De therapeutische perspectieven van embryonale stamcellen en

FACULTEIT GENEESKUNDE EN
GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN
Academiejaar 2010 - 2011
De therapeutische perspectieven van embryonale
stamcellen en geïnduceerde pluripotente stamcellen.
Marieken VANDEN BROUCKE
Promotor: Björn Heindryckx
Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding tot
MASTER IN DE GENEESKUND
Inhoudsopgave
ABSTRACT.................................................................................................................................................... 3
INLEIDING.................................................................................................................................................... 3
METHODOLOGIE ....................................................................................................................................... 4
RESULTATEN................................................................................................................................................ 4
1.1DE STAMCEL............................................................................................................................................... 4
1.1.1De normale embryogenese............................................................................................................... 4
1.1.1.1De eerste week............................................................................................................................................................. 4
1.1.1.2De tweede week........................................................................................................................................................... 4
1.1.1.3De derde week............................................................................................................................................................. 4
1.1.2Definitie........................................................................................................................................... 4
1.1.3Indeling............................................................................................................................................ 4
1.1.3.1Indeling volgens ontwikkelingspotentieel.................................................................................................................... 5
1.1.3.2Indeling volgens oorsprong ......................................................................................................................................... 5
1.2DE GESCHIEDENIS VAN HET STAMCEL ONDERZOEK ..............................................................................................6
1.3STRATEGIEËN VOOR REPROGRAMMERING OF DE PRODUCTIE VAN PATIËNT SPECIFIEKE STAMCELLEN................................ 6
1.3.1Nucleaire transfer (NT) of Somatische Cel Nucleaire Transfer (SCNT)...........................................6
1.3.2Fusie................................................................................................................................................ 7
1.3.3Spontane reprogrammering door kweekcondities............................................................................ 7
1.3.4Geïnduceerde pluripotente stamcellen............................................................................................. 7
1.3.4.1Mechanisme van de belangrijkste 4 transcriptiefactoren............................................................................................. 8
1.4ROL VAN DE EPIGINETICA BIJ REPROGRAMMERING .............................................................................................. 8
1.4.1In vivo reprogrammering................................................................................................................. 8
1.4.2Na de fertilisatie.............................................................................................................................. 8
1.4.3Pluripotentie en epigenetica............................................................................................................ 8
1.4.4Epigenetica en differentiatie............................................................................................................ 9
1.4.4.1De transcriptie factoren................................................................................................................................................ 9
1.4.4.2De epigenetische factoren die het cellot bepalen. ........................................................................................................ 9
1.4.4.3Factoren die het cellot vastleggen................................................................................................................................ 9
1.5MOLECULAIRE HANDTEKENING VAN PLURIPOTENTIE.......................................................................................... 10
1.6TESTEN VOOR PLURIPOTENTIE ...................................................................................................................... 10
1.6.1De strengste test............................................................................................................................. 10
1.6.2Minder strenge testen maar bruikbaar bij de mens........................................................................ 10
1.6.2.1Testen voor het differentiatie-potentieel in vitro........................................................................................................ 10
1.6.2.2in vivo........................................................................................................................................................................ 11
1.6.2.3Morfologie en cel cyclus............................................................................................................................................ 11
1.6.2.4Genexpressie en epigenetica...................................................................................................................................... 11
1.6.3Pluripotentie categorieën .............................................................................................................. 11
1.6.4De gouden standaard is onderweg................................................................................................. 12
1.7ES CELLEN............................................................................................................................................... 12
1.7.1Ontdekking..................................................................................................................................... 12
1.7.2Ethiek............................................................................................................................................. 12
1.7.3Problemen en oplossingen............................................................................................................. 12
1.7.3.1Xeno-free................................................................................................................................................................... 12
1.7.3.2Productie op grote schaal........................................................................................................................................... 14
1.8IPS-CELLEN.............................................................................................................................................. 14
1.8.1De ontdekking ->perfectioneren selectieprocedure -> betere populatie........................................14
1.8.2iPS-cellen versus ES cellen............................................................................................................ 14
1.8.2.1Ethisch....................................................................................................................................................................... 15
1.8.2.2Immuunafstoting........................................................................................................................................................ 15
1.8.2.3Ziektemodelen........................................................................................................................................................... 15
1.8.2.4Carcinogenese............................................................................................................................................................ 15
1.8.2.5Efficiëntie.................................................................................................................................................................. 15
1.8.3zijn ES-cellen en iPS-cellen gelijk?................................................................................................ 15
1.8.3.1Moleculaire testen...................................................................................................................................................... 16
1.8.3.2Biologische testen...................................................................................................................................................... 16
1.8.4Mogelijke problemen en oplossingen ............................................................................................ 16
1.8.4.1Efficiëntie van iPSC reprogrammering...................................................................................................................... 16
1.8.4.2Inbreng van virale factoren........................................................................................................................................ 16
2
1.8.4.3De selectie van volledig gereprogrammeerde cellen.................................................................................................. 17
1.9TOEKOMSTIGE TOEPASSINGEN VAN ES CELLEN EN IPS-CELLEN IN DE REGENERATIEVE GENEESKUNDE ......................17
1.9.1Ruggenmergletsels......................................................................................................................... 17
DISCUSSIE................................................................................................................................................... 18
REFERENTIELIJST................................................................................................................................... 19
Marieken Vanden Broucke
Pagina
3
Abstract
Humane embryonale stamcellen en geïnduceerde pluripotente stamcellen worden voorgesteld als een
waardig alternatief voor regeneratieve geneeskunde. Voor dit kan omgezet worden in de praktijk moeten er
verschillende obstakels worden overwonnen. Zo kan het gebruik van dierlijke producten bij de isolatie en het
kweken van de cellen leiden tot pathogene overdracht en immuunreacties, is er een risico op carcinogenese,
staan de differentiatieprotocollen vaak nog niet op punt, is de zuivering van gedifferentieerde cellen vaak
onvoldoende en kan het gebruik van integrerende vectoren bij de generatie van geïnduceerde pluripotente
stamcellen insertionele mutagenese veroorzaken. Toch werden er al successen geboekt en is de eerste
klinische trail van start gegaan.
Inleiding
Alle 220 gespecialiseerde celtypes in ons lichaam vinden hun oorsprong vanuit 1 unicellulaire bevruchte
eicel, de zygote (1). Dit wonderbaarlijke proces intrigeert dan ook al eeuwen vele wetenschappers.
In de jaren 1880 kwam de bioloog August Weisman met de eerste theorie die dit ontwikkelingsproces kon
verklaren, de 'germ plasm' theorie. Hij stelde dat de grote verschillen tussen de verschillende celtypes
veroorzaakt worden door een asymmetrische deling. Alle cellen zouden dus een verschillende fractie krijgen
van het genetisch materiaal van de zygote en op deze manier verschillende kenmerken verkrijgen.
Maar in 1938 werd dit idee definitief afgedaan. Hans Spemann wist uit één bevruchte eicel van een
salamander, twee salamanders te ontwikkelen, onafhankelijk van elkaar. Hiermee werd het principe van
nucleaire equivalentie in het leven geroepen. Cellen splitsen zich symmetrisch waardoor alle cellen dus het
zelfde genetisch materiaal bevatten(2).
In 1952 werd dit voor goed bewezen door een baanbrekend experiment van Thomas King en Robert Briggs.
De twee wetenschappers verwisselden de kern van een onbevrucht eicel voor een kern van een later
ontwikkelingsstadium( het blastulastadium). Dit proces staat nu bekend als Nucleair Transfer (NT) of
klonen. Uit deze eicel ontstond een volledig kikkerembryo(2). King en Briggs waren er echter van overtuigd
dat dit op een bepaald moment in de ontwikkeling niet meer mogelijk was. Er zouden dus irreversibele
veranderingen optreden bij het ontwikkelingsproces (2). Maar later werden ook NT experimenten succesvol
uitgevoerd met verdere ontwikkelingsstadia. De meest ophefmakende was Dolly. Dit gekloonde schaap werd
in 1997 geboren. Ze was het succesvol resultaat van een klonering experiment waarbij een volwassen cel als
donorcel werd gebruikt. Het was de eerste keer in de geschiedenis dat dit gebeurde bij zoogdieren (1).
Hiermee werd er definitief aangetoond dat er geen irreversibele processen plaatsvinden bij het
ontwikkelingsproces. De reversiebele veranderingen die aan de basis liggen van het differentiatie proces
worden nu epigenetische fenomen genoemd (2).
Door deze epigenetische factoren te beïnvloeden zou men dus de differentiatie van een cel kunnen sturen en
op deze mannier specifieke cellen kunnen kweken in vitro. Dit kan vele mogelijkheden bieden. Want
weefsels en cellen zijn momenteel onvoldoende voorhanden zowel voor donatie/ transplantatie in de
regeneratieve geneeskunde, als voor onderzoek naar geneesmiddelen, biologische en pathologische
4
processen. Ook zou men door de nieuwe kennis over het ontwikkelingsproces, nieuwe strategieën kunnen
ontwikkelen om bepaalde ontwikkelingsstoornissen te behandelen (3-5).
De ontwikkeling van deze weefsels kan men op twee mannieren betrachten. Ten eerste kan men een
volwassen cel reprogrammeren naar een ander type gedifferentieerde cel (transdifferentiatie of lineage
conversion). Maar men kan ook een stamcel in vitro laten differentiëren naar het gewenste celtype. Enkel dit
laatste is opgenomen in deze masterproef (1).
Om embryonale stamcellen te kunnen gebruiken moet men deze eerst in vitro kunnen kweken zonder dat ze
spontaan differentiëren. Dit werd in 1981 mogelijk voor embryonale stamcellen afkomstig van de Inner Cel
Mass (ICM) van een muizenblastocyst maar pas in 1998 werd dit ook mogelijk voor menselijke embryonale
stamcellen (1). Deze stamcellen zijn pluripotent, dit betekend dat ze alle cellen uit de 3 kiembladen
(ectoderm, endoderm en mesoderm) kunnen voortbrengen maar geen oorsprong geven aan de extraembryonale structuren zoals de placenta (1). Omdat er een bevruchte eicel wordt vernietigd die eigenlijk tot
een menselijk individu kan leiden, vormt dit volgens sommigen een ethisch probleem. Ook al zijn deze
embryo’s meestal overtallige embryo’s na In Vitro Fertilisatie (IVF). De ethische bezwaren vormden dan ook
lang een blok aan het been van het stamcelonderzoek (6). In 2006 slaagde men er in om met behulp van
transfectie met welbepaalde transcriptiefactoren een volwassen cel om te vormen tot cellen die zeer veel
gelijkenissen vertoonden met embryonale stamcellen, de geïnduceerde pluripotente stamcel of iPSC
(induced pluripotent stem cells)(7) . Men zou zelf durven stellen dat ze identiek zijn aan embryonale
stamcellen maar dit moet nog definitief bewezen worden. De introductie van de iPSC heeft nog een grotere
therapeutische waarde, aangezien deze, in theorie patiënt specifieke regeneratieve geneeskunde mogelijk
maakt. Imuunafstoting zou hier geen probleem meer vormen ((1, 4, 5, 8), maar recente publicaties toonden
aan dat de overexpressie van bepaalde factoren in iPSC toch immuunafstoting zou veroorzaken (9). De
reprogrammering van cellen kan ook op andere manieren maar deze zijn minder gemakkelijk toe te passen in
een klinische context (10).
Nu men dus stamcellen heeft om te differentiëren, komt de stap naar de therapie veel dichter. Maar de weg is
nog lang en er is nog veel onderzoek nodig vooraleer dit werkelijkheid kan worden.
De differentiatie van de embryonale stamcellen (ES cellen) en de geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS
cellen) staat nog lang niet op punt, de productie van deze cellen is nog te inefficiënt en de protocollen
bevatten vaak nog dierlijke producten en cellen die een risico op pathogene overdracht geven. Het inbrengen
van transcriptiefactoren, bijvoorbeeld bij de generatie van IPS cellen, vormt tevens een risico op ongunstige
mutaties. Ook is het een inherente eigenschap van stamcellen om ongelimiteerd te delen. Dit zorgt dat een
onvolledige zuivering van de gedifferentieerde cellen van de onvolledige gedifferentieerde cellen kan leiden
tot tumorvorming in vivo (1, 4, 5, 8).
Er zijn echter al verschillende hoopgevende studies op dieren gepubliceerd. Deze tonen aan dat de
therapeutische mogelijkheden van embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen hoopvol zijn. Zo zijn
er studies die positieveresultaten toonden bij ruggenmergletsels, Parkinson, diabetes, sikkelcelanemie,
hartinfarcten en andere. Recent is het eerste humane klinische onderzoek van start gegaan die zal uitwijzen
Marieken Vanden Broucke
Pagina
5
of stamceltherapie gebruik makend van embryonale stamcellen recent opgelopen ruggenmergletsels bij de
mens kan helpen herstellen. Het is nog afwachten naar de resultaten (3).
Methodologie
Om dit werkstuk te creëren ging ik eerst op zoek naar de basiskennis waar ik op kon verder bouwen. Deze
informatie vond ik op de website; http://stemcells.nih.gov/ Deze is opgesteld door de National Institut of
Health en bevat vele interessante links maar vooral goede basis informatie die zonder veel voorkennis te
begrijpen valt. De opgedane kennis maakte me in staat om mijn onderwerp beter af te bakenen en een aantal
zoektermen te selecteren. Met behulp van Pubmed en een combinatie van verschillende zoektermen zoals;
embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells, differentiation, derivation, cellulair reprogramming,
epigenetics, therapeutic, telomerase, spinal cord injury, maakte ik een selectie van de meest relevante
artikels. Dit eerst op basis van de titel en het publicatiejaar en daarna door het lezen van de abstracts. Van de
duizenden gevonden publicaties werden er uiteindelijk 65 geselecteerd.
Resultaten
1.1 De stamcel
1.1.1
De normale embryogenese.
1.1.1.1 De eerste week
Na de versmelting van de eicel met de zaadcel in de eileider, reist de bevruchte eicel verder naar de
baarmoeder. Tijdens deze reis gaat de nieuw samengestelde cel, de zygote zich delen, dit gebeurt echter
zonder toename in volume waardoor deze delingen ook vaak klievingsdelingen worden genoemd. Het aantal
cellen stijgt dus, maar het totale volume van het embryo niet. De cel deelt zich in 2 ,daarna in 4, dan in 16
enzo verder. Na compactie van het embryo vindt de eerste differentiatie plaats waarbij de cellen
differentiëren in twee groepen; een buitenste cellaag en een binnenste cel massa. De buitenste cellaag noemt
men de trofoblast en zal later oorsprong geven aan een groot deel van de placenta en de hieraan
geassocieerde membranen. De binnenste cel massa (inner cell mass), ook wel embryoblast genoemd geeft
oorsprong aan het volledig embryo en het amnion. Op dit blastocyst stadium ontstaat er tussen de cellen een
met vocht gevulde holte, de blastocoele. Dit is op de 5de tot 6de dag (naargelang de species) van de
ontwikkeling waarbij het embryo uit een holle bal bestaat uit ongeveer 100 cellen. Op dit punt betreedt het
embryo de uterus en kan de innesteling beginnen(11, 12).
1.1.1.2 De tweede week
In het begin van de 2de week vindt de tweede segregatie plaats, waarbij de embryoblast zich splitst in het
epiblast of primair ectoderm en de hypoblast of primair endoderm. In de epiblast vormdt zich een holte de
amnion holte. Deze wordt afgelijnd door afgeplatte epiblastcellen die de amniotisch membraan vormen. De
rest van het epiblast en het hypoblast vormen een bilaminaire groeischijf. Deze groeischijf zal later instaan
voor het eigenlijke embryo en enkele van de extra-embryonale membranen. Tijdens de 2de week van de
ontwikkeling zullen er cellen vanuit het hypoblast migreren om de blastocoele om te vormen tot de primaire
6
dooierzak, hierna zal een tweede migratiegolf deze primaire dooierzak omvormen in de definitieve of
secundaire dooierzak (11, 12).
In het midden van de tweede week ontstaat het extra-embryonaal mesoderm. Deze cellaag is nog van
bediscussieerde oorsprong maar vormt zich tussen enerzijds de trofoblast en anderzijds de dooierzak. Een
nieuwe holte, de chorionholte vormt zich tussen twee lagen van het extra-embryonaal mesoderm.
Ondertussen gaat de implantatie van het embryo in de uterus verder met opsplitsing van het trofoblast
weefsel in de cytotrofoblast die het endometrium invadeert en hierbij de blastocyst in de uterine wand trekt,
en het syncytiotrofoblast die de perifere aflijning van het embryo verzorgd. Vanaf de tweede week wordt het
begin van de placenta waargenomen. Hierbij werken het extra-embryonaal mesoderm en het
trofoblastweefsel samen met de uterus via de vorming van chorion villi die ingroeien in maternale
bloedsinussen(11, 12).
1.1.1.3 De derde week
De belangrijkste gebeurtenis in de 3de week na de bevruchting is de gastrulatie. Deze start met het ontstaan
van de primitiefstreep, in het epiblast dicht bij het caudale einde van de bilaminaire groeischijf. Bovenaan
deze streep bevindt zich een indeuking, de primitieve pit omringd door een ophoging die men de primaire
knoop noemt. De epiblastcellen kunnen nu migreren aldoor de primitiefstreep naar de toekomstige ruimte
tussen het epiblast en het hypoblast. Sommige van deze epiblast cellen invaderen het hypoblast en vervangen
op deze wijze het primair endoderm door het definitieve of secundaire endoderm. Tussen de epiblast en het
endoderm vormen de invaderende epiblastcellen een derde laag, het intraembryonaal mesoderm. Het epiblast
of primair ectoderm word omgevormd tot het definitieve ectoderm. De gastrulatie vormt de bilaminaire
kiemschijf om tot een trilaminaire kiemschijf met een endoderm, mesoderm en ectoderm. Deze trilaminaire
kiemschijf vormt het vertrekpunt van de organogenese(11, 12).
1.1.2
Definitie
“Een stamcel is een ongespecialiseerde, pluripotente, klonogene voorlopercel die bij gebruik van de juiste
kweekmedia niet alleen in leven kan worden gehouden, maar zichzelf kan vernieuwen door celdeling en die
in bepaalde omstandigheden tot verschillende weefselspecifieke cellen kan differentiëren; een stamcel bij
uitstek en in optima forma is de bevruchte eicel (zygote)” (13).
“A stem cell is a cell that is capable of self-renewal to an extent that it can perpetuate itself indefinitely”(14).
We kunnen dus besluiten dat een stamcel twee belangrijke eigenschappen bezit. Ten eerste bezit ze een
bepaald differentiatiepotentieel, ten tweede heeft ze de mogelijkheid om zichzelf onbeperkt en
ongedifferentieerd te vernieuwen doormiddel van celdeling.
1.1.3
Indeling
De indeling van stamcellen gebeurt meestal aan de hand van hun ontwikkelingspotentieel en op basis van
hun oorsprong.
Marieken Vanden Broucke
Pagina
7
1.1.3.1
Indeling volgens ontwikkelingspotentieel
1.1.3.1.1 Totipotente stamcellen
“Totipotentie: het vermogen van embryonale cellen om zich in alle richtingen te differentiëren”(13).
Wanneer de zaadcel versmelt met de eicel, ontstaat een zygote. Een zygote is een voorbeeld van een
totipotente stamcel; deze cel is namelijk in staat om uit te groeien tot een compleet organisme (alle 220+
verschillende cellen) inclusief het extra-embryonaal weefsel zoals placenta, moederkoek,... (1) De vroege
blastomeren die ontstaan door klievingsdelingen van de zygote zijn ook totipotent (10).
1.1.3.1.2 Pluripotent
Op het blastocyst stadium zal de eerste vorm van differentiatie gebeuren. De cellen splitsen zich op in een
trofoblast aflijning en een inner cell mass die respectievelijk instaan voor de ontwikkeling van de extraembryonale structuren en het eigenlijke embryo (11). De cellen van de inner cell mass zijn pluripotent, wat
wil zeggen dat ze aanleiding kunnen geven tot zowel endodermale, ectodermale en mesodermale structuren.
Ook Embryonale stamcellen en epiblast stamcellen zijn pluripotent (1).
1.1.3.1.3 Multipotent
Multipotente stamcellen zijn cellen die tot een beperkt aantal celtypes kunnen differentiëren. Hun
differentiatie en proliferatiemogelijkheden zijn meer beperkt daar ze enkel tot cellen van één kiemlaag
kunnen differentiëren, hoewel men heeft aangetoond dat ze ook over een zeker plasticiteit beschikken. Ze
zijn vaak committed prognitors. De meeste multipotente stamcellen zijn volwassen stamcellen (adult stem
cells of AS-cellen). Een volwassen stamcel is een nog niet gedifferentieerde of een niet-gespecialiseerde cel
die na de geboorte voorkomt in een gedifferentieerd en gespecialiseerd weefsel van een organisme. Ze zijn
nodig in het lichaam om bepaalde cellen met een korte levensduur te vervangen. Voorbeelden van AS zijn de
hematopoietische (bloedvormende) stamcellen, neurale stamcellen uit hersenweefsel, stamcellen in huid- en
vetweefsel. Aanvankelijk was men er vast van overtuigd dat de AS zeer geringe differentiatie- en
proliferatiemogelijkheden had. Maar recent onderzoek van de Belgische onderzoekster Catherine Verfaillie
bewees het tegendeel. Ze slaagde erin AS toch te laten differentiëren tot cellen van een ander kiemblad (15)..
Wanneer committed prognitorcellen van de embryo in verschillende micro-omgevingen worden geplaatst
kan het lot van de cellen veranderen en kunnen ze plots toch in staat zijn om cellen van een ander kiemlaag
te produceren, alhoewel dit met slechts zeer lage efficiëntie gebeurt, dit fenomeen noemt men plasticiteit
(16).
1.1.3.1.4 Unipotent
Unipotente stamcellen zijn in staat om aan één welbepaald type gedifferentieerde cel oorsprong te geven.
Testiculaire stamcellen zijn hier een voorbeeld van (1).
1.1.3.2
1.1.3.2.1
Indeling volgens oorsprong
Embryonale stamcellen of ES
8
“Een embryonale stamcel is een pluripotente cel die uit de ICM van een blastocyst wordt geïsoleerd; deze
cellen zijn in principe uitermate geschikt voor weefselgeneratie, maar het gebruik ervan is beperkt door
tumorgeniciteit; daarom worden vaak somatische, meer weefselspecifieke stamcellen gebruikt, bijv.
stamcellen uit darmcrypten of uit de basale laag van de epidermis, waaruit dan uitsluitend resp.
darmepitheel of huid kan ontstaan(13).”
Embryonale stamcellen worden gepreleveerd in het pré-implantatiestadium wat hun dus doet verschillen
van de epiblast stamcellen. Beiden zijn echter pluripotent maar er zijn wel duidelijke verschilpunten (12).
1.1.3.2.2 Epiblast stamcellen
De epiblast stamcellen vinden net als de embryonale stamcellen hun oorsprong uit de cellen van de inner
cell mass maar deze keer na de implantatie van het embryo. Ze zijn pluripotent maar hun
ontwikkelingspotentieel is beperkter. Zo zijn ze minder efficiënt in het genereren van chimeren en hebben
reeds een X-chromosoom inactivatie ondergaan. Ook vertonen ze een heterogene expressie van vroege
lijnspecifieke markers (12). Muizen EpiSCs hebben meer gelijkenissen met humane ES-cellen dan dat de
muizen ES-cellen hebben (2, 12) .
1.1.3.2.3 Foetale stamcellen
“Cells derived from a FETUS that retain the ability to divide, proliferate and provide progenitor cells that
can differentiate into specialized cells.” (Mesh)
1.1.3.2.4
zie verder
Gereprogrammeerde cellen
1.2 De geschiedenis van het stamcel onderzoek
1883
“Germ plasm” theorie; cellulaire differentiatie zou worden verklaard door asymmetrische
deling (August Weismann) (2).
1938
Nucleaire equivalentie wordt aangetoond aan de hand van het bekomen van 2 volledige
salamanders uit 1 bevruchte eicel. Er werd bewezen dat wanneer cellen delen de dochter
cellen de zelfde erfelijke informatie bevatten als elkaar en als de voorloper cel.
(Spemann) (2).
1952
Eerste nucleair transfer (NT) experiment bij kikkers (Briggs and King) Waarbij cellen van
het blastula stadium werden getransplanteerd samen met nucleoplasma in een onbevrucht
eitje. Thomas King en Robert Briggs waren er echter van overtuigd dat dit enkel mogelijk
was bij vroeg embryonale cellen en dat onze cellen dus irreversibele veranderingen
ondergaan bij hun maturatie (1, 2).
1962
John Gurdon en zijn collega’s publiceerden een onderzoek waarin nucleaire transfer
experimenten werden uitgevoerd met latere ontwikkelingsstadia zoals de intestinale
cellen van een kikkervisje. Hij toonde aan dat het epiginoom van gedifferentieerde cellen
gereset kan worden naar een pluripotente status (1, 2, 12).
Marieken Vanden Broucke
Pagina
9
1964
Demonstratie dat embryonic carcinoma cellen (EC cellen) afkomstig uit teratoma's
pluripotent zijn( Kleinsmith en Pierce) (1) .
1976
De eerste pluripotente cel die men in een laboratorium kon kweken was afkomstig van een
kiemceltumor meer bepaald een teratocarcinoma. Wanneer deze kanker cellen uitgezet
worden in een weefsel cultuur vormen er zich embryonale carcinoma cellen. Dit
demonstreerde dat kankercellen gereprogrammeerd kunnen worden tot pluripotente cellen
(1).
1976
EC cellen kunnen somatische cellen reprogrammeren in hybriden (Millers Ruddle) (1).
Thymocieten werden door een fusie experiment met embryonale carcinomacellen
gereprogrameerd tot pluripotente cellen (17).
1981
Isolatie van muis embryonale stamcellen uit de inner cell mass (ICM) van muis
blastocysten. (Evans en Kaufman, Martin) (2)
1987
Transdifferentiatie van fibroblasten naar spiercellen door middel van Myod (Davis et all.)
(2)
1992
Isolatie van muis embryonale germ cellen (EG cellen) uit foetale germ cellen (Resnick er
al en Matsui et al.). (2)
1997
Eerste gekloonde zoogdier uit een volwassen cel (Dolly) (Wilmut et al.) . (2)
1998
Derivatie van humane ES cellen (Thompson et al.). (2)
2006
Eerste geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS-cellen) gegenereerd uit volwassen muis
fibroblasten (Takahashi en Yamanaka) (7).
1.3 Strategieën voor reprogrammering of de productie van patiënt
specifieke stamcellen
Muizen en menselijke embryonale stamcellen kunnen geïsoleerd worden uit de ICM van de blastocyst. Ze
worden als een waardevolle bron voor celtransplantatie therapie beschouwd. Er is echter nog steeds immuun
afstoting mogelijk waardoor de toepassing van deze transplantaties bemoeilijkt wordt. Deze problemen
kunnen gedeeltelijk worden opgelost door somatische volwassen cellen te reprogrammeren(10).
Reprogrammering is een fysiologisch verschijnsel tijdens de levenscyclus in het vroege embryo en de
kiemcellen maar kan ook worden bereikt in vitro waarbij epigenetische markers gereset worden om een
wijder ontwikkelingspotentieel te verkrijgen(18). Op deze wijze reset men als het ware een ander celtype
(meer gedifferentieerd) naar de pluripotente stamcel status. Een andere mogelijkheid voor de generatie van
patiënt specifieke cellen is de mogelijkheid tot transdifferentiëren van bepaalde cellen naar een andere
weefselspecifieke cellijn(1).
Men moet er rekening mee houden dat cellen in weefselculturen in contrast tot cellen die zich in het embryo
bevinden , blootgesteld worden aan andere selecterende condities, en dit resulteert in cellulaire statussen die
niet zijn zoals men ze zou zien in vivo. Aangezien deze cellen zich aanpassen aan de proliferatie in
weefselculturen die slechts ten dele de situatie in vivo benadert(8).
10
1.3.1
Nucleaire transfer (NT) of Somatische Cel Nucleaire Transfer (SCNT)
De eerste Nucleaire Transfer experimenten werden ontwikkeld om te evalueren of de kern van een
embryonale cel identiek is aan deze van een volwassen somatische cel. Nucleair transfer experimenten met
amfibieën in de jaren 50 en 60 en later bij zoogdieren demonstreerden dat het genoom van volwassen cellen
en zelf dat van terminaal gedifferentieerde cellen de capaciteit behouden om oorsprong te geven aan
levensvatbare klonen. Dit is een bewijs dat de beperking in differentiatiepotentieel tijdens de ontwikkeling
het gevolg is van epigenetische modificaties, in plaats van genetische veranderingen (1). Wanneer een
nucleus van een gedifferentieerde somatische cel wordt getransplanteerd in een ontkernde oocyt of een
ontkernde stamcel, word nucleaire herprogrammering geïnitieerd. Na artificiële activatie van de
gereconstrueerde eicel kan deze uitgroeien in vitro tot een embryo. Wanneer dit gekloonde embryo ingeplant
wordt in een baarmoeder kan dit aanleiding geven aan een volledig organisme met het genetisch materiaal
van de donor. Dit laatste word klonen genoemd. Dit soort experimenten toonde voor eens en voor altijd aan
dat er geen irreversibele veranderingen gebeuren bij het differentiatie proces (op enkele uitzonderingen na
zoals homologe recombinatie in de lymfocyten). Met andere woorden cel differentiatie gaat gepaard met
veranderingen in gen expressie en niet met veranderingen in genetische substantie(16).
Dit geeft een indicatie dat er factoren aanwezig zijn in de recipiënt cel die het genetisch materiaal van de
donor epigenetisch kunnen modificeren (17). Maar vele gekloonde dieren vertonen fenotypische en
genetische abnormaliteiten dat suggereert dat nucleaire reprogrammering leidt tot foute epigenetische
reprogrammering. Anderzijds zijn embryonale stamcellen die afkomstig zijn van gekloonde embryo's
verkregen na een NT-experiment niet te onderscheiden van normale ES-cellen. Dit zou kunnen veroorzaakt
worden door een positieve selectie voor volledige reprogrammering die gebeurt bij het kweken in vitro (19).
De amfibieën waren de eerste dieren waarbij er succesvol NT experimenten werden beschreven, de eerste in
1952, Thomas Briggs en Robert King slaagden er toen in om uit de vroege embryonale blastula stadia van
een kikker, via een NT in een ontkernde oocyt, zwemmende kikkervisjes te creëren. Zij slaagden er echter
niet in om dit zelfde te bereiken met verdere ontwikkelingsstadia. Hun besluit was dan ook dat er ergens in
het differentiatieproces, irreversibele genetische veranderingen optraden. Gurdon en zijn collega's konden
later vruchtbare volwassen kikkers ontwikkelen uit een NT-experiment waarbij de intestinale celkernen van
kikkervisjes in een ontkernde eicellen werden gebracht. Wanneer men echter als donorkern een adulte
celkern gebruikte konden er wel kikkervisjes maar geen volwassen kikkers worden gegenereerd (2).
Door de kleinere celgrootte bij zoogdieren is een kerntransplantatie technisch moeilijker. Maar in 1996
kwam er een doorbraak; Wilmut en zijn collega's waren er in geslaagd om uit een gedifferentieerde
volwassen follikelcel een gekloond schaap te laten ontwikkelen. Dit gekloonde dier werd Dolly genaamd en
werd wereldbekend(1). Na Dolly duurde het niet lang voor verscheidene andere zoogdieren werden
gekloond. Zoals honden (20, 21), katten (22), paarden (23, 24), koeien (25, 26) en kamelen (27).
Een omgekeerde relatie tussen de differentiatiegraad en de efficiëntie van reprogrammering zou zowel bij de
amfibieën als de zoogdieren op te merken zijn. (36)
Marieken Vanden Broucke
Pagina
11
Alhoewel het klonen van muizen slechts een zeer lage efficiëntie heeft, is de efficiëntie van de generatie van
muis embryonale stamcellen, via NT, vergelijkbaar met deze van het verkrijgen van gewone muis ESC uit
de ICM van de blastocyst (10).
Het feit dat er onbevruchte eicellen nodig zijn voor deze techniek van SCNT kan beperkingen opleggen
voor de derivatie van menselijke NT-ES-cellen. Maar men heeft ontdekt dat men het zelfde kan bereiken
wanneer men de celkern van een volwassen somatische cel inbrengt in een ontkernde zygote. Bij dit
protocol is het noodzakelijk om tijdens de mitose van de zygote de celcyclus stil te leggen doormiddel van
de toevoeging van nocodazole, de chromosomen te verwijderen en de donor afkomstige mitotische
chromosomen in te brengen. Vooral het stil leggen van de meiose is hier essentieel, aangezien het niet
mogelijk is om cellen ouder dan het vier cellig embryo stadium te kloneren met een interfase zygote als
recipiënt-cel (10, 17, 28). Men slaagde er in om op deze wijze verschillende embryonale stamcellijnen te
ontwikkelen afkomstig van embryonale en somatische donorcellen. Chimere muizen embryo's met germline
transmissie werden op deze mannier gevormd. Dit bewijst hun volledige reprogrammering. Het voorgaand
onderzoek werd uitgevoerd bij de muis, bij de mens werd deze techniek nog niet beschreven maar het zorgt
wel voor de mogelijkheid dat afgedankte embryo's verkregen na IVF behandeling kunnen worden gebruikt
voor de derivatie van NT-ES-cellen in plaats van oocyten (17, 28). Het maakt ook de weg vrij voor de
hypothese dat het mitotisch cytoplasme van de nu al aanwezige humane embryonale stamcellijnen
efficiëntere reprogrammering kan bewerkstelligen dan de vorige geteste interfase extracten.
Volgens Egli en zijn collega's zou het verschil tussen de oocyt versus zygotische cellen als acceptorcel zich
bevinden bij het feit dat de noodzakelijke factoren voor reprogrammering tijdens de interfase slechts
gelokaliseerd voorkomen, waar ze tijdens de meiose net vrijkomen en dus wel kunnen meewerken aan de
reprogrammering (17).
1.3.2
Fusie
Het eerste fusie experiment werd beschreven door Miller en Ruddle. Zij wisten thymocyten te fusioneren
met embryonale carcinoma (EC) cellen. Uit dit huwelijk ontstond een pluripotente tetraploïde hybride cel of
een pluripotente cel met dubbel zoveel genetisch materiaal(17). Later werden de zelfde resultaten geboekt
door fusie met ES cellen en EG cellen (1). Wanneer deze gereprogrameerde pluripotente stamcellen in een
immuungedeprimeerde muizenpopulatie werden ingebracht vormden zich teratoma's die bestonden uit
weefsel afkomstig uit de drie kiemlagen. Ook brengen ze genen tot expressie die centraal staan bij het
verkrijgen en behouden van pluripotentie zoals; Oct4, NANOG en Sox2. Dit bewijst dat ze pluripotent zijn
maar of deze cellen effectief volledig zijn gereprogrameerd weet men nog niet. Verder onderzoek met gen
expressie analyses en chromatine immunoprecipatie analysen zullen de graad van reprogrammering beter
kunnen vaststellen (17, 28) . Door de aanwezigheid van het kernmateriaal van de stamcel waarmee de
somatische cel wordt gefuseerd is er een het probleem van immuunrejectie. Hiervoor zijn verschillende
strategieën bedacht. Het is mogelijk om selectief bepaalde ES-cel afkomstige chromosomen te verwijderen
zoals de Major Histocompatiblillity complex (MHC) loci . Het volledig verwijderen van al het genetisch
12
materiaal afkomstig van de ES-cel wordt een technische uitdaging doordat dit leid tot een ernstige
instabiliteit van het genoom (10). Sommige groepen onderzoekers geven dan ook de voorkeur om te
proberen cellen te reprogrammeren met humaan ES-cel extract afkomstig uit de metafase (17, 28). EScellen, ECC, EpiSC-cellen, EGC's en multipotent germline stamcellen zijn allen in staat om via fusie met
een somatische cel reprogrammering te induceren. Allen zijn afkomstig van het embryo of de kiemcellijn.
De grootste overeenkomst tussen deze cellen in vivo is dat ze allen Oct4 endogeen tot expressie brengen.
Deze transcriptiefactor lijkt op deze mannier gelinkt aan het herwinnen van de pluripotentie na explantatie.
Alhoewel al deze stamcellen pluripotent zijn slaagt men er enkel bij de ES-cellen in om via tetraploïde
complementatie muizen te vormen die enkel afkomstig zijn van de ES-cellen ook all-stamcel-muizen
genaamd. Dit wordt waarschijnlijk veroorzaakt doordat ES-cellen in tegenstelling tot de rest gebalanceerde
parentale imprinting vertonen die noodzakelijk is voor een normale ontwikkeling. De EG-cellen en de mGScellen zijn hun imprinting verloren of hebben een enkel een vaderlijke imprint (19).
1.3.3
Spontane reprogrammering door kweekcondities
Net zoals de ES-cellen niet bestaan in vivo, ze worden getransformeerd en “gereprogrammeerd” door het
lange termijn kweken van de ICM cellen, zo kunnen pluripotente Embryonale germ (EG) cellen worden
gecreëerd door een lange termijn cultuur van primordiale kiemcellen. Deze vaststelling wijst er op dat het
mogelijk moet zijn om pluripotente cellen te genereren doormiddel van het kweken van andere meer mature
celtypes in vitro (10).
De Belgische Catherine Verfaillie en haar collega’s deden dit met adulte stamcellen, door het langdurig
kweken van beenmerg heamotopoetische stamcellen. Ze noemden deze nieuwe soort cellen de Multipotente
adulte prognitor cellen of MAPCs. MAPCs verschillen van de ES-cellen in dat ze een lagere serum
concentratie nodig hebben en op een lage densiteit moeten worden gehouden. Ook kunnen ze in
geselecteerde gevallen chimere muizen vormen en aan de germ line transmissie deelnemen. Maar er is nog
meer onderzoek nodig (29).
Ook door het kweken in vitro van germline stam (GS) cellen afkomstig van neonatale muizentestis kan men
pluripotente stamcellen genereren. Deze werden multipotente germline stam cells genaamd of mGS-cellen.
De kweekmethoden van de GS cellen zijn anders dan deze van de mGs-cellen die op hetzelfde medium als
ES-cellen worden onderhouden. mGS-cellen en ES-cellen hebben verschillende gemeenschappelijke
kenmerken, zo kunnen ze in het zelfde kweekcondities worden gekweekt, hebben ze gelijkaardige
morfologie, proliferatiecapaciteit, teratoma vorming en zelfs medewerking aan chimere muizen met
germline transmissie. Jammer genoeg is de efficiëntie nog steeds zeer laag (er zijn ongeveer 30
experimenten nodig voor 1 geslaagde generatie van mGS cellen) Deze stijgt door het verlies van de p53
functie, een welbekende tumor supressor. Alhoewel mGS-cellen een andere imprinting vertonen dan de GScellen en hun chimere muizen normaal lijken is er nog meer onderzoek nodig naar de carcinogeniteit van de
gedifferentieerde mGS-cel afkomstige cellen (17).
Niet enkel uit het kweken van neonatale testes cellen maar ook van adulte muistestis cellen kunnen germline
competente pluripotente stamcellen worden gegenereerd. Deze worden dan multipotent adult germline stem
Marieken Vanden Broucke
Pagina
13
(maGS)- cellen genoemd. Maar hun mannelijke imprinting kan beperkingen opleggen aan hun
differentiatiepotentieel (17).
Reprogrammering van spermatogoniale stamcellen is enkel mogelijk bij mannen en niet bij vrouwen. Als
alternatief kan men via parthenogenese toch vrouwelijke stamcellen verkrijgen. Parthenogenese is de
voortplanting via onbevruchte eicellen. Deze eicellen kunnen door chemische of andere prikkels tot
ontwikkeling worden gebracht. Doordat de embryonale ontwikkeling van zoogdieren ook vaderlijke gen
expressie nodig heeft, sterven deze embryo's normaliter vroeg na implantatie. Want de bekomen embryo’s
hebben enkel een vrouwelijke imprinting. Er werden reeds parthenogenetische ES-cellen verkregen van
zowel muizen als non-humane en humane primaten. Deze hebben echter een minder heterogeen MHC
presentatie en zouden dus afgestoten worden daar ze gemakkelijk herkend worden door ons
immuunsysteem, in het bijzonder de natural killer cells. Een oplossing voor dit probleem werd aangegeven
door Daley en zijn collega's die een methode ontwikkelde om de beide vrouwelijke MHC-loci te behouden
bij de parthenogenese (17).
1.3.4
Geïnduceerde pluripotente stamcellen
Uit het voorgaande kan men hypothetiseren dat er in ES-cellen en eicellen factoren moeten aanwezig zijn
die de pluripotentie induceren en in stand houden. In 2006 werd een baanbrekend onderzoek gepubliceerd.
Takahashi, Yamanaka en hun collega's slaagden er in om met behulp van retrovirusen, transcriptiefactoren in
te brengen bij volwassen somatische cellen en op deze mannier ze te reprogrammeren tot pluripotente
stamcellen, Induced Pluripotent Stem Cells genaamd of iPSC. Er werden 24 verschillende factoren getest op
hun potentieel om pluripotentie te induceren. Na analyse bleek dat met de retroviraal gemedieerde
introductie van slechts vier transcriptiefactoren (Oct3/4, Sox2, c-Myc en Klf4) een fibroblast kan worden
omgevormd naar een pluripotente status (15). De eerste generatie iPS-cellen die op deze wijze werden
gegenereerd waren vergelijkbaar in morfologie, proliferatie en teratomavorming met ES-cellen maar bleken
echter niet in staat te zijn om na injectie in een blastocyst aanleiding te geven tot volwassen chimere muizen
of mee te doen aan de germline transmissie. Wel werden er chimere embryo's gevormd. Dit kan verklaard
worden door het significante verschil in gen expressie en DNA methylisatiepatroon tussen de ES-cellen en
de iPS-cellen. Dit verschil bleek verklaarbaar door het gebruik van Fbx-15 als selectiecriteria. Fbx-15 is een
target van Oct3/4 en Sox2 maar is niet noodzakelijk voor pluripotentie. Er werd gezocht naar andere betere
selectiecriteria. Nanog werd in 2007 beschreven als een beter selectiemarker. Nanog speelt een cruciale rol
in de reprogrammatie. De Nanog geselecteerde iPSC-cellen zijn vrijwel niet te differentiëren van de EScellen in hun genexpressie patroon, DNA-methylatie en histoon modificatie. Hierbij komt ook dat
vrouwelijke Nanog-geselecteerde iPS-cellen een reactivatie van het somatisch geïnactiveerde Xchromosoom ondergaan en bij differentiatie een random X-inactivatie ondergaan. Oct-3/4 kan ook gebruikt
worden als waardevol alternatief (17). Deze tweede generatie iPS-cellen is vrijwel onherkenbaar van de EScellen waarbij sommige iPS-cellijnen een equivalent ontwikkelingspotentiaal vertonen als dat van ES-cellen
zoals men kon aantonen bij wijze van tetraploïde complementatie (19).. Met dezelfde transcriptiefactoren
kan men cellen van verschillende diersoorten zoals de mens, apen en ratten reprogrammeren en ook
verschillende cellen afkomstig van verschillende weefsels zoals, keratinocyten, neurale cellen, maag en
14
leverweefsel reprogrammeren ,wat er op wijst dat de fundamentele eigenschappen van het
transcriptienetwerk die instaat voor pluripotentie gedurende de evolutie bewaard is gebleven (1).
1.3.4.1 Mechanisme van de belangrijkste 4 transcriptiefactoren
Pluripotente stamcellen zijn onsterfelijk en hebben een open en actieve chromatine structuur. C-myc
proteïnen zijn waarschijnlijk verantwoordelijk voor het openen van de chromatine structuur die zich
voordoet in somatische cellen. C-myc lijkt echter ook op p53-afhankelijke mannier apoptose te veroorzaken.
KLF4 onderdrukt de p53 en de c-myc afhankelijke apoptose en activeerde p21 die dan op zijn beurt instaat
voor de onderdrukking van de proliferatie. Deze opmerking maakt duidelijk dat de ballans tussen c-Myc en
KLF4 een kritieke rol speelt bij het transformatieproces naar iPS-cellen . c-Myc en KLF4 alleen resulteert
echter enkel in de generatie van tumorcellen en geen pluripotent stamcellen. Het is waarschijnlijk dat Oct3/4 de bestemming van de cel dirigeert weg van de tumor cellen en naar het ES-like cellen. Oct-3/4 alleen is
echter niet voldoende. Sox2 blijkt ook noodzakelijk te zijn om synergetisch verschillende target genen te
activeren of te inhiberen. KLF4 fungeert hier mogelijks als een 3de cofactor (17).
1.4 Rol van de epiginetica bij reprogrammering
De evolutie van zygote tot volwassen organisme wordt gekarakteriseerd door fasen van reprogrammering en
differentiatie. De veranderingen in genexpressie die dit proces vergezellen worden veroorzaakt door
transcriptiefactoren en epigenetische modificaties (epigenetische programmering). In andere woorden, de
ontwikkelende somatische cellen verkrijgen een groeiend aantal epigenetische markers. In contrast hiermee
staat de epigenetische reprogrammering die plaats vindt in het vroege embryo en de kiemcellen.
Reprogrammering houdt in dat de epigenetische markers worden gereset wat meestal een groter
ontwikkelingspotentieel als gevolg geeft(18). Epigenetische modificaties zijn genetische processen die
erfelijke veranderingen veroorzaken zonder een verandering in de DNA sequentie. De mechanismen die dit
bewerkstelligen zijn onder andere: DNA methylering, histoon modificaties, DNA replication timing,
nucleosome positionering en heterochromatizatie. DNA methylisatie gebeurt meestal symmetrisch ter
hoogte van een cytosine base in CpG nucleotiden en is meestal geassocieerd aan gen repressie en de
vorming van heterochromatine. Histone modificaties bevatten een reeks van modificaties, inclusief
acetylisatie, methylisatie, fosforilatie, ADP ribosylatie en ubiquitylatie. De histone modificaties kunnen
zowel een repressief effect veroorzaken als een activerend effect veroorzaken (18).
1.4.1
In vivo reprogrammering
De primordiale kiemcellen kunnen bij de muis worden waargenomen vanaf dag 6,25 van de embryonale
ontwikkeling. Ze bevinden zich in de extra-embryonale regio posterieur van de primitieve streep. De
primordiale kiemcellen ondergaan uitgebreide reprogrammering tijdens en na hun migratie naar de
ontwikkelende gonaden. Dit resulteert in de deletie van de ouderlijke imprinting (epigenetische modificatie
waarbij het moederlijk en vaderlijke allel van een gen respectievelijk geactiveerd en onderdrukt worden, of
omgekeerd) en andere epigenetische merkers in hun genoom(18).
Marieken Vanden Broucke
Pagina
15
In een eerste fase van de reprogrammering die start rond dag 8,5 kan men verschillende modificaties
waarnemen. Een significant verlies van Lys9 histone H3 (H3K9me2) dimethylering en verlies van DNA
methylering zijn de eerst waar te nemen veranderingen. Beiden zijn relatief stabiele repressieve
modificaties. Maar ze zijn niet de enige, andere voorbeelden zijn verrijking met H3K4me2, H3K4me3,
H3K9 acetylering (H3K9ac) en de verrijking van symmetrische methyleringen ter hoogte van het arg3 van
histone H4 en H2A. De betekenis van deze gebeurtenissen is nog niet voldoende ontrafeld maar ze zijn
geassocieerd met de expressie van transcriptiefactoren die eigen zijn aan een pluripotente status, zoals
SOX2, OCT4, NANOG en STELLA. Dit duidt op het belang van de chromatine status bij het verkrijgen
van pluripotentie (18).
Een tweede fase van reprogrammering start vanaf dag 11,5 na de ingang van de PGC's in de ontwikkelende
gonaden, tijdens deze perioden worden de imprintingen gewist en ook vele andere DNA sequenties worden
gedemethyleerd. Maar demethylisatie is niet de enige gebeurtenis tijdens deze fase. Er worden ook andere
veranderingen waargenomen, bijvoorbeeld een verlies aan linker histone 1, een downregulatie van de
H3K9me3, H3K27me3 en een verdwijnen of verschijnen van factoren die geassocieerd zijn aan facultatief
of constitutief heterochromatine. Facultatief heterochromatine is de fractie van chromatine die
gecondenseerd en geïnactiveerd is in een bepaalde cellijn, maar gedecondenseerd en actief kan zijn in
andere cellijnen. Constitutief heterchromatine is de fractie van het heterochromatine die compact blijft
doorheen de levenscyclus, het is hoofdzakelijk samengesteld uit repetitieve sequenties en is geconcentreerd
in karakteristieke regio's zoals centromeren (18).
Deze 2 fasen lijden dus tot het progressief strippen van de meeste epigenetische markers aanwezig in de
primordiale kiemcellen. De analyse van twee loci suggereren dat de DNA demethylisatie de chromatine
remodelling voorafgaat(18).
Nadat het genoom van de meeste epigenetische markers is gestript zal er een fase van DNA remethylisatie
ontstaan. Bij mannelijke embryo's start dit proces op dag 15 a 16 van de embryologische ontwikkeling. Bij
vrouwelijke embryo's zal dit slechts postnataal plaatsvinden(18).
De meest prominente epigenetische modificaties hier is het invoegen van imprinting.
We kunnen dus besluiten dat in de kiemcellijn er grofweg 2 fasen te onderscheiden zijn. De eerste is een
fase van demethylisatie en stripping van de meeste epigenetische modificaties. De tweede fase is de
remethyleringatie die bij de man in de pro-spermatogonia plaats vind en bij de vrouw na de geboorte in de
groeiende oocyten (18).
1.4.2
Na de fertilisatie
De bevruchting brengt een nieuwe golf van epigenetische reprogrammeren met zich mee. Deze is
gekarakteriseerd door de snelle activatie van DNA demethylisatie nog voor het begin van de DNA replicatie
gevolgd door een passief DNA methylisatie die duurt tot aan het morula stadium. In contrast met de
reprogrammatie die gebeurt in de PGC's worden de ouder-specifieke methylisaties ter hoogte van de
Imprinting Control Regions behouden. De novo methylisatie wordt geïnitieerd voor het blastocyst stadium
en gaat gepaard met de vroegste differentiatie, namelijk de opsplitsing in embryonaal en extra-embryonale
cellijn, voorgesteld als respectievelijk de ICM en het trofectoderm.
16
Het globale methylisatiepatroon verschilt tussen beiden waarbij trofectodermcellen minder gemethyliseerd
zijn vergeleken met de cellen van de ICM. Ook op het niveau van de histonen is er een verschil
waarneembaar (18).
1.4.3
Pluripotentie en epigenetica
Er zijn drie fasen in de embryologische ontwikkeling van knaagdieren waaruit succesvol stamcellen kunnen
worden geïsoleerd. Deze includeren de vroege PGC's tussen dag 8,5 en 12, 5 van de embryologische
ontwikkeling die oorsprong geven aan embryonic germ cells in vitro, cellen van het morula tot
blastulastadium waaruit embryonale stamcellen kunnen worden gepreleveerd en de epiblast stamcellen die
hun oorsprong vinden in de 5,5 a 6,5 dagen oude embryo.
Het is belangrijk om te vermelden dat menselijke embryonale stamcellen meer gelijkenissen hebben met
murine epiSC-cellen dan met de muizen ES-cellen (18).
De drie verschillende stamcellen brengen allen pluripotentie markers tot expressie bijvoorbeeld; OCT4,
NANOG, SOX2, SALL4. Deze transcriptiefactoren zijn de hoofdfactoren die meewerken in het
pluripotentie netwerk. Dit netwerk activeert genen die noodzakelijk zijn voor ES-cel overleving en
proliferatie en onderdrukt target genen die enkel actief zijn tijdens differentiatie. Intrigerend genoeg
reguleren deze transcriptiefactoren hun eigen expressie en vormen ze een self-reinforcing circuit of
pluripotentie (18).
Naast deze transcriptiefactoren word pluripotentie, zelfvernieuwing en differentiatie in de ES-cellen ook
bepaald door de chromatine organisatie en de epigenetische modificaties.
Genen die onderdrukt worden bij pluripotentie maar actief zijn bij differentiatie zijn meestal gemarkeerd
door een bivalent H3K4me3 en H3K27me3 domein. De status van deze merkers kan efficiënt het verschil
duidelijk maken tot een geëxpresseerd (H3K4me3), een voorbestemming tot expressie (H3K4me3 en
H3K27me3) en een onderdrukt (H3K27me3) gen. Maar ongeveer 1/3 van de genen in ES-cellen zijn niet
gemarkeerd door H3K4me3 nog door H3K27me3 , deze genen worden echter meestal onderdrukt door een
DNA methylisatie (18).
Pluripotentie word bepaald door een intrigerend netwerk bestaande uit een wisselwerking tussen enerzijds
transcriptiefactoren en anderzijds epigenetische modificaties. Verschillende epigenetische modificaties die
genen onderdrukken of activeren zijn gebonden door OCT4, NANOG, SOX2 en/of SALL4. De ballans van
de epigenetische modificaties met tegengestelde functies kan pluripotentie onderhouden door het versterken
van de Oct4 en NANOG expressie. Maar een kleine verstoring van dit evenwicht kan lijden tot
differentiatie. Dus pluripotentie is een kwetsbaar evenwicht(18) .
Een intrinsieke eigenschap van ES-cellen is hun fluctuatie tussen verschillende epigenetische statussen met
een heterogene expressie van verschillende regulerende genen. Deze metastabiliteit wordt gezien als de
cruciale stap die moet overwonnen worden bij de derivatie van ES-cellen, aangezien er in vivo een snelle
“val' gebeurt naar meer stabielere gedifferentieerde cellen. Voorbeelden van deze heterogene geexpreseerde
factoren zijn NANOG, REX1, PECAM1 (platelet/endothelial cel adhesion molecule 1), SSEA1 (stagespecific embryonic antigen) en STELLA (18).
Marieken Vanden Broucke
Pagina
17
1.4.4
Epigenetica en differentiatie.
Differentiatie is een fundamenteel eenrichtingsproces, alhoewel individuele cellen plasticiteit vertonen. Bij
de bepaling van het cellot zijn zowel de transcriptiefactoren als de epigenetische factoren van belang
1.4.4.1 De transcriptie factoren.
De regulatie van Oct 4 lijkt een zeer belangrijke stap in de determinatie van het cellot. Oct4 bepaald of de
differentiatie richting trofoblast, epiblast of primitief endoderm zal gaan. In de afwezigheid van Oct4 zullen
de cellen zich differentiëren richting de trofoblastcellijn, overexpressie veroorzaakt differentiatie in primitief
endoderm (17, 18).
SALL4, een Oct4 regulerende factor, is net zo belangrijk als Oct4 bij de ontwikkeling van epiblast en
primitief endoderm en net zoals bij Oct4 zal downregulatie van deze transcriptiefactoren lijden tot het
ontstaan van trofoblast weefsel (18).
NANOG is ook noodzakelijk voor de ontwikkeling van de ICM; downregulatie ervan zorgt voor
differentiatie in de richting van het primitief endoderm (17, 18).
De vorige transcriptiefactoren zijn geassocieerd met de differentiatie van de ICM. Bij de differentiatie van
de trofoblastweefsel zijn andere transcriptiefactoren actief.
EOMES (eomesodermin) is in samenwerking met CDX2 noodzakelijk voor het ontstaan van een normale
en functionele trofoblast differentiatie en proliferatie in vivo. Maar ablatie van een van deze genen
verhindert niet de initiële vorming van trofectoderm. Dit ondersteunt
de hypothese dat er factoren
stroomopwaarts zijn die kunnen functioneren als een initiële determinant van het trofoblast cellot.
Elf5 ablatie heeft als gevolg dat er zich geen extra-embryonaal weefsel zal ontwikkelen en er zich geen
trofoblaststamcellen zullen ontwikkelen in vitro. Elf5 zou de cruciale link vormen in het zelf amplificerend
circuit met CDX2 en EOMES (18).
Conclusie; de ICM word gedetermineerd door een netwerk waarin Oct4, NANOG, SALL4 en Sox2
betrokken zijn, De differentiatie naar de trofoblast-cellijn word geactiveerd door een circuit waarin CDX2,
EOMES en ELF5 geactiveerd worden.
1.4.4.2 De epigenetische factoren die het cellot bepalen.
Naast de cruciale transcriptiefactoren zijn er ook de epigenetische factoren die het cellot bepalen.
Een voorbeeld is de aanwezigheid van co-activator-associated arginine methyltransferase 1 of CARM1, die
de H3R2, H3R17, H3R26 methyleert. Blastocysten met een hoog endogeen CARM1 level zullen zich bij
voorkeur differentiëren richting de embryonale cellijn. De epigenetische context bepaalt of een cel al dan
niet permissief of niet-permissief is om zich te differentiëren richting een bepaalde cellijn maar ze kan er
ook voor zorgen dat een cel meer geneigd is om een bepaalde differentiatieweg te volgen. Het is moeilijk
om te bepalen of de sleutelrol transcriptiefactoren met lijndeterminerende capaciteit een epigenetisch milieu
creëren die aan cellen restricties oplegt in verband met hun differentiatiepotentieel, of dat de eerst
aanwezige epigenetishe restricties de activiteit van de belangrijkste transcriptiefactoren determineert en op
18
deze wijze het ontwikkelingspotentieel bepaald. Naast de transcriptiefactoren en de epigenetische factoren
zijn ook cel-cel interacties en cellulaire polarisatie processen van belang bij de bepaling van het cellot(18).
1.4.4.3 Factoren die het cellot vastleggen
Na dat de cellen een voorkeur verworven hebben voor een bepaalde differentiatie route verwerven ze een
verlies van de capaciteit om tussen verschillende cellijnen te switchen. Deze restrictie van het cel-lot wordt
geregeld door de epigenetische regulatie van
Elf5; deze is gemethyleerd en onderdrukt in de
embryologische cellijn maar gehypomethyleerd en komt tot expressie in de trofectodermale cellijn .
Door een positie-feedback loop met de trofectodermale genen CDX2 en EOMES versterkt Elf5 de
beperking van het ontwikkelingspotentieel in de richting van de trofectodermale cellijn. Een ander
voorbeeld is de expressie en hypomethylisatie van Stella in de ICM van de blastocyst en de gemethyliseerde
en onderdrukte status van Stella in epiblast cellen na implantatie. Dit hangt samen met het meer beperkt
ontwikkelingspotentieel van epiblast-stamcellen vergeleken met ES cellen. Zo zijn de ES-cellen veel
potenter in de vorming van chimere muizen dan de epiSC-cellen die nooit of enkel in uitzonderlijke
gevallen oorsprong geven aan chimera (18).
Samengevat kunnen we stellen dat er eerst een permissieve chromatine status voor cellijn determinatie
wordt verkregen, dit doormiddel van histoon modificaties en het hechte samenspel van transcriptorische
regulatoren, inclusief OCT4, NANOG, SOX2, SALL4, CDX2 en EOMES. Eens de specifieke cellijn is
vastgelegd
is DNA methylisatie van enkele cruciale loci (vb Elf5 en Stella) voldoende om hun
differentiatiepotentieel te beperken
1.5 Moleculaire handtekening van pluripotentie
Het word steeds meer duidelijk dat de pluripotente stamcel types, kunnen worden opgedeeld in 2
fundamenteel verschillende categorieën.
De eerste categorie is deze van de embryonale stamcel-like cellen, ofwel de naïeve pluripotente stamcellen
genoemd. Deze categorie bevat de muis ES cellen geïsoleerd uit de ICM voor de implantatie in de uterus,
zowel als de embryonale Germ stam cellen en de male germ stam cellen afkomstig uit de primordiale
kiemcellen of de spermatogoniale stamcellen van muizen(12).
De tweede categorie is deze van de epiblast-stamcel like cellen, typisch de post-implantatie epiblast stam
cellen van muizen, ook wel de ‘primed pluripotente stamcellen’ genoemd.(12).
Deze twee categorieën worden gestabiliseerd in vitro door verschillende groeimedia, hebben andere
specifieke moleculaire handtekeningen en groeipotentiëlen in vitro. Ook hangen deze twee statussen af van
verschillende signaal cascades die vaak elkaar antagoniseren(12)
De eerste categorie correspondeert met een meer immatuur stadia van pluripotentie terwijl de tweede
categorie meer neiging vertoont om te differentiëren. Daarom hernoemden Nichols en Smith deze twee
categorien naar de “naïeve” en de “primed” pluripotente status. Dit verschil word weerspiegeld door
verschillende vaststellingen. Zo zijn de X chromosomen bij de ES Cel-like cellen beiden nog actief, bij de
epiS cel-like cellen is er al één van de twee chromosomen geïnactiveerd (12).
Marieken Vanden Broucke
Pagina
19
Op vlak van ontwikkelingspotentieel zijn beide statussen in staat om embryoid body's te vormen en
teratomen maar is nog geen chimera-vorming beschreven bij de “primed” cellen. Wel zijn deze laatste veel
gemakkelijker te induceren voor het vormen van primordiale kiem cellen. Verschillende signalisatie
pathways werken op verschillende mannieren in op de stamcellen. Zo zullen LIF/Stat3 , BMP4, WNT, IGF
de naïeve cellen stimuleren om hun pluripotente ongediferentieerde status te behouden. Bij de primed cellen
gebeurt dit zelfde via de WNT en IGF regulatoren maar ook door TGF-beta, activin, FGF2 en ERK1/2.
BMP4 zal hier echter stimuleren tot differentiatie, vooral dan de differentiatie naar primordiale germ cellen.
Anderzijds wordt de naïve status dan weer gestimuleerd voor differentiatie door TGF-beta, activin, FGF2 en
ERK1/2, wat dus net het omgekeerde is van die bij de primed status (12).
Via de moleculaire handtekening kan men de twee verschillende categorieën ook onderscheiden. Beide
tonen ze vergelijkbare activiteit van Oct4, Sox 2 genen en bezitten ze SSEA1 en alkalisch fosfatase. En geen
één van hen bevat TRA1-60, TRA1-81, SSEA3/4. Verschillen zijn merkbaar op vlak van de expressie van
Nanog, Klf2, Klf4, Rex1, Stella die in hoge concentraties terug te vinden zijn in de naïeve cellen maar
slechts beperkt of niet worden gevonden bij de geprimede celgroep. Lijn specifieke markers zoals FGF5,
Blimp1, Cer1 zijn dan weer enkel te vinden in de primed state. Dit weerspiegelt hun verder gevorderde
differentiatie. Hetzelfde fenomeen ziet men voor de MHC type 1 complex presentatie die vrijwel afwezig is
bij de ESC-like groep maar wel voorkomt bij de epiSC-like cellen. Oscillerende genpatronen van Nanog en
Rex1 worden waargenomen bij de naïeve cellen. Bij de primed state is dit Blimp1 (een lijnspecifieke
marker). Deze gegevens zijn allemaal afkomstig van de muis. Het feit dat naïeve cellen slechts bij bepaalde
diersoorten of bepaalde kweeklijnen van een bepaalde diersoort kunnen geïsoleerd worden zorgde ervoor
dat er meer onderzoek gebeurde naar de relatie tussen de twee pluripotente statusen en het al of niet
mogelijk zijn om de ene status om te zetten tot de andere status van pluripotentie. Latere in vitro en in vivo
experimenten toonden aan dat dit mogelijk is. Naïeve cellen kunnen door het promoten van het signaal van
TGF-beta, activin en FGF2 aangezet worden om zich te differentiëren tot primed cellen. Meer nog primed
EpiSC cellen kunnen epigenetisch terug worden omgezet naar naïve cellen door een variëteit aan genetische
manipulatietechnieken en cultuur condities. Hier moet men echter een verschil maken tussen verschillende
cellijnen zo zullen deze afkomstig uit “permissive” cellijnen enkel serum en Lif/Stat3 signaal nodig hebben
maar zullen er meer factoren nodig zijn bij de “non-permissive cellijnen”(12).
De menselijke embryonale stamcellen worden net als de muis embryonale stamcellen uit de ICM-geïsoleerd
van pre-implantatie embryo's maar ze hebben meer gemeen met de muis primed state EpiS-cellen dan met
de naïeve muis ES-Cel status. Zo zijn ze morfologisch gelijkend: met een platte morfologie (muis ESC
cellen hebben een gebold uiterlijk), zijn ze afhankelijk van de FGF2/Activin signaal, en hebben ze de
neiging voor een X-chromosoom inactivatie. Door het grote belang van de kweek condities bij de muis
pluripotente stamcellen, kwam men tot de veronderstelling dat de isolatie en kweekmethode bij de
menselijke ESC, misschien de oorzaak zou kunnen zijn van het meer primed dan naïef zijn van deze cellen.
Zo werd aangetoond dat wanneer men de ESC isoleert en kweekt worden onder normale atmosferische
20
zuurstof waarden, de gepreleveerde cellen een X-inactivatie ondergaan. Wanneer men dit echter doet onder
fysiologische zuurstof waarden (5% O2) treedt deze X-inactivatie niet op. Door deze vaststelling gaat men
er vanuit dat de naïeve status bestaat maar door de oxidatieve stress die optreedt bij atmosferische O2
waarden er een X-inactivatie gebeurt. Recent werden humane ESC en iPSC geconverteerd naar een naïve
status door de aanpassing van de kweekcondities door LIF en 2i condities (2i: GSK3b inhibitor en ERK1/2
inhibitor of Kenpaullone) en de simultane overexpressie van Oct/Klf4 of de bijvoeging van Forskolin aan
het medium. De cellen die op deze wijze werden verkregen zijn op verschillende vlakken vergelijkbaar met
de naïve muizen ESC: pre-X-inactivatie status ook al werden ze gekweekt onder 20% O2, afhankelijk van
LIF/Stat3 signaalgeving in plaats van FGF/Activin en een vergelijkbaar genetisch expressiepatroon. De
naïve status is echter van korte duur want na enkele passages gaan de cellen hun naïef karakter verliezen
(12).
Deze punten tonen aan dat er nog veel moet geleerd worden over de beste kweek en isolatietechnieken maar
we zijn op de goede weg.
1.6 Testen voor pluripotentie
1.6.1
De strengste test
Idealiter kan men demonstreren dat de te onderzoeken cel in staat is om functioneel alle celtypes in het
organisme te vervangen.
Zowel voor ES-cellen als voor iPS-cellen slaagde men er in chimere muizen te ontwikkelen. Men doet dit
doormiddel van het inbrengen van een stamcel in een blastocyst. Hieruit ontwikkelt zich dan een organisme,
die opgebouwd is uit cellen afkomstig van zowel de stamcel als de blastocyst (30).
Tetraploïde complementatie is de meer stringente vorm van deze test. Eerst zal men twee blastocysten
fuseren. Hierbij bekomt men dus een cel met het dubbel aantal genetisch materiaal. Daarna worden de te
onderzoeken cellen opnieuw ingebracht (30). Doordat de 4n cellen geen oorsprong geven aan het eigenlijke
embryo en enkel kunnen deelnemen aan de ontwikkeling van de extra-embryonale weefsels zal het
ontwikkelde organisme volledig uit de te onderzoeken cellen zijn ontstaan. Deze test is al verscheidene
malen succesvol uitgevoerd met ES-cellen maar wanneer men als test-cel een iPS-cel gebruikt slaagt men er
slechts zelden in om levend geboren dieren te verkrijgen. Dit zou veroorzaakt worden door de abnormale
reductie van de materneel geimprinte Dlk1-Dio3 locus (19).
Het spreekt voor zich dat deze twee testen ethisch niet mogelijk zijn voor menselijke cellen.
1.6.2
1.6.2.1
Minder strenge testen maar bruikbaar bij de mens.
Testen voor het differentiatie-potentieel in vitro
1.6.2.1.1 Embryoid Body vorming (30) of cellular aggregation approach (8)
Wanneer men embryonale stamcellen in suspensie brengt klitten deze samen tot sferische clusters. In deze
clusters differentiëren de ES-cellen zich in cellen van de verschillende kiembladen. Doormiddel van qRTPCR of immunokleuring wordt dan bepaald of er werkelijk cellen van de 3 kiembladen te vinden zijn (8,
21).
Marieken Vanden Broucke
Pagina
21
1.6.2.1.2 Directed differentiation
Doormiddel van specifieke kweekcondities, het toevoegen van groeifactoren of andere wordt differentiatie
naar de verschillende celtypes geïnduceerd (21).
1.6.2.2
in vivo
1.6.2.2.1 Teratoma vorming :
Door injectie van de te onderzoeken cellen in immuungedeprimeerde muizen kan men onderzoeken of er
zich een tumor ontwikkeld die is opgebouwd uit cellen van de 3 kiemlagen. Er zijn echter nog verscheidene
nadelen te onderkennen; 1) determinatie van de verschillende cellen in teratoma's vraagt een grootte
histologische expertise. 2) de plaats van injectie en de muizenstam verschilt tussen de labo's maar deze twee
parameters hebben een invloed op de frequentie waarmee teratoma formatie optreedt. 3) het is een
kwalitatieve essay en kan zeer subjectief zijn. 4) De formatie van teratoma's duurt verschillende weken
waardoor deze test meer tijd nodig heeft dan de meeste andere testen (21). Of de stamcel werkelijk
oorsprong geeft aan cellen van de drie kiemlagen word onderzocht op basis van de observatie dat er
effectief weefsel van de drie kiemlagen is ontstaan, de expressie van differentiatie genen specifiek voor een
bepaalde kiemlaag, en de expressie van differentiatie specifieke proteïnen (31).
1.6.2.3 Morfologie en cel cyclus
Morfologische kenmerken voor pluripotentie zijn een hoog nucleus/cytoplasma ratio, een prominente
nucleoli, kolonies met meerdere cellagen, een specifieke nucleaire architectuur zoals lamina, nucleaire
speckles en heterochromatine domeinen, en een specifieke chromatinestructuur. De celcyclus van
pluripotente cellen word gekenmerkt door een snelle groei en een verkorte G1 fase (30).
1.6.2.4 Genexpressie en epigenetica
SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 en TRA-1-81 zijn antigenen die zich bevinden op het celoppervlakte en die als
pluripotentiemarker bij humane cellen worden gebruikt, ze kunnen worden opgespoord met behulp van
immunofluoriscentie (30, 32). Een andere merker voor pluripotentie is het alkaline fosfatase, die eveneens
via immunofluorescentie kan worden opgespoord en waarvoor een positieve kleuring word waargenomen in
pluripotente stamcellen zoals ES-cellen en iPS-cellen (32).
Telomerase is een enzym die actief is in stamcellen en hun onsterfelijkheid verzorgd (33). Het is in staat
telomeren te verlengen. In normale volwassen cellen wordt er geen telomerase activiteit waargenomen, dit
zorgd ervoor dat de telomeerlengte niet meer wordt hersteld en dus korter worden. Het verkorten van de
telomeren veroorzaakt de veroudering van de cellen en zou kunnen fungeren als een biologische klok. Bij de
productie van iPSC uit volwassen somatische cellen observeert men een verlenging van de telomeren en een
activatie van het telomerase (34).
Genexpressie van Oct-4, Sox2 en NANOG word doormiddel van immunocytochemie en qRT-PCR
opgezocht. qRT-PCR zorgt echter vaak voor vals positieven bij de bepaling van Oct-4 aangezien van dit gen
verschillende retro-pseudogenen bestaan. Bisulfiet sequencing van de promotor regio van Oct-4 en NANOG
is een andere mogelijkheid die minder vals positieven geeft en waarvan de resultaten niet afhankelijk zijn
van de condities waaronder men kweekt of de genetische achtergrond van de cel (30) .
22
Op epigenetisch vlak onderkent men een specifieke chromatine handtekening bij de muis ES-cellen
bestaande uit bivalente domeinen die zowel repressieve als activerende histone modificaties bevatten.
Onderzoek naar het micro-RNA expressieprofiel van ES-cellen leidde tot de vaststelling dat er een specifiek
micro-RNA profiel voor pluripotente cellen bestaat en dat sommige van deze miRNA's bewaard zijn
gebleven tussen verschillende diersoorten. In de toekomst zou dit dus ook kunnen worden gebruikt als
pluripotentie marker (30).
1.6.3
Pluripotentie categorieën
EpiSCs vormen teratoma's en EB waarin cellen van de 3 kiembladen terug te vinden zijn maar men slaagt er
niet in om chimere muizen te laten ontwikkelen. Dit duidt aan dat de minder strenge testen die op heden
worden uitgevoerd met humane stamcellen, niet aantonen of de cellen ook op vlak van ontwikkeling
volledig pluripotent zijn. Wanneer men echter knaagdieren ES-cellen laat groeien op het groei medium van
EpiSCs dan zullen deze cellen niet meer in staat zijn om te differentiëren naar de drie kiembladen bij
teratoma of EB vorming. Deze cellen blijven echter wel Oct-4, NANOG en Sox2 tot expressie brengen.
Wanneer men deze cellen terug in hun oorspronkelijk aangepast milieu brengt herwinnen ze opnieuw hun
oorspronkelijk differentiatiepotentieel. Dit indiceert dat pluripotentie niet 1 status is maar bestaat uit
verschillende stadia, elk met hun eigen moleculaire kenmerken en differentiatiepotentieel en dat deze status
zeer afhankelijk is van de omgeving waarin de cel zich bevind (12).
Om het begrip pluripotentie beter te omschrijven kunnen we het opsplitsen in vier categorieën, elk
gedefinieerd door specifieke criteria en testen (Tabel 1) (30).
TEST
RESULTAAT
Cellulaire
Cel
en
pluripotentie
morfologie
Marker
VOORDEEL
kolonie Indicatie dat de cel Meestal
de
zelfde resultaat
staining, karakteristieken
BEPERKINGEN
een
snel Zeer
en
een test
overzicht
van
de Markers
worden
flow cytometrie
deelt
Cel cyclus analyse
ongedifferentieerde
gebracht door niet
ES-cellen
pluripotente cellen
Determinatie
met volledige cultuur
onspecifieke
dat De
vaak tot expressie
Moleculaire
RT-PCR
meeste testen De testen definiëren
pluripotentie
Microarray analyse cellen
geven relatief snel pluripotentie
Epigenetische
ongedifferentieerd
een resultaat en zijn accuraat.
analyse
zijn
eenvoudig
uit
voeren
te Ze
verschillende
differentiatiepotenti
cellijnen
eel
Embryoid
Body Onderzoekt of de Demonstreerd
pluripotentie
vorming
cel in staat is cellen differentiatiepotenti geen
Teratoma vorming
te vormen van alle eel
Pagina
onderzoeken
op geen
Functionele
Marieken Vanden Broucke
niet
en
het EB
demonstreren
weefsel
of
de structuur vorming
23
Directed
drie de kiembladen
differentiatie
mogelijkheid om te Teratoma's
ontwikkelen
vragen
in veel tijd en zijn
specifieke celtypes
subjectief
aan
variabiliteit
De
testen
demonstreren
per
niet
definitie
de
ontwikkelings
pluripotentie
Ontwikkelings
Chimera vorming
Test
de De meest strenge Ethisch
pluripotentie
Tetraploïde
mogelijkheid van de testen
complementatie
cellen om mee te pluripotentie
werken
aan
alle
celtypes
in
een
niet
voor gerechtvaardigd bij
menselijke cellen
volwassen
organisme inclusief
de kiemcellen
Tabel 1 overgenomen en vertaald uit artikel(30)
Het begrip pluripotentie kan op basis van specifieke criteria en testen worden opgesplitst in vier
categorieën.
1.6.4
De gouden standaard is onderweg
In 2003 publiceerden verschillende wetenschappers over een standaard om de hES-cellen te karakteriseren,
deze kan ook worden gebruikt bij de karakterisering van gereprogrammeerde stamcellen. In deze standaard
werden niet enkel de hierboven besproken technieken besproken maar werden er ook extra in vivo testen
aangekaart. Zoals het transplanteren van humane pluripotente stamcellen in een niet menselijk weefsel. Dit
om te onderzoeken hoe deze cellen zich incorporeren. Ook kan men humane stamcellen injecteren in een
niet menselijke blastocyst. Het ontstane embryo wordt dan verwijderd tijdens de gestatie om ethische
risico's tot het minimum te herleiden. Het spreekt echter voor zich dat deze testen in de praktijk een grootte
ethische en legale controle vraagt. De US National Institute of Health of NIH ontwikkelde een pluripotent
stem cell registry waarin de stamcellijnen kunnen worden opgenomen die aan bepaalde criteria voldoen (30)
Deze criteria zijn hier onder weergegeven.
◦
“Men moet kunnen aantonen dat de voorgestelde cellijn in staat is om teratoma's te vormen
die cellen van de drie kiembladen bevat (endoderm, mesoderm en ectoderm). Deze methode werd gekozen
omdat het momenteel als de gouden standaard dient bij de determinatie of een humane stamcellijn
pluripotent is. Als men geen teratoma vorming kan worden aangetoond, kunnen de onderzoekers alternatief
bewijs voor pluripoptentie aanbrengen, en zal de lijn alsnog worden overwogen door het NIH.
24
◦
Men moet bewijs voorleggen dat de cellijn in staat is om zich ongelimiteerd zelf te
vernieuwen.
◦
Daarnaast zouden de onderzoekers informatie over de expressie van transcriptie factoren en
cel oppervlakte markers die veelvuldig worden gebruikt voor de karakterisering van menselijk pluripotente
stamcellen kunnen bezorgen.(35)”
Een universele standaard is er echter nog niet. Het NIH kiest er duidelijk voor om teratoma vorming als
standaard te gebruiken. Maar er zijn nog richtlijnen nodig om dit gestandaardiseerd te laten verlopen. Zo
moet er een protocol worden ontwikkeld voor zowel het procedé voor teratoma formatie (specifieke groep
immunodeficiënte muizen, injectie plaats, aantal te injecteren cellen, tijdschema voor de teratoma
ontwikkeling) als de analyse van de teratoma's (wat is representatief voor de verschillende kiemlagen,
weefsels en/of structuren). Daarnaast staat het niet vast dat teratoma vorming de beste test is om het
differentiatiepotentieel aan te tonen en is er ook de ontwikkeling van betere moleculaire technieken om de
pluripotentie en de ongedifferentieerde status beter te evalueren. Een voorbeeld van dit laatste is de bisulfiet
sequencing van de promotor regio's van pluripotentie genen (30).
1.7 ES cellen
1.7.1
Ontdekking
De eerste onderzoeken naar pluripotente stamcellen werden niet uitgevoerd met normale stamcellen maar
met Embryonale Carcinoma cellen (EC-cellen) afkomstig uit teratocarcinomen. De EC-cellen bezitten veel
karakteristieken van een stamcel wat in die tijd veel aandacht trok. Onderzoek met deze cellen waren mede
verantwoordelijk voor de ontdekking van hoe men hES-cellen in vitro kan in cultuur houden zonder dat ze
hun differentiatie of zelfvernieuwing potentieel verliezen. Toen lange termijn in vitro kweken van ES-cellen
geïsoleerd uit de ICM van een 3 tot 5 dagen oude muizenblastocyst door twee onafhankelijke groepen in
1981 werden gepubliceerd werd in één van de gevallen de cultuur die ontwikkeld was voor EC-cellen
gebruikt(8, 31). Het duurde tot 1998 vooraleer men er in slaagde humane ES-cellen voor een lange termijn te
kweken in vitro. De eerste generatie hES-cellen werden gekweekt op gedeactiveerde muizen embryologische
fibroblast (MEF) feeder lagen en passage van de ongedifferentieerde cellen werd bereikt door de manuele
microdissectie van de hES-cel kolonies doormiddel van een micropipet waarna ze verder geplaat werden op
nieuwe MEF feeder lagen. Deze delicate procedure werd herhaald om de vier tot vijf dagen. Het grootste
voordeel van mechanische transfer is het afwezig zijn van cel-dissociatie enzymen en de mogelijkheid om bij
elke transfer de ongedifferentieerde cellen te splitsen van de meer gedifferentieerde cellen. Met deze methode
worden nog steeds normale hES-cellijnen van hoge kwaliteit geproduceerd. Maar ze is tijdconsumerend,
verijst de nodige ervaring en is niet toepasbaar voor productie op grote schaal (36), bovendien wordt er
gebruik gemaakt van dierlijke producten wat een risico inhoud op vlak van pathogeen transmissie en
immuunreacties wanneer ze worden ingeplant in menselijke testpersonen(37).
Marieken Vanden Broucke
Pagina
25
1.7.2
Ethiek
Stamcelonderzoek is een bron van ethische, legale en sociale controversen sinds men er in 1998 voor het
eerst in slaagde om humane embryonale stamcellen te kweken uit restembryo's die door koppels werden
afgestaan na infertiliteitbehandeling (38). Er ontstond angst voor het klonen van mensen, regeneratieve
onsterfelijkheid, mens en dier kruisingen, modificatie van het menselijke genetische materiaal enzoverder
maar vooral het feit dat voor de generatie van hES-cellen, vijf dagen oude pre-implantatie embryo's worden
vernietigd, bracht een ethische discussie op gang (6). Aan de ene zijde staan personen die een bevruchte eicel
in een laboratorium zien als een nieuwe mens of individu met alle rechten en de morele en politieke status
van een volledig geboren mens. Zij zien vernietiging van embryo's als moord. Ze zijn tegen het vernietigen
van embryo's voor het verkrijgen van hES-cellen, zelf wanneer deze embryo's in normale omstandigheden
worden afgedankt omdat ze klinisch niet bruikbaar zijn voor de koppels die ze produceerden om
infertiliteitproblemen te behandelen. Sommigen beargumenteren ook dat het preimplantatie-embryo het
potentieel bevat om zich te vormen tot een volledig ontwikkelde mens en dat dit potentieel niet mag worden
vernietigd (38). Voorstanders weerleggen dit door er op te wijzen dat ook al zou het zo zijn dat dit potentieel
niet mag worden vernietigd, het niet zo is dat alle embryo's ook werkelijk dit potentieel bevatten, aangezien
de restembryo's bij IVF vaak van slechte kwaliteit zijn en dat ook bij een normale bevruchting 75-80% van
de bevruchte eicellen geen oorsprong kan geven aan een levensvatbare foetus. Hierbij komt dan ook dat deze
embryo’s in ieder geval geen oorsprong zullen geven aan een levende persoon aangezien op voorhand de
beslissing al is gemaakt om deze niet in te planten (6). Anderzijds zijn er personen die deze embryo's als te
rudimentair beschouwen om rechten of belangen toe te bedelen, en volgens hen dus geen bescherming
verdienen ten koste van legitiem en belangrijk wetenschappelijk onderzoek. Voor hen is het duidelijk dat
deze embryo's, die op dat moment een collectie van ongedifferentieerde cellen is, geen morele status heeft.
Alhoewel ze willen herkennen dat deze cellen een grotere status hebben dan ander weefsels aangezien ze bij
implantatie aanleiding kunnen geven tot een levensvatbare foetus. Dit respect voor de embryo's zorgt ervoor
dat er goede redenen nodig zijn om ze te creëren, te vernietigen en op te experimenteren, zoals de nood voor
een infertiliteitbehandeling of het uitvoeren van legitiem wetenschappelijk onderzoek (38). De Amerikaanse
regering onder president George Bush nam een embryo beschermend standpunt in. Dit had als gevolg dat er
een legislatuur kwam die via een decreet van de president de federale financiering van stamcelonderzoek
beperkte naar onderzoek op stamcellijnen die werden aangelegd voor 9 augustus 2001. Wetenschappers
waren hier niet voor te vinden, ze stelden vast dat de federale geregistreerde lijnen niet voldoende waren om
alle onderzoeken uit te voeren, dat er steeds meer genetische mutaties optraden en dat deze hES-cellen waren
gecultiveerd in kweekmedia die niet vrij waren van muis feeder lagen wat een bedreiging vormde voor de
transmissie van dierlijke virussen. In 2005 rade de President’s Council on Bioethics aan dat “alternatieve
bronnen” voor pluripotente stamcellen onderzocht moesten worden. Hiervoor werden vier
aangekaart;
methodes
Stamcellen afkomstig uit reeds overleden embryo's, nondestructieve embryo chirurgie,
bioengineerd embryo like artefacten en gededifferentieerde somatische cellen. Maar deze alternatieven zijn
ook niet zonder hindernissen. Bij de nondestructieve embryo chirurgie word er bij een acht-cellig stadium, 1
cel weggenomen die dan oorsprong kan geven aan stamcellen. Dit is technisch mogelijk maar dit is niet
26
zonder risico voor dit embryo. Voor de ouders is het dan ook logischer om de ongebruikte embryo's af te
staan dan om een risico te leggen op hun ongeboren kind. Bij de “bioengineerd embryo like artefacten”
worden cellen ontwikkeld die zich ontwikkelen als vroege embryo’s maar die de mogelijkheid niet bevatten
om zich te implanteren in de baarmoeder en zich te ontwikkelen tot een mens (6, 39).De controverse rond
embryo destructie is nog steeds niet opgelost maar twee recente ontwikkelingen maakten het debat minder
zwaar. Ten eerste is de regering van president Obama veel vriendelijker ingesteld ten opzichte van het hEScelonderzoek. Waar men vroeger zich vooral richtte op de vraag of onderzoek op hES-cellen kon worden
toegestaan richt men zich vandaag de dag vooral op hoe men dit onderzoek het best reglementeert. Ten
tweede was er de komst van de iPS-cellen, die embryo vrij onderzoek mogelijk maakte maar ook patiënt
specifieke therapie kon bewerkstelligen maar het maakt onderzoek met hES-cellen niet overbodig aangezien
ze als controle moeten fungeren om het gedrag en het volledig wetenschappelijk potentieel van de iPS-cellen
te evalueren. Om dit te kunnen uitvoeren moet de wetenschappelijke kennis over hES-cellen nog uitgebreid
worden. Ook zijn iPS-cellen niet in staat om bepaalde vragen over de menselijke ontwikkeling op te lossen.
De veiligheid van iPS-cellen is een andere bezorgdheid die er voor zorgt dat zeker voor nu, onderzoek met
hES-cellen niet kan worden afgeschaft. Er zijn ook nieuwe ethische zorgen die de kop op steken,
bijvoorbeeld wat men moet doen wanneer incidentele bevindingen een impact kunnen hebben op de
gezondheid van de donor, de diagnose van de ziekte van Huntington kan hier een voorbeeld van zijn. Maar
het maakt ook meer ziekte modellen in vitro mogelijk, aandoeningen waarvoor er geen préimplantatie
diagnostiek voor wordt gedaan kunnen via iPS-cellen toch nog leiden tot “disease in a disch” modellen die
niet kunnen worden aangemaakt op basis van hES-cellen. Een andere mogelijkheid om pathologiespecifieke
stamcellen te creëren is via Somatic Cell Nucleair Transfer, ook “research cloning” genaamd. Recent slaagde
men erin om op deze wijze donor-gematchte stamcellen te ontwikkelen van niet menselijke primaten, wat
suggereert dat dit ook mogelijk is bij de mens. Hoe dan ook zijn er twee knelpunten. Ten eerste staan de
recent opgestelde NIH guidelines enkel financiering door de regering toe met restembryo's uit IVF
behandelingen en dus geen embryo's die specifiek zijn gecreëerd voor onderzoek. Ten tweede, zijn vrouwen
niet bereid om hun eicellen af te staan voor SCNT zonder enige vergoeding. Financiële compensaties voor
eiceldonatie zijn bij wet verboden in California en Massachusetts en worden niet aanbevolen door de
“National Academy of Sciences” Guidelines voor humaan stamcel onderzoek. Men is vooral bezorgd dat de
vergoeding de vrije keuze van de vrouw zou ondermijnen. Alhoewel de New Yorkse staat recent
aangekondigd heeft dat ze wel bereid zijn om eiceldonatie voor onderzoek te vergoeden zoals nu de
gewoonte is bij eiceldonatie voor infertiliteitbehandeling (6).
Doordat verschillende staten van Amerika en verschillende landen een verschillend beleid voeren word het
stamcelonderzoek met menselijke stamcellen bemoeilijkt. Zo is het in Duitsland en Italië enkel toegestaan
om onderzoek uit te voeren op geïmporteerde hES-cel lijnen en word de derivatie van nieuwe lijnen van
overschotten ontstaan door IVF en SCNT verboden. Landen zoals Canada en Denemarken staan derivatie
van hES-cellen uit restembryo's van IVF toe maar verbieden SCNT. Andere landen hebben dan totaal geen
expliciete wetten over dit onderwerp. Groepen zoals de Interstate Alliances on Stem Cell Research (OASCR)
en de International Society for Stem Cell Research (ISSCR) proberen de grote verschillen in dit beleid te
Marieken Vanden Broucke
Pagina
27
harmoniseren. De laatste jaren is er een tendens naar een nieuw systeem om overzicht te krijgen in het
stamcel onderzoek. De Nationale Academies en het ISSCR stelden professionele guidelines samen die er toe
hebben geleid dat alle private en publiek gefinancierde onderzoek met pluripotente stamcellen gestimuleerd
en in de meeste instellingen verplicht worden om hun onderzoeksvoorstel goed te laten keuren door een Stem
Cell Research Oversight (SCRO) comité. Deze comités zijn ontworpen om stam cel specifieke vragen en
problemen te evalueren met betrekking op het voorgestelde onderzoek. Ze zijn samengesteld uit
wetenschappers,artsen, ethici, legale experts en anderen (6).
Recent werd het eerste klinische onderzoek met hES-cellen bij patiënten met een ruggenmergletsel opgestart.
Deze evolutie leidde een nieuw tijdperk in het stamcelonderzoek in met opnieuw nieuwe ethische vragen die
zich stellen. Dit geld niet enkel voor de ES-cellen maar voor alle stamceltherapieën van welke oorsprong de
stamcellen ook zijn(6). Het ISSCR gaf in december 2008 de “Guidelines for the Clinical Translation of Stem
Cells” vrij waarin men de wetenschappelijke, klinische, wettelijke, ethische en sociale discussiepunten
worden geadresseerd om op deze mannier de transitie van het stamcelonderzoek naar de klinische
toepassingen op een verantwoordelijke mannier te laten verlopen. Momenteel zijn er op verschillende
plaatsen in de wereld niet reglementaire stamcel klinieken die stamceltherapieën aanbieden aan hopeloze
personen die dit als laatste redmiddel tegen een hoge prijs proberen. Als men deze klinieken onderwerpt aan
de ISSCR criteria die in de guidelines zijn opgenomen bekomt men momenteel steeds opnieuw dat deze niet
zijn uitgevoerd zoals men zou willen verwachten. Men mag er echter niet van uit gaan dat al deze klinieken
in de toekomst frauduleuze instellingen zullen zijn aangezien deze experimentele behandelingen ook kunnen
leiden tot een betere klinische toepassing indien ze zich ook houden aan goed opgestelde protocollen (6, 40,
41).
1.7.3
Problemen en oplossingen
De isolatie, het kweken en differentiëren van menselijke pluripotente stamcellen heeft nog verscheidene
uitdagingen. Voorbeelden hiervan zijn de spontane differentiatie van de cellen, het voorkomen van een
abnormaal karyotype, de inefficiënte differentiatie, de afhankelijkheid van dierlijke producten en lage
opbrengst.
1.7.3.1 Xeno-free
Door het gebruik van dierlijke producten bij de derivatie en het culturen van humane stamcellen ontstaat er
een risico op transmissie van dierlijke pathogenen en op immuunreacties tegen deze dierlijke componenten.
Dit zorgt ervoor dat therapeutische toepassing van humane stamceltherapie wordt bemoeilijkt. Om
embryonale stamceltherapie mogelijk te maken moet er dus worden gezocht naar de meest ideale diervrije
derivatie technieken, cultuurmedia, substraten voor coating en menselijke feedercel methodes (42).
1.7.3.1.1 Derivatie
Sinds de eerste permanente hES-cellijnen werden gerealiseerd door Thomson et al. en Reubinoff et al. in
1998 werden er al honderden beschrijvingen over de derivatie van nieuwe hES-cellijnen gepubliceerd. De
meeste hiervan zijn afkomstig uit restembryo's bij In vitro Fertilisatie waarvan de cellen van de ICM werden
gepreleveerd doormiddel van immunochirurgie en het enzym pronase. Immunochirurgie is echter niet de
28
ideale derivatie techniek wanneer het gaat over blastocystembryo's van slechte kwaliteit, waarbij de ICM
moeilijk te onderscheiden is. Ook worden er voor deze techniek dierlijke producten gebruikt zoals muizen
antilichamen en complement afkomstig van cavia's. Ook het pronase die wordt gebruikt om de zona
pellucida te verwijderen is van dierlijk oorsprong. Een alternatief voor deze derivatietechniek is het gebruik
van tyrode zuur of mechanische opening voor het verwijderen van de zona pellucida en een mechanische
isolatietechniek van de ICM. Dit heeft als voordeel dat er geen contact is van de hES-cellen met dierlijke
pronase, complement of antilichamen(42).
1.7.3.1.2 Voedingslagen
De initiële gerapporteerde kweek en derivatie condities van hES-cellen, maakten gebruik van muizen
embryologische fibroblast (MEF) feeder cellen. Wat zeer gelijkaardig was met de gebruikte technieken voor
de derivatie en propagatie van muizen ES cellen. Dit brengt een risico mee voor transmissie van retrovirusen
en andere dierlijke pathogenen naast het aanwezig zijn van dierlijke proteïnen die tot een immuunreactie
kunnen lijden bij de mens, in het bijzonder de sialoproteïnen (42). Bij de murine ES-cellen afkomstig van de
muis is de toevoeging van Leukemia Inhibitory Factor (LIF) aan het kweekmedium voldoende om feeder
vrije proliferatie zonder differentiatie te bereiken, bij de productie van hES-cellen is dit niet mogelijk.
Daarbij komt ook dat hES-cellen maar ook iPS-cellen lange tijd (meer dan 100 passages (31)) gekweekt
kunnen worden op MEF's zonder hun capaciteit tot zelfvernieuwing te verliezen of te differentiëren. Wanneer
men echter de feedercellen verwijderd, starten ze spontaan te differentiëren(31). Vandaag zijn er
verschillende humane feedercellen uitgetest en er is aangetoond dat ze de groei en derivatie van hES-cellen
ondersteunen maar ze zijn minder capabel om de ongedifferentieerde status van de stamcellen te behouden
vergeleken met dierlijke feedercellen zoals MEF. Hierdoor is het aantal passages en de hoeveelheid
geproduceerde hES-cellen beperkter (31). Voorbeelden zijn cellen afkomstig uit foetaal huid- en spierweefsel
van geaborteerde embryo's, placentaire fibroblasten, uit adulte weefsels wist men feedercellen te isoleren
zoals eileidercellen, cellen van de voorhuid, edometriumcellen, adulte beenmerg stromacellen enz... maar
ook fibroblastcellen afkomstig uit humane embryonale stamcellen zijn bruikbaar. Alhoewel er in dit laatste
geval nog steeds sprake kan zijn van dierlijke besmetting aangezien de hES-cellen vaak niet xenovrij zijn
geïsoleerd en gekweekt (37, 42). Maar niet enkel de stamcellen kunnen in contact komen met de
feedercellen. Vaak wordt het kweekmedia geconditioneerd in een feedercel preparaat wat er voor zorgt dat
ook al word nadien een feederfree methode gebruikt er toch dierlijke componenten aanwezig kunnen zijn
(43).
1.7.3.1.3 Alternatieve voedingslagen
De mogelijkheid tot xenogene contaminatie tijdens het kweken op feeder cellen legt beperkingen op aan het
klinisch gebruik van deze humane stamcellen. De MEFs verschillen vaak tussen labo's en per lot wat de
karakteristieken en differentiatiepotentieel van de stamcellen beïnvloed en daarnaast is het gebruik van
feedercellen arbeidsintensief en duur waardoor het moeilijk toepasbaar is op grootte schaal. Feederfree
methodes gebruik makend van synthetische polymeren of biomacromoleculen kunnen dus de
Marieken Vanden Broucke
Pagina
29
reproduceerbaarheid van de kweekcondities verhogen en de kostprijs reduceren zonder de mogelijke
introductie van xenogene pathogenen.(31).
De eerste feederfree methode was de extra cellulaire matrix Matrigel, dit is een basale membraan matrix die
geëxtraheerd word uit Engelbreth-Holm-Swarm muizentumoren. Matrigel is effectief gebleken bij de
propagatie van feederfree culturen mits het gebruik van geconditioneerd medium aan de MEF cellen of
andere (eventueel humane) feeder cellen. Hieruit blijkt dat de feeder cellen oplosbare stoffen produceren
zoals groeifactoren en componenten van de extra-cellulaire matrix die nodig zijn om de ongedifferentieerde
status van stamcellen te onderhouden (31, 37). Matrigel word frequent gebruikt bij de feederfree groei van
hESC in ongedifferentieerde status om dat het goed de aanhechting en de groei van ongedifferentieerde hEScellen ondersteunt in MEF-geconditioneerd medium. Maar het is niet goed geschikt voor medische
applicaties door het risico op xenogene pathogenen. (31).
Een mogelijk alternatief zijn schalen gecoat met menselijk serum in combinatie met hES-dF-CM. Dit is een
medium die geconditioneerd is met fibroblasten die gedifferentieerd zijn uit hES-cellen. Zonder dit medium
differentieerden de hES-cellen binnen de 48 uur terwijl ze met tot meer dan 26 passages pluripotent blijven
in dit geconditioneerd medium. Onderzoek met chemisch gedefinieerde media en media geconditioneerd met
humane voorhuid fibroblasten toonde dat deze media de pluripotentie in deze opstelling niet kon
onderhouden(31).
Natuurlijke of recombinante componenten van extra cellulaire matrixen zoals collageen IV, fibronectine
en vitronectine zijn gebruikt in plaats van matrigel of serum om een schaal mee te coaten. Sommige van deze
onderzoeken publiceerden positieve resultaten. Bijvoorbeeld; cultuurschalen gecoat met humaan fibronectine
in combinatie met Ko-SR en toevoeging van TGF-β1, bFGF en eventueel LIF. In dit systeem behoud bFGF
de hES-cel cultuur, TGF-β1 ondersteund de hES-cel proliferatie, fibronectine bevordert de celadhesie en LIF
activeert de JAK/STAT3 pathway en ondersteund de zelfvernieuwing van de hES-cellen. Maar verschillende
rapporten stellen dat LIF, nog de activatie van de STAT3 pathway, meewerkt aan de zelfvernieuwing van de
hES-cellen. Een andere opstelling gebruik makend van laminine die ook in een humane recombinante vorm
kan worden gebruikt konden de ongedifferentieerde deling van hES-cellen ondersteunen voor meer dan 42
dagen(31) .
E-cadherin is een Ca2+-afhankelijke cel-cel adhesiemolecule en is essentieel voor de intercellulaire adhesie
en kolonievorming van ES-cellen. Het wordt in grote hoeveelheid tot expressie gebracht in
ongedifferentieerde ES-cellen. Nagaoka et al prepareerde een fusieproteïne bestaande uit een E-cadherin
extracellulair domain en een IgG Fc domein (E-cad-Fc). Dit recombinant E-cadherin substraat werd
onderzocht in combinatie met MEF-CM en in een serum vrij medium (mTESR-1). De hES-cellen die met
deze techniek werden gekweekt konden voor meer dan 35 passages hun pluripotentie behouden(31).
HES-cellen ingekapseld in hyaluronzuur hydrogels en gekweekt in MEF-CM blijven ongedifferentieerd
dellen voor meer dan 20 dagen maar hES-cellen die gekweekt worden in een monolayer hyaluronzuur of in
dextran hydrogels behouden hun pluripotentie niet. De hyaluronzuur hydrogel ES-cellen kan men laten
differentiëren door de toevoeging van oplosbare factoren in het medium en de ES-cellen kunnen worden
vrijgemaakt door de toevoeging van hyaluronidase. Hyaluronzuur hydrogels zijn dus een waardig alternatief
30
maar het blijft moeilijk om de pluripotentie te behouden voor meer dan 10 passages. Er is dus nog meer
onderzoek nodig(31).
Biomacromolecules, zoals matrigel en verschillende soorten ECM, zijn duur en hebben een gelimiteerd
halfleven. De ontwikkeling van volledig synthetische substraten is dan ook te verkiezen voor de groei van
hES-cellen en iPS-cellen. Het gebruik van synthetische polymeren die pluripotentie en zelfvernieuwing
onderhouden zijn gerapporteerd. Voorbeelden van deze polymeren zijn oxygen plasma etched tissue culture
poly-styrene (PE-TCPS) in samenwerking met MEF-CM (31).
In vivo bevinden de hES-cellen zich in een 3D-micro-omgeving waar ze beïnvloed worden door een
combinatie van biologische, chemische, fysische en mechanische signalen. De tot nu toe besproken kweek
condities bevinden zich echter allen in een 2D configuratie. 3D biomaterialen zijn in ontwikkeling. Een
cultuur met hES-cellen op een poreuze polymer scaffold samengesteld uit chitosa?an en alginaat en zonder
de ondersteuning van feeder cellen nog geconditioneerd medium, kon de pluripotentie behouden voor
minstens 21 dagen. Kweekmethodes die gebruik maken van microcarriers zijn ook gerapporteerd. Phillips
et al rapporteerde het succesvol kweken van hES-cellen in een 3D suspensie cultuur met trimethyl
ammonium gecoate polystyrene microcarriers in een serum vrije opstelling (58). De pluripotentie kon
behouden worden voor 6 passages. In een ander rapport werden hES-cellen onderhouden in een feeder vrije,
xeno vrije omgeving omkapseld in hydrogels (58). De hES-cellen werden ingekapseld in calcium alginaat
hydrogels en gegroeid in een serumvrij medium voor meer dan 260 dagen. Deze studie toonde dat de
ongedifferentieerde status van hES kan gehandhaafd worden doormiddel van inkapseling in een geschikt
polymeer (31).
1.7.3.1.4 Kweekmedia
In de beginjaren werden de meeste hES-cellen gekweekt in media die foetaal Bovien Serum (FBS) bevatte.
Later werd menselijke serum als vervanging gebruikt. Serum is een complex mengsel van verschillende
bestanddelen waarvan sommigen onbekend. Doordat verschillende stalen serum verschillen in samenstelling
en dus ook in capaciteit om de ongedifferentieerde status van hES-cellen te behouden, zou het ideaal zijn om
serum te vervangen door welbepaalde stoffen of factoren. Als gevolg hiervan werden er verschillende
serumvrije cultuurtechnieken ontwikkeld. De meest prominente is de Ko-SR of knock out serum replacement
van Invitrogen. Deze conventionele serumvervanger bevat basic Fibroblast Growth Factor (bFGF). Alhoewel
het gebruik van Ko-SR een meer gestandaardiseerde en beter gedefinieerde kweekcondities verzorgt in
vergelijking met serumbevattend medium is het niet vrij van dierlijke producten. Aangezien het AlbuMAX
bevat, dit is een lipidenrijke albumine fractie van het boviene serum en boviene transferrine (31). Na de
conventionele Ko-SR van invitrogen werden er verschillende serum replacements geproduceerd die geen
dierlijke producten bevatten zoals KnockOutTM SR XenoFree van invitrogen (35), TeSR2 van stemcell
technologies, deze media zijn volledig gedetermineerd en er zou dus geen nood moeten zijn aan
conditionering met feeder cellen (35), zoals bij de meeste feeder-free cultuurmethodes wel wordt gedaan.
De hoge kostprijs van deze gecommercialiseerde producten vormt dan weer een groot nadeel voor
grootschalig gebruik in onderzoekslabo’s.
Marieken Vanden Broucke
Pagina
31
1.7.3.1.5 Passaging
Passaging of subculturen is het proces waarbij een deel van de cellen in een nieuw medium worden
overgebracht. Door cel-cel interacties beïnvloeden de cellen elkaar, zo zal in een kweekmedium met een
grote densiteit meer differentiatie gebeuren en zal de proliferatie afnemen (37).
Mechanisch subculturen is gebruikt door verschillende teams en maakt geen gebruik van extra toevoegingen,
wat het dus een uitstekende methode maakt voor een GMP (Good Mannifacturing practice) methode. Maar
ze is niet altijd mogelijk, vaak moet men gebruik maken van enzymen die de cellen losmaken (43), alhoewel
enzymatische subcultureren een voordeel is voor productie op grote schaal kan de herhaaldelijke
blootstelling aan enzymes cytogenetische afwijkingen veroorzaken. HES-cellen die gecultureerd worden op
een conventionele MEF-feeder laag moeten behandeld worden met collagenase of dispase voor de transfer
van cellen naar een nieuwe plaat. Een interessant alternatief werd gerapporteerd door Kim et al.. In hun
studie werden poreuze polymeer membranen gebruikt die de hES-cellen scheidt van de feedercellen.
Hierdoor is de enzymatische scheiding van feedercellen en ES-cellen overbodig (31). Collagenase van GMPkwaliteit is voor handen (43).
1.7.3.1.6 Invriezen
Het bevriezen, bewaren en ontdooien moet ook op een GMP methode gebeuren. Het cryoprotectant medium,
eiwitbron en kwaliteit van de vloeibare stikstof moet onder de loep worden genomen en contact met de
vloeibare stikstof moet vermeden worden. Zowel vitrificatie als conventionele slow cooling/ rapid warming
werd succesvol gebruikt bij de cryostorage van hES-cellen. Deze procedures zijn mogelijk op een xeno-vrije
mannier maar er is nog geen standaard voor. Men kan bijvoorbeeld het foetaal kalf serum die normaal
aanwezig is in het cryoprotectant vervangen door humaan serum of een GMP-geproduceerd xeno-free
proteine-free medium gebruiken (37).
Xenogene-vrije, chemisch gedefinieerde cultuursystemen zijn voor handen, voorbeelden zijn; TeSR2™ met
human recombinant laminin (LN-511); NutriStem™ met LN-511; RegES™ met human voorhuid
fibroblasten (hFFs); KO-SR Xeno-Free™/GF cocktail met CELLstart™ matrix. De opgenoemde isolatie en
kweek media en substraten zijn in staat om ongedifferentieerde groei van humane pluripotente stamcellen te
ondersteunen (44) . Ook da passaging en derivatie kan gebeuren zonder het gebruik van dierlijke producten.
1.7.3.2 Productie op grote schaal
Om de klinische toepassing van humane stamcellen mogelijk te maken is er nood aan grote hoeveelheden
stamcellen. Zo zou een behandeling van type 1 diabetes mellitus met insuline secreterende beta islet cellen
ongeveer 108-109cellen nodig zijn per patiënt. Dit vraagt dus voor productiemethodes die op grote schaal
toepasbaar zijn (37).
Feedercel afhankelijke methodes zijn efficiënt en economisch haalbaar op laboratoriumschaal maar de
samenstelling van de feeder coculturen en de geconditioneerde media varieert sterk van lot tot lot. Daarnaast
is er ook risico op transmissie van xenogene of infectieuze agentia. Idealiter zouden de kweekmethodes op
grote schaal gebruik maken van volledig gedefinieerde gehumaniseerde media. Deze zijn voorhanden en
32
hebben bewezen pluripotentie en zelfvernieuwing van hES-cellen en iPS-cellen te onderhouden voor een
lange periode in combinatie met een ECM, biomateriaal of synthetisch substraat. Er zijn substraten
voorhanden zonder dierlijke bestanddelen bijvoorbeeld Cellstart. die het goed doen (37).
Mechanische methodes voor subculturen van hES-cellen zijn te arbeidsintensief om op grootte schaal toe te
passen. Enzymatische passaging vormt een risico op chromosomale instabiliteit en geeft oorsprong aan meer
heterogene kolonies aangezien er hier geen selectie is zoals bij de mechanische methode (37).
In de meeste op grote schaal methodes worden de stamcellen blootgesteld aan mechanische krachten zoals
schear stres geproduceerd door voortbewegend vocht. De effecten op de zelfvernieuwing en pluripotentie van
stamcellen zijn nog niet bekend. Alhoewel deze informatie van groot belang is voor de ontwikkeling van
bioreactors die in staat zijn humane stamcellen te kweken (37).
Verschillende uitdagingen moeten worden overwonnen voor het kweken op grootte schaal mogelijk wordt.
Sommige hiervan zijn toepasbaar voor alle cellen die men wil kweken. Zo zijn cellen in suspensie vaak
geneigd om aggregaten te vormen. Deze zorgen voor problemen door een gelimiteerde diffusie van
nutriënten, groeifactoren, metabole bijproducten en gassen. Deze cellen kunnen van elkaar worden
gescheiden door te schudden of te roeren maar dit veroorzaakt schear stress wat tot apoptose en celdestructie
leidt. Maar zelf wanneer deze aggregaten zich niet vormen kan door onvolledige menging een gradiënt in
metabolieten en opgeloste gassen ontstaan. Wat ook in adherente media een probleem kan geven.
Naast deze eerder genoemde problemen zijn er ook knelpunten inherent aan de humane stamcellen.
De ECM en groeifactoren bevattende media zijn op grootte schaal economisch niet haalbaar.
Reperfusiesystemen die het medium recycleren of de productie van stabielere producten kan deze kost doen
dalen maar de mogelijkheid bestaat dat dit voor bepaalde systemen onvoldoende is om het economisch
haalbaar te maken (37).
Humane stamcellen zijn genetisch instabiel. Door het lange termijn kweken neemt de kans op mutaties toe.
Deze kunnen in vivo kanker veroorzaken. Dit moet dus van dichtbij in het oog worden gehouden. De
monitoring van de differentiatiegraad is van even groot belang als deze op genetische mutaties. Aangezien
geen enkel differentiatieprotocol oorsprong geeft aan een homogene celpopulatie is er nood aan een op
grootte schaal toepasbare selectieprocedure. Deze moet een goede garantie kunnen geven dat de ontstane
celpopulatie enkel het beoogde celtype bevat en geen verkeerd of niet (volledig) gedifferentieerde cellen
bevat. Dit om het risico op carcinogenesis te beperken. Een mogelijke oplossing is het aanmaken van
genetisch gemodificeerde fluorescerende reporter cellijnen voor een gen specifiek voor het beoogde celtype
die ook een promotor-driven resistentie heeft voor een bepaald antibiotica. Dit laat een continue monitoring
toe van het differentiatieproces via fluorescentie microscopie en een eenvoudige selectie met behulp van
antibiotica. Bij deze methode is het echter noodzakelijk om de stabiliteit van de reporter gen insertie te
evolueren als ook het effect van de genetische medicatie en selectie procedure op de capaciteit en functie van
de uiteindelijke celpopulatie (37).
Marieken Vanden Broucke
Pagina
33
1.8 IPS-cellen
1.8.1
De ontdekking ->perfectioneren selectieprocedure -> betere populatie
Reprogrammatie van somatische cellen doormiddel van nucleaire transfer experimenten en door fusie met
ES-cellen, EG-cellen en EC-cellen toont aan dat er factoren in deze cellen aanwezig zijn die volwassen
somatische cellen kunnen terugbrengen naar een pluripotente ongedifferentieerde status. Verder onderzoek
toonde aan dat het nucleaire factoren zijn die bij NT en fusie de reprogrammering veroorzaken, dit
suggereerde dat transcriptiefactoren betrokken kunnen zijn. Dit laatste wordt gesteund doordat individuele
transcriptiefactoren, bij overexpressie of deletie een verandering in cellot kunnen veroorzaken. Onderzoek
door Harold Weinstraub en collega's toonde dat de overexpressie van de transcriptie factor MyoD voldoende
is om fibroblasten om te zetten naar myogene cellen (1). In een ander onderzoek slaagde men er in om
fibroblasten te transdifferentiëren naar neuronen door activatie van de neurale factoren Ascl1, Brn2, and
Myt1l. Fibroblasten zijn van mesodermale oorsprong terwijl de neuronen hun oorsprong vinden in het
ectoderm, dit toont aan dat transdifferentiatie niet beperkt is tot cellen van dezelfde kiemlaag. O ok
embryonale cellen worden beïnvloed door transcripie-factoren. De ectopische expressie van Cdx2 in EScellen zorgt voor de formatie van trofectodermale stam cellen en de ectopische expressie van Gata factors
lijdt tot de vorming van primitief endoderm. De observatie dat ES-cellen en andere pluripotente cellen zoals
de epiblast-stamcellen en de EGS-cellen dominante reprogrammerings activiteit bevatten en dat
transcriptiefactoren het cellot kunnen veranderen leidde er toe dat Kazutoshi Takahashi en Shinya Yamanaka
in 2006 vier transcriptiefactoren publiceerden waarmee een volwassen somatische cel kan gereprogrammeerd
worden naar een pluripotente cel die in staat is tot zelfvernieuwing (1, 19).
Takahashi en Yamanaka selecteerden 24 genen als kandidaat om pluripotentie te induceren. Geen enkel van
deze factoren kon bij inbreng met behulp van retrovirusen op zich zelf pluripotentie induceren maar de
simultane introductie van deze factoren in muis embryonale fibroblasten (MEF) cellen gaf wel oorsprong aan
pluripotente hES-cel like cellen. Daarna werden om beurt transcriptie-factoren weggelaten. Op deze mannier
kon men 10 factoren identificeren. De combinatie van deze factoren was efficiënter in de generatie van
pluripotente kolonies vergeleken met alle 24 factoren samen. Dezelfde selectieprocedure werd opnieuw
doorgevoerd en leidde tot de identificatie van slecht 4 factoren, Oct3/4, Sox2, c-Myc en Klf4, die bij
retrovirale inbreng in MEF cellen oorsprong geven aan pluripotente ES-cel like cellen die men induced
Pluripotent Stem Cells of geïnduceerde pluripotente stamcellen noemde. Om de gereprogrammeerde cellen te
identificeren werd er gebruik gemaakt van een drugs gemedieerde selectie voor de expressie van het Fbx15
gen. Deze Fbx15 geselecteerde iPS-cellen zijn vergelijkbaar met ES-cellen op vlak van morfologie,
proliferatie en teratomaformatie maar ze verschillen significant in gen expressie en DNA methylatie patroon.
Bij inbreng van de Fbx15-geselecteerde iPS-cellen in blastocysten konden er chimere muizenembryo's
worden gevormd maar zij gaven geen oorsprong aan adulte germline competente chimeren, wat een slechts
gedeeltelijk gereprogrammeerde status indiceert (7, 45).
Het verschil tussen de iPS-cellen en de ES-cellen kon verklaard worden door het gebruik van Fbx15 als
selectiecriteria. Fbx15, alhoewel specifiek, is niet essentieel voor pluripotentie. Er werd gezocht naar
strengere selectiecriteria. NANOG bleek een waardige vervanger, dit gen is net als Fbx15 een target van
34
Oct3/4 en Sox2 maar is wel essentieel voor pluripotentie. Oct4 bleek een ander volwaardig alternatief te zijn.
De NANOG en Oct4 geselecteerde iPS-cellen bleken wel in staat om germline competente muizen te
genereren en zijn vrijwel onherkenbaar van ES-cellen (1, 17, 45).
Sinds de ontdekking in 2006 zijn er al verschillende iPS-celllijnen gegenereerd, afkomstig van verschillende
weefsels en verschillende species waaronder de mens. Reprogrammering kan ook geïnduceerd worden door
alternatieve combinaties van factoren met Nanog, Lin28, ESRRB, NR5A2 en andere genen die de activatie
van het belangrijkste transcriptie circuit in stamcellen promoten. De factoren moeten in staat zijn om de
endogene pluripotentie genen te activeren. Dit kan direct of via andere factoren. Vroeger werd al
waargenomen dat cytokines of andere kleine moleculen in de kweekmedia specifieke signaalcascades
positief of negatief kunnen beïnvloeden. Het is dan ook geen verassing dat deze de pluripotentie pathway
kunnen beïnvloeden bij het genereren en het behouden van zowel ES-cellen als iPS-cellen (17).
Transcriptie geinduceerde pluripotentie is een gradueel proces, er zijn 1 tot 2 weken nodig voor de generatie
van iPS-cellen uit muizenfibroblastcellen. Onderzoek op vroege en late stadia van reprogrammatie toonde
een gedefinieerde sequentie van moleculaire gebeurtenissen. Deze gebeurtenissen starten met een
downregulatie van somatische markers zoals Thy1 en collagenen, gevolgd door de reactivatie van de
embryonale marker stage specific embryonic antigen 1 (SSEA 1). SSEA1 positieve cellen gaan dan gradueel
andere markers geassocieerd met pluripotentie activeren, inclusief Oct4, Sox2, Nanog, telomerase en het
silent X chromosoom in vrouwelijke fibroblasten. Deze reactivatie van late markers correleert in de tijd met
het moment waarop de cellen onafhankelijk van de retrovirale transgene expressie worden en een
zelfonderhoudende pluripotente status verkrijgen (1).
De iPS-cellen hebben het potentieel om patiënt specifieke regeneratieve geneeskunde mogelijk te maken, te
helpen bij onderzoek naar nieuwe geneesmiddelen en onze kennis van de menselijke ontwikkeling en
biologie uit te breiden (46).
1.8.2
iPS-cellen versus ES cellen
1.8.2.1 Ethisch
De ethische bezwaren voor ES-celonderzoek zijn vooral veroorzaakt door de noodzakelijke destructie van
embryo's. Voor de generatie van iPS-cellen is dit niet nodig wat de ethische dilemma's minder hevig maakt.
Er zijn echter wel specifieke ethische bedenkingen voor de iPS-cellen, bijvoorbeeld wat men moet doen
wanneer een toevallige vondst problemen aan het licht stelt die een belangrijke impact kunnen hebben op de
donor zijn leven (6).
1.8.2.2 Immuunafstoting
Doordat de iPS-cellen het genetisch materiaal van de patiënt bevatten, zou er geen immunosuppressie
therapie nodig zijn bij transplantatie van iPS-cel gederiveerde weefsels (47). Maar een recente publicatie
toonde het tegendeel. Van muizen werden zowel ES-cellen als iPSC geproduceerd. De iPSC werden zowel
met retrovirale transfectie als met episomale technieken verkregen. Wanneer men de ES-cellen inbracht in
allogene muizen werden er teratoma’s gevormd zonder enige aanwijzing van immuunafstoting. De injectie
35
Marieken Vanden Broucke
Pagina
van autologe ES-cellen veroorzaakte een snelle immunologische destructie van de geinjecteerde cellen, nog
voor er teratoma’s konden gevormd worden. Wanneer men hetzelfde uitvoerde met de iPSC observeerde men
in meer of mindere mate een immuunrejectie. Deze werd vastgesteld aan de hand van de detectie van CD4+
T-cel infiltratie, weefselschade en tumorregressie. De iPSC geproduceerd met behulp van retrovirale
transfectie vertoonde een grotere immunogeniciteit dan de iPSC geproduceerd met de episomale methode.
Men bevestigde de hypothese dat deze immuunreactie gemedieerd werd door zowel de CD4+ als CD8+ Tcellen aangezien zowel CD4 -/- en CD8-/- muizen geen afstoting vertoonden. De immunogene factoren
aanwezig in iPSC afkomstige teratoma’s zouden afkomstig zijn van de overexpressie van factoren in de iPSC
die normaal niet tot expressie komen tijdens de normale ontwikkeling en differentiatie van ES-cellen.
Voordat men iPSC kan toepassen in de kliniek zal er dus nog meer onderzoek moeten gebeuren naar de
immunogeniciteit van deze cellen en naar de optimalisatie van het reprogramatie protocol (9).
1.8.2.3 Ziektemodelen
In vitro ziektemodellen zijn mogelijk met zowel ES-cellen en iPS-cellen. Bij de ES-cellen werden embryo's
gediagnosticeerd met een detecteerbare aandoening gebruikt bij de aanmaak van een ziektespecifieke EScellijn. Een voordeel bij het werken met iPS-cellen is dat deze ook ziektemodellen mogelijk maken van
pathologieën die pas later in de ontwikkeling zich uiten of waarvoor geen prenatale diagnostiek word
uitgevoerd (48).
Maar effecten van veroudering en ziekte in chronische condities zoals de ziekte van Alzheimer zijn
gemedieerd via epigenetisch effecten op genexpressie. Aangezien de iPS-cel technologie de epigenetische
handtekening wist, is het mogelijk dat het noodzakelijk cellulair geheugen om de ziekte tot expressie te
brengen verloren gaat in zowel de iPS-cellen als hun gedifferentieerde nakomelingen. Dit werd al
gerapporteerd bij iPS-cellen afkomstig van patiënten met het fragile X syndroom. Het fragiele X-syndroom
wordt veroorzaakt door een mutatie in het fragile X mental retardation 1 (FMR1) gen. Er bestaat een
significant verschil tussen de ES-cellen en de iPS-cellen afkomstig van embryo's/patiënten die het fragile X
syndroom hebben. De FX-ES-cellen brengen het gemuteerd FMR1 gen tot expressie in de
ongedifferentieerde status maar dit wordt transcriptioneel gesilenced tijdens de differentiatie. In contrast
blijft bij FX-iPS-cellen de FMR1 locus inactief en word ze niet gereset naar zijn transcriptionele actieve
status tijdens het reprogramatieproces (48, 49).
De ziektemodellen afkomstig van humane pluripotente stamcellen zijn niet alleen in staat om een nieuw licht
te scheppen op de ontwikkeling van de pathologie zelf, ze zijn een bron van cellen voor het testen van
mogelijke geneesmiddelen. Ook pathologievrije lijnen kunnen gebruikt worden voor de screening naar
toxiciteit. Dit kan van groot belang zijn, er zijn in het verleden geneesmiddelen op de markt geweest die zeer
negatieve bijwerkingen hadden maar deze waren niet geobserveerd bij de dierlijke testpersonen. Een
menselijk model voor toxiciteit-screening kan dit ten dele verhelpen en kan het vele dierenleed verminderen.
Een voorbeeld van een geneesmiddel met grootte gevolgen is het talidomide die werd gebruikt bij
zwangerschapsmisselijkheid (48).
36
1.8.2.4 Carcinogenese
Voor zowel de ES-cellen als de iPSC gelt dat de transplantatie van onvolledig gedifferentieerde cellen in een
individu een risico op carcinogenese veroorzaakt. Het is dus bij beiden van groot belang dat men protocollen
ontwikkeld om dit te verkomen (50). De conventionele iPS-cel technieken zijn gelimiteerd door het gebruik
van virusgemediteerde integratie van de reprogrammerings factoren, dit kan lijden tot permanente integratie
van oncogene (c-myc en Klf4) en potentieel schadelijke genomische veranderingen. Dit extra risico maakt
iPS-cellen meer tumorogeen dan ES-cellen alhoewel ze beiden inherent deze eigenschap bevatten. Er zijn
protocollen ontwikkeld die een integratie vrije productie van iPSC mogelijk maakt(62) . De integratie van cmyc kan bij reactivatie leiden tot tumorvorming. Dit laatste werd bepaald door de “derived mouse assay” , in
deze testen worden chimere muizen gederiveerd van iPSC onderzocht op tumorvorming. De iPSC
gegenereerd met behulp van de integratie van c-myc vertoonden in sommige onderzoeken tot in 20% van de
gevallen maligne tumoren, in tegenstelling tot deze geproduceerd zonder de integratie van c-myc waar er
geen maligne tumoren werden gerapporteerd (10, 51).
1.8.2.5 Efficiëntie
De efficiëntie voor de generatie van iPS-cellen reikt van 0,01 tot 1 %. In vergelijking met deze bij de
generatie van hES-cellen uit de ICM (12%) en deze bij NT (1-3%) is dit opmerkelijk laag (1, 19).
De efficiëntie kan worden verhoogd door de toevoeging van chemische agentia (19).
1.8.3
zijn ES-cellen en iPS-cellen gelijk?
De criteria die worden gebruikt om ES cellen en iPS-cellen te vergelijken includeren zowel moleculaire als
biologisch onderzoek.
Om de twee groepen cellen te kunnen vergelijken moet er echter op gelet worden dat er geen interfererende
variabelen aanwezig zijn die de genexpressie en biologische karakteristieken van de pluripotente stamcellen
kan beïnvloeden. De meest voorkomende zijn weergegeven in de tabel hieronder (tabel 2). Deze paramaters
zijn onder andere de incomplete sillicing van de transgenen, de verschillende combinaties van
reprogrammerings-factoren die worden gebruikt, de natuurlijke heterogeniteit die bestaat tussen de
verschillende iPS-cellijnen, de incomplete reprogrammering van cellen die slecht weinig passages hebben
ondergaan, en de genetische achtergrond van de cellen (12).
parameter
Factoren die de pluripotente cel
status beïnvloeden
Overwegingen voor onderzoek
iPSC die transgenen bevatten
De aanwezigheid en onvolledige
silencing
van
de
reprogrammeringsfactoren die vaak
worden ingebracht bij de generatie
van iPSC kunnen de identiteit en de
functionaliteit van de geinduceerde
cellen beinvloeden
De generatie van vector
gereprogrammeerde cellen
Marieken Vanden Broucke
Pagina
vrije
37
Genetische achtergrond van de cellen
Onvolledige reprogrammering
In vitro moleculaire heterogeniteit van
ES-cellen
Verschillende combinaties van de
reprogrammeringsfactoren
Het genexpressie patroon en de in
vivo ontwikkeling mogelijkheden
kunnen variëren tussen verschillende
muizen strain’s (help; hoe vertaal je
dit?) (bijvoorbeeld de 129 strain
versus de nonobese diabetis strain)
Directe reprogrammering is een traag
en gradueel proces die over
verschillende celdellingen gebeurt.
ES-cel
klonen
met
dezelfde
genetische
achtergrond
kunnen
interclonale variabiliteit vertonen.
Aanpassing aan de verschillende
kweekcondities zou een bron van
heterogeniciteit zijn
iPSC kunnen geproduceerd worden
door de transductie van verschillende
combinaties
van
reprogrammeringsfactoren en kleine
moleculen. Dit kan een weerslag
hebben
op
de
epigenetisch
karakteristieken van de iPSC
Vergelijking van ES-cellen en iPSC
van cellen met een identieke
genetische achtergrond
Analyse
van
volledig
gereprogrameerde
cellijnen
die
voldoende
celdelingen
hebben
ondergaan
Vergelijking tussen verschillende
onafhankelijke ES-cellen en iPSC met
dezelfde genetische achtergrond en de
zelfde kweekcondities.
Inclusie
van
cellijnen
die
geproduceerd zijn met verschillende
combinaties
van
reprogrammeringsfactoren en kleine
moleculen.
Tabel 2 overgenomen en vertaald uit (12) ; Verschillende factoren kunnen de vergelijking tussen iPSC en ES-cellen
bemoeilijken, controle van deze parameters kan een oplossing bieden.
1.8.3.1 Moleculaire testen
In ieder geval is er voor sommige iPS-cellen geen verschil waarneembaar in vergelijking met ES-cellen op
gebied van globale gen expressie, modificatie van de histone-tails, de X chromosoom inactivatie en het
DNA-methylisatie profiel. Twee onafhankelijke studies concludeerden dat het enige waarneembare
verschilpunt tussen de ES-cellen en een groot deel van de iPS-cellen de abnormale reductie van de expressie
van het materneel geimprinte Dlk1-Dio3 locus is (12). Deze reductie zou de oorzaak zijn waarom men er
lange tijd niet in slaagde om via tetraploïde complicatie all-iPS-muizen te vormen(30). Aangezien men enkel
all-iPS-mice kan genereren van iPS-cellen die deze abnormale expressie niet vertonen (12), deze werden
enkel waargenomen bij iPScellen afkomstig uit fibroblasten, waarschijnlijk omdat fibroblasten van nature de
Dlk1-Dio3cluster sterk tot expressie brengen. Men moet wel vermelden dat dit enkel geld voor muizencellen,
er moet nog onderzocht worden of het menselijk equivalent MEG-3 of andere genen de zelfde voorspellende
waarde hebben (19) . Deze conclusie moet met enige voorzichtigheid worden behandeld aangezien muizen
met een bi-allelishe deletie in componenten van Dlk1-Dio3 levensvatbaar zijn (12).
In cellen afkomstig van personen met het fragiele X-syndroom zijn er wel verschillen waarneembaar tussen
ES-cellen en iPS-cellen. Het fragiele X-syndroom is een frequent voorkomende vorm van mentale retardatie
veroorzaakt door een CGG-triple repeat ter hoogte van de 5' regio van het FMR1 gen. In de ES-cellen zorgt
deze repeat niet voor de inactivatie van het FMR1 gen. Dit gebeurt wel wanneer men de cellen laat
differentiëren. De iPS-cellen afkomstig van een patiënt met het fragiele-X-syndroom vertonen deze
inactivatie wel, en word het FMR1 gen niet gereset naar de transcriptionele actieve status (12)
Een belangrijke vraag is of de iPS-cellen een epigenetisch geheugen behouden van hen oorsprongscel. Dit
epigenetisch geheugen wordt gedefinieerd als een overblijvende epigenetische markers die afkomstig zijn
38
van de oorsprongscel en die een invloed hebben op de transcriptie in de resulterende iPS- cel. Onderzoek van
stamcellen geproduceerd aan de hand van nucleair transfer suggereert dat gekloonde embryo's een gen
expressiepatroon vertonen die hun oorsprong reflecteert (52).
In humane iPS-cellen afkomstig van fibroblasten, adipose weefsel en keratinocyten werden er ook een
expressie profielen gevonden die een transcriptioneel geheugen indiceren. De geanalyseerde cellen werden
echter afgeleid in onafhankelijke laboratoria en met verschillende technologieën. Een andere studie bij
muizen bevestigde deze resultaten door de vergelijking te maken tussen genetisch gematchte iPS-cellen
afkomstig uit granulocyten, spier progenitorcellen, fibroblasten en lymfocyten. Bij dit experiment werd er
ook een preferentiële differentiatieroute waargenomen. Een andere studie toonde dat de analyse van het
DNA-methylisatiepatroon van een gegeven iPS-cel kloon de cel van oorsprong kon voorspellen. Deze
epigenetische verschillen kunnen worden vermindert door de toediening van chromatine-modificerende
drugs of continue passaging van de cellen. Samengevat kan men dus zeggen dat iPS-cellen die nog niet veel
passages hebben ondergaan een transiënt epigenetisch geheugen bevatten van hun oorspong en dat deze het
differentiatiepotentieel kan beïnvloeden (19).
1.8.3.2 Biologische testen
Op vlak van de biologische testen zijn er geen verschillen waarneembaar tussen de iPS-cellen en de EScellen. Recent bleken iPS-cellen toch in staat te zijn om via tetraploïde complementatie oorsprong te geven
aan muizen met enkel cellen afkomstig van die iPS-cel (12, 30).
Voor het testen van humane stamcellen zijn alle ethisch verantwoorde testen uitgevoerd.
Samengevat kan men stellen dat somatische cellen kunnen gereprogrammeerd worden naar een pluripotente
status die zowel op moleculair als biologisch vlak onherkenbaar zijn van ES-cellen en voldoen aan de meest
stringente test voor pluripotentie; de tetraploïde complementatie. Hoewel er in sommige gevallen subtiele
verschillen worden vastgesteld. Deze zijn echter inconsistent en vaak van transiënte aard. Men moet er wel
steeds op bedacht zijn dat de meest stringente testen voor het ontwikkelingspotentieel wegens de voor de
hand liggende ethische redenen, niet worden uitgevoerd met humane iPS-cellen.
1.8.4
Mogelijke problemen en oplossingen
1.8.4.1 Efficiëntie van iPSC reprogrammering
Het reprogrammeringsproces is bijzonder inefficiënt. Minder dan 1% van de behandelde cellen worden
gereprogrammeerd tot iPS-cellen (17, 19). Een mogelijke verklaring hiervoor is dat de oorsprong van de
iPS-cellen te vinden is in zeldzame somatische stamcellen of voorlopercellen die zich bevinden in de
fibroblasten cultuur. Men heeft echter aangetoond via controle van de efficiëntie van in vitro plating, groei
expansie en gen transfectie dat de iPS-cel generatie niet preferentieel gebeurt in minder gedifferentieerde
cellen en dat het differentiatieproces niet vergezeld word door een intrinsieke vermindering in
reprogrammerings potentieel(12). Een andere verklaring voor de lage efficiëntie is dat er meer dan deze vier
factoren geactiveerd moeten worden en dat dit door de retrovirale insertie via insertionele mutagenese kan
gebeuren (1, 17). Dit werd dan weer tegengesproken door de mogelijkheid om genetisch niet39
Marieken Vanden Broucke
Pagina
gemodificeerde iPS-cellen te genereren (12, 15). Een derde mogelijkheid is dat de iPS-cel generatie
afhankelijk is van de specifieke hoeveelheden en patroon van de expressie van de vier factoren. Als dit het
geval is, zou men verwachten dat cellen die alle vier de transcriptiefactoren reactiveren in de correcte
stochiometrie oorsprong zouden geven aan iPS-cellen met een efficiëntie van 100%. Een doxycylineinduceerbaar “secundair” systeem werd hierbij gebruikt. De 4 transgenen konden zo gereactiveerd worden
door de toevoeging van doxycycline. Wanneer men dit uitvoerde met muizen of menselijke fibroblasten
bekomt men een efficiëntie van 3 tot 5%, wat 30 tot 100 maal meer is maar verre van succesvol. Deze
resultaten wijzen er op dat de expressie van de vier factoren alleen insufficiënt is om volwassen somatische
cellen te reprogrammeren en dat er dus additionele gebeurtenissen de efficiëntie van reprogrammeren
beïnvloedt (1, 12, 17).
De efficiëntie kan worden verhoogd door de toevoeging van chemische agentia (19). Zo kan de toevoeging
van valproic zuur de efficiëntie van de reprogrammatie 100 maal vermeerderen en de toevoeging van 5azacytidine vermeerderd deze met een tienvoud. Chemische moleculen kunnen niet enkel de efficiëntie
vergroten maar ze kunnen in sommige gevallen ook de integratie van transcriptiefactoren vervangen, zo kan
valproic zuur c-myc vervangen in het standaard protocol bij muizen en kan men met de combinatie van de
twee kleine moleculen BIX-01294 (een G9a histone methyltransferase inhibitor) en BayK8644 (een L-kanaal
calcium agonist) muizen cellen reprogrammeren met enkel de introductie van Oct3/4 en Klf4 . Kenpaullone
kan Klf4 vervangen bij de generatie van muizen iPSC (50).
1.8.4.2 Inbreng van virale factoren
De eerste generatie iPS-cell werden gegenereerd met behulp van integrerende retrovirale vectoren. Deze
worden vaak gesilenced door de activatie van DNA en histone methyltransferasen aan het eind van het
reprogramatieproces wat er voor zorgt dat er vaak een onvolledige reprogrammatie optreed. Door de
invoeging is er ook risico op insertionele mutagenese en vaak merkt men residuele activiteit of reactivatie
van de factoren op die een invloed kunnen hebben op de differentiatie. Omdat de expressie van de factoren
bij het voorgaande niet kan geregeld worden ontwikkelde men integrerende lentivirale vectoren die bij de
toevoeging van doxycyline worden geactiveerd. Dit heeft als voordeel dat men geen residuele activiteit meer
geeft en dat men de gereprogrammeerde cellen gemakkelijk kan herkennen doordat deze bij de ontrekking
van doxicycline blijven prolifereren in tegenstelling tot de cellen waar het endogeen pluripotentie circuit niet
is geactiveerd. Doordat de integratie van
vectoren altijd samengaat met een gevaar voor insertionele
mutaties werd er gezocht naar een productiemethode die hier geen gebruik van maakt. Deze integratie vrije
iPS-cellen kunnen in 3 grote categorieën worden opgedeeld. Ten eerste hebben we de non-integrerende
factoren, voorbeelden hiervan zijn de adenovirale vectoren, de plasmiden en de polycistronic mini-circle
vectoren Deze methode heeft echter een lagere efficiëntie dan die van de integrerende lentivirale vectoren
respectievelijk 0,001% versus 1-0,1%. Dit zou te wijten zijn aan de onvoldoende lange expressie van de
factoren. Men kan ook gebruik maken van verwijderbare vectoren. Het is echter nog niet duidelijk of deze
verwijdering lijd tot genomische alteraties. De laatste categorie maakt in het geheel geen gebruik van
vectoren opgebouwd uit nucleinezuur. Men kan hier bij gebruik maken van volledige cel-extracten van
bijvoorbeeld ES-cellen maar men slaagt er ook in om het zelfde te bekomen met gezuiverde recombinante
40
proteïnen mits de toediening van een histonedeacetylase inhibitor valproïnezuur.
Recente onderzoeken
proberen om de somatische cellen te reprogrammeren aan de hand van het inbrengen van modificerende
RNA molecules. De efficiëntie van de reprogrammering kan verbeterd worden door de toevoeging van
chemische substanties, en chemicaliën kunnen in sommige gevallen een transcriptiefactor vervangen maar
het is nog niet mogelijk om alle transcriptiefactoren hierdoor te vervangen (12, 19, 50).
Integrerende vectoren
Verwijderbare vectoren
Niet integrerende vectoreren
Vector
type
Retrovi
raal
Lentivi
raal
Inducee
rbaar
lentivira
al
transposo
ns
Adenov
iraal
Plasmid
en
Proteïne
n
Cel
type
Fibrobla
sten,
neurale
stamcell
en,
levercell
en,
keratino
cyten,
amniotic
he
cellen,
bloedcel
len,
adipose
cellen
M, h, rh,
v, r
 0,01
%-0,5%
Redelijk
e
efficiënti
e
Fibrobla
st,
keratino
cyten
Fibroblas
ten, betacellen,
keratinoc
yten,
bloodcell
en,
melanoc
yten
Fibroblaste
n
Lentiviraa
l
geflankeer
d
door
LoxP
Fibroblaste
n
Fibrobl
asten,
levercel
len
Fibrobla
sten
fibroblas
ten
fibroblas
ten
M, h
M, h, v
m, h
M, h
M, h
M,h
M, h
h
 0,1%
-1%a
Redelijk
e
efficiënt
ie
 0,1%
 0,00
1%
Geen
integrat
ie
 0,001
%
Geen
integrati
e
 0,001
%
Geen
integrati
e, geen
DNA
 1%
Redelijke
efficiëntie,
geen
integratie
 0,1%1%
Redelijke
efficiëntie,
geen
integratie
Meerder
e
integrati
es,
onvolled
ige
silecing
van de
factoren
Meerder
e
integrati
es,
onvolle
dige
silecing
van de
factoren
 0,1%1%
Redelijk
e
efficiënti
e,
gecontrol
eerde
expressie
van de
factoren
Meerder
e
integratie
s, nood
aan
transacti
vator
expressie
Arbeidsint
ensieve
karakterisa
tie van de
integratie
sites voor
en
na
transposon
verwijderi
Arbeidsint
ensieve
screening
van
de
excisie,
LoxP sites
blijven in
het
genoom
Lage
efficiën
tie
Lage
efficiënt
ie,
occasion
ele
vector
integrati
e
Lage
efficiënti
e
Verijst
verschill
ende
cyclusse
n
van
transfect
ie
Species
Efficië
ntie
Voorde
el
Nadeel
Marieken Vanden Broucke
Pagina
DNAvrije
vectore
n
RNA
Geen
integrati
e en een
grote
efficiënti
e
41
ng
figuur overgenomen en aangepast uit (19)
Verschillende protocollen voor de generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen
Species; (h) humaan, (m) muis, (v) varken, (rh) rhesus aap, (r) rat
a
Een efficiëntie van 1% kan bekomen worden met behulp van geconcentreerde lentivirale vectoren die alle
factoren coderen in één polycistroon transcript.
1.8.4.3 De selectie van volledig gereprogrammeerde cellen
De selectie van volledig gereprogrammeerde iPS-cellen kan gebeuren aan de hand van de koppeling van
pluripotentie geassocieerde genen (zoals NANOG en Oct4 ) aan een drugs (geneesmiddel) selectie cassette.
Een voorbeeld hiervan is het gebruik van doxycycline die hierboven werd besproken. Maar voor deze
techniek zijn genetisch gewijzigde cellen of muizen nodig wat de therapeutische toepassingen van deze
cellen beperkt. Daarnaast zijn er zeldzame cellijnen beschreven die toch slecht ten dele gereprogrammeerd
cellen bevatten, dit kan men vermijden door ook morfologische criteria te gebruiken. Bij muizen werd er
recent het geimprinte gen Gtl2 beschreven die zo als eerder beschreven kan weergeven of deze cellen het
zelfde ontwikkelingspotentieel hebben (tetraploïde complementatie) als de embryonale stamcellen. Bij de
mens kan men op basis van celoppervlakte markers, in het bijzonder TRA-1-81 de volledig
gereprogrammeerde cellen onderscheiden van deze die niet of slecht gedeeltelijk zijn gereprogrammeerd.
Een strengere test is om deze oppervlakte markers te combineren met zogenaamde “indicator retrovirussen”
die fluorescerende proteïnen tot expressie brengen die bij reprogrammatie gesilenced worden. Het is echter
ook mogelijk om enkel op basis van morfologische criteria de selectie door te voeren. De bekomen cellijnen
worden dan wel best zorgvuldig opgevolgd (19).
1.9 Toekomstige Toepassingen van ES cellen en IPS-cellen in de
regeneratieve geneeskunde
Orgaan transplantatie word bemoeilijkt door een te kort aan donorweefsel en cellen, wetenschappers kijken
dan ook hoopvol uit naar alternatieve bronnen. Gedifferentieerde cellen uit humane embryonale en
geïnduceerde stamcellen zouden hier een oplossing kunnen bieden. Of deze cellen te gebruiken zijn bij celgebasseerde therapie zal afhangen van verschillende factoren. Het is essentieel dat men er in slaagt om cellen
efficiënt te differentiëren en de bekomen populatie te zuiveren van eventueel aanwezige teratoma vormende
onvolledige gedifferentieerde cellen. Het is ook van groot belang dat de gedifferentieerde cellen in staat zijn
zich op een correcte mannier te integreren in weefsels. Recente vooruitgang in weefsel-engineering toonde
de mogelijkheid om sommige structurele limitaties te omzeilen. Verschillende rapporteringen toonden de
mogelijkheid aan om volledige bioartificiele longen, levers en harten te produceren door het uitplaten van
endotheliale en epitheliale cellen op gedecellulariseerde scaffolds. De gegenereerde organen konden
42
geïntegreerd worden in dieren en vertoonden, ten minste voor enkele dagen, een normale functie (49).
Publicaties melden de productie van retina-cellen, dopaminerge neuronen, motorneuronen, OPC,
cardiomyocyten, beta-pancreas cellen, hepatocyten (3), dendrieten en chondrocyten (33) vanuit ES-cellen.
Recent werd duidelijk dat de meeste gedifferentieerde cellen zich in een imatuur stadium bevinden. Of dit de
klinische bruikbaarheid beïnvloed is afhankelijk van het soort ziekte en het celtype (49). Transplantatie van
gedifferentieerde ES-cellen en iPSC worden voorgesteld voor de behandeling van verscheidene
degeneratieve ziekten zoals majeure metabole ziekten als diabetes type 1, diverse hersenziekten en myeline
stoornissen zoals Multiple Sclerose (MS), de ziekte van Parkinson en de ziekte van Huntington, hartziekten
waarbij cellen vervangen dienen te worden zoals een myocardinfarct en genetische ziekten zoals myopathiën
(3).
1.9.1
Ruggenmergletsels
De meeste ruggenmergletsels als gevolg van ongevallen in het verkeer, op de werkvloer of tijdens het
sporten, veroorzaken een breuk of een verplaatsing van wervellichamen, die dan op zijn beurt een contusie
van het ruggenmerg veroorzaakt, in tegenstelling tot de veel minder voorkomende ruggenmergtransectie
(33). De pathogenese van deze ruggenmergletsels bestaat uit een complex proces die start met de ruggenmerg
compressie en directe schade aan axonen en cellen, bloedingen en hypoperfusie. Dit initieel trauma initieert
een secundaire degeneratieve cascade die het verlies van neuronen, oligodendrocyten, myeline en axonen
versterkt. Dit is gemedieerd door een inflammatoire en immunologische respons, de proliferatie van
prognitorcellen, migratie van astrocyten naar de plaats van het letsel, gliosis en cyst vorming (53). Onder
Gliosis verstaat men de proliferatie van astrocyten in beschadigde delen van het centraal zenuwstelsel. Deze
proliferatie leidt meestal tot de vorming van een litteken, vaak “astrocytic scar” of “glial scar” genoemd. Dit
litteken heeft een gunstig effect op het herstel van de fysieke en chemische integriteit van het centraal
zenuwstelsel maar is een belangrijk obstakel bij de regeneratie van de neuronen, aangezien de astrocyten de
gedemyelineseerde axonen afschermen van de oligodendrocyt prognitor cellen (OPC) en ze factoren
secreteren die de proliferatie en differentiatie van deze cellen tegengaat (54). Oligodendrocyten zijn van
nature aanwezig in ons centraal zenuwstelsel en verzorgen de myelinisatie van de axonen, daarnaast
produceren ze neurotrofe factoren die de overleven en het functioneren van neuronale cellen gunstig
beïnvloed (33). Ze zijn echter zeer vatbaar voor de factoren aanwezig ter hoogte van een inflammatie,
hierdoor sterven ze ook vaak in de secundaire fase van een ruggenmergletsel (54).
De volwassen hersenen bezitten van nature neurale stam cellen, aanwezige ependymale stamcellen in het
centrale kanaal van ons ruggenmerg worden geactiveerd en gestimuleerd tot proliferatie na een contusie van
het ruggenmerg. Binnen enkele maanden worden op de plaats van het letsel bijna twee miljoen nieuw cellen
geproduceerd, met een piek op dag drie tot zeven na het ontstaan van het letstel. Deze activatie is echter
onvoldoende om een volledig herstel te veroorzaken (54). Met behulp van humane embryonale en
geïnduceerde pluripotente stamcellen hopen wetenschappers een milieu te creëren waarin er via
Marieken Vanden Broucke
Pagina
43
remyelinisatie, axon elongatie en de aanmaak van nieuwe circuits een overbrugging van het letsel kan
ontstaat (54).
Introductie van nieuwe cellen ter hoogte van een ruggenmergletsel onder de vorm van motorneuron
(motorneuron prognitor; MP) en oligodendrocyte prognitor cellen (OPC) zou een goede strategie zijn om de
onderbroken synaptische connectie te herstellen. Onderzoek toonde aan dat OPC geproduceerd uit humane
ES-cellen en MP-cellen geproduceerd uit muizen ES-cellen, bij inbrengen in een ruggenmergletsel door
contusie, meewerken aan de remyelinisatie van axonen en trofische steun bieden aan de resterende intacte
axonen, in dierexperimenten. En op deze mannier het herstel positief beïnvloeden. In modellen met een
ruggenmergcontusie konden OPC gedifferentieerd uit hES-cellen overleven, integreren, differentiëren en
beschadigde axonen remyeliniseren, met als gevolg een significante verbetering in de locomotorische functie
bij ratten. In een andere reeks experimenten werd bij raten een ruggenmergtransectie uitgevoerd ter hoogte
van T8 waarna in alle vergeleken groepen subcutaan Rolipram (een fosfodiesterase inhibitor type 4 die
axonale groei ondersteunt) werd toegediend. Bij volledige transectie van het ruggenmerg zou men
verwachten dat de OPC cellen weinig effect hebben, aangezien er geen axonen overblijven om te
remyeliniseren maar dit onderzoek toonde wel een significant herstel. Analyse van de weefsels toonde
neuronale cellen aan. De wetenschappers wijdden dit aan de aanwezigheid van neuronale prognitors in de
getransplanteerde OPC populatie, dit staat in contrast met vorige rapporteringen dat hESC differentiëren naar
een zuiver populatie van OPC. OPC zouden ook via de generatie van een paracrien/trofische omgeving en
een positieve modulatie van de locale immuun respons, alsook de bevordering van neuronale bescherming en
activatie van de endogene neurogenese het herstel bevorderen. Dit geeft aan dat regeneratieve mechanismen
niet enkel afhankelijk zijn van het specifieke cellot. Bij de zelfde populatie ratten werden ook MP-cellen
afkomstig van hES-cellen geïmplanteerd ter hoogte van de transsectie van het ruggenmerg, dit gaf net als de
OPC cellen een significante verbetering in de kliniek vastgesteld doormiddel van de BBB score.( BassoBeattie-Bresnahan score).
Men voerde het zelfde experiment ook uit maar met de simultane introductie van
OPC en MP cellen, hierbij werd opnieuw een positief resultaat geboekt, die nog beter was dan deze
vastgesteld bij de implantatie van enkel OPC of enkel MP cellen (55).
Er werd aangetoond dat hESC-gederiveerde OPC bij transplantatie in thoracale ruggenmergletsels resulteert
in pathotropisme, cel overleving en differentiatie, een betere remyelinisatie en een beter locomotorisch
functie zonder teratomavorming of andere negatieve effecten te veroorzaken. Ook werd de productie van
neurotrofe factoren en chemokines door OPC beschreven, die de neuronale overleving en de neuriet uitgroei
positief beïnvloeden. Wat opnieuw bevestigt dat hESc-OPC cellen via de myelinisatie van gedemyeliseerde
axonen en de productie van neurotrofe factoren hun effect uitvoeren. Een ander onderzoek onderzocht het
effect van h-ESc-OPC transplantatie in acute cervicale ruggenmergcontusies bij de muis. Men stelde
opnieuw een possitief resultaat vast waarbij de histologische vaststellingen zoals de hoeveelheid
overgebleven grijze stof en het aantal gespaarde motor neuronen correleerde met het functioneel resultaat.
Alhoewel de getransplanteerde OPC zich in de witte stof differentieerden in mature oligodendrocyten werd
er geen significant verschil in remyelinisatie waargenomen in vergelijking met de controlegroep. Maar in de
behandelde groep werden significant meer normaal gemyeliniseerde axonen, minder schwann cellen en
44
gedemyeliniseerde axonen geobserveerd. Wat suggereert dat in deze groep minder demyelinisatie optrad. Dit
zou kunnen geleid hebben tot minder substraat om te remyeliniseren, met als gevolg een gedaald aantal
geremyeliniseerde axonen in de behandelde groep. Dit vermoeden wordt versterkt door de vaststelling dat de
oligodendrocyt remyelinisatie efficiëntie groter is in de behandelde groep vergeleken met de controle groep.
De geïnduceerde pluripotente stamcellen zijn een waardevol alternatief als bron voor transplantatiecellen. Na
de differentiatie in neurosferen werd hun tumorgeniciteit onderzocht aan de hand van de injectie in nonobese
diabetic/severe combined immunodefiency (NOD/SCID) muizen, op deze mannier konden veilige niet
carcinogene iPSC populaties worden geselecteerd. Neurosferen gedifferentieerd uit deze iPSC zijn in staat
om in vitro te differentiëren naar elektrofysiologisch functionele astrocyten, oligodendrocyten en functionele
neuronen. Wanneer deze veilige neurosferen werden ingeplant negen dagen na een contusief
ruggenmergletsel, vertoonden ze het zelfde differentiatiepotentieel, zonder de vorming van teratoma’s of
andere tumoren. Daarnaast werkten ze mee aan de remyelinisatie en induceerden ze axonale groei in de gast
serotonerge vezels. Op deze mannier verbeterden ze het uiteindelijk functioneel locomotorisch resultaat (56).
iPSC en ES-cellen zijn dus mogelijke bronnen voor een regeneratieve behandeling van acute en subacute
ruggenmergletsels. Ze zijn beiden in staat om in de juiste neuronale cellen te differentiëren, in vivo te
overleven en te integreren en tot beter functioneel resultaat te leiden.
Recent ging het eerste ES-cel onderzoek bij de mens van start. Het bedrijf Geron ontwikkelde OPC cellen
gedifferentieerd uit de hES-cel H1 lijn. In preclinische studies bij dieren vertoonden deze cellen de capaciteit
om te migreren naar het letstel, te matureren in functionele oligodendrocyten die in staat zijn axonen te
remyelineren en neurotrofe factoren te stimuleren, wat resulteerde in een beter locomotorisch herstel
wanneer geïntroduceerd binnen 7 dagen na een experimenteel veroorzaakte ruggenmergcontusie. Na het
boeken van deze hoopvolle resultaten werden klinisch bruikbare protocollen geproduceerd, om klinisch
onderzoek bij de mens mogelijk te maken. De OPC geproduceerd op deze mannier werden onderworpen aan
verschillende testen. De OPC vormden geen teratoma’s binnen een jaar na injectie in proefdieren, er werd
geen significante acute of chronische toxiciteit vastgesteld, nog migratie buiten het zenuwstelsel. Wel werden
er in een klein percentage van de testdieren kleine cysten gedetecteerd, deze waren beperkt tot de plaats van
het letsel,kleiner dan het letsel zelf en veroorzaakten geen waarneembare negatieve consequenties voor de
dieren. De transplantatie van OPC cellen is net zoals andere allotransplantaties gecompliceerd door de
mogelijkheid van immuunafstoting. Daarom werden OPC geïncubeerd met serum of weefselstalen van
gezonde vrijwilligers, waarna OPC cel-lyse en T-cel proliferatie werd onderzocht. Dit om de humane
allogene antilichamen, T-cel en NK-cel respons te testen. Er werden geen majeure directe humorale of celgemedieerde immunologische reacties geobserveerd wat zich in het klinische protocol vertaalde in de
toediening van een korte termijn en lage dosis immunosupresiva (33).
De FDA goedgekeurde klinische studie is een fase-1- trail bedoeld om de veiligheid te testen, de “efficacy”
of de doeltreffendheid van de behandeling is slechts een secundair eindpunt. In de studie worden enkel
proefpersonen toegelaten met een recent AIS (American Spinal Injury Assosiation (ASIA) Imparment Scale)
graad A thoracaal ruggenmergletsel (neurologisch nivo: T3 tot T10). De graad A geeft aan dat er een
Marieken Vanden Broucke
Pagina
45
compleet verlies is van sensoriele en motorische activiteit onder het nivo van het ruggenmergletsel. Deze
groep patiënten vertonen geen of weinig functioneel herstel en vertonen geen significante respons op fysieke
therapie. Het studieprotocol stelt dat de administratie van de OPC cellen dient te gebeuren tussen de zevende
en de veertiende dag na het ontstaan van het letsel. Als immunosupresiva werd tacrolimus gekozen. Deze
wordt in een lage dosis toegediend vanaf het moment van de injectie, na 45 dagen start men met de afbouw
van de dosis zodat men na 60 dagen de medicatie kan stoppen. Gestandaardiseerd lichamelijk en
neurologisch onderzoek word uitgevoerd voor en na de injectie alsook op specifieke tijdstippen gedurende
één jaar na de injectie, om de veiligheid te scoren. De doeltreffendheid van de behandeling word aan de hand
van gelijkaardige testen onderzocht, waarbij men bewijs zoekt voor herstel van de sensorische en motorische
functie. De proefpersonen zullen in het totaal 15 jaar worden opgevolgd. Het is afwachten naar de resultaten
van dit onderzoek (33).
Discussie
Regeneratieve geneeskunde is een veelbelovend vakgebied. Men staat verder dan ik initieel gedacht had. De
eerste humane embryonale stamcel klinische trails zijn opgestart en verscheidene onderzoeken bij dieren
resulteerden in hoopvolle resultaten. Ook zijn er kweek en isolatie technieken beschikbaar die vrij zijn van
dierlijke producten en op een efficiënte wijze de proliferatie en zelfvernieuwing van humane pluripotente
stamcellen kunnen ondersteunen. Ze zijn echter nog niet toepasbaar op grootte schaal. De differentiatie van
cellen uit ES-cellen en iPSC in volledig gedifferentieerde functionele cellen staat nog niet op punt. Door het
vaak voorkomen van onvolledig gedifferentieerde cellen, is een uitgebreide controle en selectie nodig om het
risico op tumorvorming te minimaliseren. Er zijn echter al zuivere celpopulaties geproduceerd die bij
implantatie of injectie tot geen shadelijke gevolgen leiden, incorporeren in het doelorgaan en efficient hun
functie uitvoeren bij dieren. De meeste geproduceerde cellen bevinden zich in een onvolwassen stadium. De
impact van deze imaturiteit op de klinische bruikbaarheid van de cellen zal per pathologie en celtype
verschillen.
Patiënt specifieke pluripotente stamcellen kunnen op verscheidene mannieren worden geproduceerd. De
inductie van pluripotente stamcellen doormiddel van het inbrengen van transcriptiefactoren lijkt me de beste
keuze, alhoewel deze cellen recent bewezen dat ze toch kunnen leiden tot immuunrejectie. Dit zou mogelijks
worden opgelost door een optimalisatie van de productiemethode. De integratie van virale vectoren
beschreven in het initiële protocol bracht een risico op insertionele mutagenese met zich mee. Wat het
inherent risico van pluripotente stamcellen op carcinogenese nog vergroot. Er zijn echter technieken
ontwikkeld die niet integreren in het genoom, en door de toevoeging van kleine moleculen kan men de
efficiënte vergroten en iPSC produceren met introductie van minder factoren. Vooral de generatie van iPSC
zonder c-myc is hierbij van belang. Meer onderzoek zou er toe kunnen leiden dat pluripotentie kan
geinduceerd worden met het gebruik van enkel kleine moleculen. Dit zou de toepassing in de klinische
context vergemakkelijken.
Wanneer men ES-cellen en iPSC vergelijkt moet men bedacht zij op interfererende variabelen. In ieder geval
is er voor sommige iPS-cellen geen verschil waarneembaar in vergelijking met ES-cellen op gebied van
46
globale gen expressie, modificatie van de histone-tails, de X chromosoom inactivatie en het DNAmethylisatie profiel. ER werd een verschil vastgesteld in de expressie van de materneel geimprinte Dlk1Dio3 locus bij muizen iPSC. iPSC die deze abnormaliteit niet vertonen konden tetraploïde complementatie
levensvatbare muizen genereren, in tegenstelling tot de eerder vernoemde iPSC. Ook stelt men vast dat de
iPSC die nog niet veel passages hebben ondergaan een transiënt epigenetisch geheugen behouden van hun
oorsprongscel en dat deze het differentiatiepotentieel kan beïnvloeden.
Referentielijst
1.
Hochedlinger K, Plath K. Epigenetic reprogramming and induced pluripotency. Development. 2009
Feb;136(4):509-23.
2.
Lensch MW. Cellular reprogramming and pluripotency induction. Br Med Bull. 2009;90:19-35.
3.
Teo AK, Vallier L. Emerging use of stem cells in regenerative medicine. Biochem J. 2010 May
15;428(1):11-23.
4.
Ameen C, Strehl R, Bjorquist P, Lindahl A, Hyllner J, Sartipy P. Human embryonic stem cells:
current technologies and emerging industrial applications. Crit Rev Oncol Hematol. 2008 Jan;65(1):54-80.
5.
Lerou PH, Daley GQ. Therapeutic potential of embryonic stem cells. Blood Rev. 2005
Nov;19(6):321-31.
Marieken Vanden Broucke
Pagina
47
6.
Hyun I. The bioethics of stem cell research and therapy. J Clin Invest. 2010 Jan 4;120(1):71-5.
7.
Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult
fibroblast cultures by defined factors. Cell. 2006 Aug 25;126(4):663-76.
8.
Menendez P, Bueno C, Wang L. Human embryonic stem cells: A journey beyond cell replacement
therapies. Cytotherapy. 2006;8(6):530-41.
9.
Zhao T, Zhang ZN, Rong Z, Xu Y. Immunogenicity of induced pluripotent stem cells. Nature. 2011
Jun 9;474(7350):212-5.
10.
Jaenisch R, Young R. Stem cells, the molecular circuitry of pluripotency and nuclear reprogramming.
Cell. 2008 Feb 22;132(4):567-82.
11.
Larsen WJ. Human embryology. third ed. William Schmitt DO, Mary Reinwald, editor. Philadelphia:
Churchill Livingston; 2001.
12.
Hanna JH, Saha K, Jaenisch R. Pluripotency and cellular reprogramming: facts, hypotheses,
unresolved issues. Cell. 2010 Nov 12;143(4):508-25.
13.
Pinkhof geneeskundig woordenboek. 11 ed: Standaard uitgeverij; 2006. Pinkhof geneeskundig
woordenboek.
14.
Cedar SH, Cooke JA, Patel MR, Luo Z, Minger SL. The therapeutic potential of human embryonic
stem cells. Indian J Med Res. 2007 Jan;125(1):17-24.
15.
Okita K, Nakagawa M, Hyenjong H, Ichisaka T, Yamanaka S. Generation of mouse induced
pluripotent stem cells without viral vectors. Science. 2008 Nov 7;322(5903):949-53.
16.
Yamanaka S, Blau HM. Nuclear reprogramming to a pluripotent state by three approaches. Nature.
2010 Jun 10;465(7299):704-12.
17.
Yamanaka S. Strategies and new developments in the generation of patient-specific pluripotent stem
cells. Cell Stem Cell. 2007 Jun 7;1(1):39-49.
18.
Hemberger M, Dean W, Reik W. Epigenetic dynamics of stem cells and cell lineage commitment:
digging Waddington's canal. Nat Rev Mol Cell Biol. 2009 Aug;10(8):526-37.
19.
Stadtfeld M, Hochedlinger K. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. Genes
Dev. 2010 Oct 15;24(20):2239-63.
20.
Jang G, Kim MK, Lee BC. Current status and applications of somatic cell nuclear transfer in dogs.
Theriogenology. 2010 Nov;74(8):1311-20.
21.
Park J, Oh H, Hong S, Kim M, Kim G, Koo O, et al. Effective donor cell fusion conditions for
production of cloned dogs by somatic cell nuclear transfer. Theriogenology. 2011 Mar 1;75(4):777-82.
22.
Gomez MC, Pope CE, Dresser BL. Nuclear transfer in cats and its application. Theriogenology. 2006
Jul 1;66(1):72-81.
23.
Galli C, Lagutina I, Duchi R, Colleoni S, Lazzari G. Somatic cell nuclear transfer in horses. Reprod
Domest Anim. 2008 Jul;43 Suppl 2:331-7.
24.
Johnson AK, Clark-Price SC, Choi YH, Hartman DL, Hinrichs K. Physical and clinicopathologic
findings in foals derived by use of somatic cell nuclear transfer: 14 cases (2004-2008). J Am Vet Med Assoc.
2010 May 1;236(9):983-90.
48
25.
Couldrey C, Wells DN, Lee RS. DNA methylation patterns are appropriately established in the sperm
of bulls generated by somatic cell nuclear transfer. Cell Reprogram. 2011 Apr;13(2):171-7.
26.
Wang H, Zhang JX, Zhao MB, Zhang XL, Sun QY, Chen DY. Production and health assessment of
second-generation cloned Holstein cows derived by somatic cell nuclear transfer. Anim Reprod Sci. 2011
Jun;126(1-2):11-8.
27.
Wani NA, Wernery U, Hassan FA, Wernery R, Skidmore JA. Production of the first cloned camel by
somatic cell nuclear transfer. Biol Reprod. 2010 Feb;82(2):373-9.
28.
Noisa P, Parnpai R. Technical challenges in the derivation of human pluripotent cells. Stem Cells Int.
2011;2011:907961.
29.
Sohni A, Verfaillie CM. Multipotent adult progenitor cells. Best Pract Res Clin Haematol. 2011
Mar;24(1):3-11.
30.
Smith KP, Luong MX, Stein GS. Pluripotency: toward a gold standard for human ES and iPS cells. J
Cell Physiol. 2009 Jul;220(1):21-9.
31.
Higuchi A, Ling QD, Ko YA, Chang Y, Umezawa A. Biomaterials for the feeder-free culture of
human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Chem Rev. 2011 May 11;111(5):3021-35.
32.
Zhao HX, Li Y, Jin HF, Xie L, Liu C, Jiang F, et al. Rapid and efficient reprogramming of human
amnion-derived cells into pluripotency by three factors OCT4/SOX2/NANOG. Differentiation. 2010 SepOct;80(2-3):123-9.
33.
<81-totaal grnopc1-backgrounder.pdf>.
34.
Huang J, Wang F, Okuka M, Liu N, Ji G, Ye X, et al. Association of telomere length with authentic
pluripotency of ES/iPS cells. Cell Res. 2011 May;21(5):779-92.
35.
; Available from: http://www.stemcell.com/en/Products/Popular-Product-Lines/mTeSR-TeSR2.aspx.
36.
Rajala K, Lindroos B, Hussein SM, Lappalainen RS, Pekkanen-Mattila M, Inzunza J, et al. A defined
and xeno-free culture method enabling the establishment of clinical-grade human embryonic, induced
pluripotent and adipose stem cells. PLoS One. 2010;5(4):e10246.
37.
Azarin SM, Palecek SP. Development of Scalable Culture Systems for Human Embryonic Stem
Cells. Biochem Eng J. 2010 Feb 15;48(3):378.
38.
Robertson JA. Embryo stem cell research: ten years of controversy. J Law Med Ethics. 2010
Summer;38(2):191-203.
39.
Hug K. Sources of human embryos for stem cell research: ethical problems and their possible
solutions. Medicina (Kaunas). 2005;41(12):1002-10.
40.
Hyun I, Lindvall O, Ahrlund-Richter L, Cattaneo E, Cavazzana-Calvo M, Cossu G, et al. New
ISSCR guidelines underscore major principles for responsible translational stem cell research. Cell Stem
Cell. 2008 Dec 4;3(6):607-9.
41.
ISSCR Guidelines for the Clinical Translation of Stem Cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 2009
Apr;Appendix 1:Appendix 1B.
42.
Skottman H, Dilber MS, Hovatta O. The derivation of clinical-grade human embryonic stem cell
lines. FEBS Lett. 2006 May 22;580(12):2875-8.
Marieken Vanden Broucke
Pagina
49
43.
Unger C, Skottman H, Blomberg P, Dilber MS, Hovatta O. Good manufacturing practice and
clinical-grade human embryonic stem cell lines. Hum Mol Genet. 2008 Apr 15;17(R1):R48-53.
44.
Bergstrom R, Strom S, Holm F, Feki A, Hovatta O. Xeno-free culture of human pluripotent stem
cells. Methods Mol Biol. 2011;767:125-36.
45.
Takahashi K. Direct reprogramming 101. Dev Growth Differ. 2010 Apr;52(3):319-33.
46.
Deng W. Induced pluripotent stem cells: paths to new medicines. A catalyst for disease modelling,
drug discovery and regenerative therapy. EMBO Rep. 2010 Mar;11(3):161-5.
47.
Li M, Chen M, Han W, Fu X. How far are induced pluripotent stem cells from the clinic? Ageing Res
Rev. 2010 Jul;9(3):257-64.
48.
Sidhu KS. New approaches for the generation of induced pluripotent stem cells. Expert Opin Biol
Ther. 2011 May;11(5):569-79.
49.
Wu SM, Hochedlinger K. Harnessing the potential of induced pluripotent stem cells for regenerative
medicine. Nat Cell Biol. 2011 May;13(5):497-505.
50.
Anastasia L, Pelissero G, Venerando B, Tettamanti G. Cell reprogramming: expectations and
challenges for chemistry in stem cell biology and regenerative medicine. Cell Death Differ. 2010
Aug;17(8):1230-7.
51.
Nakagawa M, Koyanagi M, Tanabe K, Takahashi K, Ichisaka T, Aoi T, et al. Generation of induced
pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nat Biotechnol. 2008 Jan;26(1):1016.
52.
Kim K, Doi A, Wen B, Ng K, Zhao R, Cahan P, et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem
cells. Nature. 2010 Sep 16;467(7313):285-90.
53.
Sharp J, Frame J, Siegenthaler M, Nistor G, Keirstead HS. Human embryonic stem cell-derived
oligodendrocyte progenitor cell transplants improve recovery after cervical spinal cord injury. Stem Cells.
2010 Jan;28(1):152-63.
54.
Ronaghi M, Erceg S, Moreno-Manzano V, Stojkovic M. Challenges of stem cell therapy for spinal
cord injury: human embryonic stem cells, endogenous neural stem cells, or induced pluripotent stem cells?
Stem Cells. 2010 Jan;28(1):93-9.
55.
Erceg S, Ronaghi M, Oria M, Rosello MG, Arago MA, Lopez MG, et al. Transplanted
oligodendrocytes and motoneuron progenitors generated from human embryonic stem cells promote
locomotor recovery after spinal cord transection. Stem Cells. 2010 Sep;28(9):1541-9.
56.
Tsuji O, Miura K, Okada Y, Fujiyoshi K, Mukaino M, Nagoshi N, et al. Therapeutic potential of
appropriately evaluated safe-induced pluripotent stem cells for spinal cord injury. Proc Natl Acad Sci U S A.
2010 Jul 13;107(28):12704-9.
50