fluorescentie - Telenet Users

FLUORESCENTIE
1. Inleiding
In alle fotosynthetisch actieve organismen, speelt chlorophyl een actieve centrale rol in
de absorptie en fotochemische transformaie van licht energie. Absorptie van licht
(kwanta) geeft aanleiding tot de vorming van een aangeslagen chlorophyl molecule
dewelke terug naar de grondtoestand zal gaan via drie concurrerende processen. In een
verdunde oplossing is dit voor 65% via triplet vorming, 30% fluorescentie (in vivo zien
we echter dat de opbrengst van fluorescentie veel lager is dan eerder vermeld, slechts 3%
van het geabsorbeerde licht.) en 5% uitsrtaling van warmte. In het geval van fluorescentie
keert het aangeslagen elektron terug naar de grondtoestand met uitzending van een foton.
Fluorescentie kent verscheidene toepassingen, bijvoorbeeld in de fruitteelt (bepalen van
de rijpingsgraad), bij remote sensing onerzoek maar ook is het een belangrijke
stressindicator bij planten. De indicator functie van chlorofyl fluorescentie komt voort uit
het feit dat fluorescentie in verband staat met de andere processen die ontstaan bij het
terugvallen van een geëxciteerd elektron: warmte uitstraling en fotochemische processen.
In het algemeen, is de fluorescentie opbrengst het hoogst wanneer de relatieve bijdragen
van de twee andere processen het laagst zijn. Dus, zullen veranderingen in de
fluorescentie opbrengst, veranderingen in fotochemische efficiëntie weerspiegelen.
2. Doelstellingen
 De toepasbaarheid van chlorofyl a fluorescentie in ecofysiologisch onderzoek
illustreren. Met behulp van fluorescentie metingen de toestand van planten
achterhalen.
 Chlorofyl a fluorescentie in de praktijk leren meten en de bekomen resultaten
interpreteren met het oog op het gehele individu.
1
3. Materiaal en methoden
Twee meettoestellen werden gebruikt tijdens het practicum: PAM-2000 en PEA (Plant
Effiiency Analyzer). Met beide toestellen hebben we, op een groep van gestresseerde
planten (Begonia) en een controle groep, metingen gedaan. De metingen voerden we op
volgende manier uit:
1. Clips werden op de bladeren geplaatst die er nog het gezondst uitzagen. Ook werd
gezien dat we bij alle planten een blad gebruikte dat ongeveer gelijk was (een
homogeen groen blad).
2. Dan werden de planten in het donker geplaatst voor twintig minuten. (Voor
metingen met de PEA werd dit niet gedaan omdat genoeg donkeradptatie clips
voor handen waren.)
3. Op de donkergeadapteerde planten werden dan de metingen gedaan met de PAM2000 en de PEA
4. De bekomen waarden werden voor de PEA in excell gezet via biolyzer, de files
van de PAM-2000 werden rechtstreeks geïmporteerd in excell.
Voor de vergelijking van de controle groep en de gestresseerde groep planten, hebben we
het gemiddelde van de 5 laatst gemeten waarden genomen (met middelbare fout). Zo
werd grafische vergelijking van de twee behandelingen eenvoudiger.
Verder hebben we met de PEA nog enkele andere experimenten gedaan, om het effect
van donkeradaptatietijd en lichtintensiteit op de fluorescentie na te gaan. Deze metingen
hebben we buiten in het daglicht op klimop (Hedera helix) uitgevoerd.
4. Resultaten
Met in het achterhoofd wetende dat in gestresseerde planten het fotosynthese proces
minder efficiënt zal verlopen en het feit dat we via het meten van fluorescentie
parameters een beeld kunnen krijgen van de staat van het fotosyntheseaparaat zijn we van
start gegaan met het meten.
2
PAM-2000
Onderstaande tabel geeft gemiddelde waarden van alle metingen, voor de controle groep
en de planten die onder stresseerende omstandigheden werden gehouden samen met de
middelbare fout op deze berekende waarden.
Een grafische weergave van de berekende parameters bleek het overzichtelijkst ter
vergelijking van de twee behandelingen.
Controle groep
MF
Yield
0.25
0.09
qP
0.37
0.13
qN
0.34
0.13
Fv/Fm
0.76
0.03
Stress groep
MF
0.12
0.03
0.18
0.05
0.30
0.10
0.71
0.07
Quenching coëfficiënten
Quenching bundelt al de processen die de fluorescentieopbrengst verlagen onder het
minimum, m.a.w. fluorescentie doen uitdoven. Quenching kan opgesplitst worden in
fotochemische- (qP) en niet-fotochemische quenching (qN). Fotochemische quenching is
gerelateerd aan de proportie excitatie-energie die gevangen wordt door open reactiecentra
en omgezet wordt in chemische energie. Niet-fotochemische quenching zijn alle
processen die geabsorbeerde energie wegdissiperen (bv. als warmte) om schade te
voorkomen (teveel instraling kan tot schade leiden).
0.600
0.500
0.400
0.300
0.200
0.100
0.000
qP
qN
Controle
Stress
3
Beide soorten van quenching waren voor de planten in de controle groep groter dan voor
de gestresseerde planten. Dit is al een aanwijzing dat de niet gestresseerde planten
efficiënter functioneren.
Fotochemische efficiëntie
Een ratio die ons meer kan vertellen over de toestand van de plant is Fv/Fm, de maximale
fotochemische efficiëntie van fotosysteem II (PSII). Deze is op empirische basis lineair
gekoppeld aan de fotosynthetische kwantumopbrengst (yield). Uit onderzoek blijkt dat in
gezonde vaatplanten deze verhouding dicht bij 0,80 ligt, een lagere waarde kan een
indicatie zijn dat een deel van de PSII reactiecentra beschadigd zijn. Dit fenomeen wordt
foto-inhibitie genoemd en komt vaak voor bij planten onder stress.
0.900
0.800
0.700
0.600
0.500
0.400
0.300
0.200
0.100
0.000
Fv/Fm
Yield
Controle
Stress
We zien dat voor beide groepen de Fv/Fm ratio onder 0,8 ligt, wat een aanwijzing is dat
niet alleen de ‘gestresseerde groep’ een vorm van stress heeft ondervonden. Door al onze
handelingen zijn de planten van de ‘controle groep’ ook niet gespaard gebleven van stress
waardoor de waarde voor Fv/Fm onder 0,8 ligt. Als we naar de fotosynthese opbrengst
4
kijken zien we wel dat de controle groep meer energie heeft gebruikt voor de chemische
omzettingsprocessen. En dus over een efficiënter FSII beschikt.
PEA
Ook uit de gemeten waarden van de PEA hebben we Fv/Fm berekend, zoals te zien is in
het onderstaande blokdiagram. Meest opvallend is het feit dat bij dit meettoestel er een
enorme overlap is tussen de beide waarden. We kunnen dus besluiten dat voor de
bepaling van Fv/Fm de nauwkeurigheid van de PAM groter is dan deze van de PEA.
Als we de keuze hebben nemen we dus best de PAM om metingen uit te voeren, deze
keuze hebben we echter niet altijd. Als metingen op het veld moeten uitgevoerd worden
dan zijn we bijna genoodzaakt om met de PEA te meten om de simpele reden dat deze
‘draagbaar’ is en de PAM niet.
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
Fv/Fm
Controle
Stress
5
Kautsky curve
Voor curve zie bijlage.
Een
kautsky
curve
is
de
fluorescentieinductiecurve
bij
belichting
van
een
donkergeadapteerd blad. Deze curve vertoont een snelle initiële fase gevolgd door een
trage fase. De curve die we hier zullen beschrijven komt overeen met de snelle kinetiek.
Door donkeradaptatie is een toestand gecreëerd waarin alle reactiecentra open zijn, alle
QA (Quinon A) bevinden zich in geoxideerde vorm. Bij belichting is er eerst een stijging
van de fluorescentie naar een minimaal niveau (O=F0), als het licht voldoende sterk is zal
de fluorescentie tot een maximaal niveau (P=Fm) stijgen. In P zijn alle rectiecentra
gesloten (quinon (QA en QB) poel is volledig greduceerd), er wordt geen excitatie-energie
meer weggevangen door fotochemische processen. De stijging tot P verloopt over twee
dalletjes in de curve. De eerste daling van fluorescentie is het gevolg van het wegvangen
van de excitatie-energie door de geoxideerde Quinon A (QA) poel. Na enige tijd zal deze
volledig gereduceerd zijn waardoor terug een stijging van het fluorescentiesignaal zal
optreden tot het tweede inflectiepunt. Deze daling in de curve weerspiegelt de overdracht
van elektronen van QA naar QB. Hierdoor is terug meer geoxideerd QA, meer excitatieenergie wordt weggevangen voor fotochemische reacties en er gaat minder verloren als
fluorescentie. Na dit dipje zal het fluorescentiesignaal voort stijgen tot het maximale
niveau.
Donkeradaptatieproef en bepaling van de verzadigingsintensiteit
Voor een goede bepaling van de boven gebruikte fluorescentie parameters moet aan
enkele
voorwaarden
voldaan
zijn.
Het
blad
waarop
gemeten
word
moet
donkergeadapteerd zijn voor de bepaling van de maximale fotochemische efficiëntie van
FSII. Donkeradaptatie is vereist omdat dan alle QA volledig geoxideerd is en alle nietfotochemische quenching processen gerelaxeerd zijn. (Bij donkeradaptatie is qp = 1 en qn
= 0). Tevens moet met een saturerende lichtintensiteit gewerkt worden om nauwkeurige
metingen te kunnen doen. Bij onderstaande experimentjes hebben we geprobeerd om de
donkeradaptatietijd en verzadigende lichtintensiteit voor klimop te bepalen.
6
Donkeradaptatieproef
t (min)
0.5
1
5
10
15
20
Fv/Fm
0.60
0.66
0.54
0.62
0.60
0.54
0.7
0.6
Fv/Fm
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0
5
10
15
20
25
Donkeradaptatietijd (min)
Metingen werden uitgevoerd bij een lichtintensiteit van 2400 micromol m-2 s-1. In de
grafiek zien we geen duidelijke stijging noch daling, wat betekent dat reeds na een halve
minuut het klimop blad donkergeadapteerd is, dit was zeker niet verwacht. Wat we
eigenlijk (intuïtief) verwacht hadden, is een stijging van Fv/Fm beginnende van een
waarde die veel lager ligt dan de gemeten waarden en eindigend bij een waarde voor
Fv/Fm rond 0,8.
Een oorzaak voor het feit dat Fv/Fm slechts rond 0,6 ligt, zou kunnen zijn dat bij koude
(toen wij onze metingen hebben uitgevoerd was het lichtjes aan het sneeuwen) er een
toename is van fluorescentie afkomstig van FSI. De verklaring van de lagere waarde is
dat Fv/Fm voor FSI slechts rond 0,3 ligt, een waarde voor Fv/Fm rekening houdend met
beide soorten fluorescentie zal dus lager dan 0,8 liggen
7
Bepaling van de verzadigingsintensiteit
0.9
0.8
0.7
Fv/Fm
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
Lichtintensiteit (micromol -2
ms-
De grafiek toont aan dat voor een klimop blad buiten, een lichtintensiteit van 300 mol
m-2s-1 voldoende is om het blad te verzadigen, m.a.w. om alle reactiecentra te sluiten. Als
we waren beginnen meten bij een lagere intensiteit, dan hadden we een stijgende curve
gekregen die zal afvlakken rond 0,8 en daarrond constant blijven.
De variatie die we zien in de waarde van Fv/Fm, kunnen we verklaren doordat we niet
elke meting op hetzelfde blad hebben gedaan (blad heterogeniteit).
5. Discussie
Metingen met de PEA tonen geen direct verschil aan tussen de twee groepen planten, er
is geen significant verschil in maximale fotochemische efficiëntie (Fv/Fm).
Als we naar de parameters kijken die we met de PAM-2000 (qn, qp, Fv/Fm,, fotosynthese
opbrengst) hebben gemeten, kunnen we al met een grotere zekerheid zeggen dat we met
twee niet gelijke groepen planten zijn begonnen. De maximale fotochemische efficiëntie
die berekend werd door de PAM geeft echter geen groot verschil tussen beide groepen.
De yield (fotosynthese opbrengst) en daarmee samenhangend de fotochemische
quenching (qp) tonen aan dat, de planten die niet onder stresseerende omstandigheden
hebben moeten leven meer excitatie-energie gerbuiken voor omzetting naar chemische
enrgie. Stress leid vaak tot een minder goed functioneren van het fotosynthetisch aparaat,
waardoor minder energie wordt weggevangen voor fotochemische reacties. De energie
die niet naar het fotosyntheseproces gaat zal uitgezonden worden als fluorescentie of
warmte. Als we het anders bekijken, er zal minder fluorescntie zijn bij planten die niet
8
gestresseerd zijn doordat ze meer excitatie-energie gerbuiken in de fotochemische
reacties. Er is een grotere fotochemische quenching bij niet gestresseerde planten.
Hierdoor is ineens het verschil in qp verklaart tussen de twee groepen.
Maar waarom is er meer qn (niet-fotochemische quenching) bij planten die niet
gestresseerd zijn? Intuïtief zouden we verwachten dat er minder qn zou zijn als er meer qp
is, maar is dit wel juist geredeneerd? Kunnen we qp en qn zomaar optellen en ervan
uitgaan dat deze som 1 is? Onze metingen tonen aan dat deze assumptie niet zomaar
aangenomen kan worden. Een verklaring hiervoor zou kunnen zijn dat planten die niet
gestresseerd zijn betere regulatiemechanismen hebben tegen beschadiging van FSII door
overtollige energie. De planten zullen ten eerste meer energie gebruiken voor
fotosynthese en zullen daarnaast ook meer alles warmte uitstralen zodat kans op
beschadiging van de fotosystemen beperkt blijft. Niet gestresseerde planten gaan
efficiënter om met (overtollige) excitatie-energie.
9