Praktische richtlijnen bji aanvraag typering RBC

PRAKTISCHE RICHTLIJNEN BIJ AANVRAAG TYPERING RBC MEMBRAANANTIGENEN
(dmv SEROLOGIE - MOLECULAIRE BEPALING)

AANVRAAGFORMULIER immunohematologie:
o Vermeld op de aanvraag: aanvraagpad bepaling membraanantigenen
o Geef steeds de volgende informatie :
 Aan of afwezigheid van recente transfusie
 Aan of afwezigheid van auto-antistoffen : stuur steeds een kopij van
uw resultaten mee

STAAL:
o Volwassenen : 2 EDTA complet buis 13*75 (min 2,5 ml) (max 7 d oud)
o Neonati : 1 EDTA

INDICATIE/POPULATIE:
o Chronische transfusienood bij patiënten met auto-antistoffen (moleculaire
bepaling)
o Congenitale
hemolytische
aandoeningen/
hemoglobinopathieën
(sikkelcelanemie /thalassemie) : serologische of moleculaire bepaling (ifv
recente transfusie*)
o Aplastische anemie : serologisch of moleculair (ifv recente transfusie*)
o Allo-antistoffen :
 ter preventie van allo-immunisatie
 igv corresponderend antigeen bij patiënt positief is (onderscheid auto
versus allo-antistoffen): serologisch en moleculaire bepaling
* igv recente transfusie/aanwezigheid van auto-antistoffen wordt steeds een
moleculaire bepaling uitgevoerd; vermits serologische bepaling onafdoende is.
Hiervoor wordt best behandelende arts gecontacteerd cfr. infra.

RAPPORTERING:
o Serologisch
o Moleculair (indien vereist) : steeds SSO, soms SSP (enkel in urgentie). Hierbij
worden steeds alle membraanantigenen van het gehele panel ingezet en
geantwoord cfr. schema in bijlage.
o Conclusieresultaat en transfusieadvies
Typering van RBC membraanantigenen
serologische en moleculaire technieken.
voor
patiënten
dmv
Inleiding
Naast het ABO systeem zijn Rh, Kell, Duffy, Kidd en MNS de klinisch meest belangrijke
bloedgroepsystemen in de dagelijkse bloedtransfusiepraktijk. Antistoffen tegen deze
bloedgroepantigenen kunnen ernstige hemolytische transfusiereacties veroorzaken alsook
hemolytische ziekte van de pasgeborene.
De volgende membraanantigenen (CcEe/ Kk/Fya,Fyb/ Jka,Jkb/ MNSs ) behoren tot de
reeks en de bepaling van deze bloedgroepantigenen is aangewezen bij:
Aanwezigheid van onregelmatige antistoffen
Deze controle is de bevestiging of de gevonden allo-antistof wel degelijk aanwezig is.
Patiënten kunnen enkel allo-antistoffen maken als ze het corresponderende antigeen niet
hebben (tenzij het een auto-antistof betreft).
In de meeste gevallen kan dit bevestigd worden dmv serologische technieken ahv
specifieke antisera.
In uitzonderlijke gevallen kan een moleculaire techniek aangewezen zijn bij
probleemtyperingen om het onderscheid te maken tussen allo- en autoantistoffen (vb.
auto-anti-e, auto-anti-C).
In geval van aanwezigheid van klinisch belangrijke allo-antistoffen verdient het
aanbeveling om preventief resusfenotype en K compatibele erytrocyten toe te dienen ter
preventie van verdere allo-immunisatie (daling met 71 %). Bijkomend toevoegen van Fya,
Jkb en S vermindert de antistofvorming met 93 %.
Chronische anemie oa hemoglobinopathieën die veelvuldige transfusies vergt
In deze gevallen wordt er bij de selectie van het bloed (in de mate van het mogelijke)
feno-compatibel bloed aan de patiënt toegediend ter preventie van allo-antistoffen.
In geval van transfusiedependente sikkelcelanemie of thalassemie vermelden de richtlijnen
om steeds resus compatibel (D, C, c, E, e) en K negatief bloed te geven, en indien
mogelijk ook met de andere bloedgroepsystemen (bv. Duffy, Kidd, Ss) in volgorde van
belang rekening te houden.
In deze gevallen wordt er bij voorkeur een moleculaire typering uitgevoerd van de
membraanantigenen, omdat er op deze manier geen interferentie is met eventuele
recente transfusies.
Een serologische typering is enkel betrouwbaar igv er geen recente bloedtransfusie heeft
plaatsgevonden.
Auto-immuunhemolytische anemie (AIHA)
Bij patiënten met AIHA is de interpretatie van de kruisproef vaak moeilijk tgv interferentie
door de aanwezige auto-antistoffen en kunnen onderliggende alloantistoffen moeilijk
uitgesloten worden (tenzij speciale technieken zoals allo-absorptie worden toegepast).
In dergelijke gevallen worden er bij voorkeur bloedeenheden geselecteerd die zoveel
mogelijk feno-compatibel zijn met het bloed (membraanantigenen) van de patiënt ter
preventie van allo-immunisatie. Om deze reden is het aangewezen om bij een nieuwe
diagnose van AIHA, die transfusiedependent is, de patiënt moleculair te typeren voor de
erytrocytenantigenen (genotypering) zodat bij latere dringende transfusies, snel fenocompatibel bloed kan geselecteerd worden.
Strategie
De Dienst voor het bloed is gestart met de moleculaire typeringen van de
membraanantigenen in 2006; waarbij er ondertussen een grote expertise is opgebouwd. Bij
deze strategie wordt een moleculaire typering uitgevoerd voor specifieke indicaties
waarbij een veilig transfusiebeleid beoogd wordt dmv het afleveren van feno-compatibel
bloed. Dit leidt tot een verhoogde veiligheid van transfusie bij incompatibele kruisproeven
alsook tot preventie van bijkomende allo-immunisatie.
Momenteel worden deze testen niet aangerekend en is er geen terugbetaling door het
RIZIV. Omwille van het groot aantal testen, alsook de kostelijke reagentia en specifieke
infrastuctuurvereisten voor moleculaire biologie is deze strategie niet langer houdbaar
voor de Dienst voor het bloed en zullen deze moleculaire testen vanaf heden aangerekend
worden aan de laboratoria in onderaanneming.
Inmiddels is de aanvraag voor terugbetaling van deze membraanantigenen dmv moleculaire
bepaling ingediend bij het RIZIV in januari 2013 door de werkgroep nomenclatuur klinische
biologie; waarbij ook de indicaties voor terugbetaling zijn gedefinieerd.
Bij deze strategie wordt de bepaling van moleculaire testen uitgevoerd conform de
aanbevolen indicaties zoals vermeld in de internationale richtlijnen (BCSH 2012, CBO
richtlijn 2011).
1. Indicaties

Chronische transfusienood bij patiënten met auto-antistoffen

Congenitale
hemolytische
sikkelcelanemie en thalassemie

Aplastische anemie

Allo-antistoffen na transfusie (oa voor probleemgevallen om onderscheid tussen
auto versus allo-antistof te bepalen; alsook ter preventie van allo-immunisatie)
aandoeningen/hemoglobinopathieën
zoals
2. Vereist monster

Volwassenen: 2 EDTA complet buis van 13mm*75mm (serologische bepaling: 1
EDTA, moleculaire bepaling:1 EDTA)
 Neonati: 1 EDTA
Max . 7 dagen oud
3. Verloop van de test en testprincipe
De stalen worden steeds opgestuurd naar de laboratoria immunohematologie van DvB waar
het ziekenhuis mee samenwerkt.

Serologische bepaling
In bepaalde gevallen kan er eerst een serologische bepaling uitgevoerd worden. Bij
de opsporing van andere RBC antigenen/membraanantigenen moet een onderscheid
gemaakt worden tussen RBC antigenen die kunnen opgespoord worden dmv:
o Directe methode : dit gebeurt door de cellen van de patiënt in contact te
brengen met monoklonale IgM-reagentia (vb. antigenen van K, S, Jka/Jkb….
). In dit geval is er geen interferentie met de bepaling igv een positieve
directe antiglobulinetest; wat voorkomt bij patiënten met auto-antistoffen.
o Indirecte methode : dit gebeurt door de cellen van de patiënt in contact te
brengen met polyclonale IgG reagentia (vb. antigenen van Duffy systeem, s
antigeen…). Deze bepaling dmv de indirecte methode is vals positief in
aanwezigheid van een positieve directe antiglobulinetest (+DAT) en kan in
deze gevallen niet uitgevoerd worden.
Indien de serologische typering geen problemen geeft, wordt enkel de serologie
uitgevoerd en aangerekend in onderaanneming via de RIZIV nomenclatuur.

Moleculaire bepaling
De moleculaire bepaling van deze membraanantigenen zijn gebaseerd op het
polymorfisme van deze bloedgroepen op basis van één nucleotide : SNP (Single
Nucleotide Polymorphisms). Dit betekent dat één nucleotide verschil in het gen
bepaalt welk bloedgroepantigeen op de erytrocyt tot expressie komt. Voor de
detectie van deze SNP zijn eenvoudige PCR’s ontwikkeld zoals de SSP (Sequentie
Specifieke Primers) waarbij primers gebruikt worden die specifiek zijn voor het de
te detecteren nucleotide van SNP. In urgente gevallen wordt de SSP uitgevoerd.
In de routine wordt steeds een SSO uitgevoerd (Sequentie Specifieke
Oligonucleotide probe) dmv het Luminextoestel . In het Kell systeem worden
bijkomende typeringen uitgevoerd voor de volgende membraanantigenen : Kpa,
Kpb, Kpc, Jsa en Jsb en deze worden tevens gerapporteerd. Ook worden bij de SSO
methode bijkomende SNP’s opgespoord vb. GATA-box in het Duffy systeem.
In geval er sprake is van een recente transfusie of de uitgevoerde testen wijzen op
een recente transfusie vb. dubbele populatie is een een moleculaire typering
aangewezen om interferentie bij de typering met de donorerytrocyten te vermijden
(waarbij de serologische testen onafdoende zijn).
Een moleculaire typering wordt ook uitgevoerd indien er auto-antistoffen
aanwezig zijn zoals bij AIHA aangezien de autoantistoffen kunnen leiden tot een
vals positief resultaat cfr. bepaling membraanantigenen dmv indirecte methode .

Het conclusieresultaat: indien er zowel een serologische als moleculaire bepaling
wordt uitgevoerd gebeurt er steeds een verificatie tussen beide resultaten en wordt
een conclusieresultaat : conclusie fenotype gerapporteerd.
Bij de moleculaire bepaling in urgentie gebeurt ook steeds een verificatie tussen
SSP en SSO resultaten en wordt tevens een conclusie fenotype gerapporteerd.
In geval van discordanties wordt er een bijhorend commentaar en transfusieadvies
geformuleerd : vb. bij een mutatie thv het FYB allel ter hoogte van de GATA-box.
Hierbij is het Fyb antigeen niet aantoonbaar op de rode bloedcellen maar komt wel
thv weefsels tot expressie; waarbij het transfusieadvies Fyb positief is.
Het bijhorende rapport met de resultaten wordt steeds verstuurd vanuit het
laboratorium immunohematologie van de Dienst voor het Bloed.
4. Testlimitaties
 Serologische bepaling membraanantigenen:
Deze test is enkel betrouwbaar igv geen recente transfusie de laatste 3 maanden
heeft plaatsgevonden en indien de rechtstreekse antiglobulinetest (DAT) van de
patiënt negatief is.
 Moleculaire bepaling membraanantigenen:
o Deze techniek kan niet gebruikt worden voor patiënten die gedurende de
laatste maand lymfocyten of granulocyten transfusies ondergingen.
o Bij stamceltransplantpatiënten worden in FAZE I (voor de transplantatie) de
patiënt-eigen antigenen getypeerd. In FAZE II (na de transplantatie tot de
omschakeling van de bloedgroep) is geen moleculaire typering mogelijk. In
FAZE III (na de bloedgroep omschakeling) worden de donor specifieke
antigenen getypeerd.
o Het Knull (freq. 0,007% van de kaukasische bevolking) en Jknull(zeer
zeldzaam bij de meeste bevolkingsgroepen; tot 0,27% bij Polynesiërs)
fenotype wordt met deze PCR-test foutief als K+ en Jk+ getypeerd.
Literatuur
1. BCSH 2012, Guidelines for pre-transfusion compatibility procedures in blood
transfusion laboratories.
2. CBO richtlijn, Richtlijn Bloedtransfusie 2011
3. Transfusion, 2010 Vol 50 K.E. King, Transfusion management of patients with sickle
cell disease: the continuing dilemma.
4. Transfusion, 2011 Vol 51 D.P. Blackall How do I approach patients with warmreactive autoantibodies?
5. BJH,
2012 S.T.Chou, Challenges of alloimmunization in patients with
heaemoglobinopathies.