Thesis Pieter
advertisement
Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar 2014– 2015 Lokalisatie en heterologe expressie van nieuwe ribosoominactiverende eiwitten uit graangewassen Pieter Wytynck Promotor: Prof. dr. E. VAN DAMME Tutor: ir. J. DE ZAEYTIJD Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de bio-ingenieurswetenschappen: cel- en genbiotechnologie Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar 2014– 2015 Lokalisatie en heterologe expressie van nieuwe ribosoominactiverende eiwitten uit graangewassen Pieter Wytynck Promotor: Prof. dr. E. VAN DAMME Tutor: ir. J. DE ZAEYTIJD Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de bio-ingenieurswetenschappen: cel- en genbiotechnologie “De auteur en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie.” Promotor: Prof. Dr. E. VAN DAMME Begeleider: ir. J. DE ZAEYTIJD De auteur: Pieter Wytynck i ii Woord vooraf Dames en heren, bij deze is de thesis klaar. Na lange dagen, weken en maanden van werk. Ik vond het uitvoeren en het plannen van de experimenten enorm interessant, en heb het werk altijd zeer graag gedaan. Ik stond er nooit alleen voor en zou in dit deel een aantal mensen willen bedanken. Ik zou graag Professor Dr. Els Van Damme willen bedanken voor het nalezen en verbeteren van deze thesis. Daarnaast wil ik haar ook bedanken voor het deskundige advies en begeleiding tijdens mijn verblijf in de Glyco groep. Ik kon altijd terecht bij haar voor advies en zij heeft mij veel hulp geboden bij het schrijven en het indienen van mijn BOF aanvraag. Ook zou ik mijn begeleider ir. Jeroen De Zaeytijd willen bedanken. Ik kon altijd bij hem terecht met vragen en met problemen. Het was altijd enorm tof om met iemand te kunnen praten die gepassioneerd is in het onderzoek. Jeroen heeft ook steeds mijn teksten nauwkeurig verbeterd en feedback gegeven. Ik zal ook nooit onze lange microscopiesessies vergeten! Ik ben vereerd om gedurende een relatief korte tijd deel te mogen zijn van de Glyco groep. Ik zou alle leden en studenten in de Glyco groep willen bedanken voor de toffe werksfeer en het beantwoorden van mijn vragen. Ik wil ook graag mijn ouders bedanken voor alle steun en om mij de kans te geven om deze studies te doen. Daarnaast is er een zeer speciaal persoon die mij veel geholpen heeft, mijn vriendin. Zij steunde mij in alles en ving mij op als het wat tegen zat. iii iv Samenvatting Ribosoom-inactiverende proteïnen of RIP’s zijn enzymen die in staat zijn om de translatie te inhiberen. Deze eiwitten zijn in sommige gevallen toxisch voor mens en dier (bijvoorbeeld ricine en abrine). RIP’s worden aangemaakt door vele verschillende plantensoorten. Het is mogelijk dat RIP’s een rol spelen in de verdediging van planten tegen verschillende vormen van biotische en abiotische stress. Recent werden nieuwe chimere RIP’s ontdekt in het genoom van graangewassen, namelijk bij tarwe en rijst. Deze RIP’s bevatten een tot nog toe onbeschreven domeinstructuur: een RIP-domein gefuseerd met een domein dat homologie vertoont met peptidasen (het C19 of het M41 peptidase). In deze thesis werd de lokalisatie van het RIP-C19 en RIP-M41 bestudeerd. Hiervoor werden fusieconstructen aangemaakt waarbij eGFP N- of C-terminaal gekoppeld werd aan de coderende sequentie van het RIP-M41 en het RIP-C19. De sequentie voor deze constructen werd via Agrobacterium tumefaciens transient tot expressie gebracht in de bladeren van tabaksplanten. De uitgevoerde experimenten tonen aan dat het RIP-M41 en het RIP-C19 vooral aanwezig zijn in het cytoplasma. Aangezien toch beperkt wat fluorescentie werd waargenomen in de nucleus werd ook een colokalisatiestudie uitgevoerd. Hierbij werd 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) in de bladeren geïnjecteerd. Dit DAPI bindt met het DNA en kleurt de kern. Het signaal afkomstig van het eGFP (dat gekoppeld was aan de constructen) overlapte amper met DAPI. Het RIP-M41 en het RIP-C19 zijn aldus naar alle waarschijnlijkheid cytoplasmatische proteïnen. In het verleden werd getracht om het RIP-M41 en het RIP-C19 tot expressie te brengen in BY-2 cellen. Hierbij werd een signaalpeptide aan de sequentie gefuseerd om als dusdanig de proteïnen te laten terecht komen in het extracellulaire medium. Aangezien dit experiment geen aanleiding gaf tot detecteerbaar proteïne werd in deze thesis geopteerd voor een andere strategie. Er werd een ERretentiesignaal aan de eiwitten geplaatst zodat de eiwitten niet in het extracellulaire medium terecht kwamen. Wanneer na eiwitextractie western blot analyses werden uitgevoerd werden geen eiwitten gedetecteerd. Een andere strategie was de heterologe expressie in Escherichia coli. Aangezien de eiwitten cytoplasmatisch gelokaliseerd zijn, werden geen problemen verwacht bij de expressie in E. coli. De heterologe expressie gebeurde met behulp van vectoren met een induceerbare expressie. Na eiwitextractie werd eiwit gedetecteerd via western blotting in de onoplosbare fractie. v vi Afkortingen 28S 28 Svedberg (eenheid sedimentatiesnelheid) APS Ammoniumpersulfaat ATP Adenosine trifosfaat BBAP1 RIP uit Bougainvillea x buttiana Bidest Dubbel gedestilleerd water Bp Baseparen BSA Bovien serum albumine BY-2 ‘Bright Yellow 2’ CDS Coderende DNA sequentie DAP30 ‘Dianthus anti-HIV proteins, 30kDa’ DAP32 ‘Dianthus anti-HIV proteins, 32kDa’ DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole DNA Desoxyribonucleïnezuur DNase Desoxyribonuclease dNTP’s Deoxynucleotiden DTT Dithiothreitol ECL ‘Enhanced chemiluminescence’ EDTA Ethyleendiaminetetra-azijnzuur eGFP ‘Enhanced green fluorescent protein’ eIF4E Eukaryoot translatie initiatie factor 4E ER Endoplasmatisch reticulum ERAD Endoplasmatisch-reticulum-geassocieerd degradatie mechanisme GAP31 ‘Gelonium anti-HIV protein, 31 kDa’ GST ‘Glutathion S-transferase’ HIV ‘Human immunodeficiency virus’ HRP ‘Horseradish peroxidase’ IPTG Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside IRAb Type 2 RIP uit Iris IRIP Type 1 RIP uit Iris JIP60 ‘Jasmonate inducible protein of 60kDa’ Kcat Katalytische constante kDa Kilodalton vii KDEL ER-retentiesignaal LB ‘Lysogeny broth’ LRP ‘Low density protein’ M Mol/L MAP30 ‘Momordica anti-HIV protein, 30kDa’ Milli-Q Ultrapuur water uit ‘Millipore Milli-Q lab water’ system’ MVB ‘Multivesicular bodies’ OD Optische densiteit PAG Polynucleotide:adenosine glycosidase-activiteit PAP ‘Pokeweed antiviral protein’ PaP Peroxidase-antiperoxidase PBS Fosfaat buffer met zout PCR ‘Polymerase chain reaction’ PIP2 ‘Phytolacca insularis antiviral protein 2’ PMSF Fenylmethaansulfonylfluoride PR-proteïne ‘Pathogenesis related’-proteïne PVDF Polyvinylideenfluoride RIP Ribosoom-inactiverende proteïnen RIP30 RIP-gedeelte van het JIP60 RNA Ribonucleïnezuur Rnase Ribonuclease rRNA Ribosomaal ribonucleïnezuur SDS-PAGE Natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide gelektroforese SNA-I ‘Sambuccus nigra agglutinin-I’ SNA-V ‘Sambuccus nigra agglutinin-V’ TAP29 ‘Trichosanthes anti-HIV protein, 29 kDa’ TCS Trichosanthine TBST ‘Tris Buffered Saline, with Tween® 20, pH 8.0’ TEMED Tetramethylethyleendiamine tRNA Translationeel ribonucleïnezuur YEB ‘Yeast Extract Broth’ viii lipoprotein receptor-related Inhoud 1 Ribosoom-inactiverende proteïnen ................................................................................................ 1 1.1 Inleiding ................................................................................................................................... 1 1.2 Verspreiding ............................................................................................................................ 1 1.3 Classificatie .............................................................................................................................. 2 1.4 Activiteiten .............................................................................................................................. 3 1.4.1 RNA N-glycosidase-activiteit ........................................................................................... 3 1.4.2 Polynucleotide:adenosine glycosidase-activiteit (PAG) .................................................. 4 1.4.3 Andere enzymatische activiteiten ................................................................................... 4 1.4.4 Regulatie van de enzymatische activiteit ........................................................................ 6 1.5 1.5.1 Toegang tot de cel ........................................................................................................... 6 1.5.2 Cytotoxiciteit ................................................................................................................... 8 1.6 2 Gewasbescherming ............................................................................................................... 10 2.1.1 Biotische stress .............................................................................................................. 10 2.1.2 Abiotische stress............................................................................................................ 12 2.2 4 Structuur ................................................................................................................................. 9 Toepassingen in biotechnologie.................................................................................................... 10 2.1 3 Cytotoxiciteit ........................................................................................................................... 6 Medische toepassingen......................................................................................................... 13 2.2.1 Antiviraal ....................................................................................................................... 13 2.2.2 Anticarcinogeen ............................................................................................................ 14 Type 3 RIP’s ................................................................................................................................... 15 3.1 JIP60 ...................................................................................................................................... 15 3.2 RIP-M41 ................................................................................................................................. 16 3.3 RIP-C19 .................................................................................................................................. 17 Materiaal en methoden ................................................................................................................ 19 4.1 ‘Polymerase chain reaction’ .................................................................................................. 19 4.1.1 Standaard PCR ............................................................................................................... 19 4.1.2 Kolonie-PCR ................................................................................................................... 20 4.2 Agarose gelelektroforese ...................................................................................................... 20 4.3 Concentratiebepaling DNA , RNA en eiwit ............................................................................ 22 4.4 Analyse van eiwit................................................................................................................... 22 4.4.1 SDS-PAGE....................................................................................................................... 22 ix 4.4.2 Coomassiekleuring......................................................................................................... 23 4.4.3 Western blot analyse ..................................................................................................... 23 4.4.4 Bradford ......................................................................................................................... 24 4.5 4.5.1 Transformatie van competente cellen .......................................................................... 25 4.5.2 Gateway klonering......................................................................................................... 25 4.5.3 Klonering in pJET1.2....................................................................................................... 27 4.5.4 Gibson assembly ............................................................................................................ 28 4.5.5 Opzetten suspensieculturen van bacteriën ................................................................... 28 4.5.6 Glycerolstock ................................................................................................................. 28 4.5.7 Opzuiveren van plasmide-DNA ...................................................................................... 29 4.5.8 Sequentiebepaling DNA................................................................................................. 29 4.5.9 Eiwitexpressie in E. coli .................................................................................................. 29 4.6 5 Tabak en tabakscellen ........................................................................................................... 30 4.6.1 Triparentale mating ....................................................................................................... 30 4.6.2 Transiënte transformatie van tabaksbladeren .............................................................. 31 4.6.3 Infiltratie van DAPI in tabaksbladeren ........................................................................... 32 4.6.4 Stabiele transformatie van BY-2 cellen ......................................................................... 32 4.6.5 Screenen op fluorescentie ............................................................................................. 33 4.6.6 Extractie van nucleïnezuren uit BY-2 cellen .................................................................. 33 4.6.7 Eiwitextractie uit BY-2 suspensiecultuur ....................................................................... 34 Resultaten...................................................................................................................................... 35 5.1 6 Escherichia coli en Agrobacterium tumefaciens .................................................................... 25 Lokalisatie van RIP-M41 en RIP-C19 ...................................................................................... 35 5.1.1 Aanmaak van de lokalisatieconstructen ........................................................................ 35 5.1.2 Transformatie van Agrobacterium tumefaciens............................................................ 39 5.1.3 Transiënte expressie in Nicotiana benthamiana ........................................................... 39 5.2 Colokalisatie van RIP-M41 en RIP-C19 met DAPI .................................................................. 40 5.3 Heterologe expressie van RIP-M41 en RIP-C19 in BY-2 cellen .............................................. 41 5.3.1 KDEL-constructen .......................................................................................................... 42 5.3.2 Expressie in E. coli .......................................................................................................... 50 Discussie ........................................................................................................................................ 57 6.1 Lokalisatie .............................................................................................................................. 57 6.2 Heterologe expressie ............................................................................................................. 59 6.2.1 Heterologe expressie in BY-2 cellen .............................................................................. 59 x 6.2.2 Heterologe expressie in E. coli ...................................................................................... 62 7 Conclusie en ideeën voor verder onderzoek ................................................................................ 66 8 Referenties .................................................................................................................................... 67 9 Bijlagen .......................................................................................................................................... 80 9.1 Gebruikte primers ................................................................................................................. 80 9.2 DNA sequenties RIP-M41 en RIP-C19.................................................................................... 83 9.3 Vectoren ................................................................................................................................ 84 9.3.1 Lokalisatie en colokalisatie ............................................................................................ 84 9.3.2 Heterologe expressie in BY-2 cellen .............................................................................. 88 9.3.3 Heterologe expressie in E. coli ...................................................................................... 90 9.4 Foto’s lokalisatie en colokalisatie .......................................................................................... 92 9.4.1 Lokalisatie in blad van N. benthamiana ........................................................................ 92 9.4.2 Colokalisatie in blad van N. benthamiana ..................................................................... 97 xi 1 Ribosoom-inactiverende proteïnen 1.1 Inleiding Ribosoom-inactiverende proteïnen (RIP’s) zijn proteïnes die de ribosomen irreversibel inhiberen waardoor de translatie in de cel stopt (Nielsen K., Boston S. R. 2001). Het belang van ribosoominactiverende proteïnen (RIP’s) voor de verdediging van de plant werd voor het eerst beschreven in 1925. Toen werd opgemerkt dat bepaalde componenten uit extracten van Phytolacca americana waarin het RIP PAP (“pokeweed antiviral protein”) voorkomt beschikken over antivirale eigenschappen (Irvin J. D. 1983). Men heeft ontdekt dat in sommige planten de expressie van RIP’s wordt opgereguleerd bij senescentie (Chaudhry B. et al. 1994, Rippmann J. F. et al. 1997, Stirpe F. et al. 1996), verschillende types van stress (Reinbothe S. et al. 1994, Rippmann J. F. et al. 1997, Stirpe F. et al. 1996), virale infectie (Girbés T. et al. 1996, Iglesias R. et al. 2005) en door micro-organismen (Wong R. N. S. et al. 1995). Al deze data wijzen op een rol van de RIP’s in de verdediging van de plant. Ook vanuit de medische wereld is er interesse in de RIP’s (Stirpe F. en Battelli M. G. 2006) omwille van het feit dat sommige RIP’s meer toxisch zijn voor tumorcellen dan voor normale cellen en de cytotoxische activiteit van RIP’s in het algemeen. Deze RIP’s zouden dus gebruikt kunnen worden voor het maken van antitumor geneesmiddelen (Lin J. Y. et al. 1970, Zou L. B., Zhan J. B. 2005). Tevens is er op medisch vlak ook interesse in de antivirale eigenschappen van RIP’s, bijvoorbeeld voor de bestrijding van het HIV-virus (McGrath M. S. et al. 1989, Zarling J. M. et al. 1990) en andere virussen (Kaur I. et al. 2013). In het eerste deel van deze thesis zal het voorkomen, de classificatie, de activiteiten en de structuur van RIP’s besproken worden en tenslotte zal dieper worden ingegaan op hun mogelijke toepassingen. 1.2 Verspreiding RIP’s werden voor het eerst ontdekt in extracten van Phytolacca americana (Irvin J. D. 1983), maar werden later ook teruggevonden in een groot aantal planten van taxonomisch uiteenlopende families zoals de Caryophyllaceae, Cucurbitaceae, Euphorbiaceae, Nyctaginaceae, Phytolaccaceae en de Poaceae (Peumans W., Van Damme E. 2010). De RIP’s zijn wijdverspreid over het plantenrijk en in verschillende concentraties aanwezig in veel verschillende planten (Stirpe F., Battelli M. G. 2006). De meeste RIP’s werden geïsoleerd uit bladeren, stengels en zaden (Wang S. et al. 2012). Sommige RIP’s zijn zeer bekend omwille van hun toxiciteit voor de mens (bijvoorbeeld ricine) (Peumans W., Van Damme E. 2010). Toch worden sommige RIP bevattende planten rauw gegeten zoals tomaten (Barbieri L. et al. 2006) en spinazie (Ishizaki, T. et al. 2002, Prestle J. et al. 1992). Ook een aantal graangewassen bevatten RIP’s waaronder tarwe, maïs en gerst (Coleman W. H., Roberts W. K. 1982). Aangezien er geen genen voor ribosoom-inactiverende proteïnes aanwezig zijn in Arabidopsis thaliana is het duidelijk dat de RIP-genen niet geconserveerd zijn over het hele plantenrijk en dat RIP’s dus geen functie hebben in een universeel proces (Stirpe F. 2013). Genen voor RIP’s werden ook buiten het plantenrijk teruggevonden in verschillende bacteriën, fungi (Nielsen K., Boston S. R. 2001) en in ten minste één alg namelijk in Laminaria japonica (Girbés T. et al. 2004). Lapadula W. J. et al. (2013) vonden ook RIP-genen in twee insecten, namelijk de muggen Aedes aegypti en Culex 1 quinquefasciatus. In cellen en weefsels van zoogdieren werd er een glycosylase-activiteit opgemerkt die gelijkaardig was aan die van RIP’s, maar deze was eerder zwak en het proteïne kon niet opgezuiverd worden (Barbieri L. et al. 2001). 1.3 Classificatie Ribosoom-inactiverende proteïnes worden geclassificeerd als EC 3.2.2.22 N-glycosidasen die een geconserveerde lus herkennen in het 23S/25S/28S rRNA (de Virgilio M. et al. 2010). Dit wil zeggen dat RIP’s een specifieke adenine verwijderen uit het ribosomaal RNA. RIP’s worden in drie groepen onderverdeeld naargelang hun structuur (Mundy, J. et al. 1994). De verschillende groepen, samen met enkele typevoorbeelden, zijn weergegeven in Figuur 1. De eerste groep omvat de type 1 RIP’s die bestaan uit slechts een RNA N-glycosidase-domein. De meeste type 1 RIP’s zijn intacte polypeptiden van +/- 30 kDa, doch zijn er ook type 1 RIP’s waarvan de 30kDa keten in twee stukken geknipt wordt. Deze zogenaamde tweeketen type 1 RIP’s (“two-chain type 1 RIP’s”) bestaan uit een alpha- en een beta-keten die samengehouden worden door nietcovalente bindingen (Peumans W. J. et al. 2001). De tweede groep bevat de type 2 RIP’s die bestaan uit twee domeinen. Het amino-terminale gedeelte (de A-keten) is een RNA N-glycosidase-domein gelijkaardig aan de type 1 RIP’s. Het carboxyterminale domein (de B-keten) is een lectine-domein en kan dus met suikerstructuren binden. Deze domeinen zijn samen aanwezig op een precursor eiwit. Gedurende de post-translationale modificatie van het eiwit zullen de domeinen gescheiden worden van elkaar door het uitknippen van een linkerpeptide, maar de domeinen blijven verbonden door een disulfidebinding (Peumans W. J. et al. 2001). Een derde groep bevat de type 3 RIP’s. De type 3 RIP’s bestaan eveneens uit twee domeinen, namelijk een amino-terminaal gedeelte met RNA N-glycosidase-activiteit en daaraan gekoppeld een carboxy-terminaal niet-lectine-domein (Peumans W. J. et al. 2001). Figuur 1: Illustratie van de verschillende types van RIP’s (figuur naar Peumans W. J. et al. 2001). 2 1.4 Activiteiten 1.4.1 RNA N-glycosidase-activiteit RIP’s zijn enzymen die de eiwitsynthese kunnen verhinderen door het ribosomaal RNA (rRNA) irreversibel te modificeren waardoor de translatie niet kan doorgaan. Het modificeren van het rRNA gebeurt niet willekeurig maar volgens een specifiek mechanisme. Zo wordt een welbepaald adenineresidu verwijderd uit een geconserveerd deel van het 28S ribosomaal RNA, de sarcine/ricine lus genaamd. Deze enzymatische activiteit van RIP’s wordt aangeduid met de term “rRNA Nglycosidase-activiteit” (Peumans W. J. et al. 2001). De sarcine/ricine lus, ook wel alfa-sarcine lus genoemd, is een regio van 14 nucleotiden. De adenine die specifiek verwijderd wordt uit deze lus is de eerste van de zogenaamde GAGA sequentie, nl. adenine 4324 in rRNA uit de lever van ratten (Figuur 2) (Correll C. C. et al. 1998, Endo Y., Tsurugi K. 1988, Gutell R. R. et al. 1993, Orita M. et al. 1993). Deze alpha-sarcine lus is universeel geconserveerd en noodzakelijk voor de correcte werking van de ribosomen. Ook heel wat ribotoxines (niet enkel de RIP’s) hebben deze alpha-sarcine lus als doelwit voor hun activiteit (Xinying S. et al. 2012). De modificatie van het ribosomaal rRNA door RIP’s is irreversibel en verhindert de binding van elongatiefactor 2 aan het ribosoom, waardoor het onmogelijk wordt voor het ribosoom om de translatie verder te zetten (Nielsen K., Boston S. R. 2001). De Kcat (dit is het aantal substraat moleculen dat gemodificeerd wordt per molecule enzym per seconde of per minuut) voor de toxische RIP’s ricine en abrine bedraagt 103 min-1 voor ribosomen uit andere organismen dan planten. Dit wil zeggen dat slechts één molecule van deze RIP’s voldoende is om een dierlijke cel te doden (Olsnes S., Pihl A. 1982). Figuur 2: Voorstelling van het 28S rRNA en de werking van RIP’s (Stirpe F. et al. 1992, Stirpe F., Battelli M. G. 2006). Tussen de verschillende RIP’s zijn er grote verschillen in substraatspecificiteit (Peumans W. J. et al. 2001). Ricine is bijvoorbeeld zeer actief ten opzichte van de ribosomen van zoogdieren maar weinig tot niet actief ten opzichte van ribosomen van planten en E. coli (Barbieri L. et al. 1993). PAP daarentegen is actief tegenover ribosomen van zowel planten, dieren als bacteriën (Peumans W. J. et al. 2001). Er werd opgemerkt dat type 1 RIP’s vaak een vrij brede substraatspecificiteit hebben terwijl 3 type 2 RIP’s vaak actiever zijn tegen dierlijke ribosomen. Aangezien de rRNA sequentie die het doelwit is van de RIP’s geconserveerd is, ligt de basis van de substraatspecificiteit bij de ribosomale proteïnes en in de structuur van de verschillende RIP’s (Peumans W. J. et al. 2001). Opdat RIP’s hun activiteit kunnen uitvoeren, moeten ze eerst binden aan ribosomale proteïnes. De complementariteit van de RIP’s en hun bindingspartner (het specifieke ribosomale proteïne) is dus zeer belangrijk. Zo zijn bijvoorbeeld de L9 en L10e ribosomale proteïnen in de levercellen van de rat de bindingspartners voor de ricine A-keten terwijl het L3 ribosomale proteïne in gist zal associëren met PAP (Hudak K. A. et al. 1999, Vater C. A. et al. 1995). RIP’s zijn ook actief op vrij rRNA, hoewel minder efficiënt in vergelijking met het rRNA in de ribosomen (Endo Y. et al. 1991). Waarschijnlijk kunnen RIP’s naakt rRNA herkennen uit ribosomen waartegen deze RIP’s actief zijn. Er zijn echter ook RIP’s die naakt RNA kunnen depurineren van ribosomen waar diezelfde RIP’s niet actief tegenover zijn. Dit wijst op het feit dat de ribosomale proteïnen belangrijk zijn bij de herkenning. Naakt rRNA is waarschijnlijk niet belangrijk als fysiologisch doelwit van de RIP-activiteit in vivo aangezien RIP’s veel actiever zijn tegenover RNA in de ribosomen (Peumans W. J. et al. 2001). 1.4.2 Polynucleotide:adenosine glycosidase-activiteit (PAG) Verschillende RIP’s zijn in staat om verschillende adenines te verwijderen van het rRNA buiten de alpha-sarcine loop (Barbieri L. et al. 1992). Sommige RIP’s reageren met DNA uit haring sperma, poly(A) en tRNA (Barbieri L. et al. 1994, Barbieri L. et al. 1997). Een aantal RIP’s zijn in staat om te reageren met RNA van het tabaksmozaïekvirus (Barbieri L. et al. 1997) of met RNA’s met een 5’ cap (Hudak K. A. et al. 2000). Bepaalde RIP’s kunnen ook inwerken op nucleair en mitochondriaal DNA uit zoogdieren (Barbieri L. et al. 2000). RIP’s verschillen van elkaar in hun substraatspecificiteit (Peumans W. J. et al. 2001). Naast het verwijderen van adenine residuen werden ook gevallen beschreven waar RIP’s guanine residuen verwijderen van zowel prokaryoot als eukaryoot RNA (Peumans W. J. et al. 2001). PAP en ricine bijvoorbeeld zijn in staat om guanine 4323 te verwijderen uit de alpha-sarcine lus in ribosomen uit ratten (Endo Y. et al. 1987). 1.4.3 Andere enzymatische activiteiten Naast de RNA N-glycosidase-activiteit en de polynucleotide:adenosine glycosidase-activiteit zijn er nog heel wat andere activiteiten die aan RIP’s worden toegeschreven. De meeste ervan zijn gerelateerd met DNase- of RNase-activiteit (Peumans W. J. et al. 2001). Andere mogelijke activiteiten die beschreven zijn voor sommige RIP’s zijn: fosfatase-activiteit op lipiden en nucleotiden, chitinaseactiviteit en superoxidedismutase-activiteit (Chen H. et al. 1996, Helmy M. et al. 1999, Li X. D. et al. 1996, Remi Shih N. R. et al. 1997). Het verschil van PAG en N-glycosidase-activiteit met DNAse- en fosfatase-activiteit is weergegeven in Figuur 3. De DNase- en fosfatase-activiteit zijn gericht op het verbreken van een verbinding tussen zuurstof en fosfor. Terwijl de PAG-activiteit een verbinding tussen stikstof en koolstof verbreekt. 4 Figuur 3: Illustratie van de verschillende mogelijke activiteiten van RIP’s (Domashevskiy A. V., Goss D. J. 2015). De verschillende enzymatische activiteiten van RIP’s zijn weergegeven in Tabel 1. Tabel 1: Enzymatische activiteiten van RIP’s (tabel naar Peumans W. J. et al. 2001. Referenties: Barbieri L. et al. 1997, Chen H. et al. 1996, Endo Y. et al. 1987, Endo Y., Tsurugi K. 1987, Girbes T. et al. 1993, Habuka N. et al. 1991, Helmy M. et al. 1999, Li M. X. et al. 1991, Mock J. W. et al. 1996, Nicolas E. et al. 1997, Nicolas E. et al. 1998, Nicolas E. et al. 2000, Prestle J. et al. 1992, Remi Shih N. R. et al. 1997, Roncuzzi L., Gasperi-Campani A. 1996, Taylor B. E., Irvin J. D. 1990) Activiteit Substraat Product RIP RNA N-glycosidase Ribosomen: Dier Plant Bacterie Adenine Adenine Adenine Alle RIP’s Meeste type 1 en sommige type 2 RIP’s Meeste type 1 en sommige type 2 RIP’s Polynucleotide:adenosine glycosidase Nucleïnezuren Adenine Alle RIP’s Ribonuclease RNA, poly(U) Geknipt RNA Α en β momorcharine DNase Supercoiled DNA Lineair en geknipt (knicked)DNA Trichosanthine, saporine, gelonine DNA glycosidase/AP lyase DNA (supercoiled en lineair) Adenine Ricine, gelonine, PAP Fosfatase Fosfolipide AMP Ricine, trichosanthine Chitinase Chitine Trichosanthes kirilowii RIP 5 1.4.4 Regulatie van de enzymatische activiteit De aanwezigheid van cofactoren is belangrijk voor de activiteit van verschillende RIP’s. Zo hebben bijvoorbeeld gelonine en PAP nood aan ATP voor hun enzymatische activiteit maar saporine en momordine niet (Carnicelli D. et al. 1992). Ook tRNA’s kunnen de activiteit van RIP’s beïnvloeden. Tritine-S bijvoorbeeld wordt gelijkaardig gestimuleerd door verschillende tRNA’s, maar gelonine wordt enkel gestimuleerd door tRNAtrp van zoogdieren en van vogels (Brigotti M. et al. 1995, Brigotti M. et al. 1996, Brigotti M. et al. 1998, Brigotti M. et al. 1999). Er zijn ook inhibitoren van RIP’s geïdentificeerd. Niet verassend blijkt adenine een inhibitor te zijn van de enzymatische activiteit van RIP’s. Adenine wordt vrijgesteld door zowel de RNA N-glycosidaseactiviteit als de polynucleotide:adenosine glycosidase-activiteit van RIP’s. Adenine gedraagt zich in dat geval als een oncompetitieve inhibitor van RIP’s door te gaan binden aan het enzym-substraat complex (Pallanca A. et al. 1998). Andere inhibitoren zoals bijvoorbeeld pteroïnezuur kunnen de activiteit van ricine inhiberen (Yan X. et al. 1997). 1.5 Cytotoxiciteit De toxiciteit van verscheidene RIP’s kan sterk verschillen (Battelli M. G. 2004, Stirpe F. 2004). De redenen hiervoor zijn waarschijnlijk te vinden in de binding aan moleculen op het oppervlakte van cellen en de mogelijkheid van een RIP om het cytoplasma van de cel te bereiken. Andere redenen zijn degradatie en mogelijke exocytose van de proteïnen (Stirpe F., Battelli M. G. 2006). De toxiciteit van RIP’s werd vooral beschreven in dierlijke cellen. Maar RIP’s kunnen ook toxisch zijn ten opzichte van plantencellen. In zoogdiercellen werd aangetoond dat door de schade aan het 28S rRNA een speciale kinase pathway geïnduceerd kan worden, die apoptose veroorzaakt. Dit wordt de ribotoxische stress respons genoemd (Iordanov M. S. et al. 1997). Het is dus mogelijk dat RIP’s apoptose kunnen induceren door de ribosomen te beschadigen. 1.5.1 Toegang tot de cel 1.5.1.1 Verschil tussen type 1 en type 2 RIP’s Type 2 RIP’s zijn in staat om te binden aan suikerstructuren (meestal galactose) die aanwezig zijn aan de oppervlakte van cellen. Deze binding kan leiden tot de opname van het RIP in de cel. De manier waarop type 2 RIP’s in de cellen binnenkomen en wat er met de RIP’s gebeurt, is voor enkele RIP’s onderzocht (Stirpe F. 2005). Type 1 RIP’s hebben geen lectine-domein en worden daardoor veel minder efficiënt opgenomen door cellen. Maar indien deze type 1 RIP’s toch in de cel kunnen binnendringen kunnen ze in sommige gevallen even toxisch zijn als de toxische type 2 RIP’s. Type 1 RIP’s kunnen de cel binnenkomen via pinonocytose (Madan S., Ghosh P. C. 1991) of door de α2-macroglobuline receptor (‘low density lipoprotein receptor-related protein’)(Cavallaro U. et al. 1995). Wanneer men type 1 RIP’s of de RIP-domeinen van type 2 RIP’s vastmaakt aan antilichamen of groeifactoren kunnen ze ook in de cel terechtkomen. Dit heeft dan ook mogelijke toepassingen in de geneeskunde (zie later). 1.5.1.2 Mechanisme Veel onderzoek naar de internalisering van RIP’s werd gedaan met ricine doch niet alle type 2 RIP’s volgen dezelfde weg als ricine (Walsh M. J. et al. 2013). Hieronder wordt ricine besproken als een voorbeeld van internalisatie van type 2 RIP’s in de cel. 6 Vooraleer RIP’s hun toxische effecten kunnen uitvoeren moeten ze eerst tot in het cytosol geraken. In eerste instantie moeten RIP’s binden aan glycoproteïnen of glycolipiden aan de oppervlakte van de cel. Voor verschillende RIP’s werden verschillende endocytose processen gerapporteerd. De endocytose van sommige RIP’s is afhankelijk van clathrine (Barbieri L. et al. 1993). In dit proces speelt het trans-golgi-netwerk een zeer belangrijke rol (Sandvig K., van Deurs B. 1996). Proteïnen die een signaal (KDEL) hebben om terug te keren naar het endoplasmatisch reticulum (ER), worden getransporteerd tot het trans-golgi-netwerk en keren dan dankzij dat KDEL-signaal terug naar het ER (Stirpe F., Battelli M. G. 2006). Type 2 RIP’s zoals ricine bevatten een lectine-domein dat in het geval van ricine galactose kan binden. Galactose is vaak aanwezig in de suikerstructuren van geglycosyleerde proteïnen. Het is mogelijk dat ricine via zijn lectine-domein bindt aan een geglycosyleerd proteïne dat een dergelijke KDEL-sequentie bevat. Daardoor zou ricine mee kunnen liften met dit proteïne naar het ER (Lord J. M., Roberts L. M. 1998). In het ER kunnen dan de A- en de B-keten van ricine gescheiden worden van elkaar door proteïne disulfide isomerase (Spooner R. A. et al. 2004). De vrije ricine A-keten kan dan naar het cytosol migreren. Er zijn aanwijzingen dat dit gebeurt via het endoplasmatisch reticulum associated degradation mechanisme of ERAD. De vrije Aketen kan door de cel herkend worden als een onvolledige polypeptide. Het is aangetoond dat de Aketen kan interageren met het ER membraan (en met negatief geladen lipide vesikels). Door die interactie zou de A-keten een beter substraat worden voor de ERAD pathway (Lombardi A. et al. 2010, Mayerhofer P. U. et al. 2009). Normaal gezien worden dergelijke proteïnen naar het cytosol getransporteerd, gepolyubiquitinyleerd en vervolgens afgebroken door het proteasoom (Tsai B. et al. 2002). De ricine A-keten kan getransporteerd worden naar het cytosol, maar zou daarna ontsnappen aan de degradatie (Lord J. M., Roberts L. M. 1998, Rapak A. et al. 1997), waarschijnlijk omdat ricine vrij weinig lysine bevat (Deeks E. D. et al. 2002). In het cytosol kan de A-keten inwerken op de ribosomen. De mogelijkheid van ricine om het proteasoom te ontwijken is zeer belangrijk voor de toxiciteit ervan (Roberts L. M., Lord J. M. 2004). In Figuur 4 zijn de verschillende wegen weergegeven waarlangs ricine, saporine (type 1 RIP) en trichosanthine (type 1 RIP) toegang krijgen tot het cytosol van dierlijke cellen. In Figuur 4.A is te zien hoe ricine bindt met galactose-bevattende glycoproteïnes die op het celoppervlak voorkomen. Na endocytose zal ricine via endosomen naar de lysosomen (niet in de figuur) gaan, of via endosomale sortering naar het trans-golgi-netwerk (Amessou M. et al. 2007). Dan zal ricine naar het ER getransporteerd worden waar de A- en de B-keten zullen gescheiden worden. De A-keten zal dan via ERAD in het cytosol terecht komen. De A-keten kan dan ontsnappen aan degradatie en hervouwen in het cytosol (Li S. et al. 2010). Dit hervouwen in het cytosol gebeurt deels dankzij chaperones (Spooner R. A. et al. 2008). In Figuur 4.B is de opname van saporine geïllustreerd. Saporine bindt aan de cel via een ‘low density lipoprotein receptor-related protein’ of LRP. Na de binding zal er endocytose plaatsvinden en op een nog onbekende manier zal saporine in het cytosol terecht komen. In Figuur 4.C is te zien dat trichosanthine in “Multivesicular bodies” of MVB’s kan terecht komen. Wanneer deze MVB’s fuseren met het plasmamembraan komen vesikels met trichosanthine erin vrij. Deze vesikels difunderen en smelten samen met andere cellen (de Virgilio, M. et al. 2010). 7 Figuur 4: De verschillende mechanismen waardoor ricine (A), saporine (B) en trichosanthine (C) toegang krijgen tot het cytosol van dierlijke cellen. RTA is de A-keten van ricine, RTB is de B-keten van ricine (de Virgilio M. et al. 2010). 1.5.2 Cytotoxiciteit RIP’s kunnen verschillende pathways activeren die leiden tot apoptose. Zhang C. Y. et al. (2000) toonden aan dat cellen (menselijke choriocarcinoma cellen) die behandeld werden met trichosanthine apoptose ondergingen. Wanneer men echter α-tocopherol (beschermt de cel tegen schade veroorzaakt door reactieve zuurstofspecies) toediende aan deze cellen verhoogden de overlevingskansen van deze cellen aanzienlijk. Hieruit kan besloten worden dat door de behandeling met trichosanthine de cellen meer reactieve zuurstof species zullen produceren. Uit onderzoek van Komatsu N. et al. (1998) en Oda T. et al. (1998) bleek dat wanneer men inhibitoren toevoegde tegen serine proteasen en caspasen dat ricine geen apoptose meer kan induceren (Komatsu N. et al. 1998, Oda T. et al. 1998). In een tweede onderzoek werd opgemerkt dat ricine ook in staat is om geprogrameerde celdood te induceren via de redox regulatie van de thiol-groep van proteïnen. Deze twee pathways (apoptose door redox regulatie en de caspase-pathway) om apoptose te induceren bleken onafhankelijk te zijn van elkaar (Oda T. et al. 1999). Ook werd er aangetoond dat tumornecrosis-factor-α belangrijk is in de apoptose die veroorzaakt wordt door ricine (Hassoun E., Wang X. 2000). Dit wijst op de mogelijkheid dat RIP’s verschillende pathways kunnen induceren om apoptose te veroorzaken. Het is mogelijk dat RIP’s via de schade aan ribosomen apoptose induceren. Toch is er evidentie dat het cytotoxische effect van RIP’s niet enkel door de inhibitie van de translatie wordt veroorzaakt (Stirpe F., Battelli M. G. 2006). Barbieri en collega’s vonden dat RIP’s adenine kunnen verwijderen uit de ADP-ribose keten in geactiveerd poly(ADP-ribose) polymerase. Poly(ADP-ribose) polymerase is belangrijk bij het herstellen van DNA. De schade die de RIP’s veroorzaken aan poly(ADP-ribose) polymerase kan het herstellen van het DNA inhiberen (Barbieri L. et al. 2003). Het verwijderen van het adenineresidu uit poly(ADP-ribose) polymerase blijkt onafhankelijk te zijn van de inhibitie van de 8 proteïnesynthese (Sestili P. et al. 2005). Ricine en shiga-toxine kunnen nucleair DNA beschadigen in endotheliale cellen. Bij beiden gebeurt het beschadigen van het DNA lang voordat apoptose zelf begint, wat wil zeggen dat de beschadiging van DNA geen gevolg kan zijn van apoptose (Brigotti M. et al. 2002). Beschadiging van DNA is echter wel een mogelijke oorzaak voor apoptose (Roos W. P., Kaina B. 2006). De geïsoleerde B-keten van ricine kan eveneens apoptose induceren, waarschijnlijk door het linken van moleculen op de oppervlakte van cellen (Hasegawa N. et al. 2000). Wat dus wijst op het feit dat de inhibitie van de translatie door RIP’s gescheiden kan zijn van de cytotoxische eigenschappen. 1.6 Structuur De aminozuursequenties van een groot aantal RIP’s zijn gekend. Bij het vergelijken van de primaire structuren is er een hoge graad van sequentie-identiteit tussen type 1 RIP’s en de A-ketens van de type 2 RIP’s, evenals tussen de B-ketens van verschillende type 2 RIP’s. De gelijkenis in de aminoterminale sequenties van RIP’s is hoger dan voor de carboxy-terminale gedeelten die dus minder geconserveerd zijn (Peumans W. J. et al. 2001). De variabiliteit in de sequentie van de carboxyterminale delen van de RIP-domeinen kan aan de basis liggen van de verschillen in enzymatische activiteiten en substraatspecificiteit tussen verschillende RIP’s (Hartley M. R. et al. 1996). Ook de tertiaire en quaternaire structuren van de A-ketens van een aantal type 2 RIP’s en type 1 RIP’s zijn bekend. De meeste verschillen in de driedimensionale structuur van RIP’s zijn te vinden in lussen die aan de oppervlakte gelegen zijn of in het carboxy-terminale gedeelte (waar ook de grootste verschillen in de aminozuursequentie gelokaliseerd zijn). De tertiare structuren van RIP’s zijn beter geconserveerd dan de primaire structuren zoals te zien is in Figuur 5, daarin zijn de driedimensionale structuren van een aantal type 1 RIP’s en de A-keten van ricine weergegeven (Peumans W. J. et al. 2001). Als men de driedimensionale structuur bekijkt van RIP’s zijn er twee delen te zien: een N-terminaal deel die vooral bestaat uit beta-platen en een C-terminaal deel met vooral alpha-helices (de Virgilio M. et al. 2010). Essentieel voor de N-glycosidase-activiteit van RIP’s zijn de residuen die de actieve site van het enzyme uitmaken. In saporine-6 zijn de actieve residuen Tyr72, Tyr120, Glu176, Arg179 en Trp208 (Bagga S. et al. 2002). Deze actieve residuen komen in bijna alle RIP’s voor. Glutaminezuur en arginine zijn belangrijk in de katalytische activiteit zelf terwijl de twee tyrosine residuen samen met het tryptofaan residu belangrijk zijn in de substraatbinding (Chen J. K. et al. 1997, Katiyar S. P. et al. 2011). 9 Figuur 5: Driedimensionale structuren van verschillende types 1 RIP’s en de A-keten van ricine. Vijf geconserveerde residuen in de actieve site zijn gekleurd weergegeven. Blauw is ricine, thrichosanthine in rood, PAP in groen, bouganine in geel en gelonine in het oranje (de Virgilio M. et al. 2010). 2 Toepassingen in biotechnologie 2.1 Gewasbescherming Het zoeken naar de biologische functie van RIP’s wordt bemoeilijkt door de heterogeniteit binnen de familie van de RIP’s. Zo zijn RIP’s zoals PAP zeer actief tegen zowel plantenribosomen als ribosomen van zoogdieren, terwijl andere RIP’s zoals die van de granen een vrij lage activiteit vertonen tegen plantenribosomen maar een hoge activiteit tegen de ribosomen van zoogdieren (Hartley M. R. et al. 1996, Hartley M. R, Lord J. M. 1993, Madin K. et al. 2000). Er is bijvoorbeeld 103 meer ricine nodig om ribosomen uit tarwe te depurineren dan om ribosomen van zoogdieren te depurineren (Massiah A. J., Hartley M. R. 1995). Heel wat onderzoeken gaven indicaties dat type 1 en type 2 RIP’s een rol spelen in de bescherming van planten. Type 1 RIP’s blijken veelal antivirale activiteit te bezitten, daar waar de type 2 RIP’s eerder toxisch zijn aangezien deze RIP’s via hun B-keten veel beter in staat zijn om in het cytoplasma te raken van cellen. Dit is echter enkel mogelijk in dierlijke cellen aangezien fungi en bacteriën ook beschikken over een celwand (Domashevskiy A. V., Goss J. D. 2015). Toch zijn er ook RIP’s bekend met een antifungale of een antimicrobiële werking (Wang S. et al. 2012). De aanwezigheid van zeer toxische RIP’s kan bijvoorbeeld de zaden beschermen zoals het geval is bij ricine. Ook minder toxische type 2 RIP’s kunnen accumuleren en daardoor toxische effecten veroorzaken mocht een herbivoor grote hoeveelheden van de plant in kwestie eten (Peumans W. J. et al. 2001). Er zijn ook type 2 RIP’s die een gelijkaardige structuur hebben aan de toxische type 2 RIP’s maar zelf slechts weinig toxisch zijn (Stirpe F. 2005). 2.1.1 Biotische stress 2.1.1.1 Antivirale activiteit Virussen zijn vrij belangrijke oorzaken van plantenziekten. In tegenstelling tot fungi en insecten zijn er geen commerciële chemische middelen die kunnen gebruikt worden in de bestrijding van virussen. Zowel type 1 als type 2 RIP’s zijn getest voor antivirale activiteit (Kaur I. et al. 2011, Wang P., Tumer 10 N. E. 2000). Verhoogde virusresistentie werd opgemerkt in struisgras en tabak wanneer deze PAP transgeen tot expressie brachten (Dai W. D. et al. 2003, Lodge J. K. et al. 1993). Ook werd opgemerkt dat wanneer men tabak transformeerde met het gen voor JIP60 er een verhoogde virusresistentie op te merken was (Görschen E. et al. 1997). BBAP1, een RIP uit Bougainvillea xbuttiana kan tabaksplanten die behandeld werden met het opgezuiverde proteïne beschermen tegen het tabaksmozaïek virus (Choudhary N.L. et al. 2008a). BBAP1 kan eveneens beschermen tegen het sunnhemp rosette virus (Choudhary N.L. et al. 2008b). Vooral voor type 1 RIP’s werden antivirale eigenschappen beschreven, terwijl dit minder frequent beschreven wordt voor type 2 RIP’s (Vandenbussche F. et al. 2004). Zo werden de antivirale eigenschappen in planta reeds bewezen voor type 2 RIP’s uit Sambucus nigra namelijk SNA-I en SNAV (Chen Y. et al. 2002, Vandenbussche F. et al. 2004). Een type 2 RIP uit Iris namelijk IRAb bleek net zoals een type 1 RIP uit Iris, IRIP antivirale eigenschappen te bezitten (Vandenbussche F. et al. 2004). Het exacte mechanisme waarmee RIP’s virale infecties tegenhouden is niet bekend. De mogelijkheid bestaat dat de RIP’s de ribosomen inhiberen waardoor de replicatie van virussen wordt tegengehouden. De RIP’s kunnen dan aanwezig zijn in compartimenten, weg van de ribosomen en bij infectie kunnen vervolgens de RIP’s getransloceerd worden naar het cytosol (Domashevskiy A. V., Goss D. J. 2015). Specifieke signalen kunnen dan in theorie de verplaatsing van RIP’s veroorzaken of een eventuele inhibitor van RIP’s verwijderen (Desvoyes B. et al. 1997). In onderzoek met saporine werd gevonden dat het afknippen van een signaalpeptide een belangrijke stap was in de activatie van het RIP in kwestie. Wanneer men mutaties aanbracht die het afknippen van die signaalpeptide beïnvloedde, zag men een vermindering van de cytotoxiciteit tegenover de cellen van de waardplant (Marshall R. S. et al. 2010). Een andere mogelijkheid is dat RIP’s pas worden geproduceerd als respons op de aanwezigheid van het virus (Girbés T. et al. 1996). In andere onderzoeken vond men dat RIP’s mogelijks direct inwerken op het virus en niet op de ribosomen. Zo kan het zijn dat RIP’s viraal DNA of RNA depurineren of andere componenten die belangrijk zijn voor de virale replicatie inhiberen. Zo is PAP bijvoorbeeld in staat om de translatie van RNA met een 5’cap te inhiberen zonder het inactiveren van de ribosomen (Hudak K. A. et al. 2000). Ook heel wat virussen zonder 5’cap kunnen door PAP geïnhibeerd worden (Chen Z. et al. 1991). Een andere mogelijkheid is dat RIP’s de verdediging van de plant activeren. Zo vond men in onderzoek dat PAP en een enzymatisch inactieve mutant van PAP de expressie van PR-proteïnen verhoogden in tabaksplanten die getransformeerd waren met het DNA voor PAP of de mutant (Zoubenko O. et al. 1997). 2.1.1.2 Antifungale activiteit Schimmels veroorzaken net zoals virussen vrij veel schade bij planten. PAP kan de synthese van PRproteïnen induceren. In tabak beschermde dit de zaailingen tegen de schimmel Rhizoctonia solani (Zoubenko O. et al. 1997). In bioassays werd er aangetoond dat twee type 1 RIP’s van Mirabilis expansa actief waren tegen heel wat verschillende pathogene en niet-pathogene fungi (Vivanco J. M. et al. 1999). Soms is de activiteit van RIP’s zeer specifiek. In sommige experimenten werd gevonden dat er een verschil was in gevoeligheid van verschillende schimmels binnen eenzelfde genus (Nielsen K., Boston S. R. 2001). Het maïs b-32 beschermde transgene tarwe tegen ‘Fusarium head blight’ (Balconi C. et al. 2007). Het transformeren van rijst met het gen voor alpha-momarcharine (type 1 RIP) zorgde voor een verbeterde resistentie tegen Magnaporthe grisea (Qian Q. et al. 2012). 11 Wang S. et al. (2012) deden onderzoek naar de effectiviteit van alpha-momorcharine als antifungale verbinding. De schimmels in het onderzoek waren Fusarium solani en Fusarium oxysporum. De hyfen die in contact kwamen met het RIP werden microscopisch onderzocht. Daar waar normale hyfen een homogene structuur en een normale myceliale apex bevatten zag men bij de hyfen die behandeld waren veel septa. Ook werd gezien dat er een verlies aan asymmetrie was samen met kleine zwellingen, barstende cellen en vervormingen (Wang S. et al. 2012). 2.1.1.3 Antibacteriële activiteit In het onderzoek uitgevoerd door Wang S. et al. (2012) werd aangetoond dat alpha-momorcharine actief was ten opzichte van Pseudomonas aeruginosa in een antibacteriële activiteitsassay. De IC50 was 0.59µM. Er werd geen effect van alpha-momorcharine op E. coli, S. aureus en B. subtillis opgemerkt (Wang S. et al. 2012). 2.1.1.4 Insecticidale activiteit Insecten kunnen enorme schade veroorzaken aan gewassen. Dit kan zowel rechtsreeks doordat insecten ervan eten, als onrechtstreeks doordat vele insecten vectoren zijn voor plantvirussen. Pesticiden worden veel gebruikt, maar veelal zijn deze weinig milieuvriendelijk. Er bestaan al transgene gewassen die insecticidale verbindingen tot expressie brengen, denk maar aan de cryproteïnen van Bacillus thuringiensis. Toch zijn er ook al resistente insecten tegen deze cry-proteïnen opgedoken. Er is dus een nood aan nieuwe verbindingen die planten kunnen beschermen (Tabashnik B. E. et al. 2013). Verschillende onderzoeken hebben de insecticidale activiteit van zowel type 1 als type 2 RIP’s aan het licht gebracht (Stirpe F. 2013). Expressie van het b-32 RIP uit maïs in tabaksplanten gaf een verhoogde insectenresistentie (tegen Helicoverpa zea en Lasioderma serricorne) (Dowd P. F. et al. 2003, Dowd P. F. et al. 2006). Ook de expressie van SNA-I gaf een verhoogde resistentie wanneer dit tot overexpressie werd gebracht in tabak (Shahidi-Noghabi S. et al. 2009). Uit bioassays heeft men gevonden dat ricine (type 2 RIP) en saporine (type 1 RIP) zeer toxisch zijn voor larven van twee Coleoptera soorten maar niet toxisch voor insecten uit de Lepidoptera groep (Gatehouse A. et al. 1990). In dat onderzoek zag men dat de capaciteit van de maag van het insect voor het hydrolyseren van de RIP in kwestie bepalend was voor de toxiciteit. Wanneer een homogenaat van de maag van een insect in staat was om een bepaalde RIP te hydrolyseren was de toxiciteit van dat RIP tegen dit insect lager. Dowd P. F. et al. onderzochten de effecten van het b-32 RIP (uit maïs) en “wheat germ agglutinin” (WGA). Verschillende concentraties van deze twee proteïnen werden getest op de larven van de Spodoptera frugiperda en Helicoverpa zea. Er werd aangetoond dat de combinatie van WGA en het b-32 toxischer was dan elk van de proteïnen apart. De reden voor die synergie is hoogstwaarschijnlijk te verklaren door het feit dat WGA poriën maakt in het peritrofe membraan in de maag van insecten zodat de absorptieve cellen niet meer beschermd waren en de RIP’s dus makkelijker konden binnendringen (Dowd, P. F. et al. 2012). Dit wijst op de mogelijkheid om verschillende proteïnen te combineren in de bescherming van planten. 2.1.2 Abiotische stress Uit sommige onderzoeken bleek dat bepaalde RIP’s ook meer tot expressie komen na blootstelling van de plant aan abiotische stress. JIP60 bijvoorbeeld is een type 3 RIP uit gerst dat opgereguleerd wordt in respons op jasmijnzuur (Becker W., Apel K. 1992). Verder onderzoek toonde aan dat dit gen ook werd opgereguleerd bij osmotische stress en bij dessicatie (uitdroging) (Reinbothe S. et al. 1994). 12 De expressie van een ander RIP namelijk PIP2 uit de plant Phytolacca insularis wordt ook geïnduceerd door jasmijnzuur, absicinezuur en bij verwonding van de plant (Song S. K. et al. 2000). In Phytolacca americana blijkt dat door osmotische stress en door senescentie er meer RIP-activiteit is in de bladeren. De RIP-activiteit werd ook groter bij koude shock en bij hitteshock (Stirpe F. et al. 1996). In Mesembryanthemum crystallinum werd de expressie van een RIP opgereguleerd bij zout-stress. Onafhankelijk van het stressniveau van de plant varieerde de hoeveelheid RNA dat codeert voor het RIP met de circadiaanse klok. De hoogste hoeveelheden RNA werden waargenomen op de middag (Rippmann J. F. et al. 1997). In rijst werden er 31 genen gevonden die coderen voor RIP’s. De expressie van die RIP’s wordt verhoogd onder stress, zoals koude en zoutstress (Jiang S. Y. et al. 2008). Wanneer de onderzoekers een van deze genen inbrachten op een andere plaats in het rijst genoom zag men dat de overexpressie van dat gen zorgde voor een verhoogde zout- en droogtetolerantie zonder enige merkbare schade aan de plant zelf (Jiang S. Y. et al. 2012). Het mechanisme is niet bekend maar de onderzoekers verwijzen naar de hypothese dat er een reorganisatie van het eiwitmetabolisme zou kunnen plaatsvinden door de inhibitie van translatie door de RIP’s. Een andere mogelijkheid is te vinden in een van de andere, echter controversiële, activiteiten van RIP’s zoals bijvoorbeeld de superoxidedismutase-activiteit (Li X. D. et al. 1996). De superoxidedismutase-activiteit zou dan de schade van reactieve zuurstofspecies kunnen reduceren (accumulatie van reactieve zuurstofspecies gebeurt bij sommige vormen van stress) (Foyer C. H., Noctor G. 2005). Al deze informatie wijst op een vrij diverse fysiologische rol van RIP’s. Het is dus mogelijk dat de heterogeniteit binnenin de groep van de RIP’s ook weerspiegeld wordt in hun functie. Alhoewel nog niet duidelijk is wat nu precies de rol van RIP’s is, zijn er heel wat aanwijzingen in de richting van het belang van RIP’s voor de verdediging van de plant tegen biotische en abiotische stress. Dit biedt verschillende toepassingsmogelijkheden voor het gebruik van RIP’s om planten te beschermen tegen virussen, schimmels, insecten en eventueel abiotische stress (Nielsen K., Boston S. R. 2001). 2.2 Medische toepassingen Aangezien RIP’s cytotoxisch zijn (zie boven) kunnen ze ook gebruikt worden in medische toepassingen. RIP’s kunnen gebruikt worden voor het maken van antitumor geneesmiddelen (Lin J. Y. et al. 1970, Słomińska-Wojewódzka M., Sandvig K. 2013, Zou L. B., Zhan J. B. 2005). Ook is er interesse in de antivirale eigenschappen van RIP’s bijvoorbeeld voor de bestrijding van het HIV-virus (Kaur I. et al. 2013). 2.2.1 Antiviraal De antivirale activiteit van RIP’s is niet beperkt tot plantenvirussen. Sommige RIP’s bezitten ook een antivirale activiteit tegen dierlijke virussen. Heel wat type 1 en type 2 RIP’s inhiberen de replicatie van HIV (in vitro). Voorbeelden hiervan zijn: alpha- en beta momorcharine, MAP30, GAP31, TAP29, DAP30, DAP32, TCS, PAP, bryodine en ricine (Parikh B. A. Tumer N. E. 2004). Balsamine is een type 1 RIP uit Momordica balsamin. Kaur I. et al. bewezen dat balsamine de replicatie van HIV kon tegenhouden in T-cel lijnen en in primaire CD4+ T-cellen. Ook kon worden bewezen dat het antivirale effect niet werd veroorzaakt door cytotoxische eigenschappen. Verder werd aangetoond dat balsamine de omzetting van het viraal RNA naar DNA en de integratie ervan niet beïnvloedde. Het RIP zou vooral inwerken net voor of op de translatie van het RNA. Naast HIV 13 kon balsamine ook de replicatie van het influenza virus inhiberen. Het exacte mechanisme van de antivirale activiteit is nog steeds niet duidelijk (Kaur I. et al. 2013). Men vermoedt dat een aantal RIP’s zoals MAP30, GAP31, luffine, en TCS de replicatie van het HIV virus inhiberen door op het HIV integrase in te werken (Au T.K. et al. 2000, Lee-Huang S. et al. 1995). Het effect van RIP’s op HIV werd reeds getest in klinische proeven. Deze klinische proeven gaven echter weinig hoopvolle resultaten (Kaur I. et al. 2011, Parikh B.A. Tumer N.E. 2004). 2.2.2 Anticarcinogeen De apoptose-inductie door RIP’s kan via verschillende pathways gebeuren. Dit kan zeer belangrijk zijn in het bestrijden van tumoren aangezien vele kanker- of tumorcellen ongevoelig zijn voor apoptose via caspasen en serine proteasen. Deze kunnen echter wel gevoelig zijn voor apoptose via de redoxregulatie van de thiol-groepen van eiwitten of apoptose via de tumor-necrosis-factor-α pathway (Nielsen K., Boston S.R. 2001). Sommige RIP’s zijn meer toxisch voor kankercellen dan voor normale cellen. Voorbeelden hiervan zijn ricine en abrine (Lin J. Y. et al. 1970, Zou L. B., Zhan J. B. 2005). De reden hiervoor is niet meteen duidelijk. Een mogelijke reden is dat kankercellen omwille van hun snelle proteïnesynthese, die nodig is voor de snelle proliferatie, gevoeliger zijn aan translationele inhibitie door RIP’s. Een andere mogelijkheid is dat de RIP’s toxischer zijn voor kankercellen ten gevolge van de verschillende morfologie en structuur die kankercellen vertonen vergeleken met normale cellen (Stirpe F., Battelli M.G. 2006). Het effect van RIP’s is mogelijks niet beperkt tot de directe inwerking op de kankercellen, maar zou ook kunnen verklaard worden door een soort van “stimulatie” van het immuunsysteem (Yamasaki C. et al. 2004). Ook zijn er testen gedaan om RIP’s (die niet op zichzelf in de tumorcellen raken) via elektroschocks van tumoren in de tumorcellen te brengen (Kodama T. et al. 2003) RIP’s (type 1 RIP’s of de A-keten van type 2 RIP’s) kunnen ook aan allerlei moleculen vastgemaakt worden om zodanig op een zeer selectieve manier bepaalde cellen te doden. Dit kan gebeuren door RIP’s vast te hechten aan antilichamen maar mogelijks ook aan groeifactoren, hormonen en lectinen. Zulke fusies (RIP en antilichaam) worden immunotoxines genoemd en zijn te zien in Figuur 6 (Fracasso G. et al. 2010, Stirpe F. 2013). Een eerste probleem wanneer men immunotoxines gebruikt is het optreden van het vasculaire lek syndroom (Litvak-Greenfeld D., Benhar I. 2012). Om dit op te lossen dient men de RIP’s te muteren (Smallshaw J. E. et al. 2003). Aangezien RIP’s en antilichamen eiwitten zijn, kan het menselijk lichaam een immuunrespons teweeg brengen tegen deze immunotoxines. Men kan dit vermijden op drie manieren (Stirpe F. 2013). De eerste manier is om immunogeniciteit van de RIPs te verlagen door het gebruik van gehumaniseerde of menselijke antilichamen. Bij de RIP’s kan men epitopen verwijderen of pegyleren (Lorberboum-Galski H. 2011, Meng Y. et al. 2012, Stirpe F. 2013). Een tweede manier bestaat er in om de RIP’s toe te dienen op een manier dat ze niet in contact komen met het immuunsysteem. Een voorbeeld hiervan is te vinden in de behandeling van blaaskanker waarbij men intravesikale irrigatie van immunotoxines kan toepassen met goede resultaten (Kowalski M. et al. 2012, Zang Z. et al. 2000). Als laatste kan men de behandeling beperken door slechts eenmaal te behandelen met immunotoxines indien dit volstaat voor de behandeling (Stirpe F. 2013). 14 Figuur 6: Schematische voorstelling van immunotoxines. A: schematische voorstelling van een klassiek immunotoxine, waar een toxine (bv. een RIP) gekoppeld is via een disulfide brug aan een antilichaam. B: een recombinante fusie tussen een bepaald ligand (bv. groeifactoren, hormonen) en een toxine via een linker. C: recombinante fusie tussen een stuk van een antilichaam, vaak het Fab fragment of een single-chain antilichaam met een toxine (de Virgilio, M. et al. 2010). 3 Type 3 RIP’s Dankzij recente genoomstudies werden gensequenties coderend voor nieuwe chimere RIP’s met een ongekende domeinstructuur ontdekt. Zo werden RIP’s gevonden waarin een RIP-domein gekoppeld was aan een domein dat homologie vertoonde met peptidasen of heat-shock proteïnes of zelfs NBARC-domeinen. Deze eiwitten waarin een RIP-domein gefuseerd is met zo een niet-lectine-domein worden ingedeeld bij de type 3 RIP’s. Voorbeelden zijn: JIP60 afkomstig uit gerst, het RIP-C19 uit tarwe en het RIP-M41 uit rijst. 3.1 JIP60 JIP60 is een jasmonaat induceerbaar proteïne met een moleculaire massa van 60kDa. De functie van JIP60 werd grotendeels bekend dankzij het recente onderzoek van Rustgi S. et al. in 2014. In het gerstgenoom zijn twee genen voor JIP60 aanwezig. Het onderzoek werd gedaan op het gen dat correspondeert met het cDNA X66376.1. JIP60 bestaat uit twee domeinen, namelijk een N-terminaal domein dat gerelateerd is aan type 1 RIP’s en de A-keten van type 2 RIP’s, en een C-terminaal domein dat sterk gelijkt op de eukaryoot translatie initiatie factor 4E (eIF4E) (Chaudhry B. et al. 1994, Reinbothe S. et al. 1994) . JIP60 is één van de proteïnes waarvan de expressie geïnduceerd wordt door jasmonaat. Jasmonaat en methyljasmonaat zijn zeer belangrijke planthormonen. Deze verbindingen spelen een rol in een aantal ontwikkelingsstadia van planten zoals het generatieve stadium, knopvorming en ook in de senescentie, stressrespons en verdediging van de plant (Reinbothe C. et al. 2009, Reinbothe S. et al. 1993, Wasternack C. 2007). eIF4E is een onderdeel van een multiproteïne complex dat een rol heeft in de initiatie van translatie. eIF4E bindt aan de 5’cap structuur die te vinden is aan mRNA’s en ook met eIF4G (een andere initiatiefactor). Dit complex interageert met eIF3 dat aan het ribosoom gebonden is. De 40S ribosomale subunit is dan gebonden aan de 5’cap en zal het mRNA scannen voor een 15 translatiestartplaats. Wanneer dit gevonden is, zal de binding met het 60S ribosomale subunit ervoor zorgen dat een functioneel initiatie complex gevormd wordt (Rhoads R. E. 2009). Uit het onderzoek blijkt dat JIP60 de ribosomen reversibel inhibeert door de ribosomen uiteen te laten vallen. Deze activiteit was te zien 24 uren na inductie met methyljasmonaat. Ook zal het JIP60 worden gesplitst en zal er aldus eIF4E en RIP30 gevormd worden. Dit eIF4E zal dan bepaalde mRNA’s die belangrijk zijn in de reactie op stress opreguleren. Samen zorgen deze peptiden voor een snelle herprogrammering van de translatie (Reinbothe S. et al. 1994, Rustgi, S. et al. 2014). In Figuur 7 is het model te zien van de werking van JIP60 volgens Rustgi S. et al. (2014). Figuur 7: Model van de werking van JIP60 volgens Rustgi S. et al. (Rustgi, S. et al. 2014). 3.2 RIP-M41 Het genoom van rijst bevat een gen met een domein die een hoge graad van homologie vertoonde met RIP’s en een domein dat homologie vertoonde met M41-peptidasen. Het open leesraam (vanuit cDNA) is weergegeven in Figuur 43. De eiwitsequentie met de actieve site van het RIP-domein is weergegeven in Figuur 8. Door middel van een multiple alignment werd de sequentie van het RIP-domein van het RIP-M41 vergeleken met de sequenties van andere RIP-domeinen (bv. de A-keten van ricine) en type 1 RIP’s (EMBL-EBI 2015). De actieve site van RIP’s is sterk geconserveerd en bestaat uit YYERW (tyrosine, tyrosine, glutaminezuur, arginine en tryptofaan) (residuen aangeduid op Figuur 8 met de corresponderende kleuren). De belangrijkste residuen zijn glutaminezuur en arginine. De arginine is in het geval van het RIP-M41 veranderd in een lysine. In onderzoek met ricine is gebleken dat wanneer deze arginine uit de actieve site vervangen werd door lysine, er een drievoudige verlaging van de activiteit waar te nemen was. Indien men de arginine wijzigde in glutamine werd de activiteit 250 keer verlaagd (Day P. J. et al. 1996). Dus is de vervanging van het arginine residu uit de actieve site van RIP-M41 met een lysine waarschijnlijk niet nefast voor de activiteit van het RIP-domein. 16 Figuur 8: Eiwitsequentie van RIP-M41. Het best gekarakteriseerde M41-peptidase is het FtsH-peptidase uit E.coli (Akiyama Y. et al. 2004, WTSI, 2014c). De proteïnen die behoren tot de M41-peptidasen zijn zogenaamde metalloproteasen. De actieve site omvat histidine-glutaminezuur-histidine-asparaginezuur (WTSI, 2014a). Hierin wordt verwacht dat het aminozuur glutaminezuur belangrijk is voor de katalytische functie zelf en dat de histidines kunnen binden met een zink atoom. Dat gebonden zink atoom zou dan H2O kunnen activeren wat ook belangrijk is in de proteolyse (WTSI, 2014c). Het is eveneens mogelijk dat glutaminezuur ook kan binden aan het zink atoom en als derde ligand kan functioneren (Saikawa N. et al. 2002). Ook zou de peptidase-activiteit ATP-afhankelijk zijn aangezien er een ATPase-domein te vinden is in deze peptidasen (Bruckner R. C. et al. 2003). Het M41-peptidase heeft als substraat meestal membraan-proteïnen. Er zijn leden van de M41-peptidase familie teruggevonden in alle takken van het leven, behalve bij de Archaea (WTSI, 2014c). Er zijn eukaryote homologen van het FtsH-peptidase gevonden in eukaryoten bijvoorbeeld de m-AAA en de i-AAA peptidasen. De m-AAA en de i-AAA peptidasen zijn mitochondriale peptidasen. Het mAAA peptidase zou een chaperone functie hebben in de mitochondriën en ervoor zorgen dat proteïne complexen in de mitochondriën goed opgevouwen worden. De m-AAA en de i-AAA peptidasen zouden ook belangrijk zijn voor de afbraak van ongecomplexeerde componenten in de mitochondriën (WTSI, 2014c). 3.3 RIP-C19 Bij een genoomanalyse in tarwe werd een gen ontdekt dat naast een domein met homologie ten opzichte van RIP’s ook een domein bevat dat een hoge graad van homologie had ten opzichte van een deel van een C19-peptidase. Het cDNA van het gen is weergegeven in Figuur 44 en de eiwitsequentie in Figuur 9. Via een multiple alignment werd de sequentie van het RIP-domein van het RIP-C19 vergeleken met de sequenties van andere RIP-domeinen (bv. de A-keten van ricine) en type 1 RIP’s (EMBL-EBI 2015). De actieve site van RIP’s bestaat uit YYERW (tyrosine, tyrosine, glutaminezuur, arginine en tryptofaan) (residuen aangeduid op Figuur 9 met de corresponderende kleuren). De belangrijkste residuen zijn glutaminezuur en arginine. De eerste tyrosine in RIP-C19 is vervangen door een phenylalanine. 17 Figuur 9: Eiwitsequentie van RIP-C19 De C19-peptidase familie bevat ubiquitinyl hydrolasen. Ubiquitinyl hydrolasen zijn cysteïne proteasen en bevatten als actieve site residuen Asn, Cys, His en Asp. In het RIP-C19 zijn slechts twee actieve residuen aanwezig in het C19-domein (Asn en Cys) (WTSI, 2014a). De peptidasen breken aldus de binding van ubiquitine met een ander proteïne of met een ander ubiquitine. De binding die verbroken wordt, is dus de binding tussen de C-terminale glycine van ubiquitine met de N-terminus van een ander ubiquitine of de isopeptide binding van dit glycine aan een lysine residu van een ander peptide of van een ander ubiquitine (WTSI, 2014b). De functie van de C19-peptidasen is niet helemaal duidelijk. Het zijn intracellulaire ubiquitinyl hydrolasen waarvan men denkt dat ze door het verwijderen van ubiquitine sommige proteïnen verhinderen om afgebroken te worden. Ook kan het zijn dat deze proteasen zorgen voor de recyclage van ubiquitine (WTSI, 2014b). 18 4 Materiaal en methoden 4.1 ‘Polymerase chain reaction’ In de ‘polymerase chain reaction’ (PCR) zullen specifiek bepaalde DNA-fragmenten geamplificeerd worden. Uitgaande van een zeer kleine hoeveelheid DNA kunnen miljoenen identieke strengen gecreëerd worden door het aan elkaar hechten van deoxynucleotiden door een polymerase. In een PCR-reactie zijn primers nodig, dit zijn korte stukken DNA die complementair zijn aan een sequentie te vinden op het te amplificeren DNA. Deze primers vormen de startplaats van de amplificatie en zullen bepalen (aan de hand van de bindingsplaats) welk gedeelte van het DNA geamplificeerd wordt. 4.1.1 Standaard PCR Het standaard PCR-programma wordt weergegeven in Tabel 2. Voor PCR kan gebruik gemaakt worden van twee verschillende polymerasen met elk hun specifieke werkingstemperatuur. Het Taqpolymerase heeft geen proofreading-activiteit, en maakt dus meer fouten bij het amplificeren. Taqpolymerase wordt enkel gebruikt onder omstandigheden waar het niet nodig is om foutloze sequenties te produceren (bv. kolonie-PCR). Het pfx-polymerase beschikt wel over proofreadingactiviteit. Tabel 2: Standaard PCR-programma1. Stap Temperatuur Tijdsduur Aantal cycli Initiële denaturatie 94°C 2 min. 1X Denaturatie 94°C 15 sec. nX Annealing A 30 sec. nX Extensie 68°C (pfx)/72°C(Taq) B nX Finale extensie 68°C (pfx)/72°C(Taq) 5 min. 1X Bewaar 4-12°C ∞ 1 A,B en n zijn afhankelijk van het te amplificeren fragment. De constanten A, B en n uit Tabel 2 zijn variabel en afhankelijk van het te amplificeren fragment. De annealingstemperatuur (A) dient verhoogd te worden indien er meer stringentie gewenst is (geen of minder toevallige priming). De extensietijd (B) is afhankelijk van de lengte van het te amplificeren fragment (ongeveer één minuut per 1000 baseparen (bp)). Het aantal cycli is afhankelijk van de gewenste mate van amplificatie. Een PCR begint steeds met het maken van een mastermix (Tabel 3). Het DNA (template) zal worden toegevoegd aan deze mastermix en het geheel wordt in een PCRtoestel (Labcycler (SensoQuest GmbH) of de T100 thermal cycler (Bio-Rad)) geplaatst. De initiële denaturatiestap maakt alle DNA enkelstrengig. Na deze initiële denaturatie begint de eerste cyclus. In dergelijke cyclus worden alle DNA-fragmenten opnieuw gedenatureerd. Hierna zal de temperatuur dalen en zullen de primers kunnen binden, dit heet de annealing. Na de annealing worden de primers verlengd door de inwerking van het aanwezige polymerase, dit is de extensie. Na deze extensiestap zal de cyclus herbeginnen. Na n keer de cyclus te hebben doorgelopen zal een finale extensiestap 19 ervoor zorgen dat eventueel nog niet volledig geamplificeerde fragmenten vervolledigd worden. De bewaarstap zorgt ervoor dat het DNA kan bewaard worden zonder degradatie. Tabel 3: Samenstelling PCR-mastermix.2 Product Pfx-PCR Taq-PCR dNTP’s (10 mM) (Invitrogen) 2µL 2µL RxN buffer (Invitrogen) 2,5µL / 10X Extra buffer / 2,5µL MgCl2 (50 mM) (Invitrogen) 0,75µL / Forward primer (5 µM) 1µl 1µl Reverse primer (5 µM) 1µl 1µl Polymerase 0,125µL (Invitrogen, Carlsbad CA, VS) 0,125µL (5 U/µl) (VWR, Radnor PA, VS) Milli-Q (H2O) 17,625 - xµl 18,375- xµl Template xµl xµl 2 De hoeveelheid template (x) varieert van 1-5µL tot zelfs 10µl in geval van kolonie-PCR. In Tabel 3 worden de essentiële componenten van de mastermix weergegeven. De buffer (en MgCl2 indien dit niet standaard in de buffer aanwezig is) zorgt voor een optimale omgeving voor de werking van het polymerase. De dNTP’s bestaan uit deoxyguanosinetrifosfaat (dGTP), deoxythymidinetrifosfaat (dTTP), deoxyadenosinetrifosfaat (dATP) en deoxycytidinetrifosfaat (dCTP). Dit zijn de bouwstenen waarvan het polymerase DNA strengen vormt. De primers vormen de startpunten van de amplificatie, het DNA-fragment dat aan weerszijden complementair is met een respectievelijke primer zal geamplificeerd worden. De extra buffer bestaat uit 100mM Tris-HCl (Sigma Aldrich), 500mM KCl (VWR), 15mM MgCl2 (VWR) en 1% Triton-X-100 (Applichem). 4.1.2 Kolonie-PCR 4.1.2.1 E. coli Bij kolonie-PCR worden afzonderlijke kolonies afkomstig van een vast medium opgepikt. Deze bacteriën worden dan gesuspendeerd in 10µL bidest, dit vormt de template. Aan de template wordt telkens de benodigde hoeveelheid mastermix toegevoegd (Tabel 3). Het Taq-polymerase wordt meestal gebruikt voor de kolonie-PCR. Het PCR-programma is hetzelfde als de standaard PCR, behalve de initiële denaturatiestap die 10 minuten duurt in plaats van 2 minuten. Deze langere denaturatietijd is nodig om de bacteriecellen kapot te maken zodat het DNA vrijkomt. 4.1.2.2 Agrobacterium tumefaciens Bij een kolonie-PCR op Agrobacterium tumefaciens wordt een kolonie opgelost in 30µL bidest. Hierna wordt het mengsel gedurende 10 minuten opgekookt bij 99°C. Vervolgens wordt er 4µL gebruikt als template. Het PCR-programma is hetzelfde als de standaard PCR. 4.2 Agarose gelelektroforese Tijdens een gelelektroforese worden DNA-fragmenten gescheiden op basis van grootte. DNA is dankzij de aanwezige fosfaatgroepen negatief geladen en zal aangetrokken worden tot de positieve 20 elektrode en afgestoten worden door de negatieve. Het DNA wordt in een agarosegel geplaatst en wordt gescheiden op basis van de grootte van de fragmenten. Door de concentratie agarose in de gel te variëren kan men een efficiëntere scheiding uitvoeren doordat daarmee de poriegrootte van de gel verandert. Indien een hogere concentratie aan agarose wordt gebruikt zal het makkelijker zijn om kleinere DNA-fragmenten onderling te scheiden, omdat globaal gezien de poriën kleiner zijn. Indien men een lagere agaroseconcentratie gebruikt, worden de langere fragmenten efficiënter gescheiden van elkaar. In deze thesis werd vooral gebruik gemaakt van een agaroseconcentratie van 1,5%. Het maken van agarosegel gebeurt uitgaande van agarose-poeder (Invitrogen) en een tris-azijnzuurEDTA-buffer (TAE-buffer). De 50X-TAE-buffer wordt gemaakt uitgaande van de producten die te zien zijn in Tabel 4. Deze 50X-TAE-buffer werd 100 maal verdund. Per 300ml van deze verdunde TAEbuffer werd dan 4,5 g agarose toegevoegd. Dit mengsel dient te worden opgekookt en kan worden bewaard bij 60°C. Tabel 4: Samenstelling van TAE-buffer. Product Hoeveelheid Tris-HCl 2M EDTA (pH8) (VWR) 0,05 M Azijnzuur (watervrij) (VWR) 5,7% H2O (bidest) Aanlengen tot 1L Voor de aanvang van gelelektroforese dient de agarosegel in een vorm gegoten te worden. Door middel van een kam worden gaten gecreëerd in de gel waar het DNA wordt ingebracht. Per laantje wordt standaard 5µL DNA met 1,6µL ‘6X Massloader DNA Loading Dye’ (Thermo Scientific) ingebracht. Als referentie wordt er telkens in één laan een DNA-merker geladen (‘Massruler Low Range DNA Ladder’ (Thermo Scientific) voor fragmenten tot 1000 baseparen of ‘Massruler DNA Ladder mix’ (Thermo Scientific) voor fragmenten tot 10.000 baseparen (zie Figuur 10)). Nadat de gestolde gel in het elektroforeseapparaat werd geplaatst, zal het DNA worden geladen in de laantjes. De elektroforese werd uitgevoerd bij 100 V. Na de elektroforese wordt de gel met het DNA in een verdunde ethidiumbromide-oplossing (MP biomedicals) gebracht. Dit ethidiumbromide intercaleert met het DNA en absorbeert UV-licht (absorbantiemaxima tussen 300 en 360 nm) waardoor na fluorescentie (emissiemaximum op 590 nm) het DNA zichtbaar wordt in het Gel doc XR systeem (BioRad) (Thermo Fisher Scientific Inc. 2015b). 21 Figuur 10: ‘Massruler Low Range DNA Ladder’ (links), ‘Massruler DNA Ladder Mix’(rechts) (Thermo Fisher Scientific Inc. 2015c, Thermo Fisher Scientific Inc. 2015d). 4.3 Concentratiebepaling DNA , RNA en eiwit De concentratie van DNA, RNA en eiwit kan bepaald worden via de NanoDrop 2000 (Thermo Scientific). De concentratie van DNA of RNA wordt gemeten bij 260 nm, terwijl de eiwitconcentratie wordt bepaald bij 280nm. Ook de absorptie bij 230 nm wordt gemeten omdat organische contaminanten (bv. fenolen) absorberen bij deze golflengte. Bij het meten van de concentratie van DNA en RNA worden de ratio’s van de absorptie bij 260 nm t.o.v. de absorptie bij 280 nm en 230 nm bepaald en deze zijn een maat voor de zuiverheid en de kwaliteit van het DNA of RNA. Het is gewenst dat deze ratio’s groter dan 1,8 zijn. 4.4 Analyse van eiwit 4.4.1 SDS-PAGE Met behulp van natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide gelektroforese (SDS-PAGE) kunnen eiwitten gescheiden worden op basis van de lengte van de eiwitketen. Het SDS zorgt dat eiwitten denatureren (om disulfidebruggen uiteen te halen moet β-mercaptoethanol ook worden toegevoegd) en geeft eenzelfde negatieve lading per lengte-eenheid aan de verschillende eiwitten. De polyacrylamidegel zorgt dat de proteïnen gehinderd worden in de beweging naar de positieve pool toe. Grotere proteïnen zullen trager migreren dan kleine door de zeefwerking van de gel. De polyacrylamidegel bestaat uit twee delen namelijk de concentratiegel en de scheidingsgel. De samenstelling van de gels is te zien in Tabel 5. De concentratiegel zorgt dat alle eiwitten samen aankomen aan de rand van de scheidingsgel waarin de eigenlijke scheiding zal plaatsvinden. De TEMED en de APS-oplossing worden pas toegevoegd net voordat de gel gegoten wordt. 22 Tabel 5: Samenstelling van de verschillende gels met de respectievelijke percentages acrylamide. Product Scheidingsgel (12%) Concentratiegel (4%) H2O (bidest) 1,7 mL 3,05 mL Acrylamide/bisacrylamide (37,5:1) (Roth) 2,0 mL 650 µL Tris-HCl (1,5 mol/L, pH 8,8) 1,3 mL 1,25 mL SDS-oplossing (10%) (Acros) 50µL 50 µL APS-oplossing (10%) (Thermo Scientific) 50 µL 25 µL TEMED (Merck) 2 µL 5 µL Er wordt 15µL van het staal vermengd met 5µL sample buffer (8% (w/v) SDS, 200 mM Tris-HCl (pH 6,8), 40% (v/v) glycerol (VWR), 0,4% (w/v) bromo-fenolblauw (Merck)). Dit mengsel wordt gedurende 7 minuten opgekookt bij 99°C en daarna kort gecentrifugeerd. In de gel kan per laan maximum 20µL geladen worden. Naast de verschillende stalen wordt 5µL van de ladder geladen (pageruler prestained protein ladder, Thermo Scientific). De gel wordt gedurende 15 minuten bij 130V geplaatst zodat alle eiwit op hetzelfde moment bij de scheidingsgel komt. Vervolgens wordt het voltage verhoogd naar 150V voor de effectieve scheiding van de eiwitten in de scheidingsgel. 4.4.2 Coomassiekleuring Aan de hand van coomassiekleuring kan het eiwit dat aanwezig is in een gel na elektroforese gevisualiseerd worden. Hiervoor wordt de gel 15 tot 30 minuten in een 15X coomassiebuffer geplaatst (0,05% (m/v) Coomassie blue R-250 (Merck), 8,35 % (v/v) azijnzuur, 20,8 % (v/v) methanol (Roth)). Hierdoor zal de gel blauw kleuren. Nadien wordt de gel behandeld met ontkleuringsreagens ((15 % (v/v) ethanol (Thermo Scientific), 7,5 % (v/v) azijnzuur) zodat enkel de eiwitpolypeptiden blauw gekleurd blijven. 4.4.3 Western blot analyse In een western blot analyse worden specifieke eiwitten gedetecteerd op een membraan met behulp van antilichamen. Na een SDS-PAGE, kunnen proteïnen overgebracht worden naar een PVDF membraan (Pall). Hiervoor wordt het PVDF membraan gedurende 5 minuten in 100% methanol geplaatst. Hierna zal de gel uit de SDS-PAGE bovenop het PVDF membraan gelegd worden. Dit geheel wordt dan tussen twee stukken blotpapier geplaatst die kortstondig in Towbin buffer (10 % (v/v) methanol, 20mM Tris-HCl, 0.2M glycine (Sigma Aldrich)) geïncubeerd werden. Het blotten in de Trans-Blot SD Semi-Dry transfer cel (Bio-rad) duurt 2 uur (of langer indien nodig) bij 15V (constante), 0,8A en 12W. Nadat de proteïnen zijn overgebracht op het membraan kunnen bepaalde proteïnen zichtbaar gemaakt worden aan de hand van antilichamen. De verdere procedure is afhankelijk van het gebruikte detectiemiddel. Er wordt gebruik gemaakt anti-His antilichamen, specifieke antilichamen (tegen een bepaalde epitoop) en een HisProbe. 4.4.3.1 Anti-his antilichamen Na het blotten wordt het PVDF membraan met de proteïnen in blocking buffer (trissaline (10 mM Trizma base (Sigma Aldrich), 34mM NaCl (VWR), 0,1% (v/v) Triton-X-100, pH 7,6) met 5% (m/v) 23 melkpoeder (AppliChem)) geïncubeerd om alle plaatsen die niet door de proteïnen ingenomen worden te bezetten. Na incubatie in blocking buffer wordt de blot driemaal gewassen met trissaline gedurende 5 minuten. Het membraan zal dan geïncubeerd worden gedurende 1uur in 15mL trissaline (en geschud) met een 1 op 5000 verdunning van het anti-His antilichaam (Thermo Scientific) uit muizen. Vervolgens wordt er opnieuw driemaal 5 minuten gewassen met trissaline. Dan wordt het membraan 1 uur lang geïncubeerd (en geschud) met een 1 op 500 verdunning van anti-muis antilichamen uit konijnen (Thermo Scientific) dat gekoppeld is aan ‘horseradish peroxidase’. Vervolgens wordt er tweemaal 5 minuten gewassen met 15mL trissaline en eenmaal 5 minuten met 15mL 0,1M tris-HCl (pH 7,6). Uiteindelijk wordt het membraan geïncubeerd in 50mL detectie oplossing (0,058 mM diaminobenzidine (Sigma Aldrich), 0,033% (v/v) H2O2 in 50 mL 0,1M tris-HCl (pH 7,6)). Deze incubatie duurt niet langer dan 5 minuten anders wordt te veel achtergrondsignaal bekomen. De kleuringsreactie wordt gestopt door de blot te incuberen in bidest. 4.4.3.2 Specifieke antilichamen Wanneer gebruik wordt gemaakt van specifieke antilichamen is de procedure hetzelfde als met de anti-His antilichamen. Het verschil is dat er een 1 op 500 verdunning van het antilichaam (anti-eGFP, (proteintech)) nodig is. Vervolgens zal er drie maal 5 minuten gewassen worden met trissaline. Dan wordt het membraan 1 uur lang geïncubeerd (en geschud) met een 1 op 400 verdunning van antikonijn antilichamen uit geiten (Dako, Heverlee, België) dat gekoppeld is aan ‘horseradish peroxidase’. Na drie wasbeurten met trissaline wordt PAP (peroxidase anti-peroxidase) (Sigma Aldrich, St. Louis MO, VS) in een 1 op 300 verdunning in 15mL trissaline bij het membraan gevoegd en het geheel wordt geïncubeerd gedurende 45 minuten (en geschud). De wasprocedure en detectie is dezelfde als bij het anti-His antilichaam. 4.4.3.3 Hisprobe Het PVDF membraan wordt na het blotten behandeld met 10mL blocking buffer (0,38 mM BSA (Sigma Aldrich) in TBST (25mM Tris-HCl, 0,15M NaCl, 0,05% tween-20 (VWR) en pH 7,2)). Dit geheel wordt gedurende 1 uur geïncubeerd (en geschud) bij kamertemperatuur. Vervolgens wordt het membraan twee maal gewassen gedurende 10 minuten met TBST. Na het wassen wordt het membraan geïncubeerd met 10mL Hisprobe-HRP oplossing (1 op 5000 verdunning van 4g/L Hisprobe (Thermo Scientific) in Milli-Q-water) gedurende 1 uur (en geschud). Daarna wordt het membraan twee maal gewassen gedurende 10 minuten met TBST. Vervolgens wordt het membraan geïncubeerd met “SuperSignal Working Solution” (Thermo Scientific) voor 5 minuten en gebeurt de visualisatie van het signaal via het ChemiDoc MP imaging system (Bio-Rad). 4.4.4 Bradford De Bradford methode wordt gebruikt om de concentratie aan eiwit te bepalen in een eiwitoplossing. De verschillende oplossingen die eiwit bevatten (10µL), worden toegevoegd aan de verschillende welletjes van een 96-well plaat. Elk staal (en elke verdunning) wordt drie maal herhaald. Bij elk staal wordt 200µL Bradford reagens toegevoegd (Coomassie (Bradford) Proteïne Assay kit, Thermo Scientific). Vervolgens zal de absorptie bij 595 nm gemeten worden met de Tecan GENios Plus microplate reader (Tecan) en met behulp van een standaardreeks (gebaseerd op BSA) kan de eiwitconcentratie bepaald worden. 24 4.5 Escherichia coli en Agrobacterium tumefaciens 4.5.1 Transformatie van competente cellen 4.5.1.1 Heat-shock transformatie Bij heat-shock of hitteshock transformatie kunnen Top10 competente E. coli-cellen (Invitrogen) DNA opnemen. Om dit te doen wordt er 40µL hitteshock competente cellen uit -80°C opslag gehaald en ontdooid op ijs. Na ontdooien wordt 4µL plasmide-DNA toegevoegd (concentratie 100 ng/µL). Dit mengsel wordt kortstondig geschud en geïncubeerd voor 30 minuten op ijs. Hierna zal de effectieve hitteshock plaatsvinden door het mengsel gedurende 42 seconden te incuberen bij 42°C. Na deze hitteshock wordt het mengsel 2 minuten op ijs geplaatst. De cellen worden vervolgens verdund door 500µL vloeibaar LB-medium (1% (m/v) tryptone (UCB), 0,5% (m/v) ‘yeast extract’ (Merck) en 0,17M NaCl) toe te voegen en geïncubeerd bij 37°C en geschud bij 185tpm gedurende één uur. De cellen worden daarna uitgeplaat op selectief medium, vast LB-medium (1% (m/v) tryptone, 0,5% (m/v) ‘yeast extract’, 1,5% (m/v) agar (Duchefa) en 0,17M NaCl) met het antibioticum dat dient als selectiemerker. Vervolgens worden de cellen overnacht bij 37°C geplaatst. 4.5.1.2 Elektroshock transformatie Elektrocompetente cellen worden getransformeerd door het toevoegen van 2µL DNA (afkomstig van de Gibson assembly) aan 20µL competente cellen. Dit mengsel wordt gedurende 30 tot 60 seconden op ijs bewaard. Vervolgens wordt het mengsel overgebracht naar een steriele electroporatie cuvet. De electroporatie gebeurt aan de hand van een elektrische puls met een capaciteit van 25µF, een weerstand van 200 ohm, een veldsterkte van 2,0kV en een tijdsconstante van 4,2 tot 4,7 milliseconden. De getransformeerde cellen worden vervolgens verdund in 1mL vloeibaar LB-medium en gedurende 1 uur geïncubeerd bij 37°C en geschud bij 185tpm op een shaker. De cellen worden daarna uitgeplaat op selectief medium, vast LB-medium met het antibioticum dat dient als selectiemerker. Vervolgens worden de uitgeplaatte cellen overnacht bij 37°C geplaatst. 4.5.2 Gateway klonering Gateway klonering is een kloneringsmethode gebaseerd op de site-specifieke recombinatie van bacteriofaag lambda (Landy A. 1989). Voor gateway klonering moeten aan de DNA-fragmenten attBsites worden geplaatst. Nadat deze attB-sites aangebracht zijn kan het DNA via een BP-reactie in een vector ingebracht worden om een ‘entry clone’ te vormen. Vanuit deze ‘entry clone’ kan dan via een LR-reactie een ‘expression clone’ worden gemaakt. Gateway klonering biedt als voordeel dat er gemakkelijk DNA kan worden uitgewisseld met verschillende vectoren terwijl de oriëntatie en het juiste open leesraam behouden blijven. 4.5.2.1 BP-reactie In een BP-reactie kunnen DNA-fragmenten met attB-sites ingebracht worden in een donorvector (pDONR221 (VIB)). Voor de BP-reactie voegt men 1 tot 5µL (concentratie bepaald zoals in Vergelijking 1) van het PCR-product samen met 1 µL van de donorvector (150ng/µL), 2µL BP Clonase mix II (Invitrogen) en men lengt aan tot 8µL met TE-buffer (pH 8,0) (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA). Dit mengsel wordt geïncubeerd bij 25°C. Het aantal mol van het DNA moet gelijk zijn aan het aantal mol van de donorvector. De benodigde hoeveelheid van het DNA kan bepaald worden via Vergelijking 1. 25 Vergelijking 1: Berekening van de benodigde massa van het DNA voor de BP-reactie (Invitrogen Corporation 2012). ( )=( )∗( )∗ 660 ∗ 1 10 Na incubatie (gedurende minstens 1 uur) dient men 1µl proteïnase K (Invitrogen, Carlsbad CA, VS) toe te voegen en het mengsel te incuberen gedurende 10 minuten bij 37°C om de reactie te stoppen. Het BP-clonase zal het DNA-fragment met attB-sites in een vector plaatsen met attP-sites (Figuur 11). Na dit proces zal het DNA-fragment in de donorvector (de ‘entry clones’) te vinden zijn. Nadien kan via een hitteshock de vector in competente E. coli-cellen binnen gebracht worden (Top10 E. colicellen). Deze cellen worden uitgeplaat (telkens 50µL en 150µL van de celsuspensie) op vast LBmedium met 50 µg/ml kanamycine (duchefa). De kanamycine zorgt dat enkel getransformeerde cellen kunnen groeien (aangezien de donorvector een gen voor kanamycine-resistentie bevat) (Invitrogen Corporation 2003). 4.5.2.2 LR-reactie Tijdens de LR-reactie zal het DNA vanuit een ‘entry clone’ overgebracht worden naar een destinationvector met behulp van het enzym LR-clonase (Figuur 11). De attL-sites die gecreëerd werden in de donorvector door de BP-reactie zullen recombineren met de attR-sites in de destinationvector. Na de LR-reactie zal het DNA in de destinationvector geplaatst zijn. Voor de LRreactie dienen equimolaire hoeveelheden van de ‘entry clone’ en de destinationvector worden gemengd. Daarbij wordt vervolgens 2μl van het LR Clonase mix II (Invitrogen) toegevoegd, en vervolgens wordt het geheel aangelengd tot 8µL met behulp van TE-buffer. Dit mengsel wordt overnacht geïncubeerd bij kamertemperatuur. Om de reactie te stoppen, wordt 10µL proteïnase K toegevoegd. Na incubatie bij 37°C gedurende 10 minuten kan de destinationvector met het insert (‘expression clone’) in competente E. coli-cellen worden gebracht. Kolonies met de pK7WG2D-vector (VIB) (voor stabiele transformatie) worden uitgeplaat op vast LB-medium met 50 µg/ml spectinomycine(duchefa), voor kolonies met de pK7FWG2-vector (VIB) of de pK7WGF2-vector (VIB) (voor lokalisatie) wordt eveneens 50 µg/ml spectinomycine toegevoegd als selectiemerker. 26 Figuur 11: Voorstelling van de BP-(boven) en de LR-reactie (onder) (The Board of Regents of the University of Wisconsin System 2015) 4.5.3 Klonering in pJET1.2 De klonering van een bepaald DNA-fragment in pJET1.2 gebeurt uitgaande van de GeneJET PCR Cloning Kit (Thermo Scientific). De pJET1.2 vector is een gelineariseerde vector waarin DNAfragmenten met een grootte varierend van 6 tot 10000 bp geligeerd kunnen worden. DNAfragmenten die afkomstig zijn van amplificatie door middel van een proofreading enzyme (zoals pfxpolymerase) kunnen direct in de vector geligeerd worden. Fragmenten afkomstig van PCR met polymerasen zoals taq (zonder proofreading-activiteit), die overhangende eindjes plaatsen aan de PCR-producten, dienen daarentegen eerst aangepast te worden zodat deze fragmenten geen overhangende eindjes meer hebben. Dit gebeurt aan de hand van een ‘blunting enzyme’. De pJET1.2 vector met het insert kan gemakkelijk in E. coli gebracht worden. De pJET1.2 vector is weergegeven in Figuur 12. Op deze vector ligt een ampicilline resistentiegen bla(APR) en een origin of replication namelijk rep(pMB1). De multiple cloning site (waar het insert terechtkomt) ligt in het eco47IR gen. Indien de vector zich sluit zonder het gewenste DNA-fragment op te nemen zal het eco47IR gen actief worden. Daar dit eco47IR gen codeert voor een lethaal restrictie-enzyme zullen de bacteriën die het plasmide zonder insert opnemen sterven, terwijl andere bacteriën met een insert in de vector kunnen overleven en resistent zijn aan ampicilline. 27 Figuur 12: Voorstelling van de pJET1.2 vector (Thermo Fisher Scientific Inc. 2015a). Om een PCR-product dat aangemaakt werd met behulp van pfx-polymerase in de vector te ligeren dient 10µL reactiebuffer gemengd te worden met 1µL PCR-product (concentratie van het DNA is afhankelijk van de grootte van het DNA), 1µL pJET1.2 vector (50ng/µL), 1µL T4 DNA Ligase en 7µL H2O (nuclease vrij). Hierna wordt het mengsel gevortexed gedurende 3 tot 5 seconden en 5 minuten geïncubeerd bij kamertemperatuur. Het product kan direct gebruikt worden voor transformatie. De getransformeerde cellen worden uitgeplaat op LB-platen met 100 µg/ml ampicilline (Duchefa). 4.5.4 Gibson assembly De Gibson assembly dient om twee DNA-fragmenten aaneen te koppelen. Het PCR-product wordt opgezuiverd met behulp van de innuPrep PCRpure Kit (analytik Jena). Van het opgezuiverde PCRproduct en de vector wordt steeds 0,02-0,5 pmols gemengd met 10µL Gibson Assembly mix (26,7% ISObuffer (0,5M Tris-HCl pH 7,5, 0,05M MgCl2, 4mM dNTP’s (Westburg), 0,05M DTT (Sigma Aldrich) en 5mM NAD (Sigma Aldrich)), 0,053% T5 exonuclease (10 000U/ml) (NEB), 1,67% Q5 High fidelity polymerase (10 000U/ml) (NEB) en 13,3% Taq DNA ligase (40 000U/ml) (NEB)) en een variabele hoeveelheid Milli-Q tot een eindvolume van 20µL. 4.5.5 Opzetten suspensieculturen van bacteriën Uitgaande van kolonies van E. coli-cellen kunnen suspensieculturen gemaakt worden door op steriele wijze een kolonie op te pikken met een entnaald en deze te suspenderen in 5mL vloeibaar LBmedium (met een antibioticum voor selectie indien het getransformeerde E. coli-cellen zijn). Deze suspensieculturen worden geïncubeerd bij 185 tpm en 37°C. Er kunnen ook suspensieculturen van Agrobacterium tumefaciens gemaakt worden. Hierbij worden de bacteriën opgelost in 5mL vloeibaar YEB-medium (15mM sucrose (VWR), 0,1% (m/v) ‘yeast extract’ 0,5% (m/v) pepton (UCB), en 0,5% (m/v) ‘beef extract’ (LabM)) eventueel met antibiotica. Deze suspensieculturen worden bij 28°C geïncubeerd en geschud aan 200 tpm. 4.5.6 Glycerolstock Om een glycerolstock te maken wordt 800µL uit een suspensiecultuur gemengd met 400 µL glycerol (100%) in een cryovial (Greiner Bio-One). Deze glycerolstock kan bewaard worden bij -80°C. 28 4.5.7 Opzuiveren van plasmide-DNA Het opzuiveren van plasmide-DNA gebeurt met de GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo Scientific). De bacteriën die gegroeid zijn in 5 mL suspensieculturen worden overgebracht in een 2mL epje en gecentrifugeerd (bij kamertemperatuur) bij 8000tpm voor 2 minuten. Het supernatans wordt weggegoten. Dit proces wordt herhaald tot alle vloeistof in het epje gebracht werd en werd afgecentrifugeerd. De pellet wordt daarna geresuspendeerd in 250µL resuspensie oplossing door op en neer te pipetteren. Daarna wordt er 250µL lyse oplossing toegevoegd om de cellen te lyseren en het epje wordt vier tot zes keer geïnverteerd. Wanneer de oplossing viskeus en klaar is, wordt 350µL neutralisatie oplossing toegevoegd en wordt er wederom vier tot zes keer geïnverteerd. Hierna zal er gecentrifugeerd worden bij 13000tpm voor 5 minuten om chromosomaal DNA en celmateriaal neer te slaan. Het supernatans wordt op een ‘GeneJET spin column’ gebracht en er wordt 1 minuut gecentrifugeerd bij 13000tpm. Na de centrifugatie zal het plasmide-DNA gebonden zijn aan de kolom (in de ‘GeneJET spin column’) en de doorloop wordt weggegoten. Op de kolom wordt 500µL was oplossing gebracht en de kolom wordt gedurende 1 minuut gecentrifugeerd aan 13000tpm (deze stap wordt eenmaal herhaald). Nadat de doorloop is weggegoten, wordt de kolom nogmaals 1 minuut gecentrifugeerd aan 13000tpm. De kolom van de ‘GeneJET spin column’ wordt vervolgens op een vers 1,5mL epje geplaatst. Op de kolom zal 20µL bidest worden aangebracht om het plasmideDNA te elueren. Na 2 minuten incubatie op kamertemperatuur wordt 2 minuten gecentrifugeerd aan 13000tpm. Deze elutiestap wordt herhaald met 10µL bidest. Uiteindelijk zal het plasmide-DNA opgelost zijn in 30µL bidest. 4.5.8 Sequentiebepaling DNA Indien DNA moet worden gesequeneerd dient het DNA verdund te worden tot een concentratie van 100 ng/µL. Daarvan wordt steeds 20µL (10µL per sequentie bepaling, forward en reverse) in een 1,5mL epje geplaatst en opgestuurd naar LGC Genomics. 4.5.9 Eiwitexpressie in E. coli 4.5.9.1 Opgroeien E. coli BL21 De BL21-cultuur wordt ‘s avonds geïnoculeerd in 5mL vloeibaar LB-medium met 5µL ampicilline (stock is 100 mg/ml) en overnacht gegroeid bij 37°C in een shaker (185 tpm). Hieruit kan vervolgens plasmide worden geëxtraheerd. 4.5.9.2 Opgroeien E. coli rosetta De bacteriën worden ’s avonds geïnoculeerd in 5mL vloeibaar LB-medium met 5µL ampicilline en 5µL chlooramfenicol (stock is 25 mg/mL) (Duchefa). Deze cultuur wordt overnacht gegroeid bij 37°C in een shaker (185tpm). Na een nacht groeien wordt 100µL overgezet naar vers 5mL vloeibaar LBmedium met 5µL ampicilline en 5µL chlooramfenicol. Dit wordt dan gedurende 6 uur geïncubeerd bij 37°C en geschud bij 185tpm. Na deze incubatie wordt 5mL overgezet in vers 250mL LB-medium met 250µL ampicilline en 250µL chlooramfenicol. Deze suspensiecultuur wordt gedurende 2 uur bij 37°C (en 200tpm) geïncubeerd. Omdat er gewerkt wordt met een plasmide voor induceerbare expressie (bv. pET-vector) wordt de OD (bij 600nm) gemeten tijdens de incubatie van de suspensiecultuur bij 37°C. De inductie gebeurt aan de hand van 1 mM isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) (Sigma Aldrich) wanneer de OD tussen 0,5 en 0,8 bedraagt. Na de inductie worden de suspensieculturen overnacht geïncubeerd bij 25°C (en geschud bij 200tpm). Vervolgens wordt deze 29 suspensiecultuur gecentrifugeerd bij 8000 tpm gedurende 20 minuten. De cellen in de pellet worden dan ingevroren bij -20°C. 4.5.9.3 Sonicatie Aan de pellet van bacteriecellen wordt 8mL lysebuffer (lysebuffer: 49,75 mM PBS (op basis van 50 mM PBS (op pH 8): 12,92mM NaH2PO4 (VWR) en 38,39mM Na2HPO4 (VWR) met 500mM NaCl) en 10 mM imidazole (pH 7,4) (VWR)) toegevoegd en de te lyseren suspensie wordt overgebracht naar een 50mL falcon. De falcon wordt in een ijsbeker geplaatst om er voor te zorgen dat het staal niet te warm zou worden tijdens het soniceren. Vervolgens zal er driemaal gedurende 2,5 minuten gesoniceerd worden (bij 50% output). Daarna wordt het geheel gecentrifugeerd aan 9000 tpm bij 4°C. In het supernatans bevindt zich de oplosbare fractie van eiwitten en in de pellet de onoplosbare fractie. De onoplosbare fractie eiwit wordt oplosbaar gemaakt door het toevoegen van 8M ureum (Acros) tot er geen pellet meer is. Deze oplossing kan verder gebruikt worden voor SDS-PAGE. 4.5.9.4 Opzuivering eiwit uit E. coli De opzuivering van eiwit met een His-tag uit E. coli gebeurt aan de hand van Nikkelaffiniteitschromatografie. De matrix voor de kolomchromatografie is de NI-NTA agarose beads van MCLAB. Alle stappen worden uigevoerd bij een temperatuur van 4°C. Alvorens de matrix op de kolom te brengen wordt de NI-NTA agarose matrix geresuspendeerd. Dan wordt 1,5mL in een kolom gebracht van 10mL. Nadat de beads door de zwaartekracht naar de bodem gezakt zijn wordt 6mL Milli-Q-water op de kolom gebracht en wordt de matrix geresuspendeerd. Nadat de matrix dankzij de zwaartekracht uitgezakt is naar de bodem laat men het water uit de kolom lopen. Vervolgens wordt achtereenvolgens twee maal 6mL natieve bindingsbuffer (49,75 mM PBS (pH 8) en 10 mM imidazole (pH 7,4)) op de kolom gebracht en de matrix geresuspendeerd. Na het uitzakken van de matrix wordt de buffer uit de kolom verwijderd. Vervolgens wordt er 8mL van het lysaat (het supernatans met de oplosbare eiwitfractie na sonicatie) op de kolom gebracht. De matrix wordt geresuspendeerd, en gemengd met het lysaat. Het mengsel wordt gedurende 1uur geïncubeerd en zacht geschud. Na het incuberen moet de matrix precipiteren onder invloed van de zwaartekracht. De niet-gebonden eiwitfractie (doorloopfractie genoemd) wordt van de kolom verwijderd en bewaard. Vervolgens wordt de matrix vier maal gewassen door telkens 8mL natieve wasbuffer (49,5 mM PBS (pH 8) en 20mM imidazole (pH 7,4)) op de kolom te brengen en de buffer van de kolom te laten lopen. Deze wasbuffers worden eveneens bewaard. Om het proteïne te elueren wordt 8 tot 12mL natieve elutiebuffer (43,75 mM PBS (pH 8) en 250 mM imidazole (pH 7,4)) op de kolom gebracht. Er wordt telkens een 250-500µL opgevangen in een 1,5mL epje. Vervolgens kan de concentratie van het proteïne gemeten worden met behulp van de NanoDrop 2000. De eiwitfracties worden bewaard bij 4°C. De verschillende elutiefracties met hoge concentraties aan eiwit kunnen gebruikt worden voor SDS-PAGE en western blot analyse, evenals de doorloopfractie en de wasbuffers. 4.6 Tabak en tabakscellen 4.6.1 Triparentale mating Triparentale mating wordt gebruikt om een plasmide over te brengen van E. coli naar A. tumefaciens. Vervolgens kan het T-DNA doorgegeven worden aan plantencellen. Voor dit proces is naast de donorstam (E. coli) die het over te brengen plasmide bevat ook een helperstam (E. coli) nodig, deze 30 geeft een plasmide door aan de donorstam die zorgt dat plasmiden kunnen worden doorgegeven naar andere bacteriën. Nadat de donorstam het plasmide die de overdracht mogelijk maakt gekregen heeft van de helperstam kan de originele plasmide worden doorgegeven naar A. tumefaciens. Er worden suspensieculturen opgezet uitgaande van de geselecteerde E. coli-cellen met de gewenste vector (de donorstam, getransformeerde Top10 competente E. coli) in 5mL LB-medium met 2,5 µL spectinomycine (stock: 100 mg/ml). Er wordt ook een suspensiecultuur opgezet van de helperstam namelijk E. coli HB1001 pAK2013 in 5mL LB-medium met kanamycine. Deze suspensieculturen werden geïncubeerd bij 37°C en geschud bij 185tpm. Een dag voordat deze culturen werden opgezet, werd er een suspensiecultuur gestart van Agrobacterium tumefaciens (LBA4404 of C58C1). Hiervoor werd er YEB-medium gebruikt zonder antibiotica. Deze suspensiecultuur werd geïncubeerd bij 28°C en geschud op 200 tpm. Een dag na het opstarten van de suspensieculturen van de donor- en helperstam (HB1001 pAK2013) wordt er 100µL van elke stam gemengd (helperstam, Agrobacterium tumefaciens (LBA4404 of C58C1) en donorstam). Van dit mengsel wordt een druppel aangebracht op vast YEB-medium (zelfde samenstelling als vloeibaar YEB-medium, met 1,5% (m/v) agar) met MgSO4 (2mM MgSO4 (VWR)). Deze plaat wordt niet afgesloten met parafilm en wordt geïncubeerd bij 28°C. Na een dag groeien worden van de rand van de druppel bacteriën opgenomen en geresuspendeerd in 1mL vloeibaar YEB-medium. Daarna wordt een verdunningsreeks gemaakt en de 10-2, 10-3 en 10-4 verdunningen worden uitgeplaat (100µL per plaat). De uitplating gebeurt op vast YEB-medium met spectinomycine (50µg/mL) en gentamycine (20µg/ml) (Duchefa). Deze antibiotica zorgen dat enkel de getransformeerde A. tumefaciens kunnen groeien op de platen. Na de uitplating worden de platen afgesloten met parafilm en 3 dagen geïncubeerd bij 28°C. De gevormde kolonies kunnen vervolgens gescreend worden met behulp van een kolonie-PCR. 4.6.2 Transiënte transformatie van tabaksbladeren Bij transiënte transformatie van tabak (Nicotiana benthamiana) zal DNA afkomstig van het Tiplasmide van A. tumefaciens (C58C1) transiënt tot expressie gebracht worden in de epidermale cellen van tabaksplanten. Een mogelijke toepassing is te vinden in lokalisatiestudies waar GFP-fusieeiwitten transiënt tot expressie komen in cellen en de lokalisatie van de eiwitten bestudeerd wordt. Voor deze transiënte transformatie worden drie tot vier weken oude tabaksplanten gebruikt. De planten worden opgekweekt in potgrond bij een temperatuur van 28°C. Er wordt allereerst een suspensiecultuur opgezet van de A. tumefaciens (C58C1) die het plasmide bevat met de gewenste sequentie die tot expressie moet komen in de plant. Hiervoor worden de bacteriën gedurende een tweetal dagen gegroeid in 5mL YEB-medium bij 28°C en geschud bij 200tpm. In dat medium wordt 1µL gentamycine(100 mg/ml) en 2,5µl spectinomycine (stock: 100 mg/ml) (afhankelijk van het resistentiegen) toegevoegd voor selectie. Na twee dagen groeien wordt de cultuur overgebracht naar een 2mL epje en gecentrifugeerd bij 7000 tpm gedurende 10 minuten. Het supernatans wordt verwijderd en de pellet wordt tweemaal gewassen door de pellet te resuspenderen in 1 mL infiltratiebuffer en te vortexen. Vervolgens wordt gedurende 2 minuten gecentrifugeerd bij 7000 tpm waarna het supernatans wordt verwijderd. De infiltratiebuffer bestaat uit 50 mM MES monohydraat (Sigma Aldrich), 2 mM Na2HPO4 en 0,5% glucose (Merck) in 100mL bidest en heeft een pH van 5,6 voor optimale efficiëntie. Na het wassen wordt de pellet opgelost in 1mL infiltratiebuffer met 100 µmol/L acetosyringone (Sigma Aldrich). Van dit mengsel wordt de optische densiteit (OD) gemeten bij een golflengte van 600nm in een spectrofotometer. Vervolgens wordt het mengsel verdund tot 31 OD’s van: 0,1, 0,05 en 0,01. Deze verdunningen worden met behulp van een spuit zonder naald in de onderkant van het blad gespoten van een tabaksplant. De geïnfiltreerde bladstukjes worden na één tot twee dagen uitgesneden en op een microscopisch draagglas (Thermo Scientific) gelegd samen met water, en afgedekt met een dekglas (VWR). Deze preparaten kunnen bekeken worden onder een confocale fluorescentiemicroscoop (Nikon A1R). 4.6.3 Infiltratie van DAPI in tabaksbladeren De infiltratie van DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) (Thermo Scientific) in bladeren van tabak dient om de celkern te kleuren aangezien DAPI bindt met DNA. Opgeloste DAPI met een concentratie van 10µg/mL wordt met behulp van een spuit zonder naald in het blad gespoten van een tabaksplant. Deze planten worden vervolgens gedurende 20-30 minuten in het donker geplaatst. Hierna worden de bladstukjes uitgesneden en op een draagglas gelegd samen met water, en afgedekt met een dekglas. Deze preparaten worden bekeken onder een fluorescentiemicroscoop. 4.6.4 Stabiele transformatie van BY-2 cellen Bij een stabiele transformatie van BY-2 cellen zullen deze cellen DNA afkomstig van het Ti-plasmide van A. tumefaciens (LBA4404) stabiel tot expressie brengen. De BY-2 cellen worden opgekweekt in schudcultuur (185 tpm) bij een temperatuur van 25°C. Een BY-2 cultuur bestaande uit ongetransformeerde cellen wordt verdund. Er wordt eens 2mL, 3mL en 4mL cultuur in vers 40mL vloeibaar BY-2-medium (0,43% (m/v) Murashige & Skoog medium (Duchefa), 0,088M sucrose en 1,47mM KH2PO4 (VWR)) met 100µg/ml BY-2 vitaminen (1,8mM 2,4D (Duchefa), 2,96mM thiamineHCl (Duchefa) en 0,55M myo-inositol (Duchefa) geplaatst. Deze verdunningen worden geïncubeerd bij 25°C en geschud bij 185tpm. Terzelfdertijd wordt een suspensiecultuur opgezet van de A. tumefaciens (LBA4404) die het plasmide bevat met de gewenste sequentie die tot expressie moet komen in de BY-2 cellen. De A. tumefaciens wordt in 5mL YEB gebracht met antibiotica namelijk 1µL gentamycine (100 mg/ml) en 2,5µL spectinomycine. Deze suspensiecultuur wordt geïncubeerd bij 28°C en geschud bij 200 tpm. Twee dagen later wordt 1mL van de A. tumefaciens cultuur in 5mL YEB verdund en geïncubeerd bij 28°C en geschud bij 200 tpm. Een dag later wordt telkens 4mL BY-2 cultuur uit elke verdunning overgezet naar een lege petriplaat. Daarbij wordt telkens 300µL A. tumefaciens gemengd uit de suspensiecultuur. De petriplaten worden afgesloten met chirurgische tape en geïncubeerd bij 28°C gedurende twee dagen. De overblijvende BY-2 cellen worden verder gegroeid voor een nacht. De overgebleven A. tumefaciens suspensiecultuur wordt opnieuw verdund (1ml in 5ml YEB en geïncubeerd gedurende een nacht bij 28°C en bij 200tpm. De volgende dag zal weer 4mL van elke BY-2 verdunning gemengd worden met 300µL A. tumefaciens. Deze petriplaten worden ook afgesloten en geïncubeerd bij 28°C voor twee dagen. Na twee dagen incubatie van het mengsel van bacteriën en BY-2 cellen wordt het geheel uitgespreid op een plaat met vast BY-2 medium (zelfde samenstelling als vloeibaar BY-2 medium met 0,65% (m/v) agar), 100µg/ml BY-2 vitaminen) en antibiotica: 500µg/ml carbenicilline (Duchefa), 200µg/ml vancomycine (Sigma Aldrich) en 100µg/ml kanamycine. Vancomycine en carbenicilline doden alle A. tumefaciens terwijl kanamycine gebruikt wordt om te selecteren naar getransformeerde BY-2 cellen aangezien op het ingebrachte DNA ook een kanamycine resistentiegen ligt. Na 14 tot 21 dagen groeien er BY-2 calli op de platen die dan overgezet worden naar nieuwe platen (met antibiotica). Als de calli groot genoeg zijn kan een suspensiecultuur gestart worden door de calli in 20mL vloeibaar BY-2 medium te brengen. Deze vloeibare cultuur kan dan opgeschaald worden tot 40mL. 32 4.6.5 Screenen op fluorescentie Het is mogelijk om stabiel getransformeerde BY-2 cellen te screenen op fluorescentie door gebruik te maken van een UV-scanner (fujifilm). Indien BY-2 cellen stabiel getransformeerd worden voor eiwitproductie ligt er op het ingebrachte DNA naast het gen voor het gewenste eiwit en een selectiemerker ook een gen voor eGFP productie. Het idee is dat calli die veel eGFP produceren ook een vrij grote expressie zullen hebben van het gewenste gen. Met de fujifilm kan men gemakkelijk en snel een hele plaat vast BY-2 medium met verschillende calli screenen om dan de meest fluorescente calli te bekijken onder een fluorescentiemicroscoop. De calli werden gesuspendeerd in 100µL water en op een dekglaasje geplaatst om deze te bestuderen op fluorescentie in de confocale fluorescentiemicroscoop. 4.6.6 Extractie van nucleïnezuren uit BY-2 cellen 4.6.6.1 DNA extractie Voor de extractie van genomisch DNA is een CTAB-buffer (54,88mM CTAB (Sigma Aldrich), 0,1 M TrisHCl (pH 7,5), 1,4 M NaCl, 20 mM EDTA (pH 7,5) in 10mL Milli-Q) nodig. De cellen uit een BY-2 suspensiecultuur (40mL) worden na 7 dagen groeien via vacuümfiltratie afgezonderd van het medium. De cellen worden vervolgens gecrushed in een mortier met vloeibare stikstof en in een 2mL epje gebracht. Daarna wordt 1mL van de CTAB-buffer toegevoegd bij 65°C en er wordt gevortexed. Dit mengsel wordt gedurende 90 minuten geïncubeerd bij 65°C en continu geschud. Na deze incubatiestap wordt het mengsel afgekoeld bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten alvorens 500µl van een chloroform (Thermo Scientific)/iso-amylalcohol (VWR) (24/1) mengsel wordt toegevoegd. Hierna wordt het mengsel 5 minuten lang geïnverteerd. Het mengsel wordt gecentrifugeerd aan 13000tpm voor 10 minuten. Na centrifugatie wordt de waterige fase naar een nieuw epje overgebracht. Door het toevoegen van 1mL isopropanol (Merck) en het inverteren van het epje precipiteert het DNA. Om het DNA af te scheiden moet er gecentrifugeerd worden aan 13000tpm gedurende 10 minuten. Daarna kan het supernatans verwijderd worden en kan het DNA gewassen worden met 500µL van een mengsel van 76% ethanol en 0,2 M NaOAc (VWR). Het DNA met de wasvloeistof wordt geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Vervolgens wordt het mengsel gedurende 10 minuten gecentrifugeerd aan 13000tpm. De wasvloeistof wordt dan verwijderd en vervangen door 500µL van een mengsel bestaande uit 76% ethanol en 10 mmol/L NH4OAc (VWR). Dit mengsel wordt geïncubeerd gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Daarna wordt het mengsel voor 10 minuten gecentrifugeerd aan 13000tpm en wordt de ethanol verwijderd. Het DNA wordt vervolgens gedurende 20 minuten gedroogd bij 37°C en daarna opgelost in 50µL water. 4.6.6.2 RNA extractie Het materiaal dat gebruikt wordt tijdens de RNA-extractie wordt vooraf geautoclaveerd en behandeld met RNase away (Molecular BioProducts) en 70% disolol (Chem-lab NV) om eventuele RNasen te vernietigen. Het celmateriaal wordt allereerst gecrushed in een mortier met vloeibare stikstof. Het verpoederde materiaal wordt in 2mL epjes gebracht en hieraan wordt 1mL TRIzol (Sigma Aldrich) toegevoegd in een trekkast. Dan wordt het geheel gevortexed en gedurende 10 minuten geïncubeerd bij kamertemperatuur. Na deze incubatiestap wordt er opnieuw gevortexed waarna er 5 minuten gecentrifugeerd wordt bij 12000tpm. Het supernatans wordt overgebracht naar een nieuw epje. Bij deze vloeistof wordt 250µL chloroform gepipetteerd en het geheel wordt gedurende 15 seconden geschud en vervolgens voor 2 tot 3 minuten geïncubeerd bij kamertemperatuur. Na 15 33 minuten centrifugatie bij 14000tpm en bij 4°C zijn er drie lagen zichtbaar en wordt de waterige (bovenste) laag overgebracht naar een nieuw epje. Vervolgens wordt 0,5mL isopropanol toegevoegd, de oplossing wordt zachtjes gemengd en na incubatie voor 10 minuten bij kamertemperatuur wordt het geheel 10 minuten gecentrifugeerd bij 12000tpm en 4°C. Vervolgens wordt de pellet gewassen in 1 mL 75% ethanol. Om de pellet opnieuw te precipiteren centrifugeert men 5 minuten bij 4°C en bij 7500tpm. Na het verwijderen van de ethanol wordt de pellet gedroogd in een trekkast. Eens de pellet droog is, wordt 50µL bidest toegevoegd om de pellet op te lossen. Op deze 50µL RNA-oplossing wordt vervolgens een DNAse behandeling uitgevoerd om het eventuele contaminerende DNA af te breken. Hiervoor wordt 12µL van het RNA-staal in een eppendorf gemengd met 2µL DNase buffer (10X) (Thermo Scientific), 2µL DNase I (Thermo Scientific) en 4µL Milli-Q-water. Dit mengsel wordt geïncubeerd bij 37°C voor 30 minuten. Vervolgens wordt 2µL EDTA toegevoegd (25 mM). Het geheel wordt voor 10 minuten geïncubeerd bij 65°C. Na deze laatste incubatie wordt de RNA concentratie gemeten. 4.6.6.3 cDNA synthese Het RNA kan omgezet worden tot cDNA met de iScript™ select cDNA Synthesis Kit van Bio-Rad. De gebruikte primer is een oligo(dT)-primer. Om RNA om te zetten naar cDNA wordt er 4µL 5X iScript reactiemix, 1µL iScript reverse transcriptase gemengd met een oplossing van 1µg RNA en aangelengd tot 20µL met nucleasevrij water. Dit mengsel wordt eerst 5 minuten geïncubeerd bij 25°C, vervolgens 30 minuten bij 42°C en dan uiteindelijk 5 minuten bij 85°C. Na deze incubatiestappen is het cDNA gevormd en kan het bewaard worden bij -20°C (Bio-Rad Laboratories Inc. 2015). 4.6.7 Eiwitextractie uit BY-2 suspensiecultuur Van een BY-2 suspensiecultuur wordt 10mL genomen, door vacuumfiltratie wordt het medium gescheiden van de cellen. De cellen worden vervolgens gecrushed tot een homogeen poeder in een mortier met vloeibare stikstof, en uitverdeeld over 2mL epjes. Aan de verpoederde cellen wordt dan de extractiebuffer (50 mM DAP (VWR) buffer (pH 10) of 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7,5)) toegevoegd. Beide buffers bevatten ook 1 mM EDTA, 1mM DTT (Sigma Aldrich) en 1 mM PMSF (Amresco). Dan wordt het volume van één pcr-epje aan glazen beads toegevoegd en het mengsel wordt acht keer afwisselend 30 seconden op ijs en 30 seconden gevortexed. Vervolgens zal het geheel worden gecentrifugeerd bij 3000g gedurende 10 minuten. De oplosbare fractie van de eiwitten is te vinden in het supernatans. 34 5 Resultaten In deze thesis werd de lokalisatie van twee RIP-chimeren bestudeerd namelijk RIP-C19 en RIP-M41. De lokalisatie van een eiwit kan een indicatie geven omtrent de mogelijke fysiologische rol van deze proteïnen, en levert bovendien belangrijke informatie voor vervolgexperimenten. In een tweede deel van het eindwerk werd ook gezocht naar een geschikt heteroloog expressiesysteem om deze eiwitten recombinant aan te maken. Het produceren en opzuiveren van de proteïnen is zeer belangrijk aangezien het opgezuiverde eiwit later gebruikt kan worden in toxiciteitstesten en activiteitstesten. Ook is het mogelijk om op basis van het opgezuiverde eiwit specifieke antilichamen te produceren. Deze antilichamen kunnen op hun beurt gebruikt worden in immunolokalisatiestudies die kunnen aangeven in welke weefsels van de plant de proteïnen te vinden zijn. De sequenties van RIP-C19 en RIP-M41 zijn te vinden in Figuur 43 en Figuur 44 (bijlage). De gebruikte primers zijn weergegeven in Tabel 6 (bijlage). 5.1 Lokalisatie van RIP-M41 en RIP-C19 In deze thesis werd een lokalisatiestudie uitgevoerd voor het RIP-M41 uit rijst en RIP-C19 uit tarwe in tabak. Hiervoor werden fusieconstructen aangemaakt waarbij de RIP-M41 en RIP-C19 eiwitten gekoppeld werden aan eGFP. De koppeling van eGFP aan de eiwitten zorgde ervoor dat deze eiwitten gevisualiseerd kunnen worden met behulp van fluorescentiemicroscopie. De fusie van de coderende sequentie van RIP-C19 en RIP-M41 met eGFP gebeurde steeds N- of C-terminaal met behulp van gateway-technologie. Het RIP-M41 construct met de C-terminale eGFP wordt voorgesteld als RIPM41-eGFP, met de N-terminale fusie als eGFP-RIP-M41. Het RIP-C19 construct met de C-terminale eGFP wordt voorgesteld als RIP-C19-eGFP, met de N-terminale fusie als eGFP-RIP-C19. 5.1.1 Aanmaak van de lokalisatieconstructen 5.1.1.1 Additie van attB-sites Voor de lokalisatie dienden speciale constructen gemaakt te worden waarbij de coderende sequenties van het RIP-M41 en het RIP-C19 uit respectievelijk rijst en tarwe werden geamplificeerd en voorzien van attB-sites. Via een BP reactie werden deze sequenties ingebracht in een donorvector, waarna vervolgens via een LR-reactie de ‘expression clones’ tot stand kwamen. In deze ‘expression clones’ werd de sequentie van de RIP’s gefusioneerd met deze van het eGFP. Figuur 13 geeft de schematische weergave van de lokalisatieconstructen. Aan de open leesramen werden attB-sites aangebracht (Figuur 13, blauwe gedeelte) met behulp van twee opeenvolgende PCR-reacties voor elk construct: RIP-M41 en RIP-C19. Voor de C-terminale GFP-fusieconstructen werd het stopcodon in de RIP sequentie verwijderd zodat bij de C-terminale fusie van eGFP de RIP sequentie overgaat in de eGFP sequentie. De primers voor de eerste PCR bevatten een sequentiespecifiek deel en het eerste deel van de attB-site. De primers voor de tweede PCR zijn telkens complementair aan het eerste deel van de attB-site en vullen het tweede deel van de attB-site aan. De template voor de PCR-reactie was telkens een pJET1.2 vector waarin de cDNA sequentie voor het RIP-C19 of RIP-M41 aanwezig was. Deze vectoren waren reeds beschikbaar in het laboratorium. 35 Figuur 13: Schematische voorstelling van de N- en C-terminale fusie van het RIP-M41 met eGFP (A en B, respectievelijk), evenals de N- en C-terminale fusie van het RIP-C19 met eGFP (C en D, respectievelijk). Alle PCR-reacties werden uitgevoerd met een polymerase met proofreading-activiteit, waardoor de kans op mutaties in de sequenties kleiner is. Het RIP-M41 construct met de attB-sites heeft een lengte van ongeveer 1945bp terwijl het RIP-C19 construct na de twee PCR’s een lengte heeft van ongeveer 1885bp. Figuur 14 toont het resultaat van de analyse van DNA-fragmenten na de tweede PCR. Het is duidelijk dat de DNA-bandjes van alle constructen vrij dicht liggen tegen de 2000bpmerker van de ladder. De concentratie en zuiverheid van het DNA werd gemeten met behulp van de NanoDrop 2000. De concentraties van het DNA zijn telkens vrij hoog (ongeveer 350 ng/µL), wat wijst op succesvolle PCR-reacties. Figuur 14: Analyse van DNA-fragmenten na twee PCR-reacties voor het bevestigen van de attB-sites aan de RIP sequenties. RM staat voor RIP-M41, RC staat voor RIP-C19, -N staat voor het N-terminale construct en -C staat voor het C-terminale construct. Voor de twee PCR-reacties werd een annealingstemperatuur van 55°C gebruikt, een extentietijd van 2 minuten en werden 30 cycli doorlopen. De gebruikte primers zijn: P118, P119, P120, P121, P122 en P123. De forward en reverse primers in de tweede PCR-reactie waren EVD2 en EVD4. 5.1.1.2 Kloneren van de lokalisatieconstructen 5.1.1.2.1 BP-reactie Nadat de attB-sites aan de coderende sequenties van de RIP’s werden bevestigd, werd een BPreactie opgezet om de constructen via de attB-sites binnen te brengen in de pDonr221 donorvector. Het amplificatieproduct van de PCR-reacties werd samengebracht met de vector en met behulp van het enzyme BP-clonase werden de constructen geligeerd in de donorvector. Na de BP-reactie werden de bekomen ‘entry clones’ via heat-shock binnengebracht in heat-shock competente E. coli cellen. Na de heat-shock transformatie werden de E. coli-cellen uitgeplaat op LB-meduim met kanamycine als selectiemerker zodat enkel de getransformeerde E. coli-cellen konden groeien. Op een vijftal 36 kolonies werd een kolonie-PCR uitgevoerd. In Figuur 15 is het resultaat te zien van de kolonie-PCR. Bij een aantal kolonies is te zien dat het PCR-product de verwachte grootte heeft (voor het RIP-M41 construct ongeveer 1911bp en het RIP-C19 construct ongeveer 1851bp). Voor elk construct werd een kolonie geselecteerd waarvan een suspensiecultuur werd gegroeid in LB-medium met kanamycine. De plasmiden werden uit de bacteriën geëxtraheerd met behulp van de QIAprep Spin Miniprep Kit en de sequentie van het construct werd gecontroleerd met behulp van DNA-sequencing. Voor RIP-M41eGFP had kolonie 1 de correcte sequentie, voor eGFP-RIP-M41 had kolonie 6 de correcte sequentie. Kolonie 1 had de correcte sequentie voor RIP-C19-eGFP, kolonie 2 voor eGFP-RIP-C19. Figuur 15: Agarosegelelektroforese na kolonie-PCR. RM staat voor RIP-M41, RC staat voor RIP-C19, -N staat voor het N-terminale construct en -C staat voor het C-terminale construct. De gebruikte primers waren P118, P119, P120, P121, P122 en P123. In de PCR werd een annealingstemperatuur van 55°C en een extentietijd van 2 minuten gebruikt voor 30 cycli. 5.1.1.2.2 LR-reactie Van de kolonies met een correcte sequentie van het BP product werden bacterieculturen gemaakt voor een opzuivering van het plasmide-DNA met behulp van de QIAprep Spin Miniprep Kit. Dit DNA werd gebruikt voor de LR-reactie waarbij de sequenties voor het RIP-C19 en het RIP-M41 overgebracht werden naar de destinationvectoren, waar de fusie gebeurt met het eGFP. De gebruikte vectoren zijn de pK7WGF2-vector voor de N-terminale fusie en de pK7FWG2-vector voor de C-terminale fusie van het RIP met eGFP (Figuur 16). 37 Figuur 16: De destinationvectoren en ‘expression clones’ die gebruikt worden in de lokalisatiestudie. A en B: pK7WGF2-vector zonder en met RIP insert. C en D: pK7FWG2-vector zonder en met RIP insert (Thermo Fisher Scientific Inc. 2015e). De bekomen ‘expression clones’ na LR-reactie werden vervolgens ingebracht in heat-shock competente cellen (E. coli). Na de heat-shock werden de E. coli -cellen uitgeplaat op LB-medium met spectinomycine als selectiemerker. Om te screenen welke bekomen kolonies de correcte ‘expression clones’ hadden opgenomen werd een kolonie-PCR uitgevoerd. Figuur 17 toont het elektroforesepatroon voor de DNA-fragmenten en geeft aan dat DNA-fragmenten met de verwachte grootte werden geamplificeerd tijdens de koloniePCR, ongeveer 2600bp voor RIP-M41-eGFP, ongeveer 2400bp voor eGFP-RIP-M41, ongeveer 2540bp voor RIP-C19-eGFP en ongeveer 2360bp voor eGFP-RIP-C19. Voor de C-terminale constructen werd telkens kolonie 5 geselecteerd, voor de N-terminale telkens kolonie 1. Figuur 17: Agarosegelelektroforese van DNA-fragmenten geamplificeerd in kolonie-PCR na de LRreactie. RM staat voor RIP-M41, RC staat voor RIP-C19, -N staat voor het N-terminale construct en -C staat voor het C-terminale construct. De gebruikte primers voor de N-terminale constructen waren EVD668 en P1. Voor de C-terminale constructen waren de primers EVD472 en EVD667. In de PCRreactie werd een annealingstemperatuur van 55°C, een extensietijd van 2 minuten en 35 seconden gebruikt en er werden 32 cycli uitgevoerd. 38 5.1.2 Transformatie van Agrobacterium tumefaciens Het uiteindelijke doel is het transiënt transformeren van plantencellen zodat deze cellen de fusieconstructen aanmaken. Agrobacterium tumefaciens is een plantpathogeen die in staat is om een stuk DNA dat gelegen is op de Ti-plasmide over te brengen naar planten. Dit kan resulteren in stabiele transformatie van plantencellen, maar ook transiënte transformatie is mogelijk. Voor de transiënte transformatie van tabaksbladeren werden A. tumefaciens getransformeerd via triparentale mating. Hierbij werden de ‘expression clones’ naar A.tumefaciens overgebracht. Deze getransformeerde A. tumefaciens werden uitgeplaat op YEB platen met spectinomycine en gentamycine zodat enkel de getransformeerde A. tumefaciens kunnen groeien op de platen. De kolonies die op deze platen groeiden werden geanalyseerd met een kolonie-PCR (Figuur 18). Alle kolonies bevatten een DNA-fragment op de verwachte hoogte, dichtbij 2500bp. Voor het RIP-M41 met de N-terminale eGFP werd verdergewerkt met kolonie 3, voor de C-terminale eGFP met kolonie 1. Voor het RIP-C19 met de N-terminale eGFP werd kolonie 5 gekozen, voor de C-terminale eGFP kolonie 2. Figuur 18: Agarosegel van de kolonie-PCR na de triparentale mating. RM staat voor RIP-M41, RC staat voor RIP-C19, -N staat voor het N-terminale construct en -C staat voor het C-terminale construct. De gebruikte primers voor de N-terminale constructen waren EVD668 en P1. Voor de Cterminale constructen waren de primers EVD472 en EVD667. Er werden 32 cycli uitgevoerd met een annealingstemperatuur van 55°C en een extensietijd van 2 minuten en 35 seconden. 5.1.3 Transiënte expressie in Nicotiana benthamiana De getransformeerde A. tumefaciens zijn na de triparentale mating in staat om de epidermiscellen van Nicotiana benthamiana bladeren transiënt te transformeren. Er werden suspensieculturen gemaakt van de getransformeerde A. tumefaciens. Verschillende experimenten werden uitgevoerd waarbij de OD van de suspensiecultuur bij 600nm steeds werd gemeten. Deze OD geeft een idee over de groeifase van de bacteriën. Het is belangrijk dat de bacteriën niet in of voorbij de stationaire groeifase zijn. Het was duidelijk dat de efficiëntie van de transiënte transformatie afhankelijk was van de OD’s van de bacterieculturen. Een getransformeerde A. tumefaciens die een expressievector bevat met een gen voor vrij eGFP werd gebruikt als positieve controle. Als negatieve controle werd steeds een plant geïnfiltreerd met infiltratiebuffer zonder bacteriën. De infiltratie van tabaksbladeren werd verschillende malen uitgevoerd. Aangezien de groei (OD) van de suspensieculturen van groot belang bleek te zijn voor een efficiënte transformatie was er optimalisatie nodig. Deze optimalisatie gebeurde door het variëren van het inoculum en de incubatietijd. Uiteindelijk werden fluorescente cellen waargenomen voor het eGFP-RIP-M41 (OD van 39 de suspensiecultuur: 1,298), RIP-M41-eGFP (OD: 1,217), eGFP-RIP-C19 (OD: 1,212; 0,691; 0,421 en 0,3675), RIP-C19-eGFP (OD: 1,308; 1,214; 1,3695 en 1,210) en het eGFP (OD: 1,418). De fluorescentie van het eGFP in de transiënt getransformeerde epidermiscellen werd geanalyseerd met behulp van fluorescentiemicroscopie (Figuur 19). Extra figuren zijn te vinden in de bijlage (Figuur 60 tot Figuur 67). Het vrij eGFP is aanwezig in het cytoplasma, maar kan ook via passieve diffusie in de kern terechtkomen (zie de homogeen gekleurde nucleus in Figuur 19 bij het vrij eGFP). Wanneer de fluorescentie voor de planten geïnfiltreerd met de RIP constructen wordt vergeleken met de fluorescentie van het vrij eGFP is er een duidelijke indicatie dat het RIP-M41 en het RIP-C19 cytoplasmatisch gelokaliseerd zijn. Omdat er toch een beperkte hoeveelheid fluorescentie in de kern te zien is werd een colokalisatie uitgevoerd. Figuur 19: Lokalisatie van A. eGFP-RIP-M41, B. RIP-M41-eGFP, C. eGFP-RIP-C19, D. RIP-C19-eGFP en E. vrij eGFP. 5.2 Colokalisatie van RIP-M41 en RIP-C19 met DAPI Colokalisatie maakt gebruik van twee fluorescente moleculen. Deze twee moleculen worden samengebracht in één cel. De mate van overlap tussen de fluorescente signalen kan een indicatie leveren of de twee moleculen in hetzelfde compartiment aanwezig zijn in de cel. In deze thesis werd gebruik gemaakt van de fluorescentie van 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) en eGFP (geïncorporeerd in de lokalisatieconstructen). DAPI bindt met DNA en zal zorgen dat de kern fluorescent wordt. Indien het RIP-M41 en het RIP-C19 in de kern aanwezig zijn zal het signaal van het eGFP en het signaal van DAPI overlappen. Voor de colokalisatie studies werden dezelfde getransformeerde A. tumefaciens gebruikt als voor de lokalisatiestudies die hierboven werden vermeld. Er werden suspensieculturen gemaakt van de getransformeerde A. tumefaciens. Er werden 40 na optimalisatie fluorescente cellen waargenomen voor het eGFP-RIP-M41 (OD: 0,302), RIP-M41eGFP (OD: 0,722), eGFP-RIP-C19 (OD: 0,727), RIP-C19-eGFP (OD: 0,811) en het eGFP (OD: 0,669). In Figuur 20 zijn de epidermiscellen te vinden die de fusieconstructen tot expressie brengen en een kern hebben die gekleurd is door DAPI. Bijkomende foto’s zijn weergegeven in de bijlagen (Figuur 68, Figuur 69 tot Figuur 74). DAPI zorgt voor een blauwe fluorescentie in de nucleus. In het geval van het vrije eGFP is er een duidelijke overlap te zien tussen het DAPI en het eGFP, de nucleus is duidelijk lichtgroen gekleurd door de overlap. Bij de lokalisatieconstructen is de nucleus steeds blauw gekleurd zoals de omliggende niet-getransformeerde cellen, er is sprake van weinig tot geen overlap. Deze foto’s geven een indicatie dat het RIP-M41 en het RIP-C19 enkel in het cytoplasma aanwezig zijn, en niet in de nucleus. Figuur 20: Colokalisatie van A. eGFP-RIP-M41, B. RIP-M41-eGFP, C. eGFP-RIP-C19, RIP-C19-eGFP en E. vrij eGFP. 5.3 Heterologe expressie van RIP-M41 en RIP-C19 in BY-2 cellen In deze thesis werd gezocht naar een geschikt expressiesysteem om het RIP-M41 en het RIP-C19 recombinant aan te maken. Om opzuivering mogelijk te maken werd gebruik gemaakt van een Histag. In de onderzoeksgroep werden reeds expressieconstructen gemaakt voor BY-2 cellen. Deze expressieconstructen bestonden uit het RIP-M41 en het RIP-C19 waaraan een signaalpeptide en een His-tag bevestigd was. Hierdoor kwam het RIP in kwestie in het extracellulair medium terecht. Deze aanpak leverde geen detecteerbaar recombinant eiwit op, alhoewel kon bewezen worden dat er transcriptie was van het ingebrachte DNA. Daardoor werd voor een andere strategie geopteerd. 41 Uitgaande van constructen waarin de sequentie voor het RIP-M41 en het RIP-C19 met het signaalpeptide en de His-tag reeds aanwezig waren, werden nieuwe constructen aangemaakt waarbij deze RIP’s werden voorzien van een His-tag en een ER-retentiesignaal (aminozuursequentie: KDEL). Dit ER-retentiesignaal zorgt dat de eiwitten in het endoplasmatisch reticulum (ER) blijven. Deze constructen werden via A. tumefaciens in BY-2 cellen ingebracht. 5.3.1 KDEL-constructen Om de strategie te testen werden twee constructen aangemaakt: het volledige RIP-M41 met een KDEL-signaal (aangeduid met RIP-M41-KDEL) en het RIP-domein van het RIP-M41 met een KDELsignaal (het RIP(M41)-KDEL construct). De constructen zijn weergegeven in Figuur 21. De constructen bevatten een N-terminaal signaalpeptide (donkerblauw) dat zorgt voor de secretie van het eiwit. Dit signaalpeptide wordt gevolgd door een knipplaats voor het Xa protease (in paars). Na deze knipplaats komt het eigenlijke RIP-M41 of het RIP-domein dat gevolgd wordt door een linker bestaande uit drie glycines (geel). Na de eerste linker komt de His-tag die bestaat uit zes opeenvolgende histidines (lichtblauw). Hierna komt opnieuw een linker en uiteindelijk een C-terminaal ER-retentiesignaal (oranje) dat ervoor zorgt dat het eiwit in het ER blijft. Figuur 21: Schematische voorstelling van het volledige RIP-M41-KDEL construct (A) en het RIP(M41)KDEL construct (B). 5.3.1.1 Aanmaak van de KDEL-constructen 5.3.1.1.1 attB-sites en KDEL-signaal adheren De aanmaak van constructen startte vanuit eerder aangemaakte ‘entry clones’. De forward primer van de eerste PCR heeft een specifiek gedeelte voor het signaalpeptide en een gedeelte voor het aanbrengen van het eerste deel van de attB1-site. De reverse primer bevat een specifiek gedeelte complementair aan de His-tag en zal het KDEL-signaal aanbrengen aan het construct. Na deze eerste PCR werd een tweede PCR uitgevoerd die de attB1-site vervolledigt en die het eerste deel van de attB2-site aanbrengt. Vervolgens werd met behulp van een laatste PCR-reactie de attB2-site vervolledigd. De agarosegel na elektroforese is weergegeven in Figuur 22. Er is telkens een DNAfragment te zien op de correcte hoogte (het RIP-M41-KDEL is ongeveer 2071bp, het RIP(M41)-KDEL is ongeveer 1081bp). 42 Figuur 22: Agarosegelektroforese van het PCR-product na de PCR-reacties voor het aanmaken van de constructen.De primers in de eerste PCR waren EVD607 en P134. De primers voor de tweede PCR waren EVD2 en P135. De primers voor de derde PCR waren EVD2 en EVD4. Voor de PCR-reacties werden 30 cycli gebruikt, de extensietijd bedroeg 2 minuten en 30 seconden en de annealingstemperatuur was 55°C. 5.3.1.1.2 Kloneren van de constructen 5.3.1.1.2.1 BP-reactie BP reactie dient om de eerder geconstrueerde fragmenten via de attB-sites binnen te brengen in de pDonr221 donorvector. Het amplificatieproduct van de voorgaande PCR-reacties werd samengebracht met de vectoren, en via het enzyme BP-clonase, de attB-sites (op het insert) en de attP-sites (op de vector) werden ‘entry clones’ gevormd. Hierna werd een heat-shock uitgevoerd waardoor de ‘entry clones’ ingebracht werden in heat-shock competente cellen (E. coli). Vervolgens werden deze cellen uitgeplaat op een plaat die LB-medium en kanamycine bevat, zodat enkel de getransformeerde E. coli-cellen konden groeien. Op de groeiende kolonies werd een kolonie-PCR uitgevoerd met als doel het identificeren van kolonies die de vector met het gewenste insert bevatten. Er werden telkens 4 kolonies van elk construct opgepikt voor de kolonie-PCR. In Figuur 23 is te zien dat er steeds een PCR-product gevormd is op de correcte hoogte voor alle kolonies, de grootte voor het geamplificeerde DNA uit de vector met het RIP-M41-KDEL is ongeveer 2301bp, uit de vector met het RIP(M41)-KDEL is de grootte van het geamplificeerde DNA ongeveer 1311bp. Uit sequencing bleek dat de tweede kolonie voor zowel het RIP-M41-KDEL als het RIP(M41)-KDEL de correcte DNA-sequentie hadden. 43 Figuur 23: Agarosegel na kolonie-PCR van het BP-product. RM staat voor RIP-M41 en R(M) voor het RIP-domein van RIP-M41. De gebruikte primers waren EVD386 en EVD387. Er werden 30 cycli uitgevoerd met een annealingstemperatuur van 55°C en een extensietijd van 2 minuten en 30 seconden. 5.3.1.1.2.2 LR-reactie Na de BP-reactie werd een LR-reactie uitgevoerd op het opgezuiverde plasmide-DNA van de geselecteerde kolonies. De destinationvector is de pK7WG2D-vector. De ‘entry clones’ werden met de destinationvector in TE buffer samengevoegd en door de aanwezigheid van het LR-clonase vond de LR-reactie plaats. Hierna werden de vectoren door een heat-shock in competente cellen gebracht en werd een kolonie-PCR uitgevoerd. De elektroforese van de PCR-producten is te zien in Figuur 24. Er is een bandje te zien op de correcte hoogte voor het RIP-M41-KDEL en bij elke kolonie van het het RIP(M41)-KDEL (de grootte voor het geamplificeerde DNA uit de vector met het RIP-M41-KDEL is ongeveer 2712bp, uit de vector met het RIP(M41)-KDEL is de grootte ongeveer 1722bp). Figuur 24: Agarosegelelektroforese van het PCR-product na kolonie-PCR van het LR-product in E. coli. In de PCR-reactie vonden 30 cycli plaats met een annealingstemperatuur van 55°C en een extensietijd van 3 minuten. De gebruikte primers waren EVD472 en P1. 5.3.1.2 Transformatie van Agrobacterium tumefaciens Er werd vanuit de geselecteerde kolonies (voor het RIP(M41)-KDEL was dit kolonie 1) uit de koloniePCR een triparentale mating uitgevoerd. De vector werd daarbij in A. tumefaciens-cellen ingebracht. De getransformeerde cellen werden uitgeplaat op vast YEB-medium met spectinomycine en gentamycine als selectiemerker. Na een incubatietijd van drie dagen werd een kolonie-PCR uitgevoerd. In Figuur 25 is de agarosegel na elektroforese van het amplificatieproduct van de kolonie-PCR te zien. De bandjes bij elke kolonie zijn aanwezig op de correcte hoogte, de grootte van 44 het geamplificeerde DNA voor het RIP-M41-KDEL is ongeveer 1588bp, het geamplificeerde DNA voor het RIP-(M41)-KDEL is ongeveer 1722bp. Figuur 25: Agarosegelelektroforese van het PCR-product na kolonie-PCR van de A. tumefaciens kolonies. RM staat voor RIP-M41 en R(M) voor het RIP-domein van RIP-M41. De gebruikte primers waren EVD472 en P30 voor RIP-M41-KDEL, voor RIP(M41)-KDEL waren de primers EVD472 en P1. Er werden 30 cycli uitgevoerd bij een extensietijd van 2 minuten en 10 seconden en een annealingstemperatuur van 55°C. 5.3.1.3 Stabiele transformatie van BY-2 cellen Met de geselecteerde kolonies (kolonie 2 voor het RIP-M41-KDEL en kolonie 1 voor het RIP-(M41)KDEL) van de A. tumefaciens werden BY-2 cellen getransformeerd. Na 15 dagen werden getransformeerde calli opgemerkt op de platen (vast BY-2 medium met kanamycine, vancomycine en carbenicilline). Deze calli werden overgezet op verse platen (vast BY-2 medium met kanamycine). 5.3.1.4 Screening stabiel getransformeerde BY-2 cellen aan de hand van fluorescentie Op het ingebrachte DNA zat ook een gen voor eGFP, dit is te zien in Figuur 26. Dit eGFP heeft een ERretentiesignaal en zal dus te vinden zijn in het ER. Door het bestuderen van de mate van fluorescentie krijgt men een indicatie van de expressie van het ingebrachte DNA. Eerst werden de calli met behulp van de fluorescentie-scanner (fujifilm) gescreend. Het doel is om de calli die veel fluorescentie vertonen te identificeren om die dan later onder een confocale fluorescentiemicroscoop in meer detail te gaan bestuderen. Men is dus op zoek naar de calli met de hoogste fluorescentie omdat deze het meeste eGFP produceren, en dus in alle waarschijnlijkheid een hoge expressie hebben van de ingebrachte constructen. 45 Figuur 26: ‘Expression clone’ die gebruikt werd in de stabiele transformatie van BY-2 cellen. eGFP(ER) staat voor het eGFP gen met het ER-retentiesignaal (Thermo Fisher Scientific Inc. 2015e). Figuur 27: Fluorescente calli onder de fluorescentie-scanner. De onderste rij zijn de calli met het RIPM41-KDEL construct. Op de bovenste rij zijn de calli met het RIP(M41)-KDEL. In Figuur 27 zijn de calli te zien onder de fluorescentie-scanner, hoe donkerder de cellen waren hoe meer fluorescent. De calli die de meeste fluorescentie vertoonden, zijn omcirkeld in het rood. De meest belovende werden uitgekozen om nader te bekijken onder de microscoop. Wanneer de calli bestudeerd werden op fluorescentie onder de confocale fluorescentie-microscoop werd er echter weinig correlatie opgemerkt tussen fluorescentie onder de fluorescentie-scanner en de mate van fluorescentie onder de fluorescentiemicroscoop. Zo vertoonden enkel de calli 1, 2, 5, 6 en 7 die het RIP-M41-KDEL construct bevatten sterke fluorescentie. Callus 10 daarentegen leek onder de fluorescentie-scanner zeer fluorescent maar was onder de fluorescentiemicroscoop veel minder fluorescent dan bijvoorbeeld callus 2. Calli 1, 2, 5, 6 en 7 werden geselecteerd voor het volledige RIPM41 construct. Voor de calli die het RIP(M41)-KDEL bevatten werden 6 en 8 geselecteerd. In Figuur 28 zijn een aantal representatieve foto’s van fluorescente calli te zien. Het eGFP is gelokaliseerd in het ER aangezien dit eGFP een ER-retentie signaal bevat. 46 Figuur 28: Fluorescente calli die stabiel getransformeerd zijn, onder de confocale fluorescentie microscoop. Van deze geselecteerde calli werden suspensieculturen opgestart met een volume van 20 ml (de verschillende calli werden gemengd). Twee suspensieculturen van 20mL werden gestart voor het RIPM41-KDEL construct en één voor het RIP(M41)-KDEL construct. Na 7 tot 10 dagen werden de cellen getransfereerd naar een volume van 40 ml. 5.3.1.5 Screening stabiel getransformeerde BY-2 cellen op DNA-niveau Om na te gaan of de transformatie geslaagd was en te bevestigen dat de getransformeerde BY-2 cellen wel degelijk beschikten over het DNA coderend voor het RIP-M41-KDEL of het RIP(M41)-KDEL werd DNA geëxtraheerd. Op dit DNA werd vervolgens een PCR uitgevoerd met specifieke primers. In Figuur 29 is te zien dat in de laantjes die corresponderen met de transgene BY-2 cellen telkens een bandje te zien is op de correcte hoogte, het geamplificeerde DNA voor het RIP-M41-KDEL heeft een grootte van ongeveer 1588bp, het geamplificeerde DNA voor het RIP(M41)-KDEL is ongeveer 1722bp. Hieruit kan besloten worden dat het DNA dat codeert voor het RIP-M41-KDEL en het RIP(M41)-KDEL aanwezig is in de getransformeerde BY-2 cellen. Figuur 29: Agarosegelelektroforese van het PCR-product na PCR op het geëxtraheerde DNA uit de getransformeerde cellen en wild type cellen. RM-KDEL staat voor RIP-M41-KDEL en R(M)-KDEL staat voor RIP(M41)-KDEL. De primers voor het RIP-M41-KDEL construct waren EVD472 en P30. De primers voor het RIP(M41)-KDEL construct en de wild type cellen waren EVD472 en P1. Er werden 35 cycli uitgevoerd met een elongatietijd van 2 minuten en een annealingstemperatuur van 55°C. 5.3.1.6 Screening stabiel getransformeerde BY-2 cellen op RNA-niveau Uit de screening op DNA-niveau bleek dat de BY-2 culturen wel degelijk beschikten over de juiste DNA-inserten. Om te checken of dit DNA ook effectief tot expressie komt, werd een analyse op RNA47 niveau uitgevoerd. RNA werd geëxtraheerd uit de verschillende suspensieculturen en uitgaande van het geëxtraheerde mRNA werd cDNA gemaakt. Op dit cDNA werd een PCR uitgevoerd met specifieke primers. De agarosegels na elektroforese van het PCR-product zijn te zien in Figuur 30. Er is telkens een bandje te zien op de correcte hoogte (de grootte van het geamplificeerde DNA van het RIP-M41KDEL is ongeveer 951bp, de grootte van het geamplificeerde DNA van het RIP(M41)-KDEL is ongeveer 1011bp), behalve bij de wild type cellen. Het is dus duidelijk dat het ingebrachte DNA ook tot expressie komt. Figuur 30: Agarosegelelektroforese van het PCR-product na PCR op het cDNA. RM-KDEL staat voor RIP-M41-KDEL en R(M)-KDEL staat voor RIP(M41)-KDEL. Voor het RIP(M41)-KDEL construct werd een PCR uitgevoerd met primers EVD805 en P134. Voor het RIP-M41-KDEL construct werden primers P29 en P134 gebruikt. Voor beide PCR-reacties werden 43 cycli, een annealingstemperatuur van 55°C en een elongatietijd van 2 minuten gebruikt. 5.3.1.7 Screening stabiel getransformeerde BY-2 cellen in suspensiecultuur op eiwit-expressie Uitgaande van deze suspensieculturen werd een eiwitextractie uitgevoerd. De geëxtraheerde eiwitfractie werd vervolgens gescreend op de aanwezigheid van het gewenste recombinant eiwit door middel van SDS-PAGE gevolgd door coomassiekleuring enerzijds en western blot anderzijds. Het RIP-M41-KDEL eiwit heeft een theoretische moleculaire massa van 74,5 kDa wanneer het signaalpeptide bevestigd blijft. Indien het signaalpeptide verwijderd wordt heeft het eiwit een massa van 71,6 kDa. Verder zijn er twee mogelijke N-glycosylatiesites te vinden in het eiwit en de theoretische PI bedraagt 6,62. Het RIP(M41)-KDEL eiwit heeft een theoretische moleculaire massa van 37,7 kDa als het signaalpeptide bevestigd blijft en zonder het signaalpeptide een massa van 34,8 kDa. Het eiwit bevat eveneens twee mogelijke N-glycosylatiesites. De theoretische PI van het eiwit bedraagt 9,25. 5.3.1.7.1 Eiwitextractie Eiwit werd geëxtraheerd uit 7 dagen oude suspensieculturen. Er werden telkens twee extractiebuffers gebruikt, een basische (DAP (50mM, pH 10)) en een neutrale (Tris-HCl (50mM, pH 7,5)) extractiebuffer. Op het geëxtraheerde eiwit werd vervolgens een Bradfordmeting uitgevoerd om de concentratie van het eiwit te bepalen. Voor SDS-PAGE werd in elk laantje ongeveer 30µg eiwit geanalyseerd. Vervolgens werd een coomassiekleuring en een western blot analyse uitgevoerd. 5.3.1.7.2 Coomassiekleuring Na de eiwitextractie en SDS-PAGE werd een gel gekleurd met een coomassieoplossing om de eiwitten te visualiseren (Figuur 31). Op de gel zijn er veel banden te zien, wat wijst op een succesvolle 48 eiwitextractie. Maar er is geen duidelijk verschil tussen het eiwitextract van de wild type cultuur en de getransformeerde BY-2 cellen en ook geen verschil tussen de twee gebruikte extractiebuffers. Er zijn dus geen extra banden waar te nemen op de verwachte hoogtes voor de recombinante eiwitten (74,5 of 71,6 kDa voor het RIP-M41-KDEL eiwit en 37,7 of 34,8 kDa voor het RIP(M41)-KDEL eiwit). Figuur 31: Coomassiekleuring van de gel na SDS-PAGE. RM-KDEL staat voor RIP-M41-KDEL en R(M)KDEL staat voor RIP(M41)-KDEL. Per laan werd ongeveer 30µg eiwit geladen, in het midden van de gel is de ladder te zien. 5.3.1.7.3 Western blot analyse Op het geëxtraheerde eiwit werd ook een western blot analyse gedaan met anti-His antilichamen (Figuur 32, links). Deze antilichamen binden met de His-tag die aanwezig is in de verschillende fusieconstructen. Er is enkel een duidelijk bandje te zien bij de positieve controle. Bij alle andere lanen zijn wel nog zeer lichte banden te zien, maar aangezien deze zowel bij de wild type BY-2 cellen als bij de getransformeerde voorkomen kan besloten worden dat dit achtergrondkleuring is. De gel werd na het blotten ook gekleurd met een coomassieoplossing (Figuur 32, rechts). Alhoewel er duidelijk eiwit aanwezig was op de gel, zijn er op de coomassiegekleurde gel geen extra banden te zien bij de extracten van de getransformeerde stalen ten opzichte van stalen van de wild type cellen. Figuur 32: Western blot analyse van eiwitextracten van de suspensieculturen getransformeerd voor de heterologe expressie van het RIP-M41-KDEL en het RIP(M41)-KDEL met anti-His antilichamen (links). Coomassiekleuring van de gel na het blotten (rechts). RM-KDEL staat voor RIP-M41-KDEL en R(M)-KDEL staat voor RIP(M41)-KDEL. Per laan werd ongeveer 30µg eiwit geladen, in het midden is de ladder te zien. Het expressieconstruct bevat ook een gen voor eGFP dat voorzien is van een ER-retentiesignaal (KDEL). Het RIP-M41-KDEL en het RIP(M41)-KDEL zijn aanwezig in het ER. Om te bewijzen dat met de gebruikte eiwitextractieprocedure eiwitten uit het ER worden geëxtraheerd werd een western blot 49 analyse uitgevoerd met anti-eGFP antilichamen (Figuur 33). Er zijn telkens bandjes te zien op de verwachte hoogte. De positieve controle was recombinant eGFP. Er kan dus besloten worden dat er bij eiwitextractie inderdaad eiwitten uit het ER worden geëxtraheerd. Figuur 33: Western blot analyse met anti-eGFP. RM-KDEL staat voor RIP-M41-KDEL en R(M)-KDEL staat voor RIP(M41)-KDEL. Per laan werd ongeveer 30µg eiwit geladen, in het midden van de gel is de ladder te zien. 5.3.1.7.4 Western blot analyse met HisProbe Aangezien de His-tag wordt gevolgd door een linker en de sequentie voor de ER-retentie (KDEL) kan het zijn dat deze His-tag minder beschikbaar is voor interactie met de antilichamen. Daarom werd ook een western blot analyse met een HisProbe (Thermo Scientific) en ECL detectie uitgevoerd. De HisProbe is kleiner dan antilichamen en heeft minder last van sterische hinder. Daardoor kan de HisProbe His-tags binden onafhankelijk van omliggende sequenties. De blot is te zien in Figuur 34, doch behalve de positieve controle is geen signaal te zien. Figuur 34: Western blot analyse met HisProbe. RM-KDEL staat voor RIP-M41-KDEL en R(M)-KDEL staat voor RIP(M41)-KDEL. Per laan werd ongeveer 30µg eiwit geladen, in het midden is de ladder te zien. 5.3.2 Expressie in E. coli De bacteriële gastheer E. coli werd getest als alternatief heteroloog expressiesysteem. In dit geval werd de procedure enkel uitgevoerd met het volledige RIP-M41, waarbij twee verschillende constructen werden aangemaakt, namelijk de RIP-M41 sequentie met een C-terminale of Nterminale His-tag (Figuur 35). 50 Figuur 35: Schematische weergave van expressieconstructen voor E. coli. A, het RIP-M41 construct met een C-terminale His-tag. B, Het RIP-M41 construct met een N-terminale His-tag. Initiëel werden de expressieconstructen in de pCXP34h-vector gekloneerd met als doel om constitutieve expressie van het RIP construct te bekomen in de bacteriecellen. Deze plasmiden met de expressieconstructen werden getransformeerd in twee verschillende E. coli stammen, de BL21 stam en de rosetta stam. De rosetta stam is geoptimaliseerd om eukaryote eiwitten tot expressie te brengen. Aangezien geen heterologe eiwitexpressie werd bekomen gebruik makende van de constitutieve vector, werd gekozen om expressie te realiseren met een induceerbare expressievector. De constructen werden na de benodigde PCR-reacties allereerst in de constitutieve vector (pCXP34h-vector) binnengebracht. Daarna werd gebruik gemaakt van de pCXP34h-vectoren die de constructen bevatten uit de BL21 E. coli stam om de constructen aan te maken voor de induceerbare vector. 5.3.2.1 Aanmaak constructen De coderende sequentie voor het RIP-M41 was beschikbaar in een pJET-vector en kan vanuit deze vector geamplificeerd en gebruikt worden voor de aanmaak van de twee constructen. In de eerste PCR werd de RIP-M41 sequentie voorzien van een C-terminale of een N-terminale Histag. Voor de ligatie van de constructen in de vectoren werd gebruik gemaakt van een Gibson assembly. Deze Gibson assembly vereist dat er specieke DNA-fragmenten aanwezig zijn op het DNA. Deze specifieke fragmenten werden aangebracht in de tweede PCR. De DNA-fragmenten bekomen na deze twee PCR-reacties zijn weergegeven in Figuur 36. Bij beide constructen is er een bandje te zien op de correcte hoogte (het RIP-M41 met de N-terminale His-tag en de C-terminale His-tag hebben een grootte van ongeveer 1948bp). 51 Figuur 36: Agarosegelelektroforese na PCR voor het aanbrengen van de sequenties voor Gibson assembly. N-His staat voor RIP-M41 met een N-terminale His-tag. C-His staat voor RIP-M41 met een C-terminale His-tag. De primers die gebruikt werden voor het RIP-M41 met de C-terminale His-tag in de eerste PCR zijn P39 en P60. Voor de N-terminale His-tag werden primers P178 en P179 gebruikt. Voor de tweede PCR-reactie waren de primers voor het N-terminale construct P182 en P183. Voor het C-terminale construct werd gebruik gemaakt van de primers P184 en P185 in de tweede PCR-reactie. Beide PCR-reacties bestonden uit 35 cycli, een elongatietijd van 2 minuten en een annealingstemperatuur van 55°C. Dit PCR-product werd in een pJET-plasmide geligeerd en vervolgens met behulp van een heat-shock in competente E. coli cellen ingebracht en uitgeplaat op LB-medium met ampicilline. Met behulp van een kolonie-PCR werden de kolonies gescreend op de aanwezigheid van het RIP-M41 met de N- of Cterminale His-tag (Figuur 37). Alle kolonies met het RIP construct met de C-terminale His-tag (RIPM41-His) geven een DNA-fragment op de verwachte hoogte van ongeveer 2077bp. Slechts enkele kolonies werden succesvol getransformeerd met het construct met de N-terminale His-tag (His-RIPM41), namelijk kolonies 1,3 en 8 vertonen een DNA-fragment op de correcte hoogte (ongeveer 2077bp). Figuur 37: Agarosegel na kolonie-PCR van getransformeerde E. coli na heath-shock. N-His staat voor RIP-M41 met een N-terminale His-tag (His-RIP-M41). C-His staat voor RIP-M41 met een C-terminale His-tag (RIP-M41-His). De gebruikte primers zijn primers EVD275 en EVD276. Er werden 30 cycli uitgevoerd met een elongatietijd van 2 minuten en een annealingstemperatuur van 60°C. Via een plasmide-extractie werd het plasmide-DNA uit de getransformeerde cellen gehaald en vervolgens geanalyseerd door middel van DNA-sequencing. Voor het RIP-M41-His construct bevatte kolonie 2 de juiste sequentie, enkel één nucleotide aan de N-terminus ontbrak. Voor het His-RIP-M41 construct had geen enkele kolonie een insert met een correcte sequentie. Bij kolonie 8 ontbraken de 52 eerste 13 nucleotiden van de N-terminale Gibson-sequentie. Via PCR op de pJET-vector uit de geselecteerde kolonies werden die laatste 13 nucleotiden opnieuw aangebracht bij het N-terminale construct en de ontbrekende nucleotide bij het C-terminale construct. Bij deze PCR waren de primers voor het N-terminale construct P182 en P183. Voor het C-terminale construct waren de primers P184 en P185 gebruikt. Het PCR-programma bestond uit 35 cycli, een elongatietijd van 2 minuten en een annealingstemperatuur van 55°C. Na deze PCR werd de Gibson assembly uitgevoerd voor beide constructen. Hierdoor werd het DNA voor de constructen ingebracht in de pCXP34h-vector. De vectoren werden in E. coli BL21 ingebracht met behulp van een elektroshock. De bacteriën werden op vast LB-medium met ampicilline uitgeplaat en de kolonies werden geanalyseerd met een kolonie-PCR (Figuur 38). Er zijn voor zowel het RIP-M41-His als het His-RIP-M41 DNA-fragmenten geamplificeerd met de correcte lengte. Voor het His-RIP-M41 zijn er bij kolonies 1, 3, 4, 5, 8 en 10 een DNA-fragment te zien met de correcte hoogte. Voor het RIP-M41-His zijn bij kolonies 1, 2, 3 en 5 telkens een DNA-fragment te zien met de juiste grootte (grootte van het DNA is in beide gevallen 1875bp). Figuur 38: Agarosegelelektroforese van het geamplificeerde DNA na kolonie-PCR op getransformeerde BL21 E. coli. N-His staat voor RIP-M41 met een N-terminale His-tag. C-His staat voor RIP-M41 met een C-terminale His-tag. De gebruikte primers waren P186 en P187. Er werden 30 cycli uitgevoerd met een elongatietijd van 2 minuten en een annealingstemperatuur van 55°C. Aangezien er voor de gibson assembly een PCR-reactie plaats vond, was het nodig om de sequentie van het insert in de vectoren die in de E. coli gebracht zijn te controleren. De plasmiden werden geëxtraheerd uit de getransformeerde E. coli. De sequentie van het insert in kolonie 4 voor het HisRIP-M41 was correct. Voor het RIP-M41-His had kolonie 8 de correcte sequentie. Deze kolonies werden gebruikt om E. coli culturen op te zetten. Er werden geen positieve resultaten bekomen voor de constitutieve expressie van het recombinant eiwit. 5.3.2.2 Induceerbare expressie Voor de induceerbare expressie werd gebruik gemaakt van de pET-21a-vector. Voor de klonering in deze pET-vector zijn andere Gibson-sequenties nodig dan bij de pCXP34h-vector. Voor het RIP-M41 met de N-terminale His-tag werd de opgezuiverde pCXP34h-vector van kolonie 4 uit E. coli BL21 (met de N-terminale His-tag) gebruikt als template in de PCR-reactie met primers P213 en P214. Voor de PCR die werd uitgevoerd op het RIP-M41 met de C-terminale His-tag werd de opgezuiverde pCXP34hvector van kolonie 8 uit E. coli BL21 (met de C-terminale His-tag) gebruikt als template. De PCRreactie werd uitgevoerd met primers P215 en P216 bij een elongatietijd van 2 minuten, een annealingstemperatuur van 55°C en 30 cycli. 53 5.3.2.2.1 E. coli rosetta De PCR-producten werden via Gibson assembly in de pET-vector geligeerd. Vervolgens werden de plasmiden getransformeerd in E. coli (rosetta stam) via heat-shock. De bacteriecellen werden uitgeplaat op vast LB-medium met ampicilline en chlooramphenicol en de kolonies werden geanalyseerd met behulp van een kolonie-PCR (Figuur 39). Voor het RIP-M41-His had kolonie 5 een bandje op de correcte hoogte (grootte van het DNA is 1875bp), voor het His-RIP-M41 hadden kolonies 2, 4, 6 en 8 een bandje op de juiste hoogte (grootte van het DNA is 1948bp). Figuur 39: Agarosegelelektroferese na kolonie-PCR op getransformeerde rosetta E.coli. N-His staat voor RIP-M41 met een N-terminale His-tag. C-His staat voor RIP-M41 met een C-terminale His-tag. De kolonie-PCR voor het RIP-M41 met de C-terminale His-tag werd gedaan met primers P186 en P187. Voor het RIP-M41 met de N-terminale His-tag werden primers P213 en P214 gebruikt. De kolonie-PCR had een elongatietijd van 2 minuten, een annealingstemperatuur van 55°C en 27 cycli. Kolonie 5 werd geselecteerd voor het RIP-M41 met de C-terminale His-tag en kolonie 6 voor het RIPM41 met de N-terminale His-tag. Deze kolonies werden opgegroeid in vloeibaar LB-medium en het plasmide werd geëxtraheerd. De sequentieanalyse van beide constructen toonde aan dat de sequenties correct waren. Kolonie 5 voor het RIP-M41-His en kolonie 6 voor het His-RIP-M41 werden opgegroeid in 250mL vloeibaar LB-medium met ampicilline en chlooramphenicol. Per construct werden twee bacterieculturen opgegroeid tot de gewenste celdichtheid en één ervan werd telkens geïnduceerd met IPTG. Na centrifugatie en sonicatie werd de oplosbare eiwitfractie van de onoplosbare gescheiden. De oplosbare eiwitfractie werd op een Nikkel-kolom geanalyseerd maar er was amper eiwit te zien in de elutiefracties. De onoplosbare eiwitfractie werd gesuspendeerd met behulp van 8M ureum. De onoplosbare fractie en de oplosbare fractie (deel van de onoplosbare fractie die niet op de Nikkel-kolom was gebracht) werden op een polyacrylamidegel geladen. Er werd telkens 5µL van de oplosbare fractie geladen in de corresponderende laantjes. De onoplosbare fractie werd opgelost in ongeveer 8mL van 8M ureum. Hiervan werd eveneens 5µL in de corresponderende laantjes van de gel gebracht. Na SDSPAGE werd de gel gekleurd met coomassieblauwoplossing (Figuur 40). Na een tweede SDS-PAGE werd een western blot uitgevoerd. De detectie gebeurde met anti-His antilichamen (Figuur 42). De gel na het blotten werd gekleurd met coomassieblauwoplossing (Figuur 41). 54 Figuur 40: Coomassiekleuring van de gel na SDS-PAGE met het geëxtraheerde eiwit uit E. coli rosetta. N-term staat voor het RIP-M41 met de N-terminale His-tag. C-term staat voor het RIP-M41 met de Cterminale His-tag. (+) betekent geïnduceerd met IPTG, (-) is het eiwit uit de niet-geïnduceerde suspensieculturen. Figuur 41: Coomassiekleuring van de gel na blotten van de SDS-PAGE met het geëxtraheerde eiwit uit E. coli rosetta (Figuur 42). N-term staat voor het RIP-M41 met de N-terminale His-tag. C-term staat voor het RIP-M41 met de C-terminale His-tag. (+) betekent geïnduceerd met IPTG, (-) is het eiwit uit de niet-geïnduceerde suspensieculturen. Figuur 42: Western blot analyse met anti-His antilichamen na SDS-PAGE met het geëxtraheerde eiwit uit E. coli rosetta. N-term staat voor het RIP-M41 met de N-terminale His-tag. C-term staat voor het RIP-M41 met de C-terminale His-tag. (+) betekent geïnduceerd met IPTG, (-) is het eiwit uit de nietgeïnduceerde suspensieculturen. 55 In Figuur 40 en Figuur 41 is duidelijk een aanrijking aan eiwit te zien in de onoplosbare eiwitfractie van de E. coli culturen die het RIP-M41 met de C-terminale His-tag tot expressie brengen. De accumulatie is het hoogst rond de 70kDa, wat correspondeert met de verwachte grootte van het recombinante eiwit (70,962 kDa). Bij de western blot analyse (Figuur 42) is ook duidelijk een signaal te zien voor het recombinante eiwit met de C-terminale His-tag ter hoogte van 70kDa in de onoplosbare eiwitfractie. Bovendien zijn ook duidelijk fragmenten zichtbaar met een grootte van ongeveer 55kDa, 42,8kDa, 32,6kDa, 26,5kDa, 21,4kDa en 14,7kDa. Dit zijn wellicht afbraakproducten van het RIP-M41-His eiwit. 56 6 Discussie Wanneer de genomen en transcriptomen van verschillende planten onderzocht werden, werd ontdekt dat een groot aantal planten waar tot dan toe geen RIP’s werden gevonden toch RIP-achtige sequenties tot expressie brengen (Peumans W. J., Van Damme E. 2010, Peumans W. J. et al. 2014, Shang C. et al. 2014). Daarenboven werden in het genoom van graangewassen (tarwe en rijst) een aantal genen gevonden die coderen voor RIP-achtige proteïnen met een chimere structuur. Deze proteïnen bestaan uit een RIP-domein gekoppeld aan een domein met homologie ten opzichte van de C19-peptidasen (RIP-C19) of met homologie ten opzichte van de M41-peptidasen (RIP-M41). Indien men de sequentie bekijkt van deze chimere RIP’s is er geen signaalpeptide te vinden. Het werd dan ook verwacht dat deze proteïnen in het cytoplasma van de cel terechtkomen. 6.1 Lokalisatie Voor de lokalisatiestudie van de chimere RIP’s in de cel werden epidermiscellen van tabaksbladeren (Nicotiana benthamiana) transiënt getransformeerd. De efficiëntie van de transiënte transformatie was steeds laag. Slechts heel weinig cellen waren effectief transiënt getransformeerd. Deze lage efficiëntie kan te wijten zijn aan de groei van de suspensieculturen. De OD’s van de bacterieculturen waren telkens vrij hoog, daarom werd gevreesd dat de getransformeerde A. tumefaciens al voorbij het stationaire groeistadium waren (aangezien de meting van de OD geen verschil maakt tussen levende en dode cellen). Ook is het mogelijk dat door de lange groeitijd de A. tumefaciens hun infectiviteit verloren. Zelfs na optimalisatie van het protocol bleef de efficiëntie vrij laag. Een mogelijke reden is de silencing van het ingebrachte DNA. In het onderzoek van Voinnet et al. (2003) werd de fluorescentie van GFP gevolgd in tabaksbladeren die transiënt getransformeerd werden met behulp van A. tumefaciens. Indien ook p25 (inhibitor van silencing) werd ingebracht zag men een verhoogde fluorescentie op 5 dagen na infiltratie. In een gelijkaardig experiment werd de hoeveelheid geproduceerd eiwit (Cf-9) gevolgd met of zonder co-infiltratie van het p19 gen (inhibitor van silencing). Op de eerste twee dagen na infiltratie was geen verschil te zien wanneer er wel of geen co-infiltratie met p29 gebeurde. Vanaf drie dagen na infiltratie echter verhoogde de hoeveelheid geproduceerd Cf-9 wanneer wel een co-infiltratie gebeurde terwijl er geen proteïne meer waar te nemen was wanneer geen co-infiltratie gebeurde. Dit onderzoek wijst op het feit dat mogelijks de efficiëntie van de transiënte transformatie laag is door silencing. Indien men de foto’s (Figuur 19) van de cellen die getransformeerd zijn met eGFP vergelijkt met de foto’s van de cellen getransformeerd met de andere constructen is er duidelijk een indicatie dat alle constructen cytoplasmatisch gelokaliseerd zijn. Zoals verwacht is er geen verschil tussen de C-terminale en de Nterminale GFP-fusie van de proteïnes. Vrij eGFP is door zijn geringe grootte in staat om via passieve diffusie in de nucleus te geraken (Seibel N.M. et al. 2007), wat te zien is in Figuur 19 als een een duidelijk homogeen fluorescentiesignaal ter hoogte van de kern. De maximale grootte van een proteïne dat de kern kan binnenkomen door passieve diffusie is ongeveer 60 kDa (Gorlich D. 1998, Mattaj I. W., Englmeier L. 1998, Nigg E. A. 1997, Peters R. 1986, Silver P. A. 1991, Weis K. 2003). Normaal gezien zouden het RIP-M41 en het RIP-C19 zonder een nucleair lokalisatie signaal niet in staat zijn om de kern binnen te komen. Voor colokalisatie werd gebruik gemaakt 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). DAPI bindt met DNA en zal zorgen dat de kern fluorescent wordt. Indien het RIP-M41 en het RIP-C19 in de kern aanwezig 57 zijn zal het signaal van het eGFP (van de fusieconstructen) en het signaal van DAPI overlappen. De gevolgde procedure was analoog als degene beschreven door Ricardi M. M. et al. (2012). DAPI bindt specifiek met DNA en zorgt dat de nucleus gekleurd wordt met een blauwachtige fluorescentie. Bij colokalisatie werden de suspensieculturen slechts overnacht geïncubeerd bij 28°C, dit zorgde voor lagere OD’s van de suspensieculturen en een verhoogde efficiëntie. Hoewel de efficiëntie hoger was, waren er toch nog vrij weinig cellen te zien die effectief de eGFP-fusieconstructen tot expressie brachten. Bij de colokalisatie (Figuur 20) met DAPI is er een duidelijke indicatie dat de fusieproteïnen in het cytoplasma aanwezig zijn en niet (of slechts zeer weinig) in de kern, aangezien de signalen van het eGFP (van de fusieconstructen) en het DAPI slechts weinig overlappen in vergelijking met de overlap in het signaal bij het vrije eGFP en DAPI. De foto’s van de lokalisatie- en de colokalisatiestudie zijn het resultaat van een Z-projectie van de verschillende gescande XY-vlakken. Het fluorescentiesignaal in deze foto’s is aldus een som van de fluorescentiesignalen van de verschillende dwarsdoorsneden. Deze experimenten geven een indicatie over de lokalisatie. Doordat de intensiteit van de gebruikte laser niet steeds dezelfde was kunnen geen sluitende conclusies genomen worden. Het is mogelijk om de visuele informatie uit de foto’s aan de hand van algoritmen en computerprogramma’s te vertalen naar kwantitatieve informatie. Hierbij zou dus per dwarsdoorsnede de mate van overlap van de verschillende fluorescentiesignalen gekwantificeerd worden. Met deze kwantitatieve data kunnen vervolgens sluitende conclusies genomen worden. Er werd geen kwantitatieve analyse gedaan aangezien slechts weinig foto’s werden genomen van een aantal constructen (door de lage efficiëntie van de transiënte transformatie). Op basis van de foto’s uit deze thesis kan wel een eerste indicatie van de lokalisatie afgeleid worden: Het RIP-M41 en het RIP-C19 zijn hoogstwaarschijnlijk louter cytoplasmatisch gelokaliseerd. Bij de type 2 RIP’s is het meeste onderzoek gedaan naar ricine. Ricine wordt aangemaakt als een preproteïne dat bestaat uit een signaalpeptide, de A-keten, een linker (bestaande uit 12 aminozuren) en de B-keten. Dit proteïne matureert tijdens het transport via het ER en het golgi apparaat naar proteïneopslag-vacuolen (‘protein bodies’). Slechts na de aankomst in deze ‘protein bodies’ wordt het ricine actief (Lord J. M. et al. 1994, Van Damme E. J. M. et al. 2001). Het type 2 RIP van Sambucus nigra is aanwezig in de ‘protein bodies’ van de parenchym cellen van het floëem (Greenwood J. S. et al. 1986). Vele type 1 RIP’s worden als preproproteïnen aangemaakt die bestaan uit een signaalpeptide, het RIP-domein zelf en een C-terminale verlenging (Van Damme E. J. M. et al. 2001). Dankzij immunolokalisatie is gevonden dat PAP vooral aanwezig is in de matrix van de celwand en een klein gedeelte in de vacuole in cellen van de bladeren van Phytolacca americana (Ready M. et al. 1986). In de zaden van Saponaria officinalis is saporine vooral te vinden in de intercellulaire ruimten en in de vacuole van periplasmatische cellen. In de bladeren is het saporine te vinden in de intercellulaire ruimten van de parenchymcellen (chlorenchym) (Carzaniga R. et al. 1994). Gypsophilin uit de Gypsophila elegans is aanwezig in de intercellulaire ruimten en de vacuolen van de cellen in de bladeren (Yoshinari S. et al. 1997). Pepocine is een RIP uit Cucurbita pepo, dit type 1 RIP is aanwezig in de intercellulaire ruimten in bladeren en het sarcocarp (Yoshinari S. et al. 1996). Het type 1 RIP luffine van Luffa cylindrica heeft een verschillende subcellulaire lokalisatie naargelang het ontwikkelingsstadium van de plant. In rijpe zaden is het luffine te vinden in de ‘protein bodies’ van het opslagweefsel, terwijl in de volgroeide weefsels (stengel en volgroeide bladeren) het luffine aanwezig is in de extracellulaire matrix (Di Cola A. et al. 1999). Beetines zijn type 1 RIP’s uit Beta 58 vulgaris. Iglesias R. et al. (2005) toonden aan dat deze RIP’s aanwezig zijn in de apoplast. Ook hier zijn de RIP’s dus aanwezig op plaatsen weg van de ribosomen. De type 1 RIP’s uit Poaceae bevatten veelal geen signaalpeptiden. Deze RIP’s zijn dus waarschijnlijk aanwezig in het cytoplasma (Habuka, N. et al. 1993, Van Damme E. J. M. et al. 2001). JIP60 is net zoals het RIP-M41 en het RIP-C19 een type 3 RIP en eveneens afkomstig uit een graangewas. Het JIP60 bezit geen signaalpeptide en is dus waarschijnlijk aanwezig binnenin de cel (Van Damme E. J. M. et al. 2001). Zoals bewezen door Rustgi S. et al. (2014) kan het JIP60 de translatie inhiberen. Maar het JIP60 wordt geïnduceerd door jasmonaat, en zal dus niet continu aanwezig zijn. Rijst en tarwe zijn leden van de familie van de Poaceae. Net zoals vele type 1 RIP’s uit de Poaceae en JIP60 hebben het RIP-M41 en het RIP-C19 geen signaalpeptide. In deze thesis werd een indicatie geleverd dat deze proteïnen naar alle waarschijnlijkheid in het cytoplasma gelokaliseerd zijn. Deze RIP’s zijn dus aanwezig in hetzelfde compartiment als de ribosomen net zoals verwacht voor vele type 1 RIP’s uit de Poaceae (Habuka N. et al. 1993, Van Damme E. J. M. et al. 2001). Het is mogelijk dat de waardeigen ribosomen resistent zijn aan het RIP-M41 en/of het RIP-C19. Een andere mogelijkheid is dat deze proteïnen meer tot expressie komen in respons op specifieke signalen. 6.2 Heterologe expressie 6.2.1 Heterologe expressie in BY-2 cellen Om eukaryote eiwitten recombinant aan te maken is het vaak gewenst dit te doen in een eukaryote gastheer zoals planten of plantencellen. Het gebruik van plantcel-culturen heeft vele voordelen. Omdat planten eukaryoten zijn, kunnen ze ervoor zorgen dat het proteïne de correcte tertiaire structuur en de benodigde post-translationele modificaties heeft. Plantcel-culturen zijn minder duur dan culturen van zoogdiercellen aangezien de plantencellen veel eenvoudigere media en geen serum nodig hebben om te groeien. Ook zijn plantcel-culturen relatief veiliger om mee te werken aangezien deze geen pathogenen bevatten die schadelijk zijn voor mens of dier (Doran P. M. 2006a, Hellwig S. et al. 2004, Ma J. K-C. et al. 2005, Twyman R. M. et al. 2003). Er zijn celculturen beschikbaar van verschillende planten zoals rijst (Huang, J. et al. 2002), wortel (Aviezer D. et al. 2008), soja (Smith, M. L. et al. 2002) en andere. De celculturen gemaakt van tabak (bv. BY-2 cellen) zijn het meest populair door hun vrij snelle groei, goed gekende transformatie methoden (An G. 1985) en de relatief eenvoudige en goedkope nutritionele eisen (Dhingra A. et al. 2009, Shojima S. et al. 1989). Voor de aanvang van deze thesis werden reeds suspensieculturen gemaakt die het RIP-M41 en het RIP-C19 tot expressie brachten. Deze proteïnen bestonden uit het RIP-M41 en het RIP-C19 gefuseerd met een signaalpeptide dat zorgde voor de secretie van deze eiwitten in het medium. Daarnaast waren ze ook voorzien van een C-terminale His-tag voor detectie en opzuivering. Indien de eiwitten aanwezig zijn in het medium van suspensieculturen is de opzuiveringsstap vrij beperkt en relatief eenvoudig door de geringe aanwezigheid van andere proteïnen in het medium. Er werd echter geen recombinant eiwit gedetecteerd in het medium. Het is mogelijk dat de proteïnen gedegradeerd werden door gesecreteerde proteasen en/of geadsorbeerd werden aan de wanden van de cultuurflessen. Het verlies van gesecreteerd recombinant eiwit geproduceerd in plantcelsuspensieculturen werd al meermaals opgetekend in verschillende onderzoeken (James E. A. et al. 59 2000, Kwon T. H. et al.2003, Lee, S.-Y. et al. 2004, Magnuson N. S. et al. 1996, Sharp J. M., Doran P. M. 2001, Tsoi B. M-Y., Doran P. M. 2006b). De degradatie van de recombinante proteïnen door gesecreteerde proteasen is een mogelijke verklaring voor het verlies aan eiwit. Een mogelijke oplossing om proteolyse te stoppen is het toedienen van protease inhibitoren aan het medium van de plantencellen, maar deze inhibitoren zijn echter vrij duur. Een andere manier is het introduceren van knock-out mutaties in de plantcellen voor de genen van deze proteasen die gesecreteerd worden. Ook kan men samen met de gewenste proteïnen protease inhibitoren tot expressie brengen in de cellen van deze celcultuur (Doran P. M. 2006a). De adsorptie (irreversibel) van proteïnen aan de wand van het cultuurvat kan zorgen voor grote verliezen in de opbrengst. Proteïnen kunnen gemakkelijk adsorberen aan de wand van de suspensiecultuur (dus aan glas, maar ook aan metaal en plastiek). De heteroloog aangemaakte proteïnen kunnen beschermd worden tegen absorptie door aanwezigheid van andere proteïnen die de adsorptieplaatsen innemen. De media die echter gebruikt worden voor plantcel-culturen bevatten vaak vrij weinig proteïnen. Door de adsorptie zal wellicht niet alle eiwit verdwijnen uit het medium, zodat niets meer gedetecteerd wordt (Doran P. M. 2006a, Doran P. M. 2006b). Het is echter wel mogelijk dat het mede verantwoordelijk is (samen met bijvoorbeeld proteolyse en dergelijke) voor de volledige verdwijning. Het is mogelijk om het verlies aan heteroloog aangemaakte proteïnen in het medium te beperken door het toevoegen van bepaalde stabilizerende componenten zoals polyvinylpyrrolidone (PVP), dimethyl sulfoxide (DMSO), gelatine, albumine en bepaalde zouten (Baur A. et al. 2005, James E. A. et al. 2000, LaCount W. et al. 1997, Lee J.-H. et al. 2002, Magnuson N. S. et al. 1996, Kwon T. H. et al. 2003, Sharp J. M., Doran P. M. 2001, Soderquist R. G., Lee J. M. 2005, Wahl M. F. et al. 1995 Wongsamuth R., Doran P. M. 1997). In deze thesis werd geopteerd voor een andere strategie waarbij de proteïnen niet meer gesecreteerd worden. De proteïnen werden voorzien van een KDEL (lysine-asparaginezuurglutaminezuur-leucine)-signaal. Deze KDEL is noodzakelijk voor proteïnen die in het ER blijven en niet worden gesecreteerd (Pelham H. R. 1990). Dit signaal werd al vaak gebruikt om recombinant aangemaakte eiwitten specifiek in het ER te laten accumuleren (Herman E. M. et al. 1990, Wandelt C. I. et al. 1992). Proteïnen die een ER-retentiesignaal bevatten kunnen nog steeds geglycosyleerd worden (Nair N. R. et al. 2014). In onderzoek van Nair N. R. et al. (2014) zag men dat de C-terminale fusie van een KDEL-signaal aan het proteïne dat heteroloog tot expressie werd gebracht een grote impact had op de hoeveelheid proteïne dat kon worden opgezuiverd in vergelijking met de situatie waarin men het proteïne secreteerde. De reden hiervoor was waarschijnlijk een tragere degradatie in het ER (ook geen adsorptie aan het cultuurvat). Hetzelfde fenomeen werd gezien in het onderzoek van Wandelt C. I. et al. (1992). Er werden aldus constructen aangemaakt waar het RIP-M41 of het aparte RIP-domein van het RIPM41 voorzien werd van een signaalpeptide, His-tag en ER-retentiesignaal. Deze constructen werden in BY-2 cellen ingebracht met behulp van A. tumefaciens. Suspensieculturen werden gestart uitgaande van gepoolde veelbelovende calli. De selectie van calli gebeurde op basis van de fluorescentie omdat op het ingebrachte DNA ook een gen aanwezig was dat voor de productie van eGFP zorgt. De fluorescentie (en dus de hoeveelheid eGFP) is een maat voor de expressie van het ingebrachte DNA. De gevormde suspensieculturen werden geanalyseerd op DNA-, RNA- en eiwit60 niveau. Bij de DNA-screening was duidelijk te zien dat de cellen succesvol getransformeerd waren. Uit analyse op RNA-niveau bleek dat de constructen ook effectief tot expressie kwamen. Vervolgens werd eiwit geëxtraheerd en een SDS-PAGE uitgevoerd. Op basis van deze gels na SDS-PAGE werden western blots uitgevoerd evenals coomassiekleuring. In de coomassiegekleurde gels was in geen enkel geval een duidelijk extra bandje te zien bij de getransformeerde BY-2 cellen in vergelijking met de ongetransformeerde suspensiecultuur (wild type suspensiecultuur). Er werd een western blot analyse gedaan op het opgezuiverde eiwit met anti-His antilichamen. Het anti-His antilichaam zou moeten binden met de His-tag die aanwezig is in de heteroloog aangemaakte eiwitten. Het recombinant eiwit, dat al dan niet gevormd was, kon echter niet gedetecteerd worden. Om te bewijzen dat er wel degelijk eiwitten werden geëxtraheerd uit het ER met het gebruikte protocol werd een western blot gedaan met antilichamen tegen eGFP. Het eGFP dat mee tot expressie komt in de getransformeerde cellen is eveneens voorzien van een ER-retentiesignaal. De western blot analyse toonde duidelijk de aanwezigheid van eGFP aan. Het is dus duidelijk dat er succesvol proteïnen uit het ER konden geëxtraheerd en gedetecteerd worden. Omdat het mogelijk is dat de His-tag moeilijk bereikbaar is voor de anti-His antilichamen (doordat het KDEL-signaal C-terminaal naast de His-tag zit en het open leesraam voor de constructen N-terminaal) werd een HRP-Nikkel conjugaat gebruikt in plaats van een anti-His antilichaam om het eiwit te detecteren. Dergelijk systeem zou minder gevoelig moeten zijn aan sterische hindering door het feit dat het nikkel-conjugaat kleiner is dan een antilichaam. Er zijn een aantal nadelen geassocieerd met het gebruik van ER-retentie. Zo kan het zijn dat de tertiare structuur en de post-translationele modificaties verschillen van de normale situatie (Mikschofsky H. et al. 2009). In het ER zijn er proteolytische pathways die verkeerd gevouwen proteïnen afbreken. Ongevouwen of verkeerd gevouwen proteïnen kunnen in sommige gevallen getransporteerd worden naar het cytosol om door het proteasoom afgebroken te worden (ERAD) (Gomord V. et al. 2010). De afbraak van proteïnen die naar het ER gestuurd werden, werd in verschillende onderzoeken reeds opgemerkt (Benchabane M. et al. 2009, Schiermeyer A. et al. 2005). Zo wordt bij het bovien aprotinine de N- en C-termini partieel afgebroken wanneer het proteïne heteroloog wordt aangemaakt en een ER-retentiesignaal bevat (Badri M. A. et al. 2009). Bij antilichamen die recombinant werden aangemaakt in planten zag men ook een systematische processing (De Muynck B. et al. 2009). Een mogelijke reden voor het falen van dit experiment is dat het eiwit misschien herkend werd als niet correct gevouwen en werd afgebroken via ERAD. Uit de lokalisatiestudie is er een sterke indicatie dat zowel het RIP-M41 als het RIP-C19 cytoplasmatische proteïnen zijn. Deze proteïnen zijn dus aanwezig in de reducerende omgeving van het cytoplasma in tarwe of rijst. Door een secretiesignaal en een ER-retentiesignaal te bevestigen aan de proteïnen komen deze terecht in het ER. Doordat het RIP-M41 en het RIP-C19 in het ER terecht komen kunnen er aldus disulfide bruggen gevormd worden die er niet horen. Door deze disulfide bruggen kunnen de eiwitten verkeerd worden opgevouwen en herkend worden door ERAD. Een andere reden is dat het eiwit mogelijks in te lage hoeveelheden wordt geproduceerd. Het is ook mogelijk dat het eiwit aanwezig is, maar dat de detectie niet correct verloopt. Een mogelijke oplossing is het gebruik van een andere tag. Mogelijkheden zijn: polyarginine-tag, Flag-tag, c-myc-tag, strep-tag, SBP-tag, cellulose-bindingsdomein, calmoduline bindend peptide, chitinebindend-domein, glutathione S-transferase-tag, maltose-bindend proteïne (Terpe K. 2002). 61 6.2.2 Heterologe expressie in E. coli Als alternatief systeem voor de expressie in BY-2 cellen werd de heterologe expressie in E. coli uitgevoerd. De expressie van proteïnen in E. coli heeft vele voordelen. E. coli heeft een zeer snelle groei (Sezonov G. et al. 2007). Het is ook mogelijk om vrij gemakkelijk hoge celdensiteiten te behalen. Een ander voordeel is dat rijke en complexe media te maken zijn met goedkope en makkelijk te verkrijgen bestanddelen (Rosano G. L., Ceccarelli E. A. 2014). Ook de transformatie van E. coli is relatief snel en gemakkelijk (heat-shock of electroshock) (Pope B., Kent H. M. 1996, Rosano G. L., Ceccarelli E. A. 2014). De recombinante proteïnen kunnen terechtkomen in het cytoplasma of het periplasma. Het cytoplasma werd in dit geval gekozen omdat dit vaak zorgt voor een hogere productie (Terpe K. 2006). In deze thesis werd als test slechts één construct tot expressie gebracht, namelijk het RIP-M41. Het is mogelijk dat de heterologe expressie in BY-2 cellen mislukte doordat het fout loopt in de detectie van de His-tag. Aangezien in dit geval geopteerd werd om het proteïne in het cytoplasma te laten accumuleren was er geen signaalpeptide nodig. Hierdoor was het mogelijk om twee constructen aan te maken met de His-tag enerzijds C- of N-terminaal om uit te sluiten dat de positie van de His-tag de detectie beïnvloedt. Voor de expressie werd gebruik gemaakt van de rosetta stam. De rosetta stam is speciaal gemaakt om eukaryote genen met een afwijkende codon-samenstelling ten opzichte van prokaryote genen succesvol in E. coli tot expressie te brengen. Aangezien het RIP-M41 zich in het cytoplasma van de plantencel bevind (zie lokalisatie) wordt er geen extensieve N-glycosylatie van het proteïne verwacht die noodzakelijk zou zijn voor de functie van het proteïne en geen disulfide bruggen. De coderende sequentie voor het RIP-M41 met de N- of C-terminale His-tag werd in de pCXP34hvector ingebracht. De pCXP34h-vector zorgt voor een constitutieve expressie van het ingebrachte insert. Het experiment met de constitutieve vector leverde geen resultaten op. De constitutieve expressie van RIP’s in bacteriën kan problematisch zijn door de mogelijke toxiciteit. Het is duidelijk dat de actieve site van het RIP-domein aanwezig is in het RIP-M41 waardoor er dus RIP-activiteit kan zijn. Het werd al eerder beschreven dat sommige RIP’s toxisch zijn voor prokaryoten. Dianthine en PAP bijvoorbeeld zijn in staat om de prokaryotische ribosomen te inactiveren (Hartley M. R. et al. 1991). Bij de heterologe expressie van type 1 RIP’s in bacteriën zijn er reeds problemen opgetekend (Vepachedu R. et al. 2005). MAP (Mirabilis antiviral protein, een type 1 RIP) bijvoorbeeld werd tot expressie gebracht in E. coli, maar dit resulteerde in slechte opbrengsten en een vertraging van de groei (Kataoka J. et al. 1991). Wanneer het ME1 (RIP uit Miribalis expensa) (Vepachedu R. et al. 2005) of het b-32 RIP (pro-RIP en de actieve sequentie) (Hey T. D. et al. 1995) tot expressie werden gebracht in E. coli werd geen toxiciteit opgemerkt. Het is dus afhankelijk van RIP tot RIP of de heterologe expressie ervan mogelijk is in E. coli. De mogelijke oplossing is het gebruik van induceerbare expressie van het RIP om eventuele toxiciteit tijdens de groei te vermijden. Hierdoor kunnen de bacteriën groeien tot een hoge celdensiteit alvorens de expressie van het potentieel toxische proteïne geïnduceerd wordt. Ook kan het proteïne naar het periplasma worden gebracht, weg van de ribosomen in het cytoplasma (Rosano G. L., Ceccarelli E. A. 2014). In dit geval werd gekozen voor induceerbare expressie. De expressie van eukaryote eiwitten in E. coli kan problemen geven. Één van deze redenen is het niet overeenkomen van de codonfrequentie in het gen met de codonfrequentie van de gastheer. Dit betekent dat er in het gen codons aanwezig zijn waarvan het tRNA zeldzaam is in de gastheer. 62 Wanneer het mRNA van dat gen dan wordt vertaald zullen al deze zeldzame tRNA’s worden opgebruikt en zal een tekort ontstaan. Door dit tekort kan vervolgens bij de vertaling van het mRNA de verkeerde aminozuren worden geïncorporeerd (Gustafsson C. et al. 2004, Rosano G. L., Ceccarelli E. A. 2014). Ook kan door het tekort van de tRNA’s de translatie zeer traag gaan, vroegtijdig stoppen en leiden tot een translationele frameshift (Kurland C., Gallant J. 1996). In Figuur 45 (bijlage) is het open leesraam voor RIP-M41 weergegeven, in kleur zijn de zeldzame tRNA’s (in E. coli) aangeduid (UCLA 2012). Er zijn twee strategieën die worden gebruikt om dit probleem (zijnde het verschil in codonfrequentie in het ingebrachte DNA en de gastheer voor recombinante expressie) op te lossen. De eerste strategie is de codon-optimalisatie van het transgen. Hierbij worden de problematische codons vervangen door codons die wel een hoge frequentie hebben in de gastheer en die coderen voor hetzelfde aminozuur (Burgess-Brown N. A. et al. 2008, Menzella H. G. 2011, Welch M. et al. 2009). Dit proces is eerder omslachtig en kost veel geld (Rosano G. L., Ceccarelli E. A. 2014). Een andere oplossing is het aanpassen van de gastheer (Sorensen H. P., Mortensen K. K. 2005). Hierbij zal een plasmide met extra kopieën van de genen voor de zeldzame tRNA’s worden ingebracht in de gastheer (Rosano G. L., Ceccarelli E. A. 2014). Aangezien er een vermoeden was dat de translatie in E. coli problemen kan geven door het niet voldoende aanwezig zijn van een aantal tRNA’s die nodig zijn voor de translatie van het RIP-M41 mRNA, werd de rosetta stam gebruikt voor de heterologe expressie. De rosetta stam is afgeleid van de BL21 stam maar bevat extra genen voor zeldzame codons zoals: ata, agg, aga, cgg, cta, ccc en gga (Terpe K. 2006). Door bovenstaande redenen werd de heterologe expressie van het RIP-M41 met de N- of Cterminale His-tag uitgevoerd in de rosetta stam met een induceerbare vector. De vector die werd gebruikt was de pET-21a-vector. De CDS voor het RIP-M41 met de N- of C-terminale His-tag werd in de vector gebracht. Deze vector werd vervolgens in E. coli rosetta ingebracht. Wanneer de OD bij 600nm tussen 0,5 en 0,8 bedroeg werd de productie van het RIP-M41 geïnduceerd met 1mM IPTG. Zoals te zien is in Figuur 40, Figuur 41 en Figuur 42 is er duidelijk heteroloog aangemaakt RIP-M41 te vinden in de onoplosbare fractie van de E. coli rosetta met het open leesraam voor het RIP-M41 met de C-terminale His-tag. De reden waarom het RIP-M41 onoplosbaar is, kan te vinden zijn in de codonfrequentie van de gastheer. Het veranderen van codons, zelfs al codeert het codon voor hetzelfde aminozuur kan een duidelijk effect hebben op het proteïne in kwestie (Angov E. et al. 2008). Zo kan het veranderen van een niet-frequent gebruikt codon naar een frequent gebruikt codon een negatief effect hebben op de enzymatische activiteit (Komar A. A. et al. 1999). Ook zou het veranderen van een frequent codon naar een zeldzaam codon in gebieden met veel frequent voorkomende codons aanleiding kunnen geven tot een veranderde substraatspecificiteit (Kimchi-Sarfaty C. et al. 2007). Iets gelijkaardigs kan optreden wanneer een gen tot expressie komt in een andere gastheer. Deze gastheer kan andere codonfrequenties hebben dan de originele gastheer. Soortspecifieke verschillen in codonfrequentie kunnen aan de basis liggen van heel wat problemen in heterologe expressie van proteïnen, onder andere niet-functioneel of onoplosbaar proteïne wat veroorzaakt kan worden door niet correct gevouwen eiwit (Adzhubei A. A. et al. 1996, Kurland C., Gallant J. 1996, Lindsley D. et al. 2003). In E. coli heeft men de DNA-sequentie van genen vergeleken met de proteïne-sequentie. Daar werd gevonden dat groepen van zeldzamere codons vaak geassocieerd waren met de sequenties tussen de domeinen (Thanaraj T. A., Argos P. 1996a). Doordat tussen deze domeinen infrequente codons aanwezig zijn zal het ribosoom de sequentie tijdelijk trager vertalen, hierdoor kunnen de domeinen al (geheel of gedeeltelijk) op zichzelf vouwen (Angov E. et al. 2008). Door eukaryote genen in te 63 brengen in E. coli verandert de codonfrequentie van het gen. Hierdoor kunnen deze gebieden tussen de domeinen dan wel frequente codons bevatten en kunnen de domeinen niet meer individueel opvouwen. Dit kan leiden tot verkeerde vouwing. Rosano G. L. en Ceccarelli A. (2009) hebben onderzoek gedaan waarbij plantproteïnen tot expressie werden gebracht in E. coli. In dat onderzoek werd gebruik gemaakt van twee stammen, een normale E. coli stam en een E. coli stam waarbij een aantal codons een verhoogde frequentie hadden. Wanneer genen met een relatief groot aantal (meer dan 5%) codons die waren aangerijkt in de aangepaste stam tot expressie werden gebracht in de aangepaste stam, waren de corresponderende proteïnen meer onoplosbaar dan wanneer ze in de niet-aangerijkte stam tot expressie werden gebracht. Proteïnen afkomstig van genen met een kleiner aantal van deze codons waren oplosbaar bij expressie in beide stammen. De rosetta stam is ook aangerijkt aan een aantal zeldzame codons. Hierdoor is het dus mogelijk dat de gebieden tussen de domeinen niet meer zorgen voor een vertraging in de translatie en dat de domeinen niet meer (geheel of gedeeltelijk) individueel kunnen opvouwen. Dit kan op zijn beurt zorgen voor een onvolledige vouwing en aggregatie van de recombinante proteïnen in ‘inclusion bodies’ (onoplosbare eiwitfractie). Een andere reden voor het onoplosbaar zijn van de eiwitten kan te vinden zijn in de Histag. Zhu S. et al. (2012) zagen in experimenten dat de incorporatie van een His-tag kan zorgen voor een onoplosbaar eiwit. Het natieve eiwit was steeds oplosbaar maar het eiwit met de His-tag kwam vaker in de onoplosbare fractie terecht (afhankelijk van de driedimensionale structuur van het eiwit). Het is vaak gewenst om oplosbaar eiwit te bekomen. Om het eiwit oplosbaar te maken kan er aan het eiwit een polypeptide gefuseerd worden dat zeer oplosbaar is zoals bijvoorbeeld thioredoxine of GST. Een andere mogelijkheid is de translocatie naar het periplasma (Novagen 2003). De translocatie naar het periplasma is in dit geval een weinig interessante oplossing aangezien het periplasma de vorming van disulfidebruggen in de hand werkt, en het RIP-M41 een cytoplasmatisch proteïne is. Wanneer proteïnen heteroloog worden aangemaakt is er in vele gevallen een zeer hoge productie van dit proteïne. Zo een hoge productie kan ervoor zorgen dat het cytosol vol raakt en de kwaliteitscontrole mechanismen van de cel overbelast (Carrio M. M., Villaverde A. 2002). Het vertragen van de eiwitexpressie is daarom een andere optie om meer oplosbaar eiwit te bekomen. De inductie bij lagere temperaturen is zo een mogelijkheid om meer oplosbaar recombinant eiwit te bekomen, de gebruikte temperaturen liggen dan vaak tussen 15-25°C (Rosano G. L., Ceccarelli A. 2014). Vaak wordt de eiwitexpressie geïnduceerd wanneer de bacteriën in de mid-log groeifase zijn, wanneer de bacteriën zeer snel groeien en de proteïnesynthese maximaal is. Maar inductie in de vroege stationaire fase zou in sommige gevallen tot meer oplosbaar eiwit kunnen leiden, omdat de eiwitsynthese vertraagd is op dat moment (Galloway C. A. et al. 2003, Ou J. et al. 2004). Ook kunnen extra chaperones samen met het eiwit tot expressie gebracht worden (Carrio M. M., Villaverde A. 2001, de Marco A., De Marco V. 2004). Een andere aanpak om oplosbaar, actief eiwit te bekomen is het terug opvouwen van de proteïnen. In sommige onderzoeken is de vorming van ‘inclusion bodies’ gewenst. Een voordeel van ‘inclusion bodies’ is een hoge productie van het recombinante eiwit. Deze ‘inclusion bodies’ zijn gemakkelijk af te scheiden door hun hoge densiteit. Er is ook een verlaagde degradatie van het recombinante proteïne. De proteïnen in ‘inclusion bodies’ zijn in vele gevallen ook al vrij zuiver. Om vanuit ‘inclusion bodies’ terug actief eiwit te krijgen zijn twee stappen essentieel, namelijk het oplosbaar maken en de hervouwing van de eiwitten. Eerst kunnen de ‘inclusion bodies’ gescheiden worden van het celmateriaal door gebruik te maken van centrifugatie met een lage snelheid na de lyse van de cellen (Singh S. M., Panda A. K. 2005). De eiwitten worden dan weer oplosbaar gemaakt met behulp 64 van hoge concentraties aan chaotropische agentia zoals ureum, guanidine hydrochloride en andere (Fischer B. et al. 1993, Rudolph R. et al. 1997). Hierbij kan ook β-mercaptoethanol worden toegevoegd of een ander reducerend agens (Fischer B. et al. 1993). Vervolgens hervouwen de proteïnen zich tijdens het verwijderen van het chaotropische agens (Clark E. D. 2001, Fischer B. et al. 1993, Mayer M., Buchner J. 2004, Misawa S., Kumagai I. 1999, Rudolph R. et al. 1997, Vallejo L. F. Rinas U. 2004). Na het hervouwen kan er nog een opzuiveringsstap plaatsvinden om de nog eventueel aanwezige contaminanten te verwijderen. Er bestaan verschillende varianten op dit protocol (Singh S. M., Panda A. K. 2005). 65 7 Conclusie en onderzoek ideeën voor verder In deze thesis werd onderzoek gedaan naar een tot nu toe vrij weinig beschreven klasse van RIP’s namelijk de type 3 RIP’s. Met behulp van lokalisatie- en colokalisatiestudies werd een sterke indicatie geleverd dat het RIP-M41 en RIP-C19 zich in het cytoplasma van de cel bevinden. Dit resultaat kan een eerste indicatie leveren naar de fysiologische functies van deze proteïnen. Aangezien ze in het cytoplasma vertoeven is het logisch om te veronderstellen dat respectievelijk de ribosomen van tarwe en rijst en bij uitbreiding eventueel de Poaceae of planten in het algemeen tolerant zijn tegenover deze RIP’s. Het is ook mogelijk dat de expressie van deze RIP’s wordt opgereguleerd als respons op een bepaalde vorm van stress en dat de waardeigen ribosomen niet resistent zijn. Het feit dat deze eiwitten in het cytoplasma aanwezig zijn is in overeenstemming met een mogelijke rol ervan in de plantenbescherming. Zo zouden deze RIP’s toxisch kunnen zijn voor fytofage insecten, bacteriën of virussen die de plant aanvallen. Of de RIP’s kunnen de planten beschermen tegen abiotische stress. De ER-retentie strategie voor het recombinant aanmaken van de eiwitten was niet succesvol. De problemen met de expressie in BY-2 cellen zijn waarschijnlijk niet te verklaren door mogelijke toxiciteit aangezien de proteïnen in het ER aanwezig zijn (dankzij het ER-retentiesignaal), weg van de ribosomen. Ook werd geen vertraagde groei of silencing opgemerkt. Voor de expressie in BY-2 cellen kan een andere tag gebruikt worden, bijvoorbeeld de veelgebruikte FLAG-tag. Het RIP-M41 werd heteroloog aangemaakt met behulp van een induceerbare vector en de rosetta stam van E. coli en zal accumuleren in het cytoplasma. Het heteroloog aangemaakte proteïne was aanwezig in de onoplosbare fractie. Om actief eiwit te bekomen moet het eiwit oplosbaar gemaakt worden. Dit kan gebeuren door het hervouwen van het eiwit uit de onoplosbare fractie. Een andere mogelijkheid is het aanpassen van de cultuurcondities om het eiwit toch in een oplosbare vorm te kunnen aanmaken. Gelijkaardige constructen moeten ook worden gemaakt voor het RIP-C19, waarna dit ook tot expressie kan worden gebracht. Het heteroloog aangemaakte proteïne kan gebruikt worden om de biologische activiteit van het RIP te analyseren. De RIP-activiteit van de RIP-domeinen kan getest worden alsook de protease-activiteit van de protease-domeinen. De RIP-activiteit kan geanalyseerd worden met ribosomen van verschillende oorsprong, zoals ribosomen van zoogdieren, insecten, planten, fungi en prokaryoten. De cytotoxiciteit van de type 3 RIP’s kan getest worden op dierlijke cellen en cellen van insecten. Er kan nagegaan worden of het protease-domein de cytotoxiciteit verhoogt of niet. Het opgezuiverde proteïne zou ook aan insecten gevoed kunnen worden in een zogenaamde ‘feeding assay’ om de eventuele toxiciteit te meten tegen insecten. Transgene planten die de eiwitten tot overexpressie brengen kunnen eveneens gemaakt worden. Deze planten kunnen geïnfecteerd worden met prokaryoten, virussen, fungi en insecten. De symptomen van deze infecties kunnen worden vergeleken met een analyse op ongetransformeerde planten. Ook zou men kunnen nagaan of de overexpressie van de type 3 RIP’s een verhoogde tolerantie geeft tegenover abiotische stress. Om een fysiologische functie te bepalen kan het interessant zijn om te bestuderen hoe het expressieniveau van de RIP’s varieert in tarwe en rijst in functie van bepaalde vormen van stress. 66 8 Referenties Addgene (2015). pET-21a(+)-T-protein. https://www.addgene.org/12652/ (geraadpleegd op 28/05/2015). Adzhubei, A. A., Adzhubei, I. A., Krasheninnikov, I. A., Neidle, S. (1996). Non-random usage of ‘degenerate’ codons is related to protein three-dimensional structure. FEBS Letters 399(1), 78-82. Aerts, D., Verhaeghe, T., De Mey, M., Desmet, T., Soetaert, W. (2011). A constitutive expression system for high-throughput screening. Engineering in Life Sciences, 11(1), 10-19. Akiyama, Y., Ito, K., Ogura, T. (2004). FtsH protease. Elsevier, Handbook of Proteolytic Enzymes 2 pp. 794-798. Amessou, M., Fradagrada, A., Falguières, T., Lord J. M., Smith, D. C., Roberts, L. M., Lamaze, C., Johannes, L. (2007). Syntaxin 16 and syntaxin 5 are required for efficient retrograde transport of several exogenous and endogenous cargo proteins. Journal of Cell Science 120(8), 1457-1468. An, G. (1985). High efficiency transformation of cultured tobacco cells. Plant Physiology 79(2): 568-570. Angov, E., Hillier, C. J., Kincaid, R. L., Lyon, J. A. (2008). Heterologous protein expression is enhanced by harmonizing the codon usage frequencies of the target gene with those of the expression host. PLoS One 3(5), e2189. Au, T. K., Collins, R. A., Lam, T. L., Ng, T. B., Fong, W. P., Wan, D. C. C. (2000). The plant ribosome inactivating proteins luffin and saporin are potent inhibitors of HIV-1 integrase. FEBS Letters 471(2), 169-172. Aviezer, D., Almon-Brill, E., Shaaltiel, Y., Galili, G., Chertkoff, R., Hashmueli, S., Galun, E., Zimran, A. (2008). 6. Novel enzyme replacement therapy for Gaucher disease: On-going phase III clinical trial with recombinant human glucocerebrosidase expressed in plant cells. Molecular Genetics and Metabolism, 93(2), 15. Badri, M. A., Rivard, D., Coenen, K., Michaud, D. (2009). Unintended molecular interactions in transgenic plants expressing clinically useful proteins: the case of bovine aprotinin traveling the potato leaf cell secretory pathway. Proteomics 9(3), 746-756. Bagga, S., Seth, D., Batra, J. K. (2002). The Cytotoxic Activity of Ribosome-inactivating Protein Saporin-6 Is Attributed to Its rRNA N-Glycosidase and Internucleosomal DNA Fragmentation Activities. Journal of Biological Chemistry 278(7), 4813-4820. Balconi, C., Lanzanova, C., Conti, E., Triulzi, T., Forlani, F., Cattaneo, M., Lupotto, E. (2007). Fusarium head blight evaluation in wheat transgenic plants expressing the maize b-32 antifungal gene. European Journal of Plant Pathology 117(2), 129-140. Barbieri, L., Battelli, M. G., Stirpe, F. (1993). Ribosome inactivating proteins from plants. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Reviews on Biomembranes 1154(3), 237-282. Barbieri, L., Brigotti, M., Perocco, P., Carnicelli, D., Ciani,M., Mercatali, L. Stirpe, F. (2003) Ribosome-inactivating proteins depurinate poly(ADP-ribosyl)ated poly(ADP-ribose) polymerase and have transforming activity for 3T3 fibroblasts. FEBS Letters 538(1), 178-182. Barbieri, L., Ferreras, J. M., Barraco, A., Ricci, P., Stirpe, F. (1992). Some ribosome-inactivating proteins depurinate ribosomal RNA at multiple sites. Biochemical Journal 286, 1-4. Barbieri, L., Gorini, P., Valbonesi, P., Castiglioni, P., and Stirpe, F. (1994). Unexpected activity of saporins. Nature 372(6507), 624. Barbieri, L., Polito, L., Bolognesi, A., Ciani, M., Pelosi, E., Farini, V., Jha, A., Sharma, N., Vivanco, J. M., Chambery, A., Parente, A., Stirpe, F. (2006). Ribosome-inactivating proteins in edible plants and purification and characterization of a new ribosome-inactivating protein from Cucurbita moschata. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects 1760(5), 783-792. Barbieri, L., Valbonesi, P., Bonora, E., Gorini, P., Bolognesi, A., Stirpe, F. (1997). Polynucleotide:adenosine glycosidase activity of ribosome-inactivating proteins: effect on DNA, RNA and poly(A). Nucleic Acids Research 25(3), 518-522. Barbieri, L., Valbonesi, P., Bondioli, M., Lugo Alvarez, M., Dal, Monte P., Landini, M. P., Stirpe, F. (2001). Adenine glycosylase activity in mammalian tissues: an equivalent of ribosome-inactivating proteins. FEBS Letters 505(1), 196-197. 67 Barbieri, L., Valbonesi, P., Govoni, M., Pession, A., Stirpe, F. (2000). Polynucleotide:adenosine glycosidase activity of saporin- L1: effect on various forms of mammalian DNA. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Protein Structure and Molecular Enzymology 1480(1), 258-266. Battelli, M. G. (2004). Cytotoxicity and toxicity to animals and humans of ribosome-inactivating proteins. Mini reviews in Medicinal Chemistry 4(5), 513-521. Baur, A., Reski, R., Gorr, G. (2005). Enhanced recovery of a secreted recombinant human growth factor using stabilizing additives and by co-expression of human serum albumin in the moss Physcomitrella patens. Plant Biotechnology Journal 3(3), 331-340. Becker, W., Apel, K. (1992). Isolation and characterization of a cDNA clone encoding a novel jasmonate-induced protein of barley (Hordeum vulgare L.). Plant Molecular Biology 19(6), 1065-67. Benchabane, M., Saint-Jore-Dupas, C., Bardor, M., Faye, L., Michaud, D., Gomord, V. (2009). Targeting and posttranslational processing of human α1-antichymotrypsin in BY-2 tobacco cultured cells. Plant Biotechnology Journal 7(2), 146-160. Bio-Rad Laboratories, Inc. (2015). iScript™ cDNA Synthesis Kit. http://www.bio-rad.com/enus/product/reverse-transcription-reagents/iscript-cdna-synthesis-kit (geraadpleegd op 22/02/2015). Brigotti, M., Alfieri, R., Sestili, P., Bonelli, M., Petronini, P., Guidarelli, A., Barbieri, L., Stirpe, F., Sperti, S. (2002). Damage to nuclear DNA induced by Shiga toxin 1 and by ricin in human endothelial cells. The FASEB Journal 16(3), 365-372. Brigotti, M., Carnicelli, D., Alvergna, P., Pallanca, A., Lorenzetti, R., Denaro, M., Sperti, S., Montanaro, L. (1995). 3’-immature tRNA(Trp) is required for ribosome inactivation by gelonin, a plant RNA N-glycosidase. Biochemical Journal 310, 249-253 Brigotti, M., Carnicelli, D., Pallanca, A., Rizzi, S., Accorsi, P., Sperti, S., Montanaro, L. (1999). Identity elements in bovine tRNA(Trp) required for the specific stimulation of gelonin, a plant ribosome-inactivating protein. RNA 5(10), 1357-1363. Brigotti, M., Carnicelli, D., Alvergna, P., Pallanca, A., Sperti, S., Montanaro, L. (1996). tRNA(Trp) as cofactor of gelonin, a ribosome-inactivating protein with RNAN- glycosidase activity. Features required for the cofactor activity. IUBMB Life 40(1), 181-188. Brigotti, M., Keith, G., Pallanca, A., Carnicelli, D,. Alvergna, P., Dirheimer, G., Montanaroa, L., Sperti, S. (1998). Identification of the tRNAs which up-regulate agrostin, barley RIP and PAP-S, three ribosome-inactivating proteins of plant origin. FEBS Letters 431(2), 259-262. Bruckner, R. C., Gunyuzlu, P. L., Stein, R. L. (2003). Coupled kinetics of ATP and peptide hydrolysis by Escherichia coli FtsH protease. Biochemistry 42(36), 10843-10852. Burgess-Brown, N. A., Sharma, S., Sobott, F., Loenarz, C., Oppermann, U., Gileadi, O. (2008). Codon optimization can improve expression of human genes in Escherichia coli: a multi-gene study. Protein Expression and Purification 59(1), 94-102. Carnicelli, D., Brigotti, M., Montanaro, L., Sperti, S. (1992). Differential requirement of ATP and extra-ribosomal proteins for ribosome inactivation by eight RNA N-glycosidases. Biochemical and Biophysical Research Communications 182(2), 579-82. Carrio, M. M., Villaverde, A. (2002). Construction and deconstruction of bacterial inclusion bodies. Journal of Biotechnology 96(1), 3-12. Carrio, M. M., Villaverde, A. (2001). Protein aggregation as bacterial inclusion bodies is reversible. FEBS Letters 489(1), 29-33. Carzaniga, R., Sinclair, L., Fordham-Skelton, A. P., Harris, N., Croy, R. R. D. (1994). Cellular and subcellular distribution of saporins, type- ribosome-inactivating proteins in soapwort (Saponaria officinalis L.). Planta 194(4), 461-470. Cavallaro, U., Nykjaer, A., Nielsen, M., Soria, M. (1995). α2-Macroglobulin receptor mediates binding and cytotoxicity of plant ribosome-inactivating proteins. European Journal of Biochemistry 232(1), 165-171. Chaudhry, B., Müller-Uri, F., Cameron-Mills, V., Gough, S., Simpson, D., Skriver, K., Mundy, J. (1994). The barley 60 kDa jasmonate-induced protein (JIP60) is a novel ribosome-inactivating protein. The Plant Journal J 6(6), 815-824. 68 Chen, J. K., Hung, C. H., Liaw Y. C., Lin, J. Y. (1997). Identification of amino acid residues of abrin-a A chain is essential for catalysis and reassociation with abrin-a B chain by site-directed mutagenesis. Protein Engineering 10(7), 827-833. Chen, Y., Peumans, W. J, Van Damme, E. J. (2002). The Sambucus nigra type-2 ribosome-inactivating protein SNA-I' exhibits in planta antiviral activity in transgenic tobacco. FEBS Letters 516(1), 27-30. Chen, H., Wang, Y., Yan, M. G., Yu, M. K., Yao, Q. Z. (1996). The phosphatase activity of five ribosomeinactivating proteins. Chinese Biochemal Journal 12, 125-129. Chen, Z., White, R. F., Antoniw, J. F., Lin, Q. (1991). Effect of pokeweed antiviral protein (PAP) on the infection of plant viruses. Plant Pathology 40(4), 612-620. Choudhary, N. L., Yadav, O. P., Lodha, M. L. (2008a). Cloning and expression of antiviral/ribosome-inactivating protein from Bougainvillea xbuttiana. Journal of Biosciences 33(1), 91-101. Choudhary, N. L., Yadav, O. P., Lodha, M. L. (2008b). Ribonuclease, deoxyribonuclease, and antiviral activity of Escherichia coli expressed Bougainvillea xbuttiana antiviral protein 1. Biochemistry (Moscow) 73(3), 273-277. Clark, E. D. B. (2001). Protein refolding for industrial processes. Current Opinion in Biotechnology 12(2), 202207. Coleman, W. H., Roberts, W. K. (1982). Inhibitors of animal cell-free protein synthesis from grains. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Structure and Expression 696(3), 239-244. Correll, C. C., Munishkin, A., Chan, Y. L., Ren, Z., Wool, I. G., Steitz, T. A. (1998). Crystal structure of the ribosomal RNA domain essential for binding elongation factors. Proceedings of the National Academy of Sciences 95(23), 13436-13441. Dai, W. D., Bonos, S., Guo, Z., Meyer, W. A., Day, P. R., Belanger, F. C. (2003). Expression of pokeweed antiviral proteins in creeping bentgrass. Plant Cell Reports 21(5), 497-502. Day, P. J., Ernst, S. R., Frankel, A. E., Monzingo, A. F., Pascal, J. M., Molina-Svinth, M. C., Robertus, J. D. (1996). Structure and activity of an active site substitution of ricin A chain. Biochemistry. 35(34), 11098-11103. de Marco, A., De Marco, V. (2004). Bacteria co-transformed with recombinant proteins and chaperones cloned inindependent plasmids are suitable for expression tuning. Journal of Biotechnology 109(1), 45-52. De Muynck, B., Navarre, C., Nizet, Y., Stadlmann, J., Boutry, M. (2009). Different subcellular localization and glycosylation for a functional antibody expressed in Nicotiana tabacum plants and suspension cells. Transgenic Research 18(3), 467-482. de Virgilio, M., Lombardi, A., Cliandro, R., Fabbrini, M. S. (2010). Ribosome-inactivating proteins: from plant defense to tumor attack. Toxins 2(11), 2966-2737. Deeks, E. D., Cook, J. P., Day, P. J., Smith, D. C., Roberts, L. M., Lord, J. M. (2002). The low lisine content of ricin A chain reduces the risk of proteolytic degradation after translocation from the endoplasmic reticulum to the cytosol. Biochemistry 41(10), 3405-3413. Desvoyes, B., Proyet, J. L., Schlik, J. L., Adami, P., Jouvenot, M., Dulieu, P. (1997). Identification of a biological inactive complex from a pokeweed antiviral protein. FEBS Letters 410(2), 303-308. Dhingra, A., James, V. A., Koop, H. U., Mok, M. C., De Paepe, R., Gallo, M., Folta, K. M. (2009). Transgenic plantation crops, ornamentals and Turf grasses: Tobacco. In C. Kole, T. Hall (Eds.), Compendium of transgenic crop plants. John Wiley and sons, VS. Di Cola, A., Marcozzi, G., Balestrini, R., Spano, L. (1999). Localization of the type I ribosome-inactivating protein, luffin, in adult and embryonic tissues of Luffa cylindrica L. Roem. Journal of Experimental Botany 50(334), 573579. Domashevskiy, A., V., Goss, D., J. (2015). Pokeweed antiviral protein, a ribosome inactivating protein: activity, inhibition and prospects. Toxins 7(2), 274-298. Doran, P. M. (2006a). Foreign protein degradation and instability in plants and plant tissue cultures. Trends in Biotechnology 24(9), 426-432. Doran, P. M. (2006b). Loss of secreted antibody from transgenic plant tissue cultures due to surface adsorption. Journal of Biotechnology 122(1), 39-54. Dowd, P. F., Holmes, R. A., Pinkerton, T. S., Johnson, E. T., Lagrimini, L. M., Boston, R. S. (2006). Relative activity of a tobacco hybrid expressing high levels of a tobacco anionic peroxidase and maize ribosome inactivating 69 protein against Helicoverpa zea and Lasioderma serricorne. Journal of Agricultural and Food Chemistry 54(7), 2629-2634. Dowd, P. F., Johnson, E. T., Price, N. P. (2012). Enhanced pest resistance of maize leaves expressing monocot crop plant-derived ribosome-inactivating protein and agglutinin. Journal of Agricultural and Food Chemistry 60(43):10768-10775. Dowd, P. F., Zuo, W. N., Gillikin, J. W., Johnson, E. T., Boston, R. S. (2003). Enhanced resistance to Helicoverpa zea in tobacco expressing an activated form of maize ribosome-inactivating protein Journal of Agricultural and Food Chemistry 51(12), 3568-3574. EMBL-EBI (2015). Clustal Omega. http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ (geraadpleegd op 22/02/2015). Endo, Y., Gluck, A., Wool, I. G. (1991). Ribosomal RNA identity elements for ricin A-chain recognition and catalysis. Journal of Molecular Biology 221(1), 193-207. Endo, Y., Mitsui, K., Motizuki, M., Tsurugi, K. (1987). The mechanism of action of ricin and related toxic lectins on eukaryotic ribosomes. The site and the characteristics of the modification in 28S ribosomal RNA caused by the toxins. Journal of Biological Chemistry 262(12), 5908-5912. Endo, Y., Tsurugi, K. (1987). RNA N-glycosidase activity of ricin A-chain. Mechanism of action of the toxic lectin ricin on eukaryotic ribosomes. Journal of Biological Chemistry 262(17), 8128-8130. Endo, Y., Tsurugi, K. (1988). The RNA N-glycosidase activity of ricin A-chain: the characteristics of the enzymatic activity of ricin A-chain with ribosomes and with rRNA. Journal of Biological Chemistry 263(18), 8735-8739. Endo, Y., Tsurugi, K., Franz, H. (1988). The site of action of the A-chain of mistletoe lectin I on eukaryotic ribosomes: the RNA N-glycosidase activity of the protein. FEBS Letters 231(2), 378-380. Fischer, B., Sumner, I., Goodenough, P. (1993). Isolation, renaturation and formation of disulfide bonds of eukaryotic proteins expressed in E. coli as inclusion bodies. Biotechnology and Bioengineering 41(1), 3-13. Foyer, C. H., Noctor, G. (2005). Redox homeostasis and antioxidant signaling: a metabolic interface between stress perception and physiological responses. The Plant Cell Online 17(7), 1866-1875. Fracasso, G., Stirpe, F., Colombatti, M. (2010) Ribosome-inactivating protein-containing conjugates for therapeutic use. Toxic Plant Proteins. Springer Science & Business Media, Duitsland, pp. 225-263. Galloway, C. A., Sowden, M. P., and Smith, H. C. (2003). Increasing the yield of soluble recombinant protein expressed in E. coli by induction during late log phase. Biotechniques 34(3), 524-526, 528, 530. Gatehouse, A., Barbieri, L., Stirpe, F., Croy, R. R. D. (1990). Effects of ribosome inactivating proteins on insect development— differences between Lepidoptera and Coleoptera. Entomologia Experimentalis et Applicata 54(1), 43-51. Girbes, T., Barbieri, L., Ferreras, M., Arias, F. J., Rojo, M. A., Iglesias, R., Alegre, C., Escarmis, C., Stirpe, F. (1993). Effects of ribosome-inactivating proteins on Escherichia coli and Agrobacterium tumefaciens translation systems. Journal of Bacteriology 175(20), 6721- 6724. Girbés, T., de Torre, C., Iglesias, R., Ferreras, J. M, Méndez, E. (1996). RIP for viruses. Nature 379, 777-778. Girbés, T., Ferreras, J. M., Arias, F. J., Stirpe, F. (2004). Description, distribution, activity and phylogenetic relationship of ribosome-inactivating proteins in plants, fungi and bacteria. Mini reviews in Medicinal Chemistry 4(5), 461-476. Gomord, V., Fitchette, A. C., Menu-Bouaouiche, L., Saint-Jore-Dupas, C., Plasson, C., Michaud, D., Faye, L. (2010). Plant-specific glycosylation patterns in the context of therapeutic protein production. Plant Biotechnology Journal 8(5), 564-587. Gorlich, D. (1998). Transport into and out of the cell nucleus. The EMBO Journal 17(10), 2721-2727. Görschen, E., Dunaeva, M., Hause, B., Reeh, I., Wasternack, C., Parthier, B., (1997). Expression of the ribosomeinactivating protein JIP60 from barley in transgenic tobacco leads to an abnormal phenotype and alterations on the level of translation. Planta 202(4), 470-478. Greenwood, J. S., Stinissen, H. M., Peumans, W. J., Chrispeels, M. T. (1986). Sambucus nigra agglutinin is located in protein bodies in the phloem parenchyma of bark. Planta 167(2), 275-278. Gustafsson, C., Govindarajan, S., Minshull, J. (2004). Codon bias and heterologous protein expression. Trends in Biotechnology 22(7), 346-353. 70 Gutell, R. R., Gray, M. W., Schnare, M. N. (1993). A compilation of large subunit (23S and 23S-like) ribosomal RNA structures: 1993. Nucleic Acids Research 21(13), 3055-3074. Habuka, N., Kataoka, J., Miyano, M., Tsuge, H., Ago, H., Noma, M. (1993). Nucleotide sequence of a genomic gene encoding tritin, a ribosome-inactivating protein from Triticum aestivum. Plant Molecular Biology 22(1), 171-176. Habuka, N., Miyano, M., Kataoka, J., Noma, M. (1991). Escherichia coli ribosome is inactivated by Mirabilis antiviral protein which cleaves the N-glycosidic bond at A2660 of 23S ribosomal RNA. Journal of Molecular Biology 221(3), 737-743. Hartley, M. R., Chaddock, J. A., Bonness, M. S. (1996). The structure and function of ribosome-inactivating proteins. Trends in Plant Science 1(8), 252. Hartley, M. R., Legname, G., Osborn, R., Chen, Z., Lord, J. M. (1991). Singlechain ribosome-inactivating proteins from plants depurinate Escherichia coli 23S ribosomal RNA. FEBS Letters 290(1), 65-68. Hartley, M. R, Lord, J. M. (1993). Structure, function and applications of ricin and related cytotoxic proteins. Biosynthesis and manipulation of plant products. Springer, Nederland, pp. 210-239. Hasegawa, N., Kimura, Y., Oda, T., Komatsu, N., Muramatsu, T. (2000). Isolated ricin B-chain-mediated apoptosis in U937 cells. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 64(7), 1422-1429. Hassoun, E., Wang, X. (2000). Ricin-induced toxicity in the macrophage J744A.1 cells: the role of TNF-alpha and the modulation effects of TNF-alpha polyclonal antibody. Journal of biochemical and molecular toxicology 14(2), 95-101. Hellwig, S., Drossard, J., Twyman, R. M., Fischer, R. (2004). Plant cell cultures for the production of recombinant proteins. Nature Biotechnology 22(11), 1415-1422. Helmy, M., Lombard, S., Pieroni, G. (1999). Ricin RCA60: evidence of its phospholipase activity. Biochemical and Biophysical Research Communications 258(2), 252-255. Herman, E. M., Tague, B. W., Hoffman, L. M., Kjemtrup, S. E., Chrispeels, M. J. (1990). Retention of phytohemagglutinin with carboxy terminal tetrapeptide KDEL in the nuclear envelope and the endoplasmic reticulum. Planta, 182(2), 305-312. Hey, T. D., Hartley, M., Walsh, T. A. (1995). Maize ribosome-inactivating protein (b-32). Homologs in related species, effects on maize ribosomes, and modulation of activity by pro-peptide deletions. Plant Physiology 107(4), 1323-1332. Huang, J., Wu, L., Yalda, D., Adkins, Y., Kelleher, S., Crane, M., Lonnerdal, B., Rodriguez, R. L., Huang N. (2002). Expression of functional recombinant human lysozyme in transgenic rice cell culture. Transgenic Research, 11(3), 229-239. Hudak, K. A., Dinman, J. D., Tumer, N. E. (1999). Pokeweed antiviral protein accesses ribosomes by binding to L3. Journal of Biological Chemistry 274(6), 3859-3864. Hudak, K. A., Wang, P., Tumer, N. E. (2000). A novel mechanism for inhibition of translation by pokeweed antiviral protein: depurination of the capped RNA template. RNA 6(3), 369-380. Iglesias, R., Pérez, Y., de Torre, C., Ferreras, J. M., Antolín, P., Jiménez, P., Rojo, M. A., Méndez, E., Girbés, T. (2005). Molecular characterization and systemic induction of single-chain ribosome-inactivating proteins (RIPs) in sugar beet (Beta vulgaris) leaves. Journal of Experimental Botany 56(416), 1675-1684. Invitrogen Corporation (2003). Gateway® Technology A universal technology to clone DNA sequences for functional analysis and expression in multiple systems Catalog Numbers 12535-019 and 12535-027. Invitrogen Corporation (2012). Gateway® pDONR™ Vectors Catalog numbers 12536-017 and 12535-035. Iordanov, M. S., Pribnow, D., Magun, J. L., Dinh, T. H., Pearson, J. A., Chen, S. L., Magun, B. E. (1997). Ribotoxic stress response: activation of the stress-activated protein kinase JNK1 by inhibitors of the peptidyl transferase reaction and by sequence-specific RNA damage to the alpha-sarcin/ricin loop in the 28S rRNA. Molecular and Cellular Biology 17(6), 3373-3381. Irvin, J. D. (1983). Pokeweed antiviral protein. Pharmacology & Therapeutics 21(3), 371-387. Ishizaki, T., Megumi, C., Komai, F., Masuda, K., Oosawa, K. (2002). Accumulation of a 31-kDa glycoprotein in association with the expression of embryogenic potential by spinach callus in culture. Physiologia Plantarum 114(1), 109-115. 71 James, E .A., Wang, C., Wang, Z., Reeves, R., Shin, J. H., Magnuson, N. S., Lee, J. M. (2000). Production and characterization of biologically active human GM-CSF secreted by genetically modified plant cells. Protein Expression and Purification 19(1), 131-138. Jiang, S. Y., Bhalla, R., Ramamoorthy, R., Luan, H. F., Venkatesh, P. N., Cai, M., Ramachandran, S. (2012). Overexpression of OSRIP18 increases drought and salt tolerance in transgenic rice plants. Transgenic Research 21(4), 785-795. Jiang, S. Y., Ramamoorthy, R., Bhalla, R., Luan, H. F., Venkatesh, P. N., Cai, M., Ramachandran, S. (2008). Genome-wide survey of the RIP domain family in Oryza sativa and their expression profiles under various abiotic and biotic stresses. Plant Molecular Biology 67(6), 603-614. Kataoka, J., Habuka, N., Furuno, M., Miyano, M., Takanami, Y., Koiwai, A. (1991). DNA sequence of Mirabilis antiviral protein (MAP), a ribosome-inactivating protein with an antiviral property, from Mirabilis jalapa L. and its expression in Escherichia coli. Journal of biological Chemistry 266(13), 8426-8430. Katiyar, S. P., Bakkiyaraj, D., Pandian S. K. (2011). Role of aromatic stack pairing at the catalytic site of gelonin protein. Biochemical and Biophysical Research Communications 410(1), 75-80. Kaur, I., Gupta, R. C., Puri, M. (2011). Ribosome inactivating proteins from plants inhibiting viruses. Virologica sinica 26(6), 357-365. Kaur, I., Puri, M., Ahmed, Z., Blanchet, F. P., Mangeat, B., Piguet, V., (2013). Inhibition of HIV-1 Replication by Balsamin, a Ribosome Inactivating Protein of Momordica balsamina. PLos One 8(9), e73780. Kimchi-Sarfaty, C., Oh, J. M., Kim, I. W., Sauna, Z. E., Calcagno, A. M., Ambudkar, S. V., Gottesman, M. M. (2007). A ‘‘silent’’ polymorphism in the MDR1 gene changes substrate specificity. Science 315(5811), 525-528. Kodama, T., Doukas, A. G., Hamblin, M. R. (2003). Delivery of ribosome-inactivating protein toxin into cancer cells with shock waves. Cancer Letters 189(1), 69-75. Komar, A. A., Lesnik, T., Reiss, C. (1999). Synonymous codon substitutions affect ribosome traffic and protein folding during in vitro translation. FEBS Letters 462(3), 387-391. Komatsu, N., Oda, T., Muramatsu, T. (1998). Involvement of both caspase-like proteases and serine proteases in apoptotic cell death induced by ricin, modeccin, diphtheria toxin, and pseudomonas toxin. Journal of Biochemistry 124(5), 1038-1044. Kowalski, M., Guindon, J., Brazas, L., Moore, C., Entwistle, J., Cizeau, J., Jewet, M. A., Macdonald, G. C. (2012). A phase II study of oportuzumab monatox: an immunotoxin therapy for patients with noninvasive urothelial carcinoma in situ previously treated with bacillus Calmette- Guérin. The Journal of Urology 188(5), 1712-1718. Kurland, C., Gallant, J. (1996). Errors of heterologous protein expression. Current Opinion in Biotechnology 7(5), 489-493. Kwon, T. H., Seo, J. E., Kim, J., Lee, J. H., Jang, Y. S., Yang, M. S. (2003). Expression and secretion of the heterodimeric protein interleukin-12 in plant cell suspension culture. Biotechnology and Bioengineering 81(7), 870-875. LaCount, W., An G., Lee, J. M. (1997). The effect of polyvinylpyrrolidone (PVP) on the heavy chain monoclonal antibody production from plant suspension cultures. Biotechnology Letters 19(1), 93-96. Landy, A. (1989). Dynamic, Structural, and Regulatory Aspects of Lambda Site-specific Recombination. Annual Review of Biochemistry 58(1), 913-941. Lapadula, W. J., Sánchez Puerta, M. V., Juri Ayub, M. (2013). Revising the taxonomic distribution, origin and evolution of ribosome inactivating protein genes. PLoS One. 8(9):e72825. Lee, J.-H., Kim, N. S., Kwon, T. H., Jang, Y. S., Yang, M. S. (2002). Increased production of human granulocytemacrophage colony stimulating factor (hGM-CSF) by the addition of stabilizing polymer in plant suspension cultures. Journal of Biotechnology 96(3), 205-211. Lee, S.-Y., Kim, Y.-H., Roh, Y.-S., Myoung, H.-J., Lee, K.-Y., Kim, D.-I. (2004). Bioreactor operation for transgenic Nicotiana tabacum cell cultures and continuous production of recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor by perfusion culture. Enzyme and Microbial Technology 35(6), 663-671. Lee-Huang, S., Huang, P. L., Bourinbaiar, A. S., Chen, H. C., Kung, H. F. (1995). Inhibition of the integrase of human immunodeficiency virus (HIV) type 1 by anti-HIV plant proteins MAP30 and GAP31. Proceedings of the National Academy of Sciences 92(19), 8818-8822. 72 Li, M. X., Yeung, H. W., Pan, L. P., Chan, S. I. (1991). Trichosanthin, a potent HIV-1 inhibitor, can cleave supercoiled DNA in vitro. Nucleic Acids Research 19(22), 6309-6312. Li, S., Spooner, R. A., Allen, S. C., Guise, C. P., Ladds, G., Schnöder, T., Schmitt, M. J., Lord J. M., Roberts, L. M. (2010). Folding-competent and folding-defective forms of ricin A chain may have different fates after retrotranslocation from the endoplasmic reticulum. Molecular Biology of the Cell 21(15), 2543-2554. Li, X. D., Liu, W. Y., Niu, C. L. (1996). Purification of a new ribosome-inactivating protein from the seeds of Cinnamomum porrectum and characterization of the RNA N-glycosidase activity of the toxic protein. Biological Chemistry 377(12), 825-831. Lin, J. Y., Tserng, K. Y., Chen, C. C., Lin, L. T., Tung, T. C. (1970). Abrin and ricin: new anti-tumour substances. Nature 227, 292-293. Lindsley, D., Gallant, J., Guarneros, G. (2003). Ribosome bypassing elicited by tRNA depletion. Molecular Microbiology 48(5), 1267-1274. Litvak-Greenfeld, D., Benhar, I. (2012). Risks and untoward toxicities of antibody-based immunoconjugates. Advanced Drug Delivery Reviews 64(15), 1782- 1799. Lodge, J. K., Kaniewski, W. K., Tumer, N. E. (1993). Broad-spectrum virus resistance in transgenic plants expressing pokeweed antiviral protein. Proceedings of the National Academy of Sciences 90(15), 7089-7093. Lombardi, A., Marshall, R. S., Savino, C., Fabbrini, M. S., Ceriotti, A. (2010). Type I ribosome-inactivating proteins from Saponaria officinalis. Toxic Plant Proteins. Springer Science & Business Media, Duitsland, p. 5578. Lorberboum-Galski, H., (2011). Human toxin-based recombinant immunotoxins/ chimeric proteins as a drug delivery system for targeted treatment of human diseases. Expert Opinion on Drug Delivery 8(5), 605-621. Lord, J. M., Roberts, L. M. (1998). Toxin entry: retrograde transport through the secretory pathway. The Journal of Cell Biology 140(4), 733-736. Lord, J. M., Roberts, L. M., Robertus, J. D. (1994). Ricin: structure, mode of action, and some current applications. The FASEB journal 8(2), 201-208. Ma, J. K-C., Drake, P. M., Chargelegue, D., Obregon, P., Prada, A. (2005). Antibody processing and engineering in plants, and new strategies for vaccine production. Vaccine 23(15), 1814-1818. Madan, S., Ghosh, P. C. (1991). Interaction of gelonin with macrophages. Effect of lysosomotropic amines. Experimental Cell Research 198(1), 52-58. Madin, K., Sawasaki, T., Ogasawara, T., Endo, Y. (2000). A highly efficient and robust cell-free protein synthesis system prepared from wheat embryos: plants apparently contain a suicide system directed at ribosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences 97(2), 559-64. Magnuson, N. S., Linzmaier, P. M., Gao, J. W., Reeves, R., An, G., Lee, J. M. (1996). Enhanced recovery of a secreted mammalian protein from suspension culture of genetically modified tobacco cells. Protein Expression and Purification 7(2), 220-228. Marshall, R. S., D’Avila, F., Di Cola, A., Traini, R., Spanò, L., Fabbrini, M. S., Ceriotti, A. (2010). Signal peptideregulated toxicity of a plant ribosome inactivating protein during cell stress. The Plant Journal, 65(2), 218-229. Massiah, A. J., Hartley, M. R. (1995). Wheat ribosome-inactivating proteins: seed and leaf forms with different specificities and cofactor requirements. Planta 197(4), 633-640. Mattaj, I. W., Englmeier, L. (1998). Nucleocytoplasmic transport: the soluble phase. Annual Review of Biochemistry 67(1), 265-306. Mayer, M., Buchner, J. (2004). Refolding of inclusion body proteins. Molecular diagnosis of infectious diseases. Humana Press, VS, pp. 239-254. Mayerhofer, P. U., Cook J. P., Wahlman, J., Pinheiro, T. T., Moore, K. A., Lord, J. M., Johnson, A. E., Roberts, L. M. (2009). Ricin A chain insertion into endoplasmic reticulum membranes is triggered by a temperature increase to 37 ºC. Journal of Biological Chemistry 284(15), 10232-10242. McGrath, M. S., Hwang, K. M., Caldwell, S. E., Gaston, I., Luk, K. C., Wu, P., Ng, V. L., Crowe, S., Daniels, J., Marsh, J., Deihart, T., Lekas, P. U., Uennaari, J. C., Yeung, H. W., Lifson, J. F. (1989). GLQ223: an inhibitor of human immunodeficiency virus replication in acutely and chronically infected cells of lymphocyte and mononuclear phagocyte lineage. Proceedings of the National Academy of Sciences 86(8), 2844-2848. 73 Meng, Y., Liu, S., Li, J., Meng, Y., Zhao, X. (2012). Preparation of an antitumor and antivirus agent: chemical modification of a-MMC and MAP30 from Momordica charantia L. with covalent conjugation of polyethylene glycol. International Journal of Nanomedicine, 7, 3133. Menzella, H. G. (2011). Comparison of two codon optimization strategies to enhance recombinant protein production in Escherichia coli. Microbial Cell Factories 10,15. Mikschofsky, H., Schirrmeier, H., Keil, G. M., Lange, B., Polowick, P. L., Keller, W., Broer, I. (2009). Pea-derived vaccines demonstrate high immunogenicity and protection in rabbits against rabbit haemorrhagic disease virus. Plant Biotechnology Journal 7(6), 537-49. Misawa, S., Kumagai, I. (1999). Refolding of therapeutic protein produced in Escherichia coli as inclusion bodies. Biopolymers-Peptide Science Section 51(4), 297-307. Mock, J. W., Ng, T. B., Wong, R. N., Yao, Q. Z., Yeung, H. W., Fong, W. P. (1996). Demonstration of ribonuclease activity in the plant ribosome-inactivating proteins alpha- and betamomorcharins. Life Sciences 59(22), 18531859. Mundy, J., Leah, R., Boston, R., Endo, Y., Stirpe, F. (1994). Genes encoding ribosome- inactivating proteins. Plant Molecular Biology Reporter 12(2), S60-62. Nair, N. R., Chidambareswaren, M., Manjula, S. (2014). Enhanced heterologous expression of biologically active human granulocyte colony stimulating factor in transgenic tobacco BY-2 cells by localization to endoplasmic reticulum. Molecular Biotechnology 56(9), 849-862. Nicolas, E., Beggs, J. M., Haltiwanger, B. M., Taraschi, T. F. (1997). Direct evidence for the deoxyribonuclease activity of the plant ribosome-inactivating protein gelonin. FEBS Letters 406(1), 162-164. Nicolas, E., Beggs, J. M., Haltiwanger, B. M., Taraschi, T. F. (1998). A new class of DNA glycosylase/apurinic/apyrimidinic lyases that act on specific adenines in single-stranded DNA. Journal of Biological Chemistry 273(27), 17216-17220. Nicolas, E., Beggs, J. M., Taraschi, T. F. (2000). Gelonin is an unusual DNA glycosylase that removes adenine from singlestranded DNA, normal base pairs and mismatches. Journal of Biological Chemistry 275(40), 3139931406. Nielsen, K., Boston, S. R. (2001). Ribosome-Inactivating Proteins: a plant perspective. Annual Review of Plant Biology 52(1), 785-816. Nigg, E. A. (1997). Nucleocytoplasmic transport: signals, mechanisms and regulation. Nature 386, 779-87. Novagen (2003). pET System Tutorial. http://www.yrbio.com/bioresource/sites/yrbio.com.bioresource/files/document/vector/226411/c183-001.pdf (geraadpleegd op 11/05/2015). Oda, T., Iwaoka, J., Komatsu, N., Muramatsu, T. (1999). Involvement of N-acetylcysteine- sensitive pathways in ricininduced apoptotic cell death in U937 cells Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 63(2), 341-348. Oda, T., Komatsu, N., Muramatsu, T. (1998). Diisopropylfluorophosphate (DFP) inhibits ricin-induced apoptosis of MDCK cells. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 62(2), 325-333. Olsnes, S. , Pihl, A. (1982). Chimeric toxins. Pharmacology & Therapeutics 15(3), 355-381. Orita, M., Nishikawa, F., Shimayama, T., Taira, K., Endo, Y., Nishikawa, S. (1993). High-resolution NMR study of a synthetic oligoribonucleotide with a tetranucleotide GAGA loop that is a substrate for the cytotoxic protein, ricin. Nucleic Acids Research 21(24), 5670-5678. Ou, J., Wang, L., Ding, X., Du, J., Zhang, Y., Chen, H., Xu, A. (2004). Stationary phase protein overproduction is a fundamental capability of Escherichia coli. Biochemical and Biophysical Research Communications 314(1), 174180. Pallanca, A., Mazzaracchio, R., Brigotti, M., Carnicelli, D., Alvergna, P., Sperti, S., Montanaro, L. (1998). Uncompetitive inhibition by adenine of the RNA-N-glycosidase activity of ribosome-inactivating proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Protein Structure and Molecular Enzymology 1384(2), 277- 284. Parikh, B. A., Tumer, N. E. (2004). Antiviral activity of ribosome inactivating proteins in medicine. Mini Reviews in medicinal chemistry 4(5), 523-543. Pelham, H. R. (1990). The retention signal for soluble proteins of the endoplasmic reticulum. Trends in Biochemical Sciences, 15(12), 483-486. 74 Peters, R. (1986). Fluorescence microphotolysis to measure nucleocytoplasmic transport and intracellular mobility. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Reviews on Biomembranes 864(3), 305-359. Peumans, W. J., Hao, Q., Van Damme, E. J. M. (2001). Ribosome-inacyivating proteins from plants: more than RNA N-glycosidases? The FASEB journal 15(9), 1493-1506. Peumans, W. J., Van Damme, E. (2010). Evolution of plant ribosome inactivating proteins. Toxic plant proteins. Springer Science & Business Media, Duitsland, pp. 1-26. Peumans, W. J., Shang, C., Van Damme., E. J. M. (2014). Updated model of the molecular evolution of RIP genes. Ribosome-inactivating Proteins: Ricin and Related Proteins. John Wiley & Sons, VS, pp. 134-150. Pope, B., Kent, H. M. (1996). High efficiency 5 min transformation of Escherichia coli. Nucleic Acids Research 24(3), 536-537. Prestle, J., Schönfelder, M., Adam, G., Mundry, K. W. (1992). Type 1 ribosome-inactivating protein depurinate plant 25S rRNA without species specificity. Nucleic Acids Research 20(12), 3179-3182. Qian, Q., Huang, L., Yi, R., Wang, S., Ding, Y. (2012). Enhanced resistance to blast fungus in rice (Oryza sativa L.) by expressing the ribosome-inactivating protein α-momorcharin. Plant Science 217, 1-7. Rapak, A., Falnes, P. O., Olsnes, S. (1997). Retrograde transport of mutant ricin to the endoplasmic reticulum with subsequent translocation to cytosol. Proceedings of the National Academy of Sciences 94(8), 3783-3788. Ready, M., Brown, D. T., Robertus, J. D. (1986). Extracellular localization of pokeweed antiviral protein. Proceedings of the National Academy of Sciences 83(14), 5053-5056. Reinbothe, C., Springer, A., Samol, I., Reinbothe, S. (2009). Plant oxylipins: Role of jasmonic acid during programmed cell death, defence and leaf senescence. FEBS Journal 276(17), 4666-4681. Reinbothe, S., Reinbothe, C., Lehmann, J., Becker, W., Apel, K., Parthier, B. (1994). JIP60, a methyl jasmonateinduced ribosome-inactivating protein involved in plant stress reactions. Proceedings of the National Academy of Sciences 91(15), 7012-7016. Reinbothe, S., Reinbothe, C., Parthier, B. (1993). Methyl jasmonate-regulated translation of nuclear-encoded chloroplast proteins in barley (Hordeum vulgare L. cv. Salome). Journal of Biological Chemistry 268(14), 1060610611. Remi Shih, N. R., McDonald, K. A., Jackman, A. P., Girbes, T., Iglesias, R. (1997). Bifunctional plant defense enzymes with chitinase and ribosome-inactivating activities from Trichosanthes kirilowii cell cultures. Plant Science 130(2), 145-150. Rhoads, R. E. (2009). eIF4E: New family members, new binding partners, new roles. Journal of Biological Chemistry 284(25), 16711-16715. Ricardi, M. M., Guaimas, F. F., González, R. M., Burrieza, H. P., López-Fernández, M. P., Jares-Erijman, E. A., Estévez, J. M., Iusem, N. D. (2012). Nuclear Import and Dimerization of Tomato ASR1, a Water Stress-Inducible Protein Exclusive to Plants. PLoS ONE 7(8): e41008. Rippmann, J. F., Michalowski, C. B., Nelson, D. E., Bohnert, H. J.(1997). Induction of a ribosome-inactivating protein upon environmental stress. Plant Molecular Biology 35(6), 701-709. Roberts, L. M., Lord, J. M. (2004). Ribosome-inactivating proteins: entry into mammalian cells and intracellular routing. Mini Reviews in Medicinal Chemistry 4(5), 505-512. Roncuzzi, L., Gasperi-Campani, A. (1996). DNA-nuclease activity of the single-chain ribosome-inactivating proteins dianthin 30, saporin 6 and gelonin. FEBS Letters 392(1), 16-20. Roos, W. P., Kaina, B. (2006). DNA damage-induced cell death by apoptosis. Trends in Molecular Medicine 12(9), 440-450. Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. (2009). Rare codon content affects the solubility of recombinant proteins in a codon bias-adjusted Escherichia coli strain. Microbial Cell Factories 8(1), 41. Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. (2014). Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Frontiers in Microbiology 5, 172. Rudolph, R., Böhm, G., Lilie, H., Jaenicke, R. (1997). Folding proteins. Protein function: A practical approach, IRL Press, VK, p. 57-99. 75 Rustgi, S., Pollmann, S., Buhr, F., Springer, A., Reinbothe, C., von Wettstein, D., Reinbothe, S. (2014). JIP60mediated, jasmonate- and senescence-induced molecular switch in translation toward stress and defense protein synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences 111(39), 14181-14186. Saikawa, N., Ito, K., Akiyama, Y. (2002). Identification of glutamic acid 479 as the gluzincin coordinator of zinc in FtsH (HflB). Biochemistry 41(6), 1861-1868. Sandvig, K., Grimmer, S., Lauvrak, U., Torgersen, M. L., Skretting, G., van Deurs, B., Iversen, T. G. (2002). Pathways followed by ricin and Shiga toxin into cells. Histochemistry and Cell Biology 117(2), 131-141. Sandvig, K., van Deurs, B. (1996). Endocytosis, intracellular transport, and cytotoxic action of Shiga toxin and ricin. Physiological Reviews 76(4), 949-966. Sandvig, K., van Deurs B. (2000). Entry of ricin and Shiga toxin into cells: molecular mechanisms and medical perspectives. The EMBO Journal 19(22), 5943-5950. Sandvig, K., van Deurs, B. (2002). Transport of protein toxins into cells: pathways used by ricin, cholera toxin and Shiga toxin. FEBS Letters 529(1), 49-53. Schiermeyer, A., Schinkel, H., Apel, S., Fischer, R., Schillberg, S. (2005). Production of Desmodus rotundus salivary plasminogen activator α1 (DSPAalpha1) in tobacco is hampered by proteolysis. Biotechnology and Bioengineering 89(7), 848-858. Seibel, N. M., Eljouni, J., Nalaskowski, M. M., Hampe W. (2007). Nuclear localization of enhanced green fluorescent protein homomultimers. Analytical Biochemistry 368(1), 95-99. Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D’Ari, R. (2007). Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. Journal of Bacteriology 189(23), 8746-8749. Sestili, P., Alfieri, R., Carnicelli, D., Martinelli, C., Barbieri, L., Stirpe, F., Bonelli, M., Petronini, P. G. Brigotti, M. (2005). Shiga toxin 1 and ricin inhibit the repair of H2O2-induced DNA single strand breaks in cultured mammalian cells. DNA Repair 4(2), 271-277. Shahidi-Noghabi, S., Van Damme, E. J., Smagghe, G., (2009). Expression of Sambucus nigra agglutinin (SNA-I’) from elderberry bark in transgenic tobacco plants results in enhanced resistance to different insect species. Transgenic Research 18(2), 249-259. Shang, C., Peumans, W. J., Van Damme, E. J. M. (2014). Occurrence and taxonomical distribution of ribosomeinactivating proteins belonging to the ricin/shiga toxin superfamily. Ribosome-inactivating Proteins: Ricin and Related Proteins. John Wiley & Sons, VS, pp.11-27. Sharma, N., Park, S. W., Vepachedu, R., Barbieri, L., Clani, M., Stirpe, F., Savary, B. J., Vivanco, J. M. (2004). Isolation and characterization of an RIP (ribosome-inactivating protein)-like protein from tobacco with dual enzymatic activity. Plant Physiology 134(1), 171-181. Sharp, J. M., Doran, P. M. (2001). Strategies for enhancing monoclonal antibody accumulation in plant cell and organ cultures. Biotechnology Progress 17(6), 979-992. Shojima, S., Nishizawa, N. K., Fushiya, S., Nozoe, S., Kumashiro, T., Nagata, T., Ohata, T., Mori, S. (1989). Biosynthesis of nicotianamine in the suspension-cultured cells of tobacco (Nicotiana megalosiphon). Biology of Metals, 2(3), 142-145. Silver, P. A. (1991). How proteins enter the nucleus. Cell 64(3), 489-497. Singh, S. M., Panda, A. K. (2005). Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins. Journal of Bioscience and Bioengineering 99(4), 303-310. Słomińska-Wojewódzka, M., Sandvig, K. (2013). Ricin and Ricin-Containing Immunotoxins: Insights into Intracellular Transport and Mechanism of action in Vitro. Antibodies, 2(2), 236-269. Smallshaw, J. E., Ghetie, V., Rizo, J., Fulmer, J. R., Trahan, L. L., Ghetie, M. A., Vitetta, E. S. (2003). Genetic engineering of an immunotoxin to eliminate pulmonary vascular leak in mice. Nature Biotechnology 21(4), 387391. Smith, M. L., Mason, H. S., Shuler, M. L. (2002). Hepatitis B surface antigen (HBsAg) expression in plant cell culture: Kinetics of antigen accumulation in batch culture and its intracellular form. Biotechnology and Bioengineering, 80(7), 812-822. Soderquist, R. G., Lee, J. M. (2005). Enhanced production of recombinant proteins from plant cells by the application of osmotic stress and protein stabilization. Plant Cell Reports 24(2), 127-132. 76 Song, S. K., Choi, Y., Moon, Y. H., Kim, S.G., Choi, Y. D., Lee, J. S. (2000). Systemic induction of a Phytolacca insularis antiviral protein gene by mechanical wounding, jasmonic acid, and abscisic acid. Plant Molecular Biology 43(4), 439-450. Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. (2005). Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli. Journal of Biotechnology 115(2), 113-128. Spooner, R. A., Hart, P. J., Cook, J. P., Pietroni, P., Rogon, C., Höhfeld, J., Roberts, L. M., Lord, J. M. (2008). Cytosolic chaperones influence the fate of a toxin dislocated from the endoplasmic reticulum. Proceedings of the National Academy of Sciences 105(45), 17408-17413. Spooner, R. A., Watson, P. D., Marsden, C. J., Smith, D. C., Moore, K. A., Cook, J. P., Lord, J. M., Roberts, L. M. (2004). Protein disulphide-isomerase reduces ricin to it’s A and B chains in the endoplasmic reticulum. Biochemical Journal 383, 285-293. Stirpe, F. (2004) Ribosome-inactivating proteins. Toxicon 44,371-383. Stirpe, F. (2005). Ribosome-inactivating proteins. Molecular Neurosurgery With Targeted Toxins. Humana Press Inc., VS, pp. 9-29 Stirpe, F. (2013). Ribosome inactivating proteins : from toxins to useful proteins. Toxicon 67, 12-16. Stirpe, F., Barbieri, L., Battelli, M. G., Soria, M., Lappi, D. A. (1992). Ribosome-inactivating proteins from plants: present status and future prospects. Nature Biotechnology 10(4), 405- 412. Stirpe, F., Barbieri, L., Gorini, P., Valbonesi, P., Bolognesi, A., Polito, L. (1996). Activities associated with the presence of ribosome-inactivating proteins increase in senescent and stressed leaves. FEBS Letters 382(3), 309312. Stirpe, F., Battelli, M. G. (2006). Ribosome-Inactivating Proteins: progress and problems. Cellular and Molecular Life Sciences 63(16), 1850-1866. Tabashnik, B. E., Brévault, T., Carrière, Y. (2013). Insect resistance to Bt crops: lessons from the first billion acres. Nature Biotechnology 31(6), 510-521. Thanaraj, T. A., Argos, P. (1996a). Protein secondary structural types are differentially coded on messenger RNA. Protein Science 5(10), 1973-1983. Thanaraj, T. A., Argos, P. (1996b). Ribosome-mediated translational pause and protein domain organization. Protein Science 5(8), 1594-1612. Taylor, B. E., Irvin, J. D. (1990). Depurination of plant ribosomes by pokeweed antiviral protein. FEBS Letters 273(1), 144- 146. Terpe, K. (2002). Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology 60(5), 523-533. Terpe, K. (2006). Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology 72(2), 211-222. The Board of Regents of the University of Wisconsin System (2015). http://www.uwstructuralgenomics.org/cloning.htm (geraadpleegd op 19/02/2015). cDNA Thermo Fisher Scientific Inc. (2015a). CloneJET PCR Cloning https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/K1231 (geraadpleegd op 19/03/2015) . Cloning. Kit Thermo Fisher Scientific Inc. (2015b). Ethidium Bromide (EtBr) Dye for DNA and RNA Detection. http://www.lifetechnologies.com/be/en/home/life-science/dna-rna-purification-analysis/nucleic-acid-gelelectrophoresis/dna-stains/etbr.html (geraadpleegd op 19/02/2015). Thermo Fisher Scientific Inc. (2015c). MassRuler DNA Ladder Mix, ready-to-use. http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/SM0403?ICID=search-product (geraadpleegd op 19/02/2015). Thermo Fisher Scientific Inc. (2015d). MassRuler Low Range DNA Ladder, ready-to-use. https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/SM0383?ICID=search-product (geraadpleegd op 19/02/2015). Thermo Fisher Scientific Inc. (2015e). Vector NTI. https://www.lifetechnologies.com/be/en/home/lifescience/cloning/vector-nti-software.html (geraadpleegd op 19/05/2015). 77 Tsai, B., Ye, Y. and Rapoport, T. A. (2002). Retro-translocation of proteins from the endoplasmic reticulum into the cytosol. Nature reviews Molecular Cell Biology 3(4), 246-255. Tsoi, B. M-Y., Doran, P. M. (2002). Effect of medium properties and additives on antibody stability and accumulation in suspended plant cell cultures. Biotechnology and Applied Biochemistry 35(3), 171-180. Twyman, R. M. Stoger, E., Schillberg, S., Christou, P., Fischer, R. (2003). Molecular farming in plants: host systems and expression technology. TRENDS in Biotechnology 21(12), 570-578. UCLA (2012). Rare Codon Calculator (RaCC). http://nihserver.mbi.ucla.edu/RACC/ (geraadpleegd op 6/04/2015). Vallejo, L. F. Rinas, U. (2004). Strategy for recovery of active protein through refolding of bacterial inclusion body proteins. Microbial Cell Factories 3(1), 2-12. Van Damme, E. J. M., Hao, Q., Barre, A., Vandenbussche, F., Desmyter, S., Rouge, P., Peumans, W. J. (2001). Ribosome-inactivating proteins: a family of plant proteins that do more than inactivate ribosomes. Critical Reviews in Plant Sciences 20(5), 395-465. Vandenbussche, F., Peumans, W. J., Desmyter, S., Proost, P., Ciani, M., Van Damme, E. J. (2004). The type 1 and type 2 ribosome-inactivating proteins from Iris confer transgenic tobacco plants local but not systemic protection against viruses. Planta 220(2), 211-221. Vater, C. A., Bartle, L. M., Leszyk, J. D., Lambert, J. M., Goldmacher, V. S. (1995). Ricin A chain can be chemically cross-linked to the mammalian ribosomal proteins L9 and L10e. Journal of Biological Chemistry 270(21), 1293312940 Vepachedu, R., Park, S. W., Sharma, N., Vivanco, J. M. (2005). Bacterial expression and enzymatic activity analysis of ME1, a ribosome-inactivating protein from Mirabilis expansa. Protein Expression and Purification 40(1), 142-151. Vivanco, J. M., Savary, B. J., Flores, H. E. (1999). Characterization of two novel type I ribosome-inactivating proteins from the storage roots of the Andean crop Mirabilis expansa. Plant Physiology 119(4), 1447-1456. Voinnet, O., Rivas, S., Mestre, P., Baulcombe, D. (2003). An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. The Plant Journal 33(5), 949-956. Wahl, M .F., An G., Lee, J. M. (1995). Effects of dimethyl sulfoxide on heavy chain monoclonal antibody production from plant cell culture. Biotechnology Letters 17(5), 463-468. Walsh, M. J., Dodd, J. E., Hautbergue, G. M. (2013). Ribosome-inactivating proteins: Potent poisons and molecular tools. Virulence 4(8), 774-784. Wandelt, C. I., Khan, M. R. I., Craig, S., Schroeder, H. E., Spencer, D., Higgins, T. J. (1992). Vicilin with carboxyterminal KDEL is retained in the endoplasmic reticulum and accumulates to high levels in the leaves of transgenic plants. The Plant Journal 2(2), 181-192. Wang, P., Tumer, N. E. (2000). Virus resistance mediated by ribosome inactivating proteins. Advances in Virus Research 55, 325-355. Wang, S., Zhang, Y., Liu, H., He, Y., Yan, J., Wu, Z., Ding, Y. (2012). Molecular cloning and functional analysis of a recombinant ribosome-inactivating protein (alpha-momorcharin) from Momordica charantia. Applied Microbiology and Biotechnology 96(4), 939-950. Wasternack, C. (2007). Jasmonates: An update on biosynthesis, signal transduction and action in plant stress response, growth and development. Annals of Botany 100(4), 681-697. Weis, K. (2003). Regulating access to the genome: nucleocytoplasmic transport throughout the cell cycle. Cell 112(4), 441-451. Welch, M., Govindarajan, S., Ness, J. E., Villalobos, A., Gurney, A., Minshull, J., Gustafsson, C. (2009). Design parameters to control synthetic gene expression in Escherichia coli. PLoS ONE 4(9), e7002. Wong, R. N. S., Mak, N. K. Choi, W. T., Law, P. T. W. (1995). Increased accumulation of trichosanthin in Trichosanthes kirilowii induced by microorganisms. Journal of Experimental Botany 46(3), 355-358. Wongsamuth, R., Doran, P. M. (1997). Production of monoclonal antibodies by tobacco hairy roots. Biotechnology and Bioengineering 54(5), 401-415. 78 WTSI (2014a). MEROPS Blast Server. http://merops.sanger.ac.uk/cgi-bin/blast/submitblast/merops/advanced (geraadpleegd op 2/11/2014). WTSI (2014b). Family C19. http://merops.sanger.ac.uk/cgi-bin/famsum?family=c19 (geraadpleegd op 2/11/2014). WTSI (2014c). Family M41. http://merops.sanger.ac.uk/cgi-bin/famsum?family=m41 (geraadpleegd op 2/11/2014). Xinying S., Prashant K. K., Karissa, Y. S., Simpson J. (2012). Functional Role of the Sarcin-Ricin Loop of the 23S rRNA in the Elongation Cycle of Protein Synthesis. Journal of Molecular Biology 419(3), 125-138. Yamasaki, C., Nishikawa, K., Zeng, X. T., Katayama, Y., Natori, Y., Komatsu, N., Oda, T., Natori, Y. (2004). Induction of cytokines by toxins that have an identical RNA N-glycosidase activity: Shiga toxin, ricin, and modeccin. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects 1671(1), 44-50. Yan, X., Hollis, T., Svinth, M., Day, P., Monzingo, A. F., Milne, G. W., Robertus, J. D. (1997). Structure-based identification of a ricin inhibitor. Journal of Molecular Biology 266(5), 1043-1049. Yoshinari S., Koresawa S., Yokota S., Sawamoto H., Tamura M., Endo Y. (1997). Gypsophilin, a new type 1 ribosome-inactivating protein from Gypsophila elegans: purification, enzymatic characterization, and subcellular localization. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 61(2), 324-331. Yoshinari, S., Yokota, S., Sawamoto, H., Koresawa, S., Tamura, M., Endo Y. (1996). Purification, characterization and subcellular localization of a type-1 ribosome-inactivating protein from the sarcocarp of Cucurbita pepo. European Journal of Biochemistry 242(3), 585-591. Zang, Z., Xu, H., Yu, L., Yang, D., Xie, S., Shi, Y., Li, Z., Li, J.,Wang, J., Li, M., Guo, Y., Gu, F. (2000). Intravesical immunotoxin as adjuvant therapy to prevent the recurrence of bladder cancer. Chinese Medical Journal 113(11), 1002-1006. Zarling, J. M., Moran, P. A., Haffar, O., Sias, J., Richman, D. D., Spina, C. A., Myers, D. E., Kuebelbeck, V., Ledbetter, J. A., Uckun, F. M. (1990). Inhibition of HIV replication by pokeweed antiviral protein targeted to CD4+ cells by monoclonal antibodies. Nature 347, 92-95 Zhang, C. Y., Gong, Y. X., Ma, H., An, C. C., Chen, D. Y. (2000). Trichosanthin induced calcium-dependent generation of reactive oxygen species in human choriocarcinoma cells. Analyst 125(9), 1539-1542. Zhu, S., Gong, C., Ren, L., Li X., Song, D., Zheng, G. (2012). A simple and effective strategy for solving the problem of inclusion bodies in recombinant protein technology: His-tag deletions enhance soluble expression. Applied Microbiology and Biotechnology 97(2), 837-845. Zou, L. B., Zhan J. B. (2005). Purification and anti-cancer activity of ricin. Zhejiang da xue xue bao. Yi xue ban. Journal of Zhejiang University. Medical Sciences 34(3), 217-219. Zoubenko, O., Uckun, F., Hur, Y., Chet, I., Tumer, N. (1997). Plant resistance to fungal infection induced by nontoxic pokeweed antiviral protein mutants. Nature Biotechnology 15(10), 992- 996. 79 9 Bijlagen 9.1 Gebruikte primers Tabel 6: Gebruikte primers bij de verschillende PCR-reacties. Primer Sequentie Opmerkingen EVD002 GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAG GCT Complementair aan het eerste gedeelte van de attB1-site en brengt het tweede gedeelte van de attB1-site aan EVD004 GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTG GGT Complementair aan het eerste gedeelte van de attB2-site en brengt het tweede gedeelte van de attB2-site aan EVD275 GCCTGAACACCATATCCATCC Forward primer complementair aan de pJETvector EVD276 GCAGCTGAGAATATTGTAGGAGATC Reverse primer complementair aan de pJETvector EVD386 GTAAAACGACGGCCAG M13 forward primer EVD387 CAGGAAACAGCTATGAC M13 reverse primer EVD472 GAAACCTCCTCGGATTCCAT Forward primer complementair sequentie van de 35S promotor EVD607 5’AAAAAGCAGGCTTCACCATGACGAG AGTGTTAGCAATATACT’ Forward primer complementair aan het signaalpeptide en een gedeelte voor het aanbrengen van het eerste deel van de attB1site. EVD667 GGACTTGAAGAAGTCGTGCTG Reverse primer die complementair is aan de sequentie voor het eGFP EVD668 ACTTCAAGATCCGCCACAAC Forward primer die complementair is aan de sequentie voor het eGFP EVD805 AGAGTGTTAGCAATATACATTACTCTC GCATTTAGCCTCTTTCTCTGTGG Forward primer die complementair is aan het laatste deel van het signaalpeptide P1 AGGTCACTGGATTTTGGTTT Reverse primer complementair sequentie van de 35S terminator P29 CTGTCCATAGATGGCCCAAT Forward primer complementair aan het M41 gedeelte van het RIP-M41 P30 CCCAAGAAGGATCATCCAAA Forward primer die complementair is aan het RIP-gedeelte van het RIP-M41 P39 GGGGAAGCAGTAATGGAGCA Forward primer die complementair is aan het begin van het open leesraam voor het RIP-M41 P60 ATGATGATGATGTCCTCCTCCACAGTA TAATACCAATTTTTGGGCA Reverse primer voor het adheren van de linker en His-tag aan het RIP-M41 80 aan aan de de P118 AAAAAGCAGGCTTCACCATGGAGCAA GGGAGAGGG Forward primer RIP-M41 (C- en N-terminale fusie) complementair aan het eerste deel van het RIP-M41 en brengt het eerste gedeelte van de attB1-site aan P119 AGAAAGCTGGGTGACAGTATAATACC AATTTTTGGGCA Reverse primer RIP-M41 (C-terminale fusie) complementair aan het laatste deel van het RIP-M41 en brengt het eerste gedeelte van de attB2-site aan P120 AGAAAGCTGGGTGTCAACAGTATAAT ACCAATTTTTGGGCA Reverse primer RIP-M41 (N-terminale fusie) complementair aan het laatste deel van het RIP-M41 en brengt het eerste gedeelte van de attB2-site aan P121 AAAAAGCAGGCTTCACCATGGGGAAG AAGGAGGCC Forward primer RIP-C19 (C- en N-terminale fusie) complementair aan het eerste deel van het RIP-C19 en brengt het eerste gedeelte van de attB1-site aan P122 AGAAAGCTGGGTGTTTTTCATTTTTATT TGCCTTCC Reverse primer RIP-C19 (C-terminale fusie) complementair aan het laatste deel van het RIP-C19 en brengt het eerste gedeelte van de attB2-site aan P123 AGAAAGCTGGGTGTCATTTTTCATTTTT ATTTGCCTTCC Reverse primer RIP-C19 (N-terminale fusie) complementair aan het laatste deel van het RIP-C19 en brengt het eerste gedeelte van de attB2-site aan P134 TTATAGCTCATCTTTACCGCCTCCATGA TGATGATGATGATGTCC Reverse primer complementair aan de His-tag en zal het KDEL-signaal aanbrengen. P135 AGAAAGCTGGGTGTTATAGCTCATCTT TACCGCCTCC Reverse primer complementair aan het KDELsignaal en brengt het eerste deel attB2-site aan P178 ATGCACCATCACCATCACCATGGTGGT GGTGAGCAAGGGAGAGGGAAG Forward primer complementair aan het eerste gedeelte van het RIP-M41, voor het aanbrengen van de N-terminale His-tag en linker aan het RIP-M41 P179 CTAACAGTATAATACCAATTTTTGGGC A Reverse primer die complementair is aan het achterste gedeelte van het RIP-M41 P182 CGAATTCGGAGGAAACAAAGATGCAC CATCACCATCACCATG Forward primer complementair aan het eerste deel van het RIP-M41 met de N-terminale Histag en brengt de N-terminale sequentie voor de Gibson assembly aan voor de pCXP34h-vector P183 CCCATATGGTCGACCTGCAGTCAACAG TATAATACCAATTTTTGGGCA Reverse primer complementair aan het laatste deel van het RIP-M41 met de N-terminale Histag en brengt de C-terminale sequentie voor de Gibson assembly aan voor de pCXP34h-vector P184 CGAATTCGGAGGAAACAAAGATGGAG CAAGGGAGAGGG Forward primer complementair aan het eerste deel van het RIP-M41 met de C-terminale Histag en brengt de N-terminale sequentie voor de 81 Gibson assembly aan voor de pCXP34h-vector P185 CCCATATGGTCGACCTGCAGTCAATGA TGATGATGATGATGTCC Reverse primer complementair aan het laatste deel van het RIP-M41 met de C-terminale Histag en brengt de C-terminale sequentie voor de Gibson assembly aan voor de pCXP34h-vector P186 GAGCAAGGGAGAGGGAAG Forward primer voor het RIP-M41 open leesraam zonder start codon P187 ACAGTATAATACCAATTTTTGGGCA Reverse primer voor het RIP-M41 open leesraam zonder stop codon P213 TTAAGAAGGAGATATACGGGATGCAC CATCACCATCACCATG Forward primer complementair aan het eerste deel van het RIP-M41 met de N-terminale Histag en brengt de N-terminale sequentie voor de Gibson assembly aan voor de pET-vector P214 GCTTTGTTAGCAGCCGGATCCTAACAG TATAATACCAATTTTTGGGCA Reverse primer complementair aan het laatste deel van het RIP-M41 met de N-terminale Histag en brengt de C-terminale sequentie voor de Gibson assembly aan voor de pET-vector P215 TTAAGAAGGAGATATACGGGATGGAG CAAGGGAGAGGG Forward primer complementair aan het eerste deel van het RIP-M41 met de C-terminale Histag en brengt de N-terminale sequentie voor de Gibson assembly aan voor de pET-vector P216 GCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCAATGA TGATGATGATGATGTCC Reverse primer complementair aan het laatste deel van het RIP-M41 met de C-terminale Histag en brengt de C-terminale sequentie voor de Gibson assembly aan voor de pET-vector 82 9.2 DNA sequenties RIP-M41 en RIP-C19 Figuur 43: cDNA-sequentie van het open leesraam voor het RIP-M41. Het startcodon is aangeduid in het geel, het stopcodon in het groen. Figuur 44: cDNA-sequentie van het open leesraam voor het RIP-C19. Het startcodon is aangeduid in het geel, het stopcodon in het groen. 83 Figuur 45: Codons voor zeldzame tRNA’s in E. coli in het open leesraam voor het RIP-M41. In rood zijn de zeldzame codons voor arginine te zien, in het groen het zeldzame codon voor leucine, in het blauw het zeldzame codon voor isoleucine en het zeldzame proline codon in oranje (UCLA 2012). 9.3 Vectoren 9.3.1 Lokalisatie en colokalisatie 9.3.1.1 Entry clones Figuur 46: ‘Entry clone’ van het RIP-M41 voor de N-terminale eGFP fusie (vector: pDonr221) (Thermo Fisher Scientific Inc. 2015e). 84 Figuur 47: ‘Entry clone’ van het RIP-M41 voor de C-terminale eGFP fusie (vector: pDonr221) (Thermo Fisher Scientific Inc. 2015e). Figuur 48: ‘Entry clone’ van het RIP-C19 voor de N-terminale eGFP fusie (vector: pDonr221) (Thermo Fisher Scientific Inc. 2015e). 85 Figuur 49: ‘Entry clone’ van het RIP-C19 voor de C-terminale eGFP fusie (vector: pDonr221) (Thermo Fisher Scientific Inc. 2015e). 9.3.1.2 Expression clones Figuur 50: ‘Expression clone’ van het RIP-M41 met een N-terminale eGFP fusie (vector: pK7WGF2) (Thermo Fisher Scientific Inc. 2015e). 86 Figuur 51: ‘Expression clone’ van het RIP-M41 met een C-terminale eGFP fusie (vector: pK7FWG2) (Thermo Fisher Scientific Inc. 2015e). Figuur 52: ‘Expression clone’ van het RIP-C19 met een N-terminale eGFP fusie (vector: pK7WGF2) (Thermo Fisher Scientific Inc. 2015e). 87 Figuur 53: ‘Expression clone’ van het RIP-C19 met een C-terminale eGFP fusie (vector: pK7FWG2) (Thermo Fisher Scientific Inc. 2015e). 9.3.2 Heterologe expressie in BY-2 cellen 9.3.2.1 Entry clones Figuur 54: ‘Entry clone’ van het RIP-M41-KDEL (vector: pDonr221) (Thermo Fisher Scientific Inc. 2015e). 88 Figuur 55: ‘Entry clon’e van het RIP(M41)-KDEL (vector: pDonr221) (Thermo Fisher Scientific Inc. 2015e). 9.3.2.2 Expression clones Figuur 56: ‘Expression clone’ van het RIP-M41-KDEL (vector: pK7WG2D) (Thermo Fisher Scientific Inc. 2015e). 89 Figuur 57: ‘Expression clone’ van het RIP-M41-KDEL (vector: pK7WG2D) (Thermo Fisher Scientific Inc. 2015e). 9.3.3 Heterologe expressie in E. coli 9.3.3.1 pCXP34h-vector Figuur 58: De pCXP34h-vector. PXX staat voor P34 (Aerts D. et al. 2011). 90 9.3.3.2 pET-21a-vector Figuur 59: De pET-21a-vector (Addgene 2015). 91 9.4 Foto’s lokalisatie en colokalisatie 9.4.1 Lokalisatie in blad van N. benthamiana Figuur 60: Lokalisatie van eGFP, ingespoten OD = 0,1. 92 Figuur 61: Lokalisatie van het RIP-M41 C-terminale construct, ingespoten OD = 0,01. 93 Figuur 62: Lokalisatie van het RIP-M41 N-terminale construct, ingespoten OD = 0,01. Figuur 63: Lokalisatie van het RIP-C19 N-terminale construct, ingespoten OD = 0,1. 94 Figuur 64: Lokalisatie van het RIP-C19 N-terminale construct, ingespoten OD = 0.1. Figuur 65: Lokalisatie van het RIP-C19 N-terminale construct, ingespoten OD = 0,05. 95 Figuur 66: Lokalisatie van het RIP-C19 C-terminale construct, ingespoten OD = 0,1. Figuur 67: Lokalisatie van het RIP-C19 C-terminale construct, ingespoten OD = 0,2. 96 9.4.2 Colokalisatie in blad van N. benthamiana Figuur 68: Colokalisatie van eGFP, ingespoten OD = 0,1. 97 Figuur 69: Colokalisatie van het RIP-M41 N-terminale construct, ingespoten OD = 0,1. 98 Figuur 70: Colokalisatie van het RIP-M41 C-terminale construct, ingespoten OD = 0,1. Figuur 71: Colokalisatie van het RIP-M41 C-terminale construct, ingespoten OD = 0,05. 99 Figuur 72: Colokalisatie van het RIP-C19 N-terminale construct, ingespoten OD = 0,1. 100 Figuur 73: Colokalisatie van het RIP-C19 N-terminale construct, ingespoten OD = 0,2. Figuur 74: Colokalisatie van het RIP-C19 C-terminale construct, ingespoten OD = 0,2. 101
