in vitro-cultuur van aquariumplanten

In Vitro-cultuur van Aquariumplanten.
Tannia Sels
Inleiding.
In vitro betekent in glas. In-vitro cultuur kan daarom perfect worden vertaald als “een cultuur
in glas”.
Strikt genomen zou een aquarium een in vitro-cultuur kunnen zijn. Toch is “cultuur” hier niet
van toepassing, omdat een aquarium meestal wordt gehouden om er naar te kijken en niet om
er planten in te vermeerderen. Hoewel het ene het andere niet hoeft uit te sluiten.
Het kweken van fruitvliegen in een glazen recipiënt is wel in vitro-cultuur.
Verklaring.
De term in vitro-cultuur is afkomstig uit de bacteriologie.
Bacteriën worden voor medische doeleinden gekweekt in glazen recipiënten, die kunnen
worden gesteriliseerd en waarin steriele bodems worden gemaakt. De bacteriën worden op
deze bodems geënt en gaan zich vermeerderen. Het doel hiervan is de bacteriën te
identificeren of een antibiogram te nemen.
Deze techniek werd ontleend door de aquaristiek voor het kweken van planten in glas en
hangt nauw samen met de studie van het DNA.
Over DNA en chromosomen.
In 1951 hebben Crick & Watson voor de eerste keer duidelijk gemaakt dat de genetische
informatie van alle levende wezens in elke cel aanwezig is in de vorm van in een dubbele
spiraal. Zo een spiraal zit in iedere cel en kan ontrold 14 cm lang zijn. Vooral met fruitvliegjes
werd er geëxperimenteerd om de genetische code te ontcijferen. Fruitvliegjes zijn daarvoor
dankbare dieren, omdat ze in korte tijd flink vermeerderen en omdat -net zoals bij de menshet geslacht gebonden is aan een X- of een Y-chromosoom.
Een chromosoom ziet eruit als een boemerang: de X als een staafje, de Y als een staafje met
een haakje aan.
Als de dieren gameten produceren (eitjes bij het wijfje en zaadcellen bij het mannetje), dan
komen daar de helft van de chromosomen samen in een gameet. Een mannetje heeft een
gameet met een X of een Y-chromosoom. Dat bepaalt dan ook of er een mannetje (XY) of een
wijfje (XX) ontstaat. Want bij versmelting van twee gameten (een zaadje met een eitje)
komen de cellen samen en vormen een XX- of XY- chromosoom. Dat is niet universeel, want
er zijn dieren waar het geslacht niet gebonden is aan een dergelijk chromosoom.
Uit elke cel een nieuwe plant.
Omdat in elke cel uit een lichaam de erfelijke informatie dezelfde is, zouden we in principe uit
elke cel een nieuw wezen kunnen scheppen. Dat idee hadden de Oostenrijkse geleerden
Schwann & Schleiden reeds in 1838. Ze bedachten de totipotentie theorie, de theorie dat alles
uit één cel te reconstrueren is. In die tijd kon het idee nog niet in praktijk worden gebracht.
Het gebeurde pas in 1958 in de Cornal University door Stuart en zijn team. Zij schudden
plantencelletjes van wortelschijfjes met behulp van speciale apparaten door elkaar en brachten
de losgedraaide celletjes afzonderlijk in een bepaalde voedingsvloeistof. Uit elk celletje
groeide een nieuw plantje. Deze techniek van los strooien en enten wordt in de tuinbouw
toegepast. In Amerika rezen de laboratoria als paddestoelen uit de grond. Maar ook Nederland
deed mee. In Wageningen werd aan de Universiteit veel geëxperimenteerd. Momenteel is dat
in Europa zowat het grootste depot voor deze techniek, die ook kloning wordt genoemd.
Het klonen en de literatuur.
Klonen komt uit het Grieks Klon, wat gewoon een scheutje betekent. Als wij een scheutje van
een geranium nemen en het met wat wortelpoeder in de grond steken, dan doen we in wezen
net hetzelfde. De scheut is een gekloonde geranium, want het is volkomen identiek aan de
moederplant. Er is geen gametenversmelting gebeurd.
Na de eerste pogingen van Stuart, brak de hel los. Nog geen jaar later verscheen het boek van
Gordon Rattray Tailer “De biologische tijdbom”. In dat boek waarschuwde deze journalist
(die over alles zowat de doemdenker uithangt) de mensheid voor mogelijk misbruik. We
kunnen immers -zei hij- ook mensen gaan klonen met niet wenselijke eigenschappen, zoals
Hitler bijvoorbeeld.
Levin heeft dat in een Science fiction verhaal uitgewerkt met als titel “The boys of Brazil”.
Het boek werd verfilmd en gaat over cellen van Hitler die bewaard zijn gebleven en in
Brazilië -door een Nazi-dokter- worden gekloond. Zo laat de auteur een heleboel Hitlers het
levenslicht zien. Uiteindelijk komt het goed, maar niet zonder slag of stoot. Een prachtige
roman overigens!
De journalist David M. Rorvik beschrijft het eerste experiment van het klonen van een mens
op last van een eenzame miljardair die een nakomeling wenst die identiek is aan zichzelf. Dit
prachtige boek, getiteld “In his Image” vertoont geen hiaten.
Pamelo G. Sargent schreef “Cloned Lives”
Sedert het verschijnen van het boek “Jurassic Park” is het klonen gemeengoed geworden.
Geleerden bepaalden dat in een stukje amber mugjes zaten die ooit een dinosaurus zouden
hebben geprikt. Uit dat dinosaurusbloed -dat uit de muggenmaag werd genomen- zou dan een
nieuw exemplaar worden gekloond. De film Jurassic Park bracht de nodige ideeën en de
meeste mensen weten nu wat klonen is.
Taylor kreeg gelijk.
Het werd een biologische tijdbom, want nog geen 10 jaar later -in 1968- werd het eerste dier
(een kikker) gekloond. De Xenopus laevis werd gekozen omdat er twee stammen van zijn. Ze
zijn alleen uit elkaar te herkennen aan de genetische informatie. De ene stam heeft namelijk
een speciaal soort chromosoom en dat wilden de geleerden aantonen in de nakomelingen.
Het klonen van dieren is niet zo eenvoudig als het met planten gebeurt. De techniek is ook
anders. In dit geval nam men een A-kikker, de gewone stam en liet het dier eitjes leggen. De
eieren werden met UV-licht bestraald, zodat het genetisch materiaal erin vernietigd werd. De
B-kikker, stam twee met het speciale chromosoom, liet men zich voortplanten en er
ontstonden dikkopjes. Met behulp van een micropipet nam men uit het maagepitheel van deze
dikkopjes cellen weg. Die celkernen werden in een leeg eitje van de A-kikker geïnjecteerd.
Dat gebeurde natuurlijk met diverse exemplaren. Een aantal eitjes ontwikkelden zich en toen
de kikkers er waren, bleek dat ze alle kenmerken van het B-type vertoonden. Ze hadden dus
het speciale chromosoom.
Genetische manipulatie.
Genetische manipulatie hangt hiermee een beetje samen. Met deze methode kunnen we
soorten veredelen. Dat kan op een normale manier door selectie, wat tegenwoordig ook op een
tekentafel gebeurt door de genetische structuur in kaart te brengen. Eén chromosoom van een
virus bijvoorbeeld bestaat uit vier aminozuren die telkens terugkomen en samen tot 5.378
combinaties kunnen vormen. Eén genetische eenheid is 1,8 Ǻ groot (Ǻ= Ǻngström / 1,8 Ǻ =
1,8 miljoenste van een millimeter).
Ondertussen is het in de plantenteelt een business geworden. In Nederland houden 5 á 600
laboratoria zich ermee bezig. België heeft er een 30-tal, die een vrij goede naam hebben.
In vitro kweken van planten.
Deze voordracht werd gemaakt naar aanleiding van een tentoonstelling in Blijdorp. Daar
stond een hele kast met Cryptocorynes die in vitro werden gekweekt. Alles gebeurde steriel en
snel. Er komen geen zaden aan te pas en de nieuwe planten hebben identieke eigenschappen.
Dit is ook toepasbaar op snijbloemen en is dan gericht naar de bloemenwinkels. De techniek
gebeurt door het meristemen. Men neemt jonge planten met groeischeuten. De scheuten
worden open gepeld en het kleinste groeipuntje gaat in de schudkolf. Van elke cel kan men
dan een nieuwe plant maken. Klonen kan gebeuren met alle planten. De in-vitro cultuur met
uitzaaien van orchideeën past men reeds toe van in de vijftiger jaren. Orchideeën hebben heel
kleine zaadjes, zonder reservevoedsel. De suikers moeten uit de omgeving worden
gesynthetiseerd. In de natuur gebeurt dat in epifytische omstandigheden, in cultuur op een
voedingsbodem. Zo een voedingsbodem bevat zeer veel suikers. Het zaad wordt erop gezaaid
en als de plantjes uit zijn, worden ze in kolven overgeënt. Daarna worden ze diverse malen
verspeend. De meeste marktorchideeën worden op deze wijze geteeld.
Is dat alles zo natuurlijk?
De natuur doet ook af en toe zulke dingen. Bijvoorbeeld bij dieren die zich parthenogenetisch
voortplanten, zoals wandelende takken. In dat geval zijn de nakomelingen steeds wijfjes. Het
is een methode om de soort te laten voortbestaan zonder dat er mannen aan te pas komen.
Wij gebruiken dergelijke methode als we planten stekken. Alle stengelplanten laten zich zo
manipuleren en het gaat veel sneller ook. (Bv. Elodea, Ceratophyllum, Bacopa)
Vermeerderen van de groene tijgerlotus.
Planten met een rozetvorm laten zich minder goed stekken, maar komen wel gewillig in bloei.
(Bv. Aponogeton, Nymphea) Als de bladeren van de groene Tijgerlotus aan het
wateroppervlak komen, worden er ook bloemen gevormd die ‘s nachts bloeien. Ze kunnen
worden bestoven met een penseel. De bloemknop groeit uit en is op vier maanden aan het
wateroppervlak, waarna de kelkblaadjes verwelken en het vruchtbeginsel verdikt tot een
zaadbol. Plots barst de zaadbol open. De zaadjes die omgeven zijn door een slijmcapsule,
drijven van de moederplant weg. Na enige tijd lost de capsule op en de zaden gaan zinken.
We gieten alle water af en vinden dan de zaden onderaan bij elkaar. Plaats ze in een bokaal op
vensterbank tot de plantjes beginnen te groeien. Als de nieuwe plantjes een paar blaadjes en
worteltjes hebben, kunnen ze met een pincet in rijnzand worden geduwd. Tijdens et
groeiproces worden de grootste exemplaren voortdurend verspeend om ruimte te krijgen.
Klonen van Crypto’s
Cryptocorynes kunnen met uitlopers een mooi bestand geven, maar kunnen eveneens worden
gekloond.
Voorkomen:
Deze planten komen voor in een gebied dat loopt over een groot deel van Indië, Sri Lanka, een
deel van de Sumatraanse archipel, Borneo, een stuk van Papoea Nieuw Guinea en de
Filippijnen.
De verspreiding gaat over een heleboel zeeën, die voorheen min of meer met elkaar waren
verbonden en daarna gescheiden werden. Op de Filippijnen en Papoea en Nieuw Guinea zijn
de soorten beperkt. Ze moeten namelijk een zouttolerantie hebben. Zo treffen we daar
voornamelijk Cryptocoryne cilliata aan.
Natuurlijke bevruchting:
Je kunt Crypto’s in bloei krijgen nadat ze in moerascultuur zijn gezet (3-4 weken). De
moerascultuur wordt opgezet volgens het recept van Dr. Meuleman: eenderde potgrond,
eenderde turf en eenderde scherp zand, rijnzand met een spoortje klei erbij. Daarin komt elke
Crypto in bloei.
Cryptocorynes zijn erop gericht om bepaalde insecten te lokken en ze worden dan echte
vallen. Het lokken gebeurt door de geur, die een zeer delicate lijkgeur mag worden genoemd.
Binnen is het vruchtbeginsel met 4 á 5 lobben, waaruit een staafje met stuifmeelkuipjes komt.
Tussen het vruchtbeginsel liggen de eitjes die zaadjes gaan vormen en er zijn ook
reuklichaampjes die ervoor zorgen dat de deur wordt gerealiseerd. Op een bepaald moment,
als de stuifmeelkorrels rijp zijn, wordt de geur uitgestraald. De insecten worden dan
aangetrokken en bevruchten de vruchtbeginsels. Na uitwerking van de geurstof gaat een
klepje dicht en de insecten zitten gevangen. En na de bevruchting vertrekken ze weer met
stuifmeel aan hun pootjes om andere planten te bezoeken. Het natuurlijk systeem is zeer
ingewikkeld, maar efficiënt! Na de conceptie worden er zaadbollen gevormd.
Soorten Crypto’s:
Karel Ratai (een Tsjech) publiceerde “Revision of the Genus Cryptocoryne”, Fischer-Studie,
1975. Dat deed hij op een zeer eigenzinnige wijze. Een heleboel werd later ook weer
afgevoerd.
Niels Jacobson trok de zaken weer wat recht met zijn publicatie: “Cryptocorynen”.
Ondertussen stonden er in het plantenboek van prof. De Wit ook heel wat planten, maar alles
was gebaseerd op de indeling van de chromosomen.
In 1982 kende men 61 soorten. Nu kunnen we een 55-tal Crypto’s als geldig beschouwen.
Crypto’s en chromosomen:
2n is het volledige aantal chromosomen in 1 cel van een Crypto. Bij een bepaalde soort zijn
dat er 33, maar er zijn er ook met 66, 88 en met 132. Toch zijn ze alle te herleiden tot de
grondvorm met 33 chromosomen.
2n = 33 - 66 - 88 - 132
Deze zijn de fenotypes die een genetische variant zijn met dezelfde basischromosomen.
Crypto’s kun je vermeerderen door ze met de wortels in een potje met water te zetten. Na
verloop van tijd komen er nieuwe planten uit.
Vermeerderingswijzen van Crypto’s:
* Generatief vermeerderen (met bloemen en zaad dus);
* Vegetatief vermeerderen door - uitlopers,
- hydro-cultuur, of
- Klonen in vitro: de knopen worden geënt op een steriele
voedingsbodem.
Klonen in vitro.
De Cryptocorynes die in de handel worden gebracht, werden op deze wijze gekweekt.
Benodigdheden:
- Laboratoriumglaswerk
- Buizenrekje dat autoclaveerbaar is (te steriliseren);
- Brede pyrexbuizen met een diameter van 25 mm;
- Erlenmeyer voor het bereiden van het voedingsmedium;
- Bekerglazen;
- Pipetten;
- Inoxmes;
- Lang pincet om te enten;
- Bunsenbrander of brander van het fonduestel;
- Brandergaasje om de kolf op te zetten;
- PH-meter (best elektronische met temperatuurcompensatie)
Ook mogelijk met papier;
- Brievenweegschaal (zeer goede);
- Suiker, glucose en agar-agar;
- Groeistoffen zoals isobutulzuur, buttanine, Benzyladenine, zoutzuur en Natriumhydroxide
Groeistoffen zijn plantenhormonen die de plantengroei en deze van de wortels stimuleren.
Er wordt slechts weinig van gebruikt (zijn zeer duur).
- Gedestilleerd water;
- Bleekwater;
- Ontsmettingsalcohol;
- Wattenpropjes;
- Autoclaaf of snelkookpan (zeer hoog model);
- Aluminiumfolie;
- Groeistof voor voedingsbodem volgens het MS-type, dat bestaat uit 21 verschillende stoffen,
waaronder vitamines en spore-elementen.
De bodem zelf is zeer hygroscopisch en moet dadelijk worden ingelast in plastiek om
degeneratie te voorkomen.
Alle materialen moeten zuiver worden gemaakt en er dient zeer zuiver gewerkt te worden.
De voedingsbodem:
voor 250 ml:
- 100 ml water warm maken;
- 4-10% suiker erbij (zorgvuldig afwegen);
- 0,7% agar = 1,75 gram (afwegen) (= bindmiddel);
- groeistoffen toevoegen met een micropipet die verdeeld is in 1/10 ml.;
Alles moet zeer juist zijn of de groei wordt verstoord.
Mengen en water bijvoegen tot 250 ml. Laat het geheel koken tot je een homogeen mengsel
bekomt en meet de PH. Meestal moet er wat zoutzuur bij om de voedingsbodem wat aan te
zuren. Als het geheel te zuur is, voeg je wat natriumhydroxide toe. Dat is afhankelijk van het
gedemineraliseerd water dat werd gebruikt.
Gebruik je gedestilleerd water dan moet er meer zoutzuur, bij gedemineraliseerd water meer
natriumhydroxide bij.
Vul de buizen tot eenderde, stop ze af met watjes en doe er een capsule van aluminiumfolie
overheen.
Laat dan alles een half uurtje afkoelen.
Verder:
- Verpak het filtreerpapier in aluminiumfolie en autoclaveer dit samen met een bekerglas
water. - Selecteer zorgvuldig het nodige materiaal.
- Haal van de planten de delen af die nog volop in celdeling zijn. Gebruik geen bladeren,
omdat die al een afwijkende genetische informatie hebben gekregen. Een wortelstukje is
prima. Ook scheuten ertussenuit snijden evenals de worteltoppen.
- Werk in een stofvrije ruimte en zo steriel mogelijk.
- Let op eigen hygiëne, vooral op zuiverheid van handen en nagels.
- Was eerst het werkvlak af met alcohol. Zet desnoods een gedurende enkele uren een UVlamp op het werkblad.Ultraviolet licht is kiemdodend.
- Maak het plantenmateriaal zuiver met water en met een gesteriliseerd mesje (in alcohol
dopen en even door de vlam halen) de delen ertussenuit snijden. Daarbij moet je rekening
houden
met de groeirichting, want dat is tevens de groeirichting van de nieuwe plant.
- Steriliseer daarna al het materiaal.
- Plaats de plantenstukjes in dezelfde richting in een bekerglas dat gevuld is met een
javeloplossing 1 op 25. Breng ze daarna over in een bekerglas met gesteriliseerd water.
Vanaf dan wordt alles met een gevlamd pincet vastgenomen (in alcohol gedoopt en door een
vlam gehaald).
- De plantenstukjes worden nu mooi geëtaleerd op de gesteriliseerde stukken filtreerpapier,
daarna in de nodige stukken gesneden en met gesteriliseerd filtreerpapier toegedekt.
Alles gebeurt onder steriele lucht.
Het is eveneens mogelijk om de planten in wegwerp-petrischaaltjes te versnijden i.p.v.
filtreerpapier te gebruiken. Dit is wel een iets duurdere methode.
Het enten:
Enten gebeurt in één vloeiende beweging, in amper twee seconden. Met het gevlamde pincet
grijp je het wortelstukje beet, terwijl je met pink en ringvinger van dezelfde hand het
wattenpropje verwijdert. Dat kan je natuurlijk enkel doen als je eerst met de andere hand het
aluminiumcapsulletje hebt weggenomen. Onmiddellijk het plantje in de buis brengen tweederde in de voedingsbodembodem- pincet terugtrekken en het propje watten
terugplaatsen. Deze handeling moet je leren. Werk je te traag dan mislukt alles, omdat er
besmetting optreedt.
De buis wordt afgevlamd om een contaminatie te voorkomen en met een natte prop wordt het
vlammende watje gedoofd. Opnieuw aluminiumfolie of parafilm aanbrengen. Parafilm is
doorschijnend, sluit beter af en geeft en geeft minder vochtverlies. Daar staat tegenover dat
het duurder is.
De buizen worden nu bebroed. Dat kan in een aquarium met piepschuim op de bodem, een
verwarmingskabel erop met een paar stukjes kurk. Daarop komen de buisjes. Een bevochtigen
en een vochtigheidsmeter, evenals een thermometer zijn onmisbaar. De verwarmingskabel
Gevaren:
Wanneer te lang werd gesteriliseerd, is de groei ongelijk of blijft helemaal uit.
Foutief enten heeft een verkeerde groeirichting van de plant als gevolg (vb. omgekeerd).
Soms is er besmetting opgetreden. Dan beschimmelt alles door woekering van bacteriën.
Uitzetten:
Na enkele weken groeien de buizen vol. De plantjes kunnen dan worden uitgezet om verder te
groeien. Dat kan best gebeuren in potjes in een serre, maar ook rechtstreeks onder water. De
waterstand moet dan wel laag zijn.
Op de Belgische markt zijn er een zestal die actief zijn op gebied van het klonen van Crypto’s.
Ook in Nederland doet men het.
Mogelijkheden:
Via genetische manipulatie kunnen cultivars worden gemaakt die sterk zijn en die we als
aquarianen kunnen gebruiken, maar er worden ook verbruiksgoederen gemanipuleerd. Denk
maar aan de zogenaamde pommato die in de zeventiger jaren bekend raakte. Het was het
resultaat van een Amerikaans experiment: een samenvoegsel van een aardappel en een tomaat.
Op dezelfde wijze worden er ook nieuwe bacteriën gemaakt. Bijvoorbeeld om olie te eten.
Deze micro-organismen kunnen worden ingezet bij olierampen.
Tot slot.
Deze tekst wil een mysterieuze techniek ontdoen van haar mysterie.
En mocht je nog nachtmerries krijgen van Jurassic Park, denk dan dat het nog wel een tijdje
zal duren vooraleer we echt Dinosauriërs kunnen klonen!
Bron: voordracht Peter de Batist, 12/09/’97