Nederlandse Samenvatting

Samenvatting
Curriculum Vitae
Samenvatting
Samenvatting
Het is slechts vijftig jaar geleden dat de wetenschappers Watson en Crick, mede
door kennis van het werk van Franklin, de structuur van DNA wisten te herleiden,
en daarmee het werkingsmechanisme dat ten grondslag ligt aan erfelijkheid. Dit
was een doorbraak in de moleculaire biologie. Sindsdien is men steeds beter in
staat het functioneren van de levende cel te begrijpen, maar het huidige beeld is
nog lang niet compleet.
In een cel is sprake van een complex samenspel van allerlei moleculen. DNA, RNA,
eiwitten, lipiden, koolhydraten en andere kleine moleculen interacteren
voortdurend om processen zoals celgroei, metabolisme en celdeling mogelijk te
maken. Dit samenspel zorgt er dus ook voor dat de cel zijn functie binnen het
organisme kan vervullen. Eiwitten spelen een cruciale rol in veel voor de cel
essentiële processen. Elk eiwit heeft zijn eigen functie: bijvoorbeeld structuur
geven aan de cel, specifieke chemische reacties uitvoeren, een signaal doorgeven
of het reguleren van cellulaire processen.
Het disfunctioneren van een eiwit kan het complexe evenwicht van verschillende
factoren in een cel of orgaan zodanig verstoren, dat een ziekte het gevolg is. Het
is echter zeldzaam dat een ziekte een gevolg is van een enkel disfunctioneel eiwit.
Bij de meeste ziektes is er sprake van het “verkeerd” functioneren van meerdere
eiwitten. De onderliggende oorzaak voor disfunctie van een eiwit kan heel
verschillend zijn: zo kan bijvoorbeeld het voor het eiwit coderende DNA schade
opgelopen hebben, of het eiwit kan een verkeerd signaal van buiten krijgen
(waardoor het actief is op momenten dat het niet actief zou moeten zijn) of er
wordt teveel van een specifiek eiwit aangemaakt.
Proteomics als middel om cellulaire processen en ziektes te begrijpen
Proteomics is de analyse van eiwitten zoals ze in levende cellen, weefsels of
organen voorkomen. Per cel kunnen wel tienduizenden verschillende eiwitten
actief zijn. In proteomics onderzoek is het streven om een zo compleet mogelijk
beeld te verkrijgen van de eiwitten die in een cel, weefsel of orgaan aanwezig zijn.
Dat wil zeggen dat men zoveel mogelijk eiwitten wil identificeren en tevens een
idee wil hebben van de concentratie per eiwit.
Tevens worden vergelijkende studies gedaan, om bijvoorbeeld zieke cellen te
vergelijken met normaal functionerende cellen. Zo kan de onderzoeker vaststellen
of bij zieke cellen bepaalde eiwitten meer of juist minder voorkomen. Op deze
manier kan de ziekte beter begrepen worden. Dit is proteomics in een notendop.
Voor het bestuderen van ziektes, maar ook voor normale processen als groei, kan
proteomics dus een zeer nuttige benadering zijn. Een analyse kan verduidelijken
wat de onderliggende oorzaak van de ziekte is, of een beter beeld geven van de
progressie van een ziekte, of soms zelfs aanknopingspunten geven voor een
therapie.
118
Samenvatting
Hoe worden die eiwitten nu geanalyseerd? In de conventionele proteomics aanpak
worden de eiwitten van elkaar gescheiden op basis van hun grootte en hun
isoelectrisch punt (pI, de pH oftewel zuurgraad waarbij het eiwit ongeladen is).
Deze techniek heet 2D-gelelectroforese.
Vervolgens kan de onderzoeker twee monsters met elkaar te vergelijken: een
controle monster, met eiwitten van “normale” cellen, en een monster met eiwitten
van bijvoorbeeld “zieke” cellen. De interessante eiwitten (die gerelateerd lijken te
zijn aan de ziekte) zal de onderzoeker vervolgens uit de gel isoleren, opwerken en
identificeren met behulp van massaspectrometrie (MS). Bij deze zeer gevoelige
detectietechniek kunnen moleculen worden geïdentificeerd op basis van de
verhouding tussen lading en massa.
Deze conventionele proteomics methode is alles bij elkaar echter zeer
arbeidsintensief. De hele procedure hierboven beschreven kan een aantal dagen
in beslag nemen. Bovendien zijn er problemen met reproduceerbaarheid en
kunnen bijvoorbeeld eiwitten die slecht wateroplosbaar zijn (hydrofobe eiwitten)
niet goed geanalyseerd worden met 2D-gel electroforese.
Shotgun benadering: proteomics met eiwitfragmenten
De zogenaamde shotgun benadering biedt hiervoor een oplossing. De eiwitten
worden hierbij, voorafgaand aan de analyse, door een enzym (meestal trypsine) in
korte fragmenten (peptiden) geknipt. Doordat de onderzoeker nu een
peptidenmengsel heeft in plaats van een eiwitmengsel, kunnen snellere
scheidingsmethoden toegepast worden zoals vloeistofchromatografie (LC) en
capillaire electroforese (CE). Bovendien is voor identificatie directe koppeling met
de massaspectrometer mogelijk. Aan de hand van de geïdentificeerde peptiden
zijn vervolgens weer de oorspronkelijke eiwitten af te leiden, aangezien de meeste
peptiden van een eiwit uniek zullen zijn voor één bepaald eiwit. Als hulp bij de
identificatie zijn databanken (o.a. van het humane genoom) beschikbaar.
Op deze manier kunnen honderden eiwitten in korte tijd geïdentificeerd worden.
De shotgun benadering is minder goed te sturen; de onderzoeker kan niet meer
zelf kiezen welke eiwitten hij wil identificeren en welke niet, zoals bij 2D-gel
electrophorese het geval was. Maar dit wordt ruimschoots gecompenseerd door
de veel hogere analysesnelheid.
Een efficiënte scheidingstechniek die bij de shotgun benadering gebruikt kan
worden is CE. Hierbij vindt de scheiding plaats in een zeer dun capillair (met een
interne diameter van een tiende millimeter). Moleculen (opgelost in een waterig
medium) migreren door het capillair, vooruit gedreven door een elektrisch veld.
De scheiding van stoffen vindt plaats door verschillen in migratiesnelheid. Deze
verschillen worden veroorzaakt worden door verschillen in elektrische lading van
de moleculen zelf, en door verschillen in hun grootte.
Capillary Isoelectric Focusing (CIEF) is een speciale vorm van CE. Hierbij is niet
alleen sprake van een elektrisch veld, maar ook sprake van een pH gradiënt. Deze
techniek is alleen waardevol voor amfotere stoffen: stoffen die zowel een positieve
119
Samenvatting
als een negatieve lading kunnen dragen, afhankelijk van de pH van de oplossing
waarin zij zich bevinden. Voor deze stoffen is er een pH waarde waarbij de
nettolading gelijk is aan nul (de pI waarde). Met behulp van zogenaamde carrier
amfolyten, wordt onder invloed van een elektrisch veld een pH gradiënt gecreëerd
in het capillair. Deze carrier amfolyten zijn commercieel verkrijgbare complexe
mengsels van amfotere stoffen met goede bufferende werking, waardoor een
stabiele pH gradiënt kan ontstaan.
Bij de toepassing van CIEF vinden twee fenomenen plaats. In de eerste plaats
vindt er een rangschikking plaats van amfotere stoffen aan de hand van hun pI
waarde. In de tweede plaats worden de stoffen gefocusseerd. Terwijl de stoffen
zich rangschikken vindt er ook een concentratie (focusing) plaats van de stof.
Hierdoor wordt de kans op succesvolle identificatie en kwantificering van de stof
door de massaspectrometer verbeterd.
Zowel eiwitten als peptiden zijn amfotere stoffen, dus CIEF kan voor beide
gebruikt worden. In dit proefschrift is, aangezien de shotgun benadering gebruikt
wordt, alleen gewerkt met peptide monsters.
Toepassing van CIEF in de shotgun benadering
In dit proefschrift is het gebruik van CIEF als scheidingsmethode voor de shothun
benadering van het proteomics onderzoek beschreven. CIEF is nog niet eerder op
deze manier toegepast. Het was al wel gebruikt voor de analyse van eiwitten,
eventueel direct gekoppeld met een massaspectrometer, maar nog nooit voor de
analyse van peptiden zoals in de hierboven beschreven shotgun benadering. De
analyse van peptiden in plaats van eiwitten heeft als voordeel dat de identificatie
met massaspectrometrie zeer vergemakkelijkt wordt.
Grootste obstakel hierbij is het gegeven dat de aanwezigheid van carrier
amfolyten de koppeling met de massaspectrometer verstoort. Gewoonlijk wordt bij
deze koppeling door middel van een elektrisch hoogspanningveld vloeistof
afkomstig van het scheidingssysteem (CE) in een uiterst fijne spray omgezet. Deze
spray bereikt de massaspectrometer, waar de overgebleven vloeistof verdampt en
enkel nog de te analyseren stoffen (en eventuele vervuilingen) overblijven. Dit
proces is gevoelig voor verontreinigingen, en in het bijzonder voor de nietvluchtige stoffen als de carrier amfolyten.
Hier is dus een probleem: het gebruik van carrier amfolyten, nodig voor een
stabiele pH gradiënt bij de toepassing van CIEF, is niet verenigbaar met de
analyse door de massaspectrometer, welke essentieel is voor de shotgun
benadering.
In hoofdstuk 3 wordt beschreven in hoeverre CIEF van peptidenmengsels mogelijk
is in afwezigheid van carrier amfolyten, of wanneer slechts lage concentraties
carrier amfolyten aanwezig zijn. Het blijkt dat de afwezigheid van carrier
amfolyten ertoe leidt, dat de peptiden dicht op elkaar gestapeld worden tijdens de
focuserende stap. De scheiding is zeer beperkt, waardoor de massaspectrometer
relatief weinig peptiden kan identificeren. Relatief kleine hoeveelheden van carrier
120
Samenvatting
amfolyten kunnen echter al als spacers werken, en een veel betere scheiding
bewerkstelligen. Op deze manier worden meer peptiden geïdentificeerd dan
zonder het gebruik van carrier amfolyten. Er is wel een afname te bemerken van
de gevoeligheid. De optimale concentratie van de carrier amfolyten is afhankelijk
van de concentratie van het monster zelf en de complexiteit ervan.
Deze techniek wordt verder onderzocht in hoofdstuk 5. In CIEF worden de
amfotere stoffen geordend op basis van hun pI waarde Als de carrier amfolyten
worden weggelaten of in relatief lage hoeveelheden aanwezig zijn, wordt de pH
gradiënt echter makkelijk verstoord, en blijkt deze ordening ook verstoord te
raken. Desondanks is er nog wel een sterke correlatie tussen de mobilisatietijd en
de pI. Het blijkt dat hiervan gebruik kan worden gemaakt om de betrouwbaarheid
van de gevonden identificaties te ondersteunen. De methode werd toegepast voor
de analyse van een biologisch monster. Na isolatie van periplasmatische eiwitten
(eiwitten afkomstig van de ruimte tussen celwand en celmembraan) uit
Escherichia coli bacteriën, bleek het mogelijk een groot aantal daarvan succesvol
te analyseren met behulp van CIEF-MS. In totaal werden 159 eiwitten
geïdentificeerd in een enkele analyse.
CIEF en differentiële analyse.
Voor proteomics onderzoek is het echter niet genoeg om eiwitten te kunnen
identificeren, het is ook nodig om verschillende monsters met elkaar te kunnen
vergelijken: de zgn. differentiële analyse. Hoofdstukken 6 en 7 behandelen de
mogelijkheden van differentiële analyse met behulp van CIEF-MS. In dit
proefschrift is gekozen voor het inbouwen van een stabiele zuurstof isotoop 18O in
de peptiden (“normaal” zuurstof is 16O). Door de eiwitten enzymatisch te knippen
in H218O wordt de isotoop ingebouwd en krijgen deze peptiden een grotere massa.
De massaspectrometer kan zo peptiden geknipt in gewoon water ( H216O)
onderscheiden van peptiden geknipt in H218O .
Voor de differentiële analyse van twee monsters wordt het ene monster geknipt in
H216O en het andere in H218O. Vervolgens worden de monsters samengevoegd en
geanalyseerd. Deze techniek wordt al zo’n vijf jaar toegepast in combinatie met LC
als scheidingstechniek. Optimalisatie van de techniek bleek echter nodig. Zo blijkt
de concentratie van het monster tijdens de 18O labeling kritisch te zijn voor goede
resultaten (hoofdstuk 6). Verder dient trypsine (het enzym dat eiwitten in
peptiden knipt) na de reactie geïnactiveerd te worden, omdat anders
teruguitwisseling plaats kan vinden van 18O voor 16O. De oplossingen die hiervoor
tot nu toe in de literatuur geboden zijn waren zeer geschikt voor toepassingen
met LC maar niet voor toepassingen met CE, omdat CE gevoeliger is voor de
aanwezigheid van zuren en andere verontreinigingen.
In dit onderzoek is met succes thermische deactivatie van trypsine getest
(deactivatie door verhitting). Tenslotte is ook aangetoond dat differentiële analyse
met CIEF-MS zeer wel mogelijk is. Concluderend mag men stellen dat CIEF-MS
een geschikte methode is voor gebruik in de shothun-benadering in proteomics
onderzoek.
121
Samenvatting
122