Woord vooraf

Woord vooraf
Graag zou ik van deze pagina gebruik maken om iedereen die mij geholpen heeft bij
het voltooien van deze studies en de realisatie van deze thesis te bedanken.
Eerst en vooral wil ik mijn ouders bedanken voor de steun, zowel financieel als
moreel, gedurende mijn studies in Gent, die zes jaar duurden. Zonder hun
vertrouwen in mijn persoon zou ik nooit zover gekomen zijn als waar ik nu sta.
Ik dank ook al de professoren die mij gevormd hebben gedurende deze vijf jaar
durende studie. De gedrevenheid, oprechtheid en de energie van sommigen dwingen
respect af en lieten een grote indruk op mij na.
Voor het realiseren van dit eindwerk wil ik mijn promotor Prof. dr. ir. Stefaan
Werbrouck bedanken. Zowel omdat ik een thesis kon schrijven over een actueel
onderwerp, als voor de tips, de begeleiding en de ideeën die mij hielpen dit eindwerk
te realiseren evenals voor het begrip en geduld dat hij voor mij kon opbrengen.
Een extra woord van dank gaat uit naar dr. ir. Els Palmans voor het grondige nazicht,
de tips voor de lay-out van deze thesis en de steun die ik van haar kreeg.
Verder dank ik ook de andere leden van mijn leescommissie: Prof. dr. ir. Geert
Haesaert en Prof. dr. ir. Omer Mekers.
Verder zou ik ook nog graag een woordje van dank willen wijden aan mijn vrienden
die mij geholpen hebben het verlies van Dieter te verwerken.
Ook mijn LILA –vrienden en de vrienden van Student Aid wil ik bedanken voor hun
steun en de gedenkwaardige momenten die ze mij schonken. In deze verenigingen
heb ik gedurende deze vijf jaar het meeste geleerd over samenwerken met andere
mensen en wat échte vriendschap betekent.
En last but not least, wil ik mijn vriend, Stefaan, bedanken voor de nuttige tips en de
hulp bij het realiseren van dit eindwerk.
Van Den Hoeven Karen
Werken, september 2003
Inhoudsopgave
Woord vooraf ........................................................................................................................... 1
Inhoudsopgave ......................................................................................................................... 2
DEEL 1: LITERATUURSTUDIE
HOOFDSTUK 1: DE PETUNIA ................................................................................. 9
1.1 INLEIDING .......................................................................................................... 9
1.2 HERKOMST EN HUIDIGE RASSEN ................................................................ 10
1.3 BOTANISCHE BESCHRIJVING ....................................................................... 11
1.4 DE TEELT VAN PETUNIA ................................................................................ 11
HOOFDSTUK 2: AGROBACTERIUM TUMEFACIENS .......................................... 12
2.1 INLEIDING ........................................................................................................ 12
2.1.1 HET WERKINGSMECHANISME VAN DE BACTERIE .................................. 14
2.1.2 HET INFECTIEPROCES ................................................................................ 15
2.1.3 HET GEBRUIK VAN A. TUMEFACIENS BIJ DE TRANSFORMATIE VAN
PLANTEN ....................................................................................................... 18
2.2 DE SELECTIE VAN TRANSFORMANTEN ....................................................... 20
2.3 LEAF DISK TRANSFORMATIE ........................................................................ 24
HOOFDSTUK 3: CYTOKININEN EN DE ONTWIKKELING VAN PLANTEN.......... 25
3.1 INLEIDING ........................................................................................................ 25
3.2 ENKELE CYTOKININEN .................................................................................. 26
3.2.1 KINETINE ...................................................................................................... 26
3.2.2 ZEATINE ........................................................................................................ 26
3.2.3 BENZYLADENINE (BA) ................................................................................ 27
3.3 ROL VAN CYTOKININEN BIJ DE CELDELING ............................................... 27
3.3.1 INLEIDING ..................................................................................................... 27
3.3.2 CELCYCLUS ................................................................................................. 28
3.3.3 INVLOED VAN DE CYTOKININEN OP DE S-FASE ...................................... 30
3.4 ROL VAN CYTOKININEN IN DE PLANTENONTWIKKELING ......................... 32
3.4.1 KIEMING BIJ ZADEN .................................................................................... 32
3.4.2 DE NOVO SCHEUTVORMING ...................................................................... 32
3.4.3 DOORSCHIETEN VAN KNOPPEN BIJ APICALE DOMINANTIE ................. 34
3.4.4 UITZETTING VAN DE BLADEREN ............................................................... 35
3.4.5 GENERATIEVE ONTWIKKELING ................................................................. 36
3.4.6 HET UITSTELLEN VAN DE SENESCENTIE ................................................. 36
HOOFDSTUK 4: METABOLISME VAN CYTOKININEN........................................ 39
4.1 INLEIDING ........................................................................................................ 39
4.2 CHEMISCHE DIVERSITEIT VAN DE METABOLIETEN VAN CYTOKININEN . 40
4.2.1 MODIFICATIE VAN DE PURINERING .......................................................... 40
4.2.2 MODIFICATIE VAN DE ZIJKETEN ............................................................... 42
4.3 METABOLISCHE VERSCHILLEN TUSSEN PLANTENSOORTEN ................. 43
4.4 VERSCHILLEN TUSSEN PLANTENDELEN .................................................... 43
4.5 VARIATIES GEDURENDE DE ONTWIKKELING ............................................. 43
4.6 SYNTHESE VAN CYTOKININEN ..................................................................... 44
HOOFDSTUK 5: TRANSGENE PLANTEN EN WERKING CYTOKININEN ........... 46
5.1 INLEIDING ........................................................................................................ 46
5.2 ENKELE PLANTEN GETRANSFORMEERD MET HET IPT-GEN .................... 50
5.2.1 NICOTIANA TABACCUM (TABAKSPLANT) ................................................ 50
5.2.2 SOLANUM TUBEROSUM (AARDAPPEL) .................................................... 52
5.2.3 ARABIDOPSIS THALIANA ........................................................................... 52
5.3 COMPLICATIES BIJ TRANSFORMATIE MET IPT–GEN ................................. 47
5.3.1 VERWERVEN VAN IPT-GEN ........................................................................ 47
5.3.2 TRANSFORMATIE MET HET IPT–GEN ........................................................ 48
5.4 GEVOLGEN VAN HET INBOUWEN VAN EEN IPT–GEN ................................ 48
DEEL 2: ALGEMENE MATERIALEN EN METHODEN
HOOFDSTUK 6: ALGEMENE MATERIALEN EN METHODEN ............................. 54
6.1 HET PLANTENMATERIAAL ............................................................................ 54
6.1.1 INLEIDING ..................................................................................................... 54
6.1.2 STERILISATIE VAN PETUNIA-ZADEN ......................................................... 54
6.1.3. ONTWIKKELING VAN DE PETUNIA-ZADEN .............................................. 54
6.1.4 DE IN VITRO STOCK VAN PETUNIA............................................................ 54
6.2 AGROBACTERIUM TUMEFACIENS ................................................................ 55
6.2.1 DE AGROBACTERIUM-CONSTRUCTEN ..................................................... 55
6.2.2 EEN BACTERIECULTUUR VAN AGROBACTERIUM CREËREN IN
VLOEIBAAR MEDIUM ................................................................................... 57
6.3. LEAF DISK TRANSFORMATIE ....................................................................... 57
6.3.1 DE BLADSCHIJFJES .................................................................................... 57
6.3.2 DE INFECTIE ................................................................................................. 57
6.3.3 DE CO-CULTIVATIE ...................................................................................... 58
6.3.4 DE SELECTIE ................................................................................................ 58
6.3.5 DE REGENERATIE........................................................................................ 58
6.4. BESCHRIJVING VAN DE GEBRUIKTE MEDIA .............................................. 59
6.3.1 HET GENERAL STOCK MEDIUM ................................................................. 59
6.3.2 HET YEB-MEDIUM ........................................................................................ 60
6.3.3 HET VLOEIBAAR EN VAST CALLUS-INDUCEREND MEDIUM................... 61
6.3.4 HET VAST SCHEUT-INDUCEREND MEDIUM .............................................. 62
DEEL 3: EXPERIMENTEN
HOOFDSTUK 7: EXPERIMENTEN: TRANSFORMATIE VAN PETUNIA MET HET
IPT-GEN ..................................................................................... 64
7.1 TRANSFORMATIEPROEF I ............................................................................. 64
7.1.1 DOEL ............................................................................................................. 64
7.1.2 PROEFOPZET ............................................................................................... 64
7.1.3 RESULTATEN ............................................................................................... 64
7.1.4 BESLUIT ........................................................................................................ 64
7.2 TRANSFORMATIEPROEF II ............................................................................ 65
7.2.1 DOEL ............................................................................................................. 65
7.2.2 PROEFOPZET ............................................................................................... 65
7.2.3 RESULTATEN ............................................................................................... 66
7.2.4 BESLUIT ........................................................................................................ 66
7.3 TRANSFORMATIEPROEF III ........................................................................... 67
7.3.1 DOEL ............................................................................................................. 67
7.3.2 PROEFOPZET ............................................................................................... 67
7.3.3 RESULTATEN ............................................................................................... 67
7.3.4 BESLUIT ........................................................................................................ 68
Inleiding
Deel 1: literatuurstudie
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
8
Agrobacterium tumefaciens
Hoofdstuk 1:
De Petunia
1.1 INLEIDING
Nederlandse naam: Petunia (figuur 1)
Wetenschappelijke naam: Petunia sp.
Familia: Solanaceae
Classis: Dicotyledonas
Phylum: Angiospermae
Regnum: Plantae
Figuur 1: De Petunia (Wilson, 2003).
De Petunia is een zeer populaire, rijkbloeiende, éénjarige plant voor tuinen en bakken. Ze zijn
bekend voor hun opvallende kleurenpatronen. Slechts weinig andere plantensoorten kunnen
Petunia evenaren als het gaat om hun kleuren (contrasterende kleuren, gestreept…), het
gemak waarmee petunia’s groeien en hun verschillende toepassingen in de tuin. De bloemen
hebben een trompetvorm en randen met franjes.
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
9
Agrobacterium tumefaciens
1.2 HERKOMST EN HUIDIGE RASSEN
De wilde petunia’s zijn afkomstig uit Brazilië en Argentinië. Er zijn twee wilde types, namelijk de
Petunia axillaris en de Petunia violacea, waaruit de huidige Petunia-hybriden zijn ontstaan door
jarenlange veredeling. In de negentiende eeuw werd de Petunia in Europa geïmporteerd
(Bertelsmann, 1990).
Een groot aantal cultuurvormen zijn vertegenwoordigd, deze worden naar toepassingsgebied
en uiterlijke kenmerken gegroepeerd. Meestal wordt gebruik gemaakt van F1–hybride rassen
omdat deze een grote verbetering vertonen wat betreft bloeirijkdom, groeiwijze en
weersbestendigheid. Aangezien petunia’s gevoelig zijn voor wind en regen (Herwig, 1995) zijn
dit belangrijke voordelen van de F1–hybride rassen.
Een uiterlijk kenmerk waarnaar de Petunia vaak wordt onderverdeeld is de bloem. Zo zijn er de
Multiflora (de kleinbloemige) (figuur 2), de Grandiflora (de grootbloemige) (figuur 3) en de
gevuldbloemige. De kleinbloemige hebben het voordeel dat ze sterk zijn, dit in tegenstelling tot
de gevuldbloemige (Herwig, 1995). Verder bestaan ook nog de Milliflora, dit zijn petunia’s met
een bloemdiameter van 2.5 cm of kleiner (Heyssayon, 1999). In Japan werd de hangpetunia
ontwikkeld die in de handel verkocht wordt onder de groepsnaam Surfina (Oudshoorn, 1995)
(figuur 4).
Figuur 2: Petunia (Multiflora)
Figuur 3: Petunia Grandiflora
'Strawberry Sundae'
'Prism Pale Burgundy Vein'
(Nobilis, 2001).
(Nobilis, 2001).
Figuur 4: Surfina (Easy, 2003).
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
10
Agrobacterium tumefaciens
1.3 BOTANISCHE BESCHRIJVING
De Petunia is een dicotyle plant. De stengels zijn zwak en hebben zittende, gaafrandige
bladeren. De bloemen zijn okselstandig of eindstandig, ze zijn tweeslachtig en spiraalsgewijs
symmetrisch ingeplant. Deze bloemen bezitten vijf vergroeide sepalen (kroonbladeren) en
vijf
petalen
(kelkbladeren)
die
aan
de
voet
vergroeid
zijn.
De
mannelijke
voortplantingsstructuur bestaat uit vijf op de kroonbuis ingeplante meeldraden. De
vrouwelijke voortplantingsstructuur bestaat uit een stamper met stijl. Het vruchtbeginsel is
bovenstandig en
tweehokkig. De vrucht is een doosvrucht voorzien van talrijke zaden
(Nobilis, 2001).
1.4 DE TEELT VAN PETUNIA
Met uitzondering van de Surfina types, die vermeerderd worden via stek, worden alle
petunia’s vermeerderd door middel van zaden. Uitzaaien kan ofwel onder glas gebeuren
(vanaf februari) ofwel rechtstreeks op de definitieve groeiplaats (vanaf mei). Petunia’s
gezaaid onder glas moeten steeds worden afgehard voor ze een plaats in de tuin krijgen. De
meest geschikte groeiplaats voor petunia’s is een humusrijke, voedselrijke plaats die goed
waterdoorlaatbaar is om stagnerend water te vermijden.
De bloei begint rond juli en houdt aan tot in de herfst. De bloei kan gerekt worden door
vloeibare meststof toe te dienen en uitgebloeide bloemen te verwijderen zodat de negatieve
invloed van zaadzetting op de verdere bloei wordt vermeden (Bertelsmann, 1990).
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
11
Agrobacterium tumefaciens
Hoofdstuk 2:
Agrobacterium tumefaciens
2.1 INLEIDING
Agrobacterium tumefaciens is een bodembacterie die de ‘crown gall’ ziekte veroorzaakt bij
dicotyle planten (figuur 5). Vooral Rosaceae zoals bijvoorbeeld appel, peer, perzik, kriek,
amandel, framboos en rozen zijn gevoelig. A. tumefaciens is een gramnegatieve,
staafvormige bacterie die geen sporen vormt. Ze zijn sterk verwant aan Rhizobium. Deze
bacterie vormt wortelknobbels op klaver en andere Leguminosae waarin nitraat wordt
gefixeerd. A. tumefaciens wordt gegroepeerd naargelang de genen die gelegen zijn op hun
plasmiden (cirkelvormig DNA).
Figuur 5 : Verloop van de Crown gall ziekte (Brown, 2001).
De ‘Crown gall’ ziekte heeft zijn naam gekregen door de grote zwellingen gelijkend op
tumoren, die verschijnen op de wortelhals van de geïnfecteerde plant (figuur 6; figuur 7).
Alhoewel het de marktwaarde van de planten doet afnemen, is deze ziekte eigenlijk niet erg
schadelijk voor oudere planten. A. tumefaciens brengt een deel van zijn DNA in de plant. Dit
DNA veroorzaakt dan de productie van tumoren en de daarmee geassocieerde
veranderingen in het metabolisme van de plant (Haberer and Kieber, 2002).
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
12
Agrobacterium tumefaciens
Figuur 6: Crown gall tumor op een tomatenplant (Haberer and Kieber, 2002).
De unieke werkwijze van A. tumefaciens wordt gebruikt als hulpmiddel in de
plantenveredeling. Elk gewenst gen, zoals bijvoorbeeld toxische genen voor insecten of
herbicidenresistente genen, kan in het plasmide-DNA van deze bacterie en daaropvolgend in
het genoom van de plant worden ingebouwd. Dankzij het gebruik van A. tumefaciens wordt
niet alleen het veredelingsproces van een plant versneld, het laat ook toe om genen die niet
afkomstig zijn van planten in een landbouwgewas in te bouwen.
Hieronder wordt dieper ingegaan op de volgende drie aspecten:
 het werkingsmechanisme van de bacterie
 het infectieproces
 het gebruik van A. tumefaciens in de genetica
Figuur 7: Crown gall tumoren op een pruimentak (Nameth and Chatfield, 2003).
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
13
Agrobacterium tumefaciens
2.1.1 Het werkingsmechanisme van de bacterie
De mogelijkheid van A. tumefaciens om de crown gall ziekte te veroorzaken wordt
geassocieerd met de aanwezigheid van het tumorinducerend plasmide, het T i–plasmide
(figuur 8) genaamd. Het is een groot plasmide (groter dan 200 kb) dat verschillende genen
draagt die een rol spelen in het infectieproces. Het Ti–plasmide bezit de opmerkelijke
eigenschap om, na de infectie, zich deels te integreren in het chromosomaal DNA van de
plant (figuur 9A) (Brown, 2001). Dit deel van het plasmide wordt het transfer-DNA (T-DNA)
genoemd en kan tussen de 15 kb tot 30 kb groot zijn. Het T-DNA wordt in een stabiele vorm
behouden in de plantencel en wordt doorgegeven aan de dochtercellen als een integraal
deel van het plantenchromosoom. Dit T-DNA bevat een aantal genen (ongeveer acht) dat tot
expressie komt in de plantencellen en zo verantwoordelijk is voor de tumorachtige groei van
de getransformeerde cellen (figuur 9B) (Brown, 2001).
Twee gebieden op deze Ti–plasmide zijn essentieel voor de tumorinducerende eigenschap
van A. tumefaciens, in casu de ‘Virulence’ regio, virulentie- of ‘Vir’-regio en het T-DNA. De
eerste, de ‘Vir’-regio, bevat de genen die tot expressie komen binnen de bacterie. Deze
genen zijn een voorwaarde om het T-DNA te transfereren in plantencellen en hebben tevens
een invloed op de efficiëntie van deze transfer. De tweede is het eerdervermelde T-DNA dat
geïntegreerd wordt in de gastheercel. Het T-DNA codeert voor de productie van de
plantenhormonen auxine en cytokinine. Deze zijn verantwoordelijk voor de vorming van de
tumoren en voor de synthese van opinen, een derivaat van aminozuur (Walsh, 2003). Omdat
de opines afwezig zijn in gezonde planten, zijn ze een unieke bron van voeding voor A.
tumefaciens. Een bron die andere bacteriën niet kunnen gebruiken.
Figuur 8: Het Ti-plasmide (Brown, 2001).
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
14
Agrobacterium tumefaciens
Figuur 9: A. Integratie van T-DNA in het plantengenoom
B. Expressie van de genen van het T-DNA (Brown, 2001).
2.1.2 Het infectieproces
Het infectieproces van A. tumefaciens bestaat uit vier belangrijke stappen (figuur 10):
I. Bacteriële kolonisatie
Dit is een essentiële stap voor het infectieproces en zal slechts succesvol zijn
wanneer A. tumefaciens aan het oppervlakte van de plantencel vastgehecht is.
Mutanten die zich niet vasthechten aan het plantenceloppervlak blijken hun tumorinducerend vermogen te verliezen (Bradley et al., 1997).
II. Inductie van het bacteriële virulentie systeem
De T-DNA transfer wordt geleid door producten die geproduceerd worden door de
‘Vir’-regio van het Ti–plasmide. Deze regio is opgebouwd uit minstens zes essentiële
operons (stuk DNA tussen promotor en terminator): vir A, vir B, vir C, vir D, vir E, vir
G; en twee niet-essentiële operons: vir F, vir H. Het aantal genen per operon kan
verschillen: vir A, vir G en vir F hebben slechts één gen terwijl vir D en vir B
respectievelijk vier en elf genen hebben.
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
15
Agrobacterium tumefaciens
De elementaire operonen zijn vir A en vir G. Ze coderen voor een systeem dat de
transcriptie activeert van de andere vir-genen (Luchi, 1993).
Het activeren van het vir-systeem is ook afhankelijk van externe factoren zoals de
temperatuur en de zuurtegraad. Bij temperaturen hoger dan 32°C zullen de vir-genen
niet tot expressie komen omwille van een verandering in de conformatie van vir A (Jin
et al., 1993).
III. T-DNA transfer
Een enkelstrengig (ss)T-DNA-VirD2 complex wordt vanuit de bacteriecel naar de
plantennucleus geleid. Het ssT-DNA-VirD2 complex wordt daarbij omringd door het
VirE2. Dit complex zorgt ervoor dat nucleasen, van de plant, het T-DNA niet kunnen
afbreken. VirD2 en VirE2 bevatten ‘nuclear location signals’ (NLS). VirE2 is
noodzakelijk voor het transport van het ssT-DNA-VirD2 complex voorbij het nucleair
membraan. Waarschijnlijk houden zij de nucleaire porie simultaan open. De nucleaire
import wordt waarschijnlijk ook gedreven door specifieke NLS-bindende proteïnen die
aanwezig zijn in het plantcytoplasma. Er wordt nog een ander model voorgesteld
waarbij het T-DNA covelent gebonden is met het VirD2. Het VirE2 wordt
onafhankelijk van het ssT-DNA-VirD2 complex naar de plantencel gebracht (de la
Riva et al., 1998).
IV. Integratie van het T-DNA in het plantengenoom
De laatste stap van de T-DNA transfer is zijn integratie in het plantengenoom. Er
wordt aangenomen dat dit proces onder andere voorwaarden verloopt dan een
recombinatie van DNA. Volgens dit model is slechts de paring van enkele basen
genoeg om het recombinatieproces te laten starten door VirD2 in de juiste positie te
leggen voor ligatie. Door een lage homologie tussen het 3’-einde of naburige
sequenties van het T-DNA en het DNA van de plant ontstaat een eerste contact
tussen de T-streng en het planten DNA. Hierdoor ontstaat een opening in de 3’-5’
streng van het DNA van de plant. Vervolgens wordt het DNA van de plant op het 3’einde van de opening geknipt door endonucleasen en zal de eerste nucleotide van
het 5’-einde, dat verbonden is aan VirD2, paren met een nucleotide van de 5’-3’
streng van het DNA van de plant. Het overtollig deel van de 3’ streng van het T-DNA
en het overbodige DNA van de plant worden verwerkt ofwel door endonucleasen
ofwel door 3’-5’ exonucleasen. Zodra het T-DNA in de 3’-5’ streng van het DNA van
de plant is geïntegreerd volgt een torsie en wordt een ‘nick’ in de andere streng
geproduceerd. Dit activeert het herstellingsmechanisme van de plantencel zodanig
dat een complementaire streng wordt gesynthetiseerd waarbij het geïntegreerde TDNA als template wordt gebruikt (Tinland et al., 1995).
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
16
Figuur 10: Het infectieproces van A. tumefaciens (de la Riva et al., 1998).
Agrobacterium tumefaciens
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
17
Agrobacterium tumefaciens
2.1.3 Het gebruik van A. tumefaciens bij de transformatie van planten
Om nieuwe genen in een plantencel te introduceren kan het Ti–plasmide als vector gebruikt
worden. Drie grote problemen doen zich hierbij voor:
1. Het Ti–plasmide is een plasmide van + 200 kb groot waardoor de manipulatie van de
plasmide bemoeilijkt wordt.
2. Wanneer A. tumefaciens een plant infecteert, worden enkel de aangetaste
plantencellen getransformeerd, het doel is echter een transgene plant te produceren.
3. Bij een infectie door A. tumefaciens wordt een kankergezwel gevormd, dit is niet
gewenst in een getransformeerde plant.
Om een recombinant DNA-molecule te construeren zal het Ti–plasmide geknipt en weer
geplakt moeten worden. Dit gebeurt respectievelijk door restrictie-endonucleasen en ligasen
die knippen en plakken op specifieke plaatsen, ‘restriction sites’ genaamd. Aangezien het T i–
plasmide + 200 kb groot is zijn er meerdere restriction sites. Nieuwe strategieën zijn
ontwikkeld om nieuw DNA in het Ti–plasmide te introduceren
zoals de binaire vector
strategie en de co-integratie strategie.
Het T-DNA hoeft niet noodzakelijk fysisch verbonden te zijn met het Ti–plasmide, dit is het
basisprincipe van de binaire vector strategie (figuur 11). Het T-DNA plasmide is klein genoeg
om een unieke restriction site te bezitten.
Figuur 11: Binaire vector strategie (Brown, 2001).
Bij de co-integratie strategie (figuur 12) wordt een nieuw plasmide gebruikt, bijvoorbeeld een
plasmide afgeleid van een Escherichia coli plasmide, dat een klein stukje van het T-DNA
draagt. Wanneer dit plasmide en het Ti–plasmide in dezelfde A. tumefaciens cel aanwezig
zijn, zal het nieuwe plasmide door recombinatie integreren in het Ti–plasmide (Brown, 2001).
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
18
Agrobacterium tumefaciens
Figuur 12: De co-integratie strategie (Brown, 2001).
Transgene planten kunnen op verschillende manieren worden ontwikkeld, bijvoorbeeld door
plantencelculturen te infecteren in plaats van de volwassen plant (figuur 13). Wanneer de
celwanden opnieuw worden gevormd kunnen ze behandeld worden zoals micro-organismen.
Is er een selectiemerkergen in het T-DNA ingebouwd dan kunnen de transformanten
geselecteerd worden door ze op een selectief medium te enten. Een volwassen plant die
geregenereerd is uit getransformeerde cellen zal het gekloonde gen in iedere cel dragen en
zal dit gen doorgeven aan zijn nakomelingen (Brown, 2001).
Om het kankergezwel te voorkomen moet het Ti–plasmide ‘ontwapend’ worden, dit is
mogelijk omdat de kankergenen geen rol spelen in het infectieproces. Noodzakelijk bij het
infectieproces is wel de virulentieregio. Daarnaast speelt ook een deel van het T-DNA een
rol, de uiteinden worden de ‘left border’ en ‘right border’ genoemd en bestaan uit herhaalde
sequenties van 25bp lengte. Gelijk welk DNA geplaatst tussen deze twee borders zal
aanzien worden als T-DNA en geïntegreerd worden in het DNA van de plant (Brown, 2001).
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
19
Agrobacterium tumefaciens
Figuur 13: Productie van een transgene plant (Brown, 2001).
2.2. DE SELECTIE VAN TRANSFORMANTEN
Wanneer plantencellen getransformeerd werden door A. tumefaciens is er een selectie
nodig. De niet-getransformeerde plantencellen kunnen namelijk resulteren in misleidende
besluiten en dit moet vermeden worden. Hiervoor wordt gebruik gemaakt, hetzij van de
zogenaamde selectiegenen, hetzij van de merker- of reportergenen. De expressieproducten
van deze genen maken het mogelijk om transformanten te selecteren. De selectiegenen die
gebruikt worden kunnen aanleiding geven tot een negatief en een positief selectiesysteem.
2.2.1 De selectiesystemen
 Negatief selectiesysteem
Bij het negatief selectiesysteem worden de niet-getransformeerde plantencellen vernietigd,
meestal met een herbicide of antibioticum. In getransformeerde planten wordt dan ook een
herbicide- of antibiotiaresistentiegen ingebouwd.
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
20
Agrobacterium tumefaciens
Een veel gebruikt herbicideresistentiegen is het Bastaresistentiegen. Door deze laatste wordt
de plant ongevoelig voor glufosinaatammonium (ook glufosinaat of Basta® genoemd). Dit is
een contactherbicide dat uit Streptomyces, een schimmel, geïsoleerd wordt. Basta® is een
product dat de werking van glutaminesynthetase, een enzym, inhibeert. Glutaminesynthetase maakt de synthese van glutaminen mogelijk en de detoxificatie van ammoniak.
Planten behandeld met Basta® vertonen een daling van het gehalte glutaminen en een
stijging van het ammoniakgehalte. De plant zal afsterven, enerzijds door het feit dat
glutamine een uitgangsproduct is voor de verdere organische stikstofverbindingen in de
plant; anderzijds door het feit dat ammoniak toxisch is voor de stofwisseling.
In Streptomyces hygroscopicus werd een gen, bar-gen genoemd, aangetroffen dat de
werking van het glufosinaatammonium teniet doet. Het bar-gen kan worden geïsoleerd en
ingebouwd in het genoom van verschillende planten. Deze planten zijn dus niet langer
gevoelig voor Basta® (Werbrouck, 2001). In tabel 1 zijn een aantal selectiegenen
weergegeven die voor de selectie van transformanten gebruikt worden.
Tabel 1 : Een overzicht van enkele herbicideresistentiegenen (Werbrouck, 2001).
Naam van het gen
Afkorting
Resistentie
Fosfinotrycine acetyltransferase
Bar
Basta
Nitrilase
Bxn
Bromoxynil
Een veel gebruikt antibioticaresistentiegen is het nptII-gen. Het gen codeert voor neomycine
fosfotransferase en verleent een plant resistentie tegen antibiotica van het aminoglycosidetype zoals kanamycine, neomycine en geneticine. De werking van deze antibiotica berust op
hetzelfde principe als dat van kanamycine. Een kanamycinemolecule zal binden op
ribosomale subeenheden, waardoor ze de eiwitsynthese onmogelijk maakt. Deze
kanamycinemolecule draagt een hydroxylgroep dat door neomycine fosfotransferase wordt
vervangen door een fosfaatgroep. Hierdoor verandert de structuur en de lading van het
kanamycinemolecule waardoor het niet langer meer kan binden op de ribosomen en de
eiwitsynthese
toch
kan
doorgaan
(Kors,
2000).
Een
overzicht
van
een
aantal
antibioticaresistentiegenen wordt in tabel 2 weergegeven.
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
21
Agrobacterium tumefaciens
Tabel 2: Een overzicht van enkele antibioticaresistentiegenen (Werbrouck, 2001).
Naam van het gen
Afkorting
Resistentie
Neomycine fosfotransferase II
NptII
kanamycine
Chloramfenicol acetyltransferase
Cat
chloramfenical
Hygromycine fosfotransferase
Hpt
hygromycine
Dihydrofolaat reductase
Dhf
methotrexaat
Het nadeel van dit selectiesysteem is tweevoudig; als eerste de ‘ontsnappers’, vervolgens de
niet-getransformeerde cellen die afsterven. De ‘ontsnappers’ zijn niet-getransformeerde
plantencellen die de selectie toch overleven. Dit is mogelijk omdat sommige plantensoorten
een natuurlijke resistentie vertonen tegen sommige antibiotica en (of) herbiciden. De nietgetransformeerde cellen overleven de selectie niet, hierdoor kan het gebeuren dat de
getransformeerde cellen niet generen. Dit is te verklaren omdat de stervende plantencellen
groei-inhibitoren en toxische stoffen produceren (Penna et al., 2002).
 Positief selectiesysteem
Omwille van de nadelen van het negatief selectiesysteem werden positieve ontwikkeld. Bij
deze laatste zullen de niet-getransformeerde plantencellen niet afsterven, waardoor er geen
toxische stoffen meer vrijkomen. Ook het toevoegen van antibiotica of herbiciden wordt
vermeden. De getransformeerde plantencellen hebben een metabolisch voordeel ten
opzichte van de niet-getransformeerde.
Als voorbeeld wordt ß-glucuronidase aangedragen. Het gusA-gen codeert voor ßglucuronidase. Dit gen werd uit Escherichia coli geïsoleerd in 1986 door de onderzoeksploeg
van Jefferson. De inactieve substantie benzyladenine-glucuronide kan alleen door de
getransformeerde plantencellen gehydroliseerd worden waardoor benzyladenine (BA)
vrijkomt. De niet-getransformeerde cellen kunnen deze inactieve stof niet hydroliseren
waardoor ze ook niet kunnen regenereren. Het gusA-gen kan ook als reportergen toegepast
worden voor het bepalen van de genactiviteit, dit is een bijkomend voordeel.
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
22
Agrobacterium tumefaciens
2.2.2 De merker- of reportergenen
Dit is een derde manier om een selectie uit te voeren. De expressieproducten van deze
merker- of reportergenen verlenen aan de transformanten een specifiek genotype dat
gemakkelijk te herkennen is. Voorbeelden hiervan zijn het gusA-gen, het luciferase-gen en
het Green Fluorescent Protein-gene of GFP-gen.
Het gusA-gen is een effectief en veel gebruikt merkergen. De werking van het gusA-gen
werd hierboven reeds beschreven. Het enige maar ook grote nadeel van dit gen is dat de
detectiemethoden, bijvoorbeeld fluometrische analyse, destructief zijn: het onderzochte
weefsel is dus niet meer bruikbaar voor verder onderzoek. De detectiemethoden aangewend
bij gebruik van het luciferase-gen en het GFP-gen, zijn niet destructief vandaar dat zij de
voorkeur verdienen.
Het luciferase-gen is aanwezig in Photinus pyralis, het vuurvliegje. Dit gen katalyseert de
oxidatie van D-luciferine in aanwezigheid van adenosinetrifosfaat (ATP) en Mg2+, om zo
oxyluciferine te produceren. Deze stof zendt het typisch groengele licht van de vuurvliegjes
uit. Zowel in een extract van transgene als levende planten kan de activiteit van luciferase
zichtbaar gemaakt worden. In levende planten worden luciferine-esters gebruikt die in staat
zijn om het plasmamembraan te doorkruisen. Eénmaal in de cel worden ze door endogene
esterasen omgezet in luciferine. Dit zwakke licht kan gedetecteerd worden door een
gevoelige film of met een videocamera (Werbrouck, 2001).
Het GFP-gen wordt geïsoleerd uit Aequorea victoria, een soort kwal. Het GFP is een eiwit.
De fluorofoor, het deel van het eiwit dat licht geeft, wordt beschermd door de rest van het
eiwit (figuur 14). Wanneer getransformeerde plantencellen bestraald worden door licht met
een lage golflengte, bijvoorbeeld Ultra Violet licht (UV-licht), zal het GFP die energie
omzetten in licht met een lagere golflengte namelijk groen licht (Goossens, 2002).
Figuur 14: Green Fluorescent Protein (Tepper, 2003).
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
23
Agrobacterium tumefaciens
2.3 LEAF DISK TRANSFORMATIE
De leaf disk transformatie is gebaseerd op A.tumefaciens. Door de aard en de werking van
deze bodembacterie zijn er bepaalde limieten. Zo kan A. tumefaciens dicotyle planten
infecteren, monocotyle planten komen zelden in aanmerking voor de transformatie met deze
bacterie.
Een steriele plant wordt versneden. De explantaten worden blootgesteld aan een oplossing
van A. tumefaciens, een bacteriesuspensie genaamd. Op die manier worden de explantaten
geïnfecteerd. Wanneer in het T-DNA tussen de left en right border van het Ti–plasmide van
A. tumefaciens een bepaald gen ingebouwd wordt, zal dat gen in het genoom van de
explantaten worden opgenomen. Een cel die getransformeerd wordt, zal verschillende keren
delen en zo een ongedifferentieerd callus produceren. Wanneer dit callusweefsel op een
scheutinducerend medium wordt geënt, zullen getransformeerde cellen zich organiseren tot
een scheut. Wanneer de scheut groot genoeg is, kan deze overgelegd worden op een
wortelinducerend medium.Hieruit ontstaat dan een transgene plant. Wanneer de gevolgen
van het ingebouwde gen bestudeerd worden, moeten de zaden van de transgene plant, die
in vitro werd ontwikkeld, nog uitgezaaid worden in volle grond en pas bij deze nakomeling
kunnen de gevolgen van het ingebouwde gen bestudeerd worden. Er mogen geen besluiten
getrokken worden uit de resultaten van de planten die in vitro werden ontwikkeld. De
omstandigheden in vitro zijn niet natuurlijk en kunnen de ontwikkeling van de plant reeds
beïnvloeden (Werbrouck, 2001).
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
24
Cytokininen en de ontwikkeling van planten
Hoofdstuk 3:
Cytokininen en de ontwikkeling van planten
3.1 INLEIDING
Volgens Van Dale (2003) is cytokinine een plantaardige groeistof. De naam ‘cytokinine’ is
eigenlijk gebaseerd op hun meest uitgesproken eigenschap. Ze stimuleren, in vitro, de
celdeling van plantenweefsel: cyto = cel en kinine = beweging.
Ofschoon cytokininen gedefinieerd zijn als celdelingsfactoren (Skoog et al., 1965 en Miller
et al., 1955), beïnvloeden zij een groot aantal belangrijke biologische processen. Tal van
onderzoeken hebben aangetoond dat cytokininen een rol spelen gedurende de
ontwikkeling van planten, van de ontkieming van zaden tot het afsterven van de plant.
Naast cytokininen bestaan er ook nog andere klassen van plantenhormonen, die ontdekt
en bestudeerd zijn zoals de auxinen, giberelinen, abscisinezuur (ABA) en ethyleen
(Anderson, 1999). Samen staan zij in voor de ontwikkeling van planten, ze kunnen elkaar
hierbij versterken (bijvoorbeeld auxine, gibereline en cytokinine stellen de bladsenescentie
uit) of elkaar tegenwerken (bijvoorbeeld ethyleen bevordert de bladsenescentie) (Thimann,
1992). Ook externe factoren zoals licht en temperatuur spelen een belangrijke rol in het
groeiproces van planten. Een beschrijving van al deze factoren zou het doel van deze
thesis voorbijstreven. Daarom wordt in dit hoofdstuk na een korte bespreking van enkele
cytokininen een beknopt overzicht gegeven van de rol van cytokininen bij de regulatie van
de celdeling, bij het ontkiemingproces van zaden, bij de de novo knopvorming, bij het
schieten van knoppen, bij apicale dominantie, bij de expansie van bladeren, bij de
generatieve ontwikkeling en bij het uitstellen van de senescentie.
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
25
Cytokininen en de ontwikkeling van planten
3.2 ENKELE CYTOKININEN
3.2.1 Kinetine
Kinetine (figuur 15) is het eerste cytokinine en werd geïsoleerd uit het sperma van de
haring. De naam werd gekozen omdat kinetine in staat is om de cytokinese te stimuleren
(Miller et al., 1955). Ondanks het feit dat kinetine fysisch opvallend aanwezig is binnen de
plant, kon het niet geïsoleerd worden uit een plantencel (Von Sengbusch, 2002), wel kan
het gevormd worden uit gedegradeerde DNA producten (Hall and deRopp, 1955).
Hoe kinetine juist werkt moet nog onderzocht worden. Wel tonen onderzoeken aan dat
kinetine betrokken is bij signaaltransductie. Het gedraagt zich tevens als een natuurlijke
antioxidant (Rattan, 2003).
Figuur 15: N6-Furfuryladenine (kinetine)(Rattan, 2003).
3.2.2 Zeatine
Het eerste cytokinine dat werd geïsoleerd uit een plantaardige bron, namelijk uit maïs, was
zeatine (figuur 16) (Miller, 1961). Letham (1963) publiceerde bijna gelijktijdig een rapport
over zeatine waarin enerzijds haar rol in de celdeling en anderzijds ook haar chemische
eigenschappen werden beschreven. Sinds deze ontdekking werden er nog veel meer
cytokininen in planten gevonden en geïsoleerd. Cytokinine is een component dat voorkomt
in alle plantensoorten onder verschillende geconjugeerde vormen (zoals base, ribose,
nucleoside) (Kamiya, 2003).
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
26
Cytokininen en de ontwikkeling van planten
Figuur 16: (E)-2-methyl-4-(1H-purin-6-ylamino)-2-buten-1-ol (zeatine) (Wood, 2003).
3.2.3 Benzyladenine (BA)
BA (figuur 17) is, net zoals alle andere cytokininen, een adeninederivaat. Net zoals de
andere cytokininen heeft ook BA een invloed op de celdeling.
Figuur 17: N-(fenylmethyl)-1H-purin-6-amine (benzyladenine) (Wood, 2003).
3.3 ROL VAN CYTOKININEN BIJ DE CELDELING
3.3.1 Inleiding
Cytokininen stimuleren de celdeling van plantenweefsel en spelen een essentiële rol in de
organogenese waardoor ze van groot belang zijn voor de ontwikkeling van de
commerciële micropropagatie en de moderne plantenbiotechnologie. Daarenboven
worden cytokininen teruggevonden in alle hogere planten, mossen, fungi, bacteria en in
dierencellen.
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
27
Cytokininen en de ontwikkeling van planten
De concentraties van cytokininen zijn het hoogst in meristeem weefsel van groeiende
plantendelen (wortels, jonge bladeren, vruchten en zaden) (Kamiya, 2003).
3.3.2 Celcyclus
De celcyclus (figuur 18), die het delingsproces van twee cellen weergeeft, bestaat uit twee
fasen: de interfase en de mitose.
Figuur 18: De celcyclus (Steinberg, 2000).
Tijdens de interfase (figuur 19) synthetiseert de cel constant RNA en proteïnen. De cel
wordt groter. De interfase wordt onderverdeeld in vier stappen (Sullivan, 2002):
1. G0: Wanneer een cel de celcyclus verlaat en stopt met delen, gebeurt dit in deze
fase. Het kan ook een tijdelijke rustperiode zijn.
2. G1: De cel groeit en produceert RNA en synthetiseert proteïnen. Alles wordt
klaargemaakt voor de DNA synthese.
3. S: DNA replicatie vindt plaats.
4. G2: De cel groeit verder en nieuwe proteïnen worden aangemaakt. Op het einde
van deze fase is er een controlepunt.
Figuur 19: De interfase (Anonymous, 2003a).
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
28
Cytokininen en de ontwikkeling van planten
In de mitose wordt het gesynthetiseerd DNA verspreid over twee cellen en treedt de
eigenlijke celdeling op. Deze fase wordt opgesplitst in vier stadia (Anonymous,
2003a):
1. profase: Tijdens deze fase verdwijnt de kernwand. Twee centriolenparen migreren
naar de tegenovergestelde polen van een cel. Een structuur van fijne vezels
(fibrillen), de spoelfiguur, wordt gevormd (figuur 20).
2. metafase: Deze fase begint als de chromosomen het equatoriaal vlak van de cel
bereiken. De spoelfiguur is nu ontwikkeld. De centromeren van die chromosomen
worden dan met de spoeldraden verbonden. Het DNA van de centromeren
wordt intussen gedupliceerd. De chromatiden scheiden zich van elkaar en zullen
uit elkaar beginnen te bewegen (figuur 21).
3. anafase: Dit is een korte fase. Elk zusterchromatide wordt naar een verschillende
pool getrokken. De chromosomen nemen een V-vorm aan en worden nog korter
(door spiralisering). Aan het einde van de anafase begint de verdeling van het
cytoplasma (cytokinese). Bij plantencellen wordt de celplaat gevormd ter hoogte
van
het
equatoriaal
vlak
zodanig
dat
het
cytoplasma
verdeeld
wordt
(middenlamella) (figuur 21).
4. telofase: Deze fase begint zodra de dochterchromosomen bij de polen
gegroepeerd zijn. Daarna wordt de spoelfiguur onduidelijk en verdwijnt. Rondom
elke groep chromosomen vormt zich een nieuw kernmembraan en zo ontstaan
twee nieuwe kernen. Tegelijkertijd despiraliseren de chromosomen en verschijnen
de kernlichaampjes (figuur 21).
Dit is het klassieke beeld van de celcyclus en komt voor in alle cellen van het organisme.
In het actief wortel- en scheutmeristeemweefsel, in de dormante meristemen en in
geremde axillaire knoppen kunnen de cellen herbeginnen aan de celcyclus als ze de juiste
stimuli ontvangen. Wanneer de cellen gedifferentieerd zijn verlaten de plantencellen de
celcyclus definitief.
Figuur 20: De profase van de mitose (Anonymous, 2003a).
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
29
Cytokininen en de ontwikkeling van planten
Figuur 21: de metafase, anafase en telofase van de mitose (Anonymous, 2003a).
3.3.3 Invloed van de cytokininen op de S-fase
Eukaryotisch chromosomaal DNA is opgedeeld in afzonderlijke eenheden om replicatie
mogelijk te maken. Deze afzonderlijke eenheden worden replicons genoemd en bestaan
uit een startplaats voor de replicatie (origin) en twee replicatievorken die divergeren terwijl
de DNA strengen worden verdubbeld (Campbell, 1986). Niet alle replicons verdubbelen
simultaan, dit gebeurt meestal in families van replicons die opeenvolgend worden
verdubbeld gedurende de S-fase (Hand, 1978).
De duur van de S-fase wordt bepaald door de volgende drie factoren (Mok and Mok,
1994) :
1. Het aantal replicatiestartplaatsen, waardoor ook de grootte van het replicon wordt
bepaald.
2. De snelheid waarmee de replicatievork beweegt over het chromosoom.
3. De graad van synchronisatie bij de replicatie van families van replicons.
Kinetine en BA, beide cytokininen, veroorzaken een opmerkelijke verkorting van de S-fase
(tabel 3; tabel 4). De verkorting van de S-fase wordt veroorzaakt door twee verschillende
mechanismen (tabel 5):
1. Cytokininen zijn in staat om latente replicatieplaatsen te herkennen. Hierdoor
verkort de lengte van het replicon.
2. De graad van synchronisatie (Rs/Ts) neemt toe van 0,39; een normale waarde voor
planten, tot bijna totale synchronisatie, de hoogste waarde ooit gevonden in
planten (Mok and Mok, 1994).
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
30
Cytokininen en de ontwikkeling van planten
Tabel 3: De duur (uren) van de verschillende fasen van de celcyclus in worteltips van
Vicia faba en de invloed van kinetine hierop (Mok and Mok, 1994).
Behandeling
T
G1
S
G2
M
Controle
16,6
3,6
8,3
2,8
1,9
Kinetine 10-5 M
13,2
0,9
5,4
5,7
1,2
Tabel 4: De
duur
(uren)
van
de
verschillende
fasen
van
de
celcyclus
in
scheutmeristeem van Sinapsis alba en de invloed van benzyladenine (Mok and Mok,
1994).
Behandeling
T
G1
S
G2
M
Controle
66
24
15
25
2,1
BA 4,5 x 10-5 M
49
24,4
6
17,4
1,3
Tabel 5: Het effect van BA op enkele gemeten parameters van de DNA replicatie in
vegetatieve cellen van het meristematisch scheutweefsel van Sinapsis alba (Mok and
Mok, 1994).
Behandeling
Ts* (h)
R (m)
F (m/h)
Rs (h)
Rs/Ts
Control
18
15
1,05
7,14
0,39
BA
5
7,5
0,76
4,93
0,99
* Ts: De tijd nodig om het chromosomaal DNA te repliceren ook de duur van de S-fase.

R : De ‘replicon size’, gemeten van middelpunt tot middelpunt tussen één paar gelabelde
DNA-segmenten.

F : De ‘fork progression rate’ berekent uit de gemiddelde lengte van de segmenten tijdens
verschillende duren van labeling.

Rs : De tijd nodig om het DNA van een gemiddeld replicon te repliceren.

Rs/ Ts : De synchronisatie van de replicatie van replicons binnen één familie.
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
31
Cytokininen en de ontwikkeling van planten
Cytokininen hebben een grote en constante invloed op de S-fase. Zoals uit tabel 3 en 4
blijkt, hebben de cytokininen ook invloed op de andere fasen. Deze invloed is niet altijd
een constante en wordt dan ook niet verder besproken.
3.4 ROL VAN CYTOKININEN IN DE PLANTENONTWIKKELING
3.4.1 Kieming bij zaden
De invloed van cytokininen op de kieming van zaden is niet zo uitgesproken als die van
ABA en giberelinen maar wanneer de omstandigheden voor kieming suboptimaal zijn,
krijgen cytokininen wel een iets belangrijkere rol. Remming van de zaadkieming in het
donker of bij hoge temperaturen kan overwonnen worden door simultaan gebruik van
diverse cytokininen bij bepaalde genotypen, terwijl bij andere het gebruik van giberelinen
nodig is (Biddington and Thomas, 1976).
Endogeen cytokinine werd gemeten in kiemende zaden van verschillende plantensoorten.
De concentratie aan cytokininen is in het algemeen laag bij droge zaden maar neemt toe
tijdens de kieming (Martin et al., 1987). Cytokininen worden gesynthetiseerd in de embryoas van kiemende zaden en getransporteerd naar de cotylen (Nandi et al., 1988). Ook
opgeslagen proteïnen worden, door de embryo-as, getransporteerd naar de cotylen van
dicotyle planten (Revilla et al., 1988). Verder werd ontdekt dat de embryo-as kan
vervangen worden door exogene cytokininen (Pino et al., 1991). Cotylen van de
kikkererwt, die behandeld worden met een dihydrozeatine, een cytokinine, vertonen een
versnelde afbraak van proteïnen, de activiteit van carboxypeptidasen en caseïnasen
neemt toe (Pino et al., 1991). Cytokininen spelen dus een rol bij de vrijstelling van
opgeslagen proteïnen in de cotylen van dicotyle planten.
Misschien initiëren de cytokininen de kieming. Zeker is dat ze belangrijk zijn voor de groei
van zaailingen en voor de mobilisatie van opgeslagen proteïnen wanneer de kieming is
gestart.
3.4.2 De novo scheutvorming
Klassieke studies toonden aan dat cytokininen een groot effect hebben op de differentiatie
van callusweefsel in de tabaksplant (Skoog and Miller, 1957). Er is een verband tussen
cytokinine en auxine wat betreft de stimulatie van redifferentiatie van wortels en scheuten.
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
32
Cytokininen en de ontwikkeling van planten
Bij een hoge cytokinine/auxine verhouding wordt de ontwikkeling van scheuten
gestimuleerd (figuur 22; figuur 23). Bij een lage cytokinine/auxine verhouding wordt de
ontwikkeling van wortels gestimuleerd. Andere componenten zoals tyrosine of
fenylalanine, beide aminozuren, konden het aantal knoppen doen toenemen, maar de
aanwezigheid van cytokinine was onontbeerlijk (Flick et al., 1983).
Zowel in callusweefsel als in gecultiveerde plantendelen zoals bladschijven, hypocotylen
of internodiën blijkt cytokinine essentieel te zijn voor de regeneratie van knopen, hierdoor
werd organogenese mogelijk (Flick et al., 1983).
Wanneer radioactief BA als een exogeen cytokinine wordt toegevoegd aan Petunia
bladschijfjes, blijken glycosylderivaten de belangrijkste metabolieten te zijn, naast de
nucleotiden (Auer et al., 1992). Het niet vinden van ribosiden kan verklaard worden door
het hoge cytokininegehalte in het medium en dus ook in de bladschijfjes. Dit resulteert in
de vorming van producten die geglycosyleerd zijn. Deze producten worden beschouwd als
de opslagvormen van cytokininen.
In callusweefsel, waar differentiatie plaatsvindt of wanneer er adventiefknoppen gevormd
worden op gecultiveerde plantenorganen, zal slechts een klein gedeelte van de cellen
uitgroeien tot meristeemweefsel. Waarom bepaalde cellen delen en andere niet is geen
gemakkelijke vraag. Een eerste vereiste in het proces van de regeneratie is dat die cellen
die behandeld zijn de capaciteit moeten bezitten om te kunnen delen en er moet
cytokinine aanwezig zijn. Pas wanneer hieraan voldaan is, zijn andere factoren zoals de
concentratie aan cytokininen en andere hormonen van belang voor de verdere groei van
de plant.
Figuur 22: Callusweefsel van Cymbidium ensifolium
met gedifferentieerde delen (Von Sengbusch,
2002)
Figuur 23: Microscopisch preparaat van
callus-weefsel van Cymbidium ensifolium. De
vorming van meristematisch weefsel is
duidelijk te zien. De bar stelt 500m voor (Von
Sengbusch, 2002).
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
33
Cytokininen en de ontwikkeling van planten
3.4.3 Doorschieten van knoppen bij apicale dominantie
De groei van laterale knoppen wordt meestal voorkomen door een signaal van de apicale
knop. Wanneer deze laatste verwijderd wordt, worden de axillaire niet meer geremd en zal
de groei van laterale scheuten op gang komen. De rol van auxine en cytokinine in de
apicale dominantie werd het eerst gedemonstreerd bij de decaptatie van Vicia faba.
Wanneer het apicaal stompje werd behandeld met auxine ontstonden er lateraal geen
knoppen meer (Thimann and Skoog, 1964). Wanneer die dan behandeld werden met
cytokinine overwonnen deze de apicale dominantie en groeiden de knoppen toch uit
(Cline, 1991).
Er zijn verschillende pogingen gedaan om het verband tussen endogeen cytokinine en het
patroon van vertakking aan te tonen. Het beste bewijs hiervoor werd geleverd door
mutanten en transformanten. De Torosa-2 tomatenplant, die niet vertakt is, bezit een lager
cytokininegehalte
dan het
vertakte
wilde
type
(Mapelli
and
Lombardi,
1982).
Transformanten van tabaksplanten (figuur 24) en Petunia, die een hoog cytokininegehalte
hebben, door de overexpressie van het isopentenyltransferase-gen (IPT-gen), hadden
meer vertakkingen dan non-transformanten.
Het belang van cytokinine bij het doorbreken van de apicale dominantie kan ook afgeleid
worden uit het verschil aan cytokininegehalten in verschillende types van knoppen:
terminale van tomaten (Sossountzov et al., 1988) en varens (Pilate et al., 1989) bevatten
meer zeatine en ribosylzeatine in vergelijking met slapende laterale knoppen. Bovendien
geldt: hoe verder van de apicale knop hoe hogere de concentraties zijn aan zeatine en
ribosylzeatine in de laterale knoppen (Pilate et al., 1989).
De cytokininen kunnen zowel gesynthetiseerd zijn in de wortels als in de knop zelf. Het
bewijs dat cytokininen afkomstig kunnen zijn van de wortels, werd geleverd door wortels
van erwtzaailingen te behandelen met radioactief BA. Het radioactief BA werd in de
dominante knop teruggevonden (Prochazka and Jacobs, 1984).
Bij de decaptatie van aardappelscheuten, gecombineerd met een behandeling van het
apicaal stompje met auxine, wordt waargenomen dat het radioactieve cytokinine naar het
apicaal stompje getransporteerd werd. Hieruit kan afgeleid worden dat het transport van
cytokininen beïnvloed wordt door auxine. Wanneer het stompje niet behandeld werd met
auxine werden er meer radioactieve cytokininen naar de laterale knoppen getransporteerd
(Wooley and Wareing, 1972).
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
34
Cytokininen en de ontwikkeling van planten
A
B
C
Figuur 24: Vergelijking van de axillaire knoppen bij een tabaksplant van twaalf weken oud
bij Nicotiana tabaccum (tabaksplant) van het wilde type (A) en bij een mutant
van
Nicotiana tabaccum met een hoog cytokininegehalte (B en C) (Guivarc’h et al.,
2002).
3.4.4 Uitzetting van de bladeren
Dat cytokinine de uitzetting van bladeren stimuleert werd in 1956 ontdekt door Kuraishi en
Okumura. De effecten van een behandeling van cytokinine blijven echter wel beperkt tot
het behandelde blad. De uitzetting van de bladeren neemt af wanneer ook het naburige
blad behandeld wordt (Leopold and Kawase, 1964).
Dankzij analyse van cytokininen in bladeren kon een correlatie vastgesteld worden tussen
endogene cytokininen en expansie van bladeren (Ulstov et al., 1992). Hoge concentraties
van zeatine en ribosylzeatine komen eerder voor in het basaal gedeelte van de bladeren
van paprika, dit is de plaats waar de expansie van bladeren plaatsvindt, dan in de distale
delen van het blad. Oudere, volledig gevormde bladeren hebben een uniformere verdeling
van cytokininen (Ulstov et al., 1992).
Cytokininen verbeteren de ‘sink’-sterkte voor de allocatie van assimilaten. Behandelingen
met kinetine resulteerden in de verplaatsing van nutriënten van het onbehandeld gedeelte
naar het behandeld gedeelte van het tabaksblad (Ulstov et al., 1992). Eveneens leidde het
in de cotylen van radijzen (Longo et al., 1978) en watermeloenen (Norris, 1976) tot een
verhoogde osmotische concentratie.
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
35
Cytokininen en de ontwikkeling van planten
3.4.5 Generatieve ontwikkeling
Cytokininen stimuleren de bloei in verschillende soorten, maar alleen in gunstige
omstandigheden (Zeevaart, 1978). Gibereline daarentegen stimuleert de bloei, ook als de
omstandigheden eerder ongunstig zijn (Metzger, 1987).
Er bestaat een correlatie tussen bloei en endogeen cytokinine. Hoge concentraties aan
cytokinine werden vastgesteld in langedagplanten zoals Sinapsis alba (Lejeune et al.,
1988), Chenopodium (Machackova and Krekule, 1991) en Perilla frutescens (Grayling and
Hanke, 1992). In contrast hiermee staan de kortedagplanten waar een lage concentratie
aan cytokinine werd vastgesteld zoals Xanthium strumarium (Hensen and Wareing, 1974).
3.4.6 Het uitstellen van de senescentie
In 1957 werd voor de eerste keer de rol van cytokininen in verband met het uitstellen van
de senescentie gedemonstreerd. De onderdompeling van petiolen in water met kinetine
drukte duidelijk de verliezen van proteïnen en chlorofyl in vergelijking met de controle
zonder kinetine bij Xanthium blaadjes (Richmond and Lang, 1957). Bij andere
plantensoorten werden deze observaties bevestigd (figuur 25 en figuur 26), ook andere
cytokininen stelden de senescentie in de behandelde plant uit (Singh et al., 1992). Er
werden slechts enkele uitzonderingen vastgesteld.
Zo had cytokinine bij Taraxacum geen inhiberend effect op de senescentie (Fletcher and
Osborne, 1966). Senescentie kan geremd worden door cytokininen in een volledige plant,
alhoewel het effect van cytokininen op een volledige plant in het algemeen veel minder
duidelijk is dan bijvoorbeeld op losgemaakte blaadjes.
Bladsenescentie gaat samen met een daling van het endogeen cytokinine. In nonsenescente tabaksbladeren lag het cytokininegehalte twee tot acht keer hoger dan in
senescente tabaksbladeren (Singh et al., 1992).
Senescentie gaat gepaard met een verlies aan chlorofyl. Cytokininen stimuleren de
synthese van chloroplast DNA en fotosynthetische enzymen en bevorderen ook de
vorming van grana en de replicatie van chloroplasten (Van Staden et al., 1988).
Cytokininen hebben echter ook nog een invloed op een aantal andere belangrijke
processen met betrekking tot de senescentie.
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
36
Cytokininen en de ontwikkeling van planten
Tijdens de senescentie nemen het proteïnegehalte en het nucleïnezuurgehalte af (Brady,
1988). Deze daling heeft slechts invloed op het gehalte van bepaalde proteïnen, terwijl het
gehalte van andere proteïnen stabiel blijft of zelfs stijgt. De proteolytische enzymen
vertonen een hogere activiteit gedurende de senescentie. Cytokininen voorkomen deze
hogere activiteit (Legocka and Sweykowska, 1983) en doen de lipase- (Sodek and Wright,
1983) en lipoxygenase- (Grossman and Lesham, 1978) activiteit dalen. Deze zijn
betrokken bij de afbraak van membranen. Cytokininen voorkomen dus het lekken van
nutriënten en enzymen en zorgen ervoor dat de membranen niet worden afgebroken.
Senescentie gaat ook gepaard met het sluiten van de stomata. Componenten die de
sluiting van de stomata verhinderen, zoals cytokininen, verhinderen ook de senescentie
(Thimann, 1980). Als gevolg van de stomatale opening wordt de nutriëntenstroom door het
xyleem alsook het transport van cytokininen vanuit de wortels gestimuleerd.
Cytokininen stimuleren ook de biosynthese van ethyleen, één van de belangrijkste
factoren in het opwekken en bevorderen van de senescentie (Yu et al., 1981).
Dit onderstreept nogmaals de complexiteit van de interacties tussen plantenhormonen,
zowel de synergetische als de antagonistische activiteit en de invloed op elkaars
biosynthese en metabolisme.
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
37
Cytokininen en de ontwikkeling van planten
Figuur 25: Effect van gebruik van cytokininen op de blad-senescentie bij de tabaksplant
(Anonymous, 1998).
Figuur 26: Senescentie bij broccoli met verhoogde cytokininestatis (A) en een wild type (B)
(Anonymous, 2001)
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
38
Metabolisme van cytokininen
Hoofdstuk 4:
Metabolisme van cytokininen
4.1 INLEIDING
De opheldering van het metabolisme van cytokininen is grotendeels gebaseerd op het
gebruik van exogene radioactieve cytokininen bij plantenweefsel. In een plant komen
cytokininen voor in de vorm van een nucleotide, van een nucleoside of van een base.
Uiteindelijk worden deze structuren ofwel herleid naar de overeenkomstige adeninederivaten
(met onomkeerbaar verlies van hun biologische activiteit) ofwel naar hun inactieve vorm.
Adenine (figuur 27) maakt deel uit van bijvoorbeeld DNA of ATP.
Een nucleotide bestaat een een suiker (ribose of desoxyribose), een base en één, twee of
drie fosfaatgroepen (figuur 28). Een nucleoside (figuur 29) bestaat uit een suiker (ribose of
desoxyribose) en een base.
.
Figuur 27: Structuur van adenine (Anonymous, 2003b).
Figuur 28: Structuur van een nucleotide
(Anonymous, 2003c).
Figuur 29: Structuur van een nucleoside
(Anonymous, 2003d).
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
39
Metabolisme van cytokininen
4.2 CHEMISCHE DIVERSITEIT VAN DE METABOLIETEN VAN CYTOKININEN
Er bestaat een grote chemische diversiteit van de metabolieten van cytokininen die in een
plant voorkomen. Hier zullen de belangrijkste vormen besproken worden namelijk de
modificatie van de purinering en van de zijketen van een cytokinine.
4.2.1 Modificatie van de purinering (figuur 32)
4.2.1.1 Wisselwerking tussen base, riboside en nucleotide vormen
Wanneer radioactieve
cytokininen
zoals
bijvoorbeeld 3H-zeatine riboside, 3H-dihydro-
zeatine riboside… gebruikt worden bij explantaten van Arabidopsis thaliana wordt
vastgesteld dat cytokininenucleotiden de prominente metabolieten zijn, onmiddellijk gevormd
na de opname (Moffatt et al., 1991). Deze cytokininenucleotiden worden geconverteerd naar
andere cytokininen. Na 24 uur zijn de belangrijkste metabolieten adenosine, adenine en
dihydrozeatine-O-glucoside (Singh et al., 1988). Hieruit kan besloten worden dat
cytokininenucleotiden worden gevormd om de opname te vergemakkelijken, waarna ze zeer
snel worden gemetaboliseerd (Singh et al., 1988).
Aangezien
de
vorming
van
vrije
cytokininen
start
met
de
biosynthese
van
cytokininenucleotiden, is het duidelijk dat er aanzienlijk wat omzettingen mogelijk zijn van
vrije basen, ribosiden en nucleotiden.
4.2.1.2 Glycolyse
Glycolyse van cytokininen kan gebeuren op de derde, zevende en negende positie van de
purinering (figuur 30) (Letham and Palni, 1983). Deze metabolieten worden beschouwd als
detoxificerende producten (Laloue, 1977).
Figuur 30: Stuctuur van een purinering (Anonymous, 2003e) .
4.2.1.3 N-alanine derivaten
Conjugatie van cytokininen kan ook plaatsvinden met alanine op de negende positie van de
purinering (figuur 31). Alanine conjugaten zijn potentiële opslagvormen van cytokininen
(Palni et al., 1984).
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
40
Metabolisme van cytokininen
Figuur 31: Structuur van alanine (Anonymous, 2003e).
Figuur 32: Modificatie van de purinering (Mok and Mok, 1994).
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
41
Metabolisme van cytokininen
4.2.2 Modificatie van de zijketen (figuur 33)
4.2.2.1 Zijketen reductie
Wanneer zeatine en zeatineriboside gebruikt worden, vertonen de metabolieten meestal een
reductie van de zijketen. Een reductase werd geïsoleerd uit Phaseolus coccineus embryo’s
(Martin et al., 1989). Het reductase is heel specifiek voor trans-zeatine met als gevolg dat de
zijketen van cis-zeatine, zeatine riboside of isopentenyladenine niet gemodificeerd wordt.
In vitro-experimenten hebben aangetoond dat dihydroderivaten gewoonlijk geen substraten zijn
voor de cytokinine oxidatie, vandaar dat de reductie van de zijketen de structurele stabiliteit
bevordert (Mol and Mok, 1994).
4.2.2.2 Scheiden van de zijketens
Het exogeen isopentenyladenine ondergaat een oxidatieve scheiding van de zijketen. Dit
resulteert in een onomkeerbaar verlies van de cytokinine activiteit.
Figuur 33: Modificatie van de zijketen (Mok and Mok, 1994).
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
42
Metabolisme van cytokininen
4.3 METABOLISCHE VERSCHILLEN TUSSEN PLANTENSOORTEN
De metabolische wegen van cytokininen in planten zijn zeer complex. Tussen plantensoorten
kunnen er verschillen bestaan in deze metabolische weg, zelfs tussen plantendelen van
eenzelfde plant zijn verschillen mogelijk.
Bij sommige planten blijft het metabolisme hetzelfde, onafhankelijk van het toegevoegd
cytokinine. Bij andere soorten is het metabolisme wel afhankelijk van het gebruikt cytokinine.
Deze variatie wordt geïllustreerd wanneer zaailingen van radijs vergeleken worden met
primaire bladeren van Phaseolus vulgaris. Zeatine, dihydrozeatine en isopentenyladenine
toegevoegd aan zaailingen van radijs worden gemetaboliseerd tot 7-glucoside. Ook 3- en 9glucosiden worden gedetecteerd wanneer het metabolisme van dihydrozeatine werd gevolgd
(McCaw et al., 1985) .
Bij Phaseolus wordt zeatine bijna volledig gemetaboliseerd in tegenstelling tot het
dihydrozeatine dat bijna niet wordt afgebroken, zelfs na 72 uur (Palmer et al., 1981). Het
contrast wordt nog duidelijker bij Alnus glutinosa (els). Bladeren die met zeatine of
dihydrozeatine worden behandeld, breken de meeste zeatine af, terwijl de activiteit van
dihydrozeatine wordt behouden (Hensen, 1978).
4.4 VERSCHILLEN TUSSEN PLANTENDELEN
Door intensief onderzoek op verschillende plantensoorten werd vastgesteld dat er ook
verschillen zijn op het niveau van plantendelen. Als voorbeeld worden de verschillen tussen
de plantendelen van Phaseolus spp uitgelegd. De huid, zaadhuid en onvolwassen embryo’s
van een boon van Phaseolus vulgaris en Phaseolus lunatus worden onderzocht. Hiervoor
wordt
14
C-zeatine gebruikt. Het soortspecifiek metabolisme dat wordt waargenomen in de
onvolwassen embryo’s wordt ook teruggevonden in de zaadhuid (Turner et al., 1985). De
huid van de boon zelf metaboliseerde de zeatine niet actief maar een grote hoeveelheid
14
C-
zeatine wordt daar teruggevonden. De belangrijkste metaboliet is zeatinenucleotide.
4.5 VARIATIES GEDURENDE DE ONTWIKKELING
Een kwalitatieve variatie in cytokininen wordt waargenomen gedurende de ontwikkeling van
een blad. Het opvallendste verschil is het type cytokininen in een jong blad in vergelijking
met het type cytokininen in een volwassen of verouderd blad.
Ook in de ontwikkeling van de zaden kunnen deze kwalitatieve verschillen terugkeren. Hier is
het opvallendste verschil terug te vinden tussen de zaadontwikkeling, de bevruchting van de
zaden en de fase kort na de bevruchting (Mok and Mok, 1994).
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
43
Metabolisme van cytokininen
4.6 SYNTHESE VAN CYTOKININEN
Ondanks jaren van onderzoek is de kennis omtrent de biosynthese en de expressie van
cytokininen nog steeds beperkt (Sun et al., 2003).
Cytokininen kunnen op twee manieren gesynthetiseerd worden:
 Via
de
synthese
van
isopentenyladenosine-5’-monofosfaat
met
isopentenyl-
transferase.
 Via de tRNA pathway.
De
isopentenyladenosine-5’-monofosfaat
afhankelijke
pathway
gebeurt
via
een
biochemische modificatie van adenine. De biosynthese bestaat uit 4 stappen (Taiz and
Zeiger, 1999) :
1. Isopentenylpyrofosfaat,
een
product
uit
de
‘mevalonate’
pathway,
wordt
geïsomeriseerd tot het isomeer dimethylallyldifosfaat.
2. Dit isomeer reageert met adenosinemonofosfaat tot isopentenyl-adenosine-5’monofosfaat met behulp van het isopentenyltransferase (IPT) enzym.
3. Dit product wordt verder verwerkt tot isopentenyladenosine door afsplitsing van het
fosfaat door een fosfatase tot isopentenyladenine door afsplitsing van de ribose
groep.
4. Dit isopentenyladenine kan omgevormd worden tot de drie meest voorkomende
natuurlijke cytokinine vormen zoals bijvoorbeeld zeatine dat door hydroxylatie wordt
gevormd. Verdere hydroxylatie zorgt voor dihydrozeatine.
In de tRNA pathway verlopen de reacties analoog met de isopentenyladenosine-5’monofosfaat afhankelijke pathway maar bij de tRNA pathway wordt geen gebruik van het
enzym isopentenyltransferase (IPT) gemaakt (Taiz and Zeiger, 1999). Verdere bespreking
van de tRNA pathway gaat het doel van deze thesis voorbij.
De afbraak van cytokininen gebeurt grotendeels door het cytokinine-oxidase enzym. Dit
enzym verwijdert de zijketen zodat het adenine vrijkomt.
Zoals eerder vermeld komen naast de vrije vormen van de cytokininen vaak ook ribosiden en
glycosiden voor. Bij de glycosiden is de glycosegroep vaak irreversibel gebonden op het
cytokinine waardoor het zijn werking verliest. Ribosiden worden beter opgenomen uit het
medium en getransporteerd dan het corresponderend vrije cytokinine (Robischon, 2001).
In figuur 35 wordt een overzicht gegeven van de biosynthese van zeatine.
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
44
Metabolisme van cytokininen
Figuur 35: De biosynthese van zeatine, een cytokinine
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
45
Transgene planten en werking cytokininen
Hoofdstuk 5:
Transgene planten en werking cytokininen
5.1 INLEIDING
De kennis die reeds vergaard werd over cytokininen, is te danken aan de vooruitgang in
analysetechnieken en aan de mogelijkheid om transgene planten te creëren. Beiden
hebben een revolutionaire impact gehad op de kennis van de plantenfysiologie en van de
plantenbiochemie.
Dankzij de experimenten van Skoog and Miller (1957) werd ontdekt dat verschillende
auxine/cytokinine verhoudingen aanleiding kunnen geven tot de differentiatie van
plantenweefsel tot scheuten of wortels. Hiervan wordt gebruik gemaakt om transgene
planten uit bladexplantaten te regenereren.
Omdat experimenten met exogene plantenhormonen complex zijn (het is heel moeilijk te
bepalen hoeveel exogeen plantenhormoon er werkelijk wordt opgenomen door het
plantenweefsel) bieden transgene planten een alternatief. Deze planten kunnen zo worden
gemanipuleerd dat zij in bepaalde organen over een specifiek gehalte aan plantenhormonen beschikken. Natuurlijk moet rekening gehouden worden met grenzen die door
de technologie worden opgelegd, met name de beschikbaarheid van adequate promotors.
Analysen van transgene planten met een gewijzigde cytokinine-synthese (zoals tabak,
aardappel, Arabidopsis thaliana) leverden soms onverwachte en zeer interessante
inzichten op met betrekking tot de werking van cytokininen.
In dit hoofdstuk zal een korte bespreking volgen van enkele planten die reeds met het IPTgen werden getransformeerd. Verder wordt een overzicht gegeven van de belangrijkste
complicaties bij transformaties met het IPT-gen. Ook de gevolgen van het inbouwen van
het IPT-gen komen kort aan bod.
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
46
Transgene planten en werking cytokininen
5.2 COMPLICATIES BIJ TRANSFORMATIE MET IPT–GEN
5.2.1 Verwerven van IPT-gen
Alhoewel aangetoond werd dat het IPT-enzym actief is in planten (Chen, 1982), werd het
tot nu toe nog niet in zijn volledige vorm uit een plant geëxtraheerd. De corresponderende
genen kunnen in verschillende bacteriën en in Arabidopsis thaliana teruggevonden en
geïsoleerd worden. (Haberer and Kieber, 2002).
Het gen, dat instaat voor de expressie van IPT, werd voor de eerste keer geïdentificeerd in
het T-DNA van A. tumefaciens (Akiyoshi et al., 1984; Barry et al., 1984 en Schröder et al.,
1984). Analyse van het tumorweersel, geïnduceerd door A. tumefaciens, wees er sterk op
dat het gen gelokaliseerd in het T-DNA een grote invloed heeft op het gehalte aan
cytokininen
in
getransformeerd
weefsel
(Akiyoshi
et
al.,
1983).
Verschillende
onafhankelijke onderzoekers kwamen, bijna gelijktijdig, tot het besluit dat de tmr locus
codeert voor IPT-activiteit. Het A. tumefaciens gen gaf onderzoekers de mogelijkheid om
het gehalte aan cytokininen in getransformeerde planten te manipuleren.
Ook in Arabidopsis thaliana werd het tmr gen gelocaliseerd. Onderzoek leverde negen
IPT–homologen op, van AtIPT1 tot AtIPT9. Recente experimenten wijzen erop dat AtIPT2
en AtIPT9 gecodeerd worden door tRNA-IPT dat op zijn beurt gecodeerd wordt door het
IPT/tmr gen (Haberer and Kieber, 2002).
Een andere oplossing bestaat erin gebruik te maken van Shooting (Sho), voor het eerst
waargenomen bij een gemuteerde Petunia lijn. Sho codeert voor een proteïne dat een
homoloog
is
van
IPT.
Het
veroorzaakt dezelfde
effecten als IPT
zoals
de
scheutinducerende werking, gereduceerde apicale dominantie, uitgestelde senescentie….
Het IPT–gen van A. tumefaciens zal eerst het zeatine gehalte doen stijgen, Sho
daarentegen zal het gehalte van een bepaald type adenosinederivaat, adenine, doen
stijgen. Sho codeert voor een plantenenzym dat actief genoeg is om actieve cytokininen te
produceren (Zubko et al., 2002).
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
47
Transgene planten en werking cytokininen
5.2.2 Transformatie met het IPT–gen
In de wortelinducerende fase zijn IPT bevattende scheuten het grootste probleem. De
aanzet tot wortelvorming eist een hoge auxine/cytokinine verhouding. Expressie van het
IPT-gen
(waardoor
cytokininen
worden
geproduceerd
met
als gevolg
dat
de
auxine/cytokinine verhouding daalt) in deze fase van regeneratie kan wortelvorming
volledig onderdrukken. Zelfs heel lage activiteit van het IPT-gen remt de wortelvorming.
De meeste genen met betrekking tot de cytokinineproductie vertonen een expressie die
opgespoord kan worden in ongedifferentieerd callusweefsel (zimming oraal?, 2003). Dit
is de reden waarom transformatie zo moeilijk is bij het IPT–gen.
Een goed voorbeeld hiervan is de promotor voor de a’ subunit van B-conglycine. Deze
promotor is zeer specifiek en komt enkel tot uiting in zaden die tot ontwikkeling komen.
Desalniettemin komt dit gen reeds tot uiting gedurende de regeneratie hoewel het
optimaal werkt wanneer de scheuten volledig geregenereerd zijn (Klee et al., 1987).
De ‘lekkende’ promotors gedurende de regeneratie vormen is één van de belangrijkste
problemen bij het produceren van planten met een gewijzigde cytokinine balans. Een
oplossing hiervoor is werken met ‘heat-shock’ promotors. Bij deze promotors zal
cytokinine enkel kunnen opgespoord worden bij hoge temperaturen (Bond and
Schlesinger, 1987).
5.3 GEVOLGEN VAN HET INBOUWEN VAN EEN IPT–GEN
De effecten van het IPT-gen kunnen opgedeeld worden in biochemische effecten en
effecten op de ontwikkeling van de plant:
 biochemische effecten
De biosynthese van isopentenlyladenine (IPA) wordt beschouwd als de limiterende
stap in de synthese van biologisch actieve cytokininen. In tabaksplanten, die
getransformeerd worden met een door een heat-shock promotor gecontroleerd
IPT-gen, steeg het IPA-gehalte met een factor drie na een eerste heat-shock.
Trans-zeatine en trans-zeatineriboside, beide cytokininen, stegen met een factor
dertig. Na een tweede heat-shock stegen de gehalten twintig tot tweehonderd
maal. Dit suggereerde dat de plant in staat is zeer snel IPA om te zetten naar meer
actieve cytokininen (Smigocki, 1991; Smart et al., 1991).
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
48
Transgene planten en werking cytokininen
 Effecten op de ontwikkeling van de plant
Er zijn verschillende en duidelijke gevolgen van het inbouwen van een bacterieel
IPT-gen. In alle proeven is de plantenlengte afgenomen, zelfs tot 50% (figuur 36).
De oorzaak hiervan is eerder de afgenomen internodiën-lengte dan de afname
van het aantal knoppen. Bovendien vertonen deze transgene IPT-planten ook een
sterk gereduceerd wortelstelsel.
Figuur 36: Invloed van cytokininen op de morfologie van de plant en op de
wortels, rechts het wilde type, links de getransformeerde plant
met verhoogde cytokininestatus (Anonymous, 2003f).
Blijkbaar remmen hogere gehalten aan cytokininen niet alleen de wortelinductie
maar ook de wortelgroei in het algemeen. De oorzaak hiervan kan ofwel
toegeschreven worden aan een geheel tragere groei, ofwel aan een wijziging in het
patroon van vertakking. Gelijkaardige effecten worden ook waargenomen bij
transgene planten met zowel een hoger als een lager gehalte aan cytokinine.
Wortels van transgene planten reageren dus algemeen negatief op een
verandering in de auxine/cytokinine verhouding.
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
49
Transgene planten en werking cytokininen
Planten, getransformeerd met het IPT-gen, hebben ook een minder goed
ontwikkeld vasculair stelsel, in het bijzonder hebben zij veel minder xyleem. Er zijn
rapporten waaruit blijkt dat cytokininen de vasculaire differentiatie in celculturen
stimuleert (Roberts et al., 1988). Deze waarnemingen, die tegenstrijdig lijken, zijn
niet uitzonderlijk.
Een verhoging van het gehalte aan cytokininen leidt duidelijk tot een verminderde
apicale dominantie. Getransformeerde planten vertonen een zeer uitgebreide groei
van de zijscheuten in vergelijking met niet getransformeerde planten. Transgene
planten met een gewijzigd auxine gehalte vertonen echter ook deze effecten.
Wanneer nu het gehalte aan auxine tien tot twintigvoudig is afgenomen, dan
worden laterale knopen ook gevormd door gebrek aan apicale dominantie. Dit
effect komt ook tot uiting bij IPT-planten waarbij IPT meer dan normaal tot
expressie komt. Dit bevestigd dat apicale dominantie niet gecontroleerd wordt door
auxine of cytokinine maar door de twee hormonen samen (Smigocki and Owens,
1988; Estruch et al., 1991).
5.4 ENKELE PLANTEN GETRANSFORMEERD MET HET IPT-GEN
5.4.1 Nicotiana tabacum (tabaksplant)
Het IPT-gen heeft een pleiotropisch effect, wat moeilijk te bestuderen valt. Er werden
verschillende transformanten ontwikkeld met elk een specifiek cytokinine-geïnduceerd
fenotype (figuur 37a, 37b en 37c). Deze mutanten kunnen dan gebruikt worden om de
werking van cytokininen te analyseren. Het IPT-gen werd ingebouwd onder de controle
van een door hitte geïnduceerde promotor (Rupp et al., 1999), een door tetracycline
geïnduceerde promotor (Faiss et al., 1997) of een door koper geïnduceerde promotor
(MacKenzie et al., 1998), zonder veel resultaat.
Figuur 37a: BIK5 (links): gereduceerd bladoppervlak, vorming
van bloemen ontbreekt in vergelijking met het wilde type
(rechts) (Fristensky, 2001).
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
50
Transgene planten en werking cytokininen
Figuur 37b: Uistellen van de senescentie in BIK11
(rechts) in vergelijking met het wilde type (links)
(Fristensky, 2001).
Figuur 37c: Breken van ‘dormancy’ in de laterale knopen,
BIK46 (links) in vergelijking met het wilde type (rechts)
(Fristensky, 2001).
Bij het inbouwen van het IPT-gen onder de controle van een senescentie-specifieke
promotor werd erin geslaagd het beoogde doel te bereiken: een lokaal effect van
cytokininen in transgene planten. Deze transgene planten vertoonden een latere
bladsenescentie in vergelijking met het wilde type (WT), zonder dat de andere gevolgen
van het inbouwen van een IPT-gen tot expressie kwamen (figuur 37b) (Gan and Amasino,
1995).
Bij de BIK62 lijn, een transgene tabakslijn, komt het IPT cytokinine-synthese gen tot
expressie onder de controle van een ‘tagged’ promotor. Het endogeen cytokinine in het
axillair meristeem wordt bij de BIK62 mutant gemanipuleerd, in dit geval verhoogd, met als
gevolg dat de initiatiesnelheid van bladeren neemt toe (Guivarc’h et al., 2002).
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
51
Transgene planten en werking cytokininen
5.4.2 Solanum tuberosum (aardappel)
Bij de aardappel wordt vooral onderzoek gedaan naar de invloed van cytokininen op de
knolvorming. Galis et al. (1995) onderzochten de invloed van cytokininen op zowel de
intacte plant als op een knol. De cytokininen werden zowel exogeen als endogeen
toegepast. Bij het exogene gebruik van BA in het tuberisatiemedium bij de plant
verschenen de microknollen tien tot twintig dagen vroeger in vergelijking met planten waar
geen cytokininen aan toegevoegd werden. De aardappelmutanten die getransformeerd
werden met het IPT-gen vertoonden een cytokininegehalte, drie- tot twintigmaal hoger dan
in de niet-getransformeerde aardappelplanten. De initiatie van de tuberisatie in intacte
IPT-getransformeerde planten begon vroeger in vergelijking met het controle materiaal.
Exogene toepassing van BA stimuleert het tuberisatieproces met als gevolg dat de
opbrengst van IPT-getransformeerde aardappelplanten toeneemt. Dit heeft een belangrijk
economisch gevolg. IPT-getransformeerde knollen remmen het tuberisatieproces en de
toediening van exogeen BA deed de tuberisatie volledig stoppen.
5.4.3 Arabidopsis thaliana
Arabidopsis thaliana heeft een belangrijke rol gespeeld in de studie van het IPT-gen
afkomstig van A. tumefaciens. Uit Arabidopsis thaliana werd namelijk de specifieke
senescentiepromotor geïsoleerd. Wanneer deze promotor samen met het IPT-gen
ingebouwd wordt zal de senescentie van de getransformeerde plant uitgesteld worden
(Puonti-Kaerlas and Potrykus, 2003).
Wanneer het IPT-gen ingebouwd wordt in Arabidopsis thaliana zijn de gevolgen zoals
verwacht: uitgestelde bladsenescentie, grotere bladeren.
Andere planten waarbij dat het IPT ingebouwd werd, hebben praktisch steeds
dezelfde gevolgen. Planten die getransformeerd werden met het IPT-gen zijn onder
andere: maïs, Petunia, sla, tomaat, gras, Physcomitrella …
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
52
Deel 2: algemene materialen en methoden
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
53
Algemene materialen en methoden
Hoofdstuk 6:
Algemene materialen en methoden
6.1 HET PLANTENMATERIAAL
6.1.1 Inleiding
De Petunia-cultivar die in deze proeven wordt gebruikt, is de Petunia axillaris (subfamilie:
Cestroideae, tribus: Nicotianeae). Deze werd ons ter beschikking gesteld door T. Gerats
(Universiteit van Gent (RUG), Laboratorium Plantengenetica). Het is een homozygote lijn
(9883-28), een genotype die weinig of niet vertakt en goed transformeerbaar is. Verder wordt er
ook gebruik gemaakt van de tabaksplant, deze dient als controle.
6.1.2 Sterilisatie van Petunia-zaden
De
zaden
worden
eerst
gewikkeld
in
filtreerpapier
en
gedurende
tien
seconden
ondergedompeld in een bad van 70% ethanol. Daarna worden de zaden gesteriliseerd in een
oplossing bestaande uit 10% javel (1,2% NaOCl) en een druppel Tween 80 (een uitvloeier). Tot
slot worden de zaden, nog steeds gewikkeld in het filtreerpapier, driemaal grondig gewassen
met steriel water.
6.1.3. Ontwikkeling van de Petunia-zaden
De gesteriliseerde zaden worden in proefbuizen (1 zaadje per proefbuis) met General stock
medium geplaatst en in een klimaatkamer opgekweekt. De klimaatkamer heeft een dag/nacht
regime van zestien uur licht en acht uur duisternis bij een temperatuur van 22°C. Als lichtbron
worden meestal “Cool-white” fluorescentielampen gebruikt van 38 W.
6.1.4 De in vitro stock van Petunia
Eens de gekiemde zaden voldoende uitgegroeid zijn, worden ze overgebracht naar bokalen
met het General stock medium. De axillaire scheuten van elk plantje worden telkens
afgezonderd en in nieuwe bokalen gezet, op deze manier wordt een stock opgebouwd (figuur
38). In deze bokalen is een General stock medium gebruikt dat eerst op kooktemperatuur werd
gebracht. De bokalen, die het General stock medium bevatten, worden dan geautoclaveerd.
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
54
Algemene materialen en methoden
De stock wordt opgekweekt in de klimaatkamer met een dag/nacht regime van zestien uur licht
en acht uur duisternis
bij
een temperatuur van 22°C.
Als lichtbron worden Cool-white
fluorescentielampen gebruikt van 38 W.
Figuur 38: De stock.
6.2 AGROBACTERIUM TUMEFACIENS
6.2.1 De Agrobacterium-constructen
De gebruikte constructen werden ontwikkeld door Crop Design, een spin-off bedrijf van
het Vlaams Instituut voor Biotechnologie (VIB). Crop Design speelt een belangrijke rol in
het onderzoek omtrent de celdingscyclus en de invloeden hierop. Deze invloeden, zoals
bijvoorbeeld de synthese van cytokininen, spelen een cruciale rol in de ontwikkeling en de
groei van planten. Ik kreeg drie constructen ter mijner beschikking p3799, p4577 en
p4578 (figuur 39).
In deze constructen komen steeds dezelfde genen terug:
1. het specifiek gen
2. een selectiegen
3. een merkergen
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
55
Algemene materialen en methoden
Het specifiek gen is hier het IPT-gen. Zoals hoger vermeld speelt dit enzym een
belangrijke rol in de synthese van cytokininen. Aangezien cytokininen ook een rol spelen
in de celdelingscyclus, heeft dit gen ook een invloed op de ontwikkeling en de groei van
een plant.
Er wordt hier gekozen voor een negatief selectiesysteem. Het herbicideresistentiegen,
namelijk het bar-gen, werd hier gekozen als selectiegen. De getransformeerde plantencellen zijn dus niet langer gevoelig voor Basta®.
Als merkergen wordt het GFP-gen ingebouwd. Indien de plantencellen getransformeerd
zijn zullen deze oplichten in de nabijheid van UV-licht.
Deze genen moeten worden ingebouwd onder de controle van een promotor. De nospromotor en de CaMV-35-S-promotor worden veel toegepast. De nos-promotor is
geïsoleerd uit het Ti-plasmide van A. tumefaciens. De 35-S-promotor wordt geïsoleerd uit
het Cauliflower Mosaic Virus (CaMV). Beide promotors kunnen toegepast worden in
eukaryoten, ze werken uitstekend in hogere planten (Werbrouck, 2001). Bij het construct
p4577 wordt de CaMV-35-S-promotor gebruikt.
De promotor, de selectiegenen, de merkergenen en het specifiek gen worden ingebouwd
tussen de ‘right border’ en ‘left border’ van het T-DNA van A. tumefaciens.
Verder zaten de volgende antibioticaresistentiegenen in de bacterie:
op het chromosoom: rifampicine resistentie
op het helperplasmide: gentamycine resistentie
op het T-plasmide: kanamycineresistentie
deze werden niet getransfereerd naar de plant, maar dienen voor selectie tijdens de
bacteriecultuur.
Aangezien de concurrentiestrijd tussen de verschillende biotechnologische bedrijven zeer
groot is moeten een aantal genen om vertrouwelijkheidsredenen gecodeerd worden.
Constructen maken in excell.
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
56
Algemene materialen en methoden
6.2.2 Een bacteriecultuur van Agrobacterium creëren in vloeibaar medium
De bacteriecultuur wordt opgestart door de bacteriestammen te enten in 25 ml vloeibaar
YEB-medium. Er wordt 50 mg/l spectinomycine en 5 mg/l gentamycine aan toegevoegd
zodat enkel de gewenste bacteriestam tot ontwikkeling komt. Gedurende twee dagen
worden deze oplossingen in een schudtoestel (250 tpm) geplaatst bij een temperatuur van
+ 28°C. Door het schudden is er een optimaal contact met de voedingsbestanddelen
samen met de temperatuur creëren ze de ideale groeiomstandigheden.
Hierna kan de bacterieconcentratie bepaald worden aan de hand van spectrofotometrie
met behulp van volgende formule:
OD600nm= 1 = 0.8 x 109 cellen/ml
Aan de hand van deze waarden kan een aangepast volume bacteriesuspensie berekend
worden zodanig dat voor elke transformatie dezelfde concentratie bacteriën kan gebruikt
worden, namelijk 107 bacteriën/ml.
6.3. LEAF DISK TRANSFORMATIE
6.3.1 De bladschijfjes
Om de transformatie goed te laten verlopen wordt gebruikt gemaakt van jonge blaadjes.
Deze worden teruggevonden aan de top van de petuniaplant en zijn afkomstig van nieuw
gevormde axillaire scheuten. De bladschijfjes worden in stukjes gesneden met een steriel
scalpel op steriel papier in de laminaire flow, om infectie met schimmels te vermijden.
Daarna worden ze in een vloeibaar callus-inducerend medium gelegd, in een
petrischaaltje, zodanig dat de bladschijfjes kunnen worden geïnfecteerd met de gewenste
bacterie.
6.3.2 De infectie
Aan elk petrischaaltje wordt 107 bacteriën toegevoegd met een micropipet. Ook 10 l
acetosyringone worden toegevoegd, deze stof trekt de bacteriën aan en verhoogt de kans
op een geslaagde infectie. De bladschijfjes worden geïncubeerd gedurende één uur.
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
57
Algemene materialen en methoden
6.3.3 De co-cultivatie
De geïnfecteerde explantaten worden uit de bacterieoplossing genomen met een steriele
pincet en op petrischaaltjes gelegd die een vast callus-inducerend medium bevatten.
Deze bladschijfjes worden in het donker en bij 22°C, gedurende twee dagen, in de
klimaatkamer bewaard.
6.3.4 De selectie
Na twee dagen van co-cultivatie worden de bladschijfjes geënt op het vast callusinducerend weefsel waaraan 500 mg/l cefotaxime en 10 mg/l phosphinotricine (PPT)
wordt toegevoegd. De petrischaaltjes worden in aluminiumfolie ingepakt en in de
klimaatkamer geplaatst, nadien wordt gebruik gemaakt van het scheut-inducerend
medium dat een vast medium is. Op deze manier groeien de bladschijfjes in volledige
duisternis bij een temperatuur van 22°C.
6.3.5 De regeneratie
De regeneratie start reeds op het callus-inducerend medium. Tot slot om de twee weken
worden de explantaten overgeënt op het callus-inducerend medium waaraan telkens een
verschillende hoeveelheid cefotaxime wordt toegevoegd. De hoeveelheid cefotaxime
wordt afgebouwd namelijk van 500 mg/l, de eerste twee weken naar 300 mg/l, de derde
week tot 250 mg/l voor de rest van de experimenten.
Eénmaal het callusweefsel duidelijk gevormd is, kunnen explantaten overgelegd worden
op het scheut-inducerend medium. Dit medium heeft een andere auxine/cytokinine
verhouding waardoor de vorming van scheuten wordt gestimuleerd. De bladschijfjes
worden nog steeds gekweekt in volledige duisternis, door de petrischaaltjes in te pakken
met aluminiumfolie en bij een temperatuur van 22°C in de klimaatkamer.
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
58
Algemene materialen en methoden
6.4. BESCHRIJVING VAN DE GEBRUIKTE MEDIA
6.4.1 Het General Stock medium
De samenstelling van het medium voor Petunia wordt weergegeven in tabel 6. De
samenstelling van het Murashige and Skoog medium (MS) wordt in tabel 7 weergegeven.
Na deze componenten grondig te mengen wordt de pH ingesteld op 5,8. Gedurende
twintig minuten wordt het medium geautoclaveerd bij een temperatuur van 121°C en bij
een overdruk van 1 bar. Dit moet met de nodige aandacht gebeuren zoniet mislukt de
sterilisatie. Daarna moet het medium uitgegoten worden in de bokalen of in de
petrischalen. Dit laatste moet in de laminaire flow (figuur 40) opdat de steriliteit van het
medium verzekerd wordt.
Tabel 6: De samenstelling van General stock medium.
Componenten
Hoeveelheid
water
1l
sucrose
30 g/l
agar
7 g/l
Murashige and Skooge
4.405 mg/l
benzyladenine
0.230 mg/l
sequestreen (Fe-EDDHA)
200 mg/l
Figuur 40: De laminaire flow.
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
59
Algemene materialen en methoden
Tabel 7 : De samenstelling van het Murashige and Skooge medium.
Componenten
Micro-elementen
Hoeveelheid
Molariteit
COCl2. 6 H2O
0.025
mg/l
0.11
M
CuSO4. 5 H2O
0.025
mg/l
0.10
M
FeNaEDTA
36.700
mg/l
0.10
M
H3BO3
6.200
mg/l
0.10
M
KI
0.830
mg/l
5.00
M
MnSO4. H2O
16.900
mg/l
0.10
M
Na2MoO4 . 2 H2O
0.250
mg/l
1.03
M
ZnSO4. 7 H2O
8.600
mg/l
29.91
M
CaCl2
322.020
mg/l
2.99
M
KH2PO4
170.000
mg/l
1.25
M
KNO3
1.900.000
mg/l
18.79
M
MgSO4
180.540
mg/l
1.50
M
NH4NO3
1.650.000
mg/l
20.61
M
Glycine
2.000
mg/l
26.64
M
myo-inositol
100.000
mg/l
0.54
M
nicotinezuur
0.500
mg/l
4.06
M
pyridoxine-HCl
0.500
mg/l
2.43
M
thiamine-HCl
0.100
mg/l
0.30
M
Macro-elementen
Vitaminen
6.4.2 Het YEB-Medium
De samenstelling van het YEB-medium wordt in onderstaande tabel weergegeven. Nadat
deze componenten goed gemengd zijn, wordt de pH ingesteld op 7,2. Daarna wordt ook
dit medium geautoclaveerd. Pas na het autoclaveren mag er nog gentamycine (5 g/l) en
spectinomycine (5 g/l) aan het medium toegevoegd worden. Dit zijn thermolabiele stoffen,
om deze steriel te krijgen moet een filtersterilisatie doorgevoerd worden. De meest
gebruikte filters zijn cellulose-nitraat en cellulose-acetaat, filters met een diameter van
0,22 m.
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
60
Algemene materialen en methoden
Tabel 8: De samenstelling van het YEB-medium.
Componenten
Hoeveelheid
water
1l
Bacto beef extract
5 g/l
peptone
5 g/l
sucrose
5 g/l
Bacto Yeast extract
1 g/l
(2mM) MgSO4.7H2O
493 g/l
6.4.3 Het vloeibaar en vast callus-inducerend medium
De samenstelling van het vloeibaar callus-inducerend medium wordt in tabel 9
weergegeven. Het vast callus-inducerend medium heeft dezelde samenstelling als het
vloeibaar callus-inducerend medium op één component na, namelijk 7 g/l agar. Door de
agar zal het medium, na afkoeling, vast zijn. De pH wordt bij beide ingesteld op 5,8.
Tabel 9 : De samenstelling van het vloeibaar callus-inducerend medium.
Componenten
Hoeveelheid
water
1l
sucrose
30 g/l
Murashige and Skooge
4.405 g/l
MES
2.130 g/l
benzyladenine
1 mg/l
1-naftylazijnzuur (NAA)
1 mg/l
folic acid
0.880 mg/l
nicotinezuur
0.500 mg/l
pyridoxine-HCl
0.500 mg/l
thiamine-HCl
0.100 mg/l
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
61
Algemene materialen en methoden
6.4.4 Het vast scheut-inducerend medium
De samenstelling van het vast scheut-inducerend medium wordt in onderstaande tabel
weergegeven. De pH van dit medium wordt ingesteld op 5,8.
Tabel 10 : De samenstelling van het vast scheut-inducerend medium.
Componenten
Hoeveelheid
water
1l
sucrose
30 g/l
agar
7 g/l
Murashige and Skooge
4.405 g/l
MES
2.130 g/l
benzyladenine
1 mg/l
folic acid
0.880 mg/l
nicotinezuur
0.500 mg/l
pyridoxine-HCl
0.500 mg/l
thiamine-HCl
0.100 mg/l
1-naftylazijnzuur (NAA)
0.010 mg/l
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
62
Deel 3: Experimenten
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
63
Experimenten: transformatie van Petunia met het IPT-gen
Hoofdstuk 7:
Experimenten: Transformatie van Petunia met het IPTgen
7.1 TRANSFORMATIEPROEF I
7.1.1 Doel
Het doel van deze proef is het genetisch manipuleren van een Petunia plant zodanig dat
het gehalte endogene cytokininen stijgt. Door gebruik te maken van A. tumefaciens
bouwen we het IPT-gen in.
7.1.2 Proefopzet
In deze proef wordt Petunia volgens het leaf disk protocol getransformeerd. Hiervoor
worden de hierboven beschreven constructen p7, p8 en p9 gebruikt, dit is de
bacteriesuspensie. Tevens wordt een controle uitgevoerd met Petunia bladschijfjes die
niet getransformeerd werden.
Deze bladschijfjes worden gekweekt in de klimaatkamer in volledige duisternis bij een
temperatuur van 22°C.
7.1.3 Resultaten
Na twee dagen in de klimaatkamer moeten de bladschijfjes overgelegd worden op een
medium met cefotaxime en Basta®. De explantaten zagen er slecht uit en leken
afgestorven. Hier en daar zijn er wel nog stukjes die er fris uitzien maar het aandeel ervan
ligt heel laag (figuur 41). Verdere transformatie is met deze explantaten niet mogelijk.
7.1.4 Besluit
Na onderzoek bleken de bladschijfjes afkomstig te zijn van een oude stockplant. Oude
stockplanten reageren slecht op de behandelingen van het transformatieprotocol en zijn
dus niet bruikbaar om transformatieproeven uit te voeren.
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
64
Experimenten: transformatie van Petunia met het IPT-gen
Figuur 41: Explantaten afkomstig van een oude stockplant.
7.2 TRANSFORMATIEPROEF II
7.2.1 Doel
Het doel van deze tweede proef is hetzelfde als die van de eerste. Nog steeds wordt
geprobeerd het IPT-gen in te bouwen met de constructen p7, p8, p9. Hierdoor zal het
gehalte aan endogene cytokininen toenemen. Wanneer dit geslaagd is, is het de
bedoeling om uit deze explantaten een nieuwe getransformeerde plant te ontwikkelen.
Wanneer de zaden van deze plant zijn uitgegroeid, kunnen de gevolgen van een
verhoogde cytokininestatus bestudeerd worden.
7.2.2 Proefopzet
Ook in dit experiment wordt gehoopt om aan de hand van A. tumefaciens, een
transformatie van de Petunia bladschijfjes te kunnen voltooien. Ook hier wordt een
controle aan toegevoegd. Het verschil met de getransformeerde Petunia explantaten is
tweevoudig. Ten eerste zijn ze niet getransformeerd en ten tweede wordt er aan de media
dan
ook
geen
Basta®
toegevoegd,
aangezien
deze
explantaten
geen
herbicideresistentiegen ingebouwd kregen. Er werd op gelet om jonge bladschijfjes te
gebruiken, teneinde het probleem van de vorig proef te vermijden.
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
65
Experimenten: transformatie van Petunia met het IPT-gen
7.2.3 Resultaten
Na twee dagen bleken de explantaten een fris uitzicht te hebben. De bladschijfjes werden
op een selectiemedium overgelegd met toevoeging van cefotaxime. Deze stof zorgt
ervoor dat andere bacteriën, die mogelijk aanwezig zijn, worden gedood. Na twee weken
bleken de bladschijfjes gezond te zijn, maar er was nog geen callusweefsel zichtbaar. De
blaadjes werden op vers medium gelegd en in het duister in de klimaatkamer gelegd. Na
twee weken en twee dagen werden de explantaten nogmaals geëvalueerd. Er was
duidelijk
callusweefsel te zien en
wanneer
gecontroleerd werd
met
UV-licht,
fluorisceerden enkel stukjes, dus de transformatie was in sommige explantaten geslaagd.
De bladschijfjes werden opnieuw voor twee weken in de klimaatkamer gelegd. Na deze
periode volgde er een evaluatie en die was niet goed. Waarschijnlijk moet één van de
vorige stappen in de transformatie niet steriel gebeurd zijn want de Petunia explantaten
waren besmet door een schimmelinfectie (figuur 42).
Figuur 42: De aangetaste Petunia bladschijfjes.
7.2.4 Besluit
Een transformatie met A. tumefaciens is mogelijk. Ook de constructen moeten ingebouwd
zijn omdat bij bestraling met UV-licht fluorescentie te zien was. Bij het zoeken naar de
mogelijke oorzaak bleek de temperatuur van de glasparelsterilisator niet hoog genoeg te
zijn. Door deze verlaagde temperatuur was het materiaal, bijvoorbeeld de pincetten, niet
steriel.
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
66
Experimenten: transformatie van Petunia met het IPT-gen
7.3 TRANSFORMATIEPROEF III
7.3.1 Doel
Na het verlies van de vorige proef moet er opnieuw begonnen worden. Ook deze keer
blijft het doel hetzelfde. Nog steeds wordt geprobeerd om door het transformeren van
bladschijfjes van Petunia een getransformeerde Petunia plant te produceren met een
verhoogd endogeen cytokinine gehalte.
7.3.2 Proefopzet
Ook in dit experiment wordt Petunia getransformeerd volgens het leaf disk protocol. De
bladschijfjes die geïnfecteerd werden met de bacteriesuspensie worden overgebracht op
het callusinducerend medium. Ook een controle wordt deze keer weer voorzien. Na zeven
weken werd overgeschakeld op het Murashige and Skooge medium omdat die geen
cytokininen bevatten en zo de invloed van exogene cytokininen vermeden wordt. De
petrischaaltjes werden volledig ingepakt in huishoudfolie vooraleer ze ingepakt werden in
alluminiumfolie.
7.3.3 Resultaten
Ook hier werden de explantaten voor een tweede keer geëvalueerd na twee weken en
twee dagen. Er was reeds callusgroei aanwezig maar slechts in beperkte mate. Vandaar
dat de bladschijfjes nogmaals werden overgezet op vers callusinducerend medium,
teneinde het callusweefsel in zijn groei te stimuleren. Na die twee weken bleek er al meer
callusweefsel te zijn gegroeid. Bij bestraling met UV-licht was de fluorescentie duidelijk te
zien (figuur 43), de transformatie was geslaagd. Daarna werden de explantaten
overgebracht op scheutinducerend medium. Na nog eens twee weken waren er al enkele
scheuten te zien waarvan sommigen getransformeerd waren en anderen niet. De stukjes
explantaat die niet getransformeerd waren, werden verwijderd.
Figuur 43: Getransformeerd callusweefsel beschenen
met UV-licht.
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
67
Experimenten: transformatie van Petunia met het IPT-gen
Hiervoor werd de entruimte volledig verduisterd en werden, met de GFP-bril in de
laminaire flow, de niet-getransformeerde stukken weggesneden.
Hierop werden deze
explantaten overgezet op een medium zonder cytokininen, om zo de invloed van
endogene cytokininen beter te kunnen bestuderen. Deze petrischaaltjes werden niet meer
ingepakt in alluminiumfolie zodanig dat ze in de klimaatkamer opgroeiden met een lichtregime van zestien uur licht en acht uur duisternis. Bij de volgende evaluatie, na twee
weken en drie dagen, bleek dat het Murashige and Skooge medium was uitgedroogd en
de explantaten afgestorven.
7.3.4 Besluit
Ook hier weer werd een bewijs gegeven dat Petunia transformeerbaar is. Een
schimmelinfectie kwam niet meer voor wanneer het volledige petrischaaltje ingepakt werd
in huishoudfolie. De transformatie kon ook slagen door met jonge stockplanten te werken.
De scheutvorming verliep trager dan verwacht. De reden voor het afstervan van de
explantaten op het Murashige and Skooge medium kon niet worden achterhaald.
Transgene Petunia met gewijzigd cytokininestatus
68
Besluit
69
Referenties
Akiyoshi D., Klee H., Amasino R., Nester E.W. and Gordon M. (1984) T-DNA of
Agrobacterium tumefaciens encodes an enzyme of cytokinin biosynthesis. Proceedings of
the National Academy of Science, 81: 5994.
Akiyoshi D.E., Morris R.O, Hinz R., Mischke B.S., Kosuge T., Garfinkel D.J., Gordon M.P.
and Nester E.W. (1983) Cytokinin auxin balance in crown gall tumors is regulated by
specific loci in the T-DNA. Proceedings of the National Academic Science, 80: 407.
Anderson G. (1999) Plant Hormones. http://tidepool.st.usm.edu
Anonymous. (1998) Plant Biology. www.cropsci.uiuc.edu
Anonymous. (2001) Molecular biology of plant senescence. www.botany.sinica.edu.tw
Anonymous. (2003a) Universiteit Inter Antwerpen (UIA).
http://www.uia.ac.be/mrel/index.htm
Anonymous. (2003b) Southwest Biotechnology and informatics Center. www.swbic.org
Anonymous. (2003c) Western Kentucky University. www.bioweb.wku.edu
Anonymous. (2003d) Centre National de la Recherche Scientifique. www.cnrs.fr
Anonymous. (2003e) Life Science Dictionary. www.biotech.icmb.utexas.edu
Anonymous. (2003f) www.endowment.org
Barry G.F., Rogers S.G., Fraley R.T. and Brand L. (1984) Identification of a cloned
cytokinin biosynthetic gene. Proceedings of the National Academy of Science, 81: 5994.
Bertelsmann Gartenlexicon (1990) De grote geïllustreerde plantenencyclopedie. Mosaik
Verlag GmbH.
70
Biddington N .L. and
Thomas T.H. (1976) Influence of different cytokinins on the
germination of lettuce (Lactuca sativa) and celety (Apium graveolens) seeds. Phisiology of
Plant, 37: 12.
Bond U. and Schlesinger M.J. (1987) Heat-shock proteins and development. Advances
in Genetics, 24: 1.
Bradley L.R., Kim J.S. and Mathysse A.G. (1997) Attachment of Agrobacterium
tumefaciens to Carrot Cells and Arabidopsis wound sites is correlated with the presence
of a cell-associated, acidic polysaccharide. Journal of Bacteriology 179: 5372-5379.
Brady C.J. (1988) Nucleic acid and protein synthesis. Senescence and Aging in Plants,
Academic Press, 147p.
Brown T.A. (2001) Gene Cloning and DNA analysis. An introduction. Blackwell Science
Ltd, 363p.
Campbell J.L. (1986) Eukaryotic DNA replication. Annual Review of Biochemistry, 55:
733.
Chen C. (1982) Cytokinin biosynthesis in cell free systems. Plant Growth Substances,
Academic Press, 155p.
Cline M.G. (1991) Apical dominance. Botanic Review, 57: 318.
de la Riva G.A., Gonzalez-Cabrera J., Vazquez-Padron R. and Ayra-Pardo C. (1998)
The Agrobacterium tumefaciens gene transfer to plant cell. Eletronic journal of
Biotechnology, ISSN : 0717-3458.
Easy P. (2003) www.easyplant.nl
Estruch J.J., Chriqui D., Grossman K., Shell J. and Spena, A. (1991) The plant
oncogene rolC is responsible for the release of cytokinins from glucoside conjugates.
European Molecular Biology Organization Journal, 10: 2889.
71
Faiss M., Zalubilova J., Strnad M. and Schmülling T. (1997). Conditional transgenic
expression of the ipt gene indicates for cytokinins a function in paracrine signalling in
whole tobacco plants. The Plant Journal 12: 401-415.
Fristensky B. (2001). Hormonal regulation of gene expression and development.
www.umanitoba.ca .
Galis I., Macas J., Vlasak J., Ondrej M. and Vanonckelen H.A. (1995). The effect of an
elevated cytokinin level using the IPT gene and N-6-benzyladenine on single node and
intact potato plant tyberization in-vitro. Journal of plant growth regulation, 14: (3) 143-150.
Gan S. and Amasino R.M. (1995). Inhibition of leaf senescence by autoregulated production of cytokinin. Science, 270: 1986-1988.
Goossens E. (2002). Tipje van de sluier van eiwitlocalisatie en –transport in de cel.
www.amsel.wins.uva.nl
Grayling A. and Hanke D.E. (1992) Cytokinins in exudates from leaves and roots of red
Perilla. Phytochemistry, 31: 1863.
Grossman S. and Lesham Y. (1978) Lowering of endogenous lipoxygenase activity in
Pisum sativum foliage by cytokinin as related to senescence. Physiology of Plant, 43: 359.
Guivarc’h A., Rembur J., Goetz M., Roitsch T., Noin M., Schülling T. and Chriqui D.
(2002) Local expression of the ipt gene in transgenic tobacco (Nicotiana tabacum L. cv.
SR1) axillary buds establishes a role for cytokinins in tuberization and sink formation.
Journal of Experimental Botany, Vol. 53, 369: 621-629.
Haberer G. and Kieber J.J. (2002) Cytokinins. New Insights into a Classic
Phytohormone. Plant Physiology, 128: 354-362.
Hand R. (1978) Eucaryotic DNA: organization of the genome for replication. Cell, 15: 317.
Hensen I.E. (1978) Types, formation and metabolism of cytokinins in leaves of Alnus
glutinosa (L.). Journal of Experimantal Botany, 29: 935.
72
Hensen I.E. and Wareing P.F. (1974) Cytokinins in Xanthium strumarium: a rapid
response to short day treatment. Physiology Plant., 32: 185.
Herwig R. (1995) Het grote tuin- en kamerplanten boek. Kosmos – Z&K Uitgevers.
Heyssayon D.G. (1999) The new flower expert. Transworld Publishers Ltd.
Jin S., Song Y., Pan S. and Nester E.W. (1993) Characterisation of a virG mutation that
confers constitutive virulence gene expression in Agrobacterium tumefaciens. Molecular
Microbiology, 7 :555-562.
Kamiya Y (2003) Cytokinins. www.plant-hormones.info
Klee H.J., Horsch R.B., Hinchee A., Hein M.B. and Hofmann N.L. (1987) The effect of
overproduction of two Agrobacterium tumefaciens T-DNA auxin biosynthetic gene
products in transgenic Petunia plants. Genes & Development, 1: 86.
Kors F.T.M. (2000) Duchefa Biochemicals Plant Cell and Tissue Culture. Duchefa
Biochemie.
Kuraishi S. and Okumura F.S. (1956) The effect of kinetin on leaf growth. Botanic
Magazine, 69: 817.
Lalouoe M. (1977) Cytokinins: 7-glucosylation is not a prerequisite of the expression of
their biological activity. Planta, 134: 273.
Legocka J. and Sweykowska A. (1983) The role of cytokinins in the development and
metabolism of barley leaves. VI. The effect on the protein metabolism in various cell
compartments during leaf senescence. Physiology of Plant, 5: 11.
Lejeune P., Kinet J.-M. and Bernier G. (1988) Cytokinin fluxes during floral induction in
the long day plant Sinapis alba L. Plant Physiology, 86: 1095.
Leopold A.C. and Kawase M. (1964) Benzyladenine effects on bean leaf growth and
senescense. American Journal of Botany, 51: 294.
73
Letham D.S. and Palni L.M. (1963) The biosynthesis and metabolism of cytokinins.
Annual Review of Plant Physiology, 34: 163.
Longo G.P., Longo C.P., Rossi G., Vitale A. and Predetti M. (1978) Variations in
carbohydrate and in osmotic potential of watermelon cotyledons treated with
benzyladenine. Plant Science Letter, 12: 179.
Luchi S. (1993) Phosphorylation/dephosphorylation of the receiver module at the
conserved aspartate residue controls transphosphorylation activity of histidine kinase in
sensor protein ArcB of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry, 286: 2397223980.
Machackova L. and Krekule J. (1991) Cytokinins in photoperiodic flower induction in
Chenopodium species. Flowering Newsletter, 12: 15.
MacKenzie M.J., Mett V., Reynolds P.H.S. and Jameson P.E. (1998). Controlled
cytokinin production in transgenic tobacco using a copperinducible promoter. Plant
Physiology, 116: 969-977.
Mapelli S. and Lombardi L. (1982) A comparative auxin and cytokinin study in normal
and to-2 tomato plants. Plant Cell Physiology, 23: 751.
Martin L., Diez A. Nicolas G. and Villalobos N. (1987) Cytokinins in chick-pea seeds
identification and transformations during germination in seedling growth. Plant Physiology,
128: 133.
Martin R.C., Mok M.C., Shaw G. and Mok D.W.S. (1989) An enzyme mediating the
conversion of zeatin to dihydrozeatin in Phaseolus embryos. Plant Physiology, 90: 1630.
Mcgaw B.A., Horgan R. and Heald J.K. (1985) Cytokinin metabolism and the modulation
of cytokinin activity in radish. Phytochemistry, 24: 9.
Metzger, J.D. (1987) Hormones and reproductive development. Plant Hormones and their
Role in Plant Growth and Development, 431p.
Miller C.O. (1961) A kinetin-like compound in maize. Proc. Natl. Acad. Sci., 47: 170-174.
74
Miller C.O., Skoog F., Von Saltza M.H. and Strong, F.M. (1955) Kinetin, a cell division
factor from deoxyribonucleic acid. J. Am. Chem. Soc., 78: 1392.
Moffat B., Pethe C. and Laloue M. (1991) Metabolism of benzuladenine is impaired in a
mutant of Arabidopsis thaliana lacking adenine phosphoribosyltransferase activity. Plant
Physiology, 95: 900.
Mok D.W.S and Mok M.C. (1994) Cytokinins Chemistry, Activity, and Function. CRC
Press, 338p.
Nameth S. and Chatfield J. (2003) Bacterial grown gall on ornamentals in the landscape.
www.ohioline.osu.edu
Nandi S.K., Palni L.M.S., letham D.S. and Knypl, J.S. (1988) The biosynthesis of
cytokinins in germinating lupin seeds. Journal of Expl Bot, 39: 1649.
Nobilis P. (2001) Fleuroselect. www.fleuroselect.com
Norris R.F. (1976) Expansion of radish cotyledons: an interaction between NaCl and
cytokinins. Plant Science Letter, 6: 63.
Oudshoorn W. (1995) De mooiste éénjarige planten. Kosmos – Z&K Uitgevers.
Palmer M.V., SCOTT I.M. and Horgan R. (1981) Cytokinin metabolism in Phaseolus
vulgaris L. II. Comparative metabolism of exogenous cytokinins by detached leaves.
Plant Science Lettre, 22 : 187.
Palni L.M.S., Palmer M.V. and Letham D.S. (1984) The stability and biological activity of
cytokinin metabolites in soybean callus tissue. Planta, 134: 273.
Penna S., Sagi L. and Swennen R. (2002). Positive selectable marker genes for routine
plant transformation. In Vitro Cell. Dev. Plant., 38: 125-128.
Pilate G., Sossountzov L. and Miginiac E. (1989) Hormone levels and apical dominance
in the aquatic fern Marsilea drummondii. Plant Physiology, 90: 907.
75
Pino E., Martin L., Guerra H., Nicolas G. and Villalobos N. (1991) Effect of
dihydrozeatin on the mobilization of protein reserves in protein
bodies during the
germination of chick-pea seeds. Journal of Plant Physiology, 137: 425.
Prochazka S. and Jacobs W.P. (1984) Transport of benzyladenine and gibberellin A1
from roots in relation to the dominance between the axillary buds op pea (Pisum sativum
L.) cotyledons. Plant Physiology and Biochemestry, 26: 253.
Puonti-Kaerlas J., and Potrykus I. (2003). Prevention of premature leaf shed in
cassava.
www.rereth.ethz.ch
Rattan S.I.S. (2003) The science behind kinetin as an anti-aging molecule. Department of
Molecular and Structural Biology, University of Aarhus.
Revilla M.E., Martin L., Nicolas G., Legaz M.E. and Villalobos N. (1988) Effects of high
temperature on the variation and transport of endogenous cytokinins during germination of
chick-pea seeds. Journal of Plant Physiology, 132: 223.
Richmond A.E. and Lang A. (1957) Effect of kinetin on protein content and survival of
detached Xanthium leaves. Science, 125: 650.
Roberts L.W., Gahan P.B. and Aloni R. (1988) Vascular Differentiation and Plat Growth
Regulators. Springer-Verlag.
Robishon M. (2001) New light on nitrogen pollution by manipulating poplar development.
www.cies.geog.cam.ac.uk
Rupp H.M, Frank M., Werner T., Strnad M. and Schümlling T. (1999). Increased steadystate mRNA levels of the STM and KNAT1 homeoboxes genes in cytokinin overproducing
Arabidopsis thaliana indicate a role for cytokinins in the shoot apical meristem. The Plant
Journal, 18: 557-567.
Schröder G., Waffenschmidt S., Weiler E.W. and Schroder J. (1984) The T-region of Ti
–plasmids codes for an enzyme synthesizing indole-3-acetic acid. European Journal of
Biochemistry, 138: 387.
76
Singh S., Letham D.S., Jameson P.E., Zhang R., Parker C.W., Badenoch-Jones J.
and Nooden L.D. (1988) Cytokinin biochemistry in relation to leaf senescence. IV.
Cytokinin metabolism in soybean explants. Plant Physiology, 88: 788.
Singh S., Letham D.S. and Palni L.M.S. (1992) Cytokinin biochemistry in relation to leaf
senescence. VII. Endogenous cytokinin levels and exogenous applications of cytokinins in
relation to sequential leaf senescence in tobacco. Physiology Plant., 86: 388.
Skoog F. and Miller C.O. (1957) Chemical regulation of growth and organ formation in
plant tissues cultured in vitro. Symp. Soc. EXPL. Biology, 11: 118.
Skoog, F., Strong, F.M. and Miller, C.O. (1965) Cytokinins, Science, 148: 532.
Smart C., Scofield S., Bevan M. and Dyer T. (1991) Delayed leaf senescence in tobacco
plants transformed with tmr a gene for cytokinin production in Agrobacterium. Plant Cell,
3: 647.
Smigocki A.C. (1991) Cytokinin content and tissue distribution in plants transformed by a
reconstructed isopentenyl transferase gene. Plant Molecular Biology, 16: 105.
Smigocki A.C. and Owens L.D. (1988) Cytokinin gene fused with a strong promoter
enhances shoot organogenesis and zeatin levels in trasformed plant cell. Proceedings of
the National Academy of Science, 85: 5131.
Sodek L. and Wright S.T.C. (1983) The effect of kinetin on ribonucleic acid phosphatase,
lipase and esterase levels in detached wheat leaves. Phytochemistry, 8: 1629.
Sossountzov L., Maldiney R., Scotta B., Sabbagh I., Habricot Y., Bonnet M. and
Miginiac E. (1988) Immunocttochemical localization of cytokinins in Craigella tomato and
a sideshootless mutant. Planta, 175: 291.
Steinberg B. (2000) www.faculty.nl.edu/jste/mitosis2.htm
Sullivan, J.A. (2002) www.cellsalive.com
Sun J., Niu Q.W., Tarkowski P., Zheng B., Tarkowska D., Sandberg G., Chua N.H.
and Zuo, J. (2003) The Arabidopsis AtIPT8/PGA22 Gene Encodes an Isopentenyl
77
Transferase That Is Involved in De Novo cytokinin Biosynthesis. Plant Physiology, 131 (1):
167-76.
Taiz and Zeiger (1999) www.webpub.allegheny.edu
Tepper A. (2003) Green florescent protein. www.chem.leidenuniv.nl
Thimann K.V. (1980) The senescence of leaves. Senescence in Plants, CRC Press,
85p.
Thimann K.V. (1992) Antagonisms and similarities between cytokinins, abscisic acid and
auxin. Physiology and Biochemistry of Cytokinins in Plants, SPB Academic Publishers,
395p.
Thimann K.V. and Skoog F. (1964) On the inhibition of bud development and other
functions of growth substances in Vicia faba. Proc R Soc., 114: 317.
Tinland B., Schoumager F., Gloecker V., Bravo Angel A.M. and John B. (1995) The
Agrobacterium tumefaciens virulence D2 protein is responsible for precise integration of
T-DNA into the plant genome. EMBO Journal, 14: 3585-3595.
Turner J.E., Mok M.C. and Mok D.W.S. (1985) Zeatin metabolism in fruits of Phaseolus,
comparison between embryos, seedcoat, and pod tissues. Plant Physiology, 79: 321.
Ulstov P., Nielsen T.H., Seiden P. and Marcussen J. (1992) Cytokinins and leaf
development in sweet pepper (Capsicum annuum L.) I. Spatial distriburion of endogenous
cytokinins in relation to leaf growth. Planta, 177: 476.
Van Dale. (2003) Hedendaags Nederlands. www.vandale.nl
Van Staden J., Cook E.L. and Nooden L.D. (1988) Cytokinins and senescence.
Senescence and Aging in Plants. Academic Press, 281p.
Von Sengbush P. (2002) Cytokinine. http://www.biologie.unihamburg.de
Walsh A.S. (2003) Quorum sensing in Agrobacterium tumefaciens. Molecular Biology of
Prokaryotes.
78
Werbrouck S. (2001). Biotechnologie. Cursus Hogeschool Gent, CTL.
Wilson R. (2003) Natorp’s. http://www.natorp.com/Petunia.htm
Wood
A.
(2003)
Copendium
of
Pesticide
Common
Names.
http://www.hclrss.demon.co.uk
Wooley D.J. and Wareing P.F. (1972) The interaction between growth promoters in
apical dominance. I. Hormonal interaction, movement and metabolism of a cytokinin in
rootless cuttings. New Phytol., 71: 781.
Yu Y. , Yang S.F., Corse J., Kuhnle J.A., Hua, S. (1981) Structures of cytokinins
influence synergistic production of ethylene. Phytochemistry, 20: 1191.
Zeevaart J.A.D. (1978) Phytohormones and flower formation. Plant Hormones and
Related Compounds, Vol. II, Elsevier, 291p.
Zubko E., Adams C.J., Machaekova I., Malbeck J., Scollan C. and Meyer P. (2002)
Activation tagging identifies a gene from Petunia hybrida responsible for the production of
active cytokinins in plants. Plant Journal, 26 (6): 797-808.
79