Bachelorproject Maarten Kleijn

Optische eigenschappen van bloed;
brekingsindex en de verzwakkingscoëfficiënt van bloeddruppels bepaald met behulp van
OCT
Maarten Kleijn 0602892
Verslag van Bachelorproject Natuur- en Sterrenkunde, omvang 12 EC, uitgevoerd in de
periode 01-06-2009 tot 01-09-2009
AMC
Biomedical Physics, UvA
21-12-2010
Begeleider: Maurice Aalders
Tweede beoordelaar: Gerda Edelman
Samenvatting
Op dit moment kan met forensisch onderzoek nog niet aangetoond worden wanneer een
geweldmisdrijf precies heeft plaatsgevonden. Daar moet in de toekomst verandering in
komen. Van bloed is algemeen bekend dat het van kleur verandert, wanneer het het
lichaam heeft verlaten. Met spectroscopie kan worden onderzocht hoe de eigenschappen
van bloed veranderen vanaf het moment dat het buiten het lichaam is, om zo een relatie
van de bloedkleur tegen de tijd te vinden. Idealiter zou hiermee van elke aangetroffen
bloeddruppel bepaald kunnen worden hoe lang geleden hij het lichaam verlaten heeft en
wanneer een misdrijf dus heeft plaatsgevonden. Voordat aan een gedetailleerd
spectroscopisch onderzoek begonnen kan worden, is het van belang om een aantal
algemene optische eigenschappen van bloed te onderzoeken, die bekend moeten zijn in
uitgebreidere studies.
In dit onderzoek zijn de brekingsindex en de verzwakkingscoëfficiënt van bloed in de tijd
onderzocht met behulp van Optical Coherence Tomography (OCT). Dit is een nieuwe
signaalverwervingsmethode waarmee hoge resolutie dwarsdoorsneden van voorwerpen
gemaakt kunnen worden. De methode analyseert terugverstrooid licht met een
interferometer. Met het OCT systeem werden van een onbehandelde bloeddruppel tijdens
zijn indroging periodieke doorsneden gemaakt. Uit de gevonden data werd vervolgens de
brekingsindex en de verzwakkingscoëfficiënt van het bloed bepaald. Hierdoor kon de
ontwikkeling van deze beide waarden tegen de tijd weergegeven worden.
Hiertoe werd met een lancet een gaatje in de vingertop van een vrijwilliger gemaakt om
een bloeddruppel te creëren. De ontstane druppel werd direct (zonder toevoeging van
antistollingsstoffen) op een dekglaasje onder de OCT geplaatst. Het dekglaasje werd
onder een hoek met de inkomende lichtstraal geplaatst om te zorgen, dat de
gereflecteerde primaire lichtstraal de detector niet raakt. Hierdoor nam de signaal/ruis
verhouding enorm toe en ging de meting sneller. Met de OCT werden periodieke
dwarsdoorsneden van de druppel gemaakt. Vervolgens werd uit deze doorsneden, met
een hiervoor in labview geschreven computerprogramma, de brekingsindex en de
verzwakkingscoëfficiënt van het bloed op verschillende tijdstippen bepaald. De gevonden
waarden werden daarna tegen de tijd uitgezet in een grafiek.
De methode werd geijkt door de brekingsindices van gedestilleerd water en
glucoseoplossingen met verschillende concentraties te bepalen en de gevonden waarden
met literatuurwaarden te vergelijken.
De brekingsindex van de geanalyseerde bloeddruppels bleek tijdens de indroging
nauwelijks te veranderen. Na enige minuten werd een constante brekingsindex per
druppel gevonden. Daardoor kon een gemiddelde brekingsindex van de drie druppels
worden vastgesteld op 1,53.
De verzwakkingscoëfficiënt bleek eerst sterk toe te nemen tot een maximum en daarna
geleidelijk af te nemen tot 0. Bloeddruppels met een groter volume hebben ook een
hogere maximale verzwakkingscoëfficiënt en het duurt bij grotere druppels langer tot de
verzwakkingscoëfficiënt weer nul is. Een simpel model voor een verklaring hiervan
wordt gegeven.
2
1. INLEIDING ............................................................................................................................................ 4
2. THEORIE ............................................................................................................................................... 5
2.1 FORENSISCH ONDERZOEK VAN BIOLOGISCHE SPOREN ........................................................................................ 5
2.1.1 Bloed ............................................................................................................................................ 5
2.1.2 Bloeddatering ............................................................................................................................... 6
2.2 BLOED .................................................................................................................................................... 7
2.3 BREKINGSINDEX ........................................................................................................................................ 8
2.4 VERZWAKKINGSCOËFFICIËNT ..................................................................................................................... 10
2.5 OCT ..................................................................................................................................................... 10
2.5.1 Swept source OCT....................................................................................................................... 14
3. METHODE .......................................................................................................................................... 15
3.1 SANTEC ................................................................................................................................................. 15
3.1.1 De samenstelling van de Santec ................................................................................................. 15
3.1.2 Meten met de Santec ................................................................................................................. 16
3.2 LABVIEW ............................................................................................................................................... 17
3.2.1 Bepaling brekingsindex .............................................................................................................. 17
3.2.2 Bepaling verzwakkingscoëfficiënt .............................................................................................. 18
3.3 GLUCOSE OPLOSSING ............................................................................................................................... 20
3.4 BLOED AFNAME ...................................................................................................................................... 21
4. RESULTATEN ...................................................................................................................................... 22
4.1 BREKINGSINDEX ...................................................................................................................................... 25
4.2 VERZWAKKINGSCOËFFICIËNT ..................................................................................................................... 28
5. DISCUSSIE........................................................................................................................................... 29
5.1 BREKINGSINDEX ...................................................................................................................................... 29
5.2 VERZWAKKINGSCOËFFICIËNT ..................................................................................................................... 30
6. CONCLUSIE ......................................................................................................................................... 31
7. REFERENTIES ...................................................................................................................................... 32
3
1. Inleiding
Wanneer is een moord gepleegd? Kan de politie die snel ter plekke is dit bepalen op een
objectieve en kwantitatieve manier? Op dit moment kan dat eigenlijk niet. Het doel van
dit onderzoek is om te helpen om daarin verandering te brengen.
Biologische sporen spelen een belangrijke rol bij het oplossen van geweldsmisdrijven en
de bewijsvoering tegen misdadigers. Zo kan met DNA onderzoek geïdentificeerd worden
wie de betrokkenen waren bij een misdrijf. Met bloedsporen onderzoek kan worden
afgeleid wat zich op de plaats delict heeft afgespeeld. Het tijdstip waarop het misdrijf
heeft plaatsgevonden kan echter nog niet nauwkeurig worden bepaald aan de hand van
biologische sporen. Van bloed is algemeen bekend dat het van kleur verandert, wanneer
het het lichaam heeft verlaten. Met spectroscopie kan worden onderzocht hoe de
eigenschappen van bloed veranderen vanaf het moment dat het buiten het lichaam is, om
zo een relatie van de bloedkleur tegen de tijd te vinden.
Idealiter zou hiermee van elke aangetroffen bloeddruppel bepaald kunnen worden hoe
lang geleden hij het lichaam verlaten heeft en wanneer een misdrijf dus heeft
plaatsgevonden. Voordat aan een gedetailleerd spectroscopisch onderzoek begonnen kan
worden, is het van belang om een aantal algemene optische eigenschappen van bloed te
onderzoeken, die bekend moeten zijn in uitgebreidere studies.
In dit bachelorproject worden daarom de brekingsindex en de verzwakkingscoëfficiënt
van bloed bestudeerd. Bloeddruppels worden op deze eigenschappen onderzocht met een
instrumentele methode die daar heel erg geschikt voor is: Optical Coherence
Tomography (OCT). Dit is een nieuwe signaalverwervingsmethode waarmee hoge
resolutie dwarsdoorsnedes van voorwerpen gemaakt kunnen worden. Met het OCT
systeem worden van een onbehandelde bloeddruppel tijdens zijn indroging periodieke
doorsneden gemaakt. Uit de gevonden data wordt vervolgens de brekingsindex en de
verzwakkingscoëfficiënt van het bloed bepaald. Hierdoor zal de ontwikkeling van deze
beide waarden tegen de tijd weergegeven kunnen worden. Het doel van dit onderzoek is
te bepalen wat de waarde is van de brekingsindex en de verzwakkingscoëfficiënt van
bloed en hoe deze waarden zich ontwikkelen tijdens de indroging van de bloeddruppel.
Kennis van deze grootheden als functie van de tijd zal leiden tot onderzoeksmethoden en
instrumenten, die kunnen aangeven hoelang bloed al buiten een lichaam is. Dit is van
groot belang voor forensisch onderzoek.
Hopelijk draagt dit onderzoek bij aan de ontwikkeling van nieuwe, snelle en draagbare
instrumenten waarmee snel forensisch onderzoek op de plaats delict kan worden
uitgevoerd. Zo kan dan precies worden bepaald wanneer een geweldsdelict heeft
plaatsgevonden.
4
2. Theorie
2.1 Forensisch onderzoek van biologische sporen
Biologische sporen zijn de afgelopen jaren steeds belangrijker geworden in de
bewijsvoering van strafrechtzaken. Het Nederlands Forensisch Instituut (NFI)
onderscheidt drie soorten biologische sporen [1]:
1.
De lichaamsvloeistoffen bloed, sperma en speeksel. Dit zijn sporen waarvan is
vast te stellen om welk type celmateriaal of vloeistof het gaat of waarvoor
aanwijzingen daarvoor zijn te verkrijgen.
2.
Haren
3.
Biologische contactsporen. Van deze sporen is met de huidige technieken niet
vast te stellen, of zijn geen aanwijzingen te verkrijgen, tot welke
lichaamscellen ze behoren.
Naast deze drie groepen biologische sporen worden ook tanden/kiezen, botten, spieren en
weefsels gebruikt voor forensisch (DNA)onderzoek. Dit biologisch celmateriaal speelt
met name een rol bij het identificeren van overleden personen.
2.1.1 Bloed
Van de bovengenoemde biologische sporen zal in dit onderzoek alleen bloed behandeld
worden.
Om vast te stellen of een op de plaats delict gevonden stof bloed is wordt de tetrabasetest
gebruikt; deze test kan bloed onderscheiden van andere substanties. Als er geen bloed
wordt gevonden, omdat dit bijvoorbeeld is verwijderd door de dader, kan luminol worden
gebruikt. Luminol is een stof, die zich hecht aan bloedresten. In dat geval luminisceert
Luminol in het zichtbare golflengte gebied, wanneer het wordt beschenen met ultraviolet
(UV) licht uit een speciale UV lamp. Zo kan Luminol voor het blote oog onzichtbare
bloedsporen zichtbaar maken.
DNA-onderzoek van het bloed kan duidelijk maken van wie het betreffende bloed
afkomstig was en wie dus de mogelijke dader of het mogelijke slachtoffer van een
geweldsdelict was. Daarnaast kunnen bloedsporen ook waardevolle informatie
verschaffen voor de reconstructie van wat zich op de plaats delict kan hebben afgespeeld.
Deze informatie kan worden verkregen door onderzoek van de uiterlijke kenmerken van
de bloedsporen (zoals grootte, vorm en richting) op de plaats delict. Onderzoek van
bloedsporen kan ophelderen op welke manier, met wat voor kracht, van welke richting en
hoogte een letsel kan zijn toegebracht.
5
2.1.2 Bloeddatering
Met DNA-onderzoek en bloedspooranalyse kan dus bepaald worden wie betrokken waren
bij een misdrijf en hoe het zich voltrokken heeft. Een ander erg belangrijk gegeven, voor
het opsporen van en de bewijsvoering tegen een verdachte, is het tijdstip waarop het
misdrijf plaatsvond. Door de temperatuur van de huid of een bepaald orgaan op te meten
en deze waarde te vergelijken met de normale lichaamstemperatuur kan een grove
schatting worden gemaakt van hoe lang geleden het slachtoffer overleden is.
Op het AMC wordt op dit moment gewerkt aan een heel andere methodiek. Door
spectroscopische metingen aan bloed hoopt men een verband te vinden tussen de kleur
van bloed en de tijd die het bloed al buiten het lichaam is. Als dit zou lukken zou voor
een op een plaats delict aangetroffen bloeddruppel enkel de kleur bepaald hoeven worden
om het tijdstip waarop het misdrijf heeft plaatsgevonden te kunnen bepalen. Een groot
voordeel van deze methode zou zijn dat ook zonder het lichaam te kunnen onderzoeken
dit tijdstip bepaald kan worden. Bij het meten van de verandering in kleur tijdens de
stolling van het bloed moet worden gecorrigeerd voor de brekingsindex en
verzwakkingscoëfficiënt als die tijdens het stollen niet gelijk blijven.
6
2.2 Bloed
Aangezien bloed onderzocht zal worden is enig begrip van deze vloeistof vereist. Hier
volgt een korte biologische omschrijving [2].
Bloed is een roodgekleurde lichaamsvloeistof die zuurstof, voedingsstoffen en andere
belangrijke stoffen naar de lichaamscellen toe transporteert en afvalstoffen van deze
cellen wegvoert. Een volwassene heeft gemiddeld vijf liter bloed in zijn lichaam. De
dichtheid van bloed is 1060 kg/m3, hetgeen vrijwel gelijk is aan de dichtheid van water
(1000 kg/m3). Bloed bestaat uit bloedplasma en verschillende typen bloedcellen.
Bloedplasma is een heldere lichtgele vloeistof en bestaat voor 92% uit water, voor 8% uit
plasma-eiwitten en nog uit enkele andere stoffen. Ongeveer 54% van het volume van het
bloed bestaat uit bloedplasma. Het vervoert voedingsstoffen en afvalstoffen door het
lichaam.
Witte bloedcellen beslaan slechts 0,7% van het totale bloed en beschermen het lichaam
tegen infectieziekten en lichaamsvreemde stoffen. De kernen van de witte bloedcellen
zijn de bron van DNA in het bloed.
Bloedplaatjes spelen een belangrijke rol bij bescherming en herstel van bloedvaten en de
stolling van bloed buiten het lichaam om bloedingen te stoppen.
Rode bloedcellen zijn de meest voorkomende bloedcellen: ongeveer 45% van het volume
van het bloed bestaat eruit. Ze hebben als belangrijkste functie het transport van zuurstof
en koolstofdioxide door het lichaam. De rode kleur komt van de hemoglobine die in de
cellen zit. Hemoglobine bindt in de longen zuurstof en geeft deze vervolgens in het
lichaamsweefsel af. Daar wordt bij verbranding CO 2 gevormd en dit wordt vervolgens
aan de hemoglobine gebonden en in de longen weer afgestaan.
Een hemoglobinemolecuul bevat een ijzer (Fe) atoom. Dit atoom kan in de Fe2+ of Fe3+
toestand zijn. De reactie die hierbij hoort is: Fe2+ + O2 → Fe3+ + O2- Er wordt van
methemoglobine gesproken als het ijzeratoom zich in de Fe3+ toestand bevindt.
Methemoglobine kan geen zuurstof binden. Als hemoglobine een verbinding aangaat met
zuurstof molecuul spreekt men van oxyhemoglobine. Als de zuurstof vervolgens aan het
weefsel wordt afgestaan ontstaat deoxyhemoglobine. Oxyhemoglobine,
deoxyhemoglobine en methemoglobine oplossingen hebben verschillende kleuren en zijn
hierdoor van elkaar te onderscheiden. De datering van bloedsporen met behulp van
spectroscopie berust op dit kleurverschil.
7
2.3 Brekingsindex
Om te kunnen bepalen hoe lang een bloeddruppel die op een plaats delict gevonden is al
buiten het lichaam is moeten enkele waarden van deze druppel berekend worden. Een
daarvan is de brekingsindex. Daarom volgt hier een theoretische beschrijving van deze
brekingsindex [3].
De elektromagnetische toestand van het vacuüm wordt bepaald door twee vectoren: het
elektrisch veld E en het magnetisch veld H. Als deze velden niet veranderen in de tijd
zijn ze onafhankelijk van elkaar. Normaalgesproken veranderen ze echter wel en worden
de velden met de volgende vergelijkingen beschreven:
  E  -0
  H  0
H
t
(1)
E
t
(2)
E  0
(3)
H  0
(4)
De vier bovenstaande vergelijkingen worden de Maxwell vergelijkingen genoemd. De
constante μ0 is de permeabiliteit van het vacuüm. De waarde ervan is per definitie exact
4π x 10-7 Henry per meter (H/m). De constante ε0 is de permittiviteit van het vacuüm. De
waarde ervan is experimenteel bepaald op 8.854 x 10-12 farad per meter (F/m).
Uit formules 1 en 2 kunnen E en H gescheiden worden door de rotatie van de ene
formule en de tijdsafgeleide van de andere te nemen:
  (  E)    0 0
 2E
t 2
(5)
 2H
  (  H )    0 0 2
t
(6)
  (  )  (  )   2 ()
(7)
Verder geldt de regel:
Als 3 en 4 samen met 7 worden toegepast op 5 en 6 volgt:
2
 E
1  2E
c 2 t 2
(8)
8
1  2H
2
 H
(9)
c 2 t 2
Waarin voor de lichtsnelheid c geldt:
c
1
(10)
 0 0
De maxwell vergelijkingen in isotrope niet geleidende media zijn hetzelfde als die voor
het vacuüm, alleen de constanten veranderen: μ0 en ε0, worden respectievelijk μ en ε. De
snelheid in het medium wordt dan
1
(11)
v

Nu worden twee dimensieloze verhoudingen geïntroduceerd, de relatieve permeabiliteit:

r 
(12)
0
en de relatieve permittiviteit:
r 

0
(13)
De formule voor v kan nu worden omgeschreven tot:
1
1
c
v


(14)

 r  0 r  0
r r
De brekingsindex n van een bepaald medium wordt nu gedefinieerd als de verhouding
tussen de lichtsnelheid in vacuüm en de lichtsnelheid in het betreffende medium:
c
n   r r
(15)
v
Vele optisch transparante media zijn niet magnetisch, dus is μr =1. En geldt:
(16)
n  r
Stof
Brekingsindex
Lucht (1atm)
CO2 (1 atm)
Polystyreen
Glas
Water
Ethanol
1.0002926
1.00045
1.59
1.5-1.7
1.33
1.36
r
1.000295
1.0005
1.60
2.0-3.0
9.0
5.0
(Tabel 1: Brekingsindex en wortel van de permittiviteit van verschillende stoffen)
9
Uit tabel 1 blijkt dat de formule goed overeenkomt met experimenteel bepaalde gegevens
voor gassen (lucht en CO2) en voor niet polaire vaste stoffen (polystyreen). Voor deze
stoffen zijn de experimenteel bepaalde brekingsindex en de theoretisch bepaalde wortel
van de relatieve permittiviteit namelijk (vrijwel) gelijk. Voor media die polaire moleculen
bevatten (water en ethanol) komt de formule echter slecht overeen met de experimentele
gegevens. Dit komt door de hoge statische polariseerbaarheid van deze stoffen.
De polariseerbaarheid geeft aan hoe sterk een ladingsverdeling door een extern elektrisch
veld wordt beïnvloed.
Voor een betere benadering is de complexe brekingsindex geïntroduceerd:
Hierin is n de brekingsindex en k de verzwakkingscoëfficiënt, die aangeeft hoeveel de
intensiteit van de straling afneemt in een bepaald medium.
2.4 Verzwakkingscoëfficiënt
Als licht met een bepaalde intensiteit I(0) door een absorberend medium beweegt zal
deze intensiteit exponentieel afnemen met afstand z. De intensiteit I(z) is dus:
(18)
I ( z )  I (0)e  t z
Hierin is μt = μs + μa de verzwakkingscoëfficiënt, μs en μa zijn respectievelijk de
verstrooiings- en absorptiecoëfficiënt. De eenheid van μt is m-1.
2.5 OCT
Op afbeelding 1 is te zien hoe bij verschillende medische scanmethodes de
penetratiediepte van de methode zich verhoudt tot de resolutie van de opname. Grofweg
kan gesteld worden dat deze twee omgekeerd evenredig zijn: een hogere resolutie
betekent een lagere penetratiediepte. Zo heeft microscopie een extreem hoge resolutie (1
micrometer), maar door de optische verstrooiing van het licht kan met deze methode
slechts tot een diepte van enkele honderden micrometers gekeken worden. Ultrageluid
heeft daarentegen een hogere penetratiediepte, maar een kleinere resolutie.
10
(Afbeelding 1: penetratiediepte uitgezet tegen de resolutie van verschillende scanmethodes)
Tussen microscopie en ultrageluid ligt een relatief nieuwe scanmethode: “optical
coherence tomography”, of in het Nederlands: optische coherentie tomografie (OCT) [4],
[5]. Dit is een optische beeldvormingsmethode die in de biomedische fysica en
geneeskunde een steeds belangrijkere rol gaat spelen. Met OCT kunnen in situ (ter
plaatse) en in vivo (binnen het lichaam) dwarsdoorsneden van weefsel gemaakt worden
met een hoge resolutie.
De methode is vergelijkbaar met die van ultrageluid. Bij ultrageluid wordt een pulsgolf
op een medium gezonden. Het door het medium weerkaatste signaal wordt weer
opgevangen. Door heel nauwkeurig het tijdsverschil tussen het verzenden en ontvangen
van de geluidsgolven te meten kan dan bepaald worden hoe diep in het medium de golf
weerkaatst is. Door intensiteitsvariaties van het ontvangen signaal kunnen overgangen in
het medium in beeld worden gebracht. Zo kan dan een dieptescan van het medium
geproduceerd worden.
De werking van OCT is analoog hieraan, alleen wordt licht in plaats van geluid gebruikt.
Voor signaalverwerking is het belangrijkste verschil tussen licht en geluid hun snelheid.
De snelheid van geluid is ongeveer 3 x102 m/s en die van licht 3x108 m/s. Stel dat het
signaal 10cm aflegt, dan is het geluid na 3 x10-4 terug, terwijl licht al na 3 x10-10 terug is.
Op deze tijdsschaal is directe detectie onmogelijk. Daarom wordt bij OCT gebruik
gemaakt van een klassieke optische meettechniek: low coherence interferometry.
11
(Afbeelding 2: De Michelson interferometer)
Om de afstand die het licht heeft afgelegd te kunnen bepalen wordt een Michelson
interferometer gebruikt (zie afbeelding 2). De inkomende lichtbundel wordt door een
beamsplitter opgesplitst in twee armen: de referentie arm en de signaal arm. Aan het
einde van de referentie arm staat een spiegel en aan het einde van de signaal arm het
sample. De teruggekaatste lichtstralen komen weer samen bij de beamsplitter en worden
vervolgens naar een detector geleid. De spiegel in de referentie arm wordt nu van en naar
de beamsplitter bewogen. Er zal dan alleen interferentie optreden als het licht in de beide
armen een even grote afstand heeft afgelegd. Of nog preciezer: interferentie zal enkel
waargenomen worden zolang het verschil in afgelegde afstand van het licht in de beide
armen minder is dan de zogenaamde “coherentie lengte” van de lichtbron.
2
2 ln( 2) 0
L
(19)
 
In deze formule is L de coherentie lengte, 0 de centrale golflengte, en ∆λ het
golflengteverschil.
Uit formule 19 blijkt dat de coherentie lengte omgekeerd evenredig is met de frequentie
bandbreedte van het licht. Monochromatisch licht heeft bijvoorbeeld slechts één
golflengte en dus een kleine bandbreedte en volgens de formule een grote coherentie
lengte. Dit is in te zien door te denken aan de situatie dat twee van zulke lichtbundels
elkaar treffen in de Michelson interferometer. Als die golven precies in fase zijn, of juist
nπ (met n een geheel getal) uit fase, zal er interferentie optreden. Interferentie treedt dus
op over een breed gebied (zoals in het linker deel van afbeelding 3) en er wordt daarom
van een grote coherentie lengte gesproken. Op de detector in de opstelling zou nu bij een
periodieke verschuiving van de spiegel voor elke diepte een golfvormig signaal
opgevangen worden.
Voor OCT is het echter juist van belang dat alleen de bundels die precies dezelfde afstand
hebben afgelegd met elkaar interfereren. Daarom wordt bij OCT laag coherent licht
gebruikt. Dit licht heeft een grote bandbreedte (dus veel golflengtes) en daardoor een
kleine coherentie lengte (zie het rechter deel van afbeelding 3). Het heeft statistische fase
discontinuïteiten over een afstand die gelijk is aan de coherentie lengte.
12
(Afbeelding 3: Coherent en laag coherent licht)
Wanneer er interferentie wordt waargenomen in de detector kan - ervan uitgaande dat de
padlengte in de referentie arm bekend is - de positie van de reflecterende structuur in het
voorwerp met een nauwkeurigheid van de coherentie lengte berekend worden.
De T in OCT staat voor tomografie. Dit is een techniek waarmee een 2D afbeelding
weergegeven wordt door 1D doorsneden naast elkaar te leggen, of een 3D afbeelding
door 2D doorsneden naast elkaar te leggen. Bij OCT is een A-scan een weergave van de
intensiteit van het teruggekaatste licht tegen de diepte (z-richting). Een B-scan is een
weergave van een aantal naast elkaar (x-richting) genomen A-scans. De hoeveelheid
weerkaatste fotonen wordt in een B scan genormaliseerd en met een helderheidgradiënt
weergegeven; een lichtere kleur staat voor meer ontvangen fotonen. Een 3D-scan wordt
gemaakt door meerdere B-scans naast elkaar te maken in de y-richting. De drie soorten
scans zijn in afbeelding 4 weergegeven.
(Afbeelding 4: A-scan (1D), B-scan (2D) en 3D scan gemaakt met een OCT)
13
Er zijn verschillende typen OCT systemen. Het zojuist beschreven type met een
bewegende spiegel wordt Time Domain OCT genoemd. In 1995 werd voorgesteld dat
OCT ook mogelijk zou moeten zijn zonder bewegende spiegel, door het spectrum fourier
te analyseren. In 2003 werd aangetoond dat de fourier domain OCT een grotere
nauwkeurigheid heeft dan time domain OCT. Er zijn twee typen Fourier domain OCT:
spectral/Fourier domain OCT en swept source/fourier domain OCT. Spectral/Fourier
domain OCT maakt gebruik van een interferometer met een laag coherente lichtbron en
meet het interferentiespectrum met een spectrometer en een hoge snelheid line scan
camera. Voor dit onderzoek wordt een swept source/Fourier domain OCT gebruikt.
2.5.1 Swept source OCT
Een swept source OCT opstelling ziet er praktisch hetzelfde uit als de eerder in
afbeelding 2 getoonde Michelson interferometer. De lichtbron heeft nu een kleine
bandbreedte, waarvan de frequentie in de tijd periodiek wordt veranderd (swept in het
Engels). Wederom wordt de bundel gesplitst in een signaal arm en een referentie arm.
Aan het einde van de referentie arm staat in deze opstelling echter een onbeweegbare
spiegel. Het te onderzoeken object bevindt zich aan het einde van de signaal arm en
weerkaatst vanuit verschillende dieptes signaal terug door dezelfde arm. De beide
bundels krijgen een time offset, die afhankelijk is van het padlengteverschil tussen de
beide bundels. Het padlengteverschil wordt bepaald, door de diepte van de weerkaatsende
structuur in het object. Ook zullen de bundels een frequentie offset hebben, omdat de
frequentie van het uitgezonden licht verandert in de tijd. Wanneer de beide bundels weer
samenkomen op de beamsplitter ontstaat er een modulatie in de intensiteit bij een
frequentie die wordt gegeven door deze frequentie offset. Hierdoor zullen verschillende
echo vertragingen, verschillende frequentie modulaties produceren. De echo vertraging
kan gemeten worden door het signaal op de fotodetector van een frequentietoename
periode te bekijken, te corrigeren voor non-lineariteiten in de tijd en dan dit signaal
Fourier te transformeren. Het resultaat is een axiale scan van de sterkte en echo
vertraging van het licht uit het object.
14
3. Methode
3.1 Santec
(Afbeelding 5: De samenstelling van de Santec)
3.1.1 De samenstelling van de Santec
Om de optische eigenschappen van bloed te onderzoeken wordt de Santec 1300nm OCT
gebruikt [6]. Dit is een door het bedrijf Santec uit Japan geleverde OCT, die ontwikkeld
is voor de medische wereld en (daarom) tamelijk gebruikersvriendelijk is. De
samenstelling van het apparaat is in essentie die van de boven omschreven swept source
OCT, al zijn er enkele schakelingen toegevoegd om de weergave nog beter te maken. De
samenstelling van het instrument is in de afbeelding 5 te zien. Het licht van de “swept
source” HSL-2000 wordt in dit geval niet in een beam splitter, maar in een fiber coupler
gesplitst in een referentie arm en een signaal arm. De twee bundels komen weer samen in
een volgende fiber coupler daar ontstaat het interferogram tegen de tijd. Vervolgens
wordt het signaal via een balanced detector en een A/D board naar de computer geleid.
Op de computer creëert een door Santec geschreven programma 2D en 3D afbeeldingen
van het signaal.
15
3.1.2 Meten met de Santec
Om een geschikte afbeelding met de santec te creëren is de nodige ervaring met het
apparaat vereist. Eerst moet een geschikte ondergrond voor het te onderzoeken object
worden gekozen. In eerste instantie werd geprobeerd de te onderzoeken druppels op een
witte tegel te plaatsen en deze onder de lens te leggen. Het oppervlak van deze tegel
bleek het licht zo sterk te weerkaatsen dat het uitgezonden licht als weerkaatst door een
spiegel weer terugkwam in de OCT. Daarom werd besloten het oppervlak van de tegel
met een dremel (een kleine boormachine) ruwer te maken. Nu werden de druppels op dit
ruwe stuk tegel geplaatst en vervolgens onder de OCT. Weliswaar verdween hiermee het
spiegelende effect van de tegel, maar de verkregen beelden van de druppel waren nog
altijd niet bevredigend. Daarom werd besloten de druppel op een dekglaasje te leggen.
Het voordeel van een dekglaasje is dat het oppervlak ervan erg egaal en schoon is, zodat
de druppel zich mooi symmetrisch zal vormen. Het nadeel ervan is echter dat het veel
licht dat niet door de druppel geabsorbeerd wordt als een spiegel terug naar de OCT
reflecteert. Het deel van de fotonen dat niet aan bloedcellen, maar aan het dekglaasje
elastisch verstrooit is namelijk groter dan het deel van de bundel dat wel reflecteert van
het bloed. Daarom raakt de fotonendetector verzadigd en is er geen resolutie om de
diepteverschillen in bloeddruppel te registreren. Om dit te voorkomen werd het glaasje
onder een kleine hoek gelegd zodanig dat de druppel niet wegstroomde, maar de
lichtstralen die door het glaasje gereflecteerd werden wel buiten de ontvanger vielen. Dit
is te zien op afbeelding 6. Hierdoor wordt alleen het relevante signaal door de detector
opgevangen, niet verstoord door het irrelevantie gereflecteerde signaal. Daardoor neemt
de signaal-ruis verhouding en de gevoeligheid toe.
(Afbeelding 6: Om ruis te voorkomen wordt het dekglaasje onder een hoek onder de OCT geplaatst)
16
In het programma waarmee de Santec bediend wordt kan de gebruiker allerlei
verschillende instellingen kiezen. Zo kan de tijdsduur van een meting, de grootte van het
te onderzoeken oppervlak, de lichtintensiteit en de resolutie worden gevarieerd. Net als
bij klassieke microscopie moet ook bij deze OCT een geschikte afstand tussen het
voorwerp en de lens gekozen worden. Na veel experimenteren met verschillende
instellingen werd uiteindelijk de juiste manier gevonden om het onderzoek te starten.
Door een druk op de knop kon nu een dwarsdoorsnede van de druppel gemaakt worden.
In het programma was het echter niet mogelijk periodieke metingen te doen, waardoor
telkens voor elke dwarsdoorsnede (elke 30 seconden) de meting handmatig gestart moest
worden.
3.2 Labview
3.2.1 Bepaling brekingsindex
Om de brekingsindex van een druppel vloeistof te kunnen berekenen wordt een
dwarsdoorsnede van de druppel gemaakt met de OCT. Op de afbeelding die de OCT
maakt (afbeelding 7) valt direct op dat de druppel niet alleen boven het oppervlak van het
dekglaasje, maar ook daaronder te zien is. Deze afwijking komt door de brekingsindex
van de druppel. De OCT gaat ervan uit dat het licht – net als in de referentie arm - met de
lichtsnelheid in lucht gaat, terwijl de snelheid van het licht in waterachtige vloeistoffen
aanmerkelijk langzamer is. Hoeveel maal langzamer de lichtsnelheid in een medium is
dan de lichtsnelheid in vacuüm is - zoals eerder genoemd - de brekingsindex. De
brekingsindex van de vloeistof in de druppel is nu te bepalen door de afstand van de
bovenkant tot de onderkant van de druppel (a) te delen door de afstand van het oppervlak
tot de top van de druppel (b).
a
n
(20)
b
Om dit te kunnen doen voor verschillende dwarsdoorsneden wordt het programma
“labview” gebruikt. In een speciaal hiervoor geschreven labview programma kan de data
die de OCT produceert ingelezen worden. Ook werd op de afdeling van het AMC waar
het onderzoek geschiedde een programma geschreven om vanuit deze data de
brekingsindex van de druppel te bepalen. De bovenkant van de druppel, de onderkant van
de druppel en het oppervlak van het dekglaasje moeten hierin worden aangeklikt en dan
geeft het programma de bijbehorende brekingsindex. Bij een mooi gevormde verse
druppel is dit erg makkelijk. Gedurende de indroging van een bloeddruppel wordt dit
echter steeds moeilijker. De druppel krijgt namelijk een grillige vorm en wordt vanbinnen
inhomogeen. Daardoor moet bij elke dataset het contrast van de afbeelding worden
aangepast om nog een overgang tussen de druppel en de lucht en het dekglaasje te
kunnen herkennen. Daarom bleek het onmogelijk te zijn om een programma te
ontwikkelen dat automatisch van verschillende afbeeldingen van de druppel de
brekingsindex kon bepalen. Hierdoor moest na een lange meting van de indroging van
een druppel van elke individuele afbeelding handmatig de grenzen van de druppel en het
dekglaasje worden aangeklikt.
17
(Afbeelding 7: Bepaling van de brekingsindex van de druppel in het programma labview, door afstand a
door b te delen)
3.2.2 Bepaling verzwakkingscoëfficiënt
De verzwakkingcoëfficiënt is een verhouding tussen de oorspronkelijke intensiteit van de
uitgezonden lichtbundel en de intensiteit die overblijft nadat die bundel door een medium
heen is gereisd. Het licht wordt namelijk verstrooid en geabsorbeerd tijdens het passeren
van het medium. Bij deze meting werd niet de transmissie van fotonen door de
bloeddruppel, maar hun reflectie terug naar de detector (in één hoek) gemeten. Er worden
dus veel minder fotonen gedetecteerd, dan bij een transmissie meting het geval zou zijn.
Daarom is de verzwakkingcoëfficiënt uit deze meting alleen af te leiden als wordt
aangenomen dat reflectie in elke hoek even waarschijnlijk is. Wat nu wordt
waargenomen is het aantal fotonen dat vanaf een bepaalde diepte naar de detector wordt
verstrooid. Als nu vanuit een grotere diepte minder fotonen worden waargenomen kan
worden gezegd dat onderweg fotonen zijn geabsorbeerd en andere richtingen op zijn
verstrooid. Er kan dus worden gesproken van een verzwakking van de intensiteit tegen de
diepte.
18
Voor de bepaling van de verzwakkingscoëfficiënt wordt dezelfde doorsnede van de
druppel gebruikt. Op afbeelding 7 is te zien dat de helderheid van de pixels in het plaatje
afneemt met de diepte. Om deze afname in intensiteit te kwantificeren wordt wederom
een programma in labview gebruikt.
De gebruiker selecteert eerst een rechthoekig oppervlak binnen de doorsnede van de
bloeddruppel. Het geselecteerde oppervlak is eigenlijk een weergave van een matrix met
op elk (x,z) coördinaat een intensiteit, waarbij een hogere intensiteit met een helderdere
kleur wordt weergegeven. De gemiddelde intensiteit van elke rij van de matrix wordt
bepaald, door de intensiteit van alle pixels in de rij bij elkaar op te tellen en te delen door
het totale aantal x waarden per rij. Nadat dit voor elke rij gedaan is kan een gemiddelde
intensiteit tegen diepte (z) grafiek van het gekozen oppervlak worden geplot. Deze
intensiteit wordt weergegeven in afbeelding 8. De eerste piek komt overeen met
verstrooiing van het buitenoppervlak van de druppel. Daarna loopt de intensiteit snel
terug, in het plasmarijke deel van de druppel. Naar het grensvlak met de laag met rode
bloedcellen neemt de intensiteit weer toe. In deze laag neemt de intensiteit weer sterk af
naar nul.
(Afbeelding 8. Terugverstrooiingsintensiteit (y-as) als functie van de diepte in de druppel (x-as))
Deze afvallende intensiteit blijkt exponentieel af te nemen. Daarom kan worden gefit met
een functie van de vorm van formule 18. De μt die hieruit volgt is de
verzwakkingscoëfficiënt. Omdat eigenlijk de backscatter vanuit het bloed naar de
detector gemeten wordt zou ook van een backscattercoëfficiënt gesproken kunnen
worden. Op de formule en de waarde van de coëfficiënt heeft dit echter geen invloed. Het
is nu aan de onderzoeker om het begin en het einde van de te onderzoeken helling aan te
klikken in het programma. Gekozen werd de helling die hoort bij de onderste laag van
bloedcellen te fitten. Aangezien de bloeddruppel tijdens zijn indroging erg verandert was
het ook niet mogelijk het programma zelf het begin en einde van de geschikte helling te
vinden en moest de onderzoeker daarom telkens zelf een juiste fit zien te vinden bij elke
individuele afbeelding van de bloeddruppel.
19
3.3 Glucose oplossing
Om te controleren of de gekozen techniek geschikt is voor het onderzoek werd eerst de
brekingsindex van een aantal glucose-oplossingen met verschillende molariteiten
bepaald. Hiertoe werd in het laboratorium een oplossing van 1 mol/liter glucose gemaakt.
De molaire massa van glucose is: 180.16 g/mol. Door 1.8016 gram glucose af te wegen
en op te lossen in een buisje waarin 1 centiliter water is gepipetteerd, werd de beoogde
verhouding van 1 mol/liter gecreëerd. Vervolgens werd over vijf buisjes een geleidelijk
verloop van 0 tot 1 M (mol/L) gemaakt, door een bepaalde hoeveelheid gedestilleerd
water en een bepaalde hoeveelheid oplossing met een druppelpipet samen te voegen. In
de onderstaande tabel 2 staat te lezen hoe de verschillende buisjes gevuld werden.
Water (mL)
100
90
80
50
0
1 M glucose oplossing (mL)
0
10
20
50
100
Glucose concentratie (M)
0
0.1
0.2
0.5
1
(Tabel 2: Hoeveelheid water en glucose oplossing en bijbehorende glucose concentratie)
Van de verkregen oplossingen wordt met een pipet één voor één uit elk buisje een
druppel van 20 microliter op een dekglaasje onder de OCT gelegd.
Uit elk buisje met verschillende molariteit glucose werd een druppel onder de OCT
gelegd. Van deze druppels werden verschillende B-scans gemaakt. Aan de hand van deze
B-scans werd vervolgens met labview – zoals eerder beschreven is – de brekingsindex
bepaald. Per concentratie werd zo een aantal maal de brekingsindex bepaald. Daarna
werd het gemiddelde van de verschillende brekingindices per buisje en de fout hierin
berekend. De gevonden gemiddelde brekingindex is in afbeelding 9 geplot tegen de
molariteit, met bijbehorende foutbalk.
De blauwe lijn in de grafiek is de theoretische verwachte toename van de brekingsindex
met de molariteit, zoals deze in de literatuur bekend is [5].
20
Glucose
1.375
Brekingsindex
1.37
1.365
1.36
1.355
1.35
1.345
1.34
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
Molariteit (mol/L)
(Afbeelding 9: De brekingsindex van een glucoseoplossing uitgezet tegen de molariteit van de oplossing)
Het eerste buisje van de glucose meting bestond voor 100% uit gedestilleerd water.
Volgens Hale et al. [7] is de brekingsindex van water bij een golflengte van 1300 nm
1.323. Volgens Faber [5] is deze 1.343±0.001. In dit onderzoek werd een waarde van
1.342±0.002 gevonden. De door Faber gepresenteerde waarde valt dus binnen de
foutenmarge van de in dit onderzoek gevonden waarde.
Een kanttekening die wel geplaatst dient te worden is dat de temperatuur van het water
niet gemeten is alvorens de druppel onder de OCT gelegd werd, terwijl bekend is dat de
temperatuur ook van invloed is op de brekingsindex.
De theoretische lijn van de brekingsindex tegen de molariteit valt niet binnen de fout van
alle datapunten, maar de trend in de punten is zeker vergelijkbaar met die van de
theoretische lijn. Dit geeft aan dat de Santec geschikt is om brekingsindices van druppels
te bepalen en dus zullen de bloeddruppels op gelijke wijze onderzocht worden.
3.4 Bloed afname
Nadat de werking van de opstelling is geverifieerd met een glucose oplossing, worden
bloeddruppels onderzocht. Met een lancet (kleine naald die normaal door diabetes
patiënten wordt gebruikt) wordt een gaatje in de vingertop van een proefpersoon
gemaakt. Vervolgens wordt door dit gaatje een druppel bloed uit de vinger op een
dekglaasje geplaatst. Het bloed komt direct op het dekglaasje en er worden dus geen
antistollingsstoffen aan toegevoegd, zoals bij dergelijke onderzoeken vaak het geval is.
Dit dekglaasje wordt wederom onder een hoek onder de OCT gelegd. Nu wordt met de
OCT om de zoveel tijd een opname gemaakt van de druppel, zodat de ontwikkeling van
de druppel in de tijd kan worden geanalyseerd.
21
4. Resultaten
Uiteindelijk is van drie verschillende bloeddruppels de ontwikkeling van de
brekingsindex en de verzwakkingcoëfficiënt tegen de tijd bepaald. Om een aantal redenen
is dit voor slechts drie druppels gedaan. Allereerst was het moeilijk om goede druppels te
verkrijgen. De druppels konden niet te groot of te klein zijn om binnen het meetoppervlak
van de OCT bekeken te kunnen worden. Ook moest ze een vorm hebben die zodanig was
dat er een duidelijke dwarsdoorsnede gemaakt kon worden. Verder ging er veel tijd zitten
in het maken van de dwarsdoorsneden, omdat voor elke meting apart handmatig een knop
moest worden ingedrukt. En daarna moesten al deze individuele dwarsdoorsneden één
voor één in labview onderzocht worden om de brekingsindex en de
verzwakkingscoëfficiënt voor één tijdspunt te vinden.
Het bloed van de druppels A en C (gemeten op 29-6-09 en 1-7-2009) is afkomstig van
een gezonde vrijwillige donor (man, 22 jaar oud). Het bloed van druppel B (gemeten op
30-6-09) komt uit de vinger van een andere donor (vrouw, 22 jaar oud). De drie druppels
zijn op achtereenvolgende dagen volgens exact dezelfde – onder de kop methode
omschreven - procedure behandeld.
Op afbeeldingen 10, 11 en 12 is de eerste dwarsdoorsnede die de OCT van elke druppel
maakte te zien. Van elk plaatje werd eerst de juiste pixel tot afstand verhouding bepaald,
door te kijken hoe groot de afstand in pixels is tussen twee liniaalstreepjes op de x-as en
op de y-as. Vervolgens werd de helft van de breedte (a) en de hoogte (b) van de drie
druppels bepaald (zie afbeelding 7), door de afstand in pixels te meten en deze met de
eerder bepaalde verhouding om te rekenen naar millimeters. Ervan uitgaande dat de
dwarsdoorsnede precies door het midden van de druppel is genomen en dat het grondvlak
van de druppel cirkelvormig is, mag gesteld worden dat de halve lengte (c) van de
druppel gelijk is aan de halve breedte (a). Als nu ook wordt aangenomen dat de druppel
ellipsvormig is kan de formule voor het volume van een ellips gebruikt worden om het
volume van de druppel te berekenen.
4
V  abc
(21)
3
Aangezien een bloeddruppel een halve ellips is moet formule 21 door twee gedeeld
worden en dan worden ingevuld voor de hoogte en breedte van de drie druppels. De
gevonden volumes voor de drie druppels zijn te zien in tabel 3.
Druppel a
a
b (=c)
Volume
Druppel b
Druppel c
2,61
2,14
0,918
0,598
6,53
2,87
(Tabel 3: Volume van de drie bloeddruppels)
1,37
0,247
0,489
22
(Afbeelding 10: Druppel A, bestudeerd op 29 juni)
(Afbeelding 11: Druppel B, bestudeerd op 30 juni)
23
(Afbeelding 12: Druppel C, bestudeerd op 1 juli)
Op afbeelding 13 is in negen stappen weergegeven hoe bloeddruppel B zich ontwikkelt
met de tijd. Eerst is het bloed homogeen over de druppel verdeeld. Later ontstaat er een
duidelijke scheiding. De bloedcellen zakken naar beneden en bloedplasma komt er
bovenop te liggen. Uiteindelijk blijft er een korst over die ook weer homogeen lijkt te
zijn; dit omdat al het water in het bloedplasma verdampt is.
(Afbeelding 13: 9 afbeeldingen van de doorsnede van de bloeddruppel van 30-6 in chronologische
volgorde)
24
4.1 Brekingsindex
Hieronder is van elk van de drie druppels de brekingsindex tegen de tijd geplot.
Brekingsindex
Druppel A
2
1,9
1,8
1,7
1,6
1,5
1,4
1,3
1,2
1,1
1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Tijd (minuten)
(Afbeelding 14: Brekingsindex van bloeddruppel A uitgezet tegen de tijd. Gemiddelde brekingsindex:
1,53)
Brekingsindex
Druppel A
2
1,9
1,8
1,7
1,6
1,5
1,4
1,3
1,2
1,1
1
12
18
24
30
36
42
48
54
60
66
72
78
Tijd (minuten)
(Afbeelding 15: De brekingsindex van bloeddruppel A uitgezet tegen de tijd (vervolg) )
25
Brekingsindex
Druppel B
2
1,9
1,8
1,7
1,6
1,5
1,4
1,3
1,2
1,1
1
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Tijd (minuten)
(Afbeelding 16: De brekingsindex van bloeddruppel B uitgezet tegen de tijd. Gemiddelde brekingsindex:
1,54)
Druppel C
2
Brekingsindex
1,9
1,8
1,7
1,6
1,5
1,4
1,3
1,2
1,1
1
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Tijd (minuten)
18
20
22
24
(Afbeelding 17: De brekingsindex van bloeddruppel C uitgezet tegen de tijd. Gemiddelde brekingsindex:
1,54)
26
26
Aangezien het in het programma waarmee de OCT bestuurd wordt niet mogelijk is om
periodieke metingen te doen zijn de datapunten van de drie bovengetoonde grafieken niet
allen op exact hetzelfde tijdstip gemaakt. Om de datapunten toch met elkaar te kunnen
vergelijken werd een benadering bedacht. Om de 100 seconden (op het tijdstip 100, 200,
300, etc) is bij elke grafiek met lineaire interpolatie bepaald wat de waarde van de
brekingsindex voor dat tijdstip is tussen twee gemeten datapunten. Zo kon er een tabel
worden gecreëerd van de brekingsindex tegen dezelfde waarden van de tijd voor alle drie
de bloeddruppels. Uit deze tabel werd een gemiddelde brekingsindex per tijdspunt
berekend. De grafiek hiervan is hieronder te zien (afbeelding 18). Als foutenbalk is
hierbij de standaarddeviatie van de drie meetpunten gegevenVervolgens is ook het
gemiddelde genomen van alle meetpunten en deze waarde is als een rechte lijn geplot in
dezelfde afbeelding. De gevonden waarde is 1,53
De gemiddelde brekingsindex met standaarddeviatie
1,65
1,63
1,61
Brekingsindex
1,59
1,57
1,55
1,53
1,51
1,49
1,47
1,45
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900 1000 1100 1200 1300 1400 1500
Tijd (s)
(Afbeelding 18: De gemiddelde brekingsindex per tijdseenheid van drie bloeddruppels uitgezet tegen de
tijd )
27
4.2 Verzwakkingscoëfficiënt
In de onderstaande grafiek is het verloop van de verzwakkingscoëfficiënt tegen de tijd
van de drie verschillende bloeddruppels te zien.
9
8
7
μ (mm^-1)
6
5
4
3
2
1
0
-1
0
1000
2000
3000
4000
5000
Tijd (s)
(Afbeelding 19: verzwakkingscoëfficiënt μt van drie bloeddruppels met verschillend beginvolume uitgezet
tegen de tijd)
28
5. Discussie
5.1 Brekingsindex
Op afbeelding 13 is te zien hoe een bloeddruppel zich ontwikkelt van een bolvormig
druppel tot een grillige korst. Eerst scheidt het waterachtige bloedplasma zich van de rode
bloedcellen. Dit plasma is lichter en vormt daarom een laag boven de bloedcellen.
Vervolgens begint het water uit het plasma te verdampen en begint de laag rode
bloedcellen in te klinken. Bij de bepaling van de brekingsindex werd gekeken naar de
onderste laag (de bloedcellen). Aangezien het water uit deze laag verdwijnt, mag
aangenomen worden dat de concentratie van de onderste laag toeneemt. Analoog aan het
experiment van de glucoseoplossing lijkt het aannemelijk te stellen dat de brekingsindex
bij toenemende concentratie van de vloeistof toeneemt. En dus zou kunnen worden
verwacht dat de brekingsindex van het bloed ook zou toenemen tijdens de indroging van
de druppel. Dit blijkt echter in het geheel niet het geval te zijn. Als naar de ontwikkeling
van de brekingsindex tegen de tijd wordt gekeken van drie verschillende bloeddruppels
(afbeeldingen 14-17) blijkt deze vrijwel constant te blijven. Ook in de gemiddelde
waarde van drie brekingsindices (afbeelding 18) blijkt geen duidelijke stijging of daling
te zitten. Alleen laat afbeelding 18 zien, dat in de eerste ca 400 sec de brekingsindex
enigszins toeneemt vanaf ca 1,45.
De totale brekingsindex bleek 1,53 te zijn. Deze waarde is te vergelijken met de
brekingindex van glas. Uit het onderzoek van Sardar en Levy [8] kwam een
brekingsindex van 1,38. Echter, in deze experimenten zijn antistollingsmiddelen gebruikt,
waardoor de resultaten anders zouden kunnen zijn. De constatering dat de brekingsindex
tijdens de indroging van de druppel weinig verandert binnen ons ruisniveau is
opmerkelijk. In paragraaf 3.4 werd aangetoond dat de gebruikte methode om de
brekingsindex te meten een geschikte is. Daarom mag ervan uitgegaan worden dat deze
constatering wel klopt. En kan op basis van dit onderzoek worden geconcludeerd dat de
brekingsindex van een ingedroogde menselijke bloeddruppel op een glasplaat bij
kamertemperatuur 1,53 is.
Om een beter begrip van de ontwikkeling van de brekingsindex van bloed buiten het
lichaam te verwerven ligt een aantal vervolg onderzoeken voor de hand. Zo zou het
onderzoek kunnen worden herhaald met verschillende ondergronden, temperatuur in de
ruimte, of vorm en volume van de druppel. Ook de invloed van antistollingsmiddelen op
het resultaat moet nader worden onderzocht. Tenslotte verdient het gedrag bij korte tijd
(0-300 sec.) verdere aandacht.
29
5.2 Verzwakkingscoëfficiënt
In afbeelding 19 zijn de drie grafieken van de verzwakkingscoëfficiënt μt tegen de tijd
van de drie verschillende druppels samen weergegeven. De verzwakkingscoëfficiënt is
eerst laag (μt ≈1), neemt dan toe tot een maximale waarde en neemt vervolgens af tot nul.
Dit is kwalitatief ook te zien in afbeelding 13.
In eerste instantie is de bloeddruppel een behoorlijk homogene vloeistof waarin weinig
verstrooiing optreedt. Daarbij is de verzwakkingscoëfficiënt in eerste instantie laag. Met
verloop van de tijd treedt er echter een scheiding op tussen het bloedplasma en de rode
bloedcellen. Xu [9] schrijft in zijn artikel over bloed dat de voornaamste bron van
verstrooiing in bloed het verschil in brekingsindex tussen het cytoplasma van de rode
bloedcellen en het bloedplasma is. Er begint nu dus verstrooiing op te treden en daarbij
neemt de verzwakkingscoëfficiënt in de grafiek toe. Gelijktijdig verdampt ook het water
uit het plasma uit de druppel en neemt dus de concentratie van de rode bloedcellen toe.
Dit leidt tot nog meer verstrooiing en een verdere stijging van de
verzwakkingscoëfficiënt. De verzwakkingscoëfficiënt vertoont een piek en neemt vanaf
dat moment af. Dit zou geïnterpreteerd kunnen worden dat geleidelijk de concentratie
rode bloedcellen zo hoog wordt dat ze grotere structuren gaan vormen. Het licht wordt
daardoor minder vaak verstrooid. Indien aangenomen wordt dat de verzwakking
voornamelijk veroorzaakt wordt aan het oppervlak van de rode bloedcellen, neemt
daardoor de verzwakkingscoëfficiënt af. Uiteindelijk is het water uit de druppel verdampt
en blijft er een harde korst over, die vrijwel helemaal uit rode bloedcellen bestaat.
Brekingsindex overgangen tussen plasma en cellen zijn er nu dus vrijwel niet meer.
Daardoor is de verstrooiing nu klein en gaat de verzwakkingscoëfficiënt naar nul toe.
Naast de grafiek van afbeelding 19 zijn ook afbeeldingen van de drie druppels
weergegeven vlak nadat ze op het dekglaasje gelegd waren. De kleur die de afbeelding
van de druppels omringd is ook de kleur waarmee de datapunten in de grafiek zijn
weergegeven. De drie plots hebben een gelijke vorm. Er is een heel duidelijk verband te
zien: hoe hoger het volume van de druppel, des te hoger is de maximale waarde van de
verzwakkingscoëfficiënt en des te langer duurt het voor deze weer nul wordt. Tijdens het
onderzoek is gebleken dat druppels met een groter volume langer duurt om helemaal
opgedroogd te raken. Daarom duurt het voor druppels met een groter volume langer tot
de verzwakkingscoëfficiënt weer nul is. Het is interessant op te merken dat de maximale
waarde van de verzwakkingscoëfficiënt ongeveer schaalt met de lineaire afmeting van de
druppel (bijvoorbeeld de hoogte van de druppel b in tabel 3) en niet met het volume. We
lijken de verzwakking langs een min of meer rechte lichtweg te zien. Door de ruis in de
data zijn kwantitatieve uitspraken op basis van deze data niet mogelijk.
30
Een mogelijke fysische verklaring van de waarnemingen is de volgende: stel dat de
druppel bestaat uit een vloeistof en een groot aantal verstrooiers, de rode bloedcellen.
Voor het gemak kunnen we ons voorstellen dat dit bolletjes zijn. Het licht wordt nu
verstrooid van bol naar bol, en bij iedere verstrooiing verzwakt. Als de concentratie van
de bollen toeneemt, neemt de verstrooiing toe en daarmee ook de verzwakking. Want het
licht ziet langs zijn weg steeds meer bollen. Dit is de aanvankelijke toename van μt in de
tijd. Als de concentratie verder toeneemt gaan de bollen samenklonteren en vormen
grotere structuren, die voor het gemak als grotere bollen voorgesteld kunnen worden. Hoe
groter deze bollen worden, hoe minder individuele verstrooiingen optreden en daarom
neemt de verzwakking langs het lichtpad af, terwijl het verstrooiingspatroon hetzelfde
blijft. Deze verklaart mogelijk de afval van μt naar nul voor grotere tijden.
Om de verzwakkingscoëfficiënt van bloed beter te onderzoeken zou het nuttig zijn om
ook een transmissie meting te doen op een bloeddruppel tijdens zijn indroging. De
daarmee gevonden verzwakkingscoëfficiënt zou dan vergeleken kunnen worden met die
uit dit verslag. Deze metingen kunnen worden uitgevoerd werken met een losse lichtbron
en losse detector, die bijvoorbeeld achter de druppel wordt opgesteld.
De waargenomen afhankelijkheid van de maximale verzwakkingscoëfficiënt van de
druppelgrootte vereist een gedetailleerde studie met de gebruikte OCT apparatuur.
6. Conclusie
OCT is gebruikt om de verandering van de brekingsindex van bloed over de tijd waar te
nemen. De brekingsindex van bloed bleek tijdens de indroging van de druppel nauwelijks
te veranderen. Alleen in de eerste paar minuten leek de brekingsindex toe te nemen.
Daarna werd een constante brekingsindex per druppel waargenomen. De gemiddelde
brekingsindex van de drie druppels was 1,53. Deze waarde is hoger dan eerder
waargenomen, maar de meetomstandigheden in het eerdere werk waren wat anders. De
verzwakkingscoëfficiënt van het deel van de druppel met een hoge concentratie rode
bloedcellen neemt eerst toe tot een maximum en na verloop van tijd geleidelijk af tot nul.
Bloeddruppels met een groter volume hebben ook een hogere maximale
verzwakkingscoëfficiënt en het duurt bij grotere druppels langer tot de
verzwakkingscoëfficiënt weer nul is.
Het is duidelijk dat op dit gebied nog veel interessant onderzoek gedaan kan worden.
Meer metingen en hun analyse zijn nodig om een model te maken waaruit op grond van
OCT waarnemingen en verdere spectroscopische analyse de tijd waarin bloed buiten het
lichaam is kan worden bepaald.
31
7. Referenties
1. Nederlands Forensisch Instituut (NFI), De Essenties van forensisch DNA-onderzoek,
Den Haag, 2008
2. Physiology 5th edition, Robert M. Berne Ed., Mosby, St. Louis, 2004
3. Grant R. Fowles, Introduction to modern optics, Dover Publications, New York, 1989
4. Optical Coherence Tomography: Technology and Applications, Wolfgang Drexler en
James G. Fujimoto Eds., Springer, 2008
5. Dirk J. Faber, Functional optical coherence tomography: spatially resolved
measurements of optical properties, Thesis UvA, Amsterdam, 2005
6. http://www.santec.com/en/products/oct/octsystem
7. George M. Hale and Marvin R. Querry, Optical Constants of Water in the 200-nm
to 200-Mm Wavelength Region, Applied Optics, 1973, Vol. 12, Issue 3, pp. 555-563
8. D.K. Sardar and L.B. Levy, Optical Properties of Whole Blood, Lasers in Medical
Science, 1998, Vol. 13, Nr. 2, pp. 106-111,
9. Xiangqun Xu, Ruikang K Wang, James B Elder and Valery V Tuchin, Effect of
dextran-induced changes in refractive index and aggregation on optical properties of
whole blood, Physics in Medicine and Biology, 2003, Vol. 48, pp. 1205–1221
32