DE BEREIDING VAN VITAMINE B2 ( RIBOFIAVINE )

I
A. H. Besier
Klaverstraat 16
, s - Gravenhage
'
FABRIEKSSCHEIVIA
OVER
DE BEREIDING VAN VITAMINE B2 ( RIBOFIAVINE )
- - - - - - - - . _- - - - - _.
-1-
I. Inleiding
Reeds aan het eind van de 1g e eeuw werd melding gemaakt van de isolering
van een gele kleurstof uit melk.(1) Een zelfde stof werd gevonden in
eiwit, lever, nier, urine, spierweefsel, gist en zekere plantenmaterlalen.
(2). De stof bleek bestendig te zijn tegen hitte. De onderzoekers
P Kuhn, G.GyErgy en T.Wagner-Jauregg toonden aan dat de uit eiwit geisoleerde stof bij voeding aan ratten met een hoeveelheid van 10~g/dag
een grmei veroorzaakten van 10 g/week.
Later ging men verwantschap veronderstellen tussen dit pigment en het
gele ademhalingsferment van Warburg, (3) , een enzym met een oxydatiereductie systeem, dat voor de waterstofoverdraging in het lichaam zorg
draagt. Dit ferment bleek aanwezig te zijn in alle levende cellen.
Het kristallijne product bestaat uit lange oranje-gele naalden • Ze
zijn stabiel wanneer ze beschermd worden tegen de invloed van het licht
Licht veroorzaakt een langzame inactivering. In oplossing is het product niet stabiel. Beinvloeding treedt op van licht, temperatuur en
PH ( alkalisch milieu bevordert de ontleding). Het product is oplosbaar
in water, matig in alc9hOI. De waterige oplossing is geel-groen van
k~eur en fluoresceert sterk.
is in het ademhalingsferment
Het riboflavine met formule:
aanwezig als phosphorzure ester
CH
, 2 0H
gebonden aan eiwit:
HOCH
,
, OH
HeeR
t
CH -o-p '._-- 0
,2
"
HOOR
,
Hö6H
OH
H HCH
,
HOCR
,
/
H
HOÇH
f
HCH
eiwit
Groeiproeven werden eveneens
genomen met stoffen die zeer
verwant zijn met riboflavine, maar geen van allen gaven een activiteit
als het vitamine zelf. Onderzocht werden stoffen waarvan de riboserest
van het flavihe vervangen waren door suikerresten en verder de stoffen:
' ,.
-2-
7 Me-9-(d,l ' ribityl)-isoalloxazine
6 Me-9-(d,l' ribityl)-isoalloxazine
6 Et-7 Me -9-(d,l' ribityl)-isoalloxazine
(De systematische naam van riboflavine is 6,7
isoalloxazine }.
di-Me-9-(d.l'ribit~l)
11. Bereiding van vitamine B2
Na vele pogingen slaagden tegelijkertijd de o~derzoekers Kuhn en
Karrer er in het riboflavine synthetisch te bereiden. (4,5,6). Als
een van de producten nodig voor de synthese moet genoemd worden het
ribose, dat eerst zelf gesynthetiseerd moet worden.
H OH
H
Br
"" C
COOR
t
RÇOH
HOOH
t
HOOR
f
HO OH
t
CH 2 0H
D-.gluconzuur
HOC~
>
HCJOH
He)
0
j
t
CH20H
D-arabinose
,,/
ç~
__~
ACO~H
HOOAc
,
0 ~
H~ ~
CH ~
~H
H~OH
I
0~
mJ __-J
CH 2 0Ac
AcetobroomD-arabinose
D....arabinal
CH"NH
, c- 2
HOOE
f
_---"~
....~ HOOH
t
HO, OH
OH OH
D-rib~mine
Het ribamine laat men reageren met 1,2 di Me, 4,5 dinitro benzeen. Uit
het reactieproduct wordt door reductie 2-amino-4,5 qiMe-plienylD-ribamine gemaakt.
Koppeling van dit laatste produciAgeeft vorming van riboflavine.
(rllet- ah oxan)
-3-
I
I.
..
De moeilijkheid bij al deze methoden is het gebruik van ribose als uitgangsproduct. Dit moet zelf worden gesynthetiseerd. Er zijn ook wel enkele
processen ontwikkeld, waarbij geen ribose nodig is. Ze verlopen alle over
vele trappen en geven een laag rendement.
Vandaar dat men dus voor de vervaardiging van riboflavine is gaan zoeken
naar een biologisch proces .
Zeer veel microorganismen blijken in staat het vitamine te synthetisgre~,
zoals gisten, schimme~ls en bacterien (zie de tabel op de bladzijden)Ys'
en 4 van dit verslag). De prOductie ~an de meeste microben is echter te
laag om een bereiding van het vitamine langs deze weg lonend te maken.
In de industrie wordt gebruik gemaakt van twee soorten schimmels nl.
Eremothecium ashbyii en Ashbya gossyppii, die beiden een goede opbrengst
geven. Van Eremothecium ashbyii wordt zelfs in de litt. (7) een productie
genoemd van 2480 ÓIml in 7 dagen. Vandaar dan ook dat dit organisme
werd gekozen voor het schema.
111. ractoren, die de productie van het B2 beinvloeden
Bij de prOductie van vitamine B2 met behulp van de schimmel Eremothecium
ashbyii heeft men met vele factoren rekening te houden, van invloed op
de grootte van de productie. Deze zijn:
I·
l a
A. ~~_g~~1!~~~!~y~_~~_~~~~!~~~!~y~_~~~~~~!!!~g_y~_g~~_~~~!~~
In de media is nodig een geschikte koolhydraat, een stikstofverbinding,
zouten en eventueel bijzondere bestanddelen.
1~ Als koolhydraat werd in het begin genomen glucose of verstijfseld
zetmeel. Later zijn deze door goedkopere prOducten vervangen
zoals cerelose en melasse. Deze laatste stof bevat nog een groot
gehalte aan vergistbare suiker (50%) en nog wat zouten.
2. Voor eiwitvoeding eN) nam men in het begin gewoon eiwit en / of
aminozuren,bv: pepton, gistextract, bouillon, asparagine, glycine.
Ook deze producten zijn later door goedkopere vervangen, nl. door:
Corn Steep Liquor, een aftreksel van maisafval (zemelen,stofmeel )
met een hoog gehllte aan aminozuren en zouten (8)
Animal Stick Liquor, een afvalproduct van de slachthuizen.
De afval
.
wordt gekookt, het kooksel gefiltreedd en ingedikt.
Distiller's stillage,
. het residu dat men krijgt na het afdestilleren van de alcohol en waaruit de vaste stof is afgefiltreerd.
·................
·............ .. ....
·................. .
]
icum
WR
verstijfse
(11 )
]
~raan
(11 )
I
4"
)
(12)
Ik
(13)
10
llIll srne
SUCrose
zo
1
6
n
(14)
4
en
(15)
en
b
(15)
i
(17)
8
7
+
• • I. = Corn
(1
1 )
2.
2.
I
Lf'\
(
5
1.
I
1
n
9
à 7
1
]
(2
)
(
5
)
7
)
s
(
)
(25)
g)
3 à 4
]4
)
(
)
-6-
2.:. De zouten kunnen apart worden toegevoegd. Bij gebruik echter van
'
C.S.L. en andere afvalstoffen is dit niet nodig.
4. Toevoeging van bijzondere bestanddelen kunnen de opbrengst zeer
vergroten. Te vermelden zijn o.a. biotine (28) en inositol (27).
B. De sterilisatie van het medium
------------------------------
•
Lang verhitten van het medium bij sterilisatie heeft een ongunstige invloeë
op de B2 productie (8) :
methode van sterilisatie
1I
batch ster.
",/ batch ster.
continue ster.
."y'
tempgratuur
in F
250 00
250 0
275
duur ster.
in min.
45
25
5
opbrengst in!
mg/L
5
88
408
Het beste is een zg ttflash tl sterilisatie, dwz een sterilisatie op hoge
temperatuur en gedurende korte tijd. Toch is goede sterilisatie noodzake"Djk daar Eremothecium ashbyii zeer gevmelig is voor infectie • Bovendien
loopt bij infectie de productie van B2 sterk achteruit. Bij de nflash"
\/ sterilisatie wordt gebruik @Smaakt van de continue sterilisatie, die
I gunstiger resultat\ln oplevert dan de "batchn-sterilisatie.
Q.:. Q~_~~~E~E~~~_Y~_~~~_~~~!~
Voor de gisting is een hele serie van temperat~en geprobeerd; de beste
opbrengst werd verkregen bij een tempeDatuur van 28 0 C. (23,29,30). Met
behulp van een watermantel moet de temperatuur gedurende de gistingstijd
constant hierop gehouden worden.
D. De aeratie en het roeren
Een zeer sterke aeratie is nodig voor een gunstige B2 opbrengst, nl van
1/4 m3 lucht / m3 vloeistof / minuut. Hierdoor wordt tevens een goede
roering van de ketelinhoud verkregen.
~!_~~_E~_!~_~~~_~~~~~~
De PH voor de sterilisatie van het medium bedraagt 4.5. Dit gaf goede
resultaten. Voor de gisting wordt daarna de PH gebracht op 6.0. Deze
laatste PH wordt de hele duur van de gisting zo gehouden. Dit gebeurt ~
door van tijd tot tijd wat loog toe te voegen. (8,23).
Uit al deze gegevens werd het volgende gehaald voor het s:chema:
1. Gebr$t wordt de schimmel Eremothecium ashbyii
2. Als medium wordt genomen 2.5% melasse(waarin 50% droge stof)
2.5% C.S.L. (met 5ryfo droge stof)
1.5% A.S.L.
-73. Continue sterilisatie gebeurt gedurende 5 minuten op 275 0 C.
4. De temperatuur wordt gedurende de gisting constant gehouden op 28 0 C.
5. Een goede aeratie
Voor het · schema werd aangenomen een B2 prmductie van 1800 mg/L, een
opbrengst die door verschillende auteurs opgegeven werd en die toch niet
de hoogste waarde is die in de litt. gevonden werdt.
IV. BesChrijving van het gebruikte organisme
De gebruikte schimmel Eremothecium ashbyii werd geisoleerd in de Cong~
door de Engelse phytopathologist R.E. Massey, van een katoenvrucht • De
schimmel is namelijk een plantenparasiet levend op katoen, koffie,
citrusvruchten, tomaten en verschillende groenten. Op de katoen komt
het voor, grote schade verooraakend aan de katoenoogst. Hier geeft het
de ft internal boll rot" en de tt cotton staining". (31) (32)
Op vaste media vormt de schimmel kolonies die er gelatineus en geel uitzien. Het mycelium. groeit ~Ch;tOarn-~ meer of minder regelmatig. In het
begin ziet men geen tussenwanden in het mycelium, later treden ze echter
regelmatig op, stukken van ongelijke grootte VOrmend. (33)
De voortplanting gebeurt door middel van sporangien die na 48 uur gevormd worden, bijna aan het eind van de myceliumdraden. In deze sporansporen
gien vormen zich de Sporen. De~zijn langwerpig, aan een zijde afgerond of als het ware scheef afgesneden, aan de andere zijde spits toelopend. De spore - afmeting is:29-31.~ lang en 2-2.~breed. In een
sporandium. vormen zich 4-32 sporen, meestal 12- 16. Op een nieuw medium.
gebracht, ontkiemen deze sporen onder vorming van mycelium.
In de delen van het mycelium waar de groei vermindert ziet men een gele
kl eurstof verschijnen, die in oplossing gaat in de vacuolen.
V. Afscheiding van het product uit het medium
Vóór de eigenlijke isolering uit de waterige phase van het medium moet
de schimmel worden verwijderd, hetgeen gebeuren kan door afcentrifugeren
of affiltreren.
Voor de afscheiding
zijn verschillende methoden in gebruik:
.
1~ ~~~~t~~ met alcoholen (o.a. butanol), alcohol-water mengsels etc.,
gevolgd door een adsorptie aan diverse materialen zoals vollers aarde,
, - - - - - - - - - - - - - - - - - - ..
-8-
•
franconiet,kaolien, silicagel, kieselguhr e.a. Elutie hieruit en
daarop volgende omkristallisatie levert een zuiver product.
Voor het verwerken van grotere porties is deze methode niet geschikt,
dan neemt men liever de reductie met de daarmee gepaard gaande praecipitatie van de leucoverbinding •
.;
,
CH 2 H
f
I
N C/ N- C- 0
\
\:
, N () "Q. N H
f
H
riboflavine
2.
~~_~~uc~~~
(5
leucoverbinding
kan op twee manieren worden uitgevoerd
. .. . .. . . . . . ....
a. Mbv reduc;tïiemiddelen
.
..
•
Hiervoor gebruikt men Na~S~
04·2 H 0, stannochloride, vanadosulfaat
c:. c:.
•
2
of chloride, chromosulfaat,titaniumtrichloride.(34,35). Van al deze
stoffen wordt alleen de eerste in de industrie gebruikt. Met behulp
hiervan krijgt men een rendement van 90.5 %. De "praecipitatie gaat
zeer snel, sneller dan met de microbiologische praecipitatie, maar
deze methode is ook duurder.
b. Mbv bacterien.
. .. ... . .
In de litt. worden verschillende soorten genoemà, die in staat zijn
het vitamine over te voeren in de leucoverbinding,(36,37), nl
Streptococcus faecalis, Streptococcus liquefaciens, Streptococcus
cremoris, s treptococcus zymogenes, Streptococcus lactis, Escherichia
coli , Serratia plymouthensis en enige Clostridia. Meestal wordt in
het laboratorium en in de industrie gebruikt Streptococcus faecalis.
Met deze methode slaat ongeveer 90% van de vitamine als leucoverbinding neer. Een voorwaarde voor het gebruik hiervan is een minimumconcentratie van B2 in de vloeistof van 65 rog/L.
De voorwaarden voor deze reductie zijn verder:
Een temperatuur van ongeveer 25 0 C. Bij lage temperatuur krijgt men een
verlangzaamde groei en geen neerslagvorming.
Een begin PH van 6-7·5· De PH mag niet te hoog oplopen, daar dan een
ontleding van het vitamine plaats vmndt.
~------------
--
-9Geen aeratie. Het beste is te werken in een inert gas. Aeratie werkt
de reductie tegen, waardoor er geen praecipitatie kan optreden.
Voor deze neerslagmethode gebruikt men het liefst een jonge cultuur van
e
e
de 3 of 4 generatie.
Aan deze bacteriologische reductie gaat vooraf een sterilisatie van het
van de schimmel bevrijdde medium. Sterilisatie door stoominjectie is
niet gewenst, daar dit nog een concentratievermindering van de aanwezige
voedingsstoffen in het medium geeft, waardoor de groei van het microorganisme en de reductie geremd worden.
Voor de sterilisatie is hier genomen een werking met behulp van U.V.
stralen.(38). Een U.V. vloeistofsterilisator is genomen zoals uitgevoerd
is doorttPhilips" te Eindhoven. Bij dit apparaat stroomt de te steriliseren
vloeistof in een dunne film langs de U.V.lampen, in een tijd lang genoeg
om de microben te doden. Temperatuurverhoging wordt tegengegaan door een
\}. aan de buitenkant aangebrachte watermantel. Dit laatste is zeer voor,\ delig, daar bij deze handelwijze geen achteruitgang van de B2 concentraI :1
\~
, tie optreedt.
\
~
,Jo"'"
~'
\"
t
•
VI.De bepaling van het B2-gehalte
Voor de fabriekscontrole is een bepaling van het gehalte aan B2 noodzakelijk. Hiervoor zijn een tweetal methoden in gebruik:
~~ Q~_~!2~~~~!~S!~~~~ volgens Snell en Strong (39,40,41). Het is gebleken dat vitamine B2 een essentieel bestanddeel is voor de groei van
Lactobacillus casei. Men nam nu een medium vrij van riboflavine (behandelde pepton 0.5%, glucose 1%, Natriumacetaat 0.6%, cystine 0.01%,
anorganische zouten, B2-vrije gist). Hieraan wordt een monàter toegevoegd
van het me di urn waarvan de B2 concentratie bepaald moet worden. Na sterilisatie wordt dit geent met een suspensie van Lactobacillus casei.
De rest van de bepaling kan nog op twee manieren worden uitgevoerd, nl
nephelometrisch en titrimetrisch. Bij de nephelometrische methode
meet men de troebeling na 24 uur groeien, de grmei is dan optimaal. De
titrimetrische methode is gevoeliger, deze wordt dan ook meestal gebruikt.
Na 72 uur groeien wordt de zuurproductie bepaald.
Een standaardcurve is bij beide methoden nodig. De methode is nauwkeurig
maar duurt te lang.
Voor directe controle gebruikt men dan liever de methode
~~ ~~_~~~~~f1~2E~~2~~!!~~~~g~~~ (40,42,43)
Deze methode berust op het feit dat het vitamine in blauw licht een fluores-
~---
---
-10centie geeft, waarvan de sterkte even~edig is met de concentratie van
het B2
In het medium is meestal nog pigment aanwezig, dat eveneens een fluorescentie kan geven . Met Na 2S204 worden somm.ige pigmenten gereduceerd
en daarbij overgevoerd in een nie -t fluorescerende verbinding evenals
het riboflavine zelf. Het B2 heeft echter de eigenschap door schudden
met lucht weer in het vitamine zel~ overgevoerd te worden, hetgeen niet
mogelij k is voor gereduceerd pigment.
Pigment, wat niet gereduceerd kan worden, wordt verrekend door nog een
fluorescentiemeting te doen na toevoeging van een bekende hoeveelheid
0
I'"
B2 •
De bepaling berust op de volgende feiten:
De sterkte van de fluorescentie is evenredig met de B2-concentratie
Het B2 wordt niet vernietigd door zwakke oxydatie of reductie
Met NaiS204 treedt reductie tot de niet fluorescerende leucoverbinding op, waaruit door schudden met lucht weer B2 gevormd wordt
Met SnC1 2 treedt geen reductie op
5. De sterkte kan gemeten worden met een photoelectrische lamp
•
..
Bij de bepaling wordt dus eerst het onstabiele pigment verwijderd door
reductie. D ~olgend~. metingen worden verricht:
A. van de onbekende oplossing
b. Van de onbekendepplossing na toevoeging van een bekende hoeveelheid
riboflavine
c. Na reductie met natriumhydrosulfietoplossing van de oplossing onder
b. genoemd.
d. Een oplossing met zelfde hoeveelheid water als men monster gebruikte,
met toevoeging van de zelfde hoeveelheid bekende riboflavineoplossing
-10I '>,
BEREKENING VAN EEN KOELER
,.1
L
-- .. _-+
'
;. , ' 0'
_
Q~~È~~~_È~!~!~~!~~!
~ t = 35.38 o C = 6
3.6 80 F
Hoeveelheid warmte die ~ =
= 18333 x 107 x 1 = 1961631 kcal =
= 7846524 BTU
Wanneer voor de U genomen wordt 266, vindt men voor A
7846524
= 200 x 63.68
Bij gebrlitik van buizen vqn i nwendig 1" en uitwendig 3/4" (B.G. W. 14)
heeft men een capaciteit per buis van 850.5 lb/hr
In het geheel wordt doorgevoerd 40416 Ibs
Het aantal buizen wordt dus ~~6~~ = 48
Daar de lengte van de koeler dan erg lang wordt 48 x A0.2183 x 3.048
Korden hier 4 passes genomen.
Het aantal buizen voor de diameter van de koeler wordt 192
In tabel gevonden B.W .~. 14 : ~ = 22", 212 buizen
Aan hoeveelheid koelwater gaat door 107 ~518333 = 43592 kg =
Het vrije doorstroomde oppervlak = d~arsdoorsnede v.d.cylinder
i' x 22
'21 2 ( 0 . 2391
·j
- d wars d oorsne d e van d e ~~pen:4
' x ~44144 + 0.00379 ) =
2.640 - 1.155 = 1.485 ft = 13.80 dm
De bevochtigde omtrek = Omtrek cylinder. omtrek buizen =
\ \ x 22
..JL.
2
12
• 212 T2 = 58.34 ft
4 x 1.485
De = 58.34
De snelheid van het koelwater = 43592
13.80 x 3600 = 0.87 dm = 0.288 ft
Re( 350C ) = De x v x J = 4 x 1.485 x 61.99 x 0.288 x 3600 =
1. 65 x 58.34
= 3880 (goede turbulentie)
~!j_È~~~~2~~g_y~g_~~_È~!~:
•
,'
.
I
,
, /
.,t..
•
60
0
135
= 91.• 5 C
tw =
2
135 • 97.5
116°c =241 0 F
t f .=
=
2
J.
0
60 + 97.5
0
= 79 0 = 174 F
tf =
2
0
Voor het bepalen van h i (241°F) kan men de volgende waarden invullën
2
v = 192/212 x 3600 fti hr ; D = 0.834/12 ft ; k = 0.396 BTU/ft ,hr,8F,
/ft
-11-
,'-'- = 0.59 lb/hr, ft
,v =
0.396
X
0 0225 x 0.834 12
h i =.
= 442
59.09
" = 1.5
0 8
0 3
192
x
3600
x
"0.834
x 59.09'
.
(
212 x 12 x 0.59
)
(1.5)
=
Voor h kan men invullen( 174°F)
\ = 60.71
v = 0.288 x 3600
2.3
D = 1/12
/1. = 0.88
i
k = 0.387
0.387( 1/12 x 0.288 x 3600 x 60 71 0.8
0.3
ho = O. 0225 x 1/1 2
0 . 88
')
(2 • 3 )
=
= 153
°
1
,:'
1
xlA.
UA. =(~ +
1
1
1
.--<\'
= \'
d
= 0.0024
~4-x~1-:4~4
ft
2
Als materiaàl voor de koeler genomen een legering van 70% Ou
29% Zn
1% Sn
Hiervoor is de k practisch constant.
1
1
0.0024 x 0.2183
0.2183
~ + 60 x 0.2400
+ 153 x 0.2618
u=
= 0.00776
U 1 = 129
,
!
,
/
~,
.
"r
,
,
.1/
~!j-y~~!~~~~-y~~-~~-~~!~!
tw = 28
15 = 21.5°0 =
2
tf
.=
21.5 + 28
~
2
=
25°0 = 77°F
tf = 21.5 + 15 = 18°0
2
0
= 64.4 0 F
•
2.17
,Lv =
1
h.
1
= 6.6225
= 213
Voor ho kan worden ingevuld (64.4 0 F)
= 62.31
v = 0.288 x 3600
D
S
k
ho
=
0.346
= A.0225
v
= 95
= 1/12
I(
0 8
=
2.57
0 4
~ 0.346(1/12 x 0.288 x 3600 x 62.31) • (7 5) . _
"'"
1/12
2.57
.-
-
--
-
--------
-
-12-
1
u=
1
0.0024 x 0.2183
~
57 x 0.2400
+
= 77
Q =A
0.2183
95 x 0.2618
= 0.01352
U
;
t 1x
U2 -
2.3 log
t 2 x U1
t 1 xU 2
t
2
xU
1
A = 7846524 x 2.3 log
129
•
•
x
75 -
=
74 x
74 x 13
129 x 75
13
=
2076 ft
2
, - - - - - - - - - - - - - - - - , , - - - - -- - - - - - - - - -
LIJIIT VAN DE APPARATEN
1. pompen voor aanvoer en menging van de voedingsstoffen
2. Sterilisator- 1-9 Dl, 2r-1 Dl één pass
3. Koeler - 1-2.5 ., 2r-Q.45 Dl 4 paases
4. lfermentor 1- Inhoud 20 .3 - h- 4m. 2r- , .
5. Centrifuge
6. Opslagtank - Inhoud 18 .3 - h-2.6 m, 2r-3 Ja
7. Ultra-Violet sterilisator
8. Fermentor 11 - Inhoud 20 ~ - ha4 Dl, 2r-, Dl
9. Centrifuge
10. Droogstoof
11. Mixer - Inhoud 3.50 1 - h-1 Dl, 2r-Q.8 Dl
12. Kookpan - Inhoud 4.50 1 - haQ.85 IR ,2r-O.9 lil
Sharpies centrifuge
14. Koeler - 1-1 Dl, 2r-0.15 Dl - 'én pass
15- Aerator - Inhoud 450 1 - h-1.5 m, 2r-0.6 Dl
1'.
16. Centrifuge
17. Verdamper - IDhooo
1 - h-o. 9m ,21".8.7 JA
18. lI1xer voor alcohol, water - Inhoud 350L - h-O.9 .,21'*0.7
19. Opslagtank alcohol - Inhoud 2000 1 - h-1.3 m, 2r-1.4 m
20. Droogstoof voor de ru.we en de zuivere vitamine B2
21. Luchtster1lisator
.
la
-...00
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9·
10.
11.
12.
13·
14.
15·
16.
.
.
17·
18 •
19·
20.
21.
22.
23·
24.
25·
26.
27.
28.
29·
30.
31.
'atïuur1ijst
A. W. Blyth, J.Ohem.Soc., London 22, 530,(1879)
R.Kuhn, P.Gyorgy, T. Vlagner-Jauregg, Natuswiss. 21, 560, (1)33)
O.Warburg, 'N . Ohristian, Biochem.Z.254, 438, (1932)
P.Karrer, H•.F. Meerwein, Hel v.Chim.Acta 12., 274, (1937)
P.Karrer, B.Becker, F.Benz , P.Frei, H.Salomon, K.Schopp,
He1v . Chim . Acta 18, 1435, (1935)
R.Kuhn, K.Reinemund , F. Weygand, R.Strobe1e, Ber.d.deut.chem.Ges.
68,1765, (1935)
Ro che Products Ltd, B. P.615847 (1948)
V.F.Pfeiffer , F . W.'r anner, Ch.Vojnovich, D.H . 'I'rauf1er
Ind. and Eng .Chem.42, 1776,(1950)
Commercial Solvents Corp., B.P. 623082 (1949)
G.J .de Becze, H. n •Moore , E .Schraffenburger U.S . P. 2543897 (1951)
I.Yamasaki, W.Yositome, Biochem.~ .297, 398, (1938)
A.H .stevens, Western Condensing Co, B.P.602031 (1948)
R.L. May.er, M.Rodbart, Arch .of Biochem.11 , 49, (1946)
P.R . Burkholder, Arch.of Bi ochem,i, 121, (1943)
H.Levine, J.E.Oyaas, L.Wasserman, J.O.Hoogerheide, R. M.Stern,
Ind.Eng.Chem.41, 1665, (1949)
L.J. Wickerham, M.H. F1ickinger, R. l.! . Johnston, Arch. of Biochem. a, 95(194
2" 95 , ( 1946 )
F. W•Tanner , J . M.v. Lanen, J •Bact .,2i, 38, (1947)
F. W.Tanner, J.Wickerham, J. M.v. Lanen, U.S .P. 2445128 (1947)
Koninklijke Nederlandsche Gist en Spirituà Fabriek, D.P.68936 (1951)
G.Pridham, U.S.P. 2578738 (1951)
H.D.Piersma, U.S . P. 2400710 (1946)
Merck en Co, B.P. 593027 (1947)
Pfizer & 00 Inc. B.P. 593953 (1947)
Soc. des Usines Chimiques Rhone Poulene, B.P.594015 (1947)
Roche Products .Ltd. B.P. 615847 (1949)
U. S.P . 2 498 549 (1950)
Roche Products Ltd., B. P.651 671 (1951)
F .A.Robinson. The vitamin B complex. London (1951)
H. N. t"loore, G.de Becze, E.Schraffenberger, J.Bact.,2i,
F . W. 'r anner, C.Vojnovic h, J. ]\I.v. Lanen , J.Bact.2Q, 737, (1949)
J . B.Routien , M
ycologia 41, 183 (1949)
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
A.Guillermond. Compt.Rend.200(1935)1556
G. E.Hines. T. Haute. U. SP.2 367 644(1945)
Commeroial Solvents Corp. B. p .621552 (1949)
G. B.Hines. U. S. P . 2 387 023 (1945)
R.J.Hickley. Arch.of Biochem. 11(1946)259
H .C.Rentsohle~. R. Nagy.
U.S.P. 2 482 507(1949)
E.E.Schnell. F. M.Strong. I.EC. An.Ed.1l(1939)346
R.E.Johnson. F.Sargent. P. F.Robinson. F.C.Consolasio
I.E.C.An. Ed. 11(1945)384
41. F. M. Strong. L. E.Carpenter. r .E C. An.Ed.l!(1942)909
42. A.Z. Hodson. L.C. Norris. JJ Biol.Chem.131(1939)621
43. M. L.Scott. F W.Hill. L. C.Norris. G.F.Hensen.
J Biol.Chem.165(1946)65
•