Papierelektroforese van enkele aminozuren | PDF

Papierelektroforese van enkele aminozuren
Auteur
Dick Naafs
Laatst gewijzigd
26 april 2013
Licentie
CC Naamsvermelding 3.0 Nederland licentie
Webadres
https://maken.wikiwijs.nl/43342
Dit lesmateriaal is gemaakt met Wikiwijs van Kennisnet. Wikiwijs is
hét onderwijsplatform waar je leermiddelen zoekt, maakt en deelt.
Inhoudsopgave
Bronvermelding
Inleiding
De scheiding van een mengsel van aminozuren
Chemicaliën
Voorbereidende werkzaamheden
Uitvoering
Bepaling van het iso-elektrisch punt (IEP) van aminozuren
Benodigdheden
Chemicaliën
Voorbereidende werkzaamheden
Uitvoering
Literatuur
Over dit lesmateriaal
Pagina 1
Papierelektroforese van enkele aminozuren
Bronvermelding
Instituut voor Didactiek en Onderwijsontwikkeling Faculteit Wiskunde en
Natuurwetenschappen is de beheerder van de rechten van dit arrangement.
Nijenborgh 9, 9747 AG Groningen
tel. 0503634365 / fax 0503634500
Pagina 2
Papierelektroforese van enkele aminozuren
Inleiding
Bij papierelektroforese bewegen ionen onder invloed van een potentiaalverschil door een
elektrolytoplossing die op een strook papier is aangebracht. Door elektroforese kunnen positief
geladen deeltjes, nega-tief geladen deeltjes en ongeladen deeltjes van elkaar gescheiden
worden.
Elektroforese kan o.a. toegepast worden op mengsels van aminozuren, omdat in een
oplossing een aminozuurdeeltje, bij een bepaalde zuurgraad, een lading krijgt, afhankelijk van
de in het aminozuur voorkomende karakteristieke groepen.
Zo vormt bv. alanine (2-aminopropaanzuur) bij pH = 6,1 in hoofdzaak dipolaire- of Zwitterionen:
Glutaminezuur (2-aminopentaandizuur) vormt bij pH = 6,1 negatieve deeltjes:
lysine (2,6-diaminohexaanzuur) vormt bij pH = 6,1 positieve deeltjes:
De lading van een deeltje wordt bepaald door de pKz waarden van de karakteristieke groepen
(zie hieronder).
pKz1
pKz2
pKb1
pKb2
alanine
2,34
----
9,60
-----
glutaminezuur
2,19
4,25
9,67
-----
lysine
2,18
----
8,95
10,53
In een elektrisch veld bewegen de dipolaire- of Zwitter-ionen deeltjes niet, (ze zijn netto
neutraal); als een deeltje netto negatief geladen is, gaan deze deeltjes gaan naar de + pool en
de deeltjes die netto positief geladen zijn, gaan naar de - pool. De verplaatsing van de
deeltjes kan zichtbaar gemaakt worden met een ninhydrine-oplossing.
Bij een pH van 1,6 komen de genoemde aminozu-ren alle drie voornamelijk als positief
geladen:
Pagina 3
Papierelektroforese van enkele aminozuren
De deeltjes bewegen dan allen naar de - pool. Dit gebeurt met verschillende snelheden omdat
de snel-heid van beweging afhangt van de lading, van de grootte en van de vorm van de
deeltjes.
Op deze wijze kan door elektroforese de lading van aminozuurdeeltjes aangetoond worden;
kunnen mengsels van aminozuren gescheiden worden en is eventueel het iso-elektrisch punt
van een aminozuur te bepalen.
Pagina 4
Papierelektroforese van enkele aminozuren
De scheiding van een mengsel van aminozuren
Benodigdheden
elektroforese-apparatuur
gelijkspanning 300 V
föhn
Whatman 1 - chromatografiepapier
twee roerstaafjes
pipetjes met nauwe opening
rubberhandschoenen
bekerglas
1000 mL
bekerglas
250 mL
3 bekerglazen
100 mL
4 maatcilinders
5 mL
2 maatcilinders
25 mL
2 maatcilinders
50 mL
maatcilinder
250 mL
maatcilinder
1000 mL
pH-meter
pH-elektrode
8 reageerbuizen
Chemicaliën
alanine
glutaminezuur
lysine
azijnzuur
mierezuur
natriumwaterstofcarbonaat
ninhydrine
aceton
bufferoplossing pH = 7,0
bufferoplossing pH = 4,0
bufferoplossing pH = 9,0
?
Voorbereidende werkzaamheden
- IJk de pH-elektrode
Neem een bekerglas van 100 mL en giet hier in ongeveer 20 mL van de bufferoplossing met
pH=7,0.
Stel de temperatuurcorrectie knop op de juiste temperatuur in.
Pagina 5
Papierelektroforese van enkele aminozuren
Plaats de pH-elektrode in de oplossing en stel de pH-meter op 7,0 in.
Neem een bekerglas van 100 mL en giet hier in ongeveer 20 mL van de bufferoplossing met
pH=4,0.
Plaats de pH-elektrode in de oplossing en stel de pH-meter op 4,0 in.
De pH-meter is nu geijkt voor het pH-gebied 0 - 7 .
- Maak een oplossing met pH = 6,5
Neem een bekerglas van 1 L en voeg hierin: 5 mL azijn-zuur en 850 mL gedestilleerd
water. Homogeniseer.
Plaats de geijkte pH-elektrode in de oplossing en voeg met kleine schepjes zoveel
natriumwaterstofcarbonaat toe te voegen tot pH = 6,5.
- Maak een oplossing met pH = 1,6
Neem een bekerglas van 500 mL en voeg hierin: 150 ml azijnzuur en 50 ml mierezuur.
Homogeniseer.
Plaats de geijkte pH-elektrode in deze oplossing en controleer dat de pH van deze oplossing
1,6 is.
- Maken van een aminozuuroplossing met pH = 1,6
Neem een reageerbuis en voeg hierin 0,05 g alanine en 5 mL van de oplossing met pH =
1,6.
Schud het mengsel tot het aminozuur is opgelost. Homogeniseer.
Herhaal dit voor respectievelijk glutaminezuur en lysine.
- Maken van een aminozuuroplossing met pH = 6,5
Neem een reageerbuis en voeg hierin 0,05 g alanine en 5 mL van de oplossing met pH =
6,5.
Schud het mengsel tot het aminozuur is opgelost. Homogeniseer.
Herhaal dit voor respectievelijk glutaminezuur en lysine.
- Maak een oplossing met een mengsel van aminozuren met pH = 1,6
Neem een reageerbuis en voeg hierin 0,05 g alanine, 0,05 g glutaminezuur, 0,05 gram
lysine en 5 mL van de oplossing met pH = 1,6.
Schud het mengsel tot de aminozuren zijn opgelost. Homogeniseer.
- Maak een oplossing met een mengsel van aminozuren met pH = 6,5
Neem een reageerbuis en voeg hierin 0,05 g alanine, 0,05 g glutaminezuur, 0,05 gram
lysine en 5 mL van de oplossing met pH = 6,5.
Schud het mengsel tot de aminozuren zijn opgelost. Homogeniseer.
- Maak een ninhydrine oplossing
Neem een bekerglas van 100 mL en los 0,1 g ninhydrine op in 50 mL aceton.
Uitvoering
Pagina 6
Papierelektroforese van enkele aminozuren
De elektroforese-apparatuur bestaat uit twee perspexbakjes (14 cm x 6 cm x 6 cm), bevestigd
op een grondplaat elk voorzien van een 20 cm lange platina- draad (als elektrode) met
aansluitklemmen. Als lijmmiddel kan chloroform gebruikt worden. Over de bakjes wordt een
glasplaat (22 cm x 12 cm) ge-legd. Bij gebruik moet als afscherming een plastic bak over het
geheel worden geplaatst, zie tekening hierboven.
Vul de elektroforesebakjes voor ongeveer de helft met de oplossing met pH = 6,5.
Knip stroken elektroforesepapier van 10 cm x 35 cm (het papier mag alleen met rubber
handschoenen aan worden vastgepakt!) en breng de verschillende aminozuuroplossingen
met pH = 6,5 met een pipetje in het midden van het elektroforesepapier naast elkaar aan. Stip
één keer aan, zodat een vlekje van ongeveer 3 mm diameter ontstaat, zie tekening hieronder.
A = Lysine
B = glutaminezuur
C = alanine
D = mengsel van alanine, glutaminezuur en lysine
Pagina 7
Papierelektroforese van enkele aminozuren
Droog de vlekken met de föhn; bevochtig het papier met de oplossing met pH = 6,5 door de
uiteinden in de
oplossing te drenken. De opbrengpunten mogen niet in de oplossing komen.
Leg het papier op de glas-plaat van het elektroforesebakje. De uiteinden van het
papier moeten in de oplossing hangen. Plaats de beschermkap over het elekroforeseapparaat
en sluit de gelijkspanningsbron van 300 V (4- 8 mA) aan.
Laat de elektroforese 30 minuten duren (opmerking 1).
Droog het papier dan met de föhn; haal het vervol-gens door de ninhydrine-oplossing
en droog nogmaals. Gebruik hierbij rubber handschoenen.
Herhaal het experiment met de oplossing met pH = 1,6. De elektroforesetijd is hierbij 45
minuten.
Opmerking 1.
Een geringe verplaatsing van alanine bij pH = 6,5 is een gevolg van elektro-osmose. Het water
wordt ten opzichte van het papier enigszins positief geladen en beweegt naar de - pool waarbij
het de opgeloste
stof meeneemt.
Pagina 8
Papierelektroforese van enkele aminozuren
Bepaling van het iso-elektrisch punt (IEP) van aminozuren
Het iso-elektrisch punt (IEP) van aminozuren is de pH-waarde van de oplossing waarin het
aminozuur geen verplaatsing geeft bij elektroforese.
Benodigdheden
elektroforese-apparatuur
gelijkspanning 300 V
föhn
Whatman 1 - chromatografiepapier
twee roerstaafjes
pipetjes met nauwe opening
rubberhandschoenen
bekerglas
1000 mL
bekerglas
250 mL
3 bekerglazen
100 mL
4 maatcilinders
5 mL
2 maatcilinders
25 mL
2 maatcilinders
50 mL
maatcilinder
250 mL
maatcilinder
1000 mL
pH-meter
pH-elektrode
8 reageerbuizen
Chemicaliën
alanine
glutaminezuur
lysine
ninhydrine
aceton
bufferoplossing pH = 4,0
bufferoplossing pH = 5,0
bufferoplossing pH = 6,0
bufferoplossing pH = 7,0
bufferoplossing pH = 8,0
bufferoplossing pH = 9,0
0,5 M zwavelzuuroplossing
0,1 M natronloog
Voorbereidende werkzaamheden
- IJk de pH-elektrode voor het pH-gebied 0 - 7
Pagina 9
Papierelektroforese van enkele aminozuren
Neem een bekerglas van 100 mL en giet hier in ongeveer 20 mL van de bufferoplossing met
pH=7,0.
Stel de temperatuurcorrectie knop op de juiste temperatuur in.
Plaats de pH-elektrode in de oplossing en stel de pH-meter op 7,0 in.
Neem een bekerglas van 100 mL en giet hier in ongeveer 20 mL van de bufferoplossing met
pH=4,0.
Plaats de pH-elektrode in de oplossing en stel de pH-meter op 4,0 in.
De pH-meter is nu geijkt voor het pH-gebied 0 - 7.
- Maak een oplossing met pH = 4
Neem een bekerglas van 500 mL en giet hier in ongeveer 300 mL gedestilleerd water.
Voeg 2 druppels 0,5 M zwavelzuuroplossing toe en homogeniseer.
De pH van deze oplossing zal nu 4 zijn. Controleer de pH van de oplossing met een pHmeter.
Voeg bij deze oplossing een schepje kaliumnitraat.
- Maak een oplossing met pH = 5
Neem een bekerglas van 500 mL en giet hier in ongeveer 30 mL van de oplossing met pH =
4.
Voeg een roervlo toe en plaats het bekerglas op een magnestische roerder.
Plaats de pH-elektrode in de oplossing en verdun deze oplossing met gedestilleerd water tot
pH = 5.
Voeg bij deze oplossing een schepje kaliumnitraat.
- Maak een oplossing met pH = 6
Neem een bekerglas van 500 mL en giet hier in ongeveer 30 mL van de oplossing met pH =
5.
Voeg een roervlo toe en plaats het bekerglas op een magnestische roerder.
Plaats de pH-elektrode in de oplossing en verdun deze oplossing met gedestilleerd water tot
pH = 6.
Voeg bij deze oplossing een schepje kaliumnitraat.
- IJk de pH-elektrode voor het pH-gebied 7- 14
Neem een bekerglas van 100 mL en giet hier in ongeveer 20 mL van de bufferoplossing met
pH=7,0.
Stel de temperatuurcorrectie knop op de juiste temperatuur in.
Plaats de pH-elektrode in de oplossing en stel de pH-meter op 7,0 in.
Neem een bekerglas van 100 mL en giet hier in ongeveer 20 mL van de bufferoplossing met
pH=9,0.
Plaats de pH-elektrode in de oplossing en stel de pH-meter op 9,0 in.
De pH-meter is nu geijkt voor het pH-gebied 7 - 14 .
- Maak een oplossing met pH = 7
Pagina 10
Papierelektroforese van enkele aminozuren
Neem een bekerglas van 500 mL en giet hier in ongeveer 300 mL gedestilleerd water.
Voeg een roervlo toe en plaats het bekerglas op een magnestische roerder.
Plaats de pH-elektrode in de oplossing en voeg druppelsgewijs 0,1 M natronloog toe tot dat
de pH = 7.
Voeg bij deze oplossing een schepje kaliumnitraat.
- Maak een oplossing met pH = 8
Neem een bekerglas van 500 mL en giet hier in ongeveer 300 mL gedestilleerd water.
Voeg een roervlo toe en plaats het bekerglas op een magnestische roerder.
Plaats de pH-elektrode in de oplossing en voeg druppelsgewijs 0,1 M natronloog toe tot dat
de pH = 8.
Voeg bij deze oplossing een schepje kaliumnitraat.
- Maken van oplossingen van aminozuren met pH = 4
Los 0,05 g alanine op in 5 mL oplossing met pH = 4 in een reageerbuis.
Los 0,05 g lysine op in 5 mL oplossing met pH = 4 in een reageerbuis.
- Maken van oplossingen van aminozuren met pH = 5
Los 0,05 g alanine op in 5 mL oplossing met pH = 5 in een reageerbuis.
Los 0,05 g lysine op in 5 mL oplossing met pH = 5 in een reageerbuis.
- Maken van oplossingen van aminozuren met pH = 6
Los 0,05 g alanine op in 5 mL oplossing met pH = 6 in een reageerbuis.
Los 0,05 g lysine op in 5 mL oplossing met pH = 6 in een reageerbuis.
- Maken van oplossingen van aminozuren met pH = 7
Los 0,05 g alanine op in 5 mL oplossing met pH = 7 in een reageerbuis.
Los 0,05 g lysine op in 5 mL oplossing met pH = 7 in een reageerbuis.
- Maken van oplossingen van aminozuren met pH = 8
Los 0,05 g alanine op in 5 mL oplossing met pH = 8 in een reageerbuis.
Los 0,05 g lysine op in 5 mL oplossing met pH = 8 in een reageerbuis.
- Maak een ninhydrine oplossing
Neem een bekerglas van 100 mL en los 0,1 g ninhydrine op in 50 mL aceton. Homogeniseer.
Uitvoering
Voer met de oplossingen van de aminozuren elektroforeses uit bij de verschillende pH
waarden.
De elektroforesetijd is 30 - 40 minuten.
Bepaal het IEP van lysine en alanine.
Pagina 11
Papierelektroforese van enkele aminozuren
De elektroforese-apparatuur bestaat uit twee perspexbakjes (14 cm x 6 cm x 6 cm), bevestigd
op een grondplaat elk voorzien van een 20 cm lange platina- draad (als elektrode) met
aansluitklemmen. Als lijmmiddel kan chloroform gebruikt worden. Over de bakjes wordt een
glasplaat (22 cm x 12 cm) ge-legd. Bij gebruik moet als afscherming een plastic bak over het
geheel worden geplaatst, zie tekening hierboven.
Vul de elektroforesebakjes voor ongeveer de helft met de oplossing met pH = 4.
Knip stroken elektroforesepapier van 10 cm x 35 cm (het papier mag alleen met rubber
handschoenen aan worden vastgepakt!) en breng de verschillende aminozuuroplossing met pH
= 4 met een pipetje in het midden aan. Stip één keer aan, zodat een vlekje van ongeveer 3
mm diameter ontstaat.
Droog de vlekken met de föhn; bevochtig het papier met de oplossing met pH = 4 door de
uiteinden in de
oplossing te drenken. De opbrengpunten mogen niet in de oplossing komen.
Leg het papier op de glas-plaat van het elektroforesebakje. De uiteinden van het
papier moeten in de oplossing hangen. Plaats de beschermkap over het elekroforeseapparaat
en sluit de gelijkspanningsbron van 300 V (4- 8 mA) aan.
Laat de elektroforese 30 - 45 minuten duren.
Droog het papier dan met de föhn; haal het vervol-gens door de ninhydrine-oplossing
en droog nogmaals. Gebruik hierbij rubber handschoenen.
Herhaal het experiment met de oplossing met pH = 5,6,7 en 8.
Bepaal het IEP van de gebruikte aminozuren.?
Pagina 12
Papierelektroforese van enkele aminozuren
Literatuur
1. B. L. Williams, K. Wilson, Principles and techniques of practical chemistry, p. 106 (1975).
2. Instructions Griffin, electrophoresis apparatus S24-800 IS 1731/7508.
3. P. J. de Rijke en W. v.d. Veer, Research Instituut Schoolscheikunde, Vakdidactiek
Schei-kunde, Rijksuniversiteit Groningen, m.m.v.: W. Hoeve, J. Sinke. RIS-publicatie XXIV
Pagina 13
Papierelektroforese van enkele aminozuren
Over dit lesmateriaal
Colofon
Auteur
Dick Naafs
Laatst gewijzigd
26 april 2013 om 15:28
Licentie
Dit lesmateriaal is gepubliceerd onder de Creative Commons
Naamsvermelding 3.0 Nederlands licentie. Dit houdt in dat je onder de
voorwaarde van naamsvermelding vrij bent om:
het werk te delen - te kopiëren, te verspreiden en door te geven via elk
medium of bestandsformaat
het werk te bewerken - te remixen, te veranderen en afgeleide werken
te maken
voor alle doeleinden, inclusief commerciële doeleinden.
Meer informatie over de CC Naamsvermelding 3.0 Nederland licentie
Aanvullende informatie over dit lesmateriaal
Van dit lesmateriaal is de volgende aanvullende informatie beschikbaar:
Leerniveau
MBO, Niveau 2: Basisberoepsopleiding; Volwasseneneducatie, Niveau 1;
MBO, Niveau 3: Vakopleiding; Volwasseneneducatie, Niveau 4; VWO 6; MBO,
Niveau 4: Middenkaderopleiding; MBO, Niveau 1: Assistentenopleiding; VWO;
Beroepsonderwijs en Volwasseneneducatie; HAVO 5; Volwasseneneducatie,
Niveau 3; Volwasseneneducatie, Niveau 2; VWO 5;
Leerinhoud en
Scheikunde;
doelen
Eindgebruiker
leraar
Moeilijkheidsgraad gemiddeld
Studiebelasting
0 uur en 50 minuten
Trefwoorden
alanine, aminozuren, elektroforese, glutaminezuur, iep, isoelektrischpunt,
lysine, ninhydrine, onderzoeksvaardigheden, papierelektroforese, ris, rispublicatie xxiv, technisch-instrumentele vaardigheden, toepassingen,
toepassingen (vervallen)
Pagina 14
Papierelektroforese van enkele aminozuren