraties vragen een kortere behandelingsduur en omgekeerd (Acquaah, 2009).
De concentratie is ook afhankelijk van het gekozen mitosegif, voornamelijk de
bindingsaffiniteit met de microtubuli bouwstenen is van belang (Dhooghe, Van Laere,
Eeckhaut, Leus, & Van Huylenbroeck, 2011). Colchicine vereist bijvoorbeeld hogere
concentraties dan oryzaline, 750µM en 150µM respectievelijk (Zhang, Luo, Liu, & Guo, 2010)
(Väinölä, 2000). Dit is echter niet altijd eenduidig, niet alle planten zijn even gevoelig voor
een blootstelling aan colchicine (Dhooghe, et al., 2010). Behandelingsduur varieert van
enkele uren tot weken, men spreekt dan over acute of chronische behandeling (Van Laere,
2008) (Hamill, Smith, & Dodd, 1992).
20
Als laatste parameter kan men de toedieningswijze aanhalen. In vitro toepassing van de
mitoseremmer kan zowel in vloeibaar als in vast medium, meestal afhankelijk van type
explantaat en behandelingsduur. Druppeltoedieningen zijn ook mogelijk (Aleza, Juárez,
Ollitrault, & Navarro, 2009). Korte behandelingen kunnen met succes doorgaan in vloeibaar
medium, chronische behandelingen gaan bij voorkeur door in een vast medium (Chauvin,
Label, & Kermarrec, 2005). Indien men zaden wil behandelen kan men deze weken in een
oplossing waar mitoseremmer aan toegediend werd (Rubulusa, Nikolova, Smith, &
Hannweg, 2007). Bij het in vitro behandelen van de explantaten is homogeniteit in
blootstelling zeer belangrijk (Dewey, 1980). Het is immers door een grondige, homogene
blootstelling mogelijk om meerdere cellagen in het explantaat te bereiken waardoor de kans
op ploïdie-inductie stijgt. Wanneer de mitoseremmer niet volledig in het plantenweefsel
dringt, bestaat het explantaat mogelijks uit weefsels met verschillende ploïdiegraad. Men
spreekt dan van ploïdiechimeren of mixoploïden (Nontaswatsri & Fukai, 2005). Een chimere
plant is bij definitie een organisme dat bestaat uit twee of meerdere genetisch verschillende
celtypes, specifiek in dit geval uit twee of meerdere celtypes met verschillende ploïdiegraad
(Acquaah, 2009). Mixoploïde explantaten kunnen versneden worden om uit de gewenste
cellaag een nieuwe plant te regenereren.
B. Allopolyploïden
Een aantal economisch belangrijke gewassen zoals Triticum aestivum, Brassica napus en
Gossipium spp. zijn allopolyploïden (Zhao, Deng, Shan, Steudle, Zhang, & Ye, 2005) (Liu,
Brubaker, Mergeai, Cronn, & Wendel, 2001) (Adams & Wendel, 2005). De genomen die men
terugvindt in dergelijke gewassen zijn afkomstig van verschillende soorten of geslachten, ze
verschillen onderling in graad van homologie. In de natuur kunnen allopolyploïden ontstaan
door eerder toevallige hybridisatie tussen twee soorten die van nature uit niet kruisbaar zijn
met vervolgens een verdubbeling van chromosomen. Omgekeerd kan echter ook, eerst een
verdubbeling met vervolgens de hybridisatie (Harlan, 1975).
Men kan dit schematisch als volgt voorstellen (Chester, et al., 2012):
AA x BB: AAB (ongereduceerde (2n) gameet van ouder AA);
AAB x BB: AABB (terugkruising met BB).
Hieruit blijkt dat één of beide diploïde ouderplanten de ongereduceerde gameet kunnen
leveren. Het induceren van allopolyploïden kan door middel van interspecifieke hybridisatie
waarbij twee soorten met verschillende genomen gekruist worden (van Tuyl & Lim,
Interspecific hybridisation and polyploidisation as tools in ornamental plant breeding, 2003).
Genetisch vastgelegde kruisingsincompatibiliteit kan ervoor zorgen dat sommige soorten niet
kruisbaar zijn. Men kan deze incompatibiliteit omzeilen in specifieke gevallen door
verschillende technieken toe te passen. Pandey (1979) deelt deze technieken op in 'prefertilisation' en 'post-fertilization'.
21
Tabel 4: Overzicht van technieken voor het overwinnen van genetisch vastgelegde
kruisingsbarrières (Van Tuyl & De Jeu, 1997)
Voor bevruchting
Na bevruchting
Vreemde bestuiving ('mixed & mentor pollen')
Ovariumcultuur
Beïnvloeden van omgevingsfactoren
Zaadknopcultuur
Manipuleren van de stijl of het vruchtbeginsel
Embryocultuur
Chemische behandeling
Tabel 4 toont een kort overzicht van technieken die reeds in het verleden met succes
toegepast werden. Hieronder wordt elke techniek beknopt besproken:
Vreemde bestuiving: Hierbij zal men gebruik maken van een stuifmeeloplossing die
bestaat uit twee componenten. Enerzijds 'mixed pollen' (mengsel van compatibel en
incompatibel pollen) en anderzijds 'mentor pollen' (compatibel stuifmeel dat bestraald
werd, doch nog in staat is tot kieming) (Adiwilaga & Brown, 1991) (Knox, Gaget, &
Dumas, 1987);
Beïnvloeden van omgevingsfactoren: Omgevingsfactoren zoals temperatuur
(Matsubara, 1980) en luchtvochtigheid (Ockendon, 1978) hebben soms een
beduidende invloed op kieming van stuifmeelkorrels, dit fenomeen is echter sterk
plantafhankelijk;
Manipuleren van de stijl of het vruchtbeginsel: Onder manipuleren verstaat men het
verwijderen stempel of beschadigen van de stijl, men bestuift vervolgens het ontstane
snijvlak (Janson, 1993). Een andere techniek die hieronder valt is het enten van een
compatibele stijl op die plant waar men mee wil kruisen (van Tuyl & Lim, Interspecific
hybridisation and polyploidisation as tools in ornamental plant breeding, 2003);
Naast het beïnvloeden van fysische parameters, kan een behandeling met bepaalde
chemische stoffen ook bevruchting mogelijk maken (Ockendon, 1978) (Wolters-Arts,
Mary-Lush, & Mariani, 1988);
Culturen van ovarium, zaadknop en embryo: Het principe dat hier geldt is dat de
incompatibiliteitsreactie plaats zal vinden nadat bevruchting opgetreden is, men zal
dat bepaalde deel van de bloem in aparte cultuur brengen vooraleer abscissie
doorgaat (Raghavan, 1986).
Het maken van de kruising is slechts de eerste stap in de productie van allopolyploïden. De
progenie van dergelijke kruisingen is vaak steriel en duidt men aan met de term amfiploïd.
Acquaah (2009) stelt dat de keuze van geschikte ouderplanten cruciaal is voor kans op
slagen: hoe lager de ploïdiegraad van de ouderplanten, hoe groter de kans op fertiele
amfiploïden. Vervolgens kan men door middel van mitotische polyploïdisatie allopolyploïden
bekomen.
22
2.3.4 Vaststellen van de ploïdiegraad van planten
Vele plantensoorten verschillen in aantal chromosomen en in ploïdiegraad. Indien men deze
zaken eenduidig wil vast stellen, dient men preparaten te maken van worteltoppen (Adams &
Wendel, 2005). Op deze manier kan men met behulp van microscopie en een geschikte
kleurstof chromosomen tellen. In grote veredelingsprogramma's waar explantaten tegelijk
onderworpen worden aan een behandeling met mitoseremmers, kunnen honderden planten
bekomen worden in een tijdsduur van enkele maanden (Beck, Dunlop, & Fossey, 2003).
Omdat het maken van dergelijke hoeveelheden worteltoppreparaten economisch niet
haalbaar is, doet men in sommige studies beroep op bepaalde morfologische parameters. Zo
gebruiken Przywara et al. (1988) de gemiddelde lengte van stomata als indicator van de
ploïdiegraad bij Actinidia deliciosa. Ook bij deze techniek dient men microscopisch
onderzoek te verrichten bij elke plant.
Tegenwoordig doet men vooral beroep op flowcytometrie voor het vaststellen van de
ploïdiegraad van planten (Schutte, Reynders, Bosman, & Blijham, 1985). Flowcytometrie is
een krachtig hulpmiddel voor onderzoek inzake planten, pathogenen en zelfs in de medische
sector (Macey, 2007). Deze techniek steunt op verschillende domeinen binnen de fysica:
hydrodynamica, optica en elektronica (Watson, 1999). De flowcytometer (FCM) voelt cellen
of losse deeltjes aan die zich bevinden in een vloeistofstroom. Door een vernauwing van de
vloeistofstroom passeren de deeltjes individueel door een 'sensing area', deze wordt
bekomen met behulp van een excitatiebron, meestal een laser of lichtbron (vb.LED, light
emitting diode). Naarmate de cellen doorheen de excitatiebron bewegen, treedt
lichtverstrooiing op in alle richtingen. Er bestaat een specifiek verband tussen de
hoeveelheid voorwaartse lichtreflectie (forward scatter) en de straal van het deeltje, en aldus
ook de grootte van de deeltjes. Tevens bestaat er een verband tussen de hoeveelheid
zijwaartse lichtreflectie (sideward scatter) en de granulariteit van de cel (Brunsting &
Mullaney, 1994). Deze lichtverstrooiing is het gevolg van reflectie en refractie op de celkern
of andere componenten van de cel. De cellen in de vloeistofstroom kunnen vooraf behandeld
worden opdat zij makkelijker door het toestel herkend kunnen worden, bovendien is
differentiatie van verschillende celtypes hierdoor mogelijk. Ook DNA-inhoud kan op deze
manier berekend worden (Longobardi, 2001).
23
Figuur 7: Schematische voorstelling van een flowcytometer (Macey, 2007)
Door middel van een serie reflecterende oppervlakken en filters zullen specifieke golflengten
terecht komen in een 'photomultiplier tube'(PMT) (Figuur 7). Deze elektronische systemen
detecteren inkomende fotonen en converteren dit naar een elektrische impuls. De bekomen
impuls wordt verwerkt door een analoog-digitaalomzetter (A-to-D) tot een numeriek gegeven
dat door een computer vertaald wordt naar een 'single-parameter' histogram (CroslandTaylor, 1953). Een vergelijking van de verkregen piekpositie ten opzichte van de piekpositie
van een plant van diezelfde soort met gekend ploïdieniveau volstaat om grote verschillen
vast te stellen (D'hondt, 2011).
24
3 Algemene materialen en methoden
3.1 Opbouwen van een startpopulatie Escallonia spp.
Voor de start van de veredeling wordt een veredelingsprogramma opgesteld. Deze bevat
een voorstudie waarin men enerzijds kennis zal verzamelen over het gewas zelf. Anderzijds
zal men de verschillende technieken, die men wenst te gebruiken tijdens de veredeling,
uitvoering testen opdat men in latere stadia niet te maken zou krijgen met onverwachte
problemen.
Tabel 5: Escallonia soorten in het veredelingsprogramma
Code
Genotype
Oorsprong
ES1
Escallonia illinita
Hans De Neve
ES2
Escallonia laevis 'Gold Ellen'
Hans De Neve
ES3
Escallonia 'Red Elf'
Hans De Neve
ES4
Escallonia rubra var. macrantha
Hans De Neve
ES5
Escallonia 'Red Dream'
Hans De Neve
ES6
Escallonia 'Donard Seedling'
Hans De Neve
ES7
Escallonia 'Iveyi'
Hans De Neve
ES8
Escallonia bifida
Plantentuin Meise
ES9
Escallonia iveyi (x)
Plantentuin Meise
ES10
Escallonia pendula
Plantentuin Meise
ES11
Escallonia alpina
Royal Botanical Gardens Edinburgh (RBGE)
ES12
Escallonia alpina
Hillier Gardens
ES13
Escallonia resinosa
Hillier Gardens
ES14
Escallonia rosea
Hillier Gardens
ES15
Escallonia stricta (x)
Hillier Gardens
ES16
Escallonia rubra
Royal Botanical Gardens Edinburgh (RBGE)
ES17
Escallonia illinita
Botanischer Garten Universität Wien
ES18
Escallonia rubra var. rubra
Hortus Botanicus Amsterdam
ES19
Escallonia alpina
Marc Bulk
ES20
Escallonia rubra 'C.F. Ball'
Plantentuin Meise
ES21
Escallonia 'Langleyensis'
Hof ter Saksen Beveren
ES22
Escallonia 'Apple Blossom'
Esveld Boomkwekerij
ES23
Escallonia myrtoidea
Royal Botanical Gardens Edinburgh (RBGE)
25
Tabel 5 toont de verschillende Escallonia soorten die gebruikt worden in het
veredelingsprogramma. Elk genotype krijgt een code toegekend voor praktische doeleinden
in de verschillende proeven. Verschillende Escallonia soorten worden bij sommige telers
kleinschalig geteeld. Hiervan werden volledige planten opgekocht. Anderzijds werd er beroep
gedaan op botanische tuinen en universiteiten met collecties aan vaste planten, van deze
planten werden stekken opgestuurd. Planten die uit stek groeien hebben een
groeiachterstand op degene die als potplant geleverd worden. Bovendien bloeien deze
planten niet in het eerste jaar als stek waardoor evaluatie van bloeikenmerken niet mogelijk
is. Van elk genotype zijn er drie planten in pot opgekweekt in beschermde omgeving.
Doordat de planten niet blootgesteld worden aan wisselende weersomstandigheden,
verloopt initiatie vlotter met minder contaminatie (Ahmad, Faisal, Anis, & Aref, 2010). Deze
moederplanten dienen als uitgangsmateriaal voor de in vitro initiaties. Het aantal explantaten
dat men kan winnen voor in vitro initiatie is afhankelijk van de groei van de moederplanten.
Men mag de moederplanten niet volledig oogsten om voldoende hergroei te verzekeren. Ook
voor de bepaling van de genoomgrootte, doet men beroep op jong bladmateriaal van de
moederplanten. Voor evaluatie van bepaalde kenmerken, zoals winterhardheid, wordt
uitgeplant in volle grond en in open lucht. Hierbij staan de planten in rijen op het veld in
chronologische volgorde, zodanig dat evaluaties efficiënt doorgevoerd kunnen worden.
Aangezien dit veredelingsprogramma geen programma is gebaseerd op het uitvoeren van
kruisingen, is een dergelijke uitgangspopulatie voldoende groot. Een aantal genotypen
worden uitgeselecteerd voor mitotische polyploïdisatie in vitro. De criteria die hiervoor
gebruikt werden zijn:
Winterhardheid;
Interesse vanuit de sector;
In vitro eigenschappen gerelateerd aan dat genotype.
Indien men vertrekt van een meer wintervast genotype heeft men meer zekerheid over de
vermarktbaarheid een bekomen polyploïd genotype. Daarnaast spelen eigenschappen zoals
groeivorm, blad- en bloemkenmerken een belangrijke rol in de verkoop van Escallonia.
Indien aan alle voorgaande criteria voldaan wordt, kan men trachten een polyploïd genotype
te bekomen. Dit is slechts mogelijk als de plant in een in vitro systeem kan geïntroduceerd
worden. Grote verschillen zijn terug te vinden in het gedrag van een genotype in vitro, welke
op
zich
afhankelijk
zijn
van
een
aantal
factoren
(mediumsamenstelling,
hormonensamenstelling en -concentratie).
26
3.2 Bereiden van een medium
Telkens wanneer planten in vitro geïnitieerd of overgeënt worden, dient een gepast medium
aangemaakt te worden. Volgende werkwijze wordt gehanteerd:
De benodigde hoeveelheid van elke component wordt afzonderlijk herberekend in
functie van het gewenste eindvolume;
Een mengbeker wordt deels gevuld met gedemineraliseerd water waarin een roervlo
geplaatst wordt;
Alle componenten worden afzonderlijk afgewogen en toegevoegd aan het mengsel,
behalve de agar;
Terwijl het mengsel geroerd wordt, zal de pH ingesteld worden met behulp van KOH
en HCl tot de gewenste waarde, vervolgens de agar toevoegen;
Het mengsel wordt tot koken gebracht (homogeniseren van de agar);
Overgieten van het mengsel in flessen of recipiënten en autoclaveren.
De groeimedia die uitgetest worden, bevatten benzyladenine als cytokinine. Door het
toevoegen van cytokinines tracht men het uitlopen van okselknoppen te bekomen. Het
benzyladenine wordt frequent aangewend voor tal van kruidachtige gewassen (Murashige,
Plant propagation by tissue culture: a practice with unrealized potential, 1990). Lambargi et
al. (2013) gebruiken het benzyladenine ook voor de micropropagatie van houtachtige
gewassen. Dit onder andere voor verschillende Pyrus spp., hiervoor werden concentraties
van 2 tot 10µM toegevoegd. Voor Escallonia spp. worden verschillende concentraties in het
medium aangebracht om te zien welke concentratie het beoogde effect het best realiseert.
Als auxine wordt gewerkt met 1-naftylazijnzuur. Dit synthetisch auxine is minder gevoelig
voor foto-oxidatie dan indolazijnzuur en heeft daardoor een langere werking (Paek & Yeung,
1991).
Voor specifieke doeleinden wordt afgeweken van deze hormonensamenstelling. Voor
regeneratie van planten uit explantaten na behandeling met mitoseremmers wordt gebruik
gemaakt van thidiazuron.
27
3.2.1 Murashige&Skoog medium
Vanwege het universele karakter van MS medium worden verschillende groeimedia
samengesteld voor de initiatie van Escallonia spp.. Volgende componenten zijn gelijk voor
deze groeimedia:
Sucrose: 30 g/l;
Hoeveelheid MS: 4,41 g/l (Duchefa Biochemie B.V., Nederland);
Agar: 7 g/l;
pH voor autoclaveren: 5,8 - 6,0.
Tabel 6: Initiatieschema MS medium met verschillende concentraties benzyladenine
(BA) en 1-naftylazijnzuur (NAA)
NAA
BA
Concentratie
(mg/l)
0
0,1
0,5
1
0
0
1
2
3
0,2
4
5
6
7
0,5
8
9
10
11
1
12
13
14
15
2
16
17
18
19
Tabel 6 geeft het initiatieschema voor MS medium weer. De getallen in het binnenste van de
tabel is een numerieke code toegekend aan elk medium. Op deze manier kan men achteraf
eenvoudig terugvinden wat de samenstelling was van het gebruikte medium tijdens initiatie.
Met behulp van een dergelijk schema test men de verschillende concentraties op efficiënte
wijze.
3.2.2 Woody Plant medium
Een bijkomende reeks van groeimedia die uitgetest wordt, is gebaseerd op Woody Plant
Medium (WPM). Zoals reeds vermeld is WPM uitermate geschikt voor de micropropagatie
van houtachtige gewassen. Wederom zijn volgende componenten gelijk:
Sucrose: 30 g/l;
Hoeveelheid WPM: 2,46 g/l (Duchefa Biochemie B.V., Nederland);
Agar: 7 g/l;
pH voor autoclaveren: 5,8 - 6,0.
28
Tabel 7: Initiatieschema WPM met verschillende concentraties benzyladenine (BA)
Concentratie (mg/l)
0
BA
0
20
0,2
21
0,5
22
1
23
2
24
Voor WPM medium worden geen verschillende concentraties 1-naftylazijnzuur toegevoegd.
Het nut van deze groeimedia is een succesvolle initiatie voor genotypen die het minder goed
of totaal niet groeien op MS medium. Daarnaast blijkt uit de resultaten van de in vitro
initiaties dat initiatie succesvol is ook zonder 1-naftylazijnzuur toe te voegen aan het medium.
3.3 Protocol in vitro initiatie
Jonge, pas ontloken scheuten werden van de moederplanten geknipt;
De jonge scheuten worden verknipt en in een netje geplaatst;
1 volledige minuut spoelen in een ethanol oplossing (70%);
Spoelen met gedemineraliseerd water;
20 minuten spoelen in een NaOCl oplossing (10%);
Driemaal spoelen met gedemineraliseerd water;
30 minuten droogtijd.
Na ontsmetting en het drogen, worden de scheuten versneden waarbij elk stuk minstens één
axillair meristeem bevat. Het versneden explantaat kan vervolgens geënt worden in het
medium. Bij elke initiatie wordt een schema opgesteld om de explantaten te testen aan
verschillende samenstellingen en concentraties aan groeihormonen. Afhankelijk van de
groeisnelheid van het explantaat is beoordeling mogelijk vanaf vier tot zes weken na initiatie.
Goed groeiende explantaten worden tien weken na initiatie overgeënt op vers medium.
Welke samenstelling dat medium heeft waarop overgeënt wordt, hangt af van de resultaten
van de desbetreffende initiatie.
29
3.4 Bepalen van de
flowcytometrie
ploïdiegraad
met
behulp
van
3.4.1 Principe
Elk staal wordt manueel gehakt met een scherp mesje om een celsuspensie te verkrijgen. In
elk staal wordt ook aandeel interne standaard mee verhakt. De interne standaard hier is een
diploïde variëteit van Engels raaigras: Lolium perenne 'Paddock'. Deze wordt steeds aan een
staal toegevoegd als referentie. Dit is nodig omdat sommige secundaire metabolieten in het
staal, zoals bepaalde polyfenolen, kunnen interfereren met de lichtverstrooiing. Hierdoor
kunnen deze kleine, doch significante verschillen veroorzaken in piekpositie (Greilhuber,
Temsch, & Loureiro, 2007). Door het Engels raaigras toe te voegen, zullen beide pieken
verschuiven in gelijke zin zodanig dat men steeds onderscheid kan maken tussen diploïde
en tetraploïde Escallonia planten.
Er wordt gewerkt met DAPI als kleurstof die zal binden op het DNA in de stalen. Het 4',6Diamidino-2-phenylindole of kortweg DAPI is een fluorescerende kleurstof die een grote
bindingsaffiniteit vertoont met adenine-thymine bindingen in de DNA structuur (McCarthy,
2007). Het DAPI heeft een absorptiemaximum bij een golflengte van 358nm en een
emissiemaximum bij een golflengte van 461nm (blauw licht) (Maecker, Frey, Nomura, &
Trotter, 2004).
3.4.2 Protocol
Planten klaar voor analyse worden individueel gemarkeerd met een nummer. Dit is belangrijk
zodanig dat men na analyse weet welke planten tetraploïd zijn. Elk recipiënt wordt in een
laminair air flow (LAF) geopend, zodanig dat men van elke plant een staal kan nemen zonder
de cultuur te contamineren.
Vervolgens worden twee bufferoplossingen aangemaakt:
Buffer 1: 250ml gedemineraliseerd water + 5,25g citroenzuur + enkele druppels
Tween20 (uitvloeier);
Buffer 2: 500ml gedemineraliseerd water + 20g Na3PO4 + 100µl DAPI
Men voegt 500µl buffer 1 toe aan het staal voor choppen zodat een stabiele celsuspensie
bekomen kan worden. Een verhakt staal wordt gefilterd (maaswijdte 50µm) om alle grove
deeltjes uit het staal te verwijderen, vervolgens wordt buffer 2 toegevoegd. Een bijkomend
voordeel van het gebruik van DAPI in tegenstelling tot het propidium-iodide, is dat er geen
incubatietijd nodig is. De flowcytometer staat standaard ingesteld voor DAPI-metingen. Men
kan de voorkeuren wijzigen voor visuele display van het bekomen fluorescentiehistogram.
30
Op deze manier zal een diploïde Escallonia piek zijn positie geeft bij de empirische waarde
100, een tetraploïde plant zal haar piekpositie tonen bij 200 en het Engels raaigras in het
staal vertoont dan een piek rond 300. Dit laat een snelle, eenduidige analyse toe van een
groot aantal stalen.
31
4 Experimenten
4.1 Genoomgrootte van Escallonia soorten
4.1.1 Protocol
De genoomgrootte van een plant is een uitdrukking van de DNA-inhoud en staat
onrechtstreeks in verband met de ploïdiegraad. Hoe hoger de ploïdiegraad van de plant, hoe
groter het genoom van die soort. Dit is echter niet altijd correct, er is een duidelijk verschil in
genoomgrootte tussen de verschillende plantensoorten (Lynch & Walsh, 2007). Terminologie
die men hiervoor aanwendt gaat als volgt: 2C is de DNA-inhoud van een gewone somatische
cel, 1C is de DNA-inhoud van een gameet en is bovendien gelijk aan 2C/2, 1C is een
theoretische waarde. De DNA-inhoud wordt uitgedrukt in picogram (pg), alhoewel deze ook
uitgedrukt kan worden in aantal basenparen (bp). Voor omrekening van picogram naar
basenparen of omgekeerd wordt beroep gedaan op een omrekeningsfactor: 1pg = 978 Mbp
(Dolezel, et al., 1998).
De bepaling van de genoomgrootte met behulp van flowcytometrie steunt op een vergelijking
van de hoeveelheid fluorescentie geëmitteerd door een interne standaard met gekende
genoomgrootte ten opzichte van de geëmitteerde fluorescentie van het doelgewas (Dolezel,
et al., 1998). Er wordt gebruik gemaakt van propidium-iodide (PI) dat bindt op adeninethymine en guanine-cytosine bindingen in de DNA structuur. Het PI vertoont sterke absorptie
van de golflengtes 365nm en 535nm. De maximale emissie vindt plaats bij 617nm (Riccardi
& Nicoletti, 2006). Eenmaal toegevoegd aan een staal, dient het staal geïncubeerd te worden
voor dertig minuten in een koelkast. Een meting van de DNA-inhoud van enkel een
Escallonia soort zou geen relevant cijfer opleveren, vandaar dat er steeds gebruik gemaakt
wordt van een interne standaard. De interne standaard is een plantensoort met gekende
genoomgrootte die samen met de te onderzoeken soort in één staal verwerkt wordt. De
interne standaard is geen erkende standaard, maar een waarde die steeds terug gevonden
wordt in de literatuur (Johston, Bennett, Rayburn, Galbraith, & Price, 1999).
Volgende standaarden kunnen gebruikt worden in functie van de genoomgrootte van het te
onderzoeken gewas (Dolezel, et al., 1998)(Dolezel,et al., 1994)
Raphunus sativus 'Saxa' (2C = 1,38pg);
Solanum esculentum 'Stupicke' (2C = 1,96pg);
Glycine max 'Polanka' (2C = 2,50pg);
Pisum sativum 'Ctirad' (2C = 9,09pg).
32
Eenmaal men bladmateriaal (ongeveer 0,5cm²) van de interne standaard en de Escallonia
soort verzameld heeft, worden deze manueel fijngehakt met een scherp mesje. Er wordt ook
altijd minstens één blanco staal gemaakt waarbij enkel interne standaard gebruikt wordt.
Het fijngehakte materiaal wordt aangelengd met twee bufferoplossingen. De
bufferoplossingen zijn deel van een standaard kit aangekocht bij de firma Partec, CyStain.
Buffer 1 (CyStain PI Absolute P Nuclei Extraction Buffer) is een oplossing op basis van het
propidium-iodide. Men voegt 350µl toe per staal. Het fijngehakte staal met buffer 1 wordt
gefilterd (maaswijdte 50µm) zodanig dat alle grove resten verwijderd worden en de
flowcytometer niet verstopt geraakt. Daarna wordt buffer 2 toegevoegd. Buffer 2 bevat drie
componenten (20ml staining solution, 120µl PI stock solution en 60µl RNase). Vervolgens
ondergaan de stalen een incubatieperiode van dertig minuten. Na incubatie zijn de stalen
klaar voor analyse. Analyse met de flowcytometer levert twee piekposities op, 1 piek van de
interne standaard en 1 piek van de onderzochte soort. Aangezien de genoomgrootte van de
interne standaard gekend is, kan aan de hand van de onderlinge verhouding van de pieken,
de genoomgrootte van de onderzochte soort berekend worden met behulp van onderstaande
formule:
Om zoveel mogelijk toevalsfouten te vermijden, wordt voor alle Escallonia soorten de
analyse driemaal uitgevoerd, dit op verschillende dagen. Het rekenkundig gemiddelde van
de drie analyses is de uiteindelijke genoomgrootte van dat genotype.
4.1.2 Resultaten en bespreking
Tabel 20 en Tabel 21 geven de piekposities weer van de verschillende Escallonia soorten
voor de drie metingen (Bijlage 1: Meetresultaten bepaling van de genoomgrootte). Metingen
van Escallonia alpina (ES11) en Escallonia resinosa (ES13) kon men niet uitvoeren daar de
geleverde stekken niet bewortelden en afstierven. De parameters FL3 en FL4 zijn
verschillende fluorescentiegolflengtes die gemeten worden. FL4 is hierbij de primaire
golflengte die gemeten wordt, FL3 wordt gemeten in functie van de primaire golflengte. Men
meet beide fluorescentiegolflengtes als extra controle, de bekomen genoomgrootte per
genotype wordt achteraf kritisch beoordeeld.
Resultaten vindt men terug in Tabel 8 en Tabel 9.
33
Tabel 8: Genoomgrootte per genotype op FL4 (ES = Escallonia)(in picogram)
Genotype + Genoomgrootte Standaardafwijking Vermoedelijke
interne
ploïdiegraad
standaard
ES1 + T
1,20
0,03
Diploïd
ES2 + T
1,26
0,03
Diploïd
ES3 + T
1,07
0,03
Diploïd
ES4 + T
1,11
0,03
Diploïd
ES5 + T
1,20
0,14
Diploïd
ES6 + T
1,06
0,06
Diploïd
ES7 + S
1,46
0,02
Diploïd
ES8 + T
1,44
0,01
Diploïd
ES9 + T
1,22
0,02
Diploïd
ES10 + M
2,17
0,16
Tetraploïd
ES12 + T
1,15
0,04
Diploïd
ES14 + T
1,10
0,03
Diploïd
ES15 + T
1,12
0,04
Diploïd
ES16 + T
1,07
0,04
Diploïd
ES17 + T
1,27
0,08
Diploïd
ES18 + T
1,12
0,01
Diploïd
ES19 + T
1,11
0,03
Diploïd
ES20 + T
1,06
0,03
Diploïd
ES21 + T
1,05
0,00
Diploïd
ES22 + T
1,14
0,04
Diploïd
ES23 + T
1,20
0,03
Diploïd
De bekomen genoomgrootte per genotype op FL4 dient, statistisch gezien, gelijk te zijn aan
die op FL3 (statistische verwerking met behulp van SPSS22). Men dient eerst een
normaliteitstest uit te voeren, deze gaat na of de data afkomstig is uit een normaal verdeelde
populatie. Hiervoor wordt gebruik gemaakt van de Kolmogorov-Smirnov test.
34
Tabel 9: Genoomgrootte per genotype op FL3 (ES = Escallonia)(in picogram)
Genotype + Genoomgrootte Standaardafwijking Vermoedelijke
interne
ploïdiegraad
standaard
ES1 + T
1,17
0,03
Diploïd
ES2 + T
1,27
0,05
Diploïd
ES3 + T
1,03
0,07
Diploïd
ES4 + T
1,11
0,08
Diploïd
ES5 + T
1,20
0,07
Diploïd
ES6 + T
1,06
0,03
Diploïd
ES7 + S
1,50
0,09
Diploïd
ES8 + T
1,42
0,04
Diploïd
ES9 + T
1,24
0,03
Diploïd
ES10 + M
2,06
0,19
Tetraploïd
ES12 + T
1,15
0,07
Diploïd
ES14 + T
1,11
0,05
Diploïd
ES15 + T
1,12
0,06
Diploïd
ES16 + T
1,07
0,04
Diploïd
ES17 + T
1,28
0,06
Diploïd
ES18 + T
1,13
0,02
Diploïd
ES19 + T
1,09
0,08
Diploïd
ES20 + T
1,03
0,07
Diploïd
ES21 + T
1,03
0,05
Diploïd
ES22 + T
1,10
0,05
Diploïd
ES23 + T
1,16
0,02
Diploïd
De Kolmogorov-Smirnov test levert een p-waarde op van 0,00. Aangezien deze telkens
kleiner is dan 0,05 kan men dus met 95% zekerheid stellen dat de data niet afkomstig zijn uit
een normaal verdeelde populatie. Concreet houdt dit in dat verdere verwerking beroep zal
doen op de Mann-Whitney U test. De bekomen p-waarde bedraagt 0,753 en is dus groter
dan 0,05. Hieruit kan men besluiten dat de genoomgrootte gemeten op beide
fluorescentieparameters met 95% zekerheid gelijk is aan elkaar. Deze statistische test wijst
erop dat het toestel correct afgesteld staat en geen afwijkende meetresultaten geeft.
Tevens is het zo dat de gevonden genoomgrootte van Escallonia pendula (ES10) in grootte
verschilt ten opzichte van de andere genotypen. Dit kan wijzen op een gewijzigde
genoomsamenstelling van dit genotype, bovendien kan dit visueel bevestigd worden
aangezien Escallonia pendula een uniek fenotype vertoont. Voor volledige zekerheid dienen
chromosoomtellingen van de verschillende genotypen te gebeuren.
35
4.2 In vitro initiatie
4.2.1 Doel
In de ploïdieveredeling kan men opteren voor meer klassieke behandelingsmethoden (in
vivo) of men kan werken in een in vitro systeem. Naast allerhande voordelen die het in vitro
systeem te bieden heeft, zoals veiligheidsaspecten en efficiënt gebruik van beschikbare tijd
en ruimte, kan men eveneens een aantal nadelen aanhalen. Het opstellen van de geschikte
protocollen vereist tijd, kennis en de nodige infrastructuur. De uiteindelijke reden waarvoor
men voor een in vitro polyploïdisatie kiest, is omdat op die manier een zeer groot aantal
explantaten tegelijk onderworpen kunnen worden aan verschillende behandelingen. Men kan
verschillen bestuderen in aard en duur van de behandeling en dit op veel kleinere
oppervlakte. Om tot de effectieve veredeling te komen, moet men beschikken over
voldoende startmateriaal, meer specifiek vegetatieve klonen van een bepaald genotype. De
verschillende genotypen worden vermeld in Tabel 5.
Omdat het verkrijgen van een stabiele nodiëncultuur slechts een onderdeel is van de
veredelingsprocedure en geen einddoel op zich, worden de verschillende initiaties kwalitatief
beoordeeld. Het is immers niet de bedoeling een commercieel in vitrovermeerderingsprotocol op te stellen.
4.2.2 Specifieke materialen en methoden
Van elk genotype beschikt men over een aantal potplanten opgekweekt in beschermde
omgeving. Deze planten worden gehouden bij een minimumtemperatuur van 15°C en
natuurlijke lichtomstandigheden. Deze moederplanten vormen de basis voor toekomstige in
vitro culturen. De explantaten worden gewonnen en verder behandeld volgens het protocol
op pagina 29. Initiaties verlopen in glazen proefbuizen gevuld met 10ml medium. Explantaten
worden getest op verschillende groeimedia, bereid volgens het protocol op pagina 27, met
aangepaste concentraties groeihormonen volgens Tabel 6 en Tabel 7.
Na initiatie worden de explantaten geplaatst in een groeikamer met volgende instellingen:
Temperatuur: 23 ±1°C;
Fotoperiode: 16uur;
Lichtintensiteit: 35 µmol/ m²/ s.
In eerste instantie worden de verschillende MS groeimedia uitgetest. Indien initiatie niet
slaagt op deze media, worden groeimedia uitgetest op basis van McCown's WPM
(Lambardi, et al., 2013). Na succesvolle initiatie worden de explantaten opgeschoond en
verspeend. Bij sommige explantaten vertonen de jongste bladeren chlorotische
verschijnselen. Deze scheuten worden verspeend naar het gepaste medium waaraan extra
mineralen toegevoegd worden. Sequestreen (Fe-EDDHA) is een ijzerhoudend chelaat.
Chelaten zijn moleculen waar een positief geladen metaalion de centrale positie inneemt, het
is omringd en gestabiliseerd door een negatief geladen 'chelating agent'.
36
Het sequestreen wordt toegevoegd aan een concentratie van 50mg/l en geeft het medium
een typerende rode kleur. Daarnaast wordt ook extra magnesium toegevoegd onder de vorm
van Mg(NO3)2.6H2O aan een concentratie van 1,5 mM.
4.2.3 Resultaten en bespreking
Tot op het heden werden 14 van de 23 beschikbare genotypen te initiëren in vitro. Zoals
eerder aangegeven werden eerst MS groeimedia uitgetest, sommige genotypen, zoals
Escallonia illinata (afkomstig van kwekerij Hans De Neve), Escallonia rosea en Escallonia
rubra groeien goed. De meeste soorten blijken echter niet goed te groeien op standaard MS
medium, ongeacht de concentratie BA of NAA die aan het medium toegevoegd wordt.
Explantaten van Escallonia illinata (Botanischer Garten Universität Wien) en Escallonia
alpina overleven wel op MS medium met 2mg BA per liter medium (±9µM) maar vertonen
onvoldoende groei. De initiatie verloopt dan moeizaam en men bekomt na tien weken
onvoldoende nodiën voor verdere proefopzet. Genotypen die niet groeiden op MS medium
werden getest op McCown WPM. De zoutensamenstelling van het WPM verschilt sterk ten
opzichte van MS medium (McCown & Lloyd, 1981). De totale ionensom is ongeveer de helft
van het standaard MS medium. Zoutgevoeligheid van houtachtige gewassen is een
algemene regel (Kozlowski, 1997). Er bestaan grote verschillen in zoutgevoeligheid en
bovendien is de uiteindelijke schade afhankelijk van een aantal omgevingsomstandigheden.
In een in vitro systeem speelt het medium geen bufferende rol, de totale zoutsterkte van het
medium bepaalt aldus of zoutschade zal optreden (Shibli, Shatnawi, & Swaidat, 2003).
Tabel 10 toont de genotypen waarvan een in vitro cultuur tot stand gebracht is, met telkens
het medium in de rechtse kolom. Alle genotypen werden getest op WPM met verschillende
concentraties BA (Tabel 7).
Tabel 10: Geïnitieerde genotypen in vitro
Genotype
Medium
Escallonia illinita
MS + 2mg BA/l + 0,1 mg NAA/l
Escallonia laevis 'Gold Ellen'
WPM + 2mg BA/l
Escallonia 'Red Elf'
WPM + 2mg BA/l
Escallonia rubra var. macrantha
WPM + 2mg BA/l
Escallonia 'Donard Seedling'
WPM + 2mg BA/l
Escallonia 'Iveyi'
WPM + 2mg BA/l
Escallonia bifida
WPM + 2mg BA/l
Escallonia iveyi (x)
WPM + 2mg BA/l
Escallonia pendula
WPM + 2mg BA/l
Escallonia rosea
MS + 2mg BA/l + 0,1 mg NAA/l
Escallonia rubra
MS + 2mg BA/l + 0,1 mg NAA/l
Escallonia alpina
WPM + 2mg BA/l
Escallonia rubra 'C.F. Ball'
WPM + 2mg BA/l
Escallonia 'Langleyensis'
WPM + 2mg BA/l
37
Voor sommige genotypen is initiatie succesvol op media met een lagere concentratie
benzyladenine. Toch zal voor verdere vermeerdering gekozen worden voor het medium met
de hoogste concentratie BA ook al is een lagere concentratie mogelijk. Het principe dat hier
geldt, is dat de hogere concentratie cytokinine in het medium zorgt voor extra
celdelingactiviteit en stimuleert eveneens de vertakking van het uitgroeiende explantaat
(Davies, 1995). Op deze manier worden meer axillaire meristemen bekomen op dezelfde
periode.
Figuur 8: Escallonia pendula (links: zes weken na initiatie; rechts: tien weken na
initiatie)
Figuur 8 geeft een voorbeeld weer van een geslaagde initiatie. Na initiatie loopt het axillaire
meristeem op het explantaat uit en vormt zo een nieuwe scheut. Zes weken na initiatie
worden explantaten in vitro verspeend naar een groter recipiënt op vers medium. Bij het
verspenen wordt moederweefsel weggesneden, op deze manier behoudt men enkel
volwaardige scheuten. Deze cultuur is een nodiëncultuur, Er werden geen problemen
vastgesteld inzake bruinverkleuring of hyperhydriciteit. Bruinverkleuring van het medium
treedt echter wel op bij stock die te oud wordt.
38
4.2.4 Besluit
Voor de in vitro cultuur blijkt standaard MS medium geschikt te zijn voor de genotypen
Escallonia illinita, Escallonia rosea en Escallonia rubra. Deze genotypen zijn beter bestand
tegen de relatief hoge concentraties aan anorganische zouten in het medium. Het grootste
aandeel van de genotypen groeit echter niet op MS. Hiervoor kan Woody Plant medium een
oplossing bieden. Als cytokinine werd gebruik gemaakt van 2mg/l benzyladenine. Voor een
nodiëncultuur is het toevoegen van een auxine in de meeste gevallen overbodig. Alle
bekomen in vitro planten maken deel uit van een nodiëncultuur. Dit houdt in dat men met
regelmatige intervallen scheuten gaat oogsten en deze opnieuw overenten op vers medium.
Op deze manier kan men de stock opbouwen (vermeerderen) tot dat voldoende
plantmateriaal bekomen wordt voor polyploïdisatie.
39
4.3 Scheutregeneratie
van
Escallonia
rubra
uit
bladmateriaal en callusweefsel
4.3.1 Doel
Het doel van deze proef is het bekomen van volwaardige scheuten door middel van
regeneratie uit bladschijven als explantaat.
Na een behandeling met mitoseremmers worden de jonge plantjes gescreend op mogelijke
chromosoomverdubbeling. De planten die tetraploid zijn, moeten verder opgekweekt worden
vanuit het overlevende explantaat. De wijze waarop een explantaat regenereert bepaalt de
verdere vermeerdering. Sommige scheuten overleven nauwelijks de intensieve behandeling
met mitosegiffen, hierbij kan het zijn dat de cellen hun gedifferentieerde toestand verliezen,
wat aanleiding geeft tot de vorming van callus. Het algemene idee hierbij is dat de cellen uit
het explantaat zullen dedifferentiëren tot een vormeloze massa cellen, namelijk
callusweefsel. In deze toestand zullen de cellen verder delen maar niet differentiëren tot een
specifiek type weefsel of orgaan. Het callus kan echter wel op een aangepast medium
gebracht worden waar het de nodige stimuli ontvangt en zich zal differentiëren. Deze
proefopzet gaat na welke mediumsamenstelling het meest geschikt is voor regeneratie,
gebruik makend van thidiazuron (TDZ) en indol-3-boterzuur (IBA).
4.3.2 Specifieke materialen en methoden
Er werd gebruik gemaakt van een geïnitieerde stock van Escallonia rubra. Het is uitermate
belangrijk te vertrekken van in vitro blaadjes, daar in vivo blaadjes bijzonder moeilijk te
ontsmetten zijn. De bladschijven werden rechtop ingebracht in een MS medium waaraan
verschillende concentraties IBA en TDZ werden toegevoegd.
Tabel 11: Overzicht mediumsamenstelling proef scheutregeneratie
Thidiazuron
Indol-3boterzuur
Concentratie (µM)
0
1
5
0
25
26
27
0,5
28
29
30
1
31
32
33
Tabel 11 geeft de toegepaste hormonensamenstelling weer. Er wordt hier geopteerd voor
het gebruik van TDZ vanwege de krachtige werking. Op elk medium werden 30 bladschijven
getest.
40
De proef werd aangelegd op 5 november 2014. Hiervoor werd hormoonvrij medium
aangemaakt (medium 0, Tabel 6) zodat de gewenste concentraties TDZ en IBA na
autoclaveren toegediend kunnen worden. Het medium wordt in petrischalen gegoten.
Vervolgens snijdt men 270 bladschijven af uit een stockcultuur van Escallonia rubra en ent
men deze op de petrischalen (tien bladschijven per petrischaal).
Na de start van de proef werd er wekelijks gecontroleerd op mogelijke contaminatie alsook
reactie van de explantaten, dode explantaten worden verwijderd. Zes weken na initiatie
bekwam men voldoende gedifferentieerde scheuten, deze werden overgeënt op vers
hormoonvrij medium. Negen weken na initiatie werd een telling gehouden van het aantal
ontwikkelde scheuten per explantaat.
4.3.3 Resultaten en bespreking
Pas vier weken na initiatie werd een eerste reactie vastgesteld van bladschijven op medium
30, 32 en 33 (Tabel 11). Deze reactie omvat het vormen van kleine klompjes callusweefsel
aan de basis van de bladschijf (Figuur 9). Opvallend hierbij is dat het meeste callusweefsel
gevormd wordt op de groeimedia met hogere concentraties thidiazuron en indol-3-boterzuur.
Figuur 9: Geregenereerde scheuten gevormd op bladschijf explantaten (links: vier
weken na initiatie; rechts: negen weken na initiatie, op hormoonvrij medium)
Tabel 12: Samenvattende tabel proef scheutregeneratie
Aantal
Procentueel
Totaal aantal geïnitieerde
bladschijven
270
100%
Contaminatie
20
7,4%
Mortaliteit
209
77,4%
Totaal aantal geregenereerde
planten
41
15,2%
41
Na een korte callusfase van ongeveer twee weken worden scheuten gevormd. Na het
overenten van de geregenereerde scheuten op een hormoonvrij medium kennen de
scheuten een vrije uitgroei. Hiervoor doet de plant beroep op endogeen geproduceerde
groeihormonen (Bhojwani & Razdan, 1983). In sommige gevallen bepaalt de
voorbehandeling van het explantaat de verdere uitgroeicapaciteit van de plant. Dit is
bijzonder correct wanneer men gebruik maakt van TDZ als cytokinine (Huetteman & Preece,
1993). Door de lange nawerking van TDZ blijft het geregenereerd weefsel zeer reactief, dit in
combinatie met soortgebonden eigenschappen van Escallonia rubra resulteert in een
explosieve uitgroei op hormoonvrij medium.
Zoals aangegeven in Tabel 12 ligt de mortaliteit vrij hoog. De 41 planten die verkregen
werden, zijn telkens afkomstig van één explantaat en kwamen weliswaar uit verschillende
media. De herkomst van de geregenereerde planten is als volgt:
Medium 30: 13 planten;
Medium 32: 8 planten;
Medium 33: 20 planten.
Het aantal gevormde scheuten per plant kan men terugvinden in Tabel 22 (Bijlage 2) en
visueel voorgesteld in Figuur 10. Een variantieanalyse gaat na of er een duidelijk effect is
van mediumsamenstelling op het aantal gevormde scheuten. Alle data zijn normaal verdeeld
(Kolmogorov-Smirnov test, p=0,05; significantiewaardes: 0,2; 0,2; 0,2) en bovendien kunnen
geen significante verschillen in variantie aangetoond worden (Levene's-test, p=0,05,
significantiewaarde: 0,242) waardoor men een one-way ANOVA kan uitvoeren. Deze levert
een p-waarde op van 0,00 waardoor men kan besluiten dat het gemiddelde aantal scheuten
gevormd per medium significant verschillend is van elkaar.
Aantal scheuten
12
10
b
b
8,35
8
6,769230769
6
a
4
2,875
2
0
5µM TDZ; 0,5µM IBA
1µM TDZ; 1µM IBA
5µM TDZ; 1µM IBA
Figuur 10: Gemiddelde aantal scheuten op geregenereerde planten van Escallonia
rubra in functie van de mediumsamenstelling (letter boven elke balk staat voor een
significant verschillende behandeling)
42
Het grootste aantal scheuten wordt gevormd op explantaten die een voorbehandeling kregen
met 5µM TDZ. De concentratie IBA (0,5µM of 1µM) is hier minder van belang, aangezien er
geen significant verschil vastgesteld kan worden naar aantal gevormde scheuten.
Voor uiteindelijke keuze van hormonensamenstelling dient men tevens rekening te houden
met het aantal bladschijven dat de regeneratie overleeft. De herkomstverdeling laat zien dat
regeneratie pas succesvol is vanaf 1µM thidiazuron en 0,5µM indol-3-boterzuur. Lagere
concentraties TDZ en IBA zorgen niet voor de beoogde morfogenese en differentiatie van de
explantaten. Het grootste aantal van de geregenereerde planten wordt echter gewonnen uit
media met een concentratie van 5µM TDZ.
4.3.4
Besluit
Samenvattend kan men stellen dat om maximale regeneratie te combineren met zoveel
mogelijk scheuten een voorbehandeling met 5µM TDZ optimaal is. De bijdrage van het IBA is
essentieel, aangezien media met 0µM IBA geen regeneratie geven. Zowel concentraties van
0,5 en 1µM voldoende zijn voor regeneratie te bewerkstelligen. Regeneratie is tevens een
eerste stap naar het uiteindelijke in vivo brengen van de planten. Geregenereerde planten
worden best opgekweekt met voldoende ontwikkelingsruimte, hierdoor vormt de plant
sterkere scheuten die eveneens meer vertakken (Hall, 2000). Bovendien tracht men met
behulp van 'bottom cooling' de relatieve luchtvochtigheid in het recipiënt aanvaardbaar te
houden om zo weinig mogelijk hyperhydrisch weefsel te bekomen . In latere proeven zal
verder gebruik gemaakt worden van medium met 5µM TDZ en 1µM IBA voor
regeneratiedoeleinden.
43
4.4 In vitro polyploïdisatie: efficiëntie van verschillende
mitoseremmers bij Escallonia rubra
4.4.1 Doel
Deze proef gaat de efficiëntie na van verschillende mitoseremmers op het polyploïdiseren
van in vitro explantaten. Naast het type mitoseremmer worden twee parameters in rekening
gebracht: tijdsduur van de behandeling en concentratie van de mitoseremmer in het medium.
Op deze manier kan men selecteren naar de mitoseremmers die grotere percentages
tetraploïden opleveren.
4.4.2 Specifieke materialen en methoden
In deze verkennende proef wordt gebruik gemaakt van een nodiëncultuur van Escallonia
rubra. Drie verschillende mitoseremmers worden getest:
Oryzaline;
Trifluraline;
Colchicine.
Gebaseerd op verschillende studies zal hier geopteerd worden voor bepaalde concentraties
aan mitoseremmer. De concentratie oryzaline en trifluraline in het medium is 150µM, voor
colchicine is dit 1000µM. Deze proef maakt gebruik van een acute blootstelling van twee en
drie dagen. Elke behandeling wordt uitgebreid met een blancobehandeling. Tabel 13
verduidelijkt de verschillende behandelingen.
Tabel 13: Overzicht van de verschillende behandelingen
Blootstellingsduur Mitoseremmer Concentratie (µM)
Aantal nodiën
2 dagen
3 dagen
Blanco
/
30
Oryzaline
150
30
Trifluraline
150
30
Colchicine
1000
30
Blanco
/
30
Oryzaline
150
30
Trifluraline
150
30
Colchicine
1000
30
Jonge scheuten worden gesneden van de stockcultuur en ontdaan van bladeren. Vervolgens
worden deze scheuten in een vloeibaar medium geplaatst voor twee of drie dagen.
44
Dit vloeibare medium is een vloeibare versie van medium 17 (Tabel 6) met een bepaalde
concentratie mitoseremmer aan toegevoegd. Alle recipiënten worden in het donker geplaatst
op een schudtoestel (snelheid: 60rpm). Na twee en drie dagen blootstelling worden alle
nodiën van de desbetreffende behandeling uit het vloeibare medium gehaald en vervolgens
overgeënt op standaard medium 17 voor regeneratie (Tabel 6). Twaalf weken na
behandeling kan analyse met behulp van flowcytometrie van start gaan (zie pagina Fout!
Bladwijzer niet gedefinieerd. voor het protocol inzake analyse met flowcytometrie).
4.4.3 Resultaten en bespreking
Nadat alle geregenereerde planten geanalyseerd zijn, wordt per mitoseremmer het
percentage polyploïde planten berekend. Dit percentage geeft weer in welke mate die
mitoseremmer effectief resulteert in een verdubbeling van het bestaande genoom (Tabel 14).
Tabel 14: Percentage verkregen polyploïden in functie van de mitoseremmer
(behandelingen met een * verschillen significant van elkaar (Tukey-test, p=0,05))
Blootstellings- Mitoseremmer
Concentratie
Diploïd Tetraploïd
Mixoploïd
duur
(µM)
(%)
(%)
(%)
2 dagen
3 dagen
Blanco
/
100
/
/
Oryzaline*
150
32,5
17,5
50
Trifluraline*
150
19,3
24
56,7
Colchicine*
1000
83,4
2,8
13,8
Blanco
/
100
/
/
Oryzaline*
150
34,2
13,2
52,6
Trifluraline*
150
9,1
18,2
72,7
Colchicine*
1000
72,8
4,4
22,8
Het aantal tetraploïden dat bekomen wordt bij een behandeling van twee of drie dagen
verschilt niet significant van ten opzichte van elkaar (chi² - frequentieanalyse, p=0,05). Er kan
met andere woorden geen duidelijke voorkeur uitgesproken worden voor behandelingsduur
naar volgende polyploïdisatieproeven toe. De verschillende mitoseremmers resulteren allen
onderling in een significant verschillend aantal tetraploïden. Tabel 14 toont dat een colchicine
behandeling beduidend minder tetraploïden oplevert dan de andere mitoseremmers,
namelijk slechts 2,8 en 4,4% in contrast met oryzaline en trifluraline die telkens meer dan
13,2% tetraploïden opleveren. Bovendien is de concentratie bij behandeling al relatief hoog.
Colchicine geeft voor Escallonia een zwakkere verstoring van de mitose dan oryzaline en
trifluraline. Verdere polyploïdisatieproeven zullen colchicine achterwege laten.
45
4.5 Acute polyploïdisatie Escallonia rubra
4.5.1 Doel
Het doel van deze proef is het bekomen van tetraploïde planten van het genotype Escallonia
rubra (ES16) door middel van in vitro polyploïdisatie. Hiervoor worden twee protocollen
gehanteerd: enerzijds een acute polyploïdisatie en een chronische polyploïdisatie anderzijds
(zie verder). In elk protocol wordt gebruik gemaakt van twee verschillende mitoseremmers
namelijk oryzaline en trifluraline. Colchicine wordt buiten beschouwing gelaten wegens haar
relatief lage effectiviteit. De bekomen tetraploïde planten kunnen nadien in vivo gebracht
worden voor een vergelijkende morfologische studie om te zoeken naar verbeterde
eigenschappen van het genotype. Een belangrijke voorwaarde voor het opstellen van een
dergelijke proef, is dat men moet beschikken over een grote stockcultuur van het
desbetreffende genotype. Escallonia rubra groeit goed op een standaard MS met 2mg/l BA
en 0,1mg/l NAA (medium 17, Tabel 6). Deze samenstelling zal tevens gebruikt worden
doorheen de volledige proef. Het voorbereiden van de in vitro polyploïdisatie gaat aldus
vooraf aan het opbouwen van een nodiëncultuur.
Het verloop van de proef gaat als volgt:
Start chronische polyploïdisatie;
Start acute polyploïdisatie;
Explantaten die de nodige behandelingsduur gekregen hebben, overenten op
medium zonder mitoseremmer;
Start analyse van de verkregen planten met behulp van flowcytometrie;
Initiëren van beworteling en in vivo brengen van verkregen tetraploïden.
4.5.2 Specifieke materialen en methoden
Het protocol gaat van start op de eerste dag van de werkweek en loopt tot het einde van die
werkweek. De blootstellingsduur varieert van 2 tot 4 dagen met concentraties van 0, 50, 150
en 250 µM.
A. Maandag
Een schema wordt opgesteld voor het experiment, dat uitgevoerd wordt voor twee
mitoseremmers. Dit experiment heeft 12 behandelingen per mitoseremmer met per
behandeling 30 nodiën. Eerst en vooral wordt er een vloeibaar, hormoonvrij medium
gemaakt waarin de blootstelling zal plaatsvinden. Hiervoor worden 24 weckpotten gevuld
met elk 100ml vloeibaar medium:
12 potten voor oryzaline behandeling;
12 potten voor trifluraline behandeling.
46
Tabel 15: Overzichtschema acute polyploïdisatie
Concentratie (µM)
Blootstellingsduur
0
50
150
250
2 dagen
30
30
30
30
3 dagen
30
30
30
30
4 dagen
30
30
30
30
Gegevens van de mitoseremmer:
Oryzaline: 346,36 g/mol
Trifluraline: 335,28 g/mol
Vervolgens worden voldoende nodiën gesneden van de stockcultuur, elke mitoseremmer
heeft 12 behandelingen met 30 nodiën per behandeling. Elke pot bevat 6 nodiën, dit komt
neer op een totaal van 360 nodiën per geteste mitoseremmer. De nodiën worden samen in
de weckpot geplaatst met de corresponderende concentratie mitoseremmer. Eenmaal alle
weckpotten gevuld zijn, worden deze op een schudtoestel geplaatst die roteert aan een
snelheid van 60rpm.
B. Dinsdag
Deze dag wordt gebruikt om voldoende medium aan te maken. Per mitoseremmer dienen 60
meli-potten gemaakt te worden met elk 100ml vast medium.
C. Woensdag
Alle nodiën met behandelingsduur 2 dagen worden overgeënt op vast medium. De nodiën
worden uit het vloeibaar medium gehaald en grondig gespoeld met steriel water. Voldoende
gespoelde nodiën worden per 6 in het vaste medium geplaatst. Vervolgens worden de potten
gelabeld als volgt: blootstellingsduur-mitoseremmer-blootstellingsconcentratie en in de
groeikamer geplaatst bij 23±1 °C en een fotoperiode van 16uur licht / 8uur donker.
D. Donderdag
Alle nodiën met behandelingsduur 3 dagen worden overgeënt op vast medium. De nodiën
worden uit het vloeibaar medium gehaald en grondig gespoeld met steriel water. Voldoende
gespoelde nodiën worden per 6 in het vaste medium geplaatst. Vervolgens worden de potten
gelabeld als volgt: blootstellingsduur-mitoseremmer-blootstellingsconcentratie en in de
groeikamer geplaatst bij 23±1 °C en een fotoperiode van 16uur licht / 8uur donker.
47
E. Vrijdag
Alle nodiën met behandelingsduur 4 dagen worden overgeënt op vast medium. De nodiën
worden uit het vloeibaar medium gehaald en grondig gespoeld met steriel water. Voldoende
gespoelde nodiën worden per 6 in het vaste medium geplaatst. Vervolgens worden de potten
gelabeld als volgt: blootstellingsduur-mitoseremmer-blootstellingsconcentratie en in de
groeikamer geplaatst bij 23±1 °C en een fotoperiode van 16uur licht / 8uur donker.
F. Twaalf weken na de start
Per behandeling wordt de mortaliteit berekend, dit is het aantal afgestorven nodiën ten
opzichte van het aantal overlevende nodiën in die behandeling, procentueel uitgedrukt.
Geregenereerde planten die de behandeling hebben overleefd, kunnen met behulp van
flowcytometrie geanalyseerd worden om de ploïdiegraad vast te stellen.
4.5.3 Resultaten en bespreking
Voor de resultaten en bespreking van de acute polyploïdisatie wordt verwezen naar pagina
51, waar zowel de resultaten van de acute als de chronische polyploïdisatie worden
besproken en vergeleken.
48
4.6 Chronische polyploïdisatie Escallonia rubra
4.6.1 Doel
Het doel van deze proef is het bekomen van tetraploïde planten van het genotype Escallonia
rubra (ES16) door middel van in vitro polyploïdisatie. Een chronische proef opzetten vereist
de nodige planning, men dient immers tijd vrij te maken voor bepaalde werkzaamheden tot
twaalf weken na de opzet. In tegenstelling tot bij de acute behandeling, zal de blootstelling
plaats vinden in een vast medium aan lagere concentraties. De explantaten worden getest
met oryzaline en trifluraline bij vier verschillende concentraties voor zes, acht en tien weken.
4.6.2 Protocol
A. Voorbereiding
Wederom wordt een schema opgesteld per mitoseremmer die getest wordt, elk schema
bevat twaalf behandelingen (Tabel 16).
Tabel 16: Overzichtschema chronische polyploïdisatie
Concentratie (µM)
Blootstellingsduur
0
1
5
10
6 weken
30
30
30
30
8 weken
30
30
30
30
10 weken
30
30
30
30
Gegevens van de mitoseremmer:
Oryzaline: 346,36 g/mol
Trifluraline: 335,28 g/mol
Het medium wordt aangemaakt en vergoten in 60 weckpotten met elk 100ml medium. Na het
autoclaveren worden de mitoseremmers toegevoegd aan de juiste concentratie. Belangrijk
hierbij is dat het medium wel nog vloeibaar is, zodanig dat de mitoseremmer homogeen
verdeeld wordt in het medium voor stolling plaatsvindt.
B. Start van de proef
Per weckpot komen zes nodiën te staan voor hun volledige behandelingsduur. In totaal heeft
men per geteste mitoseremmer 360 nodiën nodig, versneden uit een stock cultuur.
Eenmaal alle potten gevuld zijn, worden deze in een groeikamer geplaatst bij 23±1 °C en
een fotoperiode van 16uur licht / 8uur donker.
49
C. Werkzaamheden 6, 8 en 10 weken na de start van de proef
Indien de behandelingsduur van de explantaten verlopen is, dienen deze overgeënt te
worden op een medium vrij van mitoseremmer. Alle potten worden opnieuw gelabeld en
terug in de groeikamer geplaatst.
D. Twaalf weken na de start
Per behandeling wordt de mortaliteit berekend, dit is het aantal afgestorven nodiën ten
opzichte van het aantal overlevende nodiën in die behandeling, procentueel uitgedrukt. Het
verschil met de acute behandeling is dat de planten hier regenereren in een medium met
mitoseremmer aan toegevoegd in plaats van een kortstondige blootstelling. De regeneratie
verloopt over de verschillende weken, na twaalf weken zijn de planten in de meeste gevallen
reeds voldoende ontwikkeld voor sampling voor flowcytometrie. Beworteling van tetraploïde
planten werd in vitro geïnitieerd met behulp van MS medium waaraan enkel 0,5 mg NAA/l
werd toegevoegd. Vervolgens kan men deze planten overbrengen naar een beschermde in
vivo omgeving voor afharding.
50
4.6.3 Resultaten en bespreking
Een overzicht van het aantal geregenereerde planten per behandeling kan men terugvinden
in Tabel 23 (Bijlage 3). Men kan zien dat de nulbehandelingen duidelijk enkel diploïde
planten opleveren. Een aantal van deze planten zullen behouden worden om in vivo te
brengen. Op deze manier kan men achteraf een correcte morfologische vergelijking maken
tussen bekomen tetraploïden en de controleplanten. De planten uit behandelingen met
mitoseremmer die diploïd blijven na polyploïdisatie worden onmiddellijk verwijderd daar deze
niet langer van dienst zijn.
Tabel 17 geeft de mortaliteit per behandeling weer. Over het algemeen kan men stellen dat
de mortaliteit in een behandeling toeneemt bij stijgende concentratie mitoseremmer, dit stemt
overeen met wat Leus et al. (2011) beschrijven.
Tabel 17: Overzicht van de mortaliteit per behandeling (ORY= oryzaline, TRI=
trifluraline)
Chronisch
Behandeling (aantal weken.mitoseremmer)
Concentratie 6.ORY
(µM)
8.ORY
10.ORY
6.TRI
8.TRI
10.TRI
0
0,0
5,6
5,6
0,0
8,3
0,0
1
10,0
0,0
6,7
0,0
3,3
4,2
5
20,8
33,3
30,0
0,0
0,0
8,3
10
5,6
33,3
60,0
3,3
26,7
23,3
Acuut
Behandeling (aantal dagen.mitoseremmer)
Concentratie 2.ORY
(µM)
3.ORY
4.ORY
2.TRI
3.TRI
4.TRI
0
5,6
0,0
0,0
0,0
0,0
16,7
50
0,0
0,0
20,0
0,0
4,2
0,0
150
3,3
0,0
50,0
3,3
16,7
12,5
250
0,0
0,0
83,3
0,0
10,0
16,7
Een hogere concentratie actieve mitoseremmer in het medium benadert in sommige nodiën
een letale dosis voor de cellen, de celdeling wordt hierdoor te sterk verstoord waardoor het
axillaire meristeem niet kan groeien. Naast het aspect van celdeling te verstoren hebben
dinitroanilinen, zoals oryzaline en trifluraline, ook een inhiberende werking op fotosynthese
en respiratieprocessen (Moreland, Farmer, & Hussey, 1972). De combinatie van beide
verstorende functies maakt het voor axillaire meristemen vaak moeilijk een te hoge
concentratie te overleven. Ook tussen de acute en chronische blootstelling is een verschil
aan te treffen. De acute behandeling resulteert bij de hoogste dosis van toepassing (250µM)
in systematisch minder sterfte van de nodiën dan bij de chronische behandeling. Een
mogelijke verklaring hiervoor is dat de nodiën in een chronische behandeling het verstorende
effect op groei en ontwikkeling blijven ondervinden desondanks de lagere concentratie die
aanwezig is in het groeimedium.
51
Het is immers enkel nodig om celdeling in het axillaire meristeem te verstoren in een
bepaalde periode waardoor een tetraploïde scheut wordt geregenereerd. Ook visueel werd
kan men dit verstoord groeiritme beamen, geregenereerde plantjes van de chronische
behandeling vormen over het algemeen vaker callus. Walker et al. (1979) stellen dat
callusweefsel in deze fase minder interessant is vanwege de geringe genetische stabiliteit.
Omdat het mogelijk is dat celtypen van verschillende ploïdiegraad naast elkaar voorkomen in
een klomp callusweefsel, kunnen foutieve resultaten bekomen worden bij analyse (Bass &
Birchler, 2012) (D'hondt, 2011). Op deze manier wordt een ploïdie-chimere plant bekomen
waarbij takken van een verschillend ploïdieniveau ontstaan op het originele callusweefsel.
De mortaliteit van oryzaline is gemiddeld genomen hoger dan die van trifluraline. Figuur 11
en Figuur 12 geven een grafische voorstelling van de mortaliteit per behandeling.
6.ORY
8.ORY
10.ORY
6.TRI
8.TRI
10.TRI
Mortaliteit (%)
70,0%
60,0%
50,0%
40,0%
30,0%
20,0%
10,0%
0,0%
0
1
5
10
Concentratie (µM)
Figuur
11:
Mortaliteit
per
chronische
behandeling
weken.mitoseremmer; ORY= Oryzaline; TRI= Trifluraline)
(legende:
aantal
52
2.ORY
3.ORY
4.ORY
2.TRI
3.TRI
4.TRI
Mortaliteit (%)
90,0%
80,0%
70,0%
60,0%
50,0%
40,0%
30,0%
20,0%
10,0%
0,0%
0
50
150
250
Concentratie (µM)
Figuur 12: Mortaliteit per acute behandeling (legende: aantal dagen.mitoseremmer;
ORY= Oryzaline; TRI= Trifluraline)
In totaal werden in deze proef 1440 nodiën gebruikt voor zowel de chronische, als de acute
polyploïdisatie van Escallonia rubra met behulp van de mitoseremmers oryzaline en
trifluraline. Na de proef werden hieruit 874 planten geregenereerd waarvan 213 tetraploïd
bevonden werden door analyse met flowcytometrie. Het percentage bekomen tetraploïden
wordt per behandeling getoond in Tabel 25 en Tabel 26, terug te vinden in Bijlage 3.
53
Percentage
tetraploïden
70%
6.ORY
8.ORY
10.ORY
6.TRI
8.TRI
10.TRI
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
0
1
5
10
Concentratie(µM)
Figuur 13: Percentage tetraploïden per chronische behandeling (legende: aantal
weken.mitoseremmer; ORY= Oryzaline; TRI= Trifluraline)
Percentage
tetraploïden
2.ORY
3.ORY
4.ORY
2.TRI
3.TRI
4.TRI
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
0
50
150
250
Concentratie (µM)
Figuur 14: Percentage tetraploïden per acute behandeling
dagen.mitoseremmer; ORY= Oryzaline; TRI= Trifluraline)
(legende:
aantal
54
Het knelpunt bij het vergelijken van een aantal tetraploïde planten gewonnen per
behandeling is dat de steekproefgrootte zeer variabel is. Het is echter niet mogelijk deze
steekproefgrootte constant te houden bij alle behandelingen aangezien men werkt in een in
vitro systeem. De bekomen steekproefgrootte (aantal tetraploïden) is afhankelijk van een
aantal variabelen. In eerste instantie moeten de nodiën regenereren vanuit één enkel axillair
meristeem, zelfs bij een gewone standaard regeneratie zonder blootstelling aan een
mitoseremmer kan men de regeneratie niet constant houden. Ten tweede zal de toegepaste
mitoseremmer een extra groeiremming veroorzaken wat de regeneratie bijkomstig
bemoeilijkt.
Het gemiddelde percentage bekomen tetraploïde planten bedraagt 20% en 23% voor de
chronische en de acute behandelingen respectievelijk. Toch is de trend verschillend, in de
chronische behandelingen benadert men eerder een constante 20% tetraploïden per
behandeling. Dit in tegenstelling tot bij de acute behandelingen, gekenmerkt door een
stijgende trend: meer tetraploïden naarmate de concentratie hoger wordt. Het grootste
aandeel tetraploïden wordt bekomen uit volgende behandelingen:
Chronische behandelingen met 5µM, trifluraline scoort hierbij beter dan oryzaline;
Acute behandelingen met 250µM, beide mitoseremmers scoren hierbij evenwichtig.
Tabel 18: Verdeling tetraploïden per mitoseremmer en type behandeling
Mitoseremmer
Type behandeling
Oryzaline
41,78%
Acuut
51%
Trifluraline
58,22%
Chronisch
49%
4.6.4 Besluit
Om na te gaan welke behandelingen het meest efficiënt zijn naar polyploïdisatie toe, moet
men het aantal bekomen tetraploïden in een behandeling afwegen ten opzichte van de
mortaliteit. Hoe langer de behandelingsduur en hoe hoger de concentratie mitoseremmer,
hoe hoger de mortaliteit zal komen te liggen. Hogere concentraties aan mitoseremmer
(250µM) geven bij acute behandeling echter meer tetraploïden. Bij de chronische
behandelingen bekomt men meer tetraploïden bij matige concentratie mitoseremmer (5µM).
Over de volledige proef gezien, kan men stellen dat (Tabel 18):
Oryzaline en trifluraline in grote mate een gelijk aantal tetraploïden geven;
Acute en chronische behandelingen nagenoeg evenveel tetraploïden geven.
Voor polyploïdisatieproeven van andere genotypen kan men zich richten op chronische
behandelingen met matige dosis trifluraline of acute behandelingen met hoge dosis
trifluraline en oryzaline.
55
4.7 Morfologie van de tetraploïden (Escallonia rubra)
4.7.1 Doel
De laatste stap in het polyploïdisatieproces is een kritische evaluatie van de verkregen
tetraploïde planten.
4.7.2 Specifieke materialen en methoden
De bekomen tetraploïde planten werden overgeënt op vers medium, eenmaal deze planten
voldoende gegroeid zijn, wordt beworteling geïnitieerd. Beworteling bij Escallonia rubra vindt
plaats met behulp van MS medium waaraan enkel 0,5 mg NAA/l wordt toegevoegd
Belangrijk hierbij is dat steeds een subcultuur van de tetraploïden aangehouden wordt.
Indien de planten afsterven tijdens het afharden of door infectie met pathogenen in vivo,
beschikt men steeds over een back-up. De waarde van bekomen tetraploïden kan zeer
divers zijn. Dit kan zowel een teelttechnisch aspect zijn, zoals gewijzigde plathabitus of
winterhardheid. Anderzijds kunnen bepaalde kenmerken wijzigen of tot uiting komen
waardoor een tetraploïd genotype meer aantrekkelijk is voor de consument (Dhooghe, et al.,
2011).
Een morfologische vergelijking werd gemaakt tussen tetraploïden en controleplanten op
basis van bladlengte en -breedte (Figuur 15). Om dit te realiseren werd telkens het 5de blad
van aan te top manueel opgemeten van 41 willekeurige controleplanten en 41 willekeurig
gekozen tetraploïden. Tevens is het belangrijk te vermelden dat alle opgemeten planten
even oud zijn. Deze werden met andere woorden allemaal op dezelfde dag verspeend in
vivo, dit is belangrijk om een correcte vergelijking mogelijk te maken en verschillen in
ontwikkeling zo minimaal mogelijk te houden. Een overzicht wordt gegeven in Tabel 19.
56
4.7.3 Resultaten en bespreking
Tabel 19: Morfologische vergelijking op basis van bladlengte en -breedte (gemiddelde
waarden ± standaardafwijking)
Diploïde controle
Tetraploïden
Gemiddelde bladlengte (cm)
4,21 ± 0,34
4,86 ± 0,41
bladbreedte 1,45 ±0,15
2,24 ± 0,17
Gemiddelde lengte / breedte 2,92 ± 0,24
verhouding
2,17 ± 0,14
Gemiddelde
(cm)
De bekomen tetraploïden hebben een significant langer en breder blad dan hun diploïde
controle (Mann-Whitney U test, p=0,05). De verbreding van het blad is echter meer
uitgesproken dan de toename in lengte, dit uit zich in de bekomen lengtebreedte verhouding
van de tetraploïde planten. Deze is namelijk significant kleiner dan de lengtebreedte
verhouding van diploïden (Welch test, p=0,05).
4.7.4 Besluit
Men kan dus stellen dat tetraploïde individuen van Escallonia rubra verschillen van diploïde
individuen inzake bladmorfologie. Verdere groei en ontwikkeling is nodig om verdere
opvolging en vergelijking van de tetraploïden mogelijk te maken.
Volgende vergelijkingen kunnen pas doorgaan zodra de planten volgroeid zijn en op het veld
gebracht worden. Volgende zaken kunnen in de toekomst vergeleken worden:
Planthabitus: graad van vertakking, groeiwijze (opgaand versus plagiotroop) en dikte
van de bladeren;
Bloeikenmerken: verschil in vroegheid, kleur, bloeiwijze en bloemmorfologie (steriel
versus fertiel);
Winterhardheid en vorsttolerantie.
Figuur 15: Verschil in bladmorfologie (links: vergelijking van het blad; rechts: volledig
tetraploïde plant)
57
5 Algemeen besluit
In de klassieke plantenveredeling tracht men met behulp van gerichte kruisingen nieuwe
diversiteit in bestaande cultivars te brengen. Daaropvolgende selectie, aangepast aan het
type gewas, kan na een aanzienlijk aantal jaren leiden tot nieuwe cultivars. Het gebruik van
alternatieve technieken, zoals ploïdieveredeling, welke hetzelfde doel voor ogen hebben,
doch de veredelingsprocedure kunnen inkorten worden tegenwoordig meer en meer gebruikt
(Acquaah, 2009). In deze thesis werd de in vitro ploïdieveredeling van Escallonia rubra
behandeld. Deze plantensoort biedt interessante mogelijkheden op de Belgische markt
binnen het segment van de containerplanten maar is wegens de gebrekkige winterhardheid
weinig in trek. Polyploïde planten worden vaak aangetroffen in landbouw en sierteelt omdat
zij vaak agronomisch voordelige eigenschappen bezitten in tegenstelling tot hun diploïde
tegenhangers (Adams & Wendel, 2005). Een aantal van deze eigenschappen zijn: dikker en
grotere bladeren, gewijzigde planthabitus (compactere groei), gewijzigde pigmentatie van
bladeren of bloemen en hogere tolerantie ten opzichte van abiotische stress (Kehr, 1996).
Specifiek voor sierteeltgewassen is gewijzigde bloemkleur en bloembouw zeer interessant
(Kermani et al., 2003).
Bij in vitro polyploïdisatie kan men een zeer groot aantal explantaten tegelijk onderwerpen
aan verschillende behandelingen. Men kan verschillen bestuderen in aard en duur van de
behandeling en dit op veel kleinere oppervlakte. Voordat men tot de veredeling kan komen,
dient het genotype in vitro geïnitieerd worden. Deze thesis beschrijft de in vitro
scheutinductie van Escallonia rubra op Murashige&Skoog (MS) medium aangevuld met
benzyladenine (BA) en 1-naftylazijnzuur (NAA) waarbij vertrokken wordt axillaire
meristemen. Daarnaast is thidiazuron (TDZ) in combinatie met indol-3-boterzuur (IBA)
geschikt voor regeneratie van volwaardige planten uit callusweefsel.
Tetraploïde
individuen
van
Escallonia
rubra
werden
bekomen
door
een
chromosoomverdubbeling na een in vitro behandeling met oryzaline of trifluraline. Zowel
acute als chronische behandelingen blijken efficiënt. Behandeling van axillaire meristemen is
bovendien meer efficiënt dan de behandeling van in vitro bladeren. De ploïdiegraad van
geregenereerde planten werd vastgesteld worden door middel van flowcytometrie. Een
beknopte morfologische vergelijking toont aan dat tetraploïde individuen een langer en
breder blad bezitten dan diploïden.
58
6 Literatuurlijst
Acquaah, G. (2009). Principles of plant genetics and breeding. John Wiley & Sons.
Adams, K. L., & Wendel, J. F. (2005). Polyploidy and genome evolution in plants. Current opinion in
plant biology, 8(2) , 135-141.
Adams, K., & Wendel, J. (2005). Polyploidy and genome evolution in plants. Current Opinion in Plant
Biology , 135-141.
Adiwilaga, K. D., & Brown, C. R. (1991). Use of 2n pollen-producing triploid hybrids to introduce
tetraploid Mexican wild species germ plasm to cultivated tetraploid potato gene pool. heoretical and
applied genetics, 81(5) , 645-652.
Ahmad, N., Faisal, M., Anis, M., & Aref, L. (2010). In vitro callus induction and plant regeneration
from leaf explants of Ruta graveolens. South African journal of Botany , 597-600.
Aleza, P., Juárez, J., Ollitrault, P., & Navarro, L. (2009). Production of tetraploid plants of non
apomictic citrus genotypes. Plant cell reports, 28(12) , 1837-1846.
Angiosperm phylogeny website. (sd). Opgeroepen op februari 11, 2015, van
http://www.mobot.org/MOBOT/research/APweb/
Atanassov, A., & Brown, D. (1984). Plant regeneration from suspension culture and mesophyll
protoplasts of Medicago sativa L. Plant Cell Tissue Orgn Culture , 149-162.
Avila, A., S.M., P., & Arguello, J. (1998). Nitrogen concentration and proportion of ammonium
nitrogent affect potato cultivar response in solid and liquid media. Horticultural Science , 336-338.
Barwale, U., Kerns, H., & Widholm, J. (1986). Plant regeneration from callus of several soybean
genotypes via embryogenesis and organogenesis. Planta , 473-481.
Barz, W. (1977). Catabolism of endogenous and exogenous compouds by plant cell cultures. In W.
Barz, E. Reinhard, & M. Zenk, Plant Tissue Culture and its Biotechnological Application (pp. 153-171).
Berlijn: Springer-Verlag.
Bass, H., & Birchler, J. (2012). Plant Cytogenetics. Springer.
Bean, W. (1919). Trees and shrubs hardy, in the british isles (eith edition, volume D-M). 50 Albemarle
street, London: The Royal Horticultural Society.
Beatty, R. A., & Fischberg, M. (1951). Heteroploidy in mammals. Animal Breeding Abstracts , 283.
Beck, S. L., Dunlop, R. W., & Fossey, A. (2003). Stomatal length and frequency as a measure of ploidy
level in black wattle, Acacia mearnsii. Botanical Journal of the Linnean Society, 141(2) , 177-181.
Bhojwani, S., & Razdan, M. (1983). Plant Tissue Culture: Theory and practice. Amsterdam, Nederland:
Elsevier Science Publishers B.V.
59
Bicknell, R., Borst, N., & Koltunow, A. (2000). Monogenic inheritance of apomixis in two Hieracium
species with distinct developmental mechanisms. Heredity, 84(2) , 228-237.
Birchler, J. (2013). Aneuploidy in plants and flies: The origin of studies of genomic imbalance.
Seminars in Cell & Developmental Biology 24(4) , 315– 319.
Birchler, J., Riddle, N., Auger, D., & Veitia, R. (2005). Dosage balance in gene regulation: biological
implications. Trends Genet. 21 , 219–226.
Blakeslee, A. F., & Avery, A. G. (1937). Methods of inducing doubling of chromosomes in plants by
treatment with colchicine. Journal of Heredity, 28(12) , 393-411.
Bonner, J. (1938). Thiamin (vitamin B1) and the growth of roots; the relation of chemical structure to
physiological activity. American Journal of Botany , 543-549.
Bouman, H., & Tiekstra, A. (2005). Adaptations of the mineral composition of tissue culture media on
the basis of plant elemental analysis and composition of hydroponic substrates. In A. Hvoslef-Eide, &
W. Preil, Lquid Culture Systems for in vitro Plant Propagation (pp. 493-505). Dordrecht: Springer.
Brinkley, B. R. (1985). Microtubule organizing centers. Annual review of cell biology, 1(1) , 145-172.
Brodsky, W. Y., & Uryvaeva, I. V. (1978). Cell Polyploidy: Its Relation to. International review of
cytology, 50 , 275.
Brown, S., D.F., W., & Dougall, D. (1976). The potassium requirement for growth and embryogenesis
in wild carrot suspension cultures. Plant Physiology , 73-79.
Brunsting, A., & Mullaney, P. F. (1994). Differential light scattering from mammalian cells. Biophys. J. ,
439-453.
Caraco, Y., Putterman, C., Rahamimov, R., & Ben-Chetrit, E. (1992). Acute colchicine intoxication-possible role of erythromycin administration. The Journal of rheumatology, 19(3) , 494-496.
Cathey, H. M. (1990). USDA plant hardiness zone map. United States Department of Agriculture.
Chapman, C., & Kimber, G. (1992). Developments in the meiotic analysis of hybrids: I & II. Heredity 68
, 97–103.
Chase, M., & Reveal, J. (2009). A phylogenetic classification of the land plants to accompany APG III.
Botanical Journal of the Linnean Society , 122-127.
Chauvin, J. E., Label, A., & Kermarrec, M. P. (2005). In vitro chromosome-doubling in tulip (Tulipa
gesneriana L.). Journal of horticultural science & biotechnology, 80(6) , 693-698.
Chen, Z. (2007). Genetic and epigenetic mechanisms for gene expression and phenotypic variation in
plant polyploids. Annual Review of Plant Biology 58 , 377-406.
Chen, Z. J. (2010). Molecular mechanisms of polyploidy and hybrid vigor. Trends in plant science,
15(2) , 57-71.
60
Chester, M., Gallagher, J., Symonds, V., da Silva, A., Mavrodiev, E., Leitch, A., et al. (2012). Extensive
chromosomal variation in a recently formed natural allopolyploid species, Tragopogon miscellus
(Asteraceae). Proceedings of the National Academy of Sciences , 1176-1181.
Comai, L. (2000). genetic and epigenetic interactions in allopolyploid plants. Plant Molecular Biology
43 , 387-399.
Comai, L. (2005). The advantages and disadvantages of being polyploid. Nature Reviews Genetics,
6(11) , 836-846.
Conda. Pronadisa's PTC agar technical data sheet. Quezon City, Fillipijnen.
Crosland-Taylor, P. J. (1953). A device for counting small particles suspended in a fluid through a
tube. Nature 171 , 37-38.
Davies, P. (1995). Plant Hormones. Pysiology, Biochemistry and Molecular Biology. Dordrecht,
Nederland: Kluwer Academic Publishers.
de Mitchell, I., Lambert, T., Burden, M., Sunderland, R., Porter, R., & Carlton, J. (1995). Is polyploidy
an important genotoxic lesion? Mutagenesis, 10(2) , 79-83.
Debergh, P. (1983). Effects of agar brand and concentration on the tissue culture medium.
Physiologia Plantarum , 270-276.
Debergh, P., & Maene, L. (1981). A scheme for commercial propagation of ornamental plants by
tissue culture. Scientia Horticulturae , 335-345.
Dent, D., Elliott, N., Farell, J., Gutierrez, A., van Lenteren, J., Walton, M., et al. (1995). Integrated Pest
Management. Londen, VK: Chapmann & Hall.
Depicker, A., & Van Montagu, M. (1997). Post-transcriptional gene silencing in plants. Current
Opinion in Cell Biology, 9(3) , 373–382.
d'Erfurth, I., Jolivet, S., Froger, N., Catrice, O., Novatchkova, M., & Mercier, R. (2009). Turning meiosis
into mitosis. PLoS biology, 7(6) , e1000124.
Dewey, D. R. (1980). Some applications and misapplications of induced polyploidy to plant breeding.
Polyploidy (pp. 445-470) Springer US , 445-470.
Dexter, S. T. (1956). The evaluation of crop plants for winter hardiness. Advances in agronomy, 8 ,
203-239.
D'hondt, L. (2011). Flow cytometry in plant pathology: a case study on Pseudomonas cichorii.
Universiteit Gent.
Dhooghe, E., Van Laere, K., Eeckhaut, T., Leus, L., & Van Huylenbroeck, J. (2011). Mitotic
chromosome doubling of plant tissues in vitro. Plant Cell Tissue Organ Culture 104 , 259-273.
Di Castri, F., & Hajek, E. R. (1976). Bioclimatología de Chile. Santiago: Vicerrectoría Académica de la
Universidad Católica de Chile.
61
Doebley, J. (1993). Genetics, development and plant evolution. Current opinion in genetics &
development , 865-872.
Dolezel, J., Dolezelova, M., & Novak, F. (1994). Flow cytometric estimation of nuclear DNA amount in
diploïd bananas (Musa acuminata and M. balbisiana). Biologia Plantarum 36 , 351-357.
Dolezel, J., Greilhuber, J., Lucretti, S., Meister, A., Lysak, M., Nardi, L., et al. (1998). Plant genome size
estimation by flow cytometry: Inter-laboratory comparison. Annals Botany 82 (Suppl.A) , 17-26.
Dougall, D., & Verma, D. (1978). Growth and embryo formation in wild carrot suspension cultures
with ammonium ion as a sole nitrogen source. In Vitro , 180-182.
Eeckhaut, T. G., Werbrouck, S. P., Leus, L. W., Van Bockstaele, E. J., & Debergh, P. C. (2004).
Chemically induced polyploidization in Spathiphyllum wallisii Regel through somatic embryogenesis.
Plant cell, tissue and organ culture, 78(3) , 241-246.
Epstein, E. (1971). Mineral Nutrition of Plants, Principles and Perspectives. Toronto: John Wiley and
sons, Inc.
Escalloniaceae - The Plant List. (sd). Opgeroepen op Oktober 26, 2014, van
http://www.theplantlist.org/1.1/browse/A/Escalloniaceae/
Freeling, M. (1985). Plant genetics. New York (N.Y.): Liss.
Galbraith, D., Harkins, K., Maddox, J., Ayres, N., Sharma, D., & Firoozabady, E. (1983). Rapid flow
cytometric analysis of the cell-cycle in intact plant-tissues. Science 220 , 1049-1051.
Gamborg, O., & Phillips, G. (1995). Media preparation and handling. Berlijn: Springer Berlin
Heidelberg.
Gamborg, O., & Shyluk, J. (1981). Nutrition, media and characteristics of plant cell and tissue cultures.
In T. Thorpe, Plant Tissue Culture: Methods and Applications in Agriculture (pp. 21-44). New York:
Academic Press.
Gamborg, O., & Shyluk, J. (1970). the culture of plant cells with ammonium salts as a sole nitrogent
source. Plant Physiology , 598-600.
Gaspar, T., Franck, T., Bisbis, B., Kevers, C., Jouve, L., Hausman, J., et al. (2002). Concepts in plant
stress physiology. Application to plant tissue cultures. Plant Growth Regulation , 263-285.
George, E., Hall, M., & De Klerk, G. (2008). Plant Propagation by Tissue Culture 3rd Edition. P.O. Box
17, 3300 AA Dordrecht, The Netherlands: Springer.
Gledhill, D. (2008). The names of plants (fourth edition). Cambridge: Cambridge University Press.
Götz, F. (2008). Structure and Function of DNA. Biotechnology Set, Second Edition , 190-231.
Greilhuber, J., Temsch, E., & Loureiro, J. (2007). Nuclear DNA content measurement. In J. G. Doležel,
& J. Suda, Flow cytometry with plant cells (pp. 67-101). Weinheim: Wiley-VCH.
62
Grimanelli, D., Leblanc, O., Perotti, E., & Grossniklaus, U. (2001). Developmental genetics of
gametophytic apomixis. Trends in Genetics, 17(10) , 597-604.
Gu, X. F., Yang, A. F., Meng, H., & Zhang, J. R. (2005). In vitro induction of tetraploid plants from
diploid Zizyphus jujuba Mill. cv. Zhanhua. Plant cell reports, 24(11) , 671-676.
Haesaert, G. (2014). Fytofarmacie en toxicologie. Gent: Universiteit Gent.
Hall, R. (2000). Plant cell culture initiation: practical tips. Molecular biotechnology , 161-173.
Hamill, S. D., Smith, M. K., & Dodd, W. A. (1992). In vitro induction of banana autotetraploids by
colchicine treatment of micropropagated diploids. 887-896: Australian Journal of Botany, 40(6).
Harlan, J. (1975). On Ö. Winge and a prayer: the origins of polyploidy. The botanical review, 41(4) ,
361-390.
Heller, R. (1955). Les besoins mineraux des tissus en culture. In La physiologie des cultures de tissus
végétaux (pp. 1-21). Union Internationale des Sciences Biologique.
Hoffman, M., & Revesloot, M. (1998). Winterhardheid van boomkwekerjigewassen.
Boomteeltpraktijkonderzoek , 458.
Hop, I. (2008). Vaste Planten in Nederlands openbaar groen. Wageningen, Praktijkonderzoek Plant &
Omgeving B.V.
Huetteman, C., & Preece, J. (1993). Thidiazuron: a potent cytokinin for woody plant tissue culture.
Plant Cell, Tissue and Organ Culture , Kluwer Academic Publishers.
Hunault, G. (1985). Organic acids, pH, ammonium and nitrate interactions on the growth of
Asparagus tissues cultivated in vitro. Ann. Sci. Nat. Bot. Biol. Veg. , 63-75.
Husband, B. (2004). The role of triploid hybrids in the evolutionary dynamics of mixed-ploidy
populations. Biological Journal of the Linnean Society 82 , 537–546.
III, A. (2009). An update of the Angiosperm Phylogeny Group classification for the order and families
of flowering plants: APG III. Botanical Journal of the Linnean Society , 105-121.
ITIS Standard Report Page: Escallonia rubra. (sd). Opgeroepen op Oktober 25, 2014, van Integrated
Taxonomic Information System:
http://www.itis.gov/servlet/SingleRpt/SingleRpt?search_topic=TSN&search_value=502442
Janson, J. (1993). Placental pollination in Lilium longiflorum Thunb. Plant Science 99 , 105-115.
Jensen, C. J. (1974). Chromosome doubling techniques in haploids. Haploids in higher plants:
Advances and potential , 151-190.
Johston, J., Bennett, M., Rayburn, A., Galbraith, D., & Price, H. (1999). Reference standards for
determination of DNA content of plant nuclei. American Journal of Botany 86 , 609-613.
Kadota, M., & Niimi, Y. (2002). In vitro induction of tetraploid plants from a diploid Japanese pear
cultivar (Pyrus pyrifolia N. cv. Hosui). Plant Cell Reports, 21(3) , 282-286.
63
Karami, O., Piri, K., & Bahmani, R. (2009). Plant regeneration through callus cultures derived from
immature-cotyledon explants of oleaster (Elaeagnus angustifolia L.). Trees, 23(2) , 335-338.
Kehr, A. (1996). Woody plant polyploidy. Am Nurseryman 183 , 38-47.
Kermani, M., V., S., Yokoya, K., Wenthworth, J., & Siever, V. (2003). Oryzalin-induced chromosome
doubling in Rosa and its effect on plant morphology and pollen variability. Theor Appl Genet 107 ,
1995-1200.
Knox, R. B., Gaget, M., & Dumas, C. (1987). Mentor pollen techniques. International review of
cytology, 107 , 315-332.
Köhler, C., Scheid, O. M., & Erilova, A. (2010). The impact of the triploid block on the origin and
evolution of polyploid plants. rends in Genetics, 26(3) , 142-148.
Kozai, T. (1991). Photoautotrophic micropropagation. In Vitro Cellular & Developmental Biology Plant , 47-51.
Kozlowski, T. T. (1997). Responses of woody plants to flooding and salinity. Tree physiology
monograph, 1(1) , 1-29.
Kozoi, T., Kubota, C., & Jeong, B. (1997). Environmental control for the large-scale production of
plants through in vitro techniques. Plant Cell, Tissue and Organ Culture , 49-56.
Kron, P., Suda, J., & Husband, B. (2007). Applications of flow cytometry to evolutionary and
population biology. Annu. Rev. Ecol. Evol. S. (38) , 847-876.
Krüsmann, G. (1960). Handbuch der laubgehölze. Berlijn.
Lambardi, M., Ozudogru, E., Jain, S., Gonçalves, S., Romano, A., Goh, D., et al. (2013). Protocols for
micropropagation of ornamentals and cut flowers. In Protocols for micropropagation of selected
economically-important horticultural plants (pp. 189-305). Humana Press.
Lawrence, R., & Pikaard, C. (2003). Transgene-induced RNA interference: a strategy for overcoming
gene redundancy in polyploids to generate loos-of-function mutations. The Plant Journal , 114-121.
Leus, L., Eeckhaut, T., Dhooghe, E., Van Labeke, M., Van Laere, K., & Van Huylenbroeck, J. (2011).
Polyploidy Breeding In Vitro: Experiences with Ornamentals. VII International Symposium on In Vitro
Culture and Horticultural Breeding 961 , 235-238.
Liu, B., Brubaker, C. L., Mergeai, G., Cronn, R. C., & Wendel, J. F. (2001). Polyploid formation in cotton
is not accompanied by rapid genomic changes. . Genome, 44(3) , 321-330.
Liu, G., Li, Z., & Bao, M. (2007). Colchicine-induced chromosome doubling in Platanus acerifolia and
its effect on plant morphology. Euphytica 157 , 145-154.
Lloyd, G., & McCown, B. (1980). Commercially-feasible micropropagation of mountain laurel, Kalmia
latifolia, by use of shoot-tip culture. Combined Proceedings, International Plant Propagators' Society,
Vol. 30 , 421-427.
64
Lobna, S., Taha, M., Soad, I., & Farahat, M. (2008). A micropropagation protocol of Pauwlonia
kowakamii through in vitro culture technique. Australian Journal of Basic and Applied Sciences , 594600.
Longobardi, G. (2001). Flow cytometry: first principles. New York: Wiley-Liss.
Löve, A., & Löve, D. (1943). The significance of differences in the distribution of diploids and
polyploids. Heriditas , 317-366.
Luckett, D. J. (1989). Colchicine mutagenesis is associated with substantial heritable variation in
cotton. Euphytica, 42(1-2) , 177-182.
Lynch, M., & Walsh, B. (2007). The origins of genome architecture. Sunderland: Sinauer Associates.
M., V., Thanapaisal, T., & Vajraabhaya, T. (1989). Development of salt tolerant lines of KDML and LPT
rice cultivars through tissue culture. Plant Cell Reports , 411-414.
Macey, M. (2007). Principles of Flow Cytometry. In Flow Cytopmetry principles and appications (pp.
1-17). Totowa, New Yersey: Humana Press Inc.
Maecker, H. T., Frey, T., Nomura, L. E., & Trotter, J. (2004). Selecting fluorochromes for maximum
sensitivity. Cytometry A 62 , 169-173.
Martin, S., Rose, D., & Huli, V. (1977). Growth of plant cell suspensions with ammonium as the sole
nitrogen source. Canadian Journal of Botany , 38-43.
Matsubara, S. (1980). Overcoming self-incompatibility in Raphanus sativus L. with high temperature.
Journal of the American Society for Horticultural Science, 105(6) , 842-846.
McCarthy, D. (2007). Cell Preparation. In M. Macey, Flow cytometry principles and applications (pp.
17-59). Totowa, New Jersey: Hunama Press Inc.
McCown, B. H., & Lloyd, G. (1981). Woody plant medium (WPM)-a mineral nutrient formulation for
microculture of woody plant-species. HortScience, Vol. 16, No. 3, , 453-453.
Metcalfe, C. R., & Chalk, L. (1950). Anatomy of the dicotyledons, Vols. 1 & 2. Oxford.
Minocha, R., & Jain, S. (2000). Tissue culture of woody plants and its relevance to molecular biology.
Molecular biology of woody plants , 315-339.
Moreland, D., Farmer, F., & Hussey, G. (1972). Inhibition of photosynthesis and respiration by
substituted 2, 6-dinitroaniline herbicides: II. Effects on responses in excised plant tissues and treated
seedlings. Pesticide Biochemistry and Physiology, 2(3) , 354-363.
Moura, M., Candeias, M. I., & Silva, L. (2009). In vitro propagation of Viburnum treleasei Gand., an
Azorean endemic with high ornamental interest. HortScience, 44(6) , 1668-1671.
Murashige, T. (1990). Plant propagation by tissue culture: a practice with unrealized potential. In A.
David, D. Evans, & W. Sharp, Handbook of plant cell culture. Volume 5. Ornamental species (pp. pp. 39). Calfornië, VS: Fee Press.
65
Murashige, T., & Skoog, F. (1962). Revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco
cultures. Physiologia Plantarum, Vol. 15 , 473-479.
Naik, P., & Widholm, J. (1993). Comparison of tissue culture and whole plant responses to salinity in
potato. Plant Cell, Tissue and Organ Culture , 273-280.
Nas, M., & Read, P. (2004). A hypothesis for the development of a defined medium of higher plants
and micropropagation of hazelnuts. Horticultural Science , 189-200.
Neumann, K., Kumar, A., & Imani, J. (2009). Plant Cell and Tissue Culture - A Tool in Biotechnology.
Giessen, Duitsland: Springer-Verlag Berlin Heidelberg.
Nickell, L., & Maretzki, A. (1970). The utilization of sugars and starch as carbon sources by sugarcane
cell suspension cultures. Plant & Cell Physiology , 183-185.
Nontaswatsri, C., & Fukai, S. (2005). Regenerative callus of Dianthus ‘Telstar Scarlet’showing
mixoploidy produce diploid plants. Plant cell, tissue and organ culture, 83(3) , 351-355.
Ockendon, D. J. (1978). Effect of hexane and humidity on self-incompatibility in Brassica oleracea.
Theoretical and Applied Genetics, 52(3) , 113-117.
Otto, S., & Whitton, J. (2000). Polyploid incidence and evolution. Annual review of genetics, 34(1) ,
401-437.
Ozias-Akins, P., & van Dijk, P. J. (2007). Mendelian genetics of apomixis in plants. Annu. Rev. Genet.,
41 , 509-537.
Paek, K. Y., & Yeung, E. C. (1991). The effects of 1-naphthaleneacetic acid and N6-benzyladenine on
the growth of Cymbidium forrestii rhizomes in vitro. Plant cell, tissue and organ culture, 24(2) , 65-71.
Pandey, K. (1979). Overcoming incompatibility and promoting genetic recombination in flowering
plants. New Zealandlournal of Botany, Vol. 17 , 645-663.
Parisod, C., Holderegger, R., & Brochmann, C. (2010). Evolutionary consequences of autopolyploidy.
New Phytologist , 5-17.
Paun, O., Fay, M. F., Soltis, D. E., & Chase, M. W. (2007). Genetic and epigenetic alterations after
hybridization and genome doubling. Taxon, 56(3) , 649.
Pearce, R. S. (2001). Plant freezing and damage. Annuals of Botany, 87(4) , 417-424.
Pei, X. (1985). Polyploidy induction and breeding. Shangai Science and Technology Press , 95-98.
Petersen, K., Hagberg, P., & Kristiansen, K. (2003). Colchicine and oryzalin mediated chromosome
doubling in different genotypes of Miscanthus sinensis. Plant Cell Tissue Organ Culture 73 , 137-146.
Phillips, R., Kaeppler, S., & Olhoft, P. (1994). Genetic instability of plant tissue cultures: Breakdown of
normal controls. Proceedings of the Academy of Sciences , 5222-5226.
Pierik, R. (1987). In Vitro Culture of Higher Plants. Wageningen, Nederland: Kluwer Academic
Publishers.
66
Pierik, R. (1990). Rejuvenation and micropropagation. In H. Nijkamp, L. Plas, & J. van der Aartrijk,
Progress in plant cellular and molecular biology (pp. 91-101). Amsterdam, Nederland: Kluwer
Academic Publishers.
Pierik, R., Steegmans, H., & Van der Meys, J. (1974). Plantlet formation in callus tissues of Anthurium
andaeanum. Scientia Horticulturae , 193-198.
Polne-Fuller, M., & Gibor, A. (1987). Calluses and callus-like growth in seaweeds: Induction and
culture. Hydrobiologia , 131-138.
Promkaew, N., Soontornchainaksaeng, P., Jampatong, S., & Rojanavipart, P. (2010). Toxicity and
Genotoxicity of Pendimethalin in Maize and Onion. Kasetsart Journal (Natural Sciences)(Thailand) ,
1010-1015.
Przywara, L., Pandey, K. K., & Sanders, P. M. (1988). Length of stomata as an indicator of ploidy level
in Actinidia deliciosa. New Zealand journal of botany, 26(2) , 179-182.
Raghavan, V. (1986). Experimental embryology of vascular plants. Londen: Academic Press.
Ramsey, J., & Schemske, D. (1998). Pathways, mechanisms, and rates of polyploid formation in
flowering plants. Annual Review of Ecology and Systematics , 467-501.
Rendle, A. (1938). The Classification of Flowering Plants II Dicotyledons. Cambridge: Cambridge
University Press.
Riccardi, C., & Nicoletti, I. (2006). Analysis of apoptosis by propidium iodide staining and flow
cytometry. Nature protocols, 1(3) , 1458-1461.
Ries, S., Wert, V., Sweeley, C., & Leavitt, R. (1977). Triacontanol: a nex naturally occurring plant
growth regulator. Science , 1339-1341.
Rubulusa, T., Nikolova, R., Smith, M., & Hannweg, K. (2007). In vitro induction of tetraploids in
Colophospermum mopane by colchicine. South African Journal of Botany 73 , 259-261.
Schutte, B., Reynders, M. M., Bosman, F. T., & Blijham, G. H. (1985). Flow cytometric determination
of DNA ploidy level in nuclei isolated from paraffin‐embedded tissue. Cytometry, 6(1) , 26-30.
Sede, S., Dürnhöffer, S., Morello, S., & Zapata, F. (2013). Phylogenetics of Escallonia (Escalloniaceae)
based on plastid DNA sequence data. Botanical Journal of the Linnean Society , 442-451.
Segraves, K. A., & Thompson, J. N. (1999). Plant polyploidy and pollination: floral traits and insect
visits to diploid and tetraploid Heuchera grossulariifolia. Evolution , 1114-1127.
Shibli, R. A., Shatnawi, M. A., & Swaidat, I. Q. (2003). Growth, osmotic adjustment, and nutrient
acquisition of bitter almond under induced sodium chloride salinity in vitro. Communications in soil
science and plant analysis, 34(13-14) , 1969-1979.
Siddique, I., & Anis, M. (2009). Direct plant regeneration from nodal explants of Balanites aegyptiaca
L.: a valuable medicinal tree. New Forests , 53-62.
Smith, R. (2000). Plant tissue culture: techniques and experiments. San Diego, VS: Academic Press.
67
Soltis, D. E., & Soltis, P. S. (1990). Chloroplast DNA and nuclear rDNA variation: insights into
autopolyploid and allopolyploid evolution. Biological approaches and evolutionary trends in plants ,
97-117.
Srivastava, P., Narula, A., & Srivastava, S. (2005). Plant biotechnology and molecular markers. New
Delhi, India: Kluwer Academic Publishers.
Stebbins, G. (1957). Self fertilization and population variability in the higher plants. American
Naturalist , 337-354.
Stebbins, G. (1947). Types of polyploids: Their classification and significance. Advances in Genetics ,
403-429.
Sun, Q., Sun, H., Bell, R. L., Li, H., & Xin, L. (2011). Variation of phenotype, ploidy level, and
organogenic potential of in vitro regenerated polyploids of Pyrus communis. Plant Cell, Tissue and
Organ Culture (PCTOC), 107(1) , 131-140.
Takamura, T., & Miyajima, I. (1996). Colchicine induced tetraploids in yellow-flowered cyclamens and
their characteristics. Scientia Horticulturae, 65(4) , 305-312.
Takamura, T., & Miyajima, I. (1996). Colchicine induced tetraploids in yellow-flowered cyclamens and
their characteristics. Scientia Horticulturae 65 , 305-312.
Takamura, T., Lim, K. B., & Van Tuyl, J. M. (2001). Effect of a new compound on the mitotic
polyploidization of Lilium longiflorum and oriental hybrid lilies. nternational Eucarpia Symposium,
Section Ornamentals, Strategies for New Ornamentals-Part II 572 , 37-42.
Takayama, S., & Isogai, A. (2005). Self-incompatibility in plants. Annual Review of Plant Biology , 467489.
Tantos, A., Meszaros, A., Farkas, T., Szalai, J., & Horvath, G. (2001). Triacontanol-supported
micropropagation of woody plants. Cell Biology and Morphogenesis , 16-21.
Thies, K., & Graves, C. (1992). Meristem micropropagation protocols for Vitis rodundifolia 'Michx.'.
HortScience 27(5) , 447-449.
Thomas, H. (1993). Chromosome manipulation and polyploidy. Plant Breeding , 79-92.
Thomas, J., & Katterman, F. (1986). Cytokinin activity induced by thidiazuron. Plant Physiology , 681683.
Thompson, M., Douglas, T.-S. H., & Thorpe, T. (1986). Mannitol metabolism in cultured plant cells.
Physiologia Pantarum , 365-369.
Udall, J. A., Quijada, P. A., & Osborn, T. C. (2005). Detection of chromosomal rearrangements derived
from homeologous recombination in four mapping populations of Brassica napus L. Genetics, 169(2) ,
967-979.
USDA Plant Hardiness Zone Map. (sd). Opgeroepen op Februari 11, 2015, van
http://planthardiness.ars.usda.gov/PHZMWeb/
68
Väinölä, A. (2000). Polyploidization and early screening of Rhododendron hybrids. Euphytica, 112(3) ,
239-244.
Van Duren, M., Morpurgo, R., Dolezel, J., & Afza, R. (1996). Induction and verification of
autotetraploids in diploid banana (Musa acuminata) by in vitro techniques. Euphytica, 88(1) , 25-34.
Van Laere, K. (2008). Interspecific hybridisation in woody ornamentals. Gent: Ghent University.
Van Tuyl, J. M., & De Jeu, M. J. (1997). Methods for overcoming interspecific crossing barriers. Pollen
biotechnology for crop production and improvement. Cambridge Univ. Press, NY , 273-292.
van Tuyl, J. M., & Lim, K. B. (2003). Interspecific hybridisation and polyploidisation as tools in
ornamental plant breeding. XXI International Eucarpia Symposium on Classical versus Molecular
Breeding of Ornamentals-Part I 612 , 13-22.
van Tuyl, J. M., & Stekelenburg, P. (1989). Genotypic and environmental variation in production of
2n-gametes in Lilium. Sexual Reproduction in Higher Plants , 486-486.
van Tuyl, J., de Vries, J., Bino, R., & Kwakkenbos, T. (1989). Identification of 2n-Pollen Producing
Interspecific Hybrids of Lilium Using Flow Cytometry. Cytologia 54 , 737-745.
Vanderhoeven, S., & Branquart, E. (2010). Het HARMONIA Informatiesysteem en het ISEIA Protocol.
Belgisch Biodiversiteits Platforum.
Veilleux, R. (1985). Diploid and polyploid gametes in crop plants: mechanisms of formation and
utilization in plant breeding. Plant Breeding Reviews, Volume 3 , 253-288.
Walker, K., Wendeln, M., & Jaworski, E. (1979). Organogenesis in callus tissue of Medicago sativa.
The temporal seperation of induction process from differentiation process. Plant Science Letteers ,
23-30.
Watson, J. V. (1999). The early fluidic and optical physics of cytometry. Cytometry 38 , 2-14.
Wiesenfeld, P. L., Garthoff, L. H., Sobotka, T. J., Suagee, J. K., & Barton, C. N. (2007). Acute oral
toxicity of colchicine in rats: effects of gender, vehicle matrix and pre‐exposure to lipopolysaccharide.
Journal of Applied Toxicology, 27(5) , 421-433.
Wolters-Arts, M., Mary-Lush, W., & Mariani, C. (1988). Lipids are required for directional. Nature 392
, 818–821.
Wu, J. H., & Mooney, P. (2002). Autotetraploid tangor plant regeneration from in vitro Citrus somatic
embryogenic callus treated with colchicine. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 70(1) , 99-104.
Zawierta, M., Biecek, P., Waga, W., & Cebrat, S. (2007). The role of intragenomic recombination rate
in the evolution of population's genetic pool. Theory in Biosciences 125 , 123-132.
Zhang, Q., Luo, F., Liu, L., & Guo, F. (2010). In vitro induction of tetraploids in crape myrtle
(Lagerstroemia indica L.). lant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), 101(1) , 41-47.
Zhao, C., Deng, X., Shan, L., Steudle, E., Zhang, S. Q., & Ye, Q. (2005). Changes in Root Hydraulic
Conductivity During Wheat Evolution. Journal of Integrative Plant Biology, 47 (3) , 302-310.
69
Zielinski, Q. (1955). Escallonia: The genus and its chromosomes. Botanical Gazette , 166-172.
Zimmering, S. (1955). A genetic study of segregation in a translocation heterozygote in Drosophila.
Genetics , 809.
70
Bijlage 1: Meetresultaten
genoomgrootte
bepaling
van
de
Tabel 20: Overzicht piekposities per genotype op FL4 (interne standaard: T = tomaat;
M = maïs; S = soja)(ES = Escallonia; IS = interne standaard)
Genotype + Meting 1
Meting 2
Meting 3
interne
standaard
Piek ES
Piek IS
Piek ES
Piek IS
Piek ES
Piek IS
ES1 + T
77
126
87
146
93
149
ES2 + T
126
199
118
179
132
207
ES3 + T
87
163
140
250
126
232
ES4 + T
108
193
117
202
136
245
ES5 + T
121
208
115
166
129
231
ES6 + T
104
190
126
222
125
247
ES7 + S
138
234
146
254
106
179
ES8 + T
118
161
128
173
143
196
ES9 + T
83
135
43
68
116
185
ES10 + M
93
235
104
279
125
289
ES12 + T
78
128
86
151
90
156
ES14 + T
92
168
123
212
128
230
ES15 + T
103
175
126
219
134
244
ES16 + T
118
209
113
204
120
228
ES17 + T
84
130
126
207
155
223
ES18 + T
109
190
116
205
116
200
ES19 + T
95
170
110
199
118
202
ES20 + T
101
181
92
174
119
222
ES21 + T
92
172
107
200
117
218
ES22 + T
105
174
104
184
120
208
ES23 + T
84
142
95
153
93
150
1
Tabel 21: Overzicht piekposities per genotype op FL3 (interne standaard: T = tomaat;
M = maïs; S = soja)(ES = Escallonia; IS = interne standaard)
Genotype + Meting 1
Meting 2
Meting 3
interne
standaard
Piek ES
Piek IS
Piek ES
Piek IS
Piek ES
Piek IS
ES1 + T
55
90
41
69
54
93
ES2 + T
87
130
68
103
80
129
ES3 + T
62
111
74
142
68
139
ES4 + T
73
125
69
116
81
156
ES5 + T
77
135
62
96
78
127
ES6 + T
68
124
71
128
74
142
ES7 + S
96
157
87
155
64
102
ES8 + T
78
105
127
179
85
119
ES9 + T
55
88
86
137
71
109
ES10 + M
113
303
91
263
115
276
ES12 + T
53
85
90
160
53
93
ES14 + T
61
107
74
125
75
138
ES15 + T
66
112
78
133
80
149
ES16 + T
78
137
64
122
73
135
ES17 + T
82
132
73
107
91
138
ES18 + T
106
181
49
86
107
188
ES19 + T
64
108
60
118
69
123
ES20 + T
66
118
52
107
69
131
ES21 + T
62
112
63
125
67
128
ES22 + T
67
113
58
106
70
127
ES23 + T
36
62
38
64
88
147
2
Bijlage 2: Aantal gevormde
regeneratie: Escallonia rubra
scheuten
na
Tabel 22: Aantal gevormde scheuten na regeneratie van bladschijfexplantaten
Voorbehandeling
Aantal gevormde scheuten (9 weken na
Plantnummer
initiatie
TDZ (µM)
IBA (µM)
1
5
0,5
6
2
5
0,5
5
3
5
0,5
8
4
5
0,5
4
5
5
0,5
5
6
5
0,5
7
7
5
0,5
9
8
5
0,5
7
9
5
0,5
10
10
5
0,5
4
11
5
0,5
6
12
5
0,5
8
13
5
0,5
9
14
1
1
1
15
1
1
4
16
1
1
2
17
1
1
3
18
1
1
2
19
1
1
3
20
1
1
5
21
1
1
3
22
5
1
10
23
5
1
9
24
5
1
5
25
5
1
8
26
5
1
9
27
5
1
12
28
5
1
8
29
5
1
6
30
5
1
9
31
5
1
11
32
5
1
3
1
33
5
1
8
34
5
1
9
35
5
1
6
36
5
1
8
37
5
1
9
38
5
1
10
39
5
1
7
40
5
1
14
41
5
1
6
2
Bijlage 3: Resultaten Escallonia rubra
Tabel 23: Overzicht aantal geregenereerde planten per behandeling polyploïdisatie
Escallonia rubra (mixoploïden worden niet weergegeven)
Acuut
Aantal dagen
Mitoseremmer Concentratie Aantal
Aantal
(µM)
diploïd tetraploïd
2
Oryzaline
0
15
0
2
Oryzaline
50
27
1
2
Oryzaline
150
6
9
2
Oryzaline
250
3
16
3
Oryzaline
0
9
0
3
Oryzaline
50
16
1
3
Oryzaline
150
12
10
3
Oryzaline
250
5
15
4
Oryzaline
0
18
0
4
Oryzaline
50
5
1
4
Oryzaline
150
8
1
4
Oryzaline
250
1
2
2
Trifluraline
0
17
0
2
Trifluraline
50
15
6
2
Trifluraline
150
8
6
2
Trifluraline
250
1
5
3
Trifluraline
0
3
3
3
Trifluraline
50
8
4
3
Trifluraline
150
3
2
3
Trifluraline
250
6
4
4
Trifluraline
0
6
1
4
Trifluraline
50
11
14
4
Trifluraline
150
9
4
4
Trifluraline
250
10
8
Chronisch
Aantal weken
Mitoseremmer Concentratie Aantal
Aantal
(µM)
diploïd tetraploïd
6
Oryzaline
0
18
0
6
Oryzaline
1
10
10
6
Oryzaline
5
4
1
6
Oryzaline
10
5
2
8
Oryzaline
0
14
0
1
8
Oryzaline
1
13
6
8
Oryzaline
5
2
4
8
Oryzaline
10
6
1
10
Oryzaline
0
18
0
10
Oryzaline
1
12
4
10
Oryzaline
5
3
4
10
Oryzaline
10
5
1
6
Trifluraline
0
18
0
6
Trifluraline
1
17
8
6
Trifluraline
5
3
16
6
Trifluraline
10
4
11
8
Trifluraline
0
12
0
8
Trifluraline
1
25
0
8
Trifluraline
5
6
7
8
Trifluraline
10
2
4
10
Trifluraline
0
12
0
10
Trifluraline
1
16
1
10
Trifluraline
5
5
13
10
Trifluraline
10
0
11
Tabel 24: Overzicht mortaliteit polyploïdisatie Escallonia rubra
Acuut
Aantal
dagen
Mitoseremmer
Concentratie
(µM)
Aantal afgestorven
planten
Mortaliteit
2
Oryzaline
0
1
5,6%
2
Oryzaline
50
0
0,0%
2
Oryzaline
150
1
3,3%
2
Oryzaline
250
0
0,0%
3
Oryzaline
0
0
0,0%
3
Oryzaline
50
0
0,0%
3
Oryzaline
150
0
0,0%
3
Oryzaline
250
0
0,0%
4
Oryzaline
0
0
0,0%
4
Oryzaline
50
6
20,0%
4
Oryzaline
150
15
50,0%
4
Oryzaline
250
25
83,3%
2
Trifluraline
0
0
0,0%
2
Trifluraline
50
0
0,0%
2
Trifluraline
150
1
3,3%
2
Trifluraline
250
0
0,0%
3
Trifluraline
0
0
0,0%
2
3
Trifluraline
50
1
4,2%
3
Trifluraline
150
1
16,7%
3
Trifluraline
250
3
10,0%
4
Trifluraline
0
3
16,7%
4
Trifluraline
50
0
0,0%
4
Trifluraline
150
3
12,5%
4
Trifluraline
250
4
16,7%
Aantal
weken
Mitoseremmer
Concentratie
(µM)
Aantal afgestorven
planten
Mortaliteit
6
Oryzaline
0
0
0,0%
6
Oryzaline
1
3
10,0%
6
Oryzaline
5
5
20,8%
6
Oryzaline
10
1
5,6%
8
Oryzaline
0
1
5,6%
8
Oryzaline
1
0
0,0%
8
Oryzaline
5
8
33,3%
8
Oryzaline
10
6
33,3%
10
Oryzaline
0
1
5,6%
10
Oryzaline
1
2
6,7%
10
Oryzaline
5
9
30,0%
10
Oryzaline
10
18
60,0%
6
Trifluraline
0
0
0,0%
6
Trifluraline
1
0
0,0%
6
Trifluraline
5
0
0,0%
6
Trifluraline
10
1
3,3%
8
Trifluraline
0
1
8,3%
8
Trifluraline
1
1
3,3%
8
Trifluraline
5
0
0,0%
8
Trifluraline
10
8
26,7%
10
Trifluraline
0
0
0,0%
10
Trifluraline
1
1
4,2%
10
Trifluraline
5
2
8,3%
10
Trifluraline
10
7
23,3%
Chronisch
3
Tabel 25: Overzicht percentage verkregen polyploïden per chronische behandeling
Chronisch
Behandeling (aantal weken.mitoseremmer)
Concentratie 6.ORY
(µM)
8.ORY
10.ORY
6.TRI
8.TRI
10.TRI
0
0
0
0
0
0
0
1
43
25
17
27
0
6
5
7
29
19
55
26
62
10
14
8
8
39
33
58
Tabel 26: Overzicht percentage verkregen polyploïden per acute behandeling
Acuut
Behandeling (aantal dagen.mitoseremmer)
Concentratie 2.ORY
(µM)
3.ORY
4.ORY
2.TRI
3.TRI
4.TRI
0
0
0
0
0
0
0
50
3
5
11
26
22
47
150
35
42
11
23
33
24
250
55
58
50
83
29
35
4
