Biochemische studie van nieuw ontdekte
advertisement
Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar 2015-2016 Biochemische studie van nieuw ontdekte ribosoom-inactiverende proteı̈nen in rijst Ine Storme Promotor: Prof. Dr. E. Van Damme Tutor: Ir. J. De Zaeytijd Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de bio-ingenieurswetenschappen: Cel- en Genbiotechnologie 1 Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar 2015-2016 Biochemische studie van nieuw ontdekte ribosoom-inactiverende proteı̈nen in rijst Ine Storme Promotor: Prof. Dr. E. Van Damme Tutor: Ir. J. De Zaeytijd Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de bio-ingenieurswetenschappen: Cel- en Genbiotechnologie I Toelating tot bruikleen De auteur en de promotoren geven de toelating om deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef. Promotor: Prof. dr. Els Van Damme Begeleider: Ir. Jeroen De Zaeytijd Auteur: Ine Storme I III Woord vooraf Het schrijven van een eindwerk kun je niet zomaar in je eentje. Daarom wil ik graag volgende mensen bedanken. Zonder hen zou deze masterproef nooit geworden zijn wat hij nu is. In de eerste plaats Professor Dr. Els Van Damme voor het aanbieden van een masterthesis en het nalezen en verbeteren ervan. Ook wil ik haar bedanken voor de goede begeleiding en het veelvuldige advies tijdens mijn verblijf in de Glyco groep. Daarnaast ben ik Ir. Jeroen De Zaeytijd zeker ook een dankwoord verschuldigd. Dit voor de vele hulp en de goede begeleiding tijdens het uitvoeren en schrijven van deze thesis. Verder zorgden alle collega’s van de Glyco groep voor een aangename werksfeer. Als laatste verdienen ook mijn ouders een dankwoord voor de eindeloze steun. III V Samenvatting Ribosoom-inactiverende proteı̈nen of RIPs zijn enzymen die door een gerichte depurinatie van het rRNA, ribosomen irreversibel kunnen inactiveren. Dit heeft als gevolg dat translatie van proteı̈nen niet langer kan doorgaan. Vanwege hun werking zijn sommige van deze RIPs dan ook toxisch voor zoogdieren. RIPs komen hoofdzakelijk voor in planten, waar ze mogelijk een rol spelen in de bescherming van de plant tegen insecten en pathogenen zoals virussen en fungi. Daarnaast worden deze proteı̈nen ook verhoogd tot expressie gebracht onder invloed van abiotische factoren. Recent werd ontdekt dat RIPs een hogere toxiciteit vertonen ten opzichte van kankercellen in vergelijking met normale cellen. Daardoor neemt ook in de medische wereld de interesse voor RIPs toe. In deze thesis werden de proteı̈nen OSRIP1 en RIP-M41 en het RIP(M41) domein heteroloog tot expressie gebracht in E. coli rosetta(DE3) cellen. Daarbij werd gebruik gemaakt van de induceerbare pET-21a vector. Na extractie van het eiwit werd via Western Blot analyse het RIP-M41 eiwit in de onoplosbare fractie en OSRIP1 en het RIP(M41) domein in de oplosbare fractie gedetecteerd. Hierna werden de proteı̈nen en het domein opgezuiverd met behulp van immobilized metal affinity chromatography of IMAC. De resulterende elutiefracties werden gescreend op hun inhiberende activiteit tegenover ribosomen onder de vorm van een RIP assay. In het verleden werd een lokalisatiestudie uitgevoerd voor het OSRIP1 proteı̈ne in bladeren van Nicotiana benthamiana. Daarvoor werden de pK7FWG2 en pK7WGF2 vectoren gebruikt. Tijdens deze thesis werd dezelfde lokalisatiestudie herhaald, maar werd nu gebruik gemaakt van de pEAQ-HT vectoren. Er werden zowel N- als C-terminale GFP fusieconstructen gemaakt. Deze constructen werden transiënt tot expressie gebracht in N. benthamiana door middel van Agrobacterium tumefaciens. Het OSRIP1 proteı̈ne werd gedetecteerd in het cytoplasma en de kern. Dit bevestigt het bekomen resultaat met de pK7 vectoren. Aangezien OSRIP1 in planten een cytoplasmatisch proteı̈ne blijkt te zijn, kan dit RIP mogelijk contact maken met de ribosomen van de plant. Om dit te onderzoeken werden toxiciteitsconstructen aangemaakt. Deze constructen kunnen via A. tumefaciens transiënt tot expressie gebracht worden in bladeren van N. benthamiana. Na enkele dagen kunnen de bladeren gescreend worden op mogelijke toxische effecten. V VII Lijst met symbolen en afkortingen α-MC α-momorcharine ABA Abscisic acid AIDS Acquired Immune Deficiency Syndrome AMP Ampicilline APC Antigen-presenterende cel APS Ammoniumpersulfaat ATG Anti-thymocyt globuline Bidest Dubbel gedestilleerd water BSA Bovien serum albumine CAM Chlooramfenicol CARB Carbenicilline CFU Colony forming units dATP Deoxyadenosinetrifosfaat dCTP Deoxycytidinetrifosfaat dGTP Deoxyguanosinetrifosfaat DMSO Dimethyl sulfoxide DNA Desoxyribonucleı̈nezuur dNTPs Deoxynucleotiden dTTP Deoxythymidinetrifosfaat EDTA Ethyleendiaminetetra-azijnzuur EF Elongatiefactor ER Endoplasmatisch reticulum ERAD Endoplasmic-reticulum-associated protein degradation Gal Galactose GalNAc N-Acetyl galactosamine HIV Human Immunodeficiency Virus HRP Horseradish peroxidase IC50 Halfmaximal inhibitory concentration IMAC Immobilized metal affinity chromatography IPTG Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside IZ Imidazool JIP60 Jasmonate Inducible Protein of 60 kDa LB Luria-Bertani broth LDL Low Density Lipoproteı̈ne M Mol per liter MB Multivesicular bodies Milli-Q Ultrapuur water uit Millipore Milli-Q Lab Water system NLS nuclear localization signal OD Optische densiteit PAG Polynucleotide:adenosine glycosidase PAP Pokeweed antiviral protein PB Fosfaatbuffer PBS Phosphate buffered Saline PCR Polymerase chain reaction PDI Proteı̈ne disulfide isomerase PHA Fytohemagglutinine PVDF Polyvinylideenfluoride RIP Ribosoom-inactiverend proteı̈ne ROS Reactive Oxygen species rpm Rotations per minute rRNA Ribosomaal ribonucleı̈nezuur RTA A-keten van ricine RTB B-keten van ricine SDS-PAGE Sodiumdodecylsulfaat-polyacrylamide gelelektroforese TAE Tris Acetaat EDTA TE Tris EDTA TEMED Tetramethylethyleendiamine TGN Trans-Golgi-netwerk TNF Tumor necrosis factor UPR Unfolded protein response UV Ultraviolet YEB Yeast Extract Broth IX Inhoudsopgave 1 Inleiding 1 2 Ribosoom-inactiverende proteı̈nen 2 2.1 Classificatie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 2.2 Biologische activiteiten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2.2.1 Enzymatische activiteiten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2.2.2 Toxiciteit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 Biotechnologische toepassingen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 2.3.1 Biomedische toepassingen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 2.3.2 Gewasbescherming . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 Onderzochte RIPs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 2.4.1 RIP-M41 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 2.4.2 OSRIP1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 2.3 2.4 3 Materiaal en methoden 16 3.1 Algemene moleculaire technieken . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 3.1.1 Polymerase Chain Reaction (PCR) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 3.1.2 Agarose gelelektroforese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 3.1.3 Opzuiveren PCR product . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 Heterologe Expressie in E. coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 3.2.1 Heat Shock transformatie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 3.2.2 Gibson Assembly . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 3.2.3 Suspensieculturen van E. coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 3.2.4 Glycerolstock . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 3.2.5 Opzuiveren van plasmide DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 3.2.6 Sequentiebepaling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 3.2.7 Eiwitexpressie in E. coli rosetta . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 Opzuivering van eiwit uit E. coli rosetta . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 3.3.1 23 3.2 3.3 Lyse en Sonicatie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.4 3.5 4 24 3.3.3 Laden van de Ni-NTA agarose beads . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 3.3.4 Wasstappen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 3.3.5 Elueren van de Ni-NTA agarose beads . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 3.3.6 Dialyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 Analyse van DNA en eiwit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 3.4.1 Concentratiebepaling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 3.4.2 Technieken voor analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 Transiënte expressie in Nicotiana benthamiana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 3.5.1 Gateway Klonering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 3.5.2 Elektroshock transformatie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 3.5.3 Suspensieculturen van Agrobacterium tumefaciens . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 3.5.4 Transiënte transformatie van tabaksbladeren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 3.5.5 Detectie aan de hand van een confocale fluorescentiemicroscoop . . . . . . . . . . . . . . 34 35 4.1 Heterologe expressie in E. coli rosetta . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 4.1.1 Aanmaak van de expressieconstructen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 4.1.2 Expressie in E. coli rosetta . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 Eiwitopzuivering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 4.2.1 Affiniteitschromatografie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 RIP Assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 4.3.1 Zeba kolom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 4.3.2 RIP Assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47 Lokalisatiestudie van OSRIP1 in Nicotiana benthamiana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49 4.4.1 Aanmaak van de lokalisatieconstructen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49 4.4.2 Transformatie van Agrobacterium tumefaciens . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 4.4.3 Transiënte expressie in Nicotiana benthamiana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 In planta toxiciteit van OSRIP1 in Nicotiana bethamiana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54 4.5.1 54 4.3 4.4 4.5 6 Voorbereiden van de Ni-NTA agarose beads . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Resultaten 4.2 5 3.3.2 Aanmaak van de toxiciteitsconstructen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Discussie 56 5.1 RIP-M41 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57 5.2 Het RIP(M41) domein . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59 5.3 OSRIP1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59 5.4 Lokalisatie van OSRIP1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60 5.5 In planta toxiciteit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62 Conclusie en perspectieven 64 7 Bijlagen 76 7.1 Gebruikte primers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76 7.2 Gebruikte vectoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78 7.2.1 Heterologe expressie in E. coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78 7.2.2 Gateway vectoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79 7.2.3 Transiënte expressie in N. benthamiana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81 7.3 De DNA sequenties van RIP-M41 en OSRIP1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82 7.4 De aminozuursequenties van RIP-M41 en OSRIP1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83 INLEIDING 1 1 Inleiding Sommige planten produceren ribosoom-inactiverende proteı̈nen (RIPs) (de Virgilio et al., 2010). Als respons op verwonding of infectie met pathogenen worden ze vrijgesteld en verhoogd tot expressie gebracht, samen met andere verdedigingsproteı̈nen (Vivanco et al., 1999). RIPs inhiberen de werking van ribosomen op een irreversibele manier. Hierdoor stopt de eiwitproductie en kan de cel zijn vitale functies niet meer uitoefenen. Dit leidt tot celdood (Walsh et al., 2013). Het mechanisme achter de inactivatie van ribosomen werd reeds ontdekt in 1987 (Endo et al., 1987). RIPs verwijderen een specifiek adenine residu uit het grote ribosomaal RNA (rRNA) op een specifieke plaats, gekend als de ricine/sarcine lus. Door deze deadenylatie verliest het ribosoom zijn activiteit. Deze enzymatische activiteit van het RIP wordt site specifieke RNA N-glycosidase genoemd (Nielsen and Boston, 2001). RIPs worden hoofdzakelijk geproduceerd door planten. Sommige type 1 RIPs komen zelfs voor in bepaalde groenten die rauw gegeten worden zoals tomaten en spinazie. De RIPs komen in sommige planten voor in slechts één weefsel, terwijl ze in andere planten verspreid over verschillende weefsels voorkomen (Stirpe, 2013). RIPs komen in planten niet geconserveerd voor. Zo bevat Arabidopsis thaliana geen RIP genen. RIPs werden ook aangetroffen in fungi (Volvariella volvacea), insecten (Culex aquinquefasciatus en Aedes aegypti) en minstens één alg (Laminaria japonica) (Stirpe, 2013; Stirpe and Lappi, 2014; Silva et al., 2003; Reisbig et al., 1981; Stirpe and Gilabert-Oriol, 2015). De bacteriële Shiga (Shighella shigae) en shigalike toxines (Escherichia coli) vertonen eveneens RIP activiteit (Stirpe and Gilabert-Oriol, 2015). RIPs spelen mogelijk een rol in het beschermen van de plant tegen insecten en pathogenen zoals virussen en fungi (Stirpe, 2013). Deze bescherming is mogelijk gelinkt aan de cytotoxiciteit van de RIPs. Type 1 RIPs vertonen over het algemeen een lage toxiciteit, terwijl binnen de type 2 RIPs meer variatie in toxiciteit bestaat (Stirpe and Lappi, 2014). Ook abiotische factoren kunnen invloed hebben op de expressie van RIPs. Zo kunnen onder andere osmotische stress, droogte, koude, warmte, maar ook planthormonen zoals abscisinezuur en jasmonaat een verhoogde expressie van bepaalde RIPs in planten teweegbrengen (Stirpe, 2013; Nielsen and Boston, 2001). Op basis van deze eigenschappen kunnen RIPs toegepast worden in gewasbescherming. Daarnaast toont ook de medische wereld interesse in RIPs. Zo lijken bepaalde RIPs toxischer te zijn voor tumorale cellen dan voor gewone cellen. Ook de antivirale eigenschappen van RIPs kunnen aangewend worden voor medische toepassingen. Zo wordt onder andere onderzocht hoe RIPs kunnen helpen in de strijd tegen het HIV virus (Stirpe, 2013). 1 RIBOSOOM-INACTIVERENDE PROTEÏNEN 2 2 Ribosoom-inactiverende proteı̈nen 2.1 Classificatie Binnen de familie van de RIPs kunnen op basis van de structuur 2 grote klassen worden onderscheiden: de holoRIPs en de chimero-RIPs (figuur 2.1). Tot de holo-RIPs behoren alle RIPs die enkel een N-glycosidase domein bezitten. Deze klasse bevat alle type 1 RIPs. Deze kunnen opgedeeld worden in one-chain type 1 en two-chain type 1 RIPs. De eerste vorm bestaat uit een N-glycosidase domein dat ontstaat uit 1 polypeptideketen (∼ 30 kDa). Een typisch voorbeeld hiervan is PAP (Schrot et al., 2015). De two-chain vorm bevat een katalytisch domein dat uit twee afzonderlijke polypeptideketens is opgebouwd. De originele polypeptideketen werd door proteolyse geknipt in 2 kleinere polypeptideketens (Peumans et al., 2001). Figuur 2.1: Representatie van de moleculaire structuur van de verschillende types RIPs (Depuydt, 2013) De chimero-RIPs bestaan uit twee types; namelijk de type 2 en type 3 RIPs. Deze zijn opgebouwd uit twee polypeptideketens (A- en B-keten). De A-keten voert de N-glycosidase activiteit uit. Type 2 RIPs hebben als B-keten een lectinedomein specifiek voor galactose (Gal), N-acetylgalactosamine (GalNAc) of N-acetyl neuraminezuur (Siaalzuur), dat verbonden is met de A-keten door middel van een disulfidebrug (Stirpe, 2013; Stirpe and Battelli, 2006). Een bekend voorbeeld van een type 2 RIP is ricine (Schrot et al., 2015; Peumans et al., 2001). Voor type 3 RIPs zijn zowel de A- als de B-keten gecodeerd door eenzelfde polypeptide. De B-keten codeert voor om het even welk domein dat geen lectinedomein is. Een voorbeeld van een type 3 RIP is JIP60 (Schrot et al., 2015). Dit RIP komt voor in gerst (Hordeum vulgare). Alle RIPs die structureel en evolutionair gerelateerd kunnen worden aan JIP60 worden ingedeeld bij de type 3 RIPs (Peumans et al., 2001). 2.2 Biologische activiteiten 2.2 Biologische activiteiten 2.2.1 Enzymatische activiteiten 3 Ribosoom-inactiverende proteı̈nen zijn inhibitoren van de eiwitsynthese in cellen. Deze inhibitie wordt reeds opgemerkt bij zeer lage concentraties van het RIP ten opzichte van de hoeveelheid aanwezige ribosomen. Omwille van de kleine hoeveelheid nodig voor inhibitie werd verwacht dat de toxiciteit van RIPs via een enzymatische reactie verloopt (Walsh et al., 2013). In de literatuur worden verschillende enzymatische activiteiten van RIPs gerapporteerd. Sommige daarvan werden reeds bevestigd, andere blijven controversieel (Peumans et al., 2001). 2.2.1.1 N-glycosidase activiteit De belangrijkste activiteit van RIPs is de N-glycosidase (EC klasse 3.2.2.22) activiteit (Schrot et al., 2015). Deze wordt uitgevoerd door de A-keten van type 2 en type 3 RIPs of door het volledige type 1 RIP. Ribosoominactiverende proteı̈nen zijn in staat een specifiek adenine residu uit rRNA te verwijderen en zo ribosomen te inactiveren (Peumans et al., 2001; Stirpe, 2013). Het verwijderen van het adenine residu gebeurt door hydrolyse van de N-glycosidische binding ter hoogte van de sarcine/ricine lus (Peumans et al., 2001). Dit werd aangetoond bij ratten waar A4324 werd verwijderd uit het 28S rRNA van de 60S subunit van lever ribosomen (figuur 2.2) (Stirpe and Battelli, 2006). De sarcine/ricine lus, ook wel de α-sarcine lus genoemd, is 14 nucleotiden lang. Het adenine residu dat verwijderd wordt uit deze regio, is de eerste A in de GAGA sequentie (figuur 2.2). De sarcine/ricine lus is een sterk geconserveerd deel van de grote subunit van ribosomen en is noodzakelijk voor de correcte werking van de ribosomen (Seggerson and Moore, 1998). Figuur 2.2: De N-glycosidase activiteit van RIPs in ratten (Stirpe and Battelli, 2006) 3 2.2 Biologische activiteiten 4 Onder normale omstandigheden binden elongatiefactor 2 (EF2) en elongatiefactor 1 (EF1) ter hoogte van de sarcine/ricine lus met het ribosoom (Metzler, 2003). EF1 en EF2 binden het ribosoom om de elongatie van een peptideketen onder synthese te begeleiden. EF1 zorgt ervoor dat de juiste aminoacyl-tRNA molecule bindt op de A-plaats van het ribosoom. EF2 verplaatst de groeiende peptideketen van de A-plaats naar de P-plaats (Lapadula et al., 2012). De hydrolyse van de N-glycosidische binding resulteert in de depurinatie van de bindingsplaats voor EF2 en EF1. Hierdoor kunnen beide niet langer binden met het ribosoom. Dit heeft als gevolg dat de translatie en proteı̈nesynthese volledig geblokkeerd worden (Brigotti et al., 1989). In figuur 2.3 wordt de inwerking van Pokeweed antiviral protein (PAP), een type 1 RIP, op het ribosoom weergegeven (Mansouri et al., 2006; Irvin and Uckun, 1992). Het proteı̈ne dat gevormd wordt, zit gebonden op de P-plaats en PAP deadenyleert de sarcine/ricine lus. EF1 zorgt ervoor dat het amino-tRNA bindt ter hoogte van de A-plaats. EF2 wil binden ter hoogte van de sarcine/ricine lus, maar dit is onmogelijk. Hierdoor kan het gevormde proteı̈ne niet verplaatst worden van de A-plaats naar de P-plaats en valt de werking van het ribosoom stil (Mansouri et al., 2006). Figuur 2.3: De inhibitie van proteı̈nesynthese door PAP (Mansouri et al., 2006) 2.2.1.2 Polynucleotide:adenosine glycosidase (PAG) activiteit Sommige RIPs zijn ook in staat een adenine residu te verwijderen uit andere regio0 s van het rRNA dan de sarcine/ricine lus. Daarnaast kunnen enkele RIPs ook DNA en andere polynucleotiden, weliswaar met zeer uiteenlopende efficiëntie, deadenyleren (Stirpe, 2013). Om die reden worden RIPs polynucleotide adenosine glycosidases (PAG) genoemd (Schrot et al., 2015). Verschillende RIPs kunnen ook meerdere adenine residu0 s per ribosoom verwijderen (de Virgilio et al., 2010; Stirpe and Gilabert-Oriol, 2015). 2.2.1.3 Polynucleotide:guanosine glycosidase activiteit Ricine kan naast een adenine residu ook een guanine residu knippen uit het rRNA (Schrot et al., 2015; Peumans et al., 2001). Wanneer rat ribosomen worden behandeld met ricine wordt G4323 verwijderd uit de sarcine/ricine 4 2.2 Biologische activiteiten 5 lus (Endo and Tsurugi, 1986). Dit type 2 RIP is in staat datzelfde guanine residu te verwijderen uit E. coli rRNA, ribosomen uit konijnen reticulocyten en tabak en gist ribosomen. Ook PAP vertoont deze activiteit. Bij andere RIPs werd deze activiteit nog niet waargenomen (Peumans et al., 2001). 2.2.1.4 Andere enzymatische activiteiten Bij verschillende onderzoeken werden resultaten verkregen die niet te verklaren waren door enkel en alleen de RNA N-glycosidase en de PAG activiteit van RIPs (Peumans et al., 2001). De onverwachte enzymatische activiteiten die aan RIPs werden toegeschreven, zijn chitinase activiteit (Shih et al., 1997), superoxide dismutase activiteit (Lord and Hartley, 2010), DNase activiteit (Day et al., 1998), RNase activiteit (Van Damme et al., 2001), lipase activiteit (Morlon-Guyot et al., 2003) en fosfatase activiteit (Domashevskiy and Goss, 2015). Deze activiteiten zijn mogelijk het gevolg van contaminerende enzymen (Stirpe, 2013; Peumans et al., 2001; Stirpe and Gilabert-Oriol, 2015). 2.2.1.5 Enzymatische regulatoren van RIPs Reeds in kleine concentraties vertonen RIPs RNA N-glycosidase activiteit. Voor type 1 RIPs zijn slechts ∼pM concentraties (voor dierlijke ribosomen) tot ∼nM concentraties (voor plant en microbiële ribosomen) vereist (Endo and Tsurugi, 1988; de Virgilio et al., 2010). Verschillende moleculen kunnen de RIP activiteit versterken of inhiberen (Peumans et al., 2001). Sommige type 1 RIPs, zoals PAP, gelonine en tritine-S, vereisen ATP voor hun activiteit (Nielsen and Boston, 2001). Deze ATP moleculen worden gebruikt als cofactor door het RIP en niet voor fosforylatie (Peumans et al., 2001). Ook tRNAtrp is een factor die de activiteit van bijvoorbeeld gelonine bevordert. Voorwaarde hierbij is dat het tRNAtrp afkomstig is van zoogdieren of vogels (Brigotti et al., 1996). Waarom sommige RIPs cofactoren vereisen en andere niet, is nog onbekend (Hartley et al., 1996). Het vereisen van cofactoren is mogelijk gelinkt met een hogere efficiëntie of met bijkomende biologische activiteiten (Nielsen and Boston, 2001). De activiteit van RIPs kan ook worden tegengewerkt door bepaalde moleculen. De adenine residu0 s die RIPs zelf vrijstellen, kunnen nietcompetitief binden met de RIPs en zo hun activiteit inhiberen (Peumans et al., 2001). Pteroı̈nezuur is een inhibitor voor ricine. Dit zuur kan binden waar het RIP normaal contact maakt met adenine ter hoogte van de sarcine/ricine lus (Pierce et al., 2011). 2.2.2 Toxiciteit De toxische effecten van sommige type 2 RIPs zijn reeds lange tijd gekend. Tot 1970 was hun toxiciteit zelfs de enige reden waarom onderzoek naar ribosoom-inactiverende proteı̈nen werd gedaan. Type 2 RIPs zijn meestal toxischer dan type 1 RIPs (Stirpe and Battelli, 2006; Stirpe and Gilabert-Oriol, 2015). Dit doordat type 1 RIPs niet in staat zijn te binden met het celoppervlak via een lectinedomein en daardoor moeilijker toegang krijgen tot de ribosomen in het cytoplasma van de cel (Shahidi-Noghabi et al., 2009). Wordt een type 1 RIP gekoppeld aan een vector die in staat is het proteı̈ne in de cel te brengen, dan kunnen ze wel zeer toxisch zijn (Stirpe and Gilabert-Oriol, 2015). 5 2.2 Biologische activiteiten 2.2.2.1 6 Interactie met cellen De toegang tot het cytoplasma en de ribosomen van de cel is volledig afhankelijk van de structurele opbouw van het RIP of meer specifiek, de aan- of afwezigheid van de B-keten met lectine eigenschappen. Deze B-keten van type 2 RIPs kan specifiek binden met galactose (Gal), N-acetylgalactosamine (GalN Ac) of N-acetyl neuraminezuur (siaalzuur) (Stirpe and Battelli, 2006). Type 1 en type 3 RIPs De afwezigheid van een lectine B-keten bij type 1 en type 3 RIPs limiteert hun toegang tot de cellen en verklaart de lagere toxiciteit van deze types RIP voor cellen en zoogdieren (den Hartog et al., 2002). Wanneer zo0 n RIP toch binnen in de cel raakt, kan het echter zeer toxisch zijn (Stirpe, 2013). Sommige RIPs, zoals gelonine (type 1 RIP) en dianthine (type 1 RIP), zijn geglycosyleerd en kunnen binden met suikerbindende receptoren aanwezig op het celmembraan (Nielsen and Boston, 2001; Badr, 2012; Stirpe and Lappi, 2005). Andere RIPs (saporine en trichosanthine) zijn in staat te binden met verschillende low-density lipoproteı̈ne (LDL) receptoren (figuur 2.4) (Nielsen and Boston, 2001; de Virgilio et al., 2010; Stirpe and GilabertOriol, 2015). Dit vindt enkel plaats bij hoge concentraties van het proteı̈ne (Stirpe and Gilabert-Oriol, 2015). De receptoren interageren met een breed spectrum aan liganden en brengen het ligand binnen in het cytoplasma via clathrine-gemedieerde endocytose. Ook chemokine receptoren kunnen bijvoorbeeld trichosanthine naar het cytoplasma transporteren. Alle hierboven besproken vormen van opname verlopen receptor-gemedieerd (Nielsen and Boston, 2001). Er bestaan ook niet-receptor-gemedieerde vormen van opname. α-sarcine bijvoorbeeld kan selectief binden met negatief geladen fosfolipiden en op die manier opgenomen worden in een liposoom. Door versmelting van het liposoom met het membraan van de cel, wordt de inhoud van het liposoom vrijgegeven in het cytoplasma (Nielsen and Boston, 2001). In figuur 2.4 wordt de opname en het transport weergegeven voor ricine (type 2 RIP; R), saporine (type 1 RIP; S) en trichosanthine (type 1 RIP; T). Saporine en trichosanthine binden met een low density lipoproteı̈ne receptor. Via endocytose komen beide RIPs de cel binnen. Voor saporine is nog onbekend hoe de overgang naar het cytosol gebeurt. Trichosanthine komt terecht in multivesiculaire lichamen (MB). Deze lichaampjes fuseren met het plasmamembraan waarbij de vesikels met trichosanthine, vrijkomen in het extracellulaire milieu (de Virgilio et al., 2010). 6 2.2 Biologische activiteiten 7 Figuur 2.4: De opname en het transport van ricine (type 2 RIP; R), saporine (type 1 RIP; S) en trichosanthine (type 1 RIP; T) in de cel. RTA staat voor de A-keten van ricine, RTB voor de B-keten van ricine. LRP duidt de lipoproteı̈ne receptor aan (de Virgilio et al., 2010) Type 2 RIPs Een type 2 RIP bindt met glycoproteı̈nes of glycolipiden aanwezig op het oppervlak van de cel. De endocytosestap kan zowel clathrine-afhankelijk als clathrine-onafhankelijk verlopen (Weng et al., 2008). Dit hangt af van het type 2 RIP. Na endocytose zijn er drie verschillende routes: (i) transport naar het Trans-Golgi-Netwerk (TGN) en verder naar het ER en daarna translocatie naar het cytosol, (ii) degradatie door lysosomale enzymen nadat het endosoom versmelt met een lysosoom, en (iii) excretie aan de hand van exocytose naar het extracellulaire milieu (Sandvig and van Deurs, 2005). De meeste RIPs worden onmiddellijk terug gesecreteerd, maar slechts 1 molecule is voldoende om een cel te doden. Zo kan 1 molecule van de A-keten van ricine 1500 ribosomen inactiveren per minuut (Hartley et al., 1996). Het TGN is zeer belangrijk voor de cytotoxiciteit van het ribosoom-inactiverend proteı̈ne. Proteı̈nen met een KDEL signaal keren terug naar het ER nadat het TGN werd bereikt (Sandvig et al., 2000). Ricine is het bekendste voorbeeld van een type 2 RIP. In figuur 2.4 wordt ook de opname van ricine in de cel weergegeven. Ricine bevat een lectinedomein dat bindt met (onder andere) terminale galactose glycoproteı̈nes aanwezig op het oppervlak van de cel. Galactose komt voor in een groot deel van de dierlijke glycoproteı̈nes. Ricine wordt opgenomen in de cel via endosomen tot in het TGN (=retrotranslocatie). Als het meereizende glycoproteı̈ne een KDEL signaal bevat, kan ricine samen met het glycoproteı̈ne bewegen naar het ER (= retrograad transport) (Sandvig et al., 2000). Ter hoogte van het ER worden de A- en B-keten van elkaar gescheiden aan de hand van een disulfide isomerase (PDI) (O0 Hara and Mantis, 2013). De A-keten komt in het cytosol terecht en wordt door de cel herkend als een onvolledig proteı̈ne (Stirpe and Battelli, 2006; Di Cola et al., 2005). Zo0 n proteı̈nen worden normaal geübiquitinyleerd en vervolgens afgebroken door het proteasoom (ERAD pathway). De ricine A-keten 7 2.2 Biologische activiteiten 8 ontsnapt echter aan deze degradatie. Door het lage aantal lysines in de ricine A-keten wordt degradatie vertraagd (Di Cola et al., 2005). Hierdoor kan de A-keten ter hoogte van het cytosol heropvouwen en inwerken op de aanwezige ribosomen (O0 Hara and Mantis, 2013). 2.2.2.2 Apoptose van de cel Wanneer een RIP in het cytosol van de cel raakt, kan dit mogelijk leiden tot apoptose van de cel (Narayanan et al., 2005). Apoptose is een energie-afhankelijk proces waarbij de cel sterft zonder zijn inhoud vrij te geven in de omgeving van de cel. Hierdoor wordt het immuunsysteem niet geactiveerd. Apoptose gaat gepaard met condensatie en fragmentatie van de celkern, het denser worden van het cytoplasma en wijzigingen in het mitochondriaal membraan (Nielsen and Boston, 2001; Stirpe and Gilabert-Oriol, 2015). Aangezien apoptose door saporine en bouganine (type 1 RIP) een verschillende kinetiek kennen, moeten verschillende mechanismen verantwoordelijk zijn (Stirpe and Battelli, 2006; den Hartog et al., 2002). De geı̈soleerde B-keten van ricine bezit geen proteı̈nesynthese inhiberende eigenschappen. Toch kan dit fragment apoptose veroorzaken. Dit mechanisme wordt ribotoxic stress response genoemd (Narayanan et al., 2005; Stirpe and Gilabert-Oriol, 2015). De basis voor dit mechanisme is mogelijk het linken van moleculen op het oppervlak van de cel, waardoor het proces van geprogrammeerde celdood geactiveerd wordt (Stirpe and Battelli, 2006). Viscumine (type 2 RIP) kan apoptose induceren door de expressie van de anti-apoptotische factor Mcl-1 te inhiberen en de caspase pathway te activeren (Das et al., 2012; Kolotova et al., 2012). Daarnaast beı̈nvloedt viscumine ook de mitochondriale permeabiliteit en verhoogt het de intracellulaire reactieve zuurstof species (ROS) (Lavastre et al., 2002). Trichosanthine kan apoptose veroorzaken door gebruik te maken van de stikstofmonoxidegemedieerde pathway en door de productie van reactieve zuurstof species te induceren (Stirpe and Battelli, 2006; Zeng et al., 2015). Na toevoegen van trichosanthine worden caspase 8, 9 en 3 geactiveerd wat leidt tot fragmentatie van het DNA. Daarnaast worden ook het chaperone proteı̈ne BiP en de transcriptiefactor CHOP opgereguleerd. Hierdoor wordt de ER stress pathway geı̈nduceerd. Na behandeling van tumorcellen met trichosanthine wordt eveneens een toename in NO productie waargenomen. Zowel het stikstofmonoxide als de ER stress pathway leiden tot apoptose (Sha et al., 2013). Type 2 RIPs kunnen een Unfolded Protein Response (UPR) veroorzaken. Dit is een cellulaire stress respons geactiveerd door een accumulatie van ongevouwen of verkeerd gevouwen proteı̈nen in het lumen van het ER. In eerste instantie zal UPR de translatie van proteı̈nen stilleggen en chaperones aantrekken. Als de proteı̈nen niet binnen een bepaalde tijdspanne na UPR correct opgevouwen raken, resulteert de activatie van UPR in apoptose. Wat de accumulatie van ongevouwen eiwitten in het lumen van het ER veroorzaakt, is nog niet bekend (Zeng et al., 2015; Horrix et al., 2011). Bij onderzoek naar apoptose veroorzaakt door de A-keten van ricine, bleek dat apoptose onafhankelijk was van de inhibitie van de proteı̈nesynthese. Apoptose werd gelinkt aan een structureel motief in de RIP molecule gelegen buiten de katalytische site (Stirpe and Battelli, 2006; Das et al., 2012). 8 2.3 Biotechnologische toepassingen 2.3 2.3.1 9 Biotechnologische toepassingen Biomedische toepassingen De meeste onderzoeken omtrent RIPs focussen op het structureel veranderen van RIPs zodat ze selectief hun cytotoxische activiteit kunnen uitoefenen op cellen die geëlimineerd moeten worden (Stirpe, 2013). Er werd ontdekt dat abrine en ricine meer toxisch zijn tegen tumorcellen dan tegen normale cellen. Hierdoor kunnen RIPs interessante proteı̈nen zijn voor gebruik in kankertherapieën (Lin et al., 1970; ; Zeng et al., 2015). Ook onderzoek naar RIPs in de behandeling van HIV en immunologische aandoeningen worden momenteel onderzocht (Vago, 2015). Ook in neurologisch onderzoek worden RIPs gebruikt (Stirpe and Battelli, 2006; Kaur et al., 2013). 2.3.1.1 Immunotoxines en andere conjugaten RIPs kunnen als fusieproteı̈ne gelinkt worden met verschillende moleculen om specifiek met bepaalde oppervlaktemoleculen te kunnen interageren (Gilabert-Oriol et al., 2014). Wanneer een fusie gebeurt met antilichamen, worden dit immunotoxines genoemd. Daarnaast kan de koppeling ook gebeuren met groeifactoren, hormonen en lectines. Dit wordt echter in mindere mate toegepast (Stirpe and Battelli, 2006). Immunotoxines bestaan uit een antilichaam gedeelte en een RIP gedeelte (figuur 2.5). Het antilichaam bindt met een specifieke molecule op het oppervlak van een bepaald celtype. Belangrijk hierbij is dat het antigen waarmee het antilichaam reageert exclusief gevonden wordt op tumorcellen. Tumor-specifieke antigenen zijn echter zeldzaam. Daarom wordt gebruik gemaakt van antigenen of receptoren die significant tot overexpressie worden gebracht op het oppervlak van de tumorcel (de Virgilio et al., 2010). Het RIP gedeelte is minstens even belangrijk en staat in voor het afdoden van die specifieke cel (Stirpe and Battelli, 2006). Voor immunotoxines worden enkel type 1 RIPs of de geı̈soleerde A-keten van type 2 RIPs gebruikt. Dit aangezien het volledige type 2 RIP met zijn lectine domein zo goed als ieder celtype kan binden en doden (Gilabert-Oriol et al., 2014; Stirpe, 2013). Figuur 2.5: Schematische voorstelling van een immunotoxine (de Virgilio et al., 2010) 9 2.3 Biotechnologische toepassingen 10 Saporine, gelonine en de A-keten van ricine werden reeds gekoppeld met antilichamen ter vorming van een immunotoxine. Deze complexen vertoonden zeer hoge in vitro specificiteit tegenover verschillende types kankercellen en tijdens preklinische evaluaties (Gilabert-Oriol et al., 2014). Het grootste probleem bij deze immunotoxines is dat ze als vreemd worden ervaren door het lichaam en een immunologische respons (antitherapeutic protein antibody response) door het lichaam kunnen ontlokken (Stirpe and Lappi, 2014; Mazor et al., 2016). Hierdoor kan hetzelfde immunotoxine geen tweede maal worden toegediend (Stirpe and Lappi, 2014). Dit probleem kan op drie verschillende manieren worden omzeild. Ten eerste kan gebruik gemaakt worden van menselijke of gehumaniseerde antilichamen. Hierdoor wordt de immunologische respons gereduceerd. Het RIP kan eveneens gepegyleerd worden of bepaalde epitopen kunnen verwijderd worden (Zeng et al., 2015; Stirpe, 2013; de Virgilio et al., 2010). Ten tweede kan het immunotoxine op zo0 n manier toegediend worden dat nooit contact met het immuunsysteem optreedt. Dit kan door het immunotoxine rechtstreeks in het tumorweefsel te injecteren (Stirpe, 2013; Mazor et al., 2016). Een derde mogelijkheid is ervoor te zorgen dat met slechts één toediening het gewenste resultaat wordt behaald (Stirpe, 2013; de Virgilio et al., 2010). Ook in neurologisch onderzoek worden immunotoxines vaak gebruikt. Bij molecular neurosurgery wordt een bepaald neuron vernietigd aan de hand van een op een RIP gebaseerd neurotoxine en wordt door het wegvallen van bepaalde functies afgeleid wat de functie van het vernietigd neuron was. Het eerst gebruikte immunotoxine in neurologisch onderzoek was 192 IgG-ricine A-keten. Dit toxine was werkzaam in vitro, maar niet in vivo (Wiley and Kline, 2000). Daarnaast worden immunotoxines toegepast voor de behandeling van immunologische aandoeningen. In deze discipline zijn ze interessant vanwege 3 redenen. Ten eerste zijn macrofagen gevoeliger voor RIPs dan andere cellen. Dit toont aan dat immunotoxines kunnen gebruikt worden bij de behandeling van immunologische aandoeningen die sterke ontstekingsreacties veroorzaken. Een CD64-ricine A-keten immunotoxine werd gebruikt om macrofagen selectief te elimineren bij rheumatoı̈de arthritis patiënten (van Roon et al., 2003). Daarnaast kunnen immunotoxines ook gebruikt worden bij auto-immuunziektes. Daarbij wordt een immunotoxine gebruikt dat bestaat uit een RIP gedeelte en het self antigen als antilichaam gedeelte. Op deze manier worden antigenpresenterende cellen (APC) die fungeren in de ontwikkeling van de ziekte, afgedood. Voor patiënten met rheumatoı̈de arthritis kan een anti-CD5-ricine A-keten immunotoxine gebruikt worden als behandeling. 50% van de patiënten reageerde goed op deze behandeling en daarvan ondervond 20 tot 40% een verlengde periode van remissie tot 1 jaar lang (Endressen et al., 2013). Als laatste kunnen immunotoxines gebaseerd op saporine gebruikt worden als immunosuppressief agens bij de behandeling van afweerreacties na orgaan- of beenmergtransplantaties (Cobb and LeMaistre, 1992; Endressen et al., 2013).Normaal wordt hier gebruik gemaakt van anti-thymocyt globulines (ATG) bestaande uit een mix van polyklonale antilichamen. De efficiëntie van de immuuntherapie wordt versterkt door een conjugaat te vormen met saporine-S6 (Polito et al., 2009). 10 2.3 Biotechnologische toepassingen 2.3.1.2 11 Antivirale therapieën Sommige type 1 RIPs bezitten antivirale eigenschappen tegenover dierlijke of menselijke virussen. In de literatuur werd reeds beschreven dat sommige RIPs activiteit vertonen tegenover het influenza virus en HIV. Trichosanthine en PAP werden onderzocht als AIDS therapie. Hoewel RIPs in staat zijn de replicatie van het HIV virus te inhiberen, gaven klinische studies zeer teleurstellende resultaten (de Virgilio et al., 2010; Kaur et al., 2013). Het RIP proteı̈ne veroorzaakte immunologische reacties in het lichaam en in sommige gevallen werden neurologische, mentale of allergische reacties versterkt (Stirpe and Battelli, 2006). Balsamine is een type 1 RIP afkomstig uit Momordica balsamina. Balsamine kan de replicatie van HIV tegenhouden in T cellen en primaire CD4+ T cellen. Ook is dit RIP in staat de replicatie van het influenzavirus te inhiberen. Het exacte mechanisme van de antivirale activiteit is nog onbekend (Kaur et al., 2013). Sommige type 1 RIPs waaronder trichosanthine vertonen een inhiberende activiteit ten opzichte van HIV integrase (Citores et al., 2013). 2.3.1.3 Antitumorale therapieën Veel kankercellen zijn immortaal en zullen moeilijk gedood worden door apoptose via caspases of serine proteases. Wel kunnen ze gevoelig zijn voor apoptose via de redoxregulatie van thiol-groepen van eiwitten of apoptose via de tumor-necrosis-factor-α pathway (TNF) (Nielsen and Boston, 2001). Immunotoxines kunnen gebruikt worden als antitumorale therapie omdat ze door aanwezigheid van het antilichaam specifiek op kankercellen kunnen inwerken. Immunotoxines werden reeds succesvol gebruikt voor de behandeling van verschillende types leukemie en lymfoma. Sommige type 1 RIPs werden reeds toegepast voor de behandeling van borstkanker, hepatoma en andere kankers (figuur 2.6) (Zeng et al., 2015). RIPs op zich, niet onder de vorm van een immunotoxine, kunnen als antitumoraal middel gebruikt worden. Een voorbeeld daarvan is riproximine, een toxisch type 2 RIP (Adwan et al., 2014). Het is mogelijk dat RIPs meer toxisch zijn tegenover tumorale cellen doordat deze cellen aan een hogere snelheid proteı̈nen synthetiseren (Yamasaki et al., 2004). 11 2.3 Biotechnologische toepassingen 12 Figuur 2.6: Het verschil in opname tussen een RIP (type 1 of type 2) en een immunotoxine (Zeng et al., 2015) 2.3.2 Gewasbescherming RIPs worden gelinkt aan plant defensiesystemen. Ze vertonen antivirale, antifungale en insecticidale activiteiten. Deze eigenschappen gelden niet algemeen voor alle RIPs. RIPs spelen geen essentiële rol in planten aangezien hun genen niet in alle planten species voorkomen (Nielsen and Boston, 2001). 2.3.2.1 Antibacteriële activiteit Vivanco et al. onderzochten twee type 1 RIPs, ME1 en ME2, uit Mirabilis expansa. Beide proteı̈nen hebben een grootte van ongeveer 27 kD. Na sequeneren van hun gensequentie vertonen ze overeenkomst met geconserveerde regio0 s karakteristiek voor RIPs en zijn ze in staat gist 26S rRNA te depurineren. Tijdens een bioassay op deze twee type 1 RIPs werd ontdekt dat ze antibacteriële activiteit vertonen tegen zeer kleine hoeveelheden van zowel pathogene als niet-pathogene bacteriën uit de bodem. Hiervoor werd een inhibitie-halo plaattechniek gebruikt (Vivanco et al., 1999). In een andere studie werd het effect van α-momorcharine (α-MC) op E. coli, S. aureus, P. aeruginosa en B. subtilis getest. Een oplossing van 2 µl (1, 0 − 2, 0 × 10−5 ) α-MC werd toegevoegd aan platen begroeid met de vier eerder genoemde bacteriële stammen. Na 12 uur incubatie bij 37 ◦ C werden de kolonievormende eenheden (CFU) geteld. α-MC bleek actief tegen P. aeruginosa en had weinig effect op E. coli, S. aureus en B. subtilis (Wang et al., 2012). 12 2.3 Biotechnologische toepassingen 2.3.2.2 13 Antifungale activiteit Dezelfde type 1 RIPs als hierboven vermeld, vertoonden activiteit tegen zowel pathogene als niet-pathogene fungi, waaronder Fusarium en Trichoderma species (Vivanco et al., 1999). Soms werkt een type 1 RIP enkel tegen een specifieke species binnen één genus (Nielsen and Boston, 2001). Tabaksplanten die RIPs uit gerst tot overexpressie brachten vertoonden een verhoogde resistentie tegen infecties met Rhizoctonia solani. De planten werden niet beschadigd door de schimmel (Stirpe, 2013). 2.3.2.3 Antivirale activiteit Voor verschillende RIPs werd aangetoond dat ze antivirale activiteit bezitten tegen dierlijke en plantvirussen. PAP, een type 1 RIP is één van de meest effectieve antivirale RIPs. De antivirale activiteit is onafhankelijk van de identiteit van het virus. Zo beschermt PAP planten tegen zowel RNA als DNA virussen en voorkomt het de replicatie van onder andere poliovirus, cytomegalovirus, influenzavirus, herpes simplex virus en HIV in menselijke cellen (Hartley et al., 1996). Type 2 RIPs worden in tegenstelling tot type 1 RIPs niet vaak in verband gebracht met antivirale eigenschappen. Toch zijn er ook type 2 RIPs zoals het Sambucus nigra (SNA-I0 ) die een antivirale werking hebben. Daarnaast hebben ook abrine, ricine en moddecine antivirale eigenschappen (Chen et al., 2002). Het mechanisme achter de antivirale activiteit is nog niet bekend (Nielsen and Boston, 2001). Vanwege hun enzymatische activiteit wordt verwacht dat RIPs als suicidal agents fungeren die vrijgesteld worden uit compartimenten van de cel na infectie van de plant door een virus (de Virgilio et al., 2010; Stirpe and Lappi, 2014). Daarbij worden de ribosomen geı̈nactiveerd en wordt virale replicatie verhinderd (Stirpe and Lappi, 2014). Recent onderzoek geeft aan dat de antivirale activiteit niet alleen gebaseerd is op inactivatie van de ribosomen door depurinatie. PAP bijvoorbeeld is in staat om de translatie van mRNA met een 50 cap te inhiberen zonder de ribosomen te inactiveren. Hierbij is de depurinatie activiteit niet vereist, de N-glycosidase activiteit echter wel. Ook heel wat virussen zonder 50 cap kunnen door PAP geı̈nhibeerd worden (Stirpe and Lappi, 2014, Nielsen and Boston, 2001). 2.3.2.4 Anti-Insect activiteit Sommige type 1 en type 2 RIPs zijn in staat de plant te verdedigen tegen insecten. Wanneer een insect van een plant eet, neemt ze RIPs op, waarna deze ter hoogte van het gastro-intestinale kanaal komen (Nielsen and Boston, 2001). Hoe beter de proteı̈nen gehydrolyseerd kunnen worden door de aanwezige cellen, hoe minder schadelijk de RIPs zijn voor het insect (Stirpe and Lappi, 2014). Planten die RIPs produceren die voor insecten zeer toxisch zijn zoals saporine en ricine, beschermen daarmee zichzelf tegen insecten (Nielsen and Boston, 2001). In een tweede studie werden tijdens bioassays twee Coleopteran species blootgesteld aan ricine en saporine. Daarbij werd bij de Coleopteran species extreme toxiciteit gedetecteerd. Bij Lepidoptera species werden dezelfde bioassays uitgevoerd en geen enkel effect waargenomen. Wanneer de RIPs ter hoogte van de maag van het insect konden gehydrolyseerd worden, was de toxiciteit voor het insect lager (Nielsen and Boston, 2001). 13 2.4 Onderzochte RIPs 2.3.2.5 14 Bescherming tegen abiotische stress Ook bij blootstelling aan abiotische stressfactoren, produceert een plant hogere hoeveelheden van bepaalde RIPs. Wanneer planten behandeld worden met jasmonaat of abscisinezuur (ABA) worden RIPs tot expressie gebracht (Stirpe, 2013). In aanwezigheid van jasmijnzuur wordt JIP60, een type 3 RIP uit gerst, opgereguleerd. De hogere expressie van dit RIP is niet enkel het gevolg van het jasmijnzuur, ook osmotische stress en droogte induceren de toename in expressie. Ook PAP (Pokeweed Antiviral Protein) in Phytolacca americana (Westerse karmozijnbes of pokeweed) werd meer tot expressie gebracht onder invloed van koude en warmte schok. Een RIP van de ijsplant Mesembryanthemum crystallinum wordt pas sterk tot expressie gebracht bij zoutstress (Nielsen and Boston, 2001). Het rijstgenoom bevat 31 genen coderend voor type 1 RIPs die gekenmerkt worden door verschillende expressieniveau0 s en dit in verschillende onderdelen van de rijstplant. Wanneer de rijstplant wordt blootgesteld aan infecties, planthormonen, koude of een hoog zoutgehalte, wordt de expressie van verschillende van deze RIPs verhoogd. Zo werd bij 3 van de 31 type 1 RIPs een significant verhoogde expressie waargenomen bij blootstelling aan abscisinezuur (Jiang et al., 2008). In een tweede studie werd het gen voor één van deze genen, nl. OSRIP18, ectopisch tot overexpressie gebracht. Overexpressie van dit gen veroorzaakte een toegenomen zout- en droogtetolerantie, zonder veranderingen aan het uitzicht van de plant (Jiang et al., 2012). Het mechanisme hierachter is nog niet gekend, maar de onderzoekers formuleerden wel enkele mogelijke hypothesen. Een eerste mogelijkheid is dat een reorganisatie van het eiwitmetabolisme heeft plaatsgevonden doordat de RIPs de translatie inhiberen. Een andere mogelijkheid is een andere enzymatische eigenschap van RIPs, de superoxide dismutase activiteit. Bij sommige stressomstandigheden, zoals koude, zout en droogte, treedt een accumulatie van reactieve zuurstof species op (Huang et al., 2012). De superoxide dismutase activiteit kan de schade hierdoor veroorzaakt, reduceren (Foyer and Noctor, 2005; Jiang et al., 2012). Het is evenwel nog onzeker of deze superoxide dismutase activiteit effectief een eigenschap van RIPs is. In de literatuur wordt vaak vermeld dat deze eigenschap veroorzaakt wordt door de aanwezigheid van contaminanten (Jiang et al., 2012; Van Damme et al., 2001). 2.4 2.4.1 Onderzochte RIPs RIP-M41 Het RIP-M41 gen uit rijst (Oryza sativa) codeert voor een mogelijk type 3 RIP (Stirpe and Lappi, 2014). RIP-M41 bevat één domein dat sterke homologie vertoont met RIPs en één domein dat homoloog is aan de M41-peptidasen. Proteı̈nen die behoren tot de M41-peptidasen zijn metalloproteasen. Het best gekarakteriseerde M41 protease is FtsH. Deze groep proteasen is een essentieel ATP-afhankelijk zink metalloprotease dat oplosbare en integrale membraanproteı̈nen knipt (Universität Duisburg-Essen, 2013). 14 2.4 Onderzochte RIPs 2.4.2 15 OSRIP1 OSRIP1 is een type 1 RIP uit rijst (Oryza sativa). Het proteı̈ne wordt gesynthetiseerd zonder signaalpeptide en is dus hoogstwaarschijnlijk actief in het cytoplasma. Een typische actieve site (YYERW) voor RIPs is aanwezig. Door infectie met Magnaporthe grisea en Blumeria graminis wordt OSRIP1 opgereguleerd. Ook abscisinezuur en jasmijnzuur beı̈nvloeden de expresie van OSRIP1. Hieruit blijkt dat het proteı̈ne mogelijk een rol speelt in de stressrespons van planten. In deze thesis werden de proteı̈nen RIP-M41 en OSRIP1 heteroloog tot expressie gebracht in E. coli. Hierna werden beide proteı̈nen opgezuiverd en werd hun activiteit door middel van een RIP assay bepaald. In een tweede deel werd de lokalisatie van OSRIP1 bestudeerd. De lokalisatie van een eiwit kan een indicatie geven omtrent de mogelijke fysiologische rol van het proteı̈ne. Als laatste werden ook constructen aangemaakt ter controle van mogelijke toxische effecten van OSRIP1 ter hoogte van de plant. 15 MATERIAAL EN METHODEN 16 3 Materiaal en methoden 3.1 3.1.1 Algemene moleculaire technieken Polymerase Chain Reaction (PCR) Tijdens een Polymerase Chain Reaction wordt een specifiek DNA fragment geamplificeerd. Doordat slechts een kleine hoeveelheid template DNA vereist is voor het uitvoeren van een PCR, is dit een zeer gevoelige assay. Naast template DNA worden primers, nucleotiden (dNTPs) en DNA polymerase toegevoegd. Het polymerase is het enzym dat de verschillende aangevoerde nucleotiden aan elkaar rijgt en zo het PCR product vormt. De primers zorgen voor de specificiteit van de PCR reactie. Ze hebben een korte specifieke sequentie die complementair is met de uiteinden van het DNA fragment dat geamplificeerd moet worden. Daarnaast vormen zij de startplaats van de amplificatie (Garibyan and Avashia, 2013). 3.1.1.1 Taq PCR/Pfx PCR Een standaard PCR-programma wordt weergegeven in tabel 3.1. Er kan gebruik gemaakt worden van een Taq polymerase (72 ◦ C) of een Pfx polymerase (68 ◦ C). Het Taq polymerase heeft geen proofreading activiteit. Dit betekent dat tijdens het amplificeren een reële kans bestaat op het verkeerd inbouwen van basen in het PCR product. Er wordt voor het Taq polymerase gekozen als geen 100% correcte sequentie vereist is. Het Pfx polymerase heeft wel een proofreading activiteit en garandeert een betere sequentie van het PCR product. Enzymen zonder proofreading activiteit maken tot 10x meer fouten dan enzymen met proofreading activiteit (Gury et al., 2008). Tabel 3.1: Een standaard PCR programma Stap Tijd Temperatuur Aantal cycli Initiële denaturatie Denaturatie Annealing Extensie Finale extensie 2 minuten 15 seconden 30 seconden A 5 minuten ∞ 94 ◦ C 94 ◦ C B ◦ 68 C/72 ◦ C 68 ◦ C/72 ◦ C 4 − 12 ◦ C 1 n n n 1 In de tabel zijn de waarden voor A, B en n afhankelijk van het te amplificeren fragment. De extensietijd (A) is afhankelijk van de lengte van het te amplificeren DNA fragment (Yu and Pauls, 1992). Hiervoor wordt een vuistregel gehanteerd: ongeveer 1 minuut per 1000 basenparen. Bij een niet-optimale annealingstemperatuur (B) zullen niet-specifieke PCR producten gevormd worden (Rychlik et al., 1990). Het aantal cycli (n) hangt af van de gewenste hoeveelheid PCR product. Allereerst wordt een mastermix samengesteld (tabel 3.2). Daaraan wordt het template DNA toegevoegd. Dit 16 3.1 Algemene moleculaire technieken 17 geheel wordt in een PCR toestel (Labocycler (SensoQuest GmbH) of T100 thermal cycler (Bio-rad)) geplaatst. Tijdens de initiële denaturatiestap wordt alle DNA enkelstrengig gemaakt. Hierna begint de eerste cyclus. Tijdens zo0 n cyclus wordt alle DNA gedenatureerd, worden de primers gebonden (annealing) en treedt een verlenging (extensie) op ter hoogte van de primers ter vorming van het amplificatieproduct. De verlenging zelf wordt bewerkstelligd door het polymerase. Deze drie stappen worden n keer doorlopen waarna een finale extensiestap ervoor zorgt dat alle niet volledig geamplificeerde fragmenten vervolledigd worden. De reactie wordt bewaard bij 4 − 12 ◦ C zodat het DNA niet degradeert. Tabel 3.2: De samenstelling van de mastermix voor Pfx PCR en Taq PCR Product Pfx PCR (µl) Taq PCR (µl) dNTPs (10 mM) (Invitrogen) RxN buffer (10x) (Invitrogen) 10x Extra Buffer MgCl2 (50 mM) Forward primer (5 µM) Reverse primer (5 µM) Polymerase (5 U/µl) Milli-Q (H2 O) Template DNA 2,0 2,5 / 0,75 1,0 1,0 0,125 (Invitrogen) 17,625-x x 2,0 / 2,5 / 1,0 1,0 0,125 (VWR) 18,375-x x In tabel 3.2 zijn de essentiële componenten van de mastermix opgenomen. De buffer (en het MgCl2 ) creëren een optimale omgeving voor het polymerase. De nucleotiden (dNTPs), zijnde dGTP, dATP, dCTP en dTTP, zijn de bouwstenen voor de aanmaak van het PCR product. De primers vormen het startpunt voor de extensie. 3.1.1.2 Kolonie PCR Een kolonie PCR is een high-throughput methode om de aan- of afwezigheid van een insert in een plasmide in een bacterie te controleren. Tijdens een hittestap wordt het plasmide DNA vrijgegeven uit de bacteriële cel, waarna het als template dient voor de PCR reactie. Zo’n PCR wordt uitgevoerd op individuele kolonies opgepikt van een vast medium. De bacteriën worden geresuspendeerd in 5 µl bidest. Het geheel wordt gedurende 10 minuten opgekookt om de cellen te vernietigen, waarna hiervan 2 µl als template wordt gebruikt. Dezelfde mastermix wordt gebruikt als bij een Taq PCR (tabel 3.2). In sommige gevallen worden aan de PCR enhancing agents toegevoegd: N,N,N-trimethylglycine(1M) (betaı̈ne) en dimethylsulfoxide (50%) (DMSO). Beide componenten verhogen de specificiteit en de opbrengst tijdens de PCR reactie (Kang et al., 2005). Zowel betaı̈ne als DMSO zorgen voor een betere separatie van de strengen. DMSO verbreekt de baseparing. Betaı̈ne is een isostabiliserend agens. Dit betekent dat A-T en G-C baseparing even stabiel wordt en de smelttemperatuur van DNA onafhankelijk wordt van de baseparen in het DNA (Rees et al., 1993). 17 3.1 Algemene moleculaire technieken 3.1.1.3 18 Q5 PCR Een ander type PCR is de Q5 PCR. Deze PCR maakt gebruik van het Q5 polymerase (NEB) en wordt toegepast voor moeilijk te amplificeren amplicons of wanneer een lage foutenlast gewenst is. De samenstelling van deze mastermix wordt weergegeven in tabel 3.3. Aan de mix wordt 1 ng template DNA toegevoegd (New England Biolabs, 2015a). Tabel 3.3: De samenstelling van de mastermix voor Q5 PCR en Taq PCR (New England Biolabs, 2015a) 3.1.2 Product Q5 PCR (µl) dNTPs (2 mM) (Invitrogen) 5X Q5 reactiebuffer (neb) Forward primer (5 µM) Reverse primer (5 µM) Q5 Polymerase (2 U/µl) 5x Q5 High GC Enhancer Milli-Q (H2 O) Template DNA 5,0 10 5,0 5,0 0,5 (NEB) 10 14,5-x x (∼ 1 ng) Agarose gelelektroforese Tijdens een gelelektroforese wordt DNA gescheiden op basis van zijn grootte (Garibyan and Avashia, 2013; Bjornsti and Megonigal, 1999). DNA heeft door de aanwezigheid van fosfaatgroepen een negatieve lading. Deze lading is proportioneel ten opzichte van de grootte van het DNA fragment (Bjornsti and Megonigal, 1999). Het DNA wordt in een agarosegel gebracht en beweegt onder invloed van een elektrisch veld naar de positieve elektrode toe. Afhankelijk van de grootte van het DNA fragment zal dit fragment meer of minder weerstand ondervinden tijdens het migreren door de agarosegel. Hierdoor zullen de grootste fragmenten trager migreren in vergelijking met de kleinere fragmenten (Lodish et al., 2008). Afhankelijk van de concentratie agarose in de gel, kan de resolutie van de scheiding verschillen (Lodish et al., 2008). In deze thesis wordt gewerkt met 1,5% agarose gels. 4,5 gram agarose (Invitrogen) wordt opgelost in 300 ml 0,5x TAE buffer (0,02 M Tris-HCl, 0,0005 M EDTA (pH 8, VWR), 0,057% watervrij azijnzuur (VWR), H2 O). Dit mengsel wordt opgekookt en bewaard bij 60 ◦ C. Per laantje van de gel wordt telkens 5 µl DNA met 1,6 µl 6x Massloader DNA Loading Dye (Thermo Scientific) gebracht. Per gel wordt 1 laantje gereserveerd voor een DNA merker (Massruler Low Range DNA Ladder (Thermo Scientific) voor fragmenten tot 1000 baseparen of Massruler DNA Ladder Mix (Thermo Scientific) voor fragmenten tot 10.000 baseparen). De elektroforese wordt gelopen bij 100 V gedurende 30 minuten. Hierna wordt de gel behandeld met een ethidiumbromide-oplossing (MP biomedicals). Ethidiumbromide is in staat te intercaleren tussen de basen van het DNA. Met behulp van UV licht kan op die manier het DNA gevisualiseerd worden (Sigmon and Larcom, 1996). 18 3.1 Algemene moleculaire technieken 3.1.3 3.1.3.1 19 Opzuiveren PCR product Innuprep PCR Pure Kit Het eindproduct van bovenstaande PCR assays kan opgezuiverd worden aan de hand van de Innuprep PCR Pure Kit (Analytic jena). 500 µl bindingsbuffer wordt op een spin filter gebracht. Het PCR product wordt gemengd met deze bindingsbuffer door op-en-neer te pipetteren. Er wordt 2 minuten gecentrifugeerd bij 12.000 rpm. Hierna wordt de spin filter in een 1,5 ml epje geplaatst en wordt geëlueerd. Het opgezuiverde product wordt geëlueerd in 20 µl Milli-Q en de concentratie wordt bepaald aan de hand van de Nanodrop 1000 (3.4.1.1). 3.1.3.2 QIAquick Gel Extraction Kit Een DNA fragment kan geëxtraheerd en opgezuiverd worden uit een agarosegel door middel van de QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Allereerst wordt het DNA fragment onder UV licht met een scalpel uit de gel gesneden. Het stukje gel wordt in een 2 ml epje gebracht en afgewogen. Voor het vervolg van het protocl wordt 100 mg gel gelijkgesteld aan 100 µl van de verschillende buffers (Qiagen, 2001). Aan 1 volume gel worden 3 volumes QG buffer toegevoegd. Dit geheel wordt gedurende 10 minuten geı̈ncubeerd bij 50◦ C tot het stukje gel opgelost is in de buffer. Na incubatie moet de kleur van de buffer nog steeds geel zijn, overeenkomstig met een pH ≤7,5. Enkel bij deze pH-waarden gebeurt de adsorptie van het DNA op het QIAquick membraan voldoende efficiënt. Wanneer de pH toeneemt, wordt de oplossing oranje of violet en moet 10 µl 3M natriumacetaat (pH 5) toegevoegd worden (Qiagen, 2001). Eén gelvolume isopropanol wordt toegevoegd aan het 2 ml epje. Deze stap verhoogt de opbrengst aan DNA fragmenten uit de geëxtraheerde gel. Vervolgens wordt het staal per 800 µl op een QIAquick spin kolom gebracht en gedurende 1 minuut gecentrifugeerd bij 13.000 rpm. Dit wordt herhaald tot de volledige inhoud van het 2 ml epje over de kolom werd gestuurd. Hierna wordt 500 µl QG buffer op de kolom gebracht en gedurende 1 minuut gecentrifugeerd (13.000 rpm). Tijdens deze stap worden alle restanten van de agarosegel weggewassen van de kolom. Om de DNA op de kolom te wassen wordt 750 µl PE buffer toegevoegd, waarna de kolom gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur geplaatst wordt en opnieuw 1 minuut gecentrifugeerd wordt (13.000 rpm). Hierna wordt de kolom in lege toestand nog 1 minuut gecentrifugeerd bij 13.000 rpm. Daarbij worden alle restanten ethanol afkomstig van de PE buffer verwijderd van de kolom. Vervolgens wordt de kolom in een nieuw 1,5 ml epje geplaatst om het DNA van de kolom te elueren. Dit gebeurt in twee stappen. Tijdens een eerste stap wordt 20 µl elutiebuffer op de kolom gebracht. Dit geheel wordt 1 minuut bij kamertemperatuur geplaatst en daarna 1 minuut gecentrifugeerd bij 13.000 rpm. Tijdens de tweede stap wordt slechts 10 µl elutiebuffer op dezelfde kolom gebracht en opnieuw 1 minuut bij kamertemperatuur geplaatst, waarna 1 minuut gecentrifugeerd wordt (13.000 rpm). Hierna bevindt het geëlueerde DNA zich in 30 µl elutiebuffer en kan de concentratie bepaald worden aan de hand van de Nanodrop 1000 (3.4.1.1) (Qiagen, 2001). 19 3.2 Heterologe Expressie in E. coli 3.2 3.2.1 20 Heterologe Expressie in E. coli Heat Shock transformatie Aan de hand van een hitteschok kunnen E. coli heat-shock competente cellen DNA opnemen. Hierbij wordt 40 µl cellen samengebracht met 4 µl plasmide DNA (10 ng/µl). Dit mengsel wordt 30 minuten op ijs geplaatst. Hierna wordt het epje gedurende 42 seconden bij 42 ◦ C gebracht. Na deze hittestap wordt het epje 2 minuten op ijs geplaatst. Aan de cellen wordt nu 500 µl vloeibaar LB medium toegevoegd (1% (m/v) tryptone (UCB), 0,5% (m/v) yeast extract (Merck) en 0,17 M NaCl) en geı̈ncubeerd bij 37 ◦ C, 185 rpm gedurende 1 uur. Hierna wordt een deel van de cellen uitgeplaat op vast, selectief LB medium met een antibioticum als selectiemerker. Deze platen worden overnacht bij 37 ◦ C geplaatst. 3.2.2 Gibson Assembly Tijdens een Gibson assembly reactie worden twee DNA fragmenten aan elkaar gekoppeld (figuur 3.1). Een 5’ exonuclease, een DNA polymerase en een DNA ligase werken samen om verschillende overlappende DNA molecules in één reactie samen te zetten. DNA fragmenten met single-stranded overlappende eindjes ondergaan annealing. Het 5’ exonuclease knipt aan het 5’ uiteinde van de DNA fragmenten basen weg, zodat 3’ single-stranded regio’s gecreërd worden. Dit vereenvoudigd de annealing van de fragmenten ter hoogte van de overlappende complementaire delen. Hierna verlengt het polymerase de 3’ uiteinden en sluit het DNA ligase de opening tussen de 3’ eindjes en de reeds aanwezige 5’ uiteinden van de DNA fragmenten. De techniek kan gebruikt worden voor het kloneren van een insert in een vector of meerdere inserts in een vector, het combineren van verschillende DNA fragmenten, . . . In vergelijking met traditioneel kloneren is deze methode sneller en efficiënter (Gibson et al., 2009). Er wordt vertrokken van opgezuiverd PCR product (3.3). Telkens wordt 100 ng DNA (een gelineariseerde vector) samengebracht met een equimolaire hoeveelheid insert en 15 µl Gibson assembly mix (26,7% ISObuffer (0,5 M Tris-HCl pH 7,5, 0,05 M MgCl2 , 4 mM dNTPs (Westburg), 0,05 M DTT (Sigma Aldrich) en 5 mM NAD (Sigma Aldrich)), 0,053% T5 exonuclease (10 000 U/ml) (NEB), 1,67% Q5 High fidelity polymerase (10 000 U/ml) (NEB) en 13,3% Taq DNA ligase (40 000 U/ml) (NEB)). Dit geheel wordt gedurende 1 uur bij 50 ◦ C geı̈ncubeerd. 20 3.2 Heterologe Expressie in E. coli 21 Figuur 3.1: Overzicht van de Gibson assembly methode (New England Biolabs, 2015b) 3.2.3 Suspensieculturen van E. coli Aan de hand van E. coli kolonies kunnen suspensieculturen worden aangemaakt. Een kolonie wordt opgepikt van vast LB medium en geresuspendeerd in 5 ml vloeibaar LB medium (met een antibioticum voor selectie). Deze culturen worden overnacht bij 37 ◦ C en 185 rpm geplaatst om groei te stimuleren. 3.2.4 Glycerolstock Voor een glycerolstock wordt 400 µl glycerol (100%) samengevoegd met 800 µl suspensiecultuur in een cryovial (Greiner Bio-One). Glycerolstocks worden bewaard bij −80 ◦ C. 3.2.5 Opzuiveren van plasmide DNA De GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo Scientific) wordt gebruikt om plasmide DNA op te zuiveren uit bacteriële cellen. De 5 ml suspensiecultuur (3.4.4) wordt per 2 ml geoogst. Dit betekent dat 2 ml overgebracht wordt in een 2 ml epje en gecentrifugeerd wordt bij 8000 rpm gedurende 2 minuten. Dit wordt herhaald tot de volledige suspensiecultuur werd geoogst. Het supernatans wordt telkens verwijderd. Hierna wordt de pellet geresuspendeerd in 250 µl resuspensie oplossing. Daarna wordt 250 µl lyse oplossing toegevoegd om de cellen te lyseren. Het epje wordt 6 maal geı̈nverteerd. Als laatste wordt 350 µl neutralisatie oplossing toegevoegd. Opnieuw wordt het epje 6 maal geı̈nverteerd. Dit geheel wordt gecentrifugeerd gedurende 5 minuten bij 13.000 rpm. Hierbij 21 3.2 Heterologe Expressie in E. coli 22 zal chromosomaal DNA en celmateriaal neerslaan (Thermo Fisher Scientific, 2014). Het supernatans wordt op een GeneJET spin column gebracht en 1 minuut gecentrifugeerd bij 13.000 rpm. Hierna zit het plasmide DNA gebonden op de kolom. 500 µl wasvloeistof wordt op de kolom gebracht en er wordt 1 minuut gecentrifugeerd (13.000 rpm). Deze stap wordt nogmaals herhaald. De kolom wordt in lege toestand nog één keer 1 minuut gecentrifugeerd bij 13.000 rpm om restjes ethanol van de kolom te verwijderen (Thermo Fisher Scientific, 2014). De kolom wordt in een vers 1,5 ml epje geplaatst. Er wordt in twee stappen geëlueerd (Thermo Fisher Scientific, 2014). Eerst wordt 20 µl bidest op de kolom gebracht. Dit wordt 2 minuten geı̈ncubeerd bij kamertemperatuur waarna 2 minuten wordt gecentrifugeerd bij 13.000 rpm. Dit wordt herhaald met 10 µl bidest zodat het plasmide DNA opgelost zit in een eindvolume van 30 µl. De concentratie van het plasmide DNA wordt bepaald aan de hand van de Nanodrop 1000 (3.6.1). 3.2.6 Sequentiebepaling DNA wordt verdund tot een concentratie van 100 ng/µl. Van deze oplossing wordt 10 µl samengevoegd met 4 µl primer. Dit geheel wordt in een 1,5 ml epje opgestuurd naar LGC Genomics. Daar wordt de sequentie bepaald met behulp van de Sanger methode. 3.2.7 Eiwitexpressie in E. coli rosetta Voor de expressie van de recombinante proteı̈nen werden de constructen door middel van Gibson assembly binnengebracht in de pET-21a vector. Deze bacteriële expressievector werd ontwikkeld voor het kloneren en tot expressie brengen van recombinante proteı̈nen in E. coli. De vector draagt, naast een selectiemerker voor ampicilline en een interne His-tag (C-terminaal), een T7lac promoter. Deze wordt geactiveerd door de aanwezigheid van T7 RNA polymerase. Dit polymerase wordt geleverd door een tweede plasmide aanwezig in de host, E. coli Rosetta(DE3), dat een chromosomale kopie van het gen voor T7 RNA polymerase bevat. Deze E. coli stam draagt eveneens het lacI gen en de lacUV5 promoter. Deze promoter kan geı̈nduceerd worden door IPTG. Wanneer IPTG wordt toegevoegd aan de cultuur, wordt het T7 RNA polymerase tot expressie gebracht, wat op zijn beurt leidt tot expressie van het recombinante proteı̈ne (Novagen, 2003). Een tweede reden waarom het proteı̈ne tot expressie wordt gebracht in E. coli rosetta(DE3) is het chlooramphenicolresistent plasmide (pRARE). Dit plasmide levert tRNA’s voor codons die zelden gebruikt worden in E. coli en garandeert zo een universele translatie (Berrow et al., 2006). Onder deze codons vallen AGG, AGA en CGG voor arginine, AUA voor isoleucine, CUA voor leucine, CCC voor proline en GGA voor glycine (EMBL, 2016a). Daarnaast is de rosetta stam vrij van verschillende proteasen die het proteı̈ne tijdens de opzuivering zouden kunnen degraderen (Novagen, 2003). 3.2.7.1 Opgroeien van E. coli rosetta Aan de hand van E. coli rosetta kolonies of een glycerolstock kan een suspensiecultuur worden aangemaakt. Vijftig µl glycerolstock of een kolonie wordt opgepikt van vast LB medium en geresuspendeerd in 5 ml vloeibaar LB me- 22 3.3 Opzuivering van eiwit uit E. coli rosetta 23 dium met 5 µl ampicilline (AMP) (100 mg/ml) en 5 µl chlooramfenicol (CAM) (100 mg/ml) (Duchefa). Deze cultuur wordt overnacht bij 37 ◦ C en 185 rpm geplaatst om te groeien. De volledige 5 ml cultuur wordt overgezet naar een 1 l erlenmeyer met 300 ml LB medium, 240 µl carbenicilline (CARB) (250 mg/ml) en 300 µl chlooramfenicol (100 mg/ml). Deze cultuur wordt gegroeid bij 37 ◦ C en 185 rpm tot een OD waarde van 0,5-0,6 wordt gemeten bij 600 nm. Dit vormt het tijdstip voor inductie met 0,2 mM IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) (Sigma Aldrich). Na induceren worden de suspensieculturen 48 uur bij 16 ◦ C en 185 rpm geplaatst. Deze volledige cultuur wordt geoogst door centrifugatie gedurende 15 minuten bij 8000 rpm. De verkregen pellet wordt ingevroren bij −20 ◦ C. 3.3 Opzuivering van eiwit uit E. coli rosetta De opzuivering gebeurt aan de hand van affiniteitschromatografie (Ni-NTA agarose beads) (Molecular Cloning Laboratories, 2015). Het geproduceerde recombinante eiwit bezit een 6x His-tag die kan interageren met de nikkelionen op de matrix. Op deze manier kan het recombinante eiwit specifiek weerhouden worden uit het eiwitmengsel (Rosano and Ceccarelli, 2014). Voor het RIP-domein van RIP-M41 en OSRIP1 worden alle stappen uitgevoerd bij 4 ◦ C om denaturatie van het eiwit te voorkomen. Bij RIP-M41 wordt gewerkt met ureum dat kristalliseert bij 4 ◦ C, daarom wordt de opzuivering hier bij kamertemperatuur uitgevoerd. 3.3.1 Lyse en Sonicatie De pellet wordt ontdooid en 10 ml lysebuffer wordt toegevoegd. De lysebuffer bestaat uit 50 mM fosfaatbuffer (PB), 500 mM NaCl en 1 mg/ml lysozyme. De pellet wordt opgelost in de lysebuffer en verdeeld over verschillende 50 ml falcons. De oplossingen worden gesoniceerd. Dit gebeurt drie maal per falcon gedurende telkens 2,5 minuten (bij 50% output). Tijdens en na het lyseren van de cellen komen proteasen vrij die het geproduceerde proteı̈ne kunnen degraderen. Omdat proteasen minder actief zijn bij lagere temperaturen worden de falcons op ijs bewaard. De totale oplossing wordt gecentrifugeerd gedurende 45 minuten bij 9000 rpm. In het supernatans bevindt zich de oplosbare fractie van eiwitten, in de pellet de onoplosbare fractie. Aangezien het RIP-M41 door E. coli in de onoplosbare fractie wordt geproduceerd, moet de pellet allereerst tweemaal gewassen worden met een PB-buffer die 500 mM NaCl, 4 M ureum en 1% triton (pH 8) bevat. Deze buffer dient om het gewenste proteı̈ne op te lossen en alle pellets te kunnen poolen. Na iedere wasstap wordt 15 minuten gecentrifugeerd bij 9000 rpm. Hierna wordt de pellet opnieuw tweemaal gewassen met een PBbuffer met dezelfde samenstelling als hiervoor, zonder de triton. Ook hier wordt na iedere wasstap 15 minuten gecentrifugeerd bij 9000 rpm om een goed contact tussen de wasbuffer en de pellet te bekomen. In een laatste stap wordt de pellet opgelost in een PB buffer met 500 mM NaCl, 8 M ureum, 10 mM β-mercaptoethanol en 10 mM imidazool. 23 3.3 Opzuivering van eiwit uit E. coli rosetta 3.3.2 24 Voorbereiden van de Ni-NTA agarose beads De Ni-NTA agarose beads worden bewaard op 20% ethanol. Vooraleer deze hars kan gebruikt worden, moet hij geëquilibreerd worden. Daarbij wordt het ethanol weggewassen door meerdere malen bidest over de kolom te sturen. Als laatste wordt de kolom gewassen met de buffer waarin het op te zuiveren eiwit werd opgelost. Dit zorgt ervoor dat de hars zich reeds kan 0 aanpassen0 aan de gebruikte buffers en pH’s. 3.3.3 Laden van de Ni-NTA agarose beads Aan het matrix-eiwitmengsel wordt 10 mM imidazool toegevoegd. Dit zorgt voor een verhoogde specificiteit bij de interactie eiwit-matrix. Dit geheel wordt op de kolom gebracht. De hars wordt gedurende minstens 30-60 minuten geı̈ncubeerd met dit mengsel om een goede binding te laten plaatsvinden tussen de His-tag en de nikkelionen. Afhankelijk of het eiwit zich in de oplosbare fractie of de onoplosbare fractie bevindt, wordt de kolom anders behandeld. 3.3.4 3.3.4.1 Wasstappen Eiwit geproduceerd in de onoplosbare fractie Wanneer eiwitten in hoge concentraties tot expressie worden gebracht in E. coli, wordt vaak waargenomen dat de eiwitten accumuleren als onoplosbare aggregaten, nl. inclusion bodies. Deze eiwitten zijn hun correcte opvouwing en bijhorende activiteit verloren (Singh and Panda, 2005). Hierdoor moet een extra stap worden uitgevoerd waarbij het eiwit heropgevouwen wordt. De pellet wordt opgelost in een sterk denaturerende oplossing zoals ureum in aanwezigheid van een reducerend agens zoals β-mercaptoethanol. De ureumbuffer verwijdert contaminanten, waaronder proteasen, die mogelijk geabsorbeerd zitten op de hydrofobe inclusion bodies. Het β-mercaptoethanol heeft als functie het klieven van de disulfidebruggen die zich tijdens de voorbereidingen ter hoogte van de cysteı̈ne residuen hebben kunnen vormen (EMBL, 2016b). Door stapsgewijs te wassen met een steeds lager wordende concentratie ureum en in aanwezigheid van β-mercaptoethanol en imidazool, wordt het eiwit heropgevouwen (Singh and Panda, 2005). De pellets opgelost in 8 M ureum worden gepoold en op een Ni-NTA agarose kolom gebracht. Het eiwit bindt ter hoogte van zijn His-tag met de nikkelionen aanwezig op de hars. Er wordt achtereenvolgens gewassen met ureumbuffers met een concentratie ureum van 8 M, 6 M, 4 M, 3 M, 2 M, 1 M en 0 M. Het eiwit wordt on column opgevouwen en kan nu geëlueerd worden. 3.3.4.2 Eiwit geproduceerd in de oplosbare fractie Bevindt het eiwit zich in de oplosbare fractie, dan heeft het eiwit zijn originele opvouwing en activiteit behouden. Dit betekent dat geen heropvouwingsstappen moeten worden uitgevoerd. De hars wordt in dit geval gewassen met 50 mM imidazool opgelost in 50 mM PB. Voor het RIP-domein van RIP-M41 wordt 500 mM NaCl toegevoegd aan deze wasbuffer. Het proteı̈ne OSRIP1 wordt in twee stappen opgezuiverd. Zo wordt tijdens de eerste opzuivering 24 3.4 Analyse van DNA en eiwit 25 geen zout toegevoegd aan de buffers. De tweede opzuivering wordt uitgevoerd met toevoeging van 500 mM NaCl aan de buffer. Deze wasstap heeft als functie het verwijderen van onzuiverheden aanwezig op de hars. 3.3.5 Elueren van de Ni-NTA agarose beads Om te elueren wordt gewerkt met hoge concentraties imidazool opgelost in 50 mM PB met 500 mM NaCl. Er wordt gekozen voor concentraties imidazool tussen 100 en 300 mM. Bij elueren van eiwit uit de onoplosbare fractie wordt eveneens 1 mM β-mercaptoethanol toegevoegd om de opvouwing correct te behouden. Het volume van de elutiefracties is proteı̈ne-afhankelijk. 3.3.6 Dialyse Na opzuivering van een proteı̈ne worden niet altijd zuivere elutiefracties bekomen. Daarom is het soms aangewezen om een extra opzuivering uit te voeren op de gepoolde elutiefracties. Hierbij is het belangrijk dat het aanwezige imidazool verwijderd wordt. Ook wordt soms de zoutconcentratie aangepast om een betere opzuivering te bekomen. Dit alles kan aan de hand van een dialysestap. Tijdens een dialyse worden de elutiefracties gepoold en in een dialysemembraan gebracht. Dit membraan bezit kleine poriën die diffusie onder invloed van een gradiënt tussen de binnenkant van het membraan en de buffer buiten het membraan toelaten tot de samenstelling gelijk wordt. 3.4 3.4.1 3.4.1.1 Analyse van DNA en eiwit Concentratiebepaling Methoden gebaseerd op absorbantie De concentratie van DNA en eiwit kan bepaald worden aan de hand van de Nanodrop 2000 (Thermo Scientific). Hierbij wordt de absorbantie gemeten bij een golflengte van 260 nm voor DNA en 280 nm voor eiwit. Bij een DNA meting wordt de ratio van de absorbantie bij 260 nm t.o.v. de absorbantie bij 280 nm berekend. Deze ratio is een maat voor de zuiverheid en de kwaliteit van het DNA. Een ratio met waarde gelijk aan 1,8 wordt algemeen aanvaard als puur voor DNA stalen (Thermo Fisher Scientific, 2011). Is de waarde lager, dan kan dit wijzen op de aanwezigheid van fenol of andere contaminanten die sterk absorberen bij 280 nm. Ook de ratio van de absorbantie bij 260 nm ten opzichte van de absorbantie bij 230 nm wordt bepaald. Bij zuiver DNA wordt een waarde gelijk aan 2,0 - 2,2 verwacht. Wanneer bijvoorbeeld EDTA of koolhydraten aanwezig zijn, wordt deze ratio lager (Thermo Fisher Scientific, 2008). 3.4.1.2 Bradford Assay Aan de hand van een Bradford Assay kan de concentratie eiwit bepaald worden in een eiwitoplossing (Bradford, 1976). Telkens wordt 10 µl staal toegevoegd aan welletjes van een 96-well plaat, waarbij 3 replicaties per staal 25 3.4 Analyse van DNA en eiwit 26 worden geanalyseerd. Elk staal (en zijn verdunningen) wordt driemaal herhaald. Aan ieder welletje wordt 200 µl Bradford reagens (Coomassie (Bradford) Proteı̈ne Assay Kit, Thermo Scientific) toegevoegd. De absorbantie bij 595 nm wordt bepaald met de Tecan GENios Plus microplate reader (Tecan). Aan de hand van een standaardreeks gebaseerd op BSA of fytohemagglutinine (PHA) kan de eiwitconcentratie berekend worden. 3.4.2 3.4.2.1 Technieken voor analyse SDS-PAGE Sodiumdodecylsulfaat Polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) is een elektroforese die verticaal wordt uitgevoerd en waarbij eiwitten worden gescheiden op basis van hun grootte. SDS wordt toegevoegd om de eiwitten te denatureren en elk eiwit een gelijke negatieve lading mee te geven. De polyacrylamidegel zorgt voor hinder wanneer de negatief geladen eiwitten migreren van de negatieve pool naar de positieve pool. Hoe groter het proteı̈ne, hoe meer hinder ondervonden wordt en hoe kleiner de afgelegde afstand over de gel. Een SDS-PAGE gel bestaat uit een concentratiegel en een scheidingsgel (tabel 3.4). De concentratiegel zorgt ervoor dat alle eiwitten samen aankomen aan het begin van de scheidingsgel. Ter hoogte van deze laatste gel treedt de eigenlijke scheiding op. Tabel 3.4: De samenstelling van de Concentratie- en Scheidingsgel Product Concentratiegel (4%) (ml) Scheidingsgel (12%) (ml) H2 O Acrylamidemix (30%) (Roth) Tris-HCl 1,5 M pH 8,8 Tris-HCl 0,5 M pH 6,8 SDS solution (10%) (Acros) APS solution (10%) (Thermo Scientific) TEMED (Merck) 3,050 0,650 / 1,250 0,050 0,025 0,005 1,700 2,000 1,300 / 0,050 0,025 0,002 15 µl staal wordt gemengd met 5 µl sample buffer (8% (w/v) SDS, 200 mM Tris-HCl (pH 6,8), 40% (v/v) glycerol (VWR), 0,4% (w/v) bromo-fenolblauw (Merck), 5% (v/v) β-mercaptoethanol). Dit geheel wordt gedurende 7 minuten opgekookt bij 99 ◦ C en kort gecentrifugeerd. Deze stalen worden op de gel geladen. Telkens wordt in 1 laantje een ladder geladen (Pageruler Prestained Protein Ladder, Thermo Scientific). Gedurende 30 minuten wordt een elektrisch veld van 200 V aangelegd over de gel. 3.4.2.2 Coomassie kleuring Eiwit aanwezig in de gel na elektroforese kan gevisualiseerd worden aan de hand van een coomassiekleuring (Chrambach et al., 1967). Hierbij wordt de gel 30 minuten in een 15x coomassiebuffer gelegd (0,05% (m/v) Coomassie blue R-250 (Merck), 8,35% (v/v) azijnzuur, 20,8% (v/v) methanol (Roth)). Nadien wordt de gekleurde gel 26 3.4 Analyse van DNA en eiwit 27 behandeld met een ontkleuringsreagens (15% (v/v) ethanol (Thermo Scientific), 7,5% (v/v) azijnzuur). Hierdoor zullen enkel de eiwitten blauw gekleurd blijven en zullen de fragmenten kunnen worden waargenomen. 3.4.2.3 Western Blot analyse Na het lopen van een SDS-PAGE kunnen de proteı̈nen overgebracht worden naar een PVDF membraan (Pall) via western blot. (MacPhee, 2010). Dit membraan wordt eerst voorbereid door het enkele minuten in 100% methanol te leggen. De gel na SDS-PAGE wordt op dit membraan gelegd. Dit geheel wordt omhuld door blotpapier dat kort in Towbin buffer (10% (v/v) methanol, 20 mM Tris-HCl, 0,2 M glycine (Sigma Aldrich)) werd geweekt. Er wordt gedurende 1 uur geblot in een Trans-Blot 2D Semi-Dry transfer cel (Bio-rad), dit bij 15 V (constante), 0,8 A en 12 W. Na blotten wordt het membraan minstens 1 uur geı̈ncubeerd in blocking buffer (trissaline (10 mM Trizma base (Sigma Aldrich), 34 mM NaCl (VWR), 0,1% (v/v) Triton-X-100, pH 7,6) met 5% (m/v) melkpoeder (AppliChem)). Tijdens deze stap worden alle plaatsen op het membraan die niet door proteı̈nen werden ingenomen, bezet. Hierna wordt de blot driemaal gewassen met trissaline gedurende telkens 5 minuten. Het membraan wordt geı̈ncubeerd gedurende 1 uur in 15 ml trissaline met een 1 op 5000 verdunning van het primaire antilichaam (Thermo Scientific). Vervolgens wordt opnieuw driemaal gewassen met trissaline gedurende telkens 5 minuten. Hierna wordt het membraan 1 uur geı̈ncubeerd met een 1 op 500 verdunning van het secundaire antilichaam (Thermo Scientific). Aan dit secundaire antilichaam zit horseradish peroxidase gekoppeld (MacPhee, 2010). Er wordt tweemaal gewassen met trissaline en éénmaal met 0,1 M Tris-HCl (pH 7,6). Voor de uiteindelijke detectie wordt het membraan in de detectievloeistof (0,058 mM diaminobenzidine (Sigma Aldrich), 0,033% (v/v) H2 O in 50 ml 0,1 M Tris-HCl (pH 7,6)) gelegd. Hierbij wordt een bruine verkleuring waargenomen ten gevolge van het horseradish peroxidase. De kleurreactie wordt gestopt door de detectieoplossing te vervangen door bidest. 3.4.2.4 RIP Assay De eigenschap van een ribosoom-inactiverend eiwit (RIP) om translatie van een proteı̈ne te inhiberen, wordt nagegaan aan de hand van een RIP assay. Vooraleer de assay kan uitgevoerd worden, dient het zout en imizaole uit het eiwitstaal te worden verwijderd. Dit kan aan de hand van een Zeba kolom gebeuren. Zeba kolom Hiervoor worden de commerciële Zeba kolommen (7K MWCO, Thermo Fisher Scientific) gebruikt. De kolom is gebaseerd op het principe van gelfiltratie, waarbij de moleculen doorheen een poreuze matrix moeten migreren. Zout en immidazool zijn kleine moleculen (<1 kDa) die via alle kanaaltjes migreren door de matrix en daarbij veel tijd verliezen. Grote moleculen, zoals het eiwit, kunnen geen gebruik maken van de kanalen en worden als eerste uit de kolom geëlueerd (Hagel, 2001). Door de korte centrifugatietijd blijft het zout en imidazool achter op de kolom. Maximum 130 µl elutiefractie kan per kolom ontzout worden (Thermo Fisher Scientific, 2013). 27 3.4 Analyse van DNA en eiwit 28 In een eerste stap wordt de onderkant van het kolommetje geopend en het deksel aan de bovenzijde van de kolom opengedraaid. De kolom zelf wordt in een epje geplaatst en er wordt gecentrifugeerd gedurende 1 minuut bij 1500 × g om de bovenstaande oplossing te verwijderen. De kolom dient bij elke centrifugeerstap in dezelfde positie te worden geplaatst. Nu wordt 4x 300 µl van een gewenste buffer, in dit geval DPBS (Lonza), op de kolom gebracht en telkens gecentrifugeerd gedurende 1 minuut bij 1500 × g. Op deze manier wordt de matrix verzadigd met de nieuwe buffer. Hierna kan 130 µl van het staal (bv. een elutiefractie) op de kolom gebracht worden en gedurende 2 minuten bij 1500 × g gecentrifugeerd worden. De opgevangen eiwitfractie is vrij van zout en imidazool en kan gebruikt worden in de RIP assay. RIP Assay Voor de assay wordt gebruik gemaakt van de TnT® T7 Quick Coupled Transcription/Translation System (L1170) kit (Promega). Deze kit werd ontwikkeld voor in vitro translatie van eukaryote proteı̈nen en kan onder andere gebruikt worden om het moleculair gewicht van een DNA construct te controleren of voor het screenen van constructen op mutaties (Promega Corporation, 2015). De kit bevat een TNT Quick Mastermix met konijnen reticulocyt lysaat, 1 mM methionine, T7 Luciferase Controle DNA (500 ng/µl) en nucleasevrij water (tabel 3.5). In deze thesis wordt de kit met een ander doel gebruikt. Aangezien RIPs ribosomen irreversibel inactiveren, hebben ze een invloed op de translatie van proteı̈nen. Het T7 Luciferase Controle DNA wordt hier gebruikt als template, het konijnen reticulocyt lysaat bevat de ribosomen. Door de aanwezigheid van een RIP zal de translatie niet of minder goed doorgaan, waardoor minder luciferase tot expressie zal worden gebracht. Dit luciferase kan luciferine omzetten naar oxyluciferine met de productie van licht. Dit licht wordt opgemeten en is een maat voor de ribosoom-inactiverende activiteit van het geproduceerde RIP. Hoe minder licht wordt opgemeten, hoe sterker de ribosoom-inactiverende activiteit van het RIP. Tabel 3.5: De samenstelling van de mastermix voor de RIP assay 8 µl Mastermix 6,4 µl 0,16 µl 0,32 µl 1,12 µl TNT Quick Mastermix methionine (1 mM) T7 Luciferase Controle DNA (500 ng/µl) Nucleasevrij water Allereerst wordt een mastermix samengesteld (tabel 3.5). De TNT Quick Mastermix bestaat uit de cellulaire componenten nodig voor de synthese van proteı̈nen: tRNA, ribosomen (konijn), aminozuren (geen methionine) en initiatie-, elongatie- en terminatiefactoren (Promega Corporation, 2010). Doordat geen methionine in de mastermix aanwezig is, wordt de translatiereactie pas opgestart na toevoegen van methionine. Het T7 Luciferase Controle DNA bevat het gen voor luciferase en een T7 promoter (figuur 3.2). Deze laatste wordt geactiveerd door de aanwezigheid van RNA polymerasen aanwezig in de TNT Quick Mastermix (Promega Corporation, 2016a). Het 28 3.4 Analyse van DNA en eiwit 29 Luciferase assay reagens levert het luciferine. Luciferine wordt omgezet in oxyluciferine en licht (figuur 3.3). De hoeveelheid licht (luminescentie) is een maat voor de hoeveelheid luciferase dat kon geproduceerd worden (Promega Corporation, 2016b) Figuur 3.2: Luciferase T7 controle DNA map. Amp, Ampicilline resistentie, Luc, Luciferase gen (Promega Corporation, 2011) De verschillende componenten van de mastermix werden uitverdeeld per 9 reacties. Deze componenten worden in een 1,5 ml epje samengebracht. Daarbij is het zeer belangrijk om geen luchtbellen te veroorzaken en de componenten goed op-en-neer te pipetteren. Dit geheel wordt gedurende 13 minuten bij 30 ◦ C geı̈ncubeerd. Tijdens deze incubatiestap wordt de translatie van het luciferase opgestart. Door de mastermix als 1 geheel en niet als 9 afzonderlijke reacties te incuberen, wordt bij het uitverdelen telkens van exact hetzelfde startpunt vertrokken. Tijdens de incubatiestap worden 9 PCR epjes reeds gekoeld op ijs om zo weinig mogelijk schommelingen in temperatuur toe te laten. Na de incubatie wordt de mix onmiddellijk terug op ijs en in het donker geplaatst. De mastermix wordt per 8 µl verdeeld over de 9 PCR epjes. Aan ieder epje wordt 2 µl van een staal of een negatieve controle toegevoegd. De stalen worden in verschillende concentraties met een bereik van 0 (enkel DPBS) tot 300 nM, aangemaakt. Als negatieve controle wordt gebruik gemaakt van 300 nM BSA. Ook hier mogen geen luchtbellen gecreërd worden en moet goed op-en-neer gepipeteerd worden. In ieder epje bevindt zich nu 10 µl. Deze epjes worden gedurende 30 minuten bij 30 ◦ C geplaatst. Tijdens deze incubatiestap kan het RIP of de negatieve controle inwerken op de activiteit van de ribosomen en de daaropvolgende translatie van luciferase. Na deze incubatiestap worden de epjes niet meer op ijs geplaatst. Aan ieder epje wordt 35 µl nucleasevrij water toegevoegd. Het water wordt eerst toegevoegd aan het epje met de hoogste concentratie toegevoegd RIP, en gebeurt daarna stapsgewijs richting de negatieve controle. Dit nucleasevrij water zorgt ervoor dat de reactievloeistof wordt verdund en het contact tussen de ribosomen en het RIP beperkt wordt. De 45 µl vloeistof in ieder epje wordt overgebracht in een witte 96-well plaat. Daarbij wordt enkel gebruik gemaakt van de oneven kolommen en rijen. Op deze manier wordt tijdens de meting interferentie van andere welletjes vermeden. In het welletje uiterst 29 3.5 Transiënte expressie in Nicotiana benthamiana 30 rechts onder wordt 45 µl nucleasevrij water gepipetteerd. Dit dient als negatieve controle bij het meten van de luminescentie. Aan elk welletje, opnieuw vertrekkend van de hoogste concentratie RIP in de richting van de negatieve controle, wordt vervolgens 5 µl Luciferase assay reagens toegevoegd. Ook tijdens deze stappen is het belangrijk om de vorming van luchtbellen te vermijden en goed op-en-neer te pipetteren. Het Luciferase assay reagens bevat het luciferine. Indien luciferase werd geproduceerd, zal het luciferine omgezet worden naar oxyluciferine met de vrijgave van licht (figuur 3.3). Dit licht of de luminescentie is een maat voor de inactivatie van de ribosomen. Na toevoeging van het reagens kan de luminescentie bij een golflengte van 562 nm opgemeten worden aan de hand van de Tecan GENios Plus microplate Reader (Tecan). Figuur 3.3: De bioluminescentie reactie gekatalyseerd door luciferase (Promega Corporation, 2011) 3.5 Transiënte expressie in Nicotiana benthamiana Voor het proteı̈ne OSRIP1 wordt een lokalisatiestudie uitgevoerd (figuur 3.4). Hiervoor worden fusieconstructen van OSRIP1 en eGFP aangemaakt via Gateway Klonering. Deze constructen worden geligeerd in een pEAQHT vector (figuur 3.5) en via elektroshock in Agrobacterium tumefaciens getransformeerd. Aan de hand van deze getransformeerde organismen wordt Nicotiana benthamiana transiënt getransformeerd ter expressie van het construct, waarna het fluorescente signaal wordt gedetecteerd onder de confocale fluorescentiemicroscoop. Figuur 3.4: Een stappenplan voor het uitvoeren van de lokalisatiestudie (Peyret and Lomonossoff, 2013) 30 3.5 Transiënte expressie in Nicotiana benthamiana 31 pEAQ-HT vectoren zijn transiënte expressievectoren ontworpen om snel en gemakkelijk grote hoeveelheden (milligrammen) recombinante proteı̈nen tot expressie te brengen in planten (figuur 3.5). Daarvoor maken ze gebruik van het CPMV-HT (Cowpea Mosaic Virus hypertransational) expressiesysteem met zijn hoge translatieefficiëntie. Het insert wordt ingevoegd tussen een 5’ untranslated region(UTR) en dit CMPV-HT expressiesysteem (een 3’ UTR) (Sainsbury et al., 2009; Peyret and Lomonossoff, 2013). Op de backbone bevinden zich essentiële genen voor replicatie van het plasmide zowel in E. coli als in A. tumefaciens. Daarnaast is er ook een T-DNA transfer regio aanwezig voor transfer van DNA naar het plantgenoom (figuur 3.6) (Peyret and Lomonossoff, 2013). Figuur 3.5: De pEAQ-HT-vector. Ter hoogte van dit T-DNA bevindt zich een P19 suppressor en een NPTII (neomycin phosphotransferase) kanamycine resistentiegen (Sainsbury et al., 2009). De P19 suppressor onderdrukt gene silencing waardoor een grotere hoeveelheid proteı̈ne geproduceerd kan worden zonder dat de expressie van het gen wordt uitgeschakeld (Peyret and Lomonossoff, 2013). Figuur 3.6: De T-DNA transfer regio van de pEAQ-HT-vector (Peyret and Lomonossoff, 2013) 31 3.5 Transiënte expressie in Nicotiana benthamiana 3.5.1 32 Gateway Klonering Vooraleer een Gateway klonering kan worden uitgevoerd, moeten attB sites toegevoegd worden aan de uiteinden van een DNA fragment (figuur 3.7). Aangezien de attB sites relatief groot zijn, worden ze via 2 op elkaar volgende PCR reacties bevestigd. Figuur 3.7: Een overzicht van de BP en LR reactie bij Gateway Klonering (Karimi et al., 2007) Het Gateway systeem is gebaseerd op site-specifieke recombinatie van bacteriofaag λ (Karimi et al., 2007; Hunt, 2005). Het protocol bestaat uit achtereenvolgens een BP en een LR reactie. Tijdens de BP reactie wordt het fragment met zijn attB sites in een donorvector gebracht. Dit vormt een entry clone. Hieruit wordt tijdens de LR reactie een expression clone gevormd. Gateway klonering wordt vaak toegepast omdat het fragmenten in de juiste volgorde, oriëntatie en open leesraam met elkaar worden verenigd (Karimi et al., 2007; Hunt, 2005). 3.5.1.1 BP Reactie De BP reactie wordt gekatalyseerd door een BP Clonase II enzym mix (Invitrogen). Deze mix plaatst het DNA fragment geflankeerd door attB sites in de donorvector (pDONR221 (VIB)). Deze donorvector bevat attP sites. De attB sites en de attP sites recombineren, waardoor het DNA fragment kan opgenomen worden in de donorvector. Dit resulteert in een entry clone, waarbij the DNA fragment geflankeerd zit door de attL sites (figuur 3.7) (Karimi et al., 2007). 150 ng PCR product, 150 ng donorvector en 2 µl BP Clonase mix II (Invitrogen) worden samengevoegd. Daaraan wordt TE buffer (pH 8; 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) toegevoegd tot een volume van 8 µl. Dit mengsel wordt overnacht geı̈ncubeerd bij 25 ◦ C. Na incubatie wordt de reactie stopgezet door 1 µl proteı̈nase K (Invitrogen) 32 3.5 Transiënte expressie in Nicotiana benthamiana 33 toe te voegen en gedurende 10 minuten te incuberen bij 37 ◦ C. De gevormde entry clones kunnen via een heat shock (3.2.1) binnengebracht worden in E. coli cellen en uitgeplaat worden op vast, LB medium met kanamycine selectiemerker. 3.5.1.2 LR Reactie De LR reactie wordt gekatalyseerd door een LR Clonase II enzym mix (Invitrogen). Deze enzym mix verplaatst het DNA fragment geflankeerd door attL sites in een destinatievector. Dit resulteert in het DNA fragment omgeven door attR sites. Na recombinatie van de attL en de attR sites wordt het fragment geı̈ncorporeerd in een nieuwe expression clone, geflankeerd door de uiteindelijke attB sites (figuur 3.7) (Karimi et al., 2007). 150 ng van de entry clone, 150 ng destinatievector en 2 µl LR clonase mix II (Invitrogen) worden samengevoegd. Opnieuw wordt dit geheel aangelengd met TE buffer (pH 8; 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) tot 8 µl. Dit mengsel wordt overnacht geı̈ncubeerd bij 25 ◦ C. Opnieuw wordt de reactie gestopt aan de hand van 1 µl proteı̈nase K en een incubatiestap van 10 minuten bij 37 ◦ C. De gevormde expression clones kunnen na heat shock (3.2.1) uitgeplaat worden op vast, selectief LB medium. 3.5.2 Elektroshock transformatie De LBA4404 stam van Agrobacterium tumefaciens werd reeds elektrocompetent gemaakt. Deze cellen worden getransformeerd door 10 µl plasmide DNA (50 ng/µl) toe te voegen aan 80 µl competente cellen. Dit geheel wordt in een elektroporatiecuvet gebracht. Aan de hand van een elektrische puls met een veldsterkte van 2,0 kV, een capaciteit van 25 µF en een weerstand van 200 Ω wordt in een tijdsconstante van 4,5 tot 4,7 ms de cel getransformeerd. Onmiddellijk na deze stap worden de cellen in 800 µl Yeast Extract Broth of YEB medium (15 mM sucrose (VWR), 0,1% (m/v) yeast extract, 0,5% (m/v) pepton (UCB), 0,5% (m/v) beef extract (LabM)) geresuspendeerd en gedurende 2 uur geı̈ncubeerd bij 28 ◦ C en 200 rpm. Hierna wordt 250 µl uitgeplaat op YEB platen (zelfde samenstelling als hierboven met toevoeging van 1,5% (m/v) agar) met kanamycine (100 mg/ml) en gentamicine (100 mg/ml) als selectiemerkers. Deze platen worden gedurende 2 dagen gegroeid bij 28 ◦ C. 3.5.3 Suspensieculturen van Agrobacterium tumefaciens De gegroeide bacteriën worden opgepikt met een steriele entnaald en gesuspendeerd in 5 ml vloeibaar YEB medium met 2,5 µl kanamycine (100 mg/ml) en 2,5 µl gentamicine (100 mg/ml). Deze suspensieculturen worden gedurende 2 dagen gegroeid bij 28 ◦ C en 200 rpm. 3.5.4 Transiënte transformatie van tabaksbladeren Tabaksplanten (Nicotiana benthamiana) van 4 tot 6 weken oud worden transiënt getransformeerd. Hierbij wordt de T-DNA regio gelegen op de pEAQ-HT vector, waarin het insert zich bevindt, vanuit Agrobacterium tumefaciens (LBA4404) transiënt tot expressie gebracht in de epidermale cellen van de tabaksplant. Op deze manier worden 33 3.5 Transiënte expressie in Nicotiana benthamiana 34 GFP-fusie-eiwitten tot expressie gebracht en kan de lokalisatie van de eiwitten bestudeerd worden. Twee ml van een 5 ml suspensiecultuur van A. tumefaciens wordt gedurende 10 minuten gecentrifugeerd bij 7000 rpm. De bekomen pellet wordt tweemaal gewassen in 1 ml infiltratiebuffer (50 mM MES monohydraat (Sigma Aldrich), 2 mM Na2 HPO4 en 0,5% glucose (Merck) in 100 ml bidest, pH 5,6), waarna telkens gevortext wordt. Vervolgens wordt het staal 2 minuten gecentrifugeerd bij 7000 rpm en wordt het supernatans verwijderd. De pellet wordt opgelost in 1 ml infiltratiebuffer met 100 µM acetosyringone (Sigma Aldrich). Van dit mengsel wordt de optische densiteit (OD) bepaald bij een golflengte van 600 nm. Verschillende verdunningen met een ODwaarde van 0,1, 0,05 en 0,01 worden aangemaakt. Deze oplossingen worden met een 1 ml spuit in de onderkant van het tabaksblad gespoten. 3.5.5 Detectie aan de hand van een confocale fluorescentiemicroscoop Na twee dagen wordt van verschillende geı̈nfiltreerde bladeren een stukje uitgesneden. Deze stukjes worden op een microscopisch draagglas (Thermo Scientific) gelegd met water en afgedekt met een dekglaasje (VWR). Deze preparaten kunnen onder de confocale fluorescentiemicroscoop (Nikon A1R) worden bestudeerd en gefotografeerd. 34 RESULTATEN 35 4 Resultaten 4.1 Heterologe expressie in E. coli rosetta In deze thesis werd gewerkt met 2 RIPs uit rijst, nl. OSRIP1, een type 1 RIP, en RIP-M41, een type 3 RIP. Voor elke RIP sequentie werd een expressieconstruct aangemaakt. Van het laatste proteı̈ne werd eveneens gewerkt met het afzonderlijke RIP-domein. Deze 3 proteı̈nen/domeinen werden elk recombinant tot expressie gebracht in E. coli rosetta cellen. Dit type bacteriële cellen bezit een plasmide (pRARE) dat tRNA’s levert voor codons die zelden gebruikt worden in E. coli. Hierdoor kan de E. coli rosetta stam universeel gebruikt worden voor translatie van proteı̈nen (Berrow et al., 2006). Onder deze codons vallen AGG, AGA en CGG voor arginine, AUA voor isoleucine, CUA voor leucine, CCC voor proline en GGA voor glycine (EMBL, 2016a). Daarnaast is de rosetta stam vrij van verschillende proteasen die het proteı̈ne tijdens de opzuivering zouden kunnen degraderen (Novagen, 2003). Om opzuivering mogelijk te maken, werd gebruik gemaakt van een C-terminale His-tag. Alle constructen werden geligeerd in een pET-21a vector. Dit maakt induceerbare expressie van het proteı̈ne of domein mogelijk. 4.1.1 Aanmaak van de expressieconstructen De gebruikte constructen worden weergegeven in figuur 4.1. Aan het C-terminale uiteinde van de sequentie van het proteı̈ne (blauw) bevindt zich een linker die bestaat uit 3 glycine residuen (geel). Hierna komt de His-tag die bestaat uit 6 opeenvolgende histidine residuen (oranje). Figuur 4.1: Een schematische voorstelling van de constructen voor RIP-M41 (70 kDa), het RIP-domein van RIP-M41 (34 kDa) en OSRIP1 (31 kDa) voor expressie in E. coli rosetta Het volledige construct voor RIP-M41 was reeds beschikbaar in het laboratorium. Dit betekent dat de sequentie voor het proteı̈ne met His-tag door middel van Gibson assembly geligeerd werd in de vector pET-21a en dit construct door middel van een heat shock in E. coli rosetta gebracht werd. Deze E. coli stam wordt bewaard bij -80◦ C als glycerolstock. Het afzonderlijke RIP-domein van RIP-M41 was aanwezig in het laboratorium, geligeerd in de pET-21a vector. Na heat shock in E. coli rosetta, werd aan de hand van een kolonie PCR gecontroleerd of de gegroeide kolonies het construct hadden opgenomen. Het resultaat hiervan is weergegeven in figuur 4.2. Kolonie 7 (K7) werd geselecteerd voor het opgroeien van een 5 ml suspensiecultuur en opzuivering van het plasmide. Na bevestiging van de correcte sequentie, werd een glycerolstock van deze E. coli stam bewaard bij -80◦ C. 35 4.1 Heterologe expressie in E. coli rosetta 36 Figuur 4.2: Analyse van DNA-fragmenten na kolonie PCR. Voor de kolonie PCR reactie werd een annealingstemperatuur van 60◦ C en een elongatietijd van 2 minuten toegepast. Er werden 30 cycli doorlopen. De gebruikte primers: P216 en P246 De coderende sequentie voor OSRIP1 was bij aanvang van deze thesis beschikbaar in een pJET1.2 vector. Dit plasmide bevond zich in E. coli TOP10 cellen onder de vorm van een glycerolstock. Door middel van een kolonie PCR werden kolonies geselecteerd voor het opzetten van suspensieculturen en daaropvolgend het controleren van de sequentie. Een kolonie met de correcte sequentie werd geselecteerd en de sequentie werd aangevuld met een C-terminale His-tag en Gibson assembly sites aan de hand van twee opeenvolgende Q5 PCR reacties. Dit construct werd via Gibson assembly geligeerd in de pET-21a vector. Aan de hand van de heat-shock procedure werd het construct binnengebracht in E. coli rosetta cellen, waarna een nieuwe kolonie PCR werd uitgevoerd. Hierbij werd gecontroleerd of de kolonies het pET-21a construct hadden opgenomen en het opgenomen construct de correcte sequentie had. Een kolonie die aan bovenstaande voorwaarden voldeed, werd als glycerolstock bewaard bij -80◦ C. Allereerst werden de E. coli TOP10 cellen met de pJET1.2 vector (glycerolstock) gegroeid op LB-medium. Een aantal kolonies werd geselecteerd voor een kolonie PCR. Het resultaat daarvan wordt weergegeven in figuur 4.3. Kolonie 4 en 5 werden geselecteerd voor het opzetten van een 5 ml suspensiecultuur en opzuivering van het plasmide. Na sequenering bleek kolonie 5 de correcte sequentie te bevatten. 36 4.1 Heterologe expressie in E. coli rosetta 37 Figuur 4.3: Analyse van DNA-fragmenten na kolonie PCR. Voor de kolonie PCR reactie werd een annealingstemperatuur van 60◦ C en een elongatietijd van 1 minuut en 10 seconden toegepast. Er werden 30 cycli doorlopen. De gebruikte primers: EVD275 en EVD276 Aan de hand van twee opeenvolgende Q5 PCR-reacties werd een His-tag (C-terminaal) en de Gibson assembly sites toegevoegd. Met behulp van deze sites kan het construct geligeerd worden in de pET-21a vector via Gibson assembly. Vervolgens wordt dit geheel met behulp van een heat shock in competente E. coli rosetta cellen gebracht en uitgeplaat op LB-medium met chlooramfenicol en carbenicilline als selectiemerkers. Opnieuw werd een kolonie PCR uitgevoerd om te controleren of het construct effectief door de kolonie werd opgenomen. Kolonie 1 en 8 gaven het correcte fragment na gel elektroforese en werden geselecteerd voor sequenering. Kolonie 8 bevatte de correcte sequentie en werd gebruikt voor het opzetten van een glycerolstock. 4.1.2 Expressie in E. coli rosetta Uit de glycerolstocks van OSRIP1, RIP-M41 en het RIP(M41) domein werden 5 ml suspensieculturen opgezet. Na overnacht te groeien, werden erlenmeyers met 300 ml vloeibaar LB medium geı̈noculeerd met de 5 ml cultuur. Voor selectieve groei werd ook chlooramfenicol en carbenicilline toegevoegd. Bij een optische densiteit gelegen tussen 0,5 en 0,8, werden de culturen geı̈nduceerd met 0,2 mM IPTG. Hierna werd de cultuur 2 dagen gegroeid en werd de celfractie gescheiden van het LB medium door centrifugatie . De celfractie werd gesoniceerd en opnieuw gecentrifugeerd, ditmaal om de oplosbare en onoplosbare eiwitfractie van elkaar te scheiden. De onoplosbare fractie werd gesuspendeerd in 8M ureum tot het mengsel vlot op en neer gepipeteerd kon worden. Samen met de oplosbare fractie werd de onoplosbare fractie identiek op twee polyacrylamidegels geplaatst. Eén gel werd gedetecteerd met coomassiekleuring, de andere gel werd gebruikt voor Western Blot analyse met anti-His antilichamen. Onderstaande gels zijn hiervan het resultaat (figuren 4.4 en 4.5). 37 4.1 Heterologe expressie in E. coli rosetta 4.1.2.1 38 RIP-M41 en het RIP(M41) domein Het recombinante proteı̈ne RIP-M41 heeft een grootte van ongeveer 70 kDa en vertoont op de gel gekleurd met coomassie een zeer sterke band in de onoplosbare fractie (figuur 4.4). Op diezelfde gel geeft de oplosbare fractie zo goed als geen signaal. Het recombinante RIP(M41) domein (34 kDa) komt overeen met het onderste van twee bandjes op de coomassie gel gelegen rond 35 kDa. Na Western Blot analyse bevindt het grootste deel van het domein zich in de oplosbare fractie. Ook in de onoplosbare fractie wordt een licht bandje waargenomen. Figuur 4.4: Coomassiekleuring (links) en Western Blot analyse (rechts) van een gel na SDS-PAGE met de oplosbare en onoplosbare eiwitfractie van RIP-M41 en RIP(M41). Alle culturen werden geı̈nduceerd met 0,2 mM IPTG gedurende 2 dagen. De Western Blot analyse werd uitgevoerd met anti-His antilichamen. Voor het RIP(M41) domein wordt beslist om de eiwitopzuivering uit te voeren op de oplosbare fractie. Dit omdat dit de gemakkelijkste fractie is om mee verder te werken. Zo heeft dit domein reeds de correcte opvouwing en bevindt het RIP(M41) domein zich reeds in oplossing. RIP-M41 wordt voornamelijk in de onoplosbare fractie geproduceerd. Dit wordt dan ook de fractie van RIP-M41 waarmee wordt verder gewerkt. 4.1.2.2 OSRIP1 Het recombinante OSRIP1 (31 kDa) bevindt zich ongeveer gelijk verdeeld over beide fracties. Dit is zichtbaar op zowel de gel gekleurd met coomassie als de Western blot analyse (figuur 4.5). De bandjes waargenomen na 24 en 48u IPTG inductie zijn veel intenser dan de negatieve controle, wat wijst op aanwezigheid van het proteı̈ne. Het bandje dat waargenomen wordt ter hoogte van de positieve controle, toont aan dat het blotten en de detectie succesvol zijn verlopen. 38 4.2 Eiwitopzuivering 39 Figuur 4.5: Coomassiekleuring (links) en Western Blot analyse (rechts) van een gel na SDS-PAGE met de oplosbare en onoplosbare eiwitfractie van OSRIP1. Alle culturen, behalve de N.C. of negatieve controles, werden geı̈nduceerd met 0,2 mM IPTG. De Western Blot analyse werd uitgevoerd met anti-His antilichamen. P.C. staat voor positieve controle. Voor het proteı̈ne OSRIP1 wordt beslist om de opzuivering enkel uit te voeren op de oplosbare fractie. Dit omwille van het feit dat het eiwit in deze fractie de correcte opvouwing heeft en zich reeds in oplossing bevindt. 4.2 Eiwitopzuivering Het gewenste proteı̈ne/domein wordt opgezuiverd uit de geselecteerde eiwitfracties. Op de resulterende elutiefracties zal een RIP assay worden uitgevoerd. Om de activiteit van het recombinante eiwit te bepalen is het belangrijk om te vertrekken van zo zuiver mogelijke eiwitfracties. Voor ieder construct werd vertrokken van een viertal culturen (300 ml). 4.2.1 4.2.1.1 Affiniteitschromatografie RIP-M41 Refolding-on-column Aangezien het recombinante RIP-M41 voornamelijk in de onoplosbare fractie gedetecteerd wordt is het eiwit niet, onvolledig of verkeerd opgevouwen na productie in E. coli. Daarom moet een resuspendeer- en hervouwingsstap worden doorgevoerd vooraleer de opzuivering van het proteı̈ne kan worden opgestart. Allereerst werd de pellet tweemaal gewassen met een PB-buffer die 500 mM NaCl, 4 M ureum en 1% Triton (pH 8) bevat. Deze buffer dient om het gewenste proteı̈ne op te lossen en alle pellets te kunnen poolen. Na iedere wasstap werd 15 minuten gecentrifugeerd bij 9000 rpm. Hierna werd de pellet opnieuw tweemaal gewassen met een PB-buffer met dezelfde samenstelling als hiervoor, maar zonder Triton. Ook hier werd na iedere wasstap 15 minuten gecentrifugeerd bij 9000 rpm om een goed contact tussen de wasbuffer en de pellet te bekomen. In een 39 4.2 Eiwitopzuivering 40 laatste stap werd de pellet opgelost in een PB buffer met 500 mM NaCl, 8M ureum, 10 mM β-mercaptoethanol en 10 mM imidazool. De NiNTA matrix werd voorbereid op het proteı̈nemengsel door een hoeveelheid van de 8M ureumbuffer met β-mercaptoethanol en imidazool over de kolom te sturen. Vervolgens werd de opgeloste eiwitpellet overnacht geı̈ncubeerd met de matrix om het proteı̈ne met zijn His-tag de kans te geven te binden met de nikkelionen. Het gebonden proteı̈ne en de matrix werden gewassen met ureumbuffers met een dalende concentratie aan ureum (8 M, 6 M, 4 M, 3 M, 2 M, 1 M en 0 M), waardoor het gebonden proteı̈ne langzaam gedwongen werd tot opvouwing. Opzuivering Het RIP-M41 proteı̈ne werd in de onoplosbare eiwitfractie geproduceerd en wordt gebonden op de kolom om vervolgens blootgesteld te worden aan de refolding stap. De verschillende ureumbuffers met dalende concentratie ureum die tijdens de refolding over de kolom werden gestuurd, gelden als wasstappen. Het proteı̈ne werd in 1 chromatografiestap opgezuiverd. Hierbij werd de matrix gewassen met PB buffer die 50 mM imidazool en 500 mM NaCl bevat, tot de gemeten absorbantie (280 nm) van de doorgelopen wasbuffer stagnatie vertoonde. Hierna werd de kolom tweemaal geëlueerd, achtereenvolgens met PB buffer met 500 mM NaCl en 150 mM imidazool (pH 8), en met PB buffer met 500 mM NaCl en 250 mM imidazool (pH 8). Telkens werd de matrix 30 minuten lang geı̈ncubeerd met de elutiebuffer. Dit betekent dat de buffer op de matrix werd gezet en één kolomvolume (volume van het hars) van de kolom werd gelopen. Op deze manier wordt de volledige matrix en zijn componenten omringd door de buffer. Het elutieprofiel van beide elutiestappen wordt weergegeven in figuur 4.6. Er werden elutiefracties van 500 µl opgevangen. Figuur 4.6: Een elutieprofiel na affiniteitschromatografie van RIP-M41. De gemeten absorbantie bij 280 nm werd uitgezet voor de verschillende opgevangen elutiefracties (500 µl). Er werd achtereenvolgens geëlueerd met buffer met 150 (blauw) en 250 mM imidazool (oranje). Verschillende elutiefracties werden eveneens gecontroleerd op aanwezigheid van het proteı̈ne door middel van een SDS-PAGE met coomassiekleuring. Het resultaat daarvan wordt weergegeven in figuur 4.7. Daarop is te zien 40 4.2 Eiwitopzuivering 41 dat het RIP-M41 proteı̈ne (70 kDa) abundant aanwezig is in de elutiefracties. Daarnaast worden ook lichte bandjes waargenomen ter hoogte van kleinere fragmenten. Dit zijn mogelijk afbraakproducten van RIP-M41. Figuur 4.7: Coomassiekleuring van een gel na SDS-PAGE met de elutiefracties bij 150 en 250 mM IZ van het RIP-M41 proteı̈ne. Telkens werd 20 µl staal geladen. 4.2.1.2 RIP(M41) domein Bij het RIP(M41) domein werd de oplosbare eiwitfractie geselecteerd om mee verder te werken (4.1.2.1). Deze fractie werd, na toevoeging van 10 mM imidazool, overnacht geı̈ncubeerd met de Ni-NTA matrix. Het RIP(M41) domein werd in 1 chromatografiestap opgezuiverd. Hierbij werd de matrix gewassen met PB buffer die 50 mM imidazool en 500 mM NaCl bevat, tot de gemeten absorbantie (280 nm) van de doorgelopen wasbuffer stagneerde. Hierna werd achtereenvolgens geëlueerd met PB buffer met 500 mM NaCl en 150 of 250 mM imidazool (pH 8). Telkens werd de matrix 30 minuten lang geı̈ncubeerd met de elutiebuffer. Het resultaat werd opgenomen in figuur 4.8. Er werden elutiefracties van 2 ml opgevangen. 41 4.2 Eiwitopzuivering 42 Figuur 4.8: Een elutieprofiel na affiniteitschromatografie van het RIP(M41) domein. De gemeten absorbantie bij 280 nm werd uitgezet voor de verschillende opgevangen elutiefracties (2 ml). Er werd achtereenvolgens geëlueerd met buffer met 150 (blauw) en 250 mM imidazool (oranje). Verschillende elutiefracties werden eveneens gecontroleerd op de aanwezigheid van het RIP(M41) domein door middel van een SDS-PAGE met coomassiekleuring en een Western Blot met anti-His antilichamen. Het resultaat daarvan wordt weergegeven in figuur 4.9. Op de gel na kleuring met coomassie is te zien dat het RIP(M41) domein (34 kDa) in de meeste elutiefracties abundant aanwezig is. Met de Western Blot analyse wordt bevestigd dat het bandje op de coomassie-gel effectief het gewenste domein is. Wel worden op de coomassiegel ook kleine hoeveelheden van andere fragmenten waargenomen, dit zowel boven als onder het bandje voor het RIP(M41) domein. Dit wijst erop dat andere eiwitten door middel van aspecifieke binding met de nikkelmatrix, ook op de matrix gebonden zaten en mee werden geëlueerd. Figuur 4.9: Coomassiekleuring (links) en Western Blot analyse (rechts) van een gel na SDS-PAGE met de elutiefracties bij 250 mM IZ van het RIP(M41) domein. Telkens werd 20 µl staal geladen. De Western Blot analyse werd uitgevoerd met anti-His antilichamen. 42 4.2 Eiwitopzuivering 43 Elutiefracties 1 tot en met 4, geëlueerd bij 250 mM IZ, werden gepoold en gedialyseerd ter verwijdering van het imidazool en zout. Hierbij werd opgemerkt dat het RIP(M41) domein precipiteerde in afwezigheid van zout. Aangezien zout interfereert met de RIP assay vormt dit een groot probleem dat tot nu toe nog niet opgelost kon worden. 4.2.1.3 OSRIP1 Voor het OSRIP1 proteı̈ne werd beslist om verder te werken met de oplosbare eiwitfractie (4.1.2.2). Voor deze opzuivering zijn 2 opeenvolgende chromatografiestappen vereist. Tijdens de eerste stap werden PB buffers zonder zout gebruikt. Bij deze condities kan OSRIP1 en één kleiner proteı̈ne (± 12 kDa) binden met de matrix en geëlueerd worden. Alle andere proteı̈nen in het mengsel komen in de wasbuffer terecht. Hierna werd een dialyse uitgevoerd op de gepoolde elutiefracties tegen de PB buffer met 500 mM NaCl. Op deze manier wordt het imdazool verwijderd en 500 mM zout toegevoegd aan de stalen. Dit geheel werd opnieuw onderworpen aan een opzuiveringstap, ditmaal in aanwezigheid van 500 mM NaCl. Het aanwezige zout zorgt voor een verhoogde specificiteit bij binding van proteı̈nen met de Ni-NTA matrix. Zo kan enkel OSRIP1 nog binden met de matrix en wordt het kleinere proteı̈ne gescheiden van OSRIP1. Tijdens de eerste chromatografiestap werd gebruik gemaakt van een wasbuffer bestaande uit PB buffer met 50 mM imidazool. Na wassen werd achtereenvolgens geëlueerd met PB buffer met 150 en 250 mM IZ. Telkens werd de matrix 45 minuten lang geı̈ncubeerd met de elutiebuffer. Het elutieprofiel wordt weergegeven in figuur 4.10. Er werden elutiefracties van 1 ml opgevangen. Figuur 4.10: Een elutieprofiel na de eerste affiniteitschromatografie van het OSRIP1 proteı̈ne. De gemeten absorbantie bij 280 nm werd uitgezet voor de verschillende opgevangen elutiefracties (1 ml). Er werd achtereenvolgens geëlueerd met buffer met 150 (blauw) en 250 mM imidazool (oranje). 43 4.2 Eiwitopzuivering 44 Aan de hand van een SDS-PAGE met coomassiekleuring en een Western Blot analyse werd nagegaan of het proteı̈ne OSRIP1 in de elutiefracties aanwezig was. In figuur 4.11 is te zien dat OSRIP1 (31 kDa) in de fracties aanwezig is. Daarnaast is eveneens een kleiner proteı̈ne (± 12 kDa) mee opgezuiverd. Met de Western Blot analyse wordt bevestigd dat het bandje op de coomassie-gel effectief het gewenste proteı̈ne is. Het kleinere eiwit werd door middel van aspecifieke interacties met de NiNTA matrix gebonden en mee geëlueerd. Figuur 4.11: Coomassiekleuring (links) en Western Blot analyse (rechts) van een gel na SDS-PAGE met de elutiefracties bij 150 en 250 mM IZ van OSRIP1. Telkens werd 20 µl staal geladen. De Western Blot analyse werd uitgevoerd met anti-His antilichamen. Alle opgevangen elutiefracties, zowel van 150 als van 250 mM IZ, werden gepoold voor dialyse tegen PB buffer met 500 mM NaCl. Tijdens de dialysestap werd 500 mM NaCl toegevoegd aan de elutiefracties en werd het aanwezige imidazool verwijderd. De bekomen eiwitoplossing is het beginproduct voor de tweede chromatografiestap. Als wasbuffer wordt gebruik gemaakt van een PB buffer met 500 mM NaCl en 50 mM IZ. Er werd geëlueerd met een PB buffer met 500 mM NaCl en 250 mM IZ. De matrix werd gedurende 1 uur met de eiwitoplossing geı̈ncubeerd. Aangezien het kleinere proteı̈ne (± 12 kDa) niet bindt onder de huidige omstandigheden (500 mM NaCl) en om elutiefracties met een zo hoog mogelijke absorbantie te verkrijgen, werd slechts met één buffer geëlueerd. De hoge concentratie van de stalen zorgt ervoor dat tijdens de RIP assay hogere concentraties OSRIP1 ook kunnen getest worden. Het elutieprofiel van de 2e chromatografiestap is afgebeeld in figuur 4.12. Er werden eluties van 100 µl opgevangen. 44 4.3 RIP Assay 45 Figuur 4.12: Een elutieprofiel na de tweede affiniteitschromatografie van het OSRIP1 proteı̈ne. De gemeten absorbantie bij 280 nm werd uitgezet voor de verschillende opgevangen elutiefracties (100 µl). Er werd geëlueerd met 250 mM imidazool. In figuur 4.13 wordt het resultaat van de SDS-PAGE na coomassiekleuring van enkele elutiefracties weergegeven. Het kleine proteı̈ne (± 12 kDa) dat mee opgezuiverd werd tijdens de eerste affiniteitschromatografie, wordt niet langer in de elutiefracties gedetecteerd. De eluties zijn zeer zuiver en kunnen gebruikt worden voor de RIP assays. Figuur 4.13: Coomassiekleuring van een gel na SDS-PAGE met de elutiefracties 250 mM IZ van OSRIP1. Telkens werd 20 µl staal geladen. 4.3 RIP Assay Van ieder recombinant proteı̈ne/domein werd een of meerdere (relatief) zuivere elutiefracties bekomen. Deze elutiefracties zijn echter nutteloos als de proteı̈nen of de domeinen geen activiteit vertonen. De eigenschap van een ribosoom-inactiverend eiwit (RIP) om translatie van een proteı̈ne te inhiberen, wordt nagegaan aan de hand van een RIP assay. 45 4.3 RIP Assay 4.3.1 46 Zeba kolom Vooraleer de assay kan uitgevoerd worden, dient het zout en imidazool uit het staal te worden verwijderd. Aangezien voor de RIP assay slechts kleine volumes opgezuiverd staal vereist zijn, werd geopteerd om de ontzouting uit te voeren met de commercieel beschikbare Zeba kolommen (Thermo Fisher Scientific). Tijdens de ontzouting werd eveneens een buffer exchange uitgevoerd. Zo werd het uiteindelijke staal opgelost in DPBS buffer (Lonza). Tijdens de optimalisatie van de RIP assay, werden de in het labo aangemaakte PBS buffer (500 mM NaCl) en de commerciële DPBS buffer (Lonza) met elkaar vergeleken. Daaruit bleek dat de commerciële DBPS buffer minder invloed had op de gemeten luminescentie dan de in het labo aangemaakte PBS buffer. Om die reden werd beslist om alle RIP assays uit te voeren met stalen opgelost in DPBS buffer. Een elutiefractie van OSRIP1 werd gebruikt om de efficiëntie van de kolom na te gaan. Er werd een elutiefractie met een originele OD-waarde (280 nm) gelijk aan 0,145 gebruikt voor de test. Het staal werd 1x over de Zeba kolom gestuurd en had daarna nog een OD gelijk aan 0,120. Dit wijst op een klein verlies aan proteı̈ne bij iedere passage over de kolom. Als vertrokken wordt van een elutiefractie met een voldoende hoge absorbantie kan een staal in de correcte buffer met een voldoende hoge concentratie worden bekomen. Het staal na 1 passage over de Zeba kolom werd op een SDS-PAGE gel geanalyseerd. Het resultaat daarvan werd opgenomen in figuur 4.14. Er wordt een duidelijke band waargenomen ter hoogte van OSRIP1 (31 kDa). Ook de concentratie van het staal werd bepaald. Dit zowel aan de hand van de Bradford methode als de OD280 bepaling met behulp van de Nanodrop. De Bradford methode gaf een concentratie gelijk aan 109,6 µg/ml. Deze concentratie is het gemiddelde van de concentraties gemeten ten opzichte van een PHA en een BSA standaard. De absorbantie gemeten met Nanodrop (0,120) kan omgerekend worden naar concentratie proteı̈ne aan de hand van de extinctiecoëfficiënt. De ExPASy ProtParam tool geeft twee extinctiecoëfficiënten (280 nm) weer. De eerste waarde geeft de coëfficiënt weer wanneer alle cysteı̈ne residuen als disulfidebruggen voorkomen, de tweede waarde wanneer alle cysteı̈ne residuen gereduceerd voorkomen. Aangezien OSRIP1 geen cysteı̈ne residuen bevat, wordt gekozen voor de tweede waarde of 1,063 (Swiss Institute of Bioinformatics, 2016). Op deze manier geeft de Nanodrop methode een concentratie van 112,9 µg/ml. 46 4.3 RIP Assay 47 Figuur 4.14: Coomassiekleuring van een gel na SDS-PAGE met het Zeba staal van OSRIP1 na 1 passage over de Zeba kolom. 4.3.2 RIP Assay Een RIP assay werd uitgevoerd op het proteı̈ne RIP-M41. RIP-M41 vertoonde bij geen enkele concentratie activiteit. Dit betekent ofwel dat de refolding-on-column resulteerde in een verkeerde opvouwing van het proteı̈ne ofwel dat het proteı̈ne niet actief is, wat mogelijk betekent dat het RIP-M41 geen ribosoom-inactiverend proteı̈ne is. Ook voor OSRIP1 werden verschillende RIP assays uitgevoerd. Zo werd de assay uitgevoerd op twee biologische replicaten van OSRIP1. Tijdens de eerste RIP assay werden de concentraties 282,9 nM, 141,5 nM, 47 nM, 32,9 nM, 18,8 nM, 9,4 nM en 0 nM getest. Tijdens de tweede RIP assay werden gelijkaardige, doch licht verschillende, concentraties getest, nl. 282,9 nM, 188,8 nM, 141,5 nM, 94,5 nM, 47,2 nM, 18,9 nM en 0 nM. Het laatste staal (0 nM) werd als (negatieve) controle meegenomen en bestond uit DPBS zonder eiwit. Als negatieve controle werd 300 nM BSA gebruikt. Het resultaat wordt weergegeven in figuur 4.15. De negatieve controle BSA (300 nM) kent een quasi horizontaal verloop. Dit betekent dat de gemeten luminescentie maximaal is en de translatie van het luciferase ongestoord kan doorgaan. OSRIP1 vertoont in beide RIP assays een concentratie-afhankelijk, dalend lineair verloop: Naarmate een grotere hoeveelheid RIP wordt toegevoegd aan de ribosomen, wordt een sterkere inhibitie van de translatie opgemerkt. Bij een gemiddelde concentratie gelijk aan 260,1 nM OSRIP1 wordt alle translatie geı̈nhibeerd. De gemiddelde halfmaximal inhibitory concentration of IC50 is gelijk aan 115,7 nM OSRIP1. 47 4.3 RIP Assay 48 Figuur 4.15: RIP Assay van twee biologische replicaten van OSRIP1. E. coli rosetta met het OSRIP1 construct werd tweemaal vertrekkende van de glycerolstock opgegroeid en opgezuiverd. Op beide opgezuiverde fracties werd dezelfde RIP assay uitgevoerd. In het verleden werd de RIP assay reeds uitgevoerd voor het ribosoom-inactiverend proteı̈ne SNA-I (Sambucus nigra agglutinin) afkomstig van de vlier (Shang, 2015). Exact hetzelfde experiment werd in deze thesis opnieuw uitgevoerd. Dit type 2 RIP kan hier als positieve controle worden opgenomen. In figuur 4.16 wordt het resultaat van beide assays weergegeven. De experimenten bevestigen elkaar en vertonen allebei een concentratie-afhankelijk, dalend lineair verloop. Het eerdere experiment gaf een IC50-waarde gelijk aan 5,9 nM, het herhaalde experiment een IC50-waarde van 8,8 nM. Wanneer deze waarden worden vergeleken met het resultaat van OSRIP1 valt op dat de IC50-waarde voor OSRIP1 13 tot 20 keer hoger ligt dan dezelfde waarde voor SNA-I. Daaruit kan besloten worden dat OSRIP1 wel degelijk de translatie van proteı̈nen door ribosomen kan inhiberen, maar dat deze activiteit eerder beperkt is wanneer vergeleken wordt met SNA-I. 48 4.4 Lokalisatiestudie van OSRIP1 in Nicotiana benthamiana 49 Figuur 4.16: RIP Assay van 2 technische replicaten van SNA-I. In beide gevallen werd hetzelfde gelyofiliseerde SNA-I proteı̈ne gebruikt. 4.4 Lokalisatiestudie van OSRIP1 in Nicotiana benthamiana Voor aanvang van deze thesis werd reeds een lokalisatiestudie voor OSRIP1 uitgevoerd. Daarvoor werden de pK7FWG2 en pK7WGF2 vectoren gebruikt. In deze thesis wordt de lokalisatiestudie uitgevoerd aan de hand van de pEAQ-HT vector, met als bedoeling de resultaten bekomen met de pK7FWG2 en pK7WGF2 vectoren te bevestigen. Hiervoor werden fusieconstructen van OSRIP1 en eGFP aangemaakt. Zowel de N- (eGFP-OSRIP1 of OSRIP1N-GFP) als C-terminale (OSRIP1-eGFP of OSRIP1-C-GFP) constructen werden bekomen aan de hand van Gateway klonering. Hierna werden de GFP-fusieconstructen via Gibson assembly binnengebracht in de pEAQ-HT vector. 4.4.1 4.4.1.1 Aanmaak van de lokalisatieconstructen Toevoegen van de attB-sites Er werd vertrokken van een pJET1.2 vector waarin de coderende sequentie voor OSRIP1 aanwezig was. Deze vectoren waren reeds beschikbaar in het laboratorium en werden eerder al gebruikt voor aanmaak van de expressieconstructen (4.1.1). Aan de hand van twee opeenvolgende Q5 PCR-reacties werden aan het open leesraam de attB-sites toegevoegd. Voor de C-terminale GFP-fusieconstructen werd het stopcodon verwijderd zodat bij fusie met eGFP na de LR reactie het ORF van OSRIP1 overgaat in de eGFP sequentie. De primers voor de eerste PCR hebben een sequentie die complementair is met de uiteinden van het open leesraam en bevat een eerste deel van de 49 4.4 Lokalisatiestudie van OSRIP1 in Nicotiana benthamiana 50 attB-sites. Tijdens de tweede PCR-reactie worden de attB-sites vervolledigd. Het gebruikte Q5 polymerase heeft een hoge proofreading-activiteit, waardoor de kans op fouten in de geamplificeerde sequentie kleiner zijn. Het OSRIP1 construct met de volledige attB sites heeft een lengte van ongeveer 980 basenparen. Figuur 4.17 geeft het resultaat weer van de analyse van de DNA-fragmenten na vervollediging van de attB-sites. Wanneer de grootte van de DNA fragmenten vergeleken wordt met de ladder, bevinden ze zich tussen 900 en 1031 basenparen. Figuur 4.17: Analyse van DNA-fragmenten met volledige attB-sites. Voor de twee PCR-reacties werd een annealingstemperatuur van 68◦ C en een elongatietijd van 30 seconden toegepast. Er werden 35 cycli doorlopen. De gebruikte primers: P355, P356, P357, EVD2 en EVD4 4.4.1.2 Gateway klonering in pK7FWG2 en pK7WGF2 Door de juiste destinatievectoren (pK7FWG2 en pK7WGF2) te selecteren kan via de Gateway-technologie GFP N- en C-terminaal worden toegevoegd aan OSRIP1 (figuur 4.18). BP-reactie Door middel van de attB-sites kunnen de constructen binnengebracht worden in de pDONR221 donorvector. Het BP clonase II enzym werd toegevoegd aan het mengsel van de donorvector en de constructen. Dit enzym ligeert de constructen in de donorvector waardoor entry clones verkregen worden. Dit eindproduct werd via een heatshock binnengebracht in heat-shock competente E. coli cellen. Hierna werden de cellen uitgeplaat op LB-medium met kanamycine als selectiemerker zodat enkel de getransformeerde E. coli cellen konden groeien. Op een aantal kolonies werd een kolonie PCR uitgevoerd. Voor elk construct werd een kolonie geselecteerd waarvan een suspensiecultuur werd opgezet in LB-medium met kanamycine. De plasmiden werden opgezuiverd uit de bacteriën en de sequentie werd bepaald met behulp van DNA-sequencing. 50 4.4 Lokalisatiestudie van OSRIP1 in Nicotiana benthamiana 51 LR-reactie Het eindproduct van de BP-reactie werd gebruikt om tijdens de LR-reactie in te brengen in de destinatievector. Hierbij gebeurt de fusie met het eGFP. Voor de N-terminale fusie werd de pK7WGF2-vector gebruikt, voor de C-terminale fusie de pK7FWG2-vector (figuur 4.18). Dit leidt tot de vorming van de expression clones. Via heat-shock werden deze vectoren binnengebracht in heat-shock competente E. coli cellen. Deze cellen werden uitgeplaat op LB-medium met spectinomycine als selectiemerker. Figuur 4.18: De pK7FWG2 en pK7WGF2-vectoren gebruikt tijdens de Gateway klonering. De pK7FWG2-vector wordt gebruikt voor de C-terminale fusie, de pK7WGF2-vector voor de N-terminale fusie. Een kolonie PCR (met de additieven DMSO en betaı̈ne) werd uitgevoerd op verschillende kolonies om te screenen voor kolonies die het correcte expression clone hadden opgenomen. In figuur 4.19 wordt het resultaat van de kolonie PCR na gelelektroforese weergegeven. Het product heeft de verwachte grootte (ongeveer 900 bp). Aangezien overal een bandje met de correcte grootte werd waargenomen, werd voor beide constructen kolonie 1 geselecteerd voor opzuivering van het plasmide. 51 4.4 Lokalisatiestudie van OSRIP1 in Nicotiana benthamiana 52 Figuur 4.19: Analyse van DNA-fragmenten na de LR-reactie. Voor de kolonie PCR werd een annealingstemperatuur van 55◦ C en een elongatietijd van 1 minuut toegepast. Er werden 30 cycli doorlopen. De gebruikte primers: EVD472 en P1 4.4.1.3 Gibson Assembly in pEAQ-HT Het plasmide wordt via Gibson assembly binnengebracht in een pEAQ-HT vector. Deze vector is een transiënte expressievector ontworpen om snel en gemakkelijk recombinante proteı̈nen tot expressie te brengen in planten. Ter hoogte van de T-DNA transfer regio bevindt zich een P19 suppressor die silencing van genen onderdrukt waardoor grote hoeveelheden recombinant proteı̈ne tot expressie kunnen worden gebracht (Peyret and Lomonossoff, 2013). Omwille van bovenstaande voordelen wordt het construct aangemaakt via Gateway klonering in deze vector geligeerd. De pEAQ-HT vector (10 003 bp) werd door middel van een restrictiedigest met de enzymen AgeI en XhoI gelineariseerd. Het eindproduct van deze reactie werd op een 1,5% agarosegel geplaatst, waarna de fragmenten uit de gel werden geëxtraheerd en opgezuiverd door middel van de QIAquick Gel Extraction kit (Qiagen). De fusieconstructen van OSRIP1 en eGFP werden via een Gibson assembly geligeerd in de resulterende pEAQ-HT vector. Op de LR producten van OSRIP1 in de pK7WGF2- en pK7FWG2-vectoren (4.4.1.2) werd een Q5 PCR uitgevoerd ter amplificatie van enkel de inserts, zijnde de fusieconstructen tussen OSRIP1 en eGFP (P298, P299, P300, P301). Deze geamplificeerde fusieconstructen werden via Gibson assembly geligeerd in de gelineariseerde pEAQ-HT vector. De gevormde plasmiden werden binnengebracht in E. coli cellen en gegroeid op LB-medium met kanamycine. Aan de hand van een kolonie PCR werd de grootte van de opgenomen plasmiden gecontroleerd. Het resultaat werd opgenomen in figuur 4.20. Daaruit blijkt dat alle kolonies het construct hebben opgenomen en dus een DNA-fragment met een grootte van ongeveer 2100 bp weergeven. Van geselecteerde kolonies werd een suspensiecultuur opgezet, waarna het geproduceerde plasmide werd opgezuiverd. 52 4.4 Lokalisatiestudie van OSRIP1 in Nicotiana benthamiana 53 Figuur 4.20: Analyse van DNA-fragmenten na Gibson assembly. Voor de kolonie PCR werd een annealingstemperatuur van 60◦ C en een elongatietijd van 2 minuten en 10 seconden toegepast. Er werden 30 cycli doorlopen. De gebruikte primers: P327 en P328 4.4.2 Transformatie van Agrobacterium tumefaciens Het doel van dit experiment is de lokalisatie van OSRIP1 in plantencellen/weefsel te onderzoeken. Hiervoor wordt de plantpathogeen Agrobacterium tumefaciens gebruikt. Deze kan de T-DNA regio gelegen op de pEAQ-HT vector, waarin het insert zich bevindt, transfereren naar de plant. Op deze manier kunnen plantencellen getransformeerd worden. De verschillende vectoren werden via elektroporatie binnengebracht in Agrobacterium tumefaciens. Na de elektroshock werd 800 µl YEB-medium toegevoegd aan de cellen. Na 2 uur te groeien werd een hoeveelheid op YEB-medium met kanamycine en gentamycine uitgeplaat. Aan de hand van een agro-kolonie PCR werd gecontroleerd of de vector door het organisme werd opgenomen. Per construct werd 1 agro-kolonie geselecteerd om er een suspensiecultuur van te maken. 4.4.3 Transiënte expressie in Nicotiana benthamiana De suspensieculturen van de verschillende constructen werden 2 dagen gegroeid. Na verschillende wasstappen en het resuspenderen van de bacteriën in infiltratiebuffer met 100 µM acetosyringone, werd de OD bij 600 nm bepaald. Iedere oplossing werd verdund tot een OD-waarde van 0,05. Deze verdunning werd gebruikt om de tabaksbladeren te infiltreren. Twee á drie dagen na infiltratie werden stukjes van de geı̈nfiltreerde bladeren onder de confocale fluorescentiemicroscoop bekeken. Het resultaat werd opgenomen in figuur 4.21 voor beide GFPOSRIP1 constructen. Op onderstaande figuur wordt, zoals verwacht, fluorescentie waargenomen ter hoogte van het cytoplasma. OSRIP1 draagt geen signaalpeptide, waardoor het proteı̈ne na productie in het cytoplasma voorkomt. Ook in de kern wordt een sterk fluorescent signaal opgemerkt. De beelden voor het N-terminale construct bevestigen de resultaten verkregen bij het C-terminale construct (fguur 4.21). De resultaten hier bekomen bevestigen ook de lokalisatiestudie eerder uitgevoerd met de pK7FWG2- en pK7WGF2-vectoren. 53 4.5 In planta toxiciteit van OSRIP1 in Nicotiana bethamiana 54 Figuur 4.21: Lokalisatie van OSRIP1-C-GFP en OSRIP1-N-GFP aan de hand van pEAQ-HT vectoren 4.5 In planta toxiciteit van OSRIP1 in Nicotiana bethamiana Aangezien OSRIP1 in planten een cytoplasmatisch proteı̈ne blijkt te zijn, bestaat de kans dat het de ribosomen van de plant inhibeert. Daarom werd besloten om de in planta toxiciteit van OSRIP1 in Nicotiana benthamiana te onderzoeken. 4.5.1 Aanmaak van de toxiciteitsconstructen Om de toxiciteit van OSRIP1 in tabaksbladeren na te gaan, werden nieuwe constructen aangemaakt. Door hun hoge expressie in planten zijn de pEAQ-HT vectoren hiervoor zeer geschikt (Peyret and Lomonossoff, 2013). Na transiënte transformatie van de RIPs kan de toxiciteit in de bladeren opgevolgd worden door te controleren of de bladeren mogelijk toxische effecten vertonen. Er werden zowel constructen van de coderende sequentie met en zonder His-tag gemaakt. Op deze manier kan aan de hand van de His-tag het proteı̈ne met Western Blot gedetecteerd worden. Wordt het proteı̈ne gedetecteerd, dan kan het toxische effect mogelijk gekoppeld worden aan de aanwezigheid van het ribosoom-inactiverend proteı̈ne. Er werd vertrokken van een suspensiecultuur van E. coli TOP10 cellen. Deze bacteriële cellen bevatten een pET-21a vector met het ORF van OSRIP1 als insert. Uit deze 5 ml cultuur werd het pET-21a plasmide opgezuiverd via miniprep. Dit plasmide werd opgestuurd voor sequencing ter controle van de sequentie. Aan de hand van een Q5 PCR werd het insert geamplificeerd en werd het construct voor OSRIP1 met en zonder His-tag verkregen. De His-tag werd toegevoegd door middel van een primer (P436) met daarin de sequentie voor de His-tag. Het 54 4.5 In planta toxiciteit van OSRIP1 in Nicotiana bethamiana 55 PCR product werd op agarose gel geplaatst voor extractie (figuur 4.22). Na opzuivering werd op deze manier de constructen OSRIP1 - His-tag en OSRIP1 + His-tag bekomen. Figuur 4.22: Analyse van DNA-fragmenten na Q5 PCR. Voor de Q5 PCR werd een annealingstemperatuur van 68◦ C en een elongatietijd van 40 seconden toegepast. Er werden 35 cycli doorlopen. De gebruikte primers: P389, P390 en P436. Deze constructen werden door middel van Gibson assembly binnengebracht in de pEAQ-HT vector. Na heatshock in E. coli TOP10 cellen werd een kolony-PCR uitgevoerd op een selectie kolonies (figuur 4.23). Daaruit bleek dat iedere kolonie een bandje met verwachte grootte weergaf (ongeveer 10 000 bp). Kolonie 1 voor OSRIP1 - His-tag en kolonie 2 voor OSRIP1 + His-tag werden geselecteerd voor de aanmaak van een suspensiecultuur, waarvan later een glycerolstock werd aangemaakt. Figuur 4.23: Analyse van DNA-fragmenten na kolonie PCR. Voor de kolonie PCR werd een annealingstemperatuur van 60◦ C en een elongatietijd van 2 minuten toegepast. Er werden 30 cycli doorlopen. De gebruikte primers: P327 en P328 55 DISCUSSIE 56 5 Discussie In deze thesis werd gewerkt met 2 proteı̈nen: OSRIP1 (type 1 RIP) en RIP-M41 (type 3 RIP). Ook het afzonderlijke RIP-domein van RIP-M41 werd onderzocht. Voor ieder proteı̈ne/domein werden expressieconstructen bestaande uit het ORF van het proteı̈ne/domein en een C-terminale His-tag, aangemaakt. Deze constructen werden door middel van Gibson assembly in de pET-21a vector geligeerd en daarna via heat-shock in E. coli rosetta (DE3) cellen gebracht. Deze cellen werden opgegroeid en op het ideale moment in hun groei geı̈nduceerd met IPTG ter productie van het recombinante proteı̈ne. De gebruikte vector, pET-21a, is een bacteriële expressievector ontwikkeld voor het kloneren en tot expressie brengen van recombinante proteı̈nen in E. coli (Novagen, 2003). Het proteı̈ne kan tot expressie gebracht worden in het cytoplasma van de E. coli cellen en kan daar lokaal accummuleren. Het is echter ook mogelijk dat het proteı̈ne onder de vorm van inclusion bodies in E. coli cellen voorkomt (Rosano and Ceccarelli, 2014). De vorming van deze aggregaten van eiwit is afhankelijk van verschillende factoren. Zo kan het cytoplasma van de E. coli cellen verschillen van dat van de originele gastheer in bijvoorbeeld het aantal beschikbare chaperones voor opvouwing van het eiwit. Hierdoor gebeurt de opvouwing van de proteı̈nen trager en kunnen hydrofobe regio’s in het polypeptide beschikbaar worden voor onderlinge interactie. Dit alles kan aanleiding geven tot minder stabiel eiwit en de vorming van inclusion bodies of geaggregeerde proteı̈nen (Carrió and Villaverde, 2002). Ook bij het tot overexpressie brengen van endogene proteı̈nen kunnen inclusion bodies gevormd worden. Dit suggereert dat in de meeste gevallen de inclusion bodies het gevolg zijn van overexpressie van een proteı̈ne en dit onafhankelijk van het proteı̈ne zelf (Lilie et al., 1998). De geaggregeerde proteı̈nen aanwezig in de inclusion bodies hebben een verkeerde opvouwing en zijn daardoor biologisch niet actief (Sørensen and Mortensen, 2005). Bij de productie van recombinante proteı̈nen is het belangrijk dat een actief en oplosbaar proteı̈ne wordt bekomen. Daarvoor bestaan er twee strategieën. Een eerste mogelijkheid is het gebruiken van de inclusion bodies als startpunt (Sørensen and Mortensen, 2005). Aan de hand van chaotropische reagentia kunnen de proteı̈nen uit deze inclusion bodies opgelost worden, waarna ze via een refolding stap mogelijk hun actieve structuur terug kunnen aannemen (5.1) (Lemercier et al., 2003). Een tweede mogelijkheid bestaat erin in te grijpen ter hoogte van de expressie zodat het proteı̈ne als oplosbare fractie in het cytoplasma aanwezig is. Dit kan onder andere door een fusieproteı̈ne te creëren tussen het gewenste proteı̈ne en een zeer goed oplosbaar domein zoals bijvoorbeeld het E. coli maltosebindend proteı̈ne (MBP). Ook het samen tot expressie brengen van het gewenste proteı̈ne en chaperones kan een oplossing zijn. Daarbij begeleiden de chaperone-eiwitten de polypeptideketen tijdens het opvouwproces waardoor aggregatie vermeden wordt. Een derde optie is het verlagen van de groeitemperatuur zodat cellen een vertraagde translatie kennen en ongevouwen proteı̈nen in lagere concentraties in het cytoplasma aanwezig zijn. Dit verlaagt de kans op aggregatie ter vorming van inclusion bodies (Sørensen and Mortensen, 2005). De recombinante proteı̈nen werden tot expressie gebracht in E. coli rosetta (DE3) cellen. Deze E. coli stam bevat een plasmide, pRARE, dat tRNA’s levert voor codons die in E. coli zelden gebruikt worden. Hierdoor kunnen eukaryote proteı̈nen succesvol in E. coli tot expressie gebracht worden (Berrow et al., 2006; Gräslund et al., 2008). 56 5.1 RIP-M41 57 Een bepaald ribosoom-inactiverend proteı̈ne kan slechts heteroloog tot expressie worden gebracht in een E. coli stam als het RIP geen activiteit vertoont tegenover de bacteriële ribosomen. Zo vertoont PAP, een type 1 RIP, een sterke inhiberende activiteit ten opzichte van bacteriële en plantribosomen (Nielsen and Boston, 2001). Nigrine b (type 2 RIP) daarentegen, inhibeert ribosomen van zoogdieren, maar geen ribosomen van planten of bacteriën (Girbés et al., 1993a). Ebuline I, een type 2 RIP, vertoont sterke inhibitie van konijnen en rattenribosomen, maar vertoonde eveneens geen activiteit ten opzichte van bacteriële of plantribosomen (Girbés, 1993b). Vertoont het ribosoom-inactiverend proteı̈ne activiteit tegen de ribosomen van prokaryoten, dan kan het gebruik van een induceerbare vector een oplossing bieden. Door het proteı̈ne pas tot expressie te brengen na de groeifase, kan toxiciteit tijdens de groei vermeden worden (Saı̈da et al., 2006). In deze thesis werd gebruik gemaakt van de induceerbare vector pET-21a. Andere mogelijkheden zijn het toevoegen van een N-terminaal signaalpeptide aan de sequentie van het RIP waardoor het proteı̈ne naar het periplasma wordt verplaatst (Rosano and Ceccarelli, 2014). Als laatste kan ook gebruik gemaakt worden van een E. coli stam die de pLysS of pLysE vector bevat. Deze vectoren brengen een lysozyme tot expressie dat selectief kan binden met T7 RNA polymerase. Dit heeft als gevolg dat het T7 RNA polymerase geı̈nactiveerd wordt, waardoor de T7 promoter en bijgevolg transcriptie zeer streng kan gereguleerd worden (EMBL, 2016a; Saı̈da et al., 2006; Schumann and Ferreira, 2004). 5.1 RIP-M41 Het RIP-M41 proteı̈ne werd door E. coli rosetta (DE3) in de onoplosbare eiwitfractie geproduceerd (figuur 4.4). Bij de productie van recombinante proteı̈nen in een E. coli stam, neemt de kans op het produceren van een oplosbaar proteı̈ne significant af vanaf een moleculair gewicht van ∼60 kDa (Gräslund et al., 2008). RIP-M41 heeft een grootte van ongeveer 70 kDa en valt dus binnen deze categorie. Daarnaast bevat 36,3% van de aminozuren in de aminozuursequentie van RIP-M41 een hydrofobe zijketen (figuur 7.8) (Swiss Institute of Bioinformatics, 2016). Deze zijketens kunnen met elkaar interageren ter vorming van aggregaten en uiteindelijk neerslaan onder de vorm van inclusion bodies. Proteı̈nen in de onoplosbare eiwitfractie vertonen vaak een foutieve opvouwing (Gräslund et al., 2008). Dit kan het gevolg zijn van codon bias. Dit komt voor wanneer in het DNA coderend voor het proteı̈ne, bepaalde codons die coderen voor hetzelfde aminozuur meer of minder frequent voorkomen dan in het DNA van de gekozen gastheer (Rosano and Ceccarelli, 2014). Zo kan het uitwisselen van een zeldzaam gebruikt codon voor een frequenter gebruikt codon een afname van de enzymatische activiteit teweegbrengen (Angov et al., 2008; Rosano and Ceccarelli, 2014). Een zeldzaam gebruikt codon wordt gedefinieerd als een codon dat door E. coli met een frequentie kleiner dan 1% gebruikt wordt (Rosano and Ceccarelli, 2014). Aan de hand van een online tool (UCLA, 2016) werden de zeldzame codons in de DNA sequentie van RIP-M41 gedetecteerd (figuur 7.7). Vooral de zeldzame codons voor arginine, leucine, isoleucine en proline hebben een grote invloed. Er werden 26 zeldzame arginine codons gedetecteerd waarvan 6 als een tandem repeat van 2 codons. Daarnaast werden ook voor leucine, isoleucine en proline, respectievelijk 8, 7 en 5 zeldzame codons gelokaliseerd (UCLA, 2016). RIP-M41 bestaat uit twee domeinen. In een studie werden de gensequenties en hun respectievelijke proteı̈nestructuur in E. coli met elkaar vergeleken. Daarbij werd waargenomen dat structurele elementen, zoals een α- 57 5.1 RIP-M41 58 helix, meer frequent gebruikte codons bevatten. Daartegenover werden vooral meer zeldzame codons gebruikt ter hoogte van de domeingrenzen. Hierdoor is het mogelijk dat ter hoogte van die grenzen de ribosomen de translatie tijdelijk vertragen en het reeds gevormde domein al geheel of gedeeltelijk kan opvouwen (Angov et al., 2008). Door eukaryote genen in te brengen in E. coli rosetta (DE3) geldt een gewijzigde codon-code waardoor mogelijk voor een bepaald codon een ander aminozuur in het proteı̈ne wordt ingebouwd. De rosetta stam werd eveneens aangerijkt met tRNA’s voor meer zeldzaam gebruikte codons in E. coli (Novagen, 2003). Dit heeft als gevolg dat ter hoogte van de domeingrenzen de correcte aminozuren kunnen ingebouwd worden, maar ook dat de tRNA’s nu mogelijk te abundant voorzien worden. Hierdoor wordt de vertraging in translatie ter hoogte van de domeingrenzen geminimaliseerd en kunnen de domeinen niet meer individueel en correct opvouwen. Inclusion bodies bevatten een grote hoeveelheid relatief puur proteı̈ne, waardoor het interessant zou zijn om dit onoplosbaar proteı̈ne naar zijn originele en actieve conformatie te kunnen omzetten. Om actief en oplosbaar proteı̈ne te verkrijgen moeten de inclusion bodies in oplossing gebracht worden, waarna de proteı̈nen heropgevouwd dienen te worden. Verloopt deze refolding stap correct dan kan op zijn minst een deel van de proteı̈nen terug zijn originele activiteit vertonen (Lemercier et al., 2003). Na opzuivering met behulp van IMAC werd in alle elutiefracties (behalve de eerste) het RIP-M41 proteı̈ne waargenomen. Daarnaast werden ook lichte bandjes overeenkomstig met kleinere fragmenten waargenomen (figuur 4.6). Dit zijn mogelijk degradatieproducten van het RIP-M41 proteı̈ne. De extra bandjes op de gel kunnen echter ook het gevolg zijn van aspecifieke binding van bacteriële proteı̈nen zonder His-tag. Ongeveer 2% van alle aminozuren in proteı̈nen zijn een histidine residu. Wanneer proteı̈nen in hun aminozuursequentie 2 of meer histidine residuen naast elkaar dragen, kunnen deze proteı̈nen voldoende affiniteit vertonen met de matrix (Bornhorst and Falke, 2010). Een voorbeeld hiervan is het proteı̈ne Fur of ferric uptake regulator. Dit is een proteı̈ne met een grootte van 16,7 kDa en 8,1% histidine residuen, dat instaat voor het reguleren van de intracellulaire concentratie ijzer in E. coli. Voor het uitoefenen van zijn functie is een zink bindingsplaats aanwezig. Deze bindingsplaats verklaart waarom Fur een hoge affiniteit vertoont voor de NiNTA matrix. Bij elueren met een imidazoolconcentratie hoger dan 80 mM, zal dit proteı̈ne met het gewenste proteı̈ne mee geëlueerd worden. (Bolanos-Garcia and Davies, 2006). Op een elutiefractie van het proteı̈ne RIP-M41 werd een RIP assay uitgevoerd. Bij geen enkele concentratie werd activiteit van het proteı̈ne gedetecteerd. Dit betekent dat ofwel de refolding-on-column resulteerde in een foutieve opvouwing van het proteı̈ne ofwel dat het proteı̈ne niet als ribosoom-inactiverend proteı̈ne actief is. In het eerste geval resulteerde de foutieve opvouwing in een structuur die niet de correcte activiteit vertoont. In het tweede geval is RIP-M41 geen echt ribosoom-inactiverend proteı̈ne. De aminozuursequentie van RIP-M41 werd geanalyseerd met behulp van de NCBI database voor geconserveerde domeinen (NCBI, 2016). De tool kon enkel een peptidase van de M41 familie detecteren. Over een ribosoom-inactiverende eigenschap/domein werd niets vermeld (NCBI, 2016). Dit valt mogelijk te verklaren doordat RIP-M41 ter hoogte van de actieve site een gemuteerd aminozuur bezit. De actieve site van RIPs is sterk geconserveerd en bestaat uit Y-Y-E-R-W. Bij het RIP-M41 werd het arginine (R) residu vervangen door een lysine (K) residu. Day et al. onderzocht het effect van deze substitutie bij ricine. Uit dit onderzoek bleek dat ricine nog steeds actief was, maar dat het gemuteerde ricine een activiteit vertoonde die 3x lager was dan de activiteit van het niet-gemuteerde ricine (Day et al., 1996). Dit 58 5.2 Het RIP(M41) domein 59 betekent dat deze substitutie ter hoogte van de actieve site waarschijnlijk niet nefast is voor de activiteit van het proteı̈ne. 5.2 Het RIP(M41) domein Omdat het RIP-M41 eiwit niet in een actieve vorm kan worden verkregen, werd beslist het RIP-domein zonder zijn M41-domein tot expressie te brengen in E. coli rosetta. Dit domein werd in zowel de oplosbare als onoplosbare fractie geproduceerd (figuur 4.4). Aangezien proteı̈nen in de oplosbare fractie de correcte opvouwing bezitten, de proteı̈nen reeds in oplossing aanwezig zijn en refolding-on-column van het volledige proteı̈ne geen actief proteı̈ne opleverde, werd gekozen om enkel met de oplosbare fractie verder te werken. Het RIP(M41) domein heeft een theoretische grootte van 34 kDa en heeft over zijn volledige aminozuursequentie 35,0% aminozuren met hydrofobe zijketens (Swiss Institute of Bioinformatics, 2016). Eerder werd aangehaald dat een proteı̈ne met een moleculair gewicht groter dan ∼60 kDa een grote kans heeft om door E. coli in onoplosbare vorm te worden aangemaakt (Gräslund, 2008). Aangezien het domein kleiner is dan de voorgeschreven ∼60 kDa, is de kans groot dat E. coli het recombinante domein in oplosbare vorm aanmaakt. Het percentage hydrofobe aminozuren in het RIP-domein (35,0%) en het volledige RIP-M41 proteı̈ne (36,3%) is ongeveer gelijk. De oplosbare fractie van het RIP-domein werd opgezuiverd door middel van IMAC. Het domein was in iedere elutiefractie aanwezig. Ook hier werden op de coomassiegel naast het gewenste proteı̈ne andere fragmenten waargenomen. Aangezien zowel grotere als kleinere fragmenten zichtbaar zijn, is de aanwezigheid van deze proteı̈nen het gevolg van aspecifieke binding met de NiNTA matrix (Bornhorst and Falke, 2010). NaCl interfereert tijdens de metingen voor de RIP assay. Daarom werden de bekomen elutiefracties gepoold en overnacht gedialyseerd ter verwijdering van het NaCl en imidazool. Daarbij werd echter opgemerkt dat het RIP(M41) domein precipiteert in afwezigheid van zout. Voor dit probleem werd tot nu toe nog geen oplossing gevonden. Het probleem kan mogelijk opgelost worden door voor het ontzouten een snellere methode (dan dialyse) toe te passen. Op deze manier kan de RIP assay opgestart worden kort na het ontzouten, zodat het proteı̈ne onvoldoende tijd heeft om te precipiteren. De commercieel beschikbare Zeba kolom (Thermo Fisher Scientific) is een mogelijkheid om snel een staal te ontzouten en tegelijk het proteı̈ne in de gewenste buffer te brengen. 5.3 OSRIP1 Er werd eveneens eveneens gewerkt op een nieuw ribosoom-inactiverend proteı̈ne, OSRIP1. Dit proteı̈ne werd in E. coli rosetta tot expressie gebracht in zowel de oplosbare als onoplosbare eiwitfractie. (figuur 4.5). Voor de opzuivering van OSRIP1 werd beslist om verder te werken met enkel de oplosbare fractie. Dit omdat in deze fractie het proteı̈ne de correcte conformatie heeft behouden. Het OSRIP1 proteı̈ne heeft een grootte van 31 kDa. Ook dit proteı̈ne heeft een moleculair gewicht lager dan 60 kDa. Dit is mogelijk een reden waarom het proteı̈ne in de oplosbare fractie wordt waargenomen. Er wordt echter ook ter hoogte van de onoplosbare fractie proteı̈ne gedetecteerd. Uit de aminozuursequentie van OSRIP1 59 5.4 Lokalisatie van OSRIP1 60 blijkt dat 43,7% van alle aminozuren hydrofobe zijketens dragen (figuur 7.9) (Swiss Institute of Bioinformatics, 2016). Hydrofobe proteı̈nen kunnen ter hoogte van hun hydrofobe zijketens met elkaar interageren en zorgen zo voor een verhoogde kans op aggregatie. Dit is mogelijk een verklaring voor het aanwezig zijn van het proteı̈ne in de onoplosbare fractie (Sørensen and Mortensen, 2005). Na opzuivering door middel van IMAC werden op twee biologische replicaten van OSRIP1 RIP assays uitgevoerd. Dit betekent dat beide eiwitfracties het eindproduct zijn van twee afzonderlijke opzuiveringen. Er werd een inhibitie van 50% (IC50) waargenomen bij een concentratie OSRIP1 gelijk aan 115,7 nM. Als positieve controle werd de RIP assay uitgevoerd op het ribosoom-inactiverend proteı̈ne SNA-I . Dit type 2 RIP heeft een IC50-waarde gelijk aan 8,8 nM. Dit betekent dat dit proteı̈ne reeds bij een concentratie van 8,8 nM 50% van de translatie uitgevoerd door konijnen ribosomen, inhibeert. Wanneer de vergelijking gemaakt wordt met OSRIP1 (type 1 RIP), dan is het SNA-I (type 2 RIP) tot 13 keer toxischer. In de literatuur werd voor verschillende andere ribosoom-inactiverende proteı̈nen een IC50-waarde teruggevonden. Alle waarden hieronder zijn de IC50-waarde ten opzichte van ribosomen afkomstig uit het lysaat van konijnen reticulocyten. Zo ontdekte Barbieri et al. dat PAP-C reeds bij een concentratie van 0,067 nM de proteı̈nesynthese 50% inhibeert (Barbieri et al., 1989). Verschillende andere type 2 RIPs vertonen een vergelijkbare cytotoxiciteit: De IC50-waarde van ricine, abrine, volkensine, ebuline f en ebuline l zijn respectievelijk gelijk aan 0,1 nM, 0,5 nM, 0,37 nM, 0,03 nM en 0,15 nM (Shang, 2015). Deze RIPs zijn tot 300x toxischer dan SNA-I en bijna 3500x toxischer dan OSRIP1. Bij het interpreteren van deze resultaten is het zeer belangrijk dat de meeste ribosoom-inactiverende proteı̈nen een zekere specificiteit kennen voor bepaalde types ribosomen. Dit werd eerder ook al aangehaald bij 5. Zo vertoont PAP, een type 1 RIP, een sterke inhiberende activiteit ten opzichte van bacteriële en plantribosomen (Nielsen and Boston, 2001), terwijl nigrine b (type 2 RIP) ribosomen van zoogdieren, maar geen ribosomen van planten of bacteriën kan inhiberen (Girbés et al., 1993a). Hieruit kan besloten worden dat OSRIP1 een lage activiteit vertoont tegenover konijnen ribosomen, maar dat het mogelijk een hoge toxiciteit vertoont ten opzichte van insecten- of fungale ribosomen. Om een volledig beeld van de activiteit van OSRIP1 te verkrijgen, moet het proteı̈ne getest worden op verschillende types ribosomen. 5.4 Lokalisatie van OSRIP1 Voor de lokalisatiestudie werden fusieconstructen van OSRIP1 en eGFP aangemaakt, dit zowel in N- als Cterminale vorm. Als vector werd de pEAQ-HT vector gebruikt. Deze vectoren zijn transiënte expressievectoren. Dankzij het ingebouwde CPMV-HT expressiesysteem en de P19 suppressor kan in de plant zeer snel en in grote hoeveelheden, recombinant proteı̈ne geproduceerd worden (Peyret and Lomonossoff, 2013). De P19 suppressor is afkomstig uit het Tomato bushy stunt virus (TBSV) en kan gene silencing in planten en dieren onderdrukken. Bij een virale infectie van de plant wordt een toename aan siRNA ter hoogte van het cytoplasma waargenomen. P19 kan aspecifiek binden met deze siRNA moleculen. Hierdoor kunnen deze siRNA moleculen niet langer binden met het RISC complex en wordt silencing onderdrukt (Garabagi et al., 2012). De plasmiden werden via elektroporatie 60 5.4 Lokalisatie van OSRIP1 61 binnengebracht in Agrobacterium tumefaciens, die op zijn beurt gebruikt werd voor de transiënte transformatie van de epidermiscellen van tabaksbladeren (Nicotiana benthamiana). Geı̈nfiltreerde delen van de bladeren werden onder de confocale fluorescentiemicroscoop bestudeerd. De transiënte transformatie was heel efficiënt verlopen. Zo werd bij zowel de N- als C-terminale OSRIP1constructen bij verschillende aan elkaar grenzende cellen expressie van het fusieproteı̈ne waargenomen (figuur 4.21). Door de aanwezigheid van de P19 suppressor ter hoogte van het T-DNA van de pEAQ-HT vector wordt gene silencing onderdrukt (Peyret and Lomonossoff, 2013). Dit heeft als gevolg dat de expressie van het fusieproteı̈ne in de bladeren niet geremd wordt en de kans op het lokaliseren van getransformeerde cellen onder de microscoop toeneemt. Op figuur 4.21 is duidelijk te zien dat het proteı̈ne OSRIP1 in het cytoplasma en de kern gelokaliseerd is. De C- en N-terminale GFP-fusies bevestigen elkaar. Aangezien OSRIP1 geen signaalpeptide draagt, werd verwacht dat OSRIP1 een cytoplasmatisch proteÏne is. In de literatuur werd echter nooit eerder vermeld dat ribosoominactiverende proteı̈nen ook in de kern kunnen voorkomen. Opdat een proteı̈ne de kern via de nucleaire poriën kan binnendringen, moet ter hoogte van de sequentie een nuclear localization signal (NLS) aanwezig zijn. Een klassiek NLS signaal bestaat uit basische residuen zoals lysine en arginine (Kabachinski and Schwartz, 2015). Aangezien de aminozuursequentie van OSRIP1 (figuur 7.9) geen regio’s met een lokaal hoge concentratie aan deze aminozuren bevat, kan OSRIP1 vermoedelijk niet via actief transport de kern betreden. Een alternatief voor actief transport is vrije diffusie. Vrij GFP kan door zijn geringe grootte (±27 kDa) en langwerpige vorm doorheen de nucleaire poriën diffunderen tot in de kern (Hink et al., 2000). De C- en N-terminale constructen hebben een totale grootte van 58 kDa (OSRIP1 heeft een grootte van 31 kDa, GFP een grootte van 27 kDa). Aan het einde van de 20e eeuw werd de opening van het nuclear pore complex (NPC) geschat op 9 tot 12 nm in diameter. Hieruit werd besloten dat de maximale grootte van proteı̈nen die kunnen migreren doorheen de nucleaire membraan door middel van passieve diffusie, gelijk is aan 60 kDa. In een studie van Wang and Brattain echter, werd ontdekt dat proteı̈nen met een grootte van 90 tot 110 kDa ook doorheen de nucleaire poriën in de kern kunnen diffunderen, weliswaar met een lagere efficiëntie. Doch, dit suggereert dat ook proteı̈nen zonder nucleair lokalisatie signaalpeptide de kern kunnen betreden (Wang and Brattain, 2007). Dit verklaart mogelijk waarom ook een fluorescent signaal wordt waargenomen ter hoogte van de kern. Om zeker te zijn dat het waargenomen fluorescente signaal niet afkomstig is van vrij eGFP door bijvoorbeeld degradatie van het fusieproteı̈ne, kan het intact zijn van het fusieproteı̈ne nagegaan worden door middel van een Western blot analyse. Daarvoor worden de cellen vernietigd en komt het fusieproteı̈ne vrij. Na centrifugeren worden de kapotte cellen gescheiden van hun celinhoud. De proteı̈nen kunnen geanalyseerd worden via een Western Blot analyse met een primair, anti-GFP antilichaam. Wanneer een bandje wordt waargenomen op de correcte hoogte (±58 kDa; OSRIP1 (31 kDa) en GFP (27 kDa)) en geen bandje wordt waargenomen ter hoogte van vrij eGFP (±27 kDa), kan het fluorescente signaal enkel veroorzaakt worden door aanwezigheid van het fusieproteı̈ne. 61 5.5 In planta toxiciteit 5.5 62 In planta toxiciteit Tijdens de lokalisatiestudie werd het OSRIP1 proteı̈ne ter hoogte van het cytoplasma waargenomen. In de literatuur werd teruggevonden dat RIPs uit graangewassen geen signaalsequentie dragen en daardoor in het cytosol voorkomen. Daar kunnen ze constant met ribosomen van de plant in contact komen en mogelijk de ribosomen inhiberen. Toch vertonen deze RIPs in normale in vivo concentraties, weinig tot geen activiteit tegenover de plant ribosomen. Deze cytosolische RIPs vertonen ook geen antivirale activiteit. Tot op heden is het belang van de lokalisatie van het RIP en de specificiteit voor bepaalde types ribosomes nog ongekend (Nielsen and Boston, 2001). Om die reden is het interessant om de in planta toxiciteit van OSRIP1 te bestuderen. Tijdens deze thesis werden hiervoor enkel de constructen aangemaakt: het ORF van OSRIP1 met en zonder een His-tag. Vanwege hun hoge expressie in planten werden ook hiervoor de pEAQ-HT vectoren gebruikt. Deze constructen kunnen getransformeerd worden in A. tumefaciens. Bladeren van N. benthamiana kunnen met deze bacterie transiënt geı̈nfiltreerd worden ter expressie van de proteı̈nen. Als negatieve controle werd ook GFP geligeerd in een pEAQ-HT vector. De toxiciteitsconstructen werden zowel met als zonder His-tag aangemaakt. Omdat niet bekend is of de Histag een invloed heeft op de toxiciteit van het RIP ter hoogte van de plant ribosomen, worden beide constructen tot expressie gebracht in N. benthamiana. Dit om mogelijk toxische effecten ter hoogte van de geı̈nfiltreerde bladeren te detecteren. Deze bladeren geı̈nfiltreerd met het OSRIP1 + His-tag construct kunnen gecrusht worden, waarna het vrijgekomen OSRIP1 proteı̈ne met His-tag kan gedetecteerd worden aan de hand van een Western Blot analyse met anti-His antilichamen. Op deze manier kan het waarnemen van mogelijk toxische effecten ter hoogte van de bladeren gekoppeld worden aan de aanwezigheid van OSRIP1 via Western blot analyse. De mogelijke toxische effecten kunnen zeer breed geı̈nterpreteerd worden. Er zijn visueel zichtbare effecten zoals het waarnemen van lesies ten gevolge van celdood ter hoogte van de geı̈nfiltreerde bladeren. Maar er zijn ook niet-visuele mogelijkheden. Zo kunnen door middel van biochemische assays veranderingen binnenin het blad en/of de cellen bepaald worden. Zo kan onder meer de invloed van OSRIP1 op de vorming van reactive oxygen species (ROS) of de concentratie chlorofyl onderzocht worden. Op dit moment is de uitkomst van dit experiment nog onbekend. Er zijn echter twee mogelijheden: (i) de bladeren vertonen toxische effecten ten gevolge van de aanwezigheid van OSRIP1 in het cytoplasma of (ii) er worden geen toxische effecten waargenomen. In het eerste geval worden de toxische effecten veroorzaakt door inhibitie van de ribosomen ter hoogte van het cytoplasma. Dit kan wijzen op een soort gerichte zelfmoord van de plant als reactie op de aanwezigheid van het toxische OSRIP1 proteı̈ne. Volgens het programma Genevestigator wordt OSRIP1 meer tot expressie gebracht onder invloed van abscisinezuur (ABA) en jasmijnzuur (JA). ABA wordt hoofdzakelijk onder abiotische stressfactoren (droogte, zoutconcentratie, . . . ) opgereguleerd. Ook bij virale infecties en bij insectenvraat kan de expressie van ABA toenemen (Mauch-Mani and Mauch, 2005; Walters, 2015). JA wordt in de plant opgereguleerd bij infectie met fungi of herbivore insecten (Santino et al., 2013; Walters, 2015). Aangezien JA en ABA enkel bij insectenvraat allebei verhoogd tot expresie komen, is het mogelijk dat OSRIP1 een functie heeft in de verdediging van de plant tegen insecten. In het tweede geval heeft de aanwezigheid van OSRIP1 bij de plantenribosomen geen effect op de werking van de plantencel. Dit kan mogelijk verklaard worden 62 5.5 In planta toxiciteit 63 door resistentie van de waardeigen ribosomen voor het ribosoom-inactiverend proteı̈ne. Anderzijds is het mogelijk dat OSRIP1 een gerichte specificiteit vertoont voor bepaalde types ribosomen en ze omwille van die reden geen interactie vertonen met de ribosomen van de plant. 63 CONCLUSIE EN PERSPECTIEVEN 64 6 Conclusie en perspectieven In deze thesis werden de proteı̈nen OSRIP1 en RIP-M41 en het RIP(M41) domein heteroloog tot expressie gebracht in E. coli rosetta(DE3) en opgezuiverd. Het RIP-M41 eiwit werd gedetecteerd in de onoplosbare fractie. Om actief eiwit te verkrijgen, werd dit proteı̈ne in oplossing gebracht en werd een refolding-on-column uitgevoerd. OSRIP1 en het RIP(M41) domein werden in de oplosbare fractie geproduceerd. Daardoor hebben ze hun correcte opvouwing behouden. Zowel OSRIP1 als RIP-M41 als het RIP(M41) domein werden door middel van IMAC opgezuiverd. In sommige van de elutiefracties werden aspecifiek gebonden proteı̈nen waargenomen. Door middel van een RIP assay kon voor OSRIP1 de inhiberende activiteit op de ribosomen bepaald worden. De IC50-waarde was gelijk aan 115,7 nM. Veel andere RIPs vertonen een veel hogere toxiciteit. Ook voor RIP-M41 werd een RIP assay uitgevoerd. Dit proteı̈ne vertoonde geen enkele activiteit. Mogelijk is dit het gevolg van een foutieve opvouwing tijdens de refolding-on-column stap of bezit het RIP-M41 geen ribosoom-inactiverende activiteit. Het RIP(M41) domein precipiteert in afwezigheid van zout. Hier werd enkel dialyse getest als ontzoutingstechniek. Een snellere methode om te ontzouten kan mogelijk het precipiteren beperken. Mogelijk biedt de Zeba kolom (Thermo Fisher Scientific) hier een oplossing en kan ook voor het RIP(M41) domein een RIP assay worden uitgevoerd. De activiteit van het RIP(M41) domein kan dan vergeleken worden met de activiteit van het volledige RIP-M41 proteı̈ne. Daarnaast kan ook het M41-peptidase domein van het RIP-M41 proteı̈ne tot expressie gebracht worden. Van dit domein kan dan de protease-activiteit onderzocht worden. Als laatste kan de RIP assay ook uitgebreid worden naar verschillende types ribosomen. Op deze manier kan een duidelijk beeld van de specificiteit van verschillende RIPs geschetst worden. Voor OSRIP1 werd ook een lokalisatiestudie uitgevoerd. Daarbij werd een sterke indicatie geleverd dat OSRIP1 een cytoplasmatisch eiwit is. Het proteı̈ne werd ook in de kern gedetecteerd. Dit werd nog niet in de literatuur beschreven. Het is mogelijk dat het proteı̈ne door vrije diffusie doorheen de nucleaire poriën in de kern verzeild is geraakt. Aangezien OSRIP1 in planten een cytoplasmatisch proteı̈ne blijkt te zijn, kan dit RIP mogelijk contact maken met de ribosomen van de plant. Aan de hand van toxiciteitsconstructen kan een mogelijk negatief effect op de ribosomen worden onderzocht. Deze constructen kunnen via A. tumefaciens transiënt tot expressie gebracht worden in N. benthamiana. Na enkele dagen kunnen de bladeren gescreend worden op mogelijke toxische effecten, zoals lesies, veranderingen in ROS of chlorofyl concentraties, . . . . Als geen toxische effecten worden gedetecteerd, dan lijkt de aanwezigheid van OSRIP1 geen invloed te hebben op de ribosomen van de plant. Dit kan mogelijk verklaard worden door resistentie van de waardeigen ribosomen. Worden echter wel toxische effecten waargenomen dan worden deze mogelijk veroorzaakt door inhibitie van de ribosomen van de plant. Dit kan wijzen op een vorm van gerichte zelfmoord door de plant. OSRIP1 wordt verhoogd tot expressie gebracht in aanwezigheid van abscisinezuur en jasmijnzuur. Beide planthormonen worden opgereguleerd wanneer de plant aangevallen wordt door insecten. Dit wijst op een mogelijke rol van OSRIP1 in de verdediging van de plant tegen insecten. 64 BIBLIOGRAFIE 65 Bibliografie ADWAN, H., H. BAYER, A. PERVAIZ, M. SAGINI, and M. BERGER (2014). Riproximin is a recently discovered type II ribosome inactivating protein with potential for treating cancer. Biotechnology Advances 32(6), 1077– 1090. ANGOV, E., C. HILLIER, R. KINCAID, and J. LYON (2008). Heterologous Protein Expression Is Enhanced by Harmonizing the Codon Usage Frequencies of the Target Gene with those of the Expression Host. PLOS One 3(5), e2189. BADR, M. (2012). The ribosome-inactivating protein gelonin and parts thereof to be employed for a potential treatment of cancer (thesis), Technische Universität Kaiserslautern. BARBIERI, L., A. BOLOGNESI, P. CENINI, A. FALASCA, A. MINGHETTI, L. GAROFANO, A. GUICCIARDI, D. LAPPI, and S. MILLER (1989). Ribosome-inactivating proteins from plant cells in culture. Biochemical Journal 257(3), 801–807. BERROW, N., K. BUSSOW, B. COUTARD, J. DIPROSE, M. EKBERG, G. FOLKERS, N. LEVY, V. LIEU, R. OWENS, Y. PELET, C. PINAGLIA, S. QUEVILLON-CHERUEL, L. SALIM, C. SCHEICH, R. VINCENTELLI, and D. BUSSO (2006). Recombinant protein expression and solubility screening in Escherichia coli: a comparative study. Acta Crystallographica Section D 62(Pt. 10), 1218–1226. BJORNSTI, M. and M. MEGONIGAL (1999). Methods in Molecular Biology: Resolution of DNA Molecules by One-Dimensional Agarose-Gel Electrophoresis. 9-17. (ISBN 978-1-59259-259-3). BOLANOS-GARCIA, V. and O. DAVIES (2006). Structural analysis and classification of native proteins from E. coli commonly co-purified by immobilised metal affinity chromatography. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects 1760(9), 1304–1313. BORNHORST, J. and J. FALKE (2010). Purification of Proteins Using Polyhistidine Affinity Tags. Methods in Enzymology (326), 245–254. BRADFORD, M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72(1-2), 248–254. BRIGOTTI, M., D. CARNICELLI, P. ALVERGNA, A. PALLANCA, S. SPERTI, and L. MONTANARO (1996). tRNA(Trp) as cofactor of gelonin, a ribosome-inactivating protein with RNA-N-glycosidase activity. Features required for the cofactor activity. International Journal of Biochemistry and Molecular Biology 40(1), 181–188. BRIGOTTI, M., F. RAMBELLI, M. ZAMBONI, L. MONTANARO, and S. SPERTI (1989). Effect of alpha-sarcin and ribosome-inactivating proteins on the interaction of elongation factors with ribosomes. The Biochemical Journal 257(3), 723–727. BIBLIOGRAFIE 66 CARRIO, M. and A. VILLAVERDE (2002). Construction and deconstruction of bacterial inclusion bodies. Journal of Biotechnology 96(1), 3–12. CHEN, Y., W. PEUMANS, and E. VAN DAMME (2002). The Sambucus nigra type-2 ribosome-inactivating protein SNA-I0 exhibits in planta antiviral activity in transgenic tobacco. FEBS Letters 516(1-3), 27–30. CHRAMBACH, A., R. REISFELD, M. WYCKOFF, and J. ZACCARI (1967). A procedure for rapid and sensitive staining of protein fractionated by polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry 20(1), 150–154. CITORES, L., R. IGLESIAS, and J. FERRERAS (2013). Ribosome Inactivating Proteins from Plants: Biological Properties and their Use in Experimental Therapy. 127-143. (ISBN 978-94-007-6214-5). COBB, P. and C. LEMAISTRE (1992). Therapeutic use of immunotoxins. Seminars in Hematology 29(3), 6–13. DAS, M., R. SHARMA, and V. MISHRA (2012). Induction of Apoptosis by Ribosome Inactivating Proteins. Applied Biochemistry and Biotechnology 166(6), 1552–1561. DAY, P., S. ERNST, A. FRANKEL, A. MONZINGO, J. PASCAL, M. MOLINA-SVINTH, and J. ROBERTUS (1996). Structure and activity of an active site substitution of ricin A chain. Biochemistry 35(34), 11098–11103. DAY, P., J. LORD, and L. ROBERTS (1998). The deoxyribonuclease activity attributed to ribosome-inactivating proteins is due to contamination. European Journal of Biochemistry 258(2), 540–545. DE VIRGILIO, M., A. LOMBARDI, R. CALIANDRO, and M. FABBRINI (2010). Ribosome-Inactivating Proteins: From Plant Defense to Tumor Attack. Toxins 2(11), 2699–2737. DEN HARTOG, M., C. LUBELLI, L. BOON, S. HEERKENS, A. BUIJSSE, M. DE BOER, and F. STIRPE (2002). Cloning and expression of cDNA coding for bouganin. The FEBS Journal 269(6), 1772–1779. DEPUYDT, P. (2013). Ribosome-inactivating proteins from apple: are they really toxic? (thesis), Universiteit Gent (FBW). DI COLA, A., L. FRIGERIO, J. LORD, L. ROBERTS, and A. CERIOTTI (2005). Endoplasmic reticulumassociated degradation of ricin A chain has unique and plant-specific features. Plant physiology 137(January), 287–296. DOMASHEVSKIY, A. and D. GOSS (2015). Pokeweed Antiviral Protein, a Ribosome Inactivating Protein: Activity, Inhibition and Prospects. Toxins 7(2), 274–298. EMBL (2016a). Protein expression and purification core facility: Protein expresion E. coli. https://www.embl.de/ pepcore/pepcore services/protein expression/ecoli/ (geraadpleegd op 05-02-2016). EMBL (2016b). folding. Protein Purification: Extraction and Clarification, In vitro denaturation and Re- https://www.embl.de/pepcore/pepcore services/protein purification/extraction clarification/invitro denaturation refolding/ (geraadpleegd op 23-05-2016). 66 BIBLIOGRAFIE 67 ENDO, Y. and K. TSURUGI (1986). The Mechanism of Action of Ricin and Related Toxic Lectins on Eukaryotic Ribosomes. The site and the characteristics of the modification in 28 S ribosomal RNA caused by the toxins. Nucleic Acids Symposium Series 262(17), 187–190. ENDO, Y. and K. TSURUGI (1988). The RNA N-glycosidase activity of ricin A-chain. The characteristics of the enzymatic activity of ricin A-chain with ribosomes and with rRNA. Journal of Biological Chemistry 263(18), 8735–8739. ENDRESSEN, L., O. FORRE, and H. RUGSTAD (2013). Immunopharmacology in Autoimmune Diseases and Transplantation. (ISBN 978–1–4899–1167–4). FOYER, C. and G. NOCTOR (2005). Redox Homeostasis and Antioxidant Signaling: A Metabolic Interface Between Stress Perception and Physiological Responses. The Plant Cell 17(7), 1866–1875. GARABAGI, F., E. GILBERT, A. LOOS, M. MCLEAN, and J. HALL (2012). Utility of the P19 suppressor of gene-silencing protein for production of therapeutic antibodies in Nicotiana expression hosts. Plant Biotechnology Journal 10(9), 1118–1128. GARIBYAN, L. and A. N. (2013). Polymerase Chain Reaction. Journal of Investigative Dermatology 133(3), 1–4. GIBSON, D., L. YOUNG, R.-Y. CHUANG, J. VENTER, C. HUTCHISON, and H. SMITH (2009). Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods 6(5), 343–345. GILABERT-ORIOL, R., A. WENG, B. MALLINCKRODT, M. MELZIG, and H. FUCHS (2014). Immunotoxins Constructed with Ribosome-Inactivating Proteins and their Enhancers: A Lethal Cocktail with Tumor Specific Efficacy Proteins, Volume 20. 6584-6643. (ISBN 493-0-45056-990-0). GIRBES, T., L. CITORES, J. FERRERAS, M. ROJO, R. IGLESIAS, R. MUNOZ, F. ARIAS, M. CALONGE, J. GARCIA, and E. MENDEZ (1993a). Isolation and partial characterization of nigrin b, a non-toxic novel type 2 ribosome-inactivating protein from the bark of Sambucus nigra L. Plant Molecular Biology 22(6), 1181–1186. GIRBES, T., L. CITORES, R. IGLESIAS, J. FERRERAS, R. MUNOZ, M. ROJO, F. ARIAS, J. GARCIA, E. MENDEZ, and M. CALONGE (1993b). Ebulin I, a Nontoxic Novel Type 2 Ribosome-inactivating Protein from Sambucus ebulus L. Leaves. The Journal of Biological Chemistry 268(24), 18195–18199. GRASLUND, S., P. NORDLUND, J. WEIGELT, B. HALLBERG, J. BRAY, O. GILEADI, S. KNAPP, U. OPPERMANN, C. ARROWSMITH, R. HUI, J. MING, S. DHE-PAGANON, S.-H. PARK, A. SAVCHENKO, A. YEE, A. EDWARDS, R. VINCENTELLI, C. CAMBILLAU, R. KIM, S.-H. KIM, Z. RAO, Y. SHI, T. TERWILLIGER, C.-Y. KIM, L.-W. HUNG, G. WALDO, Y. PELEG, S. ALBECK, T. UNGER, O. DYM, J. PRILUSKY, J. SUSSMAN, R. STEVENS, S. LESLEY, I. WILSON, A. JOACHIMIAK, F. COLLART, I. DEMENTIEVA, M. DONNELLY, W. ESCHENFELDT, Y. KIM, L. STOLS, R. WU, M. ZHOU, S. BURLEY, J. EMTAGE, J. SAUDER, D. THOMPSON, K. BAIN, J. LUZ, T. GHEYI, F. ZHANG, S. ATWELL, S. ALMO, J. BONANNO, A. FISER, S. SWAMINATHAN, F. STUDIER, M. CHANCE, A. SALI, T. ACTON, R. XIAO, 67 BIBLIOGRAFIE 68 L. ZHAO, L. MA, J. HUNT, L. TONG, K. CUNNINGHAM, M. INOUYE, S. ANDERSON, H. JANJUA, R. SHASTRY, C. HO, D. WANG, H. WANG, M. JIANG, G. MONTELIONE, D. STUART, R. OWENS, S. DAENKE, A. SCHUTZ, U. HEINEMANN, S. YOKOYAMA, K. BUSSOW, and K. GUNSALUS (2008). Protein production and purification. Nature Methods 5(2), 135–146. GURY, J., L. ZINGER, L. GIELLY, P. TABERLET, and R. GEREMIA (2008). Exonuclease activity of proofreading DNA polymerases is at the origin of artifacts in molecular profiling studies. Electrophoresis 29(11), 2437–44. HAGEL, L. (2001). Current Protocols in Molecular Biology: Gel-Filtration Chromatography. (ISBN 978-047114-272-0). HARTLEY, M., J. CHADDOCK, and M. BONNESS (1996). The structure and function of ribosome-inactivating proteins. Trends in Plant Science 1(8), 252. HINK, M., R. GRIEP, J. BORST, A. VAN HOEK, M. EPPINK, A. SCHOTS, and A. VISSER (2000). Structural Dynamics of Green Fluorescent Protein Alone and Fused with a Single Chain Fv Protein. The Journal of Biological Chemistry 275(23), 17556–17560. HORRIX, C., Z. RAVIV, E. FLESCHER, C. VOSS, and M. BERGER (2011). Plant ribosome-inactivating proteins type II induce the unfolded protein response in human cancer cells. Cellular and Molecular Life Sciences 68(7), 1269–1281. HUANG, G.-T., S.-L. MA, L.-P. BAI, L. ZHANG, H. MA, P. JIA, J. LIU, M. ZHONG, and Z.-F. GUO (2012). Signal transduction during cold, salt, and drought stress in plants. Molecular Biology Reports 39(2), 969–987. HUNT, I. (2005). From gene to protein: a review of new and enabling technologies for multi-parallel protein expression. Protein Expression and Purification 40(1), 1–22. IRVIN, J. and F. UCKUN (1992). Pokeweed Antiviral Protein: Ribosome inactivation and therapeutic applications. Pharmacology and Therapeutics 55(3), 279–302. JIANG, S.-Y., R. BHALLA, R. RAMAMOORTHY, H.-F. LUAN, P. VENKATESH, M. CAI, and S. RAMACHANDRAN (2012). Over-expression of OSRIP18 increases drought and salt tolerance in transgenic rice plants. Transgenic Research 21(4), 785–795. JIANG, S.-Y., R. RAMAMOORTHY, R. BHALLA, H.-F. LUAN, P. VENKATESH, M. CAI, and S. RAMACHANDRAN (2008). Genome-wide survey of the RIP domain family in Oryza sativa and their expression profiles under various abiotic and biotic stresses. Plant Molecular Biology 67(6), 603–614. KABACHINSKI, G. and T. SCHWARTZ (2015). The nuclear pore complex - structure and function at a glance. Journal of Cell Science (128), 423–429. 68 BIBLIOGRAFIE 69 KANG, J., M. LEE, and D. GORENSTEIN (2005). The enhancement of PCR amplification of a random sequence DNA library by DMSO and betaine: Application to in vitro combinatorial selection of aptamers. Journal of Biochemical and Biophysical Methods 64(2), 147–51. KARIMI, M., A. DEPICKER, and P. HILSON (2007). Recombinational Cloning with Plant Gateway Vectors. Plant Physiology 145(4), 1144–1154. KAUR, I., M. PURI, Z. AHMED, F. BLANCHET, B. MANGEAT, and V. PIGUET (2013). Inhibition of HIV-1 replication by balsamin, a ribosome inactivating protein of Momordica balsamina. PloS One 8(9), e73780. KOLOTOVA, E., S. EGOROVA, A. RAMONOVA, S. BOGORODSKI, V. POPOV, I. AGAPOV, and M. KIRPICHNIKOV (2012). Cytotoxic and Immunochemical Properties of Viscumin Encapsulated in Polyactide Microparticles. Acta Naturae 4(1), 101–106. LAPADULA, W., M. SANCHEZ-PUERTA, and M. AYUB (2012). Convergent evolution led ribosome inactivating proteins to interact with ribosomal stalk. Toxicon : official journal of the International Society on Toxinology 59(3), 427–432. LAVASTRE, V., M. PELLETIER, R. SALLER, K. HOSTANSKA, and D. GIRARD (2002). Mechanisms Involved in Spontaneous and Viscum album Agglutinin-I-Induced Human Neutrophil Apoptosis: Viscum album Agglutinin-I Accelerates the Loss of Antiapoptotic Mcl-1 Expression and the Degradation of Cytoskeletal Paxillin and Vimentin Proteins Via Caspases. The Journal of Immunology 168(3), 1419–1427. LEMERCIER, G., N. BAKALARA, and X. SANTARELLI (2003). On-column refolding of an insoluble histidine tag recombinant exopolyphosphatase from Trypanosoma brucei overexpressed in Escherichia coli. Journal of Chromatography B 786(1-2), 305–309. LILIE, H., E. SCHWARZ, and R. RUDOLPH (1998). Advances in refolding of proteins produced in E. coli. Current Opinion in Biotechnology 9(5), 497–501. LIN, J.-Y., K.-Y. TSERNG, C.-C. CHEN, L.-T. LIN, and T.-C. TUNG (1970). Abrin and Ricin: New Anti-tumor Substances. Nature 227(5255), 292–293. LODISH, H., A. BERK, C. KAISER, M. KRIEGER, M. SCOTT, A. BRETSCHER, H. PLOEGH, and P. MATSUDAIRA (2008). Molecular Cell Biology (6th ed.). (ISBN 978-0-71677-601-7). LORD, J. and M. HARTLEY (2010). Toxic Plant Proteins: Plant Cell Monographs, Volume 18. (ISBN 978-3642-12176-0). MACPHEE, D. (2010). Methodological considerations for improving Western blot analysis. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods 61(2), 171–7. 69 BIBLIOGRAFIE 70 MANSOURI, S., E. NOUROLLAHZADEH, and K. HUDAK (2006). Pokeweed antiviral protein depurinates the sarcin/ricin loop of the rRNA prior to binding of aminoacyl-tRNA to the ribosomal A-site. RNA 12(9), 1683–1692. MAUCH-MANI, B. and F. MAUCH (2005). The role of abscisic acid in plant-pathogen interactions. Current Opinion in Plant Biology 8(4), 409–414. MAZOR, R., M. ONDA, and I. PASTAN (2016). Immunogenicity of therapeutic recombinant immunotoxins. Immunological Reviews 270(1), 152–164. METZLER, D. (2003). Biochemistry: The Chemical Reactions of Living Cells (2nd ed.). (ISBN 978-0-08092471-7). MOLECULAR CLONING LABORATORIES (2015). NI-NTA Agarose User Manual. MORLON-GUYOT, J., M. HELMY, S. LOMBARD-FRASCA, D. PIGNOL, G. PIÉRONI, and B. BEAUMELLE (2003). Identification of the ricin lipase site and implication in cytotoxicity. The Journal of Biological Chemistry 278(19), 17006–17011. NARAYANAN, S., K. SURENDRANATH, N. BORA, A. SUROLIA, and A. KARANDE (2005). Ribosome inactivating proteins and apoptosis. FEBS letters 579(6), 1324–1331. NCBI (2016). Search for Conserved Domains within a protein or coding nucleotide sequence. http://www.ncbi. nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi (geraadpleegd op 28-05-2016). NEW ENGLAND BIOLABS (2015a). PCR using Q5® high fidelity DNA polymerase (M0491). https://www.neb. com/protocols/2013/12/13/pcr-using-q5-high-fidelity-dna-polymerase-m0491 (geraadpleegd op 13-12-2015). NEW ENGLAND BIOLABS (2015b). Gibson Assembly® Master Mix. https://www.neb.com/products/e2611gibson-assembly-master-mix (geraadpleegd op 17-12-2015). NEW ENGLAND BIOLABS (2016). Q5® high-fidelity DNA polymerase. https://www.neb.com/products/m0491q5-high-fidelity-dna-polymerase (geraadpleegd op 07-03-2016). NIELSEN, K. and R. BOSTON (2001). Ribosome-Inactivating Proteins: A Plant Perspective. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 52(1), 785–816. NOVAGEN. pET System Manual. http://richsingiser.com/4402/Novagen%20pET%20system%20manual.pdf (geraadpleegd op 23-05-2016). NOVAGEN (2016). pET-21a-d(+) Vectors. https://plasmid.med.harvard.edu/PlasmidRepository/file/map/pET21. pdf (geraadpleegd op 23-05-2016). 70 BIBLIOGRAFIE 71 O’HARA, J. and N. MANTIS (2013). Neutralizing monoclonal antibodies against ricin’s enzymatic subunit interfere with protein disulfide isomerase-mediated reduction of ricin holotoxin in vitro. Journal of Immunological Methods 395(1-2), 71–78. PEUMANS, W., Q. HAO, and E. VAN DAMME (2001). Ribosome-inactivating proteins from plants: more than RNA N-glycosidases? The FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology 15(9), 1493–1506. PEYRET, H. and P. LOMONOSSOFF (2013). The pEAQ vector series: the easy and quick way to produce recombinant proteins in plants. Plant Molecular Biology 83(1-2), 51–58. PIERCE, M., J. KAHN, J. CHIOU, and N. TUMER (2011). Development of a quantitative RT-PCR assay to examine the kinetics of ribosome depurination by ribosome inactivating proteins using Saccharomyces cerevisiae as a model. RNA 17(1), 201–210. POLITO, L., M. BORTOLOTTI, V. FARINI, M. PEDRAZZI, P. TAZZARI, and A. BOLOGNESI (2009). ATGsaporin-S6 immunotoxin: a new potent and selective drug to eliminate activated lymphocytes and lymphoma cells. British Journal of Haematology 147(5), 710–718. PROMEGA CORPORATION (2010). Rabbit Reticulocyte Lysate Technical Manual. https://be.promega.com/ resources/protocols/technical-manuals/0/rabbit-reticulocyte-lysate-protocol/ (geraadpleegd op 21-05-2016). PROMEGA CORPORATION (2011). Technical Manual: TNT® Quick Coupled Transcription/Translation Systems. PROMEGA CORPORATION (2015). Technical Manual: TNT® Quick Coupled Transcription/Translation Systems. PROMEGA CORPORATION (2016a). Luciferase SP6/T7 Control DNAs. https://be.promega.com/products/ protein-expression/eukaryotic-cell-free-protein-expression/luciferase-sp6 t7-control-dnas/?activeTab=0 (geraadpleegd op 21-05-2016). PROMEGA CORPORATION (2016b). Luciferase Assay System. https://be.promega.com/products/reporterassays-and-transfection/reporter-assays/luciferase-assay-system/ (geraadpleegd op 21-05-2016). QIAGEN (2001). QIAquick Gel Extraction Kit Protocol, using a microcentrifuge. http://www.indiana.edu/ ∼lchenlab/protocol QIAGEN (2015). tography. files/agarose gel extraction.pdf (geraadpleegd op 22-05-2016). Ni-NTA Agarose: For purification of His-tagged proteins by gravity-flow chroma- https://www.qiagen.com/be/shop/sample-technologies/protein/protein-preparation/ni-nta-agarose# orderinginformation (geraadpleegd op 24-05-2016). REES, W., T. YAGER, and P. VON HIPPEL (1993). Betaine can eliminate the base pair composition dependence of DNA melting. Biochemistry 32(1), 137–144. 71 BIBLIOGRAFIE 72 REISBIG, R., S. OLSNES, and K. EIKLID (1981). The cytotoxic activity of Shigella toxin. Evidence for catalytic inactivation of the 60 S ribosomal subunit. Journal of Biological Chemistry 256(16), 8739–8744. ROSANO, G. and E. CECCARELLI (2014). Recombinant protein expression in Escherichia coli: Advances and challenges. Frontiers in Microbiology 5(April), 1–17. RYCHLIK, W., W. SPENCER, and R. RHOADS (1990). Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro. Nucleic Acids Research 18(21), 6409–6412. SAIDA, F., M. UZAN, B. ODAERT, and F. BONTEMS (2006). Expression of highly toxic genes in E. coli: special strategies and genetic tools. Current Protein & Peptide Science 7(1), 47–56. SAINSBURY, F., E. THUENEMANN, and G. LOMONOSSOFF (2009). pEAQ: versatile expression vectors for easy and quick transient expression of heterlogous proteins in plants. Plant Biotechnology Journal 7(7), 682– 693. SANDVIG, K., S. GRIMMER, T. IVERSEN, K. RODAL, M. TORGERSEN, P. NICOZIANI, and B. VAN DEURS (2000). Ricin transport into cells: Studies of endocytosis and intracellular transport. International Journal of Medical Microbiology 290(4-5), 415–420. SANDVIG, K. and B. VAN DEURS (2005). Delivery into cells: lessons learned from plant and bacterial toxins. Gene Therapy 12(11), 865–872. SANTINO, A., M. TAURINO, S. DE DOMENICO, S. BONSEGNA, P. POLTRONIERI, V. PASTOR, and V. FLORS (2013). Jasmonate signaling in plant development and defense response to multiple (a)biotic stresses. Plant Cell Reports 32(7), 1085–1098. SCHROT, J., A. WENG, and M. MELZIG (2015). Ribosome-Inactivating and Related Proteins. Toxins 7(5), 1556–1615. SCHUMANN, W. and L. FERREIRA (2004). Production of recombinant proteins in Escherichia coli. Genetics and Molecular Biology 27(3), 442–453. SEGGERSON, K. and P. MOORE (1998). Structure and Stability of Variants of the Sarcin-Ricin Loop of 28S rRNA: NMR Studies of the Prokaryotic SRL and a Functional Mutant. Rna 4(10), 1203–1215. SHA, O., J. NIU, T.-B. NG, E.-P. CHO, X. FU, and W. JIANG (2013). Anti-tumor action of trichosanthin, a type 1 ribosome-inactivating protein, employed in traditional Chinese medicine: a mini-review. Cancer Chemotherapy and Pharmacology 71(6), 1387–1393. SHAHIDI-NOGHABI, S., E. VAN DAMME, and G. SMAGGHE (2009). Expression of sambucus nigra agglutinin (SNA-I') from elderberry bark in transgenic tobacco plants results in enhanced resistance to different insect species. Transgenic Research 18(2), 249–259. 72 BIBLIOGRAFIE 73 SHANG, C. (2015). Biological activity of ribosome-inactivating proteins from Malus domestica (apple) and Sambucus nigra (elderberry). PhD thesis, Faculty of Bioscience engineering, Ghent University, Ghent, Belgium (ISBN 978-90-5989-810-3). SHIH, N., K. MCDONALD, A. JACKMAN, T. GIRBÉS, and R. IGLESIAS (1997). Bifunctional plant defence enzymes with chitinase and ribosome inactivating activities from Trichosanthes kirilowii cell cultures. Plant Science 130(2), 145–150. SIGMON, J. and L. LARCOM (1996). The effect of ethidium bromide on mobility of DNA fragments in agarose gel electrophoresis. Electrophoresis 17(10), 1524–1527. SILVA, A., A. HORTA, R. MOREIRA, L. BELTRAMINI, and A. ARAÚJO (2003). Production of Abrus pulchellus ribosome-inactivating protein from seeds callus culture. Toxicon 41(7), 841–849. SINGH, S. and A. PANDA (2005). Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins. Journal of bioscience and bioengineering 99(4), 303–10. STIRPE, F. (2013). Ribosome-inactivating proteins: From toxins to useful proteins. Toxicon 67, 12–16. STIRPE, F. and M. BATTELLI (2006). Ribosome-inactivating proteins: Progress and problems. Cellular and Molecular Life Sciences 63(16), 1850–1866. STIRPE, F. and R. GILABERT-ORIOL (2015). Ribosome-Inactivating Proteins: An Overview. (ISBN 978–94– 007–6728–7). STIRPE, F. and D. LAPPI (2005). Molecular Neurosurgery with Targeted Toxins. (ISBN 978–1–58829–199–8). STIRPE, F. and D. LAPPI (2014). Ribosome-Inactivating Proteins: Ricin and Related Proteins. (ISBN 978-1118-12565-6). SWISS INSTITUTE OF BIOINFORMATICS (2016). ExPASy - ProtParam documentation. http://web.expasy. org/tools/protparam/protparam-doc.html (geraadpleegd op 22-05-2016). THERMO FISHER SCIENTIFIC (2008). T009 - Technical Bulletin - NanoDrop 1000 and 8000: 260/280 and 260/230 Ratios. THERMO FISHER SCIENTIFIC (2011). T042 - Technical Bulletin - NanoDrop Spectrophotometers: Assessment of Nucleic Acid Purity. THERMO FISHER SCIENTIFIC (2013). Instructions: ZebaTM Spin Desalting Columns, 7K MWCO. THERMO FISHER SCIENTIFIC (2014). Product Information: GeneJET Plasmid Miniprep Kit #0502 . UCLA (2016). Rare Codon Calculator (RaCC). http://nihserver.mbi.ucla.edu/RACC/ (geraadpleegd op 28-052016). 73 BIBLIOGRAFIE 74 UNIVERSITÄT DUISBURG-ESSEN (2013). Ehrmann Lab - E. coli Proteases. https://www.uni-due.de/zmb/ members/ehrmann/e-coli-proteases/metalloproteases.shtml (geraadpleegd op 05-02-2016). VAGO, R. (2015). Ribosome Inactivating Proteins: Exploiting Plant Weapons to Fight Human Cancer. Genetic Syndromes and Gene Therapy 6, 272. VAN DAMME, E., Q. HAO, Y. CHEN, A. BARRE, F. VANDENBUSSCHE, S. DESMYTER, P. ROUGÉ, and W. PEUMANS (2001). Ribosome-Inactivating Proteins: A Family of Plant Proteins That Do More Than Inactivate Ribosomes. Critical Reviews in Plant Sciences 20(5), 395–465. VAN ROON, J., A. VAN VUUREN, S. WIJNGAARDEN, K. JACOBS, J. BIJLSMA, F. LAFEBER, T. THEPEN, and J. VAN DE WINKEL (2003). Selective elimination of synovial inflammatory macrophages in rheumatoid arthritis by an Fcgamma receptor I-directed immunotoxin. Arthritis and Rheumatology 48(5), 1229–1238. VIB (2016). GatewayTM Vectors for Functional Studies. https://gateway.psb.ugent.be/ (geraadpleegd op 22-052016). VIVANCO, J., B. SAVARY, and H. FLORES (1999). Characterization of Two Novel Type I Ribosome-Inactivating Proteins from the Storage Roots of the Andean Crop Mirabilis expansa. Plant Physiology 119(April), 1447– 1456. WALSH, M., J. DODD, and G. HAUTBERGUE (2013). Ribosome-inactivating proteins: Potent poisons and molecular tools. Virulence 4(8), 774–784. WALTERS, D. (2015). Physiological Responses of Plants to Attack. (ISBN 978-1-4443-3329-9). WANG, R. and M. BRATTAIN (2007). The maximal size of protein to diffuse through the nuclear pore is larger than 60 kDa. FEBS Letters 581(17), 3164–3170. WANG, S., Y. ZHANG, H. LIU, Y. HE, J. YAN, Z. WU, and Y. DING (2012). Molecular cloning and functional analysis of a recombinant ribosome-inactivating protein (alpha-momorcharin) from Momordica charantia. Applied Microbiology and Biotechnology 96(4), 939–950. WENG, A., C. BACHRAN, H. FUCHS, and M. MELZIG (2008). Soapwort saponins trigger clathrin-mediated endocytosis of saporin, a type I ribosome-inactivating protein. Chemico-Biological Interactions 176(2-3), 204– 211. WILEY, R. and R. KLINE (2000). Neuronal lesioning with axonally transported toxins. Journal of Neuroscience Methods 103(1), 73–82. YAMASAKI, C., K. NISHIKAWA, X. ZENG, Y. KATAYAMA, Y. NATORI, N. KOMATSU, T. ODA., and Y. NATORI (2004). Induction of cytokines by toxins that have an identical RNA N-glycosidase activity: Shiga toxin, ricin, and modeccin. Biochimica et Biophysica Acta 1671(1-3), 44–50. 74 BIBLIOGRAFIE 75 YANG, Z., L. ZHANG, Y. ZYANG, T. ZHANG, Y. FENG, X. LU, W. LAN, J. WANG, H. WU, C. CAO, and X. WANG (2011). Highly Efficient Production of Soluble Proteins from Insoluble Inclusion Bodies by a TwoStep-Denaturing and Refolding Method. PLOS One 6(7), e22981. YU, K. and K. PAULS (1992). Optimization of the PCR program for RAPD analysis. Nucleic Acids Research 20(10), 2606. ZENG, M., M. ZHENG, D. LU, J. WANG, W. JIANG, and O. SHA (2015). Anti-tumor activities and apoptotic mechanism of ribosome-inactivating proteins. Chinese Journal of Cancer 34(3), 30–40. 75 7.1 Gebruikte primers 76 7 Bijlagen 7.1 Gebruikte primers Tabel 7.1: Gebruikte primers bij de verschillende PCR reacties. Primers Sequentie Beschrijving EVD002 GGGGACAAGTTTGTACAAAA Primer die de AttB1 site vervolledigd AAGCAGGCT EVD004 GGGGACCACTTTGTACAAGAA Primer die de AttB2 site vervolledig AGCTGGGT EVD472 GAAACCTCCTCGGATTCCAT Forward primer om een deel van de 35S promoter te amplificeren P001 AGGTCACTGGATTTTGGTTT Reverse primer in T35S (terminator) voor LR check P216 GCTTTGTTAGCAGCCGGATCTC Reverse primer complementair aan het laatste deel van het AATGATGATGATGATGATGTCC RIP-M41 met de C-terminale His-tag en brengt de C-terminale sequentie voor de Gibson assembly aan voor de pET21a vector P246 TTAAGAAGGAGATATACGGGAT Forward primer complementair aan de C-terminale His-tag GACATTCAGTGAATGTGATGAG van het M41 domein van RIP-M41 en brengt de C-terminale sequentie voor de Gibson assembly aan voor de pET21a vector P298 P299 TATTCTGCCCAAATTCGCGACC Forward primer (Gibson Assembly pEAQ-HT) voor de GGTATGGTGAGCAAGGGCGAG N-terminale GFP-fusie constructen TGAAACCAGAGTTAAAGGCCTC Reverse primer (Gibson Assembly pEAQ-HT) voor het GAGCTAACAGTATAATACCAAT GFP-RIP-M41 fusieconstruct TTTTGGGCAAG P300 P301 TATTCTGCCCAAATTCGCGACC Forward primer (Gibson Assembly pEAQ-HT) voor het GGTATGGAGCAAGGGAGAGGG RIP-M41-GFP fusieconstruct TGAAACCAGAGTTAAAGGCCTC Reverse primer (Gibson Assembly pEAQ-HT) voor de GAGTTACTTGTACAGCTCGTCC C-terminale GFP-fusie constructen ATG P327 AACGTTGTCAGATCGTGCTTCG forward sequencing primer voor de pEAQ-HT backbone GCACC P328 CTGAAGGACGACCTGCTAAACA reverse sequencing primer pEAQ-HT backbone GGAG 76 7.1 Gebruikte primers 77 Primers Sequentie Beschrijving P355 AAAAAGCAGGCTTCACCATGGC Forward primer voor de C-terminale eGFP fusie GTTGAACCCGCT met OSRIP1 AGAAAGCTGGGTGGTTCCCATG Reverse primer voor de C-terminale eGFP fusie AAACAGCTGAAGC met OSRIP1 AGAAAGCTGGGTGTCAGTTCCC Reverse primer voor de N-terminale eGFP fusie ATGAAACAGCTGAAGC met OSRIP1 TGAAACCAGAGTTAAAGGCCTC Reverse primer (Gibson Assembly pEAQ-HT) voor de GAGTCAGTTCCCATGAAACAGC N-terminale GFP fusie met OSRIP1 P356 P357 P389 TGAAGC P390 P436 TATTCTGCCCAAATTCGCGACC Forward primer (Gibson Assembly pEAQ-HT) voor de GGTATGGCGTTGAACCCGCT C-terminale GFP fusie met OSRIP1 TGAAACCAGAGTTAAAGGCCTC Reverse primer voor de HIS-constructen GAGTCAATGATGATGATGATGA met de pEAQ-HT vector TGTCC 77 7.2 Gebruikte vectoren 7.2 7.2.1 78 Gebruikte vectoren Heterologe expressie in E. coli Figuur 7.1: De pET-21a-vector (Novagen, 2016) 78 7.2 Gebruikte vectoren 7.2.2 79 Gateway vectoren Figuur 7.2: De pK7WGF2-vector (VIB, 2016) 79 7.2 Gebruikte vectoren 80 Figuur 7.3: De pK7FWG2-vector (VIB, 2016) 80 7.2 Gebruikte vectoren 7.2.3 81 Transiënte expressie in N. benthamiana Figuur 7.4: De pEAQ-HT-vector. 81 7.3 De DNA sequenties van RIP-M41 en OSRIP1 7.3 82 De DNA sequenties van RIP-M41 en OSRIP1 Figuur 7.5: cDNA-sequentie van het open leesraam voor het RIP-M41 proteı̈ne. Het startcodon is aangeduid in het groen, het stopcodon in het geel Figuur 7.6: cDNA-sequentie van het open leesraam voor het OSRIP1 proteı̈ne. Het startcodon is aangeduid in het groen, het stopcodon in het geel 82 7.4 De aminozuursequenties van RIP-M41 en OSRIP1 83 Figuur 7.7: cDNA-sequentie van het open leesraam voor het RIP-M41 proteı̈ne met aanduiding van de zeldzaam gebruikte codons in E. coli. De zeldzaam gebruikte codons worden in kleur weergegeven voor arginine (rood), leucine (groen), isoleucine (blauw) en proline (oranje) (UCLA, 2016) 7.4 De aminozuursequenties van RIP-M41 en OSRIP1 Figuur 7.8: Aminozuursequentie van het proteı̈ne RIP-M41. Figuur 7.9: Aminozuursequentie van het proteı̈ne OSRIP1. 83
