Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen

Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of
volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk
uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden.
Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor
enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig
vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.
UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
Academiejaar 2012- 2013
ANALYSE VAN SCHILDKLIERHORMONEN IN KATTENSERUM
door
Henriëtte HOOGEVEEN
Promotoren: Prof. dr. Lynn Vanhaecke
Julie Kiebooms
Literatuurstudie in het kader
van de Masterproef
© 2013 Henriëtte Hoogeveen
VOORWOORD
Hierbij wil ik graag van de gelegenheid gebruik maken om mijn promotoren Prof. dr. Lynn Vanhaecke
en Julie Kiebooms te bedanken voor alle tips, verbeteringen en adviezen die zij mij hebben gegeven.
Zonder hun begeleiding was ik nooit tot dit eindresultaat gekomen.
INHOUDSOPGAVE
VOORWOORD
INHOUDSOPGAVE
SAMENVATTING EN TREFWOORDEN ................................................................................................ 1
INLEIDING............................................................................................................................................... 2
1. SCHILDKLIERHORMONEN ............................................................................................................... 3
2. HYPERTHYROÏDIE EN HYPOTHYROÏDIE BIJ KATTEN ................................................................. 6
2.1 PREVALENTIE EN OORZAAK ..................................................................................................... 6
2.2 ZIEKTEBEELD .............................................................................................................................. 9
2.3 DIAGNOSE.................................................................................................................................... 9
2.3.1. Radio-isotoop opname door de schildklier ......................................................................... 10
2.3.2. Schildklierhormoonconcentraties in het bloed .................................................................... 11
2.3.3. Dynamische schildklierfunctie testen.................................................................................. 12
3. ANALYSE VAN SCHILDKLIERHORMONEN IN SERUM ............................................................... 15
3.1 DETECTIETECHNIEKEN VOOR TOTAAL SCHILDKLIERHORMOON IN SERUM ................................ 15
3.1.1 ELISA en RIA assays .......................................................................................................... 15
3.1.2 Isotoopdilutie massaspectrometrie ...................................................................................... 16
3.2 DETECTIETECHNIEKEN VOOR VRIJ SCHILDKLIERHORMOON IN SERUM ...................................... 17
3.2.1 Scheiding van gebonden en vrij hormoon ........................................................................... 17
3.2.2 Detectie van vrij schildklierhormoon in serum ..................................................................... 19
4. BESPREKING ................................................................................................................................... 21
REFERENTIELIJST .............................................................................................................................. 24
SAMENVATTING EN TREFWOORDEN
De schildklier is een, in de halsstreek gelegen, endocriene klier. De schildklierhormonen thyroxine (T4)
en tri-jodothyronine (T3) hebben ondermeer een belangrijke invloed op het basaalmetabolisme (zoals
vet- en koolhydraatmetabolisme, groeihormonen en zenuw- en cardiovasculair systeem). Om dit te
bewerkstelligen produceert de hypothalamus het thyrotropine-releasing hormoon (TRH), dat de
hypofyse stimuleert tot afgifte van thyrotropine (TSH). TSH werkt in op de schildklier en reguleert de
afgifte van de schildklierhormonen.
Hyperthyroïdie is een schildklieraandoening, die bij 11% van de katten ouder dan 8 jaar voorkomt.
Hierbij bestaat er een verhoogde productie, secretie en circulatie van T4 en T3 door de schildklier. In
98% van de gevallen is dit het gevolg van een adenomateuze hyperplasie of van adenomen van de
schildklier.
De diagnose kan onder andere gesteld worden aan de hand van palpatie van de schildklieren,
verhoogde radio-isotoop opname door de schildklier, het bepalen van de schildklierhormoon
concentratie in het bloed of dynamische schildkliertesten, zoals de TRH-stimulatietest en de T3suppressie test.
De meest gebruikte methode is het bepalen van de totale T4 concentratie in het serum door middel
van ELISA of RIA. Bij ruim 90% van de hyperthyroïde katten kan op deze manier de diagnose gesteld
worden. Bij vroege gevallen en gevallen van andere bijkomende aandoeningen is de totale T4
concentratie niet altijd gestegen bij katten, met als gevolg dat er andere methoden nodig zijn voor het
stellen van de diagnose. Dit kan door middel van het bepalen van de vrij T4 concentratie in het serum.
Hiertoe worden eerst de vrije schildklierhormonen gescheiden van de gebonden schildklierhormonen
door middel van evenwichtsdialyse of ultrafiltratie en vervolgens kan de concentratie vrije T4 bepaald
worden met behulp van massaspectrometrie of RIA.
Deze literatuurstudie biedt een overzicht van de mogelijke en gangbare methoden voor analyse van
schildklierhormonen. Daarnaast zal ook het ziektebeeld van hyperthyroïdie bij katten belicht worden.
Trefwoorden: analyse methoden, hyperthyroïdie, katten, gebonden T4, vrije T4
1
INLEIDING
Een van de meest voorkomende aandoeningen bij de oudere kat is hyperthyroïdie. Deze aandoening
werd voor het eerst in 1979 beschreven en sindsdien lijkt de prevalentie van de aandoening sterk
toegenomen te zijn. Een snellere herkenning van de ziekte en het bereiken van een hogere leeftijd
zullen hierin zeker een rol spelen. Alsook de invloed van diverse nutritionele, genetische en / of
milieufactoren spelen een rol in dit ziektebeeld. Mogelijk is er dus een reële toename in prevalentie
van deze aandoening bij katten.
Het diagnosticeren van vroege gevallen is niet altijd even eenvoudig, aangezien in een aantal gevallen
geen stijging in de concentratie van schildklierhormonen gemeten kan worden. Dit kan onder andere
te wijten zijn aan natuurlijke variatie over tijd in de concentratie aan schildklierhormonen, maar ook
door interacties met andere aandoeningen zoals nieraandoeningen, diabetes mellitus, systemische
neoplasie, primaire leveraandoeningen en andere chronische aandoeningen. Bovendien hebben de
huidige analysemethoden verschillende nadelen en zijn ze niet altijd even betrouwbaar. Dit is onder
andere een reden dat er nog steeds gezocht wordt naar een snelle, goedkope en betrouwbare test om
zowel vrije als gebonden schildklierhormonen te analyseren en de concentraties te bepalen.
2
1. SCHILDKLIERHORMONEN
De schildklier is een orgaan dat ventraal in de
halsstreek gelegen is. Het bestaat uit twee via een
isthmus verbonden lobi, die aan beide zijden,
ventraal van de trachea liggen, ter hoogte van de
larynx (Figuur 1). Het is de meest belangrijke
endocriene klier voor het basaal metabolisme.
Schildklierhormonen oefenen onder andere een
Bijschildklier
Schildklier
invloed uit op het koolhydraat- en vetmetabolisme,
op
de
groeihormonen
cardiovasculair
belangrijk
en
systeem.
voor
de
het
zenuw-
Daarnaast
normale
zijn
Trachea
Arteria carotis
en
ze
metabolische
activiteiten van alle weefsels (Cunningham & Klein,
2007).
Figuur 1: Anatomische weergave van de schildklier bij de
kat (aangepast naar Birchard, 2006).
Schildklierweefsel bestaat uit stroma en follikels
die gevormd worden door eenlagig epitheel. De follikels zijn gevuld met een gelatineuze vloeistof, het
colloïd, dat een belangrijke opslagplaats vormt voor schildklierhormonen (Cunningham & Klein, 2007).
Twee moleculen, die belangrijk zijn voor de synthese van de schildklierhormonen, zijn tyrosine en
jodide. Tyrosine maakt deel uit van de glycoproteïnemolecule thyreoglobuline, die gevormd wordt door
de epitheelcellen van de follikels en vervolgens uitgescheiden naar het lumen. Jodine wordt in het
gastro-intestinaal stelsel opgenomen en omgezet tot jodide. Eens in de bloedbaan kan jodide door
middel van actief transport opgenomen worden uit de bloedbaan in de follikelcellen (Figuur 2). De
ionenpompen, die voor dit actief transport zorgen, worden gestimuleerd door thyreotropine (TSH), dat
geproduceerd
wordt
door
de
hypofyse voorkwab (Cunningham
& Klein, 2007).
I-
Aan de apicale zijde van de cel
zorgt
thyreoperoxidase
TP
1
II-
voor
lumen bereikt.
Een tyrosine molecule met één
jodide
wordt
monojodotyrosine
(MIT) genoemd en bij een binding
van twee jodide-moleculen heet
het di-jodotyrosine (DIT).
TBG
4
3
TP
MIT
DIT
hydrolyse
ringstructuur van tyrosine van het
endocytose het colloïde van het
TBG
5
lumen snel gebonden aan de
via
10
TBGMIT/DIT
9
dat hierbij ontstaat, wordt in het
dat
I˚
2
Tyrosine
oxidatie van jodide. Het hypojodiet
thyreoglobuline,
colloïd
celmembraan
bloedbaan
T3
T3
8
7
T4
TBGMIT/
DIT/
T3/
T4
6
TBGMIT/
DIT/
T3/
T4
T4
Figuur 2. Synthese van schildklierhormonen.
Stap 1: Opname van jodide uit de bloedbaan; Stap 2: Oxidatie van jodine door
thyreoperoxidase; Stap 3: Endocytose van thyreoglobuline naar lumen; Stap 4:
Binding van hypojodiet aan thyreoglobuline met vorming van monojodotyrosine
(MIT) en dijodotyrosine (DIT); Stap 5: Binding van MIT en DIT met vorming van
trijodothyronine (T3) en thyroxine (T4); Stap 6: Endocytose van thyreoglobuline;
Stap 7: Hydrolyse van thyreoglobuline; Stap 8: Vrijstelling van T3 en T4 naar de
bloedbaan; Stap 9: Dejodatie van MIT en DIT door middel van
jodotyrosinedehalogenase; Stap 10: Hergebruik van jodide (naar Cunningham &
Klein, 2007).
3
Een binding van twee moleculen DIT geeft tertrajodothyronine (T4), ook wel thyroxine genoemd.
Trijodothyronine (T3) wordt gevormd door een binding van MIT met DIT.
Na deze binding vindt er weer endocytose van het thyreoglobuline plaats, waarna hydrolyse van de
peptidenbinding door lysosomale proteasen plaatsvindt. Hierbij komen T4, T3, dijodotyrosine en
monojodotyrosine vrij dat opgenomen wordt in het cytoplasma. T4 en T3 gaan via de celmembraan
naar de capillairen. Bij MIT en DIT vindt dejodatie plaats door het enzym jodotyrosinedehalogenase,
waarbij het jodium en de tyrosine worden hergebruikt voor de aanmaak van nieuw thyreoglobuline
(Cunningham & Klein, 2007).
Thyroxine of T4 is een prohormoon, dat pas actief wordt na perifere dejodering van het jodium uit de
buitenste ring. Dit gebeurt onder invloed van het enzym 5’-monodejodinase, dat onder meer aanwezig
is in de lever, de nieren en het spierweefsel. Hierdoor wordt trijodothyronine of T3 gevormd, wat het
meest biologisch actieve schildklierhormoon is. De vorming van T3 kan op 2 manieren gebeuren: 20%
T3 in de bloedbaan wordt gevormd in het colloïd van de schildklier door binden van MIT en DIT en de
overige 80% ontstaat door perifere dejodering van T4 in onder andere de lever, spieren en hersenen
(Cunningham & Klein, 2007; Scott-Moncrieff, 2007).
Wanneer jodium uit de binnenste ring verwijderd wordt ontstaat reverse T3 (rT3), dat biologisch inactief
is. Normaal wordt perifeer een gelijke verhouding T3 en rT3 geproduceerd. Bij vasten wordt er perifeer
minder T3 dan rT3 geproduceerd door een daling in 5’-monodejodinase, waardoor energie bespaard
kan worden. In de hypofyse daarentegen wordt geen daling in 5’-monodejodinase gezien, aangezien
dit anders, door de werking van het negatief feedback mechanisme, zou leiden tot een stijging van
TSH afgifte. Met een verhoogde T3 concentratie tot gevolg (Silbernagl & Despopoulos, 2007).
Het grootste gedeelte (99,9%) van de schildklierhormonen komen gebonden voor in de bloedbaan.
Men onderscheidt 3 type transportproteïnen, namelijk thyroxine-bindingsglobuline (TBG), albumine en
transthyretine (TTR). TBG is met zijn hoge affiniteit voor T4 het belangrijkste transportproteïne bij de
huisdieren. De katten zijn hierbij de grote uitzondering, aangezien zij geen TGB transportproteïne
bezitten. Het transport van schildklierhormonen gaat dus bij katten alleen via albumine en TTR
(Larsson et al., 1985). Ondanks zijn lage affiniteit voor T4 en T3, is albumine toch een belangrijk
transportproteïne door zijn hoge concentratie in het bloed. TTR heeft een hogere affiniteit en een
lagere bindingscapaciteit dan albumine voor T4. Het is een transportproteïne voor specifiek T4, en is
tevens een dragereiwit van het retinol-bindend proteïne. De naam TTR is dan ook een samentrekking
van transport, thyroxine en retinol. Voorheen werd TTR prealbumine genoemd, doordat het sneller
migreert dan albumine bij elektroforese (Schussler, 2000).
Slechts 0,04% van de T4 moleculen en 0,4% van de T3 moleculen in plasma komen onder de niet
gebonden toestand voor. Enkel deze fractie kan reageren met receptoren op de cellen en is dus
bioactief (Soldin & Soldin, 2011). Het evenwicht tussen vrij en gebonden schildklierhormonen, kan
eenvoudig verstoord worden. Zo kunnen bepaalde farmaceutische stoffen T3 en T4 verdringen uit de
binding met hun transportproteïne, waardoor er een hogere plasmaspiegel ontstaat van vrije T3 en T4
(Silbernagl & Despopoulos, 2007).
4
De belangrijkste regulator van de activiteit van de schildklier is thyrotropine (TSH). Het reguleert onder
meer de jodide opname, de synthese van T3 en T4 en de doorbloeding en groei van de schildklier
(Silbernagl & Despopoulos, 2007). De hypothalamus produceert het thyrotropine-releasing hormoon
(TRH), dat de hypofyse aanzet tot secretie van TSH (Panciera, 2001). Dit hormoon werkt door initiëren
van de aanmaak van cyclisch adenosine 3’,5’-monofosfaat (cAMP) en fosforylatie van proteïnekinase.
De secretie van TSH wordt geregeld door de schildklierhormonen. Door een negatief feedback
mechanisme dat zijn invloed heeft op de synthese van thyrotropine-releasing hormoon (TRH) en via
een inhibitie van TSH activiteit ter hoogte van de hypofyse (Cunningham & Klein, 2007).
Hypothalamus
+
Thyrotropine releasing hormoon (TRH)
Hypofyse
+
Thyrotropine (TSH)
-
-
Schildklier
rT3
T4
T3
Figuur 3.: Schematische weergave van de wisselwerking tussen de verschillende schildklierhormonen en het negatief
feedback mechanisme (naar Fierens, 2003).
Het negatief feedback mechanisme (Figuur 3) treedt bijvoorbeeld in werking bij een hoge T3
concentratie in het bloed. Dit geeft een remming van de TRH secretie door de hypothalamus en zorgt
voor een daling in de TRH-receptordichtheid in de hypofyse. Hierdoor remt de TSH afgifte door de
hypofyse voorkwab en dit heeft een daling in de afgifte van T3 en T4 door de schildklier als gevolg.
Hoge concentraties T4 en T3 hebben ook een remmende invloed op de afgifte van TSH door de
hypofyse (Silbernagl & Despopoulos, 2007).
5
2. HYPERTHYROÏDIE EN HYPOTHYROÏDIE BIJ KATTEN
Schildklieraandoeningen kunnen onderverdeeld worden in twee varianten, namelijk hyper- en
hypothyroïdie.
Bij hyperthyroïdie is er een verhoogde productie, secretie en circulatie van T4 en T3 door het
abnormaal functioneren van de schildklier.
Bij hypothyroïdie werkt de schildklier te traag. Dit is een zeldzame aandoening bij katten, waarvan de
oorzaak meestal iatrogeen is, als gevolg van medicamenteuze behandeling van hyperthyroïdie. Er zijn
maar een paar casussen beschreven over spontane hypothyroïdie bij een volwassen kat (Rand et al.,
1993; Blois et al., 2010). Bij kittens werden ook gevallen van hypothyroïdie gerapporteerd, maar dan
een congenitale vorm. De hypothyroïdie wordt dan meestal veroorzaakt door dysgenesie, maar er is
ook een casus beschreven van een familie Abessijnse katten met familiale dyshormogenesie. Een
andere casus beschrijft een familie van Japanse katten waar de hypothyroïdie veroorzaakt werd door
TSH-resistentie (Greco, 2006).
Een te lage T4 concentratie bij katten kan ook veroorzaakt worden door niet-thyroïdale ziektes of door
gebruik van medicatie zoals corticosteroïden of fenobarbital. Hierbij is er geen sprake van een slechte
schildklierwerking en is er dus geen sprake van echte hypothyroïdie, aangezien de oorzaak een
andere aandoening of iatrogeen is (Scott-Moncrieff, 2007).
Aangezien hypothyroïdie zelden voorkomt bij katten, zal het in deze literatuurstudie verder niet
besproken worden.
2.1 PREVALENTIE EN OORZAAK
Hyperthyroïdie is een van de meest voorkomende endocriene aandoeningen bij de oudere kat. Het
komt bij ongeveer één op de 300 katten voor (Gunn-Moore, 2005). Gemiddeld komt de aandoening bij
ongeveer 11% van de katten ouder dan 8 jaar voor (Peterson, 2012).
De oorzaak is in 98% van de gevallen adenomateuze hyperplasie of adenomen van de schildklier.
Hieronder verstaat men een goedaardig gezwel van de schildklier, maar desondanks wordt hierdoor
de levenskwaliteit wel aangetast (Meeking, 2005). Door de adenomateuze hyperplasie gaat de
schildklier autonoom functioneren, met verhoogde afgiften van T4 en onderdrukking van TSH secretie
tot gevolg. Bij 70% van de katten met adenomateuze hyperplasie zijn beide schildklierlobben
aangetast en bij 30% is maar 1 lob aangetast (Mooney, 2002).
Slechts in 1% tot 3% van de gevallen is de oorzaak van hyperthyroïdie te wijten aan een kwaadaardig
gezwel of carcinoma van de schildklier (Gunn-Moore, 2005).
Bij 9% tot 23% van de hyperthyroïde gevallen bij katten wordt ectopisch hyperfunctioneel
schildklierweefsel gevonden ergens tussen de larynx en de borstholte (Reed et al., 2011). Ectopisch
schildklierweefsel kan ontstaan doordat tijdens de embryogenese de schildklier ontwikkeld ter hoogte
van de vierde brachiaal boog als een instulping in de bodem van de farynx. Vervolgens zakt het, via
de middenlijn, van de basis van de primitieve tong naar caudaal, richting de hartbasis. Door
afwijkende migratie kan er ectopisch schildklierweefsel gevonden worden op de middenlijn van de hals
tot craniaal ter hoogte van het diafragma (Patnaik et al., 2000).
6
Hyperthyroïdie wordt voornamelijk gezien bij katten van middelbare tot oudere leeftijd (13 jaar en
ouder). Minder dan 5% van de katten met hyperthyroïdie is jonger dan 8 jaar. Er is geen
geslachtspredispositie bekend (Mooney, 2002; Meeking, 2005). Bij de Siamese kat en Himalaya kat
lijkt hyperthyroïdie minder voor te komen dan bij de Europese korthaar (Kass et al., 1999). Al werd in
het onderzoek van Martin et al. (2000) het ras als een niet significante risicofactor beschreven voor het
ontwikkelen van hyperthyroïdie bij de kat (Martin et al., 2000).
Sinds hyperthyroïdie in 1979 voor het eerst beschreven werd lijkt het aantal gevallen toegenomen
(Figuur 4). Dit kan te wijten zijn aan een snellere herkenning door de dierenartsen, een verhoogde
levensduur van katten en/of een echte toename van het voorkomen van de aandoening. Bij de laatste
optie zouden infectieuze, nutritionele, genetische of milieufactoren een rol kunnen spelen in de
Prevalentie (frequentie/1000 consultaties)
toename van de prevalentie van hyperthyroïdie bij de kat (Kass et al., 1999).
Figuur 4: Prevalentie van hyperthyroïdie (■), diabetes mellitus (●) en nierinsufficiëntie (▲) bij 9 universitaire dierenklinieken
in een periode van 1978 tot en met 1997 (uit Edinboro et al., 2004)
In verschillende epidemiologische studies worden mogelijke risicofactoren voor het ontwikkelen van
hyperthyroïdie genoemd. Deze risicofactoren kunnen grofweg in twee categorieën verdeeld worden.
De eerste categorie omvat nutritionele deficiënties of overmaat in kattenvoeders, die leiden tot
metabolische dysfunctie van de schildklier. De tweede categorie zijn de schildklier-verstorende
componenten uit het milieu, drinkwater of voeder, die interfereren met het controlemechanisme van de
schildklierhormonen, wat leidt tot schildklierpathologie en dysfunctie (Peterson, 2012)
Katten die voornamelijk blikvoeding krijgen bleken twee keer meer kans hebben op het ontwikkelen
van hyperthyroïdie dan katten die nooit blikvoeding krijgen (Kass et al., 1999). Vooral de katten die
een voorkeur hebben voor blikvoer met vis, lever of gevogelte smaak bleken een verhoogd risico te
hebben op het ontwikkelen van de aandoening. Mogelijk bevat blikvoeding met vis-smaak een relatief
hoog gehalte aan jodium, doordat oceaanvis rijk is aan jodium. Al wordt er geen verhoogd risico
gevonden bij katten met een voorkeur voor tonijnsmaak (Martin et al., 2000).
De zogenaamde “pop-top”-blikken, blikken die zonder blikopener geopend kunnen worden, blijken
eveneens het risico op het ontwikkelen van hyperthyroïdie te verhogen. Bij het maken van deze poptop blikken wordt bisfenol-A-diglycidyl ether (BADGE) gebruikt in een tussenstap bij het maken van de
epoxy-coating en bij de hittebehandeling in het organosol-coatingproces. Migratie van deze stoffen
7
naar het voeder, voornamelijk bij vet- of olierijk voeder, werd beschreven. Aan BADGE werden in vitro
cyto- en genotoxische eigenschappen toegeschreven en bovendien is het een derivaat van bisfenol-A
(BPA) epoxy. BPA zelf wordt voornamelijk via glucuronidatie gemetaboliseerd. Bij katten is juist deze
metabolisatieweg gebrekkig, door een beperkte beschikbaarheid aan glucuronosyltransferase, een
enzym in het endoplasmatisch reticulum. Bij ratten blijkt BPA de binding van T3 aan
schildklierreceptoren in de lever te verminderen en de schildklierreceptorgemedieerde transcriptie in
vitro op een dosisafhankelijke manier te onderdrukken. Deze interferentie van de T3-binding kan tot
een verhoogde TSH secretie leiden met een verhoogde schildklierhormoon productie tot gevolg
(Edinboro et al., 2004). Dit zou één van de mogelijke verklaringen kunnen zijn voor het verhoogde
risico op hyperthyroïdie bij katten die voornamelijk gevoerd worden met pop-top blikken.
Veel commerciële kattenvoeding bevatten relatief hoge concentraties aan goitrogene stoffen, zoals
ftalaten. Goitrogenen zijn stoffen die een schadelijke werking hebben op de schildklier. Daarnaast
kunnen katten aan veel andere goitrogene stoffen (vb. resorcine, polyfenolen, polychloorbifenylen
(PCB’s)) blootgesteld worden. Het grootste deel van deze stoffen worden gemetaboliseerd door
middel van glucuronidatie. Deze goitrogene stoffen kunnen een dosis-, tijds- en leeftijdsafhankelijk
cumulatief effect hebben op de hypofyse-schildklier-as bij katten, wat resulteert in chronische
stimulatie van TSH. Dit zou dan kunnen leiden tot adenomateuze hyperplasie van de schildklier en
eventueel klinische hyperthyroïdie (Peterson & Ward, 2007).
Katten die gebruik maken van de kattenbak lopen drie keer meer risico op het ontwikkelen van
hyperthyroïdie. Daarbij maakt het niet uit of er regelmatig gewisseld wordt van merk kattenbakvulling
of altijd hetzelfde merk wordt gebruikt. Kritisch bekeken zou dit kunnen betekenen dat in alle soorten
kattenbakvulling een stof zit die invloed heeft op de schildklier, maar het gebruik van een kattenbak is
ook gerelateerd aan het in huis leven van katten (Kass et al., 1999). Dit laatste komt overeen met de
bevindingen van Scarlett et al. (1988) die een elfvoudig verhoogd risico bij huiskatten vaststelden op
het ontwikkelen van hyperthyroïdie in vergelijking met katten die voornamelijk buiten leven.
Polygebromeerde difenylethers (PBDE’s) zijn synthetische componenten die gebruikt worden in
vlamvertragers in verschillende producten zoals elektronica, meubels en textiel. Deze PBDE’s hebben
een vergelijkbare chemische structuur als PCB’s en zijn persisterende organische polluenten (POP’s),
met een accumulatie doorheen de voedselketen tot gevolg. Net als PCB’s werken PBDE’s verstorend
op het schildkliermetabolisme, doordat hun chemische structuur vergelijkbaar is met de chemische
structuur van T4 en T3. De gehydroxyleerde metabolieten van PBDE’s kunnen binden aan
schildklierhormoonreceptoren en transthyretine. Daarnaast kunnen ze de activiteit van dejodinase
inhiberen (Mensching et al., 2012). De hypothese dat PBDE’s een rol spelen in het ontwikkelen van
hyperthyroïdie, wordt versterkt door het feit dat de PBDE-productie begonnen is vlak voordat in 1979
hyperthyroïdie voor het eerst beschreven werd (Peterson, 2012). Uit onderzoek van Mensching et al.
(2012) bleek dat er geen verschil was in concentratie PBDE’s in het serum van hyperthyroïde katten
en euthyroïde katten, maar dat er wel een verschil was in de concentratie PBDE’s in het huisstof in de
woningen waarin de katten verbleven. Bij de katten met hyperthyroïdie was een significant hogere
concentratie PBDE gedetecteerd in het huisstof (Mensching et al., 2012). Het onderzoek van Scarlett
et al. (1988) waarin aangetoond werd dat huiskatten een verhoogd risico hebben op ontwikkelen van
8
hyperthyroïdie, versterkt de hypothese dat PBDE’s in huisstof een rol spelen bij het ontwikkelen van
hyperthyroïdie.
Het significant verschil in concentratie van PBDE’s in huisstof, zou een verschil in PBDE
farmacokinetiek of een verschil in absorptie, distributie, metabolisatie en/of excretie (ADME) van
PBDE’s tussen eu- en hyperthyroïde katten tot gevolg kunnen hebben. Om dit te bevestigen is verder
onderzoek nodig, net als naar de farmacodynamiek van PBDE´s op elk niveau van de hypothalamushypofys-schildklier-as en in de perifere weefsels, om een goede inschatting te kunnen maken van de
risico’s die de blootstelling aan PBDE’s met zich meebrengen (Mensching et al., 2012).
Een tegenargument op de rol van PBDE’s bij het ontwikkelen van hyperthyroïdie, is dat binnenkatten
over het algemeen langer leven dan buitenkatten, doordat ze minder risico’s lopen. Hierdoor kunnen
binnenkatten een hogere leeftijd bereiken en daardoor meer kans en gelegenheid hebben op het
ontwikkelen van hyperthyroïdie (Peterson, 2012).
2.2 ZIEKTEBEELD
De typische symptomen van hyperthyroïdie bij katten waarmee
eigenaars bij de dierenarts komen, zijn: gewichtsverlies, polyfagie,
polyurie / polydipsie en hyperactief gedrag. Bij het klinisch
onderzoek zijn de katten hyperactief en geagiteerd. Verdere
observaties kunnen lage body condition score, spierverlies,
dehydratatie, zwakte, kleine nieren, ventroflexie van de nek en
retina afwijkingen (bloedingen, loslating of acute blindheid)
waargenomen worden (Meeking, 2005).
Bij ongeveer 90% van de katten met hyperthyroïdie is een
vergrootte schildklier te palperen (Figuur 5). Gastro-intestinale
symptomen zoals: braken, diarree en verhoogt volume feces
Figuur 5: Palpatie van de schildklier
voor het diagnosticeren van een
schildkliernodule bij een kat die
verdacht wordt van hyperthyroïdie (uit
Peterson, 2012).
worden ook regelmatig waargenomen. De symptomen in het cardiovasculair stelsel die vaak gezien
worden, zijn tachycardie (hartfrequentie >240 slagen per minuut), systolisch bijgeruis, cardiomegalie
en congestief hartfalen met dyspnee (Aiello, 1998). Verder kunnen huidveranderingen zoals
plaatselijke alopecia, doffe droge vacht, vettige vacht en/ of dunne huid waargenomen worden
(Meeking, 2005).
In 5 tot 10% van de gevallen vertonen katten atypische symptomen zoals: verminderde eetlust,
lethargie en depressie (Aiello, 1998).
2.3 DIAGNOSE
Diagnose van thyroïdale aandoeningen bij de kat kan aan de hand van verschillende parameters
gesteld
worden.
Elke
diagnosestelling
start
met
een
vaststelling
van
de
algemene
gezondheidstoestand van het dier en voorgeschiedenis aan de hand van concrete vragen aan de
eigenaar.
In geval van een schildklieraandoening is bij 90% van de katten bij palpatie een uni- of bilaterale
vergroting van de schildklier te voelen. Bij biochemisch bloedonderzoek wordt bij 90% van de katten
9
met hyperthyroïdie een milde tot matige stijging van alkalische fosfatase (AF) en/ of alanine
aminotransferase (ALT) waargenomen. De studie van Foster & Thoday (2000) laat zien dat bij 88%
van de hyperthyroïde katten de isoenzymes van AF afkomstig zijn van lever en bot, terwijl bij alle
gezonde katten alleen het isoenzyme van lever gezien wordt (Foster & Thoday, 2000). Na succesvolle
behandeling van hyperthyroïdie dalen de leverenzymen meestal weer tot binnen de normale waarden
(Meeking, 2005).
Verdere
testen
kunnen
vervolgens
uitgevoerd
worden
ter
bevestiging
van
mogelijke
schildklierproblemen namelijk een verhoogde radio-isotoop opname door de schildklier of door
aantonen van een verhoogde concentratie van schildklierhormonen in de bloedcirculatie (Meeking,
2005).
2.3.1. Radio-isotoop opname door de schildklier
Bij hyperthyroïdie katten wordt een verhoogde
opname gezien van radioactieve jodine isotopen
(
131
I of
123
I) en technetium in de vorm van
pertechnetaat (
99m
-
TcO4 ). Pertechnetaat vertoont
hetzelfde gedrag als jodide en chloride en wordt
daardoor ook wel “pseudohalogeen” genoemd.
Door
de
gelijkenis
met
jodide,
wordt
pertechnetaat opgenomen in de folliculaire
cellen van de schildklier, al wordt het niet
ingebouwd in de tyrosylgroep van thyroglobuline
(Daniel et al., 2002).
Pertechnetaat en radioactieve jodine isotpen
kunnen zich gaan concentreren in de schildklier,
waardoor
ze
gebruikt
kunnen
worden
bij
scintigrafie (Figuur 6). Pertechnetaat heeft de
voorkeur boven jodine isotopen, door zijn goede
Figuur 6: Een scintigrafie van een kat met een normale
schildklier.
Deze ventrale scan is 20 minuten na een intraveneuze
injectie met pertechnetaat genomen. Beide schildklierlobi
laten een uniforme opname van pertechnetaat zien (pijlen).
De intensiteit van opname door de schildklieren is gelijk aan
de intensiteit van opname door de speekselklieren
(pijlpunten) (uit Feeney & Anderson, 2007).
beschikbaarheid, lage kost en goede beeldkwaliteit. De lange halfwaardetijd en hogere γ-straling en βemissie van
131
I en hogere kosten voor
123
I maken deze stoffen minder geschikt voor scintigrafie van
de schildklier van katten (Shiel & Mooney, 2007).
Voor kwantitatieve scintigrafie wordt pertechnetaat intraveneus geïnjecteerd en na 20 tot 60 minuten
wordt het percentage dat opgenomen is door de schildklier gemeten. Bij hyperthyroïde katten is de
opname van pertechnetaat significant hoger dan bij gezonde katten. Dit resulteert in een goede
correlatie met schildklierhormoonconcentraties in het bloed. De snelheid waarmee pertechnetaat
opgenomen wordt geeft een betere weergave van een verhoogde werking van de schildklier dan een
enkele meting. Pertechnetaat wordt tevens opgenomen in de speekselklieren in dezelfde mate als in
gezond schildklierweefsel. Hierdoor kan de ratio van opname van pertechnetaat in de schildklier ten
opzichte van de speekselklieren gebruikt worden als criterium voor de diagnose van hyperthyroïdie
10
(Daniel et al., 2002). Bij hyperthyroïdie zal er in verhouding meer pertechnetaat opgenomen worden
door de schildklier dan door de speekselklieren.
Deze diagnostische methode is duur en vereist gespecialiseerde benodigdheden en technische
vaardigheden (Meeking, 2005). Voor veel katten is deze manier van diagnosticeren niet nodig, maar
bij sommige katten kan het wel een belangrijke diagnostische waarde hebben. Niet-thyroidale ziekten
hebben waarschijnlijk minder invloed op een scintigrafie dan op de basale totale T4 concentratie en
het kan hyperthyroïdie uitsluiten bij euthyroide
katten met een verhoogde vrije T4 concentratie.
Daarnaast kunnen de resultaten afwijkend zijn bij
vroege
hyperthyroïdie
en
bij
hoognormale
concentraties van schildklierhormonen in het bloed.
Kwalitatieve scintigrafie is erg nuttig om te zien of
één of beide schildklierlobben aangedaan zijn en
indien maar één lob aangetast is, welke kant dat is.
Ook een gewijzigde positie van schildklierlobben
of ectopisch schildklierweefsel (Figuur 7) en
metastasen van functionele schildkliercarcinoma’s
kunnen hiermee opgespoord worden (Shiel &
Mooney, 2007). Bij 8 tot 21% van de katten met
hyperthyroïdie
komt
intrathoracaal
schildklierweefsel voor (Harvey et al., 2009).
Zonder kwalitatieve scintigrafie zou dit gemist
worden en een behandeling door middel van
thyroidectomie
niet
het
gewenste
resultaat
Figuur 7: Een scintigrafie van een kat met hyperthyroïdie.
Deze ventrale scan is 20 minuten na een intraveneuze
injectie met pertechnetaat genomen. Bij deze kat is een
verhoogde opname van pertechnetaat waar te nemen in de
rechter schildklierlob. Daarnaast is focale zone van
opname van pertechnetaat te zien in het craniale
mediastinum, dat wijst op ectopisch hyperfunctioneel
schildklierweefsel (uit Feeney & Anderson, 2007) .
opleveren.
2.3.2. Schildklierhormoonconcentraties in het bloed
De meest gebruikte methode voor diagnose van hyperthyroïdie bij katten is op basis van analyse van
schildklierhormonen in het bloed. Hierbij kan de totale T4, vrije T4 en T3 concentratie gemeten worden
bij katten.
In veel standaard bloedonderzoeken bij geriatrische katten wordt de totale T4 concentratie mee
bepaald. Het meten van de totale T4 concentratie is een betrouwbare methode ter controle op een
verhoogde schildklierfunctie. Deze waarde, samen met het klinisch onderzoek en anamnese, kunnen
diagnostisch zijn voor hyperthyroïdie (Meeking, 2005). Zeker bij hoge concentraties T4 of T3 is de test
zeer specifiek, daar er geen vals positieve resultaten beschreven zijn (Peterson, 2006).
Bij de meeste katten met hyperthyroïdie liggen de basale totale T4 en T3 concentraties boven de
-1
referentiewaarden. Een waarde van midden tot hoognormaal (>30 nmol L ) wordt bij een significant
percentage (tot 10%) van de hyperthyroïde katten gezien. Meestal is hier dan sprake van een vroege
detectie van hyperthyroïdie (Peterson et al., 2001).
11
Een verhoogde serum totale T3 concentratie kan gezien worden bij prethyroïde katten en sommige
katten met hyperthyroïdie (Shiel & Mooney, 2007). Bij 25% van de hyperthyroïde katten valt de totale
T3 serumconcentratie binnen de referentiewaarden (Peterson et al., 2001). Evaluatie van de
schildklierfunctie kan hierdoor niet alleen op basis van de serum T3 concentratie gebeuren (Panciera,
2001). Een verklaring voor katten met een milde hyperthyroïdie, waarvan de T3 concentratie binnen de
referentiewaarden liggen, is dat er een compensatoir verminderde perifere omzetting is van T4 naar T3
(Peterson, 2006).
In een studie waarbij de serum totale T4 en T3 concentraties van 14 mild aangetaste katten ieder uur
gedurende 10 uur gemeten werd en bij 7 katten dagelijks gedurende 15 dagen, werd er fluctuaties
waargenomen. Deze fluctuatie bleken sterker bij de 15 dagen periode dan bij de 10 uur periode.
Hierdoor bestaat de kans dat bij katten, met een lichtverhoogde concentratie, een waarde gemeten
wordt die binnen de normaalwaarden valt, wanneer de concentratie op het laagste punt gemeten
wordt (Shiel & Mooney, 2007).
Sommige niet-thyroïdale ziekten, zoals nieraandoeningen, diabetes mellitus, systemische neoplasie,
primaire leverziekten en andere chronische aandoeningen, hebben een suppressief effect (Peterson,
2006). Dit is alleen van belang bij vroege of milde hyperthyroïdie, aangezien het gaat om een milde
suppressie en daardoor een kleine diagnostische significantie heeft. De graad van suppressie zegt
meer over de ernst van de niet-thyroïdale ziekte dan over het type ziekte bij euthyroïde katten. Een
lage totale T4 concentratie komt alleen bij hyperthyroïde katten voor, wanneer ze ook veel andere
afwijkingen hebben. Palpatie van de schildklier moet dan uitmaken of verder onderzoek voor
hyperthyroïdie nodig is.
Het meten van de vrije T4 concentratie lijkt een bruikbare diagnostische test, voornamelijk bij katten
met een serum totale T4 concentratie binnen de normaalwaarden. Het meten van de vrije T4
concentratie heeft een hoge gevoeligheid, maar de specificiteit is lager. Bij 6 tot 12% van de zieke
euthyroïde katten wordt een verhoogde concentratie gemeten. Hierdoor kan de vrije T4 concentratie
het best gebruikt worden als uitsluitingcriterium. De uitslag moet geïnterpreteerd worden in combinatie
met de serum totale T4 concentratie. Middel tot hoge serum totale T4 concentraties samen met
verhoogde vrije T4 concentraties zijn diagnostisch voor hyperthyroïdie. Terwijl een lage totale T4
concentratie en een verhoogde vrije T4 concentratie meestal geassocieerd kan worden met een nietschildkliergebonden ziekte (Shiel & Mooney, 2007).
2.3.3. Dynamische schildklierfunctie testen
Bij katten die verdacht worden van hyperthyroïdie, maar waarbij geen verhoogd totaal T4 gemeten
wordt in het serum, kan met behulp van dynamische schildklierfunctietesten de diagnose toch
bevestigd worden. Deze testen omvatten onder andere de T3 suppressietest en de thyrotropinereleasing-hormoon stimulatietest (Peterson et al., 2001). Voorheen kon er ook nog gebruik gemaakt
worden van de TSH stimulatietest door middel van het boviene thyroid-stimulerend hormoon (TSH).
Hierbij vertoonde de hyperthyroïde katten geen stijging van de basale totale T4 concentratie, in
tegenstelling tot gezonde katten, na het toedienen van TSH. Helaas is boviene TSH niet langer
verkrijgbaar, waardoor deze test niet meer gebruikt kan worden. In een studie van Stegeman et al.
12
(2003) werd bij 7 gezonde katten gekeken naar de respons op het veel duurdere recombinant humaan
THS (rhTSH). Hieruit kan gesuggereerd worden dat rhTSH gebruikt kan worden voor de TSH
stimulatietest, waarbij 6 tot 8 uur na de intraveneuze toediening de totale T4 gemeten wordt. De
bepaling van vrije T4 geeft weinig extra informatie. Door het lage aantal katten, dat gebruikt werd in
deze studie, kunnen er geen referentiewaardes bepaald worden (Stegeman et al., 2003).
2.3.3.1 Thyrotropine-releasing-hormoon stimulatietest
Bij een studie met behulp van de
thyrotropine-releasing hormoon (TRH) responstest werd een
significante verhoging van de gemiddelde totale T4 concentratie na toediening van TRH in 31 gezonde
katten, 35 hyperthyroïde katten en 15 katten met een niet-thyroïdale ziekte waargenomen. De totale
T4 concentratie steeg bij hyperthyroïde katten minder dan bij gezonde katten en katten met een
andere ziekte. Een stijging van minder dan 50% komt overeen met milde hyperthyroïdie en een
waarde groter dan 60% is suggestief voor euthyroïdie. Een stijging tussen 50 en 60% is twijfelachtig
(Shiel & Mooney, 2007). Tomsa et al. (2001) onderzochten de schildklierfunctie door middel van een
TRH stimulatietest bij zeer zieke katten. De conclusie uit deze test was dat TRH stimulatie niet
gebruikt kan worden om een differentiatie tussen hyperthyroïde katten en zieke katten met een nietthyroïdale aandoening te maken (Tomsa et al., 2001). Een zwak punt van deze studie is dat de
diagnose van hyperthyroïdie niet gesteld werd op basis van de schildklierfunctie, maar op basis van
klinische symptomen en histopathologie, waarbij het laatste doorslaggevend was. Een evaluatie van
alle katten uit de studie door middel van scintigrafie had waarschijnlijk een betere scheiding van de
studiegroepen gegeven (Panciera, 2001).
De TRH stimulatietest heeft een groot nadeel en dat is dat er veel bijwerkingen gezien worden. Binnen
een paar minuten na het toedienen van TRH tot aan het einde van de 4 uur-durende test gaan veel
katten braken, speekselen, vertonen tachypnee en gaan defeceren (Shiel & Mooney, 2007). Dit zou
ontstaan door het activeren van centrale cholinerge en catecholamine mechanismen en door het
directe neurotransmitter effect van TRH op specifieke centrale TRH bindingsplaatsen (Peterson, 2006).
2.3.3.2 Trijodothyronine suppressietest
De bijwerkingen zoals die gezien worden bij de TRH stimulatietest, worden niet gezien bij de T3
suppressietest. Deze test heeft dan weer als nadeel dat die 3 dagen duurt en medewerking van de
eigenaar vereist is door middel van het geven van orale medicatie (Peterson et al., 2001). Bij de T3
suppressietest worden de basale serumconcentraties van totale T4 en T3 gemeten, waarna de
eigenaar de kat 3 keer per dag gedurende 2 dagen liothyronine, een synthetisch T3-preparaat, oraal
moet geven en de derde dag enkel ’s morgens. Binnen 2 tot 4 uur na de laatste gift wordt opnieuw de
serum T4 en T3 concentratie gemeten. Bij gezonde katten wordt een duidelijke daling in serum T4
concentratie gezien na het toedienen van liothyronine in tegenstelling tot hyperthyroïde katten. Door
middel van deze test kan een onderscheid gemaakt worden tussen hyperthyroïde katten en normale
katten of katten met een niet-thyroïde aandoening. Katten met hyperthyroïdie hebben een absolute
-1
stijging van de serum T4 concentratie na toediening van liothyronine die groter is dan 20 nmol L ,
-1
terwijl de stijging bij normale katten en euthyroïde katten minder dan 20 nmol L is. Er bestaat wel een
13
grote overlap tussen de 3 groepen, maar een suppressie van 50% of meer kwam alleen voor bij katten
zonder hyperthyroïdie (Peterson, 2006).
Deze test wordt in de praktijk vanwege zijn nadelen weinig gebruikt, alleen bij katten die sterk verdacht
worden van hyperthyroïdie en waarbij na herhaalde metingen van totale T4 en vrij T4 de diagnose niet
bevestigd kan worden (Meeking, 2005).
Voor katten die verdacht worden van hyperthyroïdie maar geen verhoogde totale T4 concentratie
vertonen, zijn de dynamische schildklierfunctietesten niet ideaal en is er een simpele en geschikte
methode voor de diagnose nodig. Voor deze katten is het bepalen van de vrije T4-concentratie een
betere methode. Het enige waar wel rekening mee gehouden moet worden, is dat euthyroïde katten
met een niet-thyroïde ziekte ook een verhoogde vrije T4-concentratie kunnen hebben. De vrije T4
concentratie kan om die reden niet als definitieve diagnose gebruikt worden en moet er aan andere
criteria, in het bijzonder palpeerbare schildkliernodules, ook voldaan worden (Peterson et al., 2001).
14
3. ANALYSE VAN SCHILDKLIERHORMONEN IN SERUM
Schildklierhormonen kunnen zoals reeds gezegd zowel vrij als gebonden aan een eiwit in de
bloedbaan voorkomen. Hierdoor ontstaat een ratio tussen gebonden en vrij hormoon. Het is dus van
belang dat gebonden en ongebonden hormonen correct gemeten kunnen worden, aangezien ze een
belangrijke bijdrage kunnen leveren voor de diagnosestelling. Voor katten worden voornamelijk
analysemethoden op basis van immunoassays gebruikt voor de bepaling van totale T4. In de meeste
gevallen is dit, in combinatie met de klinische symptomen, voldoende voor diagnose. Voor de vroege
gevallen van hyperthyroïdie kan het zijn dat er ook nog ander analysemethoden nodig zijn voor een
diagnose.
In
dit
hoofdstuk
zullen
de
diverse
analysemethoden,
die
de
detectie
van
schildklierhormonen in het serum toelaten, besproken worden.
3.1 Detectietechnieken voor TOTAAL SCHILDKLIERHORMOON in serum
3.1.1 ELISA en RIA assays
De radioimmunoassay (RIA) en enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) zijn vergelijkbare
analysemethoden. Het belangrijkste verschil tussen ELISA en RIA is dat de antistof in het conjugaat
van RIA radioactief gelabeld is en van ELISA gelabeld is met een enzym.
RIA wordt gezien als de gouden standaard voor het bepalen van de totale T4 concentratie in serum en
wordt daardoor algemeen aanvaard als referentiemethode (Lurye et al., 2002).
In een vaste fase RIA zijn de antistoffen geïmmobiliseerd tegen de wand van een polypropyleenbuisje.
Het te onderzoeken staal, een standaard en een controlestaal worden elk aan een gecoat buisje
toegevoegd. De lege buisjes worden gebruikt voor het bepalen van de niet-specifieke binding en de
totale telling. Dan wordt er aan elk buisje
125
I-gelabelde T4 toegevoegd, waarna de stalen 60 minuten
bij 37°C geïncubeerd worden. Na de incubatie worden de stalen overgegoten en de radioactiviteit
wordt gedurende 1 minuut geteld in een gammateller. De concentratie T4 wordt bepaald door het
gebruik van regressieanalyse (Singh et al., 1997).
ELISA is een ligandbindingstest waarbij een enzym als merker gebruikt wordt. Het antigen wordt
geïncubeerd op een plastic plaat, waardoor kleine hoeveelheden antigen adsorberen aan het
oppervlak. De antigenen die niet geadsorbeerd zijn, worden vervolgens weggewassen. Daarna wordt
er een “blocking-vloeistof” toegevoegd, die een overmaat aan een niet-doeleiwit biedt. Hierdoor
worden alle vrije adsorptieplaatsen bezet, zodat er later in de test geen niet-specifieke bindingen
plaats kunnen vinden.
Vervolgens wordt een bepaalde hoeveelheid van het te testen serum toegevoegd. De antistoffen
hieruit zullen binden aan de antigenen die gecoat zijn aan het oppervlak. De ongebonden eiwitten
worden weggewassen. Na deze wasstap wordt een conjugaat toegevoegd. Het conjugaat is een
molecule die covalent gebonden is aan een enzym zoals peroxidase en is specifiek gericht tegenover
T4. Het conjugaat en het staal gaan met elkaar in competitie voor binding met het gecoate antiserum.
Als laatste wordt het substraat toegevoegd. Dit is een kleurloze vloeistof die door het enzymgedeelte
van het conjugaat omgezet wordt in een gekleurd eindproduct. Door middel van spectrofotometrische
15
1. De plaat coaten met antigen
antigen
2. Wassen
3. Toevoegen test-antistof
enzymdeel
4. Wassen
antistof
5. Toevoegen conjugaat
conjugaat
6. Wassen
7. Toevoegen substraat
substraat
8. Ontwikkelen plaat
Figuur 8: Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
1. Antigen wordt geïncubeerd op een plastic plaat; 2. Vrije antigenen worden weggewassen; 3. Test-antistoffen worden
toegevoegd en binden aan de antigenen; 4. De ongebonden antistoffen worden weggewassen; 5. Conjugaat wordt
toegevoegd en bindt met antistof; 6. Overmaat conjugaat wordt weggewassen; 7. Een kleurloos substraat wordt toegevoegd;
8. Het enzymgedeelte van het conjugaat zet het substraat om in een gekleurd eindproduct (naar Roitt et al., 2000).
technieken wordt de intensiteit van de kleurreactie afgelezen en de kwantitatieve waarde van de
hoeveelheid T4 in het serum bepaald (Roitt et al., 2000).
Kemppainen & Birchfield (2006) hebben een studie gedaan waarbij een speciaal voor honden
ontwikkelde RIA voor totale T4 vergeleken wordt met een zelf ontwikkelend ELISA, een andere RIA
totale T4-kit en een chemiluminescent-enzym-immunoassay (CEIA). Hieruit bleek dat er een goede
correlatie bestond tussen de 4 methoden, hoewel de speciaal voor honden ontwikkelde RIA lagere
waardes gaf. Dit werd duidelijker naar mate de concentratie totale T4 steeg (Kemppainen & Birchfield,
2006).
3.1.2 Isotoopdilutie massaspectrometrie
Isotoopdilutie is een analysetechniek die berust op het bepalen van isotoopverhoudingen in een
monster. Door toevoeging van dezelfde component ongelijk in de isotoopvorm, verandert de
isotoopverhouding. Bij het meten van schildklierhormonen wordt hiervoor de stabiele deuteriumgelabelde interne standaard, L-thyroxine-d2 gebruikt (Soukhova et al., 2004).
Aan de hand van deze verandering kan de concentratie van de te bepalen component in het monster
berekend worden. De component die geanalyseerd moet worden heeft hiervoor minimaal 2 stabiele of
langlevende isotopen nodig, die dan gemeten kunnen worden met massaspectrometrie. Na het
toevoegen van het verrijkt isotoop, is denaturatie van de eiwitten nodig om het totaal hormoon te
bekomen. Dit vindt plaats door middel van deproteïnisatie door het toevoegen van bijvoorbeeld aceton
of methanol. Vervolgens wordt het staal gecentrifugeerd en wordt er verder gewerkt met het
supernatans (Thienpont et al., 1999).
16
Voordat de te analyseren componenten met massaspectrometrie gemeten kunnen worden, moet er
eerst nog een scheiding gebeuren. Een veel gebuikte techniek is chromatografische scheiding die of
door
een
vloeistoffase
(vloeistofchromatografie)
of
door
een
gasfase
(gaschromatografie)
bewerkstelligd kan worden. Bij deze scheidingsmethode zijn er 2 fasen die ten opzicht van elkaar
bewegen. De stationaire fase is in rust en de mobiele fase beweegt over de stationaire fase heen. Het
principe van chromatografie berust op de verschillen in adsorptie of distributiecoëfficiënt tussen de
mobiele en de stationaire fase van de verschillende componenten van het staal (Bauer et al., 1968).
Door het verschil in sterkte van adsorptie van de verschillende componenten uit het staal, zal het ene
component sneller door de kolom stromen dan het andere. Hierdoor worden de componenten van
elkaar gescheiden (Lindsay, 1987).
Andere scheidingstechnieken zoals capillaire elektroforese (CE) kunnen ook gebruikt worden
(Rodríguez-González et al., 2005). Bij CE wordt het te scheiden mengsel door een dunne kolom
geleid onder invloed van een elektrisch veld. Na een temporele scheiding van de componenten kan
massaspectrometrische detectie toegepast worden.
De isotoopdilutie tandem massaspectrometrie heeft als voordeel dat het een snelle (<7 minuten),
accurate, specifieke (meet alleen het analiet dat gemeten moet worden), precieze en eenvoudig uit te
voeren test is (Soukhova et al., 2004).
3.2 Detectietechnieken voor VRIJ SCHILDKLIERHORMOON in serum
De bepaling van de vrije T4 concentratie in serum is de meest gevoelige diagnostische test voor
hyperthyroïdie. In tegenstelling tot wat men zou kunnen verwachten, is het niet mogelijk om zomaar
dezelfde extractie en analysemethode als voor de totale T4 concentratiebepaling toe te passen. Voor
het meten van de concentratie van vrije T4 moet eerst de vrije fractie gescheiden worden van de
gebonden T4 fractie, waarna de vrije hormonen gemeten kunnen worden (Fierens et al., 2000). De
vrije T4 concentratie kan alleen betrouwbaar gemeten worden na toepassing van bepaalde
scheidingstechnieken zoals evenwichtsdialyse en ultrafiltratie (Peterson, 2006). Bovendien is het
belangrijk, om een zo betrouwbaar mogelijke scheiding te bekomen, opdat de omstandigheden de in
vivo situatie zo dicht mogelijk zouden naderen. Fysische en chemische parameters, zoals de tijd, de
temperatuur, de pH, verdunning van het staal en de veranderingen in ionencompositie van het serum
spelen gedurende de scheiding dan ook een belangrijke rol (Fierens et al., 2000).
Een bijkomende moeilijkheid is dat de vrije fractie van zowel T4 als T3 in zeer lage concentraties
voorkomt in het serum. Waar de totale hormoonconcentraties gemeten wordt in nanomolaire
hoeveelheden, worden de vrije hormonen in picomol per liter serum gemeten, wat dus duizend maal
kleiner is. Hierdoor is de invloed van interferentie van veel groter belang bij deze lage concentraties
dan bij het meten van de totale hormoonconcentratie (Soukhova et al., 2004).
3.2.1 Scheiding van gebonden en vrij hormoon
Voor zowel evenwichtsdialyse als voor ultrafiltratie is het onder andere erg belangrijk dat de juiste
membranen gekozen worden. Het is vooral belangrijk dat de membraan zo min mogelijk proteïnen
bindt of laat doorsijpelen. Dit kan de meting van de vrije T4 concentratie verstoren en zorgen voor een
17
vals positief resultaat (Holm et al., 2004). Bovendien kunnen afwijkingen gemakkelijk voorkomen
doordat de vrije fractie maar een erg klein deel is van de totale schildklierhormonenconcentratie
(Tikanoja, 1990).
3.2.1.1 Evenwichtsdialyse
Evenwichtsdialyse werd historisch beschouwd als gouden standaard voor het meten van de vrije T4
fractie. Het nadeel van evenwichtsdialyse is dat het een tijdrovende, dure en technisch veeleisend
methode is, waardoor het minder praktisch in gebruik is voor commerciële laboratoria die een groot
aantal stalen moeten verwerken (Schachter et al., 2004).
Bij evenwichtsdialyse wordt er gebruik gemaakt van de affiniteit van schildklierhormonen voor zijn
bindingsproteïne. De affiniteit van een schildklierhormoon is de sterkte van binding van een
bindingsproteïne
aan
een
membraan
bindingsplaats van het hormoon.
Ongebonden
Serumstaal
schildklier-
hormonen
kunnen
het
Dialysebuffer
Schildklierhormonen
Voor incubatie
bindingsproteïnen
dialysemembraan vrij passeren,
waarna
ze
worden
bepaald
door
kunnen
middel
van
Na incubatie
evenwichtsdialyse (Murphy et
al., 2008).
Een
dialysecel
(Figuur
9)
bestaat uit twee gelijke volumes
waartussen
zich
een
Figuur 9: Evenwichtsdialyse
De 2 halfcellen met een semipermeabele membraan waarlangs de vrije
schildklierhormonen kunnen passeren en de gebonden schildklierhormonen niet
(naar Di et al., 2012).
semipermeabel membraan bevindt (Uytfanghe et al., 2006). Aan de ene halfcel (donor) wordt het
serum toegevoegd en aan de andere halfcel (acceptor) een dialysebuffer (Di et al., 2012). Via het
membraan staat het serum in contact met de proteïne-vrije dialysebuffer (Yue et al., 2008). De grootte
van de poriën van het membraan bepaalt welke moleculen het membraan kunnen passeren en welke
niet. De gebonden T4 moleculen uit het serum zijn te groot om het membraan te kunnen passeren. De
vrije T4 moleculen zijn wel klein genoeg, zodat tijdens de incubatie een evenwicht van vrije T4
moleculen ingesteld kan worden tussen het serum en de dialysebuffer. Na incubatie kan de inhoud
van zowel de donor- en acceptorcel geanalyseerd worden en kan de concentratie vrije T4 berekend
worden (Di et al., 2012).
3.3.1.2 Ultrafiltratie door middel van centrifugatie
Ultrafiltratie is een filtratiemethode die gebaseerd is op centrifugeren van onverdund serum door een
semipermeabel membraan (Weeke et al., 1986). Hierbij wordt een vloeistof onder druk door een
ultrafilter geperst. Het drukverschil en de filter bepalen de snelheid van de filtratie. Bij deze methode
worden vrije en proteïne-gebonden schildklierhormonen gescheiden. De condities waaronder deze
scheiding plaatsvindt, moeten zo dicht mogelijk de in vivo omstandigheden benaderen om een juiste
18
weergave te verkrijgen van de reële verhouding tussen de gebonden en vrije fractie in vivo (Weeke et
al., 1986).
De ultrafilters moeten voor gebruik gewassen worden om onzuiverheden op de filter te verwijderen die
mogelijk voor interferentie bij analyse zouden kunnen zorgen. Dit kan gedaan worden door met
fosfaatbuffer te centrifugeren en vervolgens met gedestilleerd water. Hierna moet het ultrafiltraat, dat
in de eerste 5 minuten gevormd wordt, verwijderd worden. Na het wassen is er water achter gebleven
in de filter en door dit water wordt het filtraat verdund. Door het ultrafiltraat te gebruiken dat pas na
deze 5 minuten gevormd wordt, wordt een verdunning vermeden (Tikanoja, 1990).
De incubatie bij 37˚C, 5% CO2 en een pH van 7,4 is nodig om het thermodynamisch in vivo evenwicht
zo goed mogelijk te benaderen. Ook tijdens het filtratieproces moeten deze omstandigheden zo goed
mogelijk gehandhaafd worden, voor een juist evenwicht (Weeke et al., 1986).
Na de incubatie wordt het serumstaal samen met een fosfaatbuffer in het ultrafiltratie-cel geplaatst,
waarna een proteïnevrije fractie verkregen wordt. Na het zuiveren van de tweede fractie, kan de fractie
vrije T3 en T4 bepaald worden (Sophianopoulos et al., 1980). Dit kan gedaan worden met behulp van
radioimmunoassay of massaspectrometrie (Weeke et al, 1986).
Bij ultrafiltratie is het belangrijk aandacht te besteden aan het vermijden van lekkages en binding van
proteïnen. Een lekkage van 0,005% van de serumproteïnen in het ultrafiltraat, zal al een duidelijke
verhoging van vrije de T4 concentratie geven (Tikanoja, 1990). Ook binding van proteïnen aan de
wanden tijdens de incubatie heeft een invloed. Daardoor is het belangrijk dat de radioimmunoassay of
massaspectrometrie zo snel mogelijk na de ultrafiltratie wordt uitgevoerd (Weeke et al., 1986).
3.2.2 Detectie van vrij schildklierhormoon in serum
Met massaspectrometrie (MS) kunnen de vrije schildklierhormonen in het serum gedetecteerd worden.
(Soldin et al., 2005). De triple quadrupole MS/MS (Figuur 10) is de meest gevoelige tandem MS,
waarbij drie quadrupolen in serie gebruikt worden. Een quadrupool bestaat uit vier elektrischgeladen
polen waarbij er kruiselings twee positief en twee negatief zijn. De eerste en laatste quadrupolen van
de triple quadrupole MS/MS zijn massa analysers en de tweede, die in het midden zit, heeft een vaste
voltage en zorgt het voor het convergeren van de ionen op basis van hun karakteristieken (Hoffmann,
1996).
Quadrupool
Ionisatie
bron
collisiecel
m/z
scheiding
Staal
Ionisatie
Q1
m/z
Fragmentatie
Q2
scheiding
Q3
MS 1
MS 2
Precursor ion
Product ion
detectie
Figuur 10. Schematische weergave van een triple quadrupool massaspectrometer (naar Antoniewicz, 2013).
19
Tandem massaspectrometrie wordt als alternatief voor immunoassay aangehaald voor het bepalen
van schildklierhormonen in serum. In eerste instantie is er een MS/MS-methode ontwikkeld voor het
meten van totale T3 en T4 concentraties en hierbij werd gebruik gemaakt van gaschromatografie voor
de scheiding en isotoopdilutie om de massaspectrometrische kwantificatie te bepalen (Soldin et al.,
2005). Bij verdere ontwikkeling werd er gebruik gemaakt van hoge performantie vloeistof
chromatografie (HPLC) gekoppeld aan massaspectrometrie of MS/MS in multipele reactie monitoring
(MRM) mode voor het meten van totaal T4 en T3 (Soukhova et al., 2004; Soldin & Soldin, 2011). MRM
is een scanmodus die in combinatie met triple quadrupool MS gebruikt wordt, voor een snelle,
gevoelige en specifieke kwantitatieve analyse van een complexe staal (Kuzyk et al., 2009). Bij deze
scanmodus worden een groot aantal van te voren bepaalde componenten geselecteerd,
gefragmenteerd en gedetecteerd. Hierdoor is, bij gebruik van LC-MS-MS in de MRM mode, het
technisch mogelijk om simultaan een significant hoog aantal componenten te screenen op een
simpele, krachtige en gevoelige manier (Gergov et al., 2003).
Naast onder andere deze voordelen, zijn er ook enkele nadelen. Massaspectrometrie is maar zo goed,
als de voorbereidende extractie stappen zijn. Bovendien zal bij een kwalitatief matige
scheidingsmethode, de massaspectrometrie ook matig zijn. Daarnaast heeft LC/MS/MS als nadeel ten
opzichte van immunoassay dat er geen “in-huis”-analysemethode bestaat. Dat wil zeggen dat
LC/MS/MS niet in de dierenartsenpraktijk of -kliniek kan worden uitgevoerd, maar in een laboratorium
moet gebeuren, waardoor de resultaten niet direct beschikbaar zijn (Soldin & Soldin, 2011).
Voor het meten van vrij T3 en T4 in serum is ID-LC/MS/MS voldoende gevoelig, specifiek, accuraat en
precies, wanneer het op de juiste manier toegepast wordt. Hierdoor kan deze methode als een goede
kandidaat beschouwd worden, om als referentiemethode te fungeren (Soldin et al.,2005; Thienpont et
al., 1999).
Men moet wel bedacht zijn op de valkuilen van LC/MS/MS. Door interferentie met onder andere matrix
componenten met dezelfde massa als het geselecteerde analiet, kenmerkende invloed van effect van
matrix op het analiet en de interne standaard kunnen de resultaten minder accuraat maken.
Bijkomende technologische ontwikkelingen kunnen de accuraatheid verhogen, waardoor de
robuustheid van de techniek verder zal stijgen en zullen er minder interferentie optreden (Vogeser &
Seger, 2010).
20
4. BESPREKING
Om
de
diagnose
hyperthyroïdie
bij
katten
te
bevestigen
wordt
de
concentratie
aan
schildklierhormonen in het bloed gemeten. Hierbij kan zowel de totale T4 en T3 concentratie als de
vrije T4 en T3 concentratie gemeten worden.
De gevoeligheid van directe evenwichtsdialyse voor het meten van vrije T4 is, als diagnostische test,
significant beter dan het meten van de totale T4 en T3 concentraties. De vrije T4 concentratie is bij 98%
van de katten met onbehandelde hyperthyroïdie hoog en bij 93% van de katten met een milde
hyperthyroïdie. Bij ruim 91% van de hyperthyroïde katten werden een hoge totale T4-concentratie
gemeten en al deze katten hadden een hoge vrije T4-concentratie (Peterson et al., 2001).
Een nadeel van het bepalen van vrije T4 concentratie is dat het alleen echt gemeten kan worden met
technieken zoals evenwichtsdialyse of ultrafiltratie. Technieken zonder dialyse zijn veel minder
nauwkeurig en geven vaak een onderschatting van de vrije T4 concentratie. Daarnaast zijn de kosten
voor het bepalen van de vrije T4 concentratie bijna het drievoudige van de kosten voor de bepaling
van de totale T4 concentratie. Daarnaast kunnen niet alle laboratoria het aanbieden. Verder is de
meting van de vrije T4 concentratie, door transport van het staal, gevoeliger voor fouten dan de meting
van totale T4.
Het belangrijkste nadeel van de vrije T4 concentratiebepaling is dat het diagnostisch minder specifiek
is, voornamelijk bij katten met een niet-thyroïdale ziekte. Tot 12% van de zieke euthyroïde katten
hebben een verhoogde vrije T4 concentratie door onverklaarbare redenen (Peterson, 2006).
Het bepalen van de vrije T4 concentratie is bovendien lang niet altijd nodig. Vooral bij katten met zeer
hoge concentraties totale T4 is de diagnose duidelijk en hoeven de hoge kosten voor het bepalen van
vrije T4 niet gemaakt te worden (Peterson et al., 2001).
In veel klinieken wordt de concentratie van schildklierhormonen gemeten met behulp van
immunoassays. Het nadeel van deze immunoassays is dat ze een gebrek kennen in specificiteit. Dit
beperkt de klinische bruikbaarheid van deze test (Soldin & Soldin, 2011).
De beperkte betrouwbaarheid door gebrek in specificiteit blijkt uit steeds meer literatuur en komt onder
andere
door
het
gebruik
van
verschillende
antistoffen.
Hierdoor
kunnen
de
gemeten
schildklierwaardes met een factor van bijna 2 verschillen (Soukhova et al., 2004).
Interferenties met andere stoffen zoals geneesmiddelen, kruisreactiviteit met antistoffen, binding met
andere proteïnen, de invloed van vrije vetzuren en endo- en exogene bindingsinhibitoren hebben
invloed op de accuraatheid, validiteit en betrouwbaarheid van direct analoge immunoassays.
Immunoassay is een veel snellere techniek dan LC/MS/MS en heeft als grote voordeel dat er een “inhuis”-analysemethode is, die uitgevoerd kan worden in de dierenartsenpraktijk of - kliniek en waarbij
de resultaten direct bekend zijn. Voor evenwichtsdialyse of ultrafiltratie LC/MS/MS is dit nog geen
optie (Soldin & Soldin, 2011).
Massaspectrometrie heeft weer als voordeel dat er minder interferentie is, het alleen het analiet meet
dat gemeten moet worden en het een lage variatiecoëfficiënt heeft, waardoor het een meer specifieke
21
methode is voor het meten van schildklierhormonen in serum, dan immunoassay (Soukhova et al.,
2004; Gu et al., 2007).
De concentratie vrije T4 in het serum kan ook in combinatie met evenwichtsdialyse gemeten worden.
Er is echter wel een verschil in de concentratie die gemeten wordt. De gemiddelde vrije T4
concentratie in het serum die met RIA gemeten wordt, is lager dan wanneer deze gemeten wordt in
combinatie met evenwichtsdialyse. Mogelijke oorzaken hiervan zijn fouten in kalibratie, verdunning
van teststalen met testreagens-oplossing voor de vrije T4 meting en verlies van T4 door binden aan
buisjes, proteïnes of andere ingrediënten van het reagens dat gebruikt wordt bij evenwichtsdialyse
(Schachter et al., 2004).
Bij veel methoden om de vrije T3 en T4 concentratie te meten, moet het serumstaal verdund worden.
Dit is een nadeel omdat het meer invloed zal hebben op overige zwakke bindingen van substanties in
het staal dan op de binding van schildklierhormonen op hun transportproteïnen. Hierdoor zal er een
onderschatting ontstaan van de vrije schildklierhormonen. De substanties, die interactie vertonen met
de binding van schildklierhormonen aan proteïnen, kunnen natuurlijk zijn, zoals vrije vetzuren, maar
ook farmaca zoals aspirine en fenclofenac kunnen interageren met de binding (Weeke et al., 1986).
Bij een verdunning het serumstaal van 1:10 voor ultrafiltratie, wordt een daling van 30% in vrije T4
concentratie gezien. Dit zou deels verklaard kunnen worden door een verandering in affiniteit van T4
voor hun bindingsproteïnen, doordat verdunning mogelijk een fysiologische inhibitor is voor de T4
binding (Tikanoja, 1990).
Tegenwoordig worden evenwichtsdialyse of ultrafiltratie gecombineerd met LC/MS/MS als de mogelijk
nieuwe gouden standaardmethoden gezien (Soldin & Soldin, 2011). Hierbij moeten evenwichtsdialyse
of ultrafiltratie gezien worden als een scheidingsprocedure en niet als een kwantitatieve stap in de
meting met de voor hen beide specifieke tekortkomingen (Yue et al. 2008).
Evenwichtsdialyse heeft als nadeel ten opzichte van ultrafiltratie dat het een arbeidintensieve,
tijdrovende (17-24 uur), onnauwkeurige, technisch veeleisende en dure methode is, die niet in alle
laboratoria beschikbaar is. Ultrafiltratie is veel minder tijdrovend (30-40 minuten), makkelijker in
gebruik en vergeleken met evenwichtsdialyse heeft het een veel betere reproduceerbaarheid (Soldin
& Soldin, 2011). Het voordeel van evenwichtsdialyse voor het scheiden van vrije T4 van de thyroxinebindingsproteïnen ten opzichte van ultrafiltratie is dat het staal bij evenwichtsdialyse helemaal vrij
gemaakt wordt van albumine (Holm et al., 2004), waardoor het niet meer kan interfereren tijdens de
rest van de meting.
Een nadeel van ultrafiltratie ten opzichte van evenwichtsdialyse is dat er gecentrifugeerd moet worden
aan 37˚C. Dit vraagt dus thermostatische controle en voorverwarming. Ook moet er minimaal 45
minuten gecentrifugeerd worden, wanneer het staal niet verdund wordt. De uiteindelijke resultaten van
ultrafiltratie zijn sterk afhankelijk van de filter die gebruikt wordt (Uytfanghe et al., 2006).
Bij ultrafiltratie worden hogere vrije T4 concentraties gevonden dan bij evenwichtsdialyse (Fierens et al.,
2000). Een mogelijk verklaring zou zijn, dat ionische componenten in de buffer die gebruikt wordt bij
22
dialyse methoden een effect hebben op de binding van schildklierhormonen met serumproteïnen
(Weeke et al., 1986).
Massaspectrometrie kan gebruikt worden voor zowel de totale T4 als voor de vrije T4 bepalingen. De
moderne massaspectrometrische technieken voor het bepalen van de schildklierhormonen
concentraties in serum, hebben een grotere specificiteit en hebben minder last van interferentie dan
immunoassays.
Een nadeel van schildklierhormoon concentratiebepaling met tandem massaspectrometrie is, dat de
voorbereidende stappen, die geassocieerd zijn met de bepaling, erg belangrijk zijn. Met name de
scheiding, opzuivering en opconcentratie van het staal zijn bepalend voor de betrouwbaarheid van de
bepaling met massaspectrometrie (Soldin & Soldin, 2011).
Aangezien bij 91% van de hyperthyroïde katten een verhoogde totale T4 concentratie gemeten kan
worden, volstaan voor het overgrote deel van de katten de huidige diagnostische methoden voor
hyperthyroïdie door middel van de totale T4 bepaling. Voor de overige 9% van de katten met
hyperthyroïdie zou het ideaal zijn als er een goedkope, snelle en betrouwbare analyse methode voor
het bepalen van vrije schildklierhormonen in het serum ontwikkeld kan worden met een hoge
gevoeligheid en specificiteit die bij voorkeur ook nog in de dierenartsenpraktijk of -kliniek zelf
uitgevoerd kan worden.
Helaas is voor het bereiken van dit doeleinde is nog veel onderzoek en ontwikkeling nodig.
23
REFERENTIELIJST
Aiello S.E. (1998). The Merck veterinary manual. 8th edition. Merck & Co., INC, Washington,
Pennsylvania, p. 419-420.
Antoniewicz M.R. (2013). Tandem mass spectrometry for measuring stable-isotope labeling. Current
Opinion in Biotechnology 24, 48-53.
Bauer J.D., Ackermann P.G., Toro G. (1968). Bray´s clinical laboratory methods. 7th edition. The C.V.
Mosby Company, Saint Louis, p. 291-293.
Birchard S.J. (2006). Thyroidectomy in the cat. Clinical Techniques in Small Animal Practice 21, 29-33.
Blois S.L., Abrams-Ogg A.C.G., Mitchell C., Yu A., Stoewen D., Lillie B.N., Kiupel M. (2010). Use of
thyroid scintigraphy and
pituitary immunohistochemistry in the diagnosis
of
spontaneous
hypothyroidism in a mature cat. Journal of Feline Medicine and Surgery 12, 156-160.
Cunningham J.G., Klein B.G. (2007). Textbook of Veterinary physiology. 4th edition. Saunders,
Missouri, USA, p. 429-436.
Daniel G.B., Sharp D.S., Nieckarz J.A., Adams W. (2002). Quantitative thyroid scintigraphy as a
predictor of serum thyroxin concentration in normal and hyperthyroid cats. Veterinary Radiology &
Ultrasound 43, 374-382.
Di L., Umland J.P., Trapa P.E., Maurer T.S. (2012). Impact of recovery of fraction unbound using
equilibrium dialysis. Journal of Pharmaceutical Sciences 101, 1327-1335.
Edinboro C.H., Scott-Moncrieff J.C., Janovitz E., Thacker H.L., Glickman L.T. (2004). Epidemiologic
study of relationships between consumption of commercial canned food and risk of hyperthyoidism in
cats. Journal of the American Veterinary Medical Association 224, 879-886.
Feeney D.A., Anderson K.L. (2007). Nuclear imaging and radiation therapy in canine and feline thyroid
disease. Veterinary Clinics of North America: Small Animal Practice 37, 799-821.
Fierens C., Stöckl D., Thienpont L.M.R., De Leenheer A.P. (2000). Towards a reference method for
serum free thyroxine based on isotope dilution mass spectrometry. Immuno-analyse & Biologie
Spécialisée 15, 311-317.
Fierens
C.
(2003).
Isotoopdilutie-vloeistofchromatografie
massaspectrometrie
referentie-
meetprocedures voor de bepaling van thyroïd- en peptidenhormonen in serum en urine. Proefschrift
Faculteit Farmaceutische Wetenschappen, Gent, p. 14.
Foster D.J., Thoday K.L. (2000). Tissue sources of serum alkaline phosphatase in 34 hyperthyroid
cats: a qualitative and quantitative study. Research in Veterinary Science 68, 89-94.
24
Gergov M., Ojanperä I., Vuori E. (2003). Simultaneous screening for 238 drugs in blood by liquid
chromatography-ionspray tandem mass spectrometry with multiple-reaction monitoring. Journal of
Chromatography 795, 41-53.
Greco D.S. (2006). Diagnosis of congenital and Adult-onset hypothyroidism in Cats. Clinical
Techniques in Small Animal Practice 21, 40-44.
Gu J., Soldin O.P., Soldin S.J. (2007). Simultaneous quantification of free triiodothyronine and free
thyroxine by isotope dilution tandem mass spectrometry. Clinical Biochemistry 40, 1386-1391.
Gunn-Moore D. (2005). Feline Endocrinopathies. Veterinary Clinics of North America: Small Animal
Practice 35, 171-210.
Harvey A.M., Hibbert A., Barrett E.L., Day M.J., Quiggin A.V., Brannan R.M., Caney S.M.A. (2009).
Scintigraphic findings in 120 hyperthyroid cats. Journal of Feline Medicine and Surgery 11, 96-106.
Holm S.S., Hansen S.H., Faber J., Staun-Olsen P. (2004). Reference methods for the measurement of
free thyroid hormones in blood: evaluation of potential reference methods for free thyroxine. Clinical
Biochemistry 37, 85-93.
Hoffmann E. (1996). Tandem mass spectrometry: a primer. Journal of Mass Spectrometry 31, 129-137.
Kass P.H., Peterson M.E., Levy J., James K., Becker D.V., Cowgill L.D. (1999). Evaluation of
environmental, nutritional, and host factors in cats with hyperthyroidism. Journal of Veterinary Internal
Medicine 13, 323-329.
Kemppainen R.J., Birchfield J.R. (2006). Measurement of total thyroxine concentration in serum from
dogs and cats by use of various methods. American Journal of Veterinary Research 67, 259-265.
Kuzyk M.A., Smith D., Yang J., Cross T.J., Jackson A.M., Hardie D.B., Anderson N.L., Borchers Ch.H.
(2009). Multiple Reaction Monitoring-based, Multiplexed, absolute quantitation of 45 proteins in human
plasma. Molecular & Cellular Proteomics 8, 1860 -1877.
Larsson M., Pettersson T., Carlström A. (1985). Thyroid Hormone Binding in Serum of 15 Vertebrate
Species: Isolation of Thyroxine-Binding Globulin and Prealbumin Analogs. General and Comparative
Endocrinology 58, 360-375.
Lindsay S. (1987). High performance liquid chromatography. John Wiley & Sons, Chichester, p. 1-2.
Lurye J.C., Behrend E.N., Kemppainen R.J. (2002). Evaluation of an in-house enzyme-linked
immunosorbent assay for quantitative measurement of serum total thyroxine concentration in dogs
and cats. Journal of the American Veterinary Medical Association 221, 243-249.
Martin K.M., Rossing M.A., Ryland L.M., DiGiacomo R.F., Freitag W.A. (2000). Evaluation of dietary
and environmental risk factors for hyperthyroidism in cats. Journal of the American Veterinary Medical
Association 217, 853-856.
25
Meeking S.A. (2005). Thyroid disorders in the geriatric patient. The Veterinary Clinics of North
America: Small Animal Practice 35, 635 -653.
Mensching D.A., Slater M., Scott J.W., Furguson D.C., Beasley V.R. (2012). The feline thyroid gland: a
model for endocrine disruption by polybrominated diphenyl ethers (PBDEs)? Journal of Toxicology and
Environmental Health 75, 201-212.
Mooney C.T. (2002). Pathogenesis of feline hyperthyroidism. Journal of Feline Medicine and Surgery
4, 167-169.
Murphy K., Travers P., Walport M. (2008). Janeway’s Immunobiology 7th edition. Garland Science
New York US, p. 745.
Panciera D.L. (2001). Thyroid function tests: What do they really tell us? Journal of Veterinary Internal
Medicine 15, 86-88.
Patnaik A.K., Peterson M.E., Hidgon A. (2000). Ectopic ligual thyroid tissue in a cat. Journal of Feline
Medicine and Surgery 2, 143-146.
Peterson M.E., Melián C., Nichols R. (2001). Measurement of serum concentrations of free thyroxine,
total thyroxine, and total triiodothyronine in cats with hyperthyroidism and cats with nonthyroidal
disease. Journal of the American Veterinary Medical Association 218, 529-536.
Peterson M.E. (2006). Diagnostic tests for hyperthyroidism in cats. Clinical Techniques in Small
Animal Practice 21, 2-9.
Peterson M.E., Ward C.R. (2007). Etiopathologic findings of hyperthyroidism in cats. The Veterinary
Clinics of North America: Small animal practice 37, 633-645.
Peterson M.E. (2012). Hyperthyroidism in cats: what's causing this epidemic of thyroid disease and
can we prevent it? Journal of Feline Medicine and Surgery 14, 804-818.
Rand J.S., Levine J., Best S.J., Parker W. (1993). Spontaneous adult-onset hypothyroidism in a cat.
Journal of Veterinary Internal Medicine 7, 272-276.
Reed T.P., Brisson B.A., Schutt L.K. (2011). Cystic ectopic lingual thyroid tissue in a male cat. Journal
of the American Veterinary Medical Association 239, 981-984.
Rodríguez-González P, Marchante-Gayón J.M., Alonso J.I., Sanz-Medel A. (2005). Isotope dilution
analysis for elemental speciation: A tutorial review. Spectrochimica Acta Part B 60, 151-207
e
Roitt I., Brostoff J., Male D. (2000). Immunologie. 2 druk. Bohn Stafleu Van Loghum, Houten
Nederland, p. 386.
Scarlett J.M., Moise N.S., Rayl J. (1988). Feline hyperthyroidism: A descriptive and case-control study.
Preventive Veterinary Medicine 6, 295-309.
26
Schachter S., Nelson R.W., Scott-Moncrieff C., Ferguson D.C., Montgomery T., Feldman E.C., Neal L.,
Kass P.H. (2004). Comparison of serum-free thyroxine concentrations determined by standard
equilibrium dialysis, modified equilibrium dialysis, and 5 radioimmunoassays in dogs. Journal of
Veterinary Internal Medicine 18, 259-264.
Schussler G.C. (2000). The thyroxine-bindings proteins. Thyroid 10, 141-149.
Scott-Moncrieff J.C. (2007). Clinical Signs and Concurrent Diseases of Hypothyroidism in Dogs and
Cats. The Veterinary Clinics of North America: Small Animal Practice 37, 709-722.
Shiel R.E., Mooney C.T. (2007). Testing for hyperthyroidism in cats. Veterinary Clinics of North
America: Small Animal Practice 37, 671-691.
e
Silbernagl S., Despopoulos A. (2007). Atlas van de fysiologie. Sesam. 3 druk, Baarn, p. 286-289.
Singh A.K., Jiang Y., White T., Spassova D. (1997). Validation of nonradioactive chemiluminescent
immunoassay methods for the analysis of thyroxine and cortisol in blood samples obtained from dogs,
cats, and horses. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 9, 261-268.
Soldin O.P., Soldin S.J. (2011). Thyroid hormone testing by tandem mass spectrometry. Clinical
Biochemistry 44, 89-94.
Soldin S.J., Soukhova N., Janicic N., Jonklaas J., Soldin O.P. (2005). The measurement of free
thyroxine by isotope dilution tandem mass spectrometry. Clinica Chimica Acta 358, 113-118.
Sophianopoulos J., Jerkunica I., Lee C.N., Sgoutas D. (1980). An improved ultrafiltration method for
free thyroxine and triiodothyronine in serum. Clinical Chemistry 26, 159-162.
Soukhova N., Soldin O.P., Soldin S.J. (2004). Isotope dilution tandem mass spectrometric method for
T4/T3. Clinica Chimica Acta 343, 185-190.
Stegeman J.R., Graham P.A., Hauptman J.G. (2003). Use of recombinant human thyroid-stimulating
hormone for thyrotropin-stimulation testing of euthyroid cats. American Journal of Veterinary Research
64, 149-152.
Thienpont L.M., Fierence C., De Leenheer A.P., Przywara L. (1999). Isotope dilution-gas
chromatography/mass spectrometry and liquid chromatography/electrospray ionization-tandem mass
spectrometry for the determination of triiodo-L-thyronine in serum. Rapid Communications in Mass
Spectrometry 13, 1924-1931.
Tikanoja S. (1990). Ultrafiltration devices tested for use in a free thyroxine assay validated by
comparison with equilibrium dialysis. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation 50,
663-669.
27
Tomsa K., Glaus T.M., Kacl G.M., Pospischil A., Reusch C.E. (2001). Thyrotropin-Releasing Hormone
stimulation test to Assess thyroid function in severely sick cats. Journal of Veterinary Internal Medicine
15, 89-93.
Uytfanghe K., Stöckl D., Ross H.A., Thienpont L.M. (2006). Use of frozen sera for FT4 standardization:
investigation by equilibrium dialysis combined with dilution-mass spectrometry and immunoassay.
Clincal Chemistry 52, 1817-1821.
Vogeser M., Seger Ch. (2010). Pitfalls associated with the use of liquid chromatography-tandem mass
spectrometry in the clinical laboratory. Clinical Chemistry 56, 1234-1244.
Weeke J., Boye N., Ørskov H. (1986). Ultrafiltration method for direct radioimmunoassay
measurement of free thyroxine and free tri-iodothyronine in serum. Scandinavian Journal of Clinical
and Laboratory investigation 46, 381-389.
Yue B., Rockwood A.L., Sandrock T., La’ulu S.L., Kushnir M.M., Meikle A.W. (2008). Free thyroid
hormones in serum by direct equilibrium dialysis and online solid-phase extraction-liquid
chromatography/tandem mass spectrometry. Clinical Chemistry 54, 642-651.
28