Exploratie van Pseudomonas syringae pv. porri en Pseudomonas

Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen
Academiejaar 2015 – 2016
Exploratie van Pseudomonas syringae pv. porri en
Pseudomonas fluorescens als pathogeen voor prei en
potentiële preventiemethodieken
Tine Maes
Promotor: Prof. dr. ir. Geert Haesaert
Co-promotor: Bart Declercq
Tutor: Kevin Dewitte
Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van
Master of Science in de biowetenschappen: land- en tuinbouwkunde
Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen
Academiejaar 2015 – 2016
Exploratie van Pseudomonas syringae pv. porri en
Pseudomonas fluorescens als pathogeen voor prei en
potentiële preventiemethodieken
Tine Maes
Promotor: Prof. dr. ir. Geert Haesaert
Co-promotor: Bart Declercq
Tutor: Kevin Dewitte
Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van
Master of Science in de biowetenschappen: land- en tuinbouwkunde
Auteursrechtelijke bescherming
De auteur en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te
stellen en delen van de scriptie te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt
onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de
verplichting de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze
scriptie.
The author and the promoter give the permission to use this thesis for consultation and to
copy parts of it for personal use. Every other use is subject to the copyright laws, more
specifically the source must be extensively specified when using the results from this thesis.
Gent, mei 2016
Tine Maes
Auteur
Geert Haesaert
Promotor
Woord vooraf
Ik wil graag alle mensen bedanken die me rechtstreeks en onrechtstreeks hebben geholpen
bij het realiseren van deze thesis.
Hierbij bedank ik eerst en vooral mijn promotor prof. dr. ir Geert Haesaert voor het kritisch
nalezen van mijn thesis.
Ik wil ook mijn co-promotor Bart Declercq heel erg bedanken voor het aanwenden van dit
interessante onderwerp. Bij Inagro heb ik door het opvolgen van de rassenproeven heel wat
bijgeleerd. Bart heeft me altijd goed begeleid zowel bij het schrijven van mijn thesis als bij het
praktische werk. Ik wil ook de mensen bedanken van Inagro voor het opstellen en
onderhouden van de proeven. Bart heeft me ook kennis laten maken met het ILVO, waar ik
Johan Van Vaerenbergh leerde kennen. Johan gaf me moed en raad om de wereld van de
bacteriën te verkennen, omdat hij vol passie kon vertellen over zijn job als bacterioloog. Hij
heeft me raad en informatie gegeven bij het uitvoeren van de infectieproeven en hij leverde
me de bacteriestammen.
Mijn begeleider Kevin Dewitte, samen met de mensen van Bottelare, wil ik ook bedanken
voor de praktische hulp bij de infectieproeven. Ik wil Kevin ook bedanken voor het regelmatig
nalezen van mijn thesis. Ik wil ook Sofie Landschoot en Jan Verwaeren bedanken voor de
hulp met de statistische verwerking in SPSS.
Als laatste gaat ook een woord van dank uit naar mijn ouders voor de steun en de kans die
ze me gegeven hebben om verder te studeren. Ook mijn twee zussen, broer en mijn vriend
Bert wil ik bedanken voor de nodige ontspannende momenten tijdens het maken van deze
thesis wat toch wel wat stress met zich meebracht. Ook mijn vrienden die ik leerde kennen in
Gent waren een goede uitlaatklep. De reis naar Californië in maart met hen was hierbij het
hoogtepunt van mijn vierjarige opleiding in Gent, waarvoor ik ook Dirk Fremaut wil bedanken.
Samenvatting
Prei is een belangrijke teelt in West-Vlaanderen. Bacterieziekte veroorzaakt door
Pseudomonas syringae pv. porri en Pseudomonas fluorescens komt steeds meer voor en
daardoor zijn er oogstverliezen en kwalitatieve schade. De ontwikkelings- en infectiestadia
van bacterieziekten zijn nog niet goed gekend en tevens zijn geen middelen beschikbaar om
de ziekte te bestrijden.
Omdat het bestrijden van bacterieziekte met chemische producten uitgesloten is, werd meer
aandacht besteed aan de preventie van deze infectieziekte. Hierbij wordt vooral teelttechniek
zoals rassenkeuze en bacteriofaagbehandeling onderzocht. Voor dit onderzoek werden twee
rassenproeven opgesteld en een veldproef waarbij bacteriofagen werden toegediend door
middel van verneveling en dompeling van de planten. Bij de rassen zijn onderling geen
significante verschillen waargenomen. Voor de behandeling met bacteriofagen onder
veldomstandigheden dient het toepassingstijdstip en -methode geoptimaliseerd te worden
om tot effectieve reducties te komen van bacteriële aantasting.
Het doel van deze thesis is tevens ook meer inzicht te verwerven over de pathogeen a.d.h.v.
infectieproeven. Deze infectieproeven werden uitgevoerd op jonge preiplanten in
groeikamers met verschillende bacteriestammen bij gecontroleerde omgevingsfactoren. Om
relatieve vochtigheid na te gaan werden de planten afgedekt met plastiek gedurende
verschillende perioden. Als resultaat werden geen significante verschillen opgemerkt voor
deze factor. De temperatuur daarentegen is een bepalende factor voor de graad van
aantasting en de densiteit van bepaalde pathogene stammen. Hogere temperaturen leiden
tot een hogere infectiegraad van P.syringae pv. porri. Uit deze thesis blijkt dat de invloed van
rassenkeuze een minimaal effect heeft op de preventie van bacteriële infectie en dat
faagtherapie in staat is de ziekte te onderdrukken, maar dat de efficiëntie op het veld nog
sterk moet worden verbeterd.
Kernwoorden: Pseudomonas syringae pv. porri - Pseudomonas fluorescens – prei temperatuur - vochtigheid
Summary
The production of leek is important in Flanders. Problems with bacterial disease caused by
Pseudomonas syringae pv. porri and Pseudomonas fluorescens are increasing. These
diseases are harmful for the yield and the quality of leek for the fresh market. The real
causes for these disease conditions are not yet known and currently, no chemical products
are available to treat or control.
Therefore, the focus is on prevention rather than treatment. Prevention can be accomplished
by optimizing the cultivation technique such as variety selection and the use of
bacteriophages for biocontrol. In the first part of this thesis, two cultivar trials were conducted
and a field trial where plants were dipped in bacteriophages or sprayed with bacteriophages.
No significant differences were obtained in the cultivar trials. The treatment with
bacteriophages for biological control needs optimization to result in effective reduction of
bacterial infection.
The second part of this thesis investigated the lifecycle of Pseudomonas spp. using
infectiontests with seven bacteria strains. To this end, young leek plants were infected with
the strains, and brought up in a phytotron. This allows to investigate the effect of temperature
and relative humidity. To assess the effect of humidity, plants were covered with plastic for
several periods resulting that the relative humidity did not have a significant influence. The
factor temperature was determinative for the level of infestation and the density of several
strains of Pseudomonas syringae pv. porri or strains coming from the Pseudomonas
fluorescens complex. Higher temperature induces a higher level of infection by strains of P.
syringae pv. porri.
In conclusion, the present thesis showed that there are no big differences between leek
cultivars and that phage therapy is able to reduce bacterial blight symptoms in leek, but to
improve the efficacy of the phages in the field, phage persistence in the plant phyllosphere
should be improved.
Keywords: Pseudomonas syringae pv. porri - Pseudomonas fluorescens - leek bacteriophages - temperature - humidity
Inhoud
Lijst met figuren ..................................................................................................................... 3
Lijst met tabellen ................................................................................................................... 4
1
Inleiding .......................................................................................................................... 5
2
Literatuurstudie .............................................................................................................. 6
2.1 Allium porrum ............................................................................................................... 6
2.1.1 Taxonomie............................................................................................................. 6
2.1.2 Biologie en ecologie .............................................................................................. 6
2.1.3 Teelt en productie .................................................................................................. 7
2.2 Fytopathogene bacteriën en de interactie met planten ................................................. 7
2.2.1 De ziektedriehoek en ziektecyclus ......................................................................... 7
2.2.2 Pathogeniciteit en resistentie ................................................................................10
2.3 Genus Pseudomonas.................................................................................................12
2.3.1 Pseudomonas syringae pv. porri (Pspo) ...............................................................13
2.3.1.1 Taxonomie en morfologie ...............................................................................13
2.3.1.2 Pathogeniciteit en infectiemechanisme .........................................................14
2.3.1.3 Aanwezigheid en verspreiding in het milieu ...................................................16
2.3.1.4 Symptomen en ziektebeeld ............................................................................18
2.3.2 Pseudomonas fluorescens ...................................................................................18
2.3.2.1 Taxonomie en morfologie ...............................................................................18
2.3.2.2 Pathogeniciteit en infectiemechanisme ..........................................................19
2.3.2.3 Symptomen en ziektebeeld ............................................................................20
2.3.3 Bestrijding en controle .........................................................................................20
2.3.4 Overzichtstabel P.syringae pv. porri versus P.fluorescens...................................25
3
Materiaal en Methoden ..................................................................................................26
3.1 Rassenproef vroege herfstprei ....................................................................................26
3.1.1 Proefplan ..............................................................................................................26
3.1.2 Teelttechnische maatregelen en klimatologische omstandigheden .......................27
3.1.3 Infectiemethode ....................................................................................................29
3.1.4 Beoordelingsmethode ...........................................................................................29
3.2 Rassenonderzoek late herfstprei en winterprei ...........................................................30
3.2.1 Proefplan ..............................................................................................................30
1
3.2.2 Teelttechnische maatregelen ................................................................................31
3.3 Efficiëntie van faagtherapie onder veldomstandigheden .............................................33
3.3.1 Proefplan .............................................................................................................33
3.3.2 Teelttechnische maatregelen ................................................................................34
3.3.3 Proefhandelingen .................................................................................................34
3.4 Infectieproeven: infectie van preiplanten via verwonding en verneveling .....................36
3.4.1 Opkweek preiplanten ............................................................................................36
3.4.2 Infectietechniek via verwonding ............................................................................36
3.4.3 Infectietechniek via verneveling ............................................................................37
3.4.4 Beoordelingsmethode ...........................................................................................37
3.5 Statistische analyse van de metingen .........................................................................38
4
Resultaten .....................................................................................................................39
4.1 Rassenproef vroege herfstprei ....................................................................................39
4.1.1 Proefopzet ............................................................................................................39
4.1.2 Resultaten ............................................................................................................39
4.2 Rassenproef winterprei ...............................................................................................40
4.2.1 Proefopzet ............................................................................................................40
4.2.2 Resultaten ............................................................................................................40
4.3 Bacteriofagentoepassing onder veldomstandigheden .................................................41
4.3.1 Proefopzet en resultaten.......................................................................................41
4.3.2 Bespreking resultaten ...........................................................................................42
4.4 Infectieproeven: infectie van preiplanten via verwonding .............................................43
4.4.1 Proefopzet ............................................................................................................43
4.4.2 Resultaten ............................................................................................................43
4.4.3 Bespreking resultaten ...........................................................................................48
4.5 Infectieproeven: infectie van preiplanten via verneveling.............................................49
4.5.1 Proefopzet ............................................................................................................49
4.5.2 Resultaten ............................................................................................................50
4.5.3 Bespreking resultaten ...........................................................................................53
5
Discussie .......................................................................................................................54
6
Algemene conclusie ......................................................................................................56
7
Referentielijst ................................................................................................................57
8
Bijlagen .........................................................................................................................62
2
Lijst met figuren
Figuur 1: De ziektedriehoek (Perkins et al., 2011) ................................................................. 7
Figuur 2: Voorstelling van de ziektecyclus ............................................................................10
Figuur 3: Co-evolutiemodel bestaande uit vier fasen (Sherif et al., 2015) .............................11
Figuur 4: Werking van het type III secretie systeem bij Xanthomonas (Boch en Bonas, 2010)
.............................................................................................................................................15
Figuur 5: De aanwezigheid en verplaatsing van P.syringae gaat goed gepaard met de cyclus
van de waterstromen (Morris et al., 2013) ............................................................................17
Figuur 6: Schadebeeld van aangetaste preiveroorzaakt door Pspo. .....................................18
Figuur 7: Foto’s genomen op besmet veld in Meulebeke ......................................................20
Figuur 8: De structuur van chitosan, waarvan de aminogroepen meestal niet geacetyleerd
zijn (Xing et al., 2015) ...........................................................................................................22
Figuur 9: Algemene structuur en een elektromicroscopische opname van een bacteriofaag 23
Figuur 10: Proefplan rassenproef vroege herfstprei .............................................................26
Figuur 11: Verloop van de temperatuur en neerslag in Beitem. ............................................29
Figuur 12: Proefplan fagenproef ...........................................................................................33
Figuur 13: Duidelijk chlorotische laesie met aan de top van het blad ....................................37
Figuur 14: Boxplot van de ziekte-index per ras (p-waarde van groep a en b is respectievelijk
0,104 en 0,070) ....................................................................................................................39
Figuur 15: Boxplot van ziekte-index van elk ras met bijhorende significantiegroep ...............40
Figuur 16: Percentage aantasting per beoordeling van dompelbehandeling met fagen en
controle ................................................................................................................................42
Figuur 17: Percentage aangetaste knipjes veroorzaakt door de verschillende stammen van
het P.fluorescens complex bij -2°C (Pm1475 staat voor P.marginalis GBBC 1475, Pf1198
staat voor P.fluorescens GBBC 1198, Pf1171 staat voor P.fluorescens GBBC 1171 en
Ps1937 staat voor P.salmoni GBBC 1937) ...........................................................................44
Figuur 18: Aantal aangetaste knipjes (in %) van iedere stam na 24 u en 48 u afdekking drie
weken na infectie bij 8°C ......................................................................................................45
Figuur 19: Aantal knipjes die infectie vertonen (in %), twee weken na de infectie met 0, 24 en
48 uren afdekking onder plastiek ..........................................................................................45
Figuur 20: Boxplot van de laesielengte veroorzaakt door de bacteriestammen bij 18°C twee
weken na infectie..................................................................................................................46
Figuur 21: Aantal aangetaste blaadjes (in %) twee weken na infectie veroorzaakt door Pspo
stammen bij 24 en 48 u afdekking op een temperatuur van 28°C .........................................47
Figuur 22: Boxplot van de laesielengte veroorzaakt door Pspo stammen bij 28 °C...............48
Figuur 23: Handsproeier waarmee de bacteriesuspensie werd verneveld op het blad ..........49
Figuur 24: Totale laesielengte na verneveling met bacteriestam een week na infectie bij een
incubatietemperatuur van 25°C ............................................................................................51
Figuur 25: Totale laesielengte na verneveling per bacteriestam twee weken na infectie bij
een incubatietemperatuur van 25°C .....................................................................................51
Figuur 26: Boxplot van de totale laesielengte twee weken na infectie i.f.v de bacteriestam ..52
3
Lijst met tabellen
Tabel 1: Taxonomische indeling van prei............................................................................... 6
Tabel 2: Taxonomische indeling van Pseudomonas .............................................................12
Tabel 3: Taxonomische indeling van Pspo ...........................................................................13
Tabel 4: Taxonomische indeling van P.fluorescens ..............................................................18
Tabel 5: Vroege herfstrassen (15) opgenomen in de proef ...................................................27
Tabel 6: Algemene werkzaamheden en bemestingen. .........................................................27
Tabel 7: Toegepaste gewasbeschermingsmiddelen .............................................................28
Tabel 8: Klimatologische omstandigheden opgemeten in Beitem vergeleken met de
gemiddelde waarden ............................................................................................................28
Tabel 9: De 12 klassen ingedeeld volgens percentage aantasting........................................30
Tabel 10: Opgenomen rassen in de proef late herfst-winterprei............................................31
Tabel 11: Algemene werkzaamheden en toegepaste bemestingen ......................................31
Tabel 12: Toegepaste gewasbeschermingsmiddelen ...........................................................32
Tabel 13: Overzicht van de objecten opgenomen in de bacteriofagenproef ..........................33
Tabel 14: Toegepaste gewasbeschermingsmiddelen bij de fagenproef ................................34
Tabel 15: Datum van infectie, behandeling en bemonstering................................................35
Tabel 16: Percentage aantasting van de planten en bijhorende ziekte-index per object .......41
Tabel 17: Overzichtstabel van percentage aangetaste knipjes bij 0,24 en 48 u afdekking
(0/24/48) ...............................................................................................................................48
Tabel 18: Aantal zieke blaadjes een en twee weken na infectie bij 25°C na 24 u afdekking .50
4
1
Inleiding
Preiteelt is in Europa een belangrijke teelt waarvan het areaal geschat wordt op 28 000 ha.
België is de derde grootste Europese producent met een relatief stabiel areaal van 4500
hectaren (Eurostat, 2016). Meer dan de helft van de geteelde prei dient voor export. De
Vlaamse prei is van hoge kwaliteit mede door het invoeren van verschillende labels zoals
Flandria, GlobalGap etc. Om aan deze hoge kwaliteit te voldoen is vakmanschap een must
en het ziektevrij houden van het gewas een grote uitdaging. Bladvlekkenziekte en bacteriële
rot veroorzaakt door Pseudomonas syringae pv. porri (Pspo) en P. fluorescens is gestaag
aan het toenemen in Vlaanderen. Een vermoedelijke verklaring is dat steeds meer preitelers
hun plantmateriaal aankopen bij plantenkwekerijen en niet meer zelf opkweken. In deze
kwekerijen wordt de verspreiding van de pathogeen gestimuleerd door grote plantdichtheden
en bepaalde handelingen zoals maaien en irrigeren (Rombouts et al., 2015). Een factor die
de verspreiding van de pathogeen ook in de hand werkt, is het preiafval die na het schonen
terug op de akkers wordt gevoerd (van Overbeek et al., 2010). De gevolgen kunnen
uiteenlopend zijn. Licht aangetaste percelen ondervinden geen enkele economische schade.
Wanneer echter de omstandigheden voor de bacterie ideaal zijn, kan de schade hoog
oplopen. Deze schade uit zich door een gedaalde kwaliteit van het eindproduct, waardoor
deze voor de versmarkt niet meer voldoet aan bepaalde kwaliteitslabels. Vooral in de winter
van 2010-2011 werd er veel schade waargenomen die veroorzaakt werd door P.
fluorescens. Chemische bestrijdingsmiddelen tegen bacteriële ziekten zijn niet beschikbaar
in België. Het is dus belangrijk om preventief de ziekte onder controle te houden. Een eerste
mogelijkheid is om op zoek te gaan naar rassen die bestendiger zijn tegen infectie van dit
pathogeen. In deze thesis werden aldus twee rassenproeven bemonsterd in functie van
gevoeligheid aan bacteriële infectie. In een tweede luik van het praktische deel werd een
veldproef aangelegd om de werking en de toepassingswijze van faagtherapie onder
veldomstandigheden te onderzoeken. Deze veldproef dient een antwoord te bieden op de
vraag of het toedienen van bacteriofagen via veldbespuitingen of dompelbehandeling de
aantasting van Pseudomonas kan verminderen.
Om infectie door bacteriële pathogenen te kunnen voorkomen, is het tevens van belang een
inzicht te verwerven in de levenscyclus van deze organismen. Doordat de ziekte niet wordt
veroorzaakt door één specifieke stam, maar door verschillenede stammen, wordt het een
heel complex gegeven. Hierbij is het interessant te weten welke bacteriestammen het meest
virulent zijn, op welke wijze ze infecteren en hoe het komt dat bepaalde bacteriën zo
agressief zijn. Infectiedruk is mede sterk afhankelijk van de omgevingsfactoren zoals
temperatuur en relatieve vochtigheid. In een derde luik werden verschillende infectieproeven
uitgevoerd onder gecontroleerde omgevingsfactoren. Hieruit kan worden afgeleid welke
bacteriestammen het meest infectieus zijn op jonge preiplanten en bij welke temperatuur de
infectie het snelst optreedt.
5
2
Literatuurstudie
2.1 Allium porrum
2.1.1 Taxonomie
Prei of Allium porrum maakt deel uit van de lookfamilie (Alliaceae) (Block, 2010).Volgens
Khedim et al. (2013) zou de familie Amaryllidaceae (Asparagales) een betere benaming zijn
voor de familie waartoe het geslacht Allium behoort. Het geslacht Allium omvat meer dan
800 soorten waarvan de economisch belangrijkste gewassen ui, sjalot, knoflook, bieslook en
prei zijn (Block, 2010).
Tabel 1: Taxonomische indeling van prei.
Rijk
Stam
Klasse
Orde
Familie
Geslacht
Soort
Plantae
Embryophyta
Spermatopsida
Asparagales
Alliaceae
Allium
Allium porrum
2.1.2 Biologie en ecologie
Prei of Allium porrum is net zoals grassen een eenzaadlobbige of monocotyl. Kenmerken
van monocotylen zijn de parallelnervige bladeren en een homorhiz wortelstel dat bestaat uit
adventief wortels. Prei is een tweejarige plant en wordt geoogst in vegetatieve toestand
tijdens het eerste groeijaar. Als de prei niet zou worden geoogst, zou deze in het tweede jaar
na een dormante periode generatief worden. Om generatief te worden heeft de plant een
koude periode nodig. Dit fenomeen wordt vernalisatie genoemd. Soms is het mogelijk dat
bepaalde planten reeds in het eerste jaar generatief worden. Dit is niet gewenst omdat deze
zogenoemde “schieters” niet meer vermarktbaar zijn. De meest aannemelijke oorzaak van
schieten is dat de plant tijdens de groeiperiode in stress heeft komen te staan. Een
voorbeeld van zo’n stresssituatie is een lange droogteperiode tijdens vroege zaai of vroeg
uitplanten. Bij late oogst van winterprei (april) neemt de kans op schieters toe door de stijging
van lange dagen na vernalisatie (Wiebe, 1994).
Prei is een vollegrondgroente die bestaat uit bij- of adventief wortels, lange bladscheden,
bladschijven en groene bladeren. De pseudostengel (schacht) die is opgebouwd uit
bladscheden en bladschijven is cilindrisch van vorm en bevindt zich onder de grond. Het is
vooral deze structuur die wordt geconsumeerd. Doordat de pseudostengel onder de grond zit
bevat deze geen chloroplasten en is ze dus wit van kleur. Door de wortelstructuur vereist de
teelt van prei een losse bodemstructuur. De plant is niet in staat om diep in de grond haar
nutriënten en water te halen zoals bij dicotyle planten met een vertakte penwortel wel het
6
geval is. Prei laat wel een goede structuur na in de bodem want er treed meestal geen
compactie op zelfs wanneer de oogst gebeurt bij te natte omstandigheden (ten Berge et al.,
2010).
2.1.3 Teelt en productie
In 2014 bedroeg het areaal prei in Europa 27 800 hectaren. Turkije, Frankrijk, België en
Polen zijn de belangrijkste Europese producenten met respectievelijk 29 %, 19 %, 16 % en
15 % van het Europese areaal (Eurostat, 2016). In België wordt prei vooral in WestVlaanderen geteeld. Het gematigd klimaat zorgt voor ideale omstandigheden voor de teelt
van prei. Lichte en zandige kleigronden zijn het meest geschikt en een lage pH-waarde dient
vermeden te worden. Bij zure gronden zijn er problemen met nutriëntendeficiënties. In een
gematigd klimaat kan een opbrengst van gemiddeld 35 tot 50 ton per hectare worden
gerealiseerd. De nutritionele behoeften zijn 200-250 kg N/ha , 50-100 kg P2O5 en 150-200
kg K2O (Vanheule H., 2015).
Tegenwoordig worden bijna uitsluitend F1 hybriden geteeld. Het telen van hybriderassen
brengt heel wat voordelen met zich mee zoals een betere kwaliteit, betere bewaarbaarheid
en uniformere prei. Prei kan het jaar rond worden geteeld aangezien er zomer-, herfst- en
winterrassen bestaan. Het gewas staat ongeveer zes maanden op het veld. Door zijn relatief
lange groeiperiode moet prei regelmatig worden behandeld met fungiciden en insecticiden.
Ongeveer 30 % van de prei wordt verwerkt door de industrie, de overige 70 % dient voor de
verse markt (Declercq, 2009).
2.2 Fytopathogene bacteriën en de interactie met planten
2.2.1 De ziektedriehoek en ziektecyclus
Infectieziekten bij planten zijn ziekten die worden veroorzaakt door virussen of levende
organismen zoals schimmels en bacteriën. Als er interactie is tussen de plant en het
pathogeen bij gunstige omgevingsfactoren dan wordt de plant ziek. Het al of niet optreden
van ziekte is dus afhankelijk van drie factoren: de plant, de ziekteverwekker en de milieuinvloeden. Onderstaande figuur toont deze ziektedriehoek (Perkins et al., 2011).
Figuur 1: De ziektedriehoek (Perkins et al., 2011)
7
De ziektecyclus omvat verschillende ontwikkelingsfasen die worden doorlopen bij een
infectieziekte. De opeenvolging van deze fasen leidt tot ontwikkeling en uitbreiding van de
ziekte. De eerste fase in de cyclus is de inoculatiefase waarbij de organismen aan het
buitenoppervlak van de plant aanwezig zijn. De besproken bacteriën in deze thesis zijn
polycyclisch. Ze kunnen m.a.w. meerdere generaties per seizoen aanleggen. Dit is niet
abnormaal bij bacteriën aangezien deze zich heel snel kunnen vermenigvuldigen. De
groeisnelheid van fytopathogene bacteriën is afhankelijk van bepaalde milieufactoren zoals
zuurtegraad, temperatuur, vochtigheid etc. Vooraleer de bacterie het waardplantweefsel
binnendringt, moet deze in staat zijn epifytische groei te verwezenlijken. Hiervoor moet de
pathogeen weerstaan aan ongunstige omgevingsfactoren zoals dehydratatie, uv-licht,
lekkage van nutriënten, competitie met andere epifyten enz. Het is een grote uitdaging om te
kunnen overleven aan het bladoppervlak van de plant. De aanwezigheid van een slijmlaag
(biofilm) rond de bacterie zorgt ervoor dat dit mogelijk is. De biofilm is een beschermende
slijmlaag die de celwand van de bacterie omvat en voornamelijk uit exopolysachariden
bestaat (EPS) (Jones en Dang, 2006; Thordal-Christensen, 2003). Niettegenstaande de
soms minder gunstige omgevingsfactoren zijn pathogenen in staat hoge populatiedichtheden
op te bouwen nl. tot 106-107 cellen per cm². Het fenomeen dat bacteriën gebruiken om hun
populatiedichtheden onder controle te houden heet quorum sensing (QS). Bij quorum
sensing gaan de bacteriën enkel de plant infecteren als ze met een voldoend groot aantal
zijn zodat de plant zich niet voldoende kan verweren (Whitehead et al., 2001). De
levenscyclus van sommige bacteriën zoals Pseudomonas impliceert zowel epifytische als
endofytische groei. De potentie om te weerstaan aan epifytische omstandigheden varieert
afhankelijk van soort en stam. Tijdens deze epifytische groeifase is de biofilm heel belangrijk
om te overleven.
De adhesie is de tweede stap in de cyclus. Deze fysieke aanhechting aan de plant betekent
dat een niet-specifieke binding tussen bacterie en plant gevormd wordt via hydrofobe
interacties. Deze stap is nog reversibel. Later wordt deze binding onomkeerbaar doordat
bacteriën zich vasthechten m.b.v. pilli, fimbrae of polysachariden (cellulose fibrillen of klein
oplosbaar cyclisch beta-1glucaan). Pseudomonas syringae species hechten zich aan de
bladoppervlakte via pilli (Baker et al., 2011).
Na de adhesie gaat de bacterie de plant penetreren. Pathogene schimmels hebben
gespecialiseerde structuren om het plantenweefsel rechtstreeks te penetreren zoals de
aanleg van een appresorium. Anders is het bij de meeste bacteriën. Deze kunnen enkel de
plant binnendringen via wondjes of natuurlijke openingen zoals lenticellen, hydathoden en
stomata. Als de plant aan actieve fotosynthese doet gaan de stomata open om CO2 in de
plant te laten en zuurstof en waterdamp vrij te stellen aan de omgeving. Tijdens dit opengaan
worden organische componenten vrijgesteld waarop bladpathogenen reageren. Als reactie
op deze organische componenten, verplaatsen de bacteriën zich naar de geopende stomata,
waar ze een vrije toegang hebben tot de plant (Goehre en Robatzek, 2008). Het
binnentreden van bacteriën via de stomata is dus geen passief en toevallig proces, maar
wordt geregeld door de vrijstelling van organische componenten tijdens het openen van de
8
stomata. De stomata bestaan uit twee speciale epidermale cellen: de sluitcellen. Door
veranderingen van de turgordruk in deze cellen gaan de stomata open of dicht. De sluitcellen
zijn in staat om PAMP’s (Pathogen-Associated Molecular Patterns) te herkennen. Wanneer
deze PAMP’s herkend worden, gaan de stomata onmiddellijk dicht. De receptoren in de
sluitcellen kunnen geen onderscheid maken tussen niet-pathogene en pathogene bacteriën.
Pathogene bacteriën kunnen echter een heropening van de stomata induceren. Het
fytotoxine coronatine zou voor deze inductie verantwoordelijk zijn. Echter pathogenen die
geen coronatine kunnen produceren, zijn ook in staat om stomata te heropenen. Er zouden
dus mogelijks nog andere fytotoxinen bestaan, die de oorzaak zijn van dit fenomeen (Melotto
et al., 2008). Coranotine heeft dezelfde structuur als methyl-jasmonaat, die de
jasmijnzuurcyclus activeert. Aangezien coranotine dezelfde structuur en functioneel
homoloog is aan het methyl-jasmonaat, kan deze als modulator optreden in de jasmijnzuur
cyclus. Jasmijnzuur is een signaalhormoon in de plant en regelt het openen en sluiten van de
stomata. Het sluiten van de stomata wordt aanzien als de eerste PTI (PAMP Trigered
Imunity) respons. Bepaalde bacteriën hebben hun flagellinemolecule gemodificeerd zodat ze
niet meer worden herkend door de receptoren van de sluitcellen en zo makkelijker toegang
hebben tot de apoplast (Sun et al., 2006).
Sommige bacteriën kunnen echter rechtstreeks doorheen de celwand penetreren door
productie van enzymen of via het type III secretiesysteem. P. fluorescens bevat
pectinolytische enzymen die pectinen in de celwand afbreken. Anderzijds is er het type III
secretie systeem dat een kanaaltje maakt in de celwand en in het plasmamembraan. Op
deze manier kan de bacterie rechtstreeks zijn effectoren in de plantencel injecteren (Sherif et
al., 2015). Na de penetratie wordt de plant geïnfecteerd. Tijdens de infectie komt de bacterie
in contact met gevoelige weefsels en cellen van de plant die als voedingsbasis dienen. In
deze fase worden meestal de ziektesymptomen duidelijk. Als gevolg van een geslaagde
infectie treedt gastheer-kolonisatie op. Fytopathogene bacteriën vermenigvuldigen zich
intercellulair. Ze dringen de plantencel niet binnen, maar bevinden zich tussen de
plantencellen. Sommige bacteriën zoals Xanthomonas (pathogeen voor kolen) kunnen zich
in het vaatbundelsysteem vestigen. Deze bevinden zich in het xyleem, met als gevolg
verwelking van de plant (Höfte en De Vos,2006).
9
Figuur 2: Voorstelling van de ziektecyclus
2.2.2 Pathogeniciteit en resistentie
Fytopathogene bacteriën interfereren met heel wat processen in het plantmetabolisme om
aan hun nutritionele behoefte te voldoen. Deze interactie tussen plant en pathogeen grijpt
plaats op moleculair niveau. Planten en pathogene bacteriën hebben specifieke
mechanismen ontwikkeld om respectievelijk hun resistentie en pathogeniciteit te versterken.
Dit proces wordt beschreven in het co-evolutie model dat bestaat uit vier fasen. Dit coevolutie proces wordt ook het zigzag model van het plantimmuunsysteem genoemd. In de
eerste fase (Figuur 3a) is de plant in staat om componenten en structuren (PAMP’s) van
micro-organismen te herkennen. Als reactie op deze aanwezige moleculen wordt een basaal
defensie mechanisme geactiveerd (PTI). Dit mechanisme draagt bij tot een vorm van
resistentie tegenover binnendringende pathogenen, samen met de natuurlijke fysische en
chemische barrières van de plant. Alle plantensoorten vertonen dus enige graad van
immuniteit tegenover pathogene bacteriën. Enkele van deze bacteriën hebben zich
aangepast om via virulentie factoren het basaal defensiesysteem van planten te doorbreken.
Veel plantpathogene bacteriën gebruiken het type III secretie systeem (T3SS) om hun
virulentie eiwitten direct in het cytoplasma van de gastheer te brengen. Op deze manier
wordt vermeden dat de plant de pathogene eiwitten herkend en dus een defensiemechanisme zou kunnen worden opgestart (Figuur 3b). In de daarop volgende fase hebben
bepaalde planten specifieke R-genen ontwikkeld die coderen voor resistentie eiwitten (Rproteïnen). Deze zijn wel weer in staat om virulentiefactoren te herkennen zodanig dat
resistentie terug wordt hersteld (Figuur 3c). Sommige bacteriën zijn in staat om hun
effectoren te elimineren of modificeren zodat de plant ze niet meer herkent (Figuur 3d). Dit
evolutionair proces tussen pathogeen en plant wijst er op dat bacteriesoorten specifieke
gastheerplanten hebben. Dit hangt af van de graad van virulentie van de pathogenen en
tolerantie of resistentie van de plant. De belangrijkste fytopathogene bacteriën zijn
10
gramnegatief en gebruiken het T3SS om hun virulentie factoren in de plantencel te brengen
(Sherif et al., 2015).
.
Figuur 3: Co-evolutiemodel bestaande uit vier fasen (Sherif et al., 2015)
11
2.3 Genus Pseudomonas
Tabel 2: Taxonomische indeling van Pseudomonas
Rijk
Bacteria
Stam
Proteobacteria
Klasse
Gammaproteobacteria
Orde
Pseudomonales
Familie
Pseudomonaceae
Geslacht
Pseudomonas
Ziekten veroorzaakt door bacteriën komen minder voor dan ziekten veroorzaakt door
schimmels en virussen. De meeste bacterieziekten komen voor in tropische gebieden, waar
het warm en vochtig is. Toch is er in Vlaanderen een stijgende tendens in voorkomen van
bacteriële infectie veroorzaakt door Pseudomonas bij prei. Deze stijgende tendens is
hoogstwaarschijnlijk te wijten aan het feit dat meer preitelers hun plantmateriaal laten
opkweken bij grote plantenkwekers. In deze kwekerijen worden veelal de preiplanten op
dezelfde grond opgekweekt, waardoor de preiplanten mogelijks vanuit de kwekerijen al
besmet zijn met Pspo. Andere handelingen die de verspreiding in de hand werken zijn het
toppen van de bladeren bij de planten waardoor wondjes ontstaan en irrigatie (Rombouts et
al., 2015).
Bacteriën zijn eencellige organismen die gekenmerkt worden door een prokaryotische
cellulaire bouw. Prokaryoten hebben geen kern en hebben ook geen membraan-omvattende
celorganellen. De afmetingen van jonge culturen van bacteriën varieert van 0,6 tot 3,5 µm.
Het cytoplasma in de cel is gevuld met een colloïdale massa waar ribosomen, reserve- en
afvalproducten zijn in opgelost. De ribosomen van bacteriën (70s) zijn kleiner dan deze van
eukaryoten (80s) en ook de moleculaire structuur is verschillend. Het genomisch DNA ligt los
in een niet afgebakende zone in het cytoplasma van de cel. Het genoom van bacteriën
bestaat uit enkele miljoenen basenparen en duizenden genen, meestal gelegen op een
cirkelvormig chromosoom. Het reproductieproces van bacteriën d.m.v. binaire deling gaat
veel sneller dan bij eukaryoten. Daarnaast kunnen ook plasmiden of transposons aanwezig
zijn. Plasmiden zijn kleine cirkelvormige DNA strengen die geen rechtstreeks verband
houden met het metabolisme van de bacteriecel. De plasmiden bevatten eerder
resistentiegenen tegen antibiotica of genen die coderen voor infectieuze proteïnen en
kunnen onderling tussen bacteriën worden uitgewisseld via een zogenoemde pillus. Het op
deze manier overdragen van DNA tussen bacteriën onderling wordt ‘horizontal gene transfer’
genoemd en ligt aan de basis van de snelle evolutie van bacteriën (Vidaver en Lambrecht,
2004).
12
Het geslacht Pseudomonas behoort tot de gramnegatieve bacteriën, meer bepaald tot de
gamma subklasse van de Proteobacteria (Kersters et al.,1996). Zoals de meeste
plantpathogene bacteriën zijn ze staafvormig. Ze zijn ongeveer 0,5 tot 1 µm breed en hebben
een lengte van 1,5 tot 4 µm. De pseudomonassoorten zijn meestal lipotrich. Dit betekent dat
ze meerdere flagellen bezitten aan slechts één zijde. Niettegenstaande zijn sommige echter
onbeweeglijk. Veel soorten uit dit genus zijn fluorescent. Het geslacht Pseudomonas heeft
een heel groot aantal soorten waarvan verschillende pathotypes bestaan. Ze leven in bodem
en water en zijn doorgaans overal terug te vinden (Höfte en De Vos,2006).
Pseudomonas species behoren tot de rRNA groep I (Palleroni et al.,1973). De taxonomische
indeling van deze groep van organismen is verwarrend en zou beter worden aangepast
(Höfte en De Vos, 2006).
2.3.1 Pseudomonas syringae pv. porri (Pspo)
2.3.1.1 Taxonomie en morfologie
Tabel 3: Taxonomische indeling van Pspo
Rijk
Bacteria
Stam
Proteobacteria
Klasse
Gammaproteobacteria
Orde
Pseudomonales
Familie
Pseudomonaceae
Geslacht
Pseudomonas
Soort
Pseudomonas syringae pv. porri
P.syringae pv. porri is een homogene groep die verschillende stammen omvat. Het zijn
gramnegatieve staafjes en ze kunnen zich goed bewegen door de aanwezigheid van twee
flagellen van het serotype H1. Pspo zijn obligate aëroben, kunnen glucose oxideren en
groeien dus goed op een minimaal medium met glucose. P.syringae soorten zijn overal
aanwezig. Groei treedt op bij een breed temperatuursinterval van 4° C tot 40° C. Ze zijn
oxidase negatief en arginine dihydrolase negatief (Samson et al., 1998). Van de oxidase
negatieve species, is P.syringae de meest belangrijkste. Deze bacteriesoort omvat meer dan
50 pathovars. Oorspronkelijk werd aangenomen dat iedere pathovar een specifieke
waardplant had (Young et al., 2004). Noble et al. (2006) diagnosticeerde echter Pspo op ui
en sjalot, waarvan men vroeger dacht dat deze enkel pathogeen was voor prei.
Via DNA-DNA hybridisatie en RFLP (Restriction Fragment Length Polymorfism) amplificatie
was Gardan et al. (1999) in staat 48 onderzochte pathotypes van P.syringae in negen
genomiespecies in te delen. Iedere groep heeft een specifieke onderscheidende ribogroep.
Alle pathovars die tot dezelfde genomiespecies behoren, zijn minstens 70 % homogeen. Zo
13
zit Pspo in genomiespecies 4 samen met P.coronofaciens, P.s.pv. garcae, P.s. pv.
striafaciens, P.s. pv. atropurpurea, P.s. pv. oryzae en P.s. pv. zizaniae. De organismen die
tot genomiespecies 4 behoren hebben allemaal ribogroep F in hun genoom (Höfte en Vos,
2006). Op hetzelfde moment was Sawada et al. (1999) bezig met een fylogenetische analyse
van 56 stammen uit 19 verschillende pathovars van P.syringae. Hierbij werden vier genen
bestudeerd. Om het verloop van de genoomevolutie vast te stellen werden de genen gyrB en
rpoD bekeken. De genen hrpL en hrpS zijn gelokaliseerd op het chromosoom en gerelateerd
aan pathogeniciteit. Uit deze analyse konden de stammen ingedeeld worden in drie
monofyletische groepen. Groep 1 bevatte de organismen die behoorden tot genomiespecies
3 en 8, ontwikkeld door Gardan et al. (1999). Groep 2 correspondeerde met genomiespecies
1 en groep 3 kwam overeen met genomiespecies 2. Vijf jaar later werd de structuur van de
P.syringae populatie en de veranderingen van het genoom bestudeerd met de MLST (Multi
Locus Sequencing Typing) analyse. Er werden 60 stammen onderzocht uit 21 pathovars en
er waren twee pathovars niet pathogeen. MLST is een recente analysetechniek waarbij het
mogelijk is om stammen te typeren door het gemeenschappelijk genoom te vergelijken. Deze
analyse is gebaseerd op de zogenoemde zeven “housekeeping genes”. Bij deze analyse
werden vier groepen getypeerd. De eerste drie komen overeen met deze geïdentificeerd
door Sawada et al. (1999), een vierde groep bevat enkel stammen die pathogeen zijn op
monocotylen (rijst, ui en prei) en die behoren tot genomiespecies 4. De waardplant van het
pathogeen wordt niet bepaald in het core genoom, maar wordt bepaald door andere factoren
(Sarkar en Guttman, 2004).
2.3.1.2 Pathogeniciteit en infectiemechanisme
Pspo is niet enkel een pathogeen voor prei. Deze pathogeen werd ook vastgesteld bij
andere Allium species zoals ui (Allium cepa) en sjalot (Allium cepa var. aggregatum) (Noble
et al., 2006).
P.syringae stammen gebruiken het type III secretie systeem (T3SS) om de plant te
parasiteren. Diverse gramnegatieve bacteriën gebruiken dit mechanisme om
virulentieproteïnen in de plant te kunnen injecteren. In Figuur 4 is de werking van het type III
secretiesysteem bij Xanthomonas voorgesteld. Bij Xanthomonas soorten zijn de belangrijkste
groep van effectoren afkomstig van de TAL (Transcription Activator-Like) familie. De injectie
van de effectoren in het cytoplasma van de plantencel gebeurt via een holle injectienaald. De
geïnjecteerde effectoren gaan vervolgens naar de nucleus van de plantencel waar ze
bepaalde targetgenen, die interfereren met het afweersysteem van de plant, induceren om
tot expressie te komen (Boch en Bonas, 2010). De hrp genen (hypersensitive response en
pathogeniciteit) en de hrc genen (hrp conserved) coderen voor de type III eiwitten. De
effectorproteïnen die in de plantencellen worden geïnjecteerd door T3SS zijn belangrijk voor
de pathogeniciteit (Jin et al.,2003). Het hrp genensysteem zorgt voor de tanslocatie van
effectoreiwitten doorheen de plantencelwand en plasmamembraan (Buel et al., 2003). Deze
effectorgenen kunnen verspreid liggen in het genoom of op een plasmide en al dan niet
vervat in een pathogeeneiland of geassocieerd met de hrp cluster ( Oguiza en Asensio,
2005). Type III effectoreiwitten laten de cel lekken, waardoor water en nutriënten vanuit de
14
gastheercel in de apoplastische ruimte terecht komen. Daarenboven onderdrukken de
effectoren het defensiemechanisme van de plant. Ze interageren met de virulentietargets van
de plant.
Figuur 4: Werking van het type III secretie systeem bij Xanthomonas (Boch en Bonas, 2010)
.
Bij resistente planten zijn de effectoren avirulent. De resistentiegenen van de plant
herkennen het effector-virulentie target complex en activeren een hypersensitive response
(HR). Dit is een primaire verdediging van de plant waarbij omringende cellen versneld
afsterven. Gevoelige planten bezitten deze resistentiegenen niet waardoor het
defensiemechanisme van de plant niet wordt geactiveerd. De effectoren zijn in deze situatie
virulent en pathogeen (Oguiza en Asensio, 2005). Type III effectoren van P.syringae kunnen
in twee klassen worden gegroepeerd afhankelijk van de targetlocatie in de plant.
Extracellulaire types en intracellulaire types zijn beschreven. Intracellulaire type III eiwitten
worden vanuit de bacteriecel direct in het cytosol van de plantencel gebracht. Recente
studies toonden aan dat deze effectoren heel virulent zijn door hun sterk vermogen om
verscheidene beschermingsmechanismen zoals gen-om-gen resistentie en primaire
resistentie, te onderdrukken (Nomura et al.,2005). Extracellulaire type III effectoreiwitten zijn
rijk aan glycine, maar bevatten geen cysteïne. Deze proteïnen worden ook wel harpinen
genoemd en zijn stabiel bij hogere temperaturen. Wanneer ze geïnjecteerd worden in de
intercellulaire ruimte van de bladeren, lokt dit een soort hypersensitieve reactie uit bij de
plant. HrpZ en HrpW zijn voorbeelden van extracellulaire type III effectoren. Waarschijnlijk
helpen deze harpinen bij het translocatieproces van de effectoren in het cytoplasma van de
gastheercel of zijn ze verantwoordelijk voor het lekken van nutriënten uit de cel van de
gastheer (Höfte en Vos, 2006).
15
Pseudomonas spp. produceren heel wat fytotoxische stoffen die dienen als virulentiefactor.
De meest gekende toxinen worden door P.syringae pathovars geproduceerd (Bender et al.,
1999). Enkele voorbeelden van toxinen die door P.syringae pathovars worden geproduceerd
zijn: tabatoxine, phaseolotoxine, syringomycine, syringopeptine en coronatine. Deze
fytotoxinen bevorderen de verplaatsing van de bacterie in de plant, de laesiegrootte en de
vermenigvuldiging van de pathogeen in de gastheer. Tabatoxine wordt geproduceerd door
P.s. pv. tabaci, coronafaciens en garcae, die tevens allemaal tot genomiespecies 4 behoren.
P.s. pv. striafaciens behoort ook tot genomiespecies 4, maar maakt geen tabatoxine aan. In
de literatuur wordt nergens aangehaald dat Pspo tabatoxine produceert, niettegenstaande
deze pathovar wel tot genomiespecies 4 behoort (Höfte en Vos, 2006).
Verschillende P.syringae soorten en enkele andere gerelateerde bacteriën zijn in staat
fytohormonen, zoals auxine en ethyleen aan te maken . De genen die coderen voor deze
hormonen zijn respectievelijk het iaaM/iaaH gen en efe (ethyleen forming enzym) gen die
gelegen zijn op plasmiden. De concentratie IAA is sterk gerelateerd aan de pathogeniciteit,
terwijl dit voor ethyleenproductie nog niet echt duidelijk is (Glickmann et al., 1998; Weingart
en Volksch, 1997; Weingart et al., 2001). Bij Pspo zijn beide genen niet aanwezig.
Algemeen produceren P.syringae pathovars twee EPS moleculen, namelijk levaan
(fructofuranan polymeer) en/of alginaat (Gross en Rudolph, 1987). Pspo kan levaan
produceren op sucrose pepton agar (LOPAT test). Het is niet geweten of Pspo pathogeen is
door productie van dit moleculen.
P.syringae is een INA bacterie (Ice Nucleation Active). Dit betekent dat de bacterie in staat is
ijskristallen te vormen bij temperaturen van 0 tot -5°C en bijgevolg de weefsels van
vorstgevoelige planten te vernietigen. Als INA bacteriën aanwezig zijn op het bladoppervlak
van planten, veroorzaken ze hetzelfde effect als vorst bij temperaturen vanaf 0°C (Hirano en
Upper, 2000).
2.3.1.3 Aanwezigheid en verspreiding in het milieu
De soort P.syringae is veel meer dan een pathogeen voor bepaalde planten. Het is een
veelzijdige bacterie die in heel wat ecosystemen aanwezig is, vooral in een aquatisch milieu.
De bacterie speelt enerzijds een grote rol in het fenomeen van regen en sneeuwval en
anderzijds is het een bacterie die in staat is planten te infecteren. Doordat P.syringae INA
positief is, heeft deze een grote invloed op het bevriezen van water in de watercyclus. Bij
temperaturen tussen 0 en -8° C in de wolken zorgt vooral deze INA actieve bacterie voor
ijskristallen en vervroren waterdruppels wat zich uit tot hagel en sneeuw. De levenscyclus
van P.syringae is complex en eigenlijk bevindt deze bacterie zich overal. Hoewel P.syringae
virulent is , kan ze ook als saprofyt overleven. Ze is aanwezig in water en in de atmosfeer.
Figuur 5 geeft de aanwezigheid en verplaatsing in het mileu weer van P.syringae (Morris et
al., 2013).
16
1. P.syringae komt op bodem en planten terecht door regen en sneeuw.
2. In gebergteomgevingen overleeft P.syringae in de sneeuwlaag.
3. In het milieu bevinden ze zich op bladafval en grassen.
4. Door het smelten van sneeuw of via neerslag, gaat een fractie van de
bacteriepopulatie naar de ondergrondse waterflow.
5. De rest komt via de bovengrondse watercyclus in rivieren terecht.
6. P.syringae wordt getransporteerd in de waterkolom en vormt epifytische biofilms.
Epifytische populaties op wilde planten die worden afgeregend kunnen ook deze weg
volgen.
7. P.syringae kan in cultuurgewassen terecht komen door regen of door irrigatie met
rivierwater.
8. De populaties aanwezig op planten gaan via aerosol terug naar de troposfeer.
9. Een deel van het water dringt door de bodem en zit in het grondwater.
Figuur 5: De aanwezigheid en verplaatsing van P.syringae gaat goed gepaard met de cyclus van de
waterstromen (Morris et al., 2013)
17
2.3.1.4 Symptomen en ziektebeeld
De symptomen van bacteriële infectie op prei zijn afhankelijk van de soort bacterie. De
symptomen veroorzaakt door Pspo verschillen met deze veroorzaakt door P.fluorescens. Bij
bacteriebrand teweeggebracht door Pspo is een bruine bladlaesie, omringd door een
geelachtige cirkel zichtbaar. Typerend zijn de lange, waterachtige plekken uitgerekt in de
lengterichting van het blad (Hall et al., 2007). Meestal zijn het de oudste bladeren die worden
aangetast. Deze zijn het meest gevoelig. Het feit dat ze tegen de grond aan liggen is ook
nadelig. In erge gevallen kan de volledige plant worden aangetast.
Figuur 6: Schadebeeld van aangetaste preiveroorzaakt door Pspo.
Duidelijke bladnecrose vanaf groeipunt langs één zijde
van het blad naar de schacht toe.
2.3.2 Pseudomonas fluorescens
2.3.2.1 Taxonomie en morfologie
Tabel 4: Taxonomische indeling van P.fluorescens
Rijk
Bacteria
Stam
Proteobacteria
Klasse
Gammaproteobacteria
Orde
Pseudomonales
Familie
Pseudomonaceae
Geslacht
Pseudomonas
Soort
Pseudomonas fluorescens
Janse et al. (1992) onderzocht de groep van fluorescentie oxidase positieve Pseudomonas
species. Deze groep wordt grotendeels vertegenwoordigd door biotypen van P.fluorescens,
maar ook door andere bacteriesoorten die zachtrot veroorzaken. Oorspronkelijk werd een
18
verschil gemaakt tussen P.marginalis en P.fluorescens. Aangezien er bij diverse fluorescente
pseudomonaden zachtrot wordt waargenomen, was het niet meer nuttig om een onderscheid
te maken binnen deze groep. Al deze pseudomonaden werden samen geschikt tot een
supercluster van P.fluorescens. Het verschijnsel van zachtrot is te wijten aan het vermogen
tot afbraak van plantencelwanden. Ze hebben pectinolytische enzymen die de pectinen in de
celwanden afbreken. P.fluorescens is voor heel wat planten infectieus en is niet gastheer
specifiek (Janse et al., 1992).
2.3.2.2 Pathogeniciteit en infectiemechanisme
P.fluorescens bestaat niet uit een homogene groep met verschillende pathovars zoals bij
P.syringae wel het geval is. Beter is om over het Pseudomonas fluorescens complex te
spreken omdat er heel wat uiteenlopende eigenschappen zijn tussen de stammen onderling.
Mogelijks zitten in deze heterogene groep verschillende soorten. Sommige hebben ook INA
activiteit of hebben ook een T3SS om te infecteren (Warren et al., 1986).
Als virulentiefactor is Pseudomonas fluorescens (marginalis) in staat pectinolytische
enzymen te produceren. Deze polygalacturonasen en pectine lyasen verbreken de α-1,4galacturonbindingen in de polymeren van de celwand van de gastheerplant door
respectievelijk hydrolyse en β-eliminatie. De bacteriën produceren deze enzymen enkel als
ze met een voldoende groot aantal aanwezig zijn. Wanneer het afweersysteem van de plant
op dat moment wordt geactiveerd, maakt de plant geen schijn van kans om zich nog te
beschermen tegen de massale aanwezige pathogenen (Höfte en Vos, 2006).
P.fluorescens heeft de potentie om viscosine te produceren (Bender et al., 1999). Viscosine
kan gezien worden als een natuurlijke uitvloeier of biosurfactant. De beweeglijkheid van
P.fluorescens SBW25 in de bodem wordt niet enkel veroorzaakt door het flagellum, maar
ook door de aanmaak van viscosine. Deze molecule zorgt ervoor dat de verspreiding van de
bacterie in de grond, maar ook op bladeren van gewassen, heel efficiënt gebeurd. Heel wat
Pseudomonaden van het fluorescens complex zijn bodembacteriën. Deze zijn niet altijd
pathogeen en kunnen zelfs een positieve invloed hebben op planten. Zo hebben bepaalde
stammen een beschermende rol bij gekiemde zaden tegen de kiemschimmel Pythium door
de aanmaak van viscosine (Alsohim et al., 2014). Anderzijds is de potentie om viscosine te
produceren een virulentiefactor die bijdraagt tot de pathogeniciteit van de bacterie en die het
binnendringen van de bacterie in plantenweefsels bevordert (Hernandez-Anguiano et al.,
2004).
Pathogene P.fluorescens species zijn meer infectieus bij rijpe en oudere prei, terwijl Pspo
meer aanwezig is op jonge prei (Van Vaerenbergh J., 2016).
19
2.3.2.3 Symptomen en ziektebeeld
Bacteriële infectie in prei veroorzaakt door bacteriën van het Pseudomonas fluorescens
complex heeft als voornaamste symptomen rotting waarbij de plantencellen gaan verslijmen.
Onderstaande foto toont een rotte bladvlek juist boven de schacht. Op de tweede foto is
duidelijk te zien dat volledige planten verdwijnen als gevolg van bacteriële infectie.
Opmerkend is dat bacterieziekte veroorzaakt door deze groep meestal later in het seizoen
voorkomt terwijl Pspo meer voorkomt bij warmere temperaturen (Van Vaerenbergh J.,2016).
Figuur 7: Foto’s genomen op besmet veld in Meulebeke
2.3.3 Bestrijding en controle
Onder controle houden van plantpathogene bacteriën is heel moeilijk en nooit 100 %
effectief. Om een geïntegreerde onderdrukking van de ziekte te bekomen, dienen
verschillende strategieën te worden gecombineerd (Bashan en de Bashan, 2002). In het
kader van IPM (Integrated Pest Management) gaat steeds meer aandacht naar preventie
van infectieziekten. Het is altijd beter om ziekten te voorkomen dan ze te bestrijden. Dit geldt
niet enkel voor bacteriële infecties. Zoveel mogelijk voorkomen van infectie en combineren
van verschillende strategieën is het efficiëntst om bacterieziekte te onderdrukken.
Pspo is zaadoverdraagbaar (Smith et al., 1988). Hierbij is het dus belangrijk dat er geen
besmet preizaad wordt gebruikt. Het gebruik van niet gecontamineerd zaad is een vereiste,
maar kan niet worden verzekerd door gecertificeerd zaaizaad te gebruiken of ontsmet zaad.
Bacteriën overleven op plantenresten in de bodem. Gewasrotatie kan ook sterk bijdragen om
inoculum te verlagen op het veld. Als geen waardplanten aanwezig zijn op het veld, is het
moeilijker voor de pathogeen om zich in stand te houden. Hierbij is het ook belangrijk om
onkruiden onder controle te houden aangezien bepaalde onkruiden waardplanten zijn voor
20
Pseudomonas species. Vooral in zaaibedden en serres is bestrijding van onkruiden
noodzakelijk. Plantafval en resten van prei is tevens een goede voedingsbodem waarop
bacteriën zich kunnen vermenigvuldigen. Pspo kan minstens een maand overleven op
gewasafval. Van Overbeek et al. (2010) concludeerde dat het preiafval na de oogst een
belangrijke rol heeft in de epidemiologie van Pspo. De primaire infectie van preiplanten
gebeurt door gewasresten die via de bodem naar de wortels en de volledige preiplant
overgaan (van Overbeek et al., 2010). Andere hygiënische maatregelen kunnen ook een
sterke invloed hebben op het voorkomen van infectie. Voorbeelden zijn ontsmetten van
zaaibedgereedschap, messen en andere machines die in contact komen met de preiplanten
(Lamichhane et al. 2015). Vooral het maaien van preiplanten is een delicaat proces, omdat
er wondjes ontstaan ter hoogte van de bladeren. Deze wondjes zijn rechtstreekse openingen
voor de bacterie om binnen te dringen in de plant. Bij het aanaarden van de rijen op het veld
wordt met een tractor door het gewas gereden en kunnen er ook wondjes ontstaan ter
hoogte van het blad. Een geïnfecteerd veld moet altijd als laatste behandeld worden zodat
geen overdracht mogelijk is naar de gezonde velden.
Overmatig gebruik van stikstofmeststoffen maakt de plant gevoeliger voor infectie. Dit komt
omdat de plant heel snel groeit en daardoor de celwanden veel dunner en minder stevig zijn.
Stilstand en groeipieken gedurende het groeiseizoen dienen ook vermeden te worden. Door
dergelijke groeischeuten ontstaan er fijne haarscheurtjes. Via deze haarscheurtjes is het heel
gemakkelijk voor de bacterie om het plantenweefsel te infecteren. De waslaag van de plant
is een fysische barrière die bescherming voorziet tegen pathogenen. Aantasting van deze
waslaag door overmatig gebruik van fungiciden of uitvloeiers, maakt de plant gevoeliger voor
infectie (Okon, 1990).
Wanneer de bacterie de plant infecteert is relatieve vochtigheid heel belangrijk. De infectie
verloopt optimaal wanneer een waterfilmpje aanwezig is op het blad. Dit is een
klimatologisch gegeven, maar toch is het enigszins mogelijk om de relatieve vochtigheid te
sturen. Als de plantdichtheid wat afneemt bijvoorbeeld kunnen de bladeren veel sneller
opdrogen. Bij een minder dicht gewas zijn de bladeren dus minder lang nat en is de kans op
infectie ook veel kleiner. In serres kan de relatieve vochtigheid en temperatuur worden
gestuurd en gecontroleerd. Door periodische beluchting in de serre, wordt een lage relatieve
vochtigheid behouden. Door druppelirrigatie toe te passen, worden de bladeren niet nat,
maar zijn ze toch voorzien van het nodige vocht (Höfte en Vos, 2006).
Chemische stoffen worden al lang gebruikt om plantenziekten te bestrijden. Bij
bacterieziekten is het moeilijker om chemisch te behandelen (Lamichhane et al., 2015). In
sommige landen wordt antibiotica gebruikt om bacteriële ziekten onder controle te houden.
De meest aangewende antibiotica zijn streptomycine en oxytetracycline. In Europa is het
gebruik van antibiotica als gewasbeschermingsmiddel verboden. Uit vrees voor resistentie
tegenover antibioticamiddelen, moet antibioticagebruik drastisch dalen in de landbouw. Zo is
er al resistentie vastgesteld bij enkele Pseudomonas-stammen tegenover streptomycine
(McManus et al., 2002). Het resistentiegen voor streptomycine bij Pseudomonas is op
21
plasmiden of transposons gelokaliseerd (Feil et al., 2005). Dit gen kan dus heel snel worden
verspreid tussen de bacteriën via ‘horizontal gene transfer’. Sinds het verbod van
antibioticagebruik in Europa, werden andere alternatieven gebruikt. Tegenwoordig wordt
gebruik gemaakt van koperverbindingen die aanwezig zijn in bepaalde fungiciden. Vooral in
de fruitbomenteelt worden koperfungiciden zoals Bordeaulese pap toegepast om
bacterieziekten onder controle te houden. Er zijn toch enkele nadelen verbonden aan het
gebruik van koper. Koper kan niet in grote concentraties worden toegediend omdat dit
fytotoxiciteit veroorzaakt. Een tweede minpunt is dat reeds resistentieontwikkeling optreedt
bij de bacteriën (Höfte en Vos, 2006). In een geïntegreerd model kunnen plant activators
worden ingezet in combinatie met koperfungiciden (Louws et al.,2001). Plant activators
induceren bij de plant systemische resistentie (SAR of Systemic Aquired Resistance) ten
aanzien van bladziekten veroorzaakt door bacteriën, schimmels of virussen. De
resistentiereacties komen op gang in de gehele plant door een accumulatie van salicylzuur.
Vervolgens worden de PR genen (Pathogen Related Genes) geactiveerd, waardoor PReiwitten worden aangemaakt die duidelijk een antifungale en bacteriocide werking hebben.
Het grote voordeel van deze middelen is, dat het niet op de bacteriën rechtstreeks inwerkt en
er zo geen resistentie kan ontstaan. Er werden verschillende moleculen beschreven die als
plant activator kunnen worden ingezet. Zo geeft het toedienen van Actigard (acibenzolar-Smethyl) aan tabak goede resultaten m.b.t. controle van P. syringae pv.tabaci (Cole, 1999).
Het middel wordt vooral toegepast in de tomatenteelt tegen Botrytis cinerea en
Pseudomonas syringae pv. tomato. Acibenzolar-S-methyl is een benzo-thiadiazoolverbinding
(BTH) die als salicylzuuranaloog werkt. Het product werd in sommige landen van Europa
toegelaten tot 2011. In België werd deze molecule nooit erkend wegens de relatief hoge
fytotoxiciteit en de toxiciteit tegenover vissen (Syngenta,2016). Tegenwoordig is het product
enkel toegelaten in bepaalde staten van de V.S. Het toedienen van deze stoffen zou een
negatieve impact hebben op de plantengroei en opbrengst (Romero et al., 2001).
Figuur 8: De structuur van chitosan, waarvan de aminogroepen meestal niet geacetyleerd zijn (Xing et al., 2015)
Chitosan is een niet toxisch product dat steeds meer interesse wekt bij het bestrijden en
voorkomen van bacterieziekten. Het product bestaat uit een biodegradeerbaar polymeer dat
zowel een werking heeft tegen schimmels, virussen als bacteriën. Bij elk van deze
organismen gaat het molecule op een verschillende manier de structuren inhiberen. Bij
gramnegatieve bacteriën reageert de kationische molecule met de negatief geladen
lipopolysachariden van de buitenste celmembraan. Hoe negatiever de lading van de
membraan, hoe sterker de reactie. Chitosan interageert ook met de gevormde biofilm van
22
verscheidene bacteriële pathogenen. Door elektrostatische interacties met P.syringae treden
er morfologische afwijkingen op en wordt de bioflim gedegradeerd. Bij P.fluorescens soorten
wordt een verlaagde membraan-permeabiliteit gecreëerd door de interactie van het polymeer
met de membraan. Tevens heeft chitine de capaciteit om plantimmuniteit te versterken door
het induceren van het SAR systeem bij planten (Xing et al.,2015).
Een alternatief voor chemische bestrijding is de biologische controle. Bij de biologische
strategie worden niet-pathogene stammen aangewend, saprofyte bacteriën of
rhizobiumbacteriën die de plantengroei bevorderen (Ji et al., 2006). Deze organismen
kunnen pathogene populaties onderdrukken, induceren systemische resistentie of activeren
een bepaald proces in de plant waardoor kolonisatie van de pathogeen sterk bemoeilijkt
wordt.
Een tweede alternatief voor biologische controle is de toepassing van bacteriofaagtherapie.
Bacteriofagen, kortweg fagen genoemd, zijn kleine virussen die specifieke bacteriecellen
infecteren. Ze bestaan net als gewone virussen uit een buitenste eiwitmantel, met daarin het
DNA. De replicatie van fagen resulteert in een lysis van de gastheerbacterie en het vrijkomen
van nieuw gevormde viruspartikels. In de landbouw wordt heel wat onderzoek verricht naar
faagtherapie om bacteriële pathogenen te onderdrukken in verschillende gewassen. Enkele
voorbeelden zijn bacteriofagen tegen Dickeya solani die zachtrot in aardappel veroorzaakt,
en fagen tegen Erwinia amylovora die voorkomt bij appel en peer. Enkel in de tomaten- en
aardappelteelt zijn commerciële producten beschikbaar gebaseerd op faagtherapie tegen de
pathogenen Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, P.syringae pv. tomato (AgriPhage) en
Dickeya solani (Biolyse, APS Biocontrol Ltd.) (Rombouts et al., 2016).
Figuur 9: Algemene structuur en een elektromicroscopische opname van een bacteriofaag
(Tack A., 2013; Rombouts et al., 2016)
Doordat bacteriofagen gastheerspecifiek zijn, infecteren ze enkel één specifieke
bacteriespecies. Deze gastheerspecificiteit is te wijten aan de staart-geassocieerde
proteïnen van de fagen die in staat zijn om specifieke oppervlaktemoleculen van de
gevoelige bacterie te herkennen. Fagen hebben de potentie om door de beschermlaag van
23
infecterende bacteriën te dringen. Een van de belangrijkste overlevingsstrategieën bij
bacteriën is de vorming van een beschermlaag of zogenoemde biofilm. Bij meer dan 60 %
van bacteriële infecties wordt een biofilm aangemaakt. De biofilm zorgt ervoor dat bacteriën
minder gevoelig zijn voor antimicrobiële stoffen en organismen zoals virussen en natuurlijke
vijanden. Bacteriofagen hebben de potentie om de biofilm van bacteriën enzymatisch
afbreken door de aanwezigheid van EPS-depolymerasen in de virusgeassocieerde
staartpieken of vezels van de fagen. De infectie en het doden van de bacteriële gastheer
gebeurt heel efficiënt. Per infectiecyclus komen afhankelijk van de soort tientallen nieuwe
faagpartikels vrij (Cornelissen et al., 2012). De infectiecyclus bestaat uit een zoekstadium, de
aanhechting aan de bacterie, de injectie van het DNA, de DNA expressie, de DNA
verpakking en het uiteindelijk vrijkomen van het virion. De replicatie en het vrijkomen van de
nakomelingen van de fagen worden beïnvloed door de metabole status van de bacteriën en
hun aantal. De aanwezigheid van vloeistof is ook belangrijk voor de fagen omdat dit hun
beweeglijkheid bevordert. Wanneer de fagen hun gastheercellen lyseren, ondergaan deze
een selectiedruk om mutanten te produceren die resistent worden aan de fagen. Door de
vele replicaties bij de fagen is de kans groot op fouten waardoor de populatie van de fagen
eerder heterogeen is. Deze heterogeniteit bij de fagen leidt er toe dat fagen zich kunnen
aanpassen bijvoorbeeld aan kleine veranderingen van de receptor van hun gastheer.
Resistentieontwikkeling van de bacterie tegen de fagen is praktisch onmogelijk, wat een heel
groot voordeel is van faagtherapie (Lantin, 2009). Rombouts et al. (2016) concludeerde dat
positieve resultaten van faagtherapie tegen Pspo werden bekomen onder laboratoriumomstandigheden waarbij mengsels van fagen nagenoeg alle bacteriën konden afdoden. De
gebruikte fagen waren behoorlijk stabiel, overleefden bij pH-waarden van 4 tot 12 en
temperaturen van 4°C tot 37°C. Een nadeel van de aangewende fagen is dat ze enkel
bacteriën kunnen lyseren die groeien bij temperaturen van 28°C of minder. Bij hogere
temperaturen zijn de fagen niet meer in staat om de bacterie te doden. Een mogelijke
verklaring is dat de bacteriële receptor, die nodig is voor faaginfectie, niet meer tot expressie
komt bij hogere temperaturen. Verder werd ook onderzocht of deze fagencocktail bestaande
uit zes fagen de Pspo stammen aanwezig op prei kon afdoden onder veldomstandigheden.
Hier waren de resultaten echter niet eenduidig. Het onderzoek op faagtherapie staat nog
voor heel wat uitdagingen aangezien de fyllosfeer een hard milieu vormt voor bacteriofagen.
Enkele moeilijkheden bij faagtherapie zijn uv-licht gevoeligheid, kans op verdroging,
toedieningsmethode en de behoefte aan grote dichtheden van fagen bij de toediening.
24
2.3.4 Overzichtstabel P.syringae pv. porri versus P.fluorescens
P.fluorescens
P. syringae pv. porri (Pspo)
Complex en grote onduidelijkheid i.v.m. indeling
Homogene groep bestaande uit diverse
pathovars
Oxidase positief
Oxidase negatief
Niet via zaad overdraagbaar
Zaadoverdraagbaar
Veroorzaakt rotting
Veroorzaakt bacteriebrand
Indringing in plantenweefsel via stomata of
wondjes, maar ook door celwandafbraak met
pectinolytische enzymen
Indringing in plantenweefsel via natuurlijke
openingen en wondjes
Meerdere gastheerplanten
Enkel pathogeen bij Allium soorten zoals prei,
ui en sjalot
Sommige INA bacteriën, sommige geen INA
Altijd INA activiteit
Meer aanwezig bij koele temperaturen
(nov-feb)
Meer aanwezig bij warme tot matige
temperaturen (jun-sep)
Meer infectieus op rijpe en afgezwakte prei
Meer infectieus op jonge prei
25
3
Materiaal en Methoden
3.1 Rassenproef vroege herfstprei
Bij de rassenproef van de herfstprei werden zes waarnemingen uitgevoerd op verschillende
tijdstippen. Zo kan de evolutie van de ziekte over het groeiseizoen worden geschetst door de
observaties die werden verricht op: 17 september (W1), 28 september (W2), 12 oktober
(W3), 26 oktober (W4), 13 november (W5) en 20 december (W6) in 2015. Het percentage
aantasting per plot voor iedere waarneming en de bijhorende ziekte-index is weergegeven in
bijlage 3.
3.1.1 Proefplan
Het proefplan werd opgesteld door het proefcentrum Inagro. Het proefveld werd aangelegd
nabij het proefcentrum, in de gemeente Beitem (coördinaten: 50,90° NB, 3,12° OL). Voor de
opstart van de proef was er braakligging van desbetreffend perceel. Het teeltsysteem dat
werd gehanteerd is ruggenteelt wat het meest wordt toegepast voor de productie van prei
voor de versmarkt.
De proef werd opgezet als een gerandomiseerde blokkenproef met drie herhalingen waarin
15 rassen opgenomen werden. Per plot werden 30 planten geplant waarna twee plantgaten
leeg werden gelaten. Afhankelijk van het aantal beschikbare planten werden hiervan ofwel
tien ofwel 20 planten bemonsterd. De tussenrijafstand is 65 cm en de afstand tussen de
planten in de rij is 10 cm. Tussen de bemonsterde rijen staat een rij Krypton. Deze tussenrij
zorgt voor een homogene ziektedruk over het perceel en vermijdt randeffecten. Het is van
belang dat het ras van de tussenrij overal hetzelfde is, welk ras het precies is, maakt niet uit.
Een schematisch overzicht van het proefplan is weergegeven in Figuur 10.
3.09
3.04
3.14
2.08
2.13
2.03
1.11
1.06
1.01
3.12
3.02
3.05
2.10
2.15
2.05
1.12
1.07
1.02
3.07
3.15
3.10
2.06
2.11
2.01
1.13
1.08
1.03
3.13
3.08
3.01
2.12
2.02
2.07
1.14
1.09
1.04
3.11
3.03
3.06
2.14
2.04
2.09
1.15
1.10
1.05
Figuur 10: Proefplan rassenproef vroege herfstprei
26
Tabel 5: Vroege herfstrassen (15) opgenomen in de proef
Objectnr. Ras
Zaadhuis
01
Krypton
Nunhems
02
Megaton
Nunhems
03
Duraton
Nunhems
04
Belton
Nunhems
05
Pluston
Nunhems
06
Longton
Nunhems
07
SV 3274 ZL
Seminis
08
SV 3192 ZE
Seminis
09
Volta
Seminis
10
Copernicus
Seminis
11
Takrima
Enza
12
Gevaria
Enza
13
Cherokee
Enza
14
Rally
Bejo
15
SG 1101
Syngenta
3.1.2 Teelttechnische maatregelen en klimatologische omstandigheden
Een overzicht van alle teelttechnische maatregelen en de uitgevoerde bemestingen wordt
weergegeven in Tabel 6.
Tabel 6: Algemene werkzaamheden en bemestingen.
Datum
Handeling/meststof
19/03/15
Zaai in plastiek serre
18/05/15
Digestaat (20 ton/ha)
08/06/15
Ploegen
09/06/15
Patentkali 30 % (500 kg/ha)
Ammoniumnitraat 27 % (500 kg/ha)
Plantklaar leggen
10/06/15
Ruggen trekken en ponsen (65 x 10 cm)
12/06/15
Planten
29/07/15
Manueel wieden
De aangewende onkruid-, ziekte- en insectenbestrijding tijdens deze proef wordt
weergegeven in Tabel 7.
27
Tabel 7: Toegepaste gewasbeschermingsmiddelen
Onkruidbestrijding
Ziektebestrijding
Datum
Middel
Dosis
Werkzame stof
09/07/15
14/07/15
12/06/15
18/08/15
25/09/15
Lentagran
Totril
Stomp aqua
Butisan S
Aramo
Topsin M
Tebusip
Tanos
2 kg/ha
0,5 l/ha
1 l/ha
1,5 l/ha
1 l/ha
Aangieten aan voet van de plant
1 l/ha
0,6 kg/ha
23/10/15
Tebusip
Ortiva Top
1 l/ha
1 l/ha
pyridaat
ioxynil
pendimethalin
metazachloor
tepraloxydim
thiofanaat-methyl
tebuconazool
famoxadone
cymoxanil
tebuconazool
27/11/15
17/12/15
Ortiva
Tanos
1 l/ha
0,6 kg/ha
Vertimec
Mesurol
Vertimec
Mesurol
Vertimec
0,5 l/ha
1,5 l/ha
0,5 l/ha
1,5 l/ha
0,5 l/ha
Insectenbestrijding 06/07/15
20/07/15
31/07/15
07/08/15
19/08/15
azoxystrobine
difenoconazool
azoxystrobine
famoxadone
cymoxanil
abamectine
methiocarb
abamectine
methiocarb
abamectine
De zomer van 2015 was iets koeler en droger dan gemiddeld. Een overzicht van de
neerslag, temperatuur en relatieve vochtigheid worden weergegeven in Tabel 8.
Tabel 8: Klimatologische omstandigheden opgemeten in Beitem vergeleken met de gemiddelde waarden
Neerslag Gemiddelde Temperatuur Gemiddelde Relatieve
in 2015 neerslag
per dag in temperatuur vochtigheid
2
2
(mm/m ) (mm/m )
2015 (°C)
per dag(°C) per dag (%)
Juli
49
74
17,9
18,4
73,29
Aug
75
79
18,2
18,0
74,67
Sep
56
69
12,8
14,9
80,28
Okt
25
75
9,5
11,1
86,15
Nov
51
76
9,1
6,8
87,48
28
Neerslag (mm/m²) en temperatuur (°C)
30
neerslag
T
25
20
15
10
5
0
26/05/15
25/06/15
26/07/15
25/08/15
25/09/15
25/10/15
25/11/15
Datum
Figuur 11: Verloop van de temperatuur en neerslag in Beitem.
Figuur 11 geeft het verloop weer van de temperatuur en neerslag op de locatie van de
proefvelden in Beitem. Optimale omstandigheden voor bacteriële infectie zijn temperaturen
rond 20°C in combinatie met een hoge relatieve vochtigheid of lichte regen. Uit Figuur 11
blijkt dat begin augustus en half september de weersomstandigheden ideaal waren voor een
natuurlijke aantasting van Pseudomonas spp.
3.1.3 Infectiemethode
De prei werd eenmaal geïnfecteerd op 3 september 2015 met P. syringae pv. porri stam
CFBP 1687. Op dat moment waren de bladeren van het gewas nog nat, wat ideaal is voor de
instandhouding en vermenigvuldiging van de bacterie. De bacteriestam werd op petrischaal
aangeleverd door het ILVO. Vervolgens werd één entoog opgelost in 1 ml kraantjeswater en
werd deze oplossing aangelengd zodat de suspensie een concentratie van 108 CFU/ml
bedroeg. Daarna werd de suspensie verdund tot 1:100. Deze verdunde suspensie werd
verneveld over de veldjes m.b.v. een proefveldspuit onder lichte druk (1,5 bar) en met een
debiet van 1000 l/ha. Er werd geen uitvloeier gebruikt.
3.1.4 Beoordelingsmethode
De proef werd continu opgevolgd zodat plagen, ziektes of deficiënties opgemerkt werden en
indien nodig behandeld konden worden. De zes beoordelingen werden uitgevoerd op
17/09/15, 28/09/15, 12/10/15, 26/10/15, 13/11/15 en 10/12/15. Zoals eerder vermeld, werden
per veldje standaard 20 planten beoordeeld. Indien er onvoldoende planten waren, dan
werden slechts tien planten beoordeeld. Bij de beoordeling werd gelet op de aanwezigheid
van duidelijke symptomen zoals beschreven in punten 2.3.1.4 en 2.3.2.3. Zowel de
symptomen veroorzaakt door Pspo als de symptomen veroorzaakt door P.fluorescens
werden in rekening gebracht. Als beoordelingsmethode werd het aantal aangetaste planten
zorgvuldig geteld. Per plot werd zo een percentage zieke planten berekend voor iedere
29
waarneming. Om de gegevens statistisch te verwerken werd een ziekte-index voor het
groeiseizoen opgesteld voor iedere plot. Deze ziekte-index is zo opgebouwd dat alle
waarnemingen evenveel doorwegen op het eindresultaat. Om de ziekte-index te berekenen
werden 12 klassen gemaakt met betrekking tot het percentage aantasting van de planten. De
formule voor de ziekte-index is:
Σ (aantal keer dat klasse n voorkomt) ∗ (klassenr − 1)
∗ 100
6 𝑤𝑎𝑎𝑟𝑛𝑒𝑚𝑖𝑛𝑔𝑒𝑛
Tabel 9: De 12 klassen ingedeeld volgens percentage aantasting
klasse 1
klasse 2
klasse 3
klasse 4
klasse 5
klasse 6
Ter
verduidelijking
wordt
(1∗1)+(1∗4)+(2∗8)+(1∗7)+(1∗11)
6
0%
1 - 10 %
11 – 20%
20 – 30 %
31 – 40 %
41 – 50 %
de
klasse 7
klasse 8
klasse 9
klasse 10
klasse 11
klasse 12
ziekte-index
van
51 – 60 %
61 – 70 %
71 – 80 %
81 – 90 %
91 – 99 %
100 %
plotnummer
101
berekend:
∗ 100 = 650
3.2 Rassenonderzoek late herfstprei en winterprei
3.2.1 Proefplan
Voor de beschrijving van het proefplan wordt verwezen naar het proefplan van de
rassenproef herfstprei (Figuur 10) aangezien dit volledig hetzelfde is. Uiteraard zijn de
onderzochte rassen anders. De tussenliggende rijen zijn in deze proef van het ras TZ 01888
(Uniseeds). De rassen die werden opgenomen in deze proef zijn weergegeven in Tabel 10.
30
Tabel 10: Opgenomen rassen in de proef late herfst-winterprei
Objectnr.
Ras
Zaadhuis
1
Aylton
Nunhems
2
Poulton
Nunhems
3
Pluston
Nunhems
4
Vitaton
Nunhems
5
Walton
Nunhems
6
Belton
Nunhems
7
Harston
Nunhems
8
SV 3274 ZL
Seminis
9
Delmas
Syngenta
10
Oberon
Syngenta
11
Curling
Bejo
12
Keeper
Bejo
13
Lucretius
Seminis
14
Lancaster
Uniseeds
15
Nestor
CN Seeds
3.2.2 Teelttechnische maatregelen
De algemene werkzaamheden, de bemesting en de toegepaste gewasbeschermingsmiddelen voor en tijdens deze proef zijn weergegeven in Tabel 11 en Tabel 12.
Tabel 11: Algemene werkzaamheden en toegepaste bemestingen
Datum
Handeling/meststof
09/04/15
Zaai in plastiek serre
14/04/15
Zaai in plastiek serre
18/05/15
Digestaat (20 ton/ha)
08/06/15
Ploegen
09/06/15
Patentkali 30 % (500 kg/ha)
Plantklaar leggen
06/07/15
Ammoniumnitraat 27 % (500 kg/ha)
2e maal plantklaar leggen
09/07/15
10 l/m2 beregend
10/07/15
Ruggen trekken en ponsen (65 x 10 cm)
10/07/15
Planten
31
Tabel 12: Toegepaste gewasbeschermingsmiddelen
Onkruidbestrijding
Ziektebestrijding
Datum
Middel
Dosis
Werkzame stof
29/07/15
Lentagran
1,5 kg/ha
pyridaat
Totril
0,5 l/ha
ioxynil
Stomp aqua
1 l/ha
pendimethalin
Butisan S
1,5 l/ha
metazachloor
10/07/15
Topsin M
Aangieten aan voet van de plant
thiofanaat-methyl
18/08/15
Tebusip
1 l/ha
tebuconazool
25/09/15
Tanos
0,6 kg/ha
famoxadone
cymoxanil
Tebusip
1 l/ha
Ortiva Top
1 l/ha
23/10/15
tebuconazool
azoxystrobine
difenoconazool
27/11/15
Ortiva Top
1 l/ha
azoxystrobine
17/12/15
Tanos
0,6 kg/ha
famoxadone
cymoxanil
Mesurol
1,5 l/ha
methiocarb
31/07/15
Vertimec
0,5 l/ha
abamectine
07/08/15
Mesurol
1,5 l/ha
methiocarb
19/08/15
Vertimec
0,5 l/ha
abamectine
Insectenbestrijding 20/07/15
Voor de klimatologische omstandigheden, de infectiemethode en de beoordelingsmethodiek
wordt verwezen naar punt 3.1.2 , 3.1.3 en 3.1.4.
32
3.3 Efficiëntie van faagtherapie onder veldomstandigheden
De interesse in bacteriofagen die potentieel bacterieontwikkeling en -groei kunnen reduceren
wordt alsmaar groter. Er is al heel wat onderzoek uitgevoerd in laboratoria, waar het
toedienen van bacteriofagen een duidelijk effect heeft op de onderdrukking van bacteriële
aantasting. In veldomstandigheden blijkt dit iets moeilijker omdat bacteriofagen niet zo
stabiel zijn in de fyllosfeer (zie punt 2.3.3).
In dit onderzoek naar het gebruik van bacteriofagen om bacterieziekten te voorkomen of te
bestrijden in de praktijk, werd een onderscheid gemaakt in preventieve en curatieve
bestrijding. De preventieve maatregel is gebaseerd op een dompelbehandeling met een
mengsel van bacteriofagen net voor het uitplanten van de prei. Na het uitplanten van de
preiplanten op het besmette perceel, werd deze opgevolgd om na te gaan of deze minder
was aangetast dan de controlebehandeling. De curatieve methode berust op regelmatige
bespuitingen met bacteriofagen na het uitplanten op een besmet perceel.
3.3.1 Proefplan
De proef die werd opgezet is op dezelfde locatie gelegen als voorgaande rassenproeven. Op
dit perceel was de voorteelt spinazie, gevolgd door raaigras. De proef omvat zes
verschillende objecten die in vier herhalingen werden uitgevoerd. Het ras dat werd
aangewend in deze fagenproef is Harston (Nunhems). Het proefveld bevat 16 rijen die elk 30
m lang zijn. Er werden slechts vier rijen bemonsterd, de tussenrijen dienden als bufferstrook.
Ieder object bevat 25 planten. Figuur 12 en Tabel 13 geven het proefplan en het overzicht
van de objecten weer.
106
105
104
103
205
203
206
204
304
306
303
305
403
404
405
406
302
301
401
402
0,50 m
102
101
201
202
Figuur 12: Proefplan fagenproef
Tabel 13: Overzicht van de objecten opgenomen in de bacteriofagenproef
1
Dompelbehandeling met fagen
2
Dompelbehandeling met water zonder aanwezigheid van fagen (negatieve controle)
3
Bespuiting met fagen
4
Inoculatie met Pspo CFBP 1687 door verneveling
5
Inoculatie met Pspo CFBP 1687 door verneveling, gevolgd met faagbespuiting
6
Bespuiting met water (negatieve controle)
33
3.3.2 Teelttechnische maatregelen
Het uitzaaien van de prei in de plastiek serre werd uitgevoerd op 09/04/15 en 14/04/15. Het
ploegen, bemesten, plantklaar leggen en ponsen (65 x 10 cm) werd allemaal dezelfde dag
uitgevoerd nl. op 22/07/15. Als bemesting werd 500 kg/ha patentkali en 500 kg/ha
ammonium-nitraat aangebracht. Op 23/07/15 werd de prei uitgeplant. Voor de toegepaste
gewasbeschermingsmiddelen wordt verwezen naar Tabel 14.
Tabel 14: Toegepaste gewasbeschermingsmiddelen bij de fagenproef
Onkruidbestrijding
Datum
Middel
Dosis/ha
Werkzame stof
17/08/15
Butisan S 500
1,5 l
Stomp aqua
1l
metazachloor
pendimethalin
Totril
0,5 l
ioxynil
Lentagran
1 kg
pyridaat
Frontier elite
0,7 l
dimethenamide-P
Stomp Aqua
1l
pendimethalin
Totril
0,5 l
ioxynil
Lentagran
1,5 kg
pyridaat
Fantic M
2,5 kg
mancozeb
21/08/15
Ziektebestrijding
25/09/15
benalaxyl-M
23/10/15
Tebusip
1l
tebuconazool
Ortiva Top
1l
azoxystrobine
difenoconazool
27/11
Ortiva
1l
azoxystrobine
17/12/15
Tanos
0,6 kg
famoxadone
cymoxanil
Mesurol
1,5 l
methiocarb
19/08/15
Vertimec
0,5 l
abamectine
03/09/15
Tracer
0,2 l
spinosad
Insectenbestrijding 07/08/15
3.3.3 Proefhandelingen
De infectie en de beoordeling werden op dezelfde manier als voorgaande proeven
uitgevoerd. Er werden zes waarnemingen uitgevoerd gedurende het groeiseizoen. Voor de
dompelbehandeling werd de eerste observatie uitgevoerd zeven weken na het planten. De
daaropvolgende observaties waren telkens met een interval van twee weken. In Tabel 15
wordt gedetailleerd weergegeven welke handelingen op welk moment werden uitgevoerd.
Aangezien deze proef ook in Beitem plaatsvond, gelden dezelfde klimatologische
omstandigheden als voorgaande rassenproeven.
34
Tabel 15: Datum van infectie, behandeling en bemonstering.
Datum
Handeling
23/07/15
Object 1 en 2: bodem besmetten met Pspo stam CFBP 1687
Object 1 : planten volledig onderdompelen met fagenoplossing (15 minuten)
Object 2: planten volledig onderdompelen met water (controle)
03/09/15
Object 4 en 5 : prei infecteren met Pspo stam CFBP 1687 (bij vochtig weer)
27/08/15
Faagbehandeling van object 3 en 5 (object 6 : controlebehandeling met water)
03/09/15
Faagbehandeling van object 3 en 5 (object 6 : controlebehandeling met water)
10/09/15
Faagbehandeling van object 3 en 5 (object 6 : controlebehandeling met water)
17/09/15
Beoordeling (1)
Faagbehandeling van object 3 en 5 (object 6 : controlebehandeling met water)
24/09/15
Faagbehandeling van object 3 en 5 (object 6 : controlebehandeling met water)
28/09/15
Beoordeling (2)
12/10/15
Beoordeling (3)
26/10/15
Beoordeling (4)
13/11/15
Beoordeling (5)
10/12/15
Beoordeling (6)
Voor het toedienen van de fagen werd het protocol gevolgd van Inagro (zie bijlage 1 en 2).
Object 1 werd voor het uitplanten 15 minuten gedompeld in een faagoplossing met een
concentratie van 107 CFU (Rombouts et al., 2016). Bij het dompelen met de faagoplossing
werd met een volume gewerkt van 5 l per 3750 planten wat overeen komt met de gangbare
toepassingen van 200 l/150 000 planten. Om een concentratie te bekomen van 107
PFU/plant werd 37,50 ml van de oplossing (109 PFU/ml) opgelost in 5L water (zie bijlage 1).
Bij object 3 en 5 werd de prei ook behandeld met fagen, maar dan na het uitplanten, op het
veld d.m.v. vijf bespuitingen met een intervalperiode van een week. Doordat fagen gevoelig
zijn voor uv-licht en ze door deze straling worden afgebroken, werd de behandeling
uitgevoerd wanneer er geen zon was. Het uitgangsmateriaal voor de twee objecten (object 3
en 5) in vier herhalingen bedraagt 218,2 ml van de stockoplossing (109 PFU/ml) zodat kan
worden verneveld met een concentratie van 108 PFU/plant (zie bijlage 2).
35
3.4 Infectieproeven: infectie van preiplanten via verwonding en
verneveling
Het is nog niet duidelijk welke bacteriestammen precies de meest infectieuze zijn. Omdat bij
de vaststelling van een zieke plant meestal meerdere stammen aanwezig zijn, is niet precies
geweten dewelke het meest voorkomt en dewelke het meeste problemen veroorzaakt. In
samenwerking met het ILVO werden zeven verschillende stammen onderzocht. Hierbij zijn er
vier stammen afkomstig uit het P.fluorescens complex en drie stammen van P. syringae pv.
porri.
3.4.1 Opkweek preiplanten
De infectieproeven werden uitgevoerd op jonge preiplanten. De aangewende preiplanten
werden los aangekocht bij plantenkweker Depraeter en zijn van het ras Krypton (Nunhems).
Daarna werden de planten direct in potten verplant die gevuld werden met potgrond. Er
werden twee planten per pot geplant en daarna werd alles in de serre geplaatst. Een week
voor infectie werden de planten verplaatst naar de fytotron op 18°C om zich wat te herstellen
van de relatief koudere temperaturen in de serre. Bij infectie hadden de preiplanten twee tot
drie echte blaadjes bij de knipmethode en vier tot vijf blaadjes bij de infectie via verneveling.
3.4.2 Infectietechniek via verwonding
Deze proef omvat verscheidene infectieproeven met zeven bacteriestammen die bij
bepaalde temperaturen (-2°C, 8°C, 18°C en 28°C) werden geïncubeerd. Om te kunnen
beoordelen wat de optimale bladnatperiode is voor infectie, werden de planten na infectie
afgedekt met plastiek gedurende een periode van 0, 24 en 48 uur. Ieder object bestond uit
vier potten met elk twee planten. Verwonding werd nagebootst door in de bladtop een knipje
te maken in de lengterichting van het blad. Indien planten of volledige blaadjes afstierven
door infectie of uitdroging, konden niet alle infectielaesies gemeten worden.
De aangewende bacteriestammen afkomstig van het ILVO zijn Pspo GBBC 1422, Pspo
GFBP 1908, Pspo LFBP 1687, P. marginalis GBBC 1475, P.fluorescens GBBC 1198,
P.fluorescens GBBC 1171 (isolaat uit kolen), P.salmoni GBBC 1937 (isolaat uit
plantenkwekerijen). De stammen werden aangebracht in een falconbuisje samen met 10 mM
fosfaatbuffer waarbij de concentratie 108 CFU bedroeg. Bij het uitvoeren van de eigenlijke
infectie werd een schaar in deze suspensie (108 CFU) gebracht en hiermee geknipt in het
blad van de preiplant.
Infectie met P.fluorescens stammen bij vorsttemperaturen
De preiplantjes werden twee dagen voor de infectie in een klimaatkast gebracht waar de
temperatuur -2°C bedroeg. Door deze vorsttemperaturen kunnen in de blaadjes van de prei
barsten ontstaan in de cellen. Dit maakt de kans op infectie door de bacteriën ook groter. Na
het infecteren werden deze planten nog drie dagen op deze negatieve temperatuur
gehouden. Daarna werden ze op een temperatuur gebracht van 8°C zodat de infectie sneller
zou doorgaan.
36
Incubatie bij 8°C en 18°C
Om te zien bij welke temperaturen de bacteriestammen nu het best infecteren en of er
verschillen zijn tussen de stammen onderling, werden de geïnfecteerde preiplantjes in een
klimaatkast van 8°C en 18°C geplaatst gedurende respectievelijk drie en twee weken.
Incubatie van Pspo stammen bij 28°C
Bij de infectie op 28°C werden enkel de Pspo stammen in rekening gebracht omdat bij
warme temperaturen vooral bacterieziekte wordt veroorzaakt door stammen van Pspo (Van
Vaerenbergh, 2016).
3.4.3 Infectietechniek via verneveling
Bij de infectie d.m.v. verneveling werden alle zeven stammen aangewend en deze werden
op dezelfde manier opgekweekt zoals voorgaande proeven. De suspensies bij verneveling
dienden 100 maal meer geconcentreerd te zijn dan deze gebruikt bij de verwonding. Deze
suspensie (1010 CFU/ml) werd opgelost in een halve liter gewoon kraantjeswater samen met
100 µl Tween 80. Deze uitvloeier zorgt voor een gelijkmatigere verspreiding op het blad.
Vervolgens werd deze oplossing verneveld met heel fijne druppeltjes over 12 preiplanten (12
x 4 à 5 blaadjes = 48 à 60 blaadjes). De planten werden direct na infectie afgedekt met
plastiek gedurende 24 u en in een klimaatkast geplaatst van 25°C.
3.4.4 Beoordelingsmethode
Bij de infectie met de knipmethode werden twee en drie weken na het infecteren geteld
hoeveel knipjes er symptomen vertoonden van bacteriële infectie. Indien er symptomen
zichtbaar waren, werd de lengte van de laesie gemeten.
Het scoren van de symptomen werd bij de vernevelingsproef ook tweemaal uitgevoerd, maar
slechts één en twee weken na infectie. Bij de beoordeling van de infectie werd terug de
lengte van de laesie gemeten en er werd rekening gehouden met het feit of deze laesie al
dan niet chlorotisch of necrotisch was.
Figuur 13: Duidelijk chlorotische laesie met aan de top van het blad
lichte necrose twee weken na verneveling met Pspo GBBC 1422
37
3.5 Statistische analyse van de metingen
Bij de statistische verwerking van de resultaten werd gebruik gemaakt van het programma
SPSS. Indien de data normaal verdeeld waren, werd op basis van een ANOVA variantie
analyse conclusies genomen op het 5%-significantieniveau. Wanneer echter de data geen
normale verdeling volgden (infectieproeven), werden niet parametrische testen (Kolmogorov
Smirnov en Mann-Whitney U) gebruikt. De tabellen met de statistische analyse van de data
zijn terug te vinden in bijlage.
38
4
Resultaten
4.1 Rassenproef vroege herfstprei
4.1.1 Proefopzet
Aantasting van planten door Pspo en P. fluorescens is moeilijk te bestrijden. Preventieve
ingrepen zijn daarom fundamenteel om het probleem te voorkomen, eerder dan het te
bestrijden. Dergelijke maatregelen worden in de literatuurstudie uitgebreid aangekaart. Eén
van deze maatregelen is het telen van rassen die toleranter zijn voor ziekten en plagen.
Deze rassenproeven onderzoeken de gevoeligheid voor bacterieziekte veroorzaakt door
Pspo of P. fluorescens. Zowel voor de herfstprei als voor de winterprei werden telkens 15
rassen opgenomen in de proef.
4.1.2 Resultaten
In onderstaande boxplot zijn Rally, Pluston en Belton de rassen met gemiddeld genomen
een lagere ziekte-index dan de andere geteste rassen. Copernic, Krypton en SG 1101 lijken
een hogere ziekte-index te hebben. Om te zien of deze rassen significant verschillen, werd
een two way Anova uitgevoerd. Uit deze statistische verwerking blijkt dat Rally een
significant lagere ziekte-index heeft dan het ras SG 1101. De verschillen tussen alle andere
rassen zijn niet significant. De output van de Tukey test is terug te vinden in bijlage 5.
Figuur 14: Boxplot van de ziekte-index per ras (p-waarde van groep a en b is respectievelijk 0,104 en 0,070)
39
4.2 Rassenproef winterprei
4.2.1 Proefopzet
Deze proef volgt dezelfde strategie als voorgaande proef. Opnieuw werd een ziekte-index
opgesteld op dezelfde wijze als voorgaande proef.
4.2.2 Resultaten
De aangetaste planten per plot uitgedrukt in procent, samen met de berekende ziekte-index
zijn terug te vinden in bijlage 5. Een two way Anova werd uitgevoerd om na te gaan of er
geen blokeffect aanwezig is. De hypothese dat de factor herhaling geen verschillen geeft,
werd ook bevestigd in deze analyse. De rassen kunnen worden onderverdeeld in drie
significantiegroepen met bijhorende p-waarden van 0,073(a), 0,072(b) en 0,122(c). De output
van de tukey test is weergegeven in bijlage 6.
Figuur 15: Boxplot van ziekte-index van elk ras met bijhorende significantiegroep
De ziekte-index van Curling is significant lager dan deze van Harston, SV3274 ZL en Nestor.
Dit wil zeggen dat Curling minder gevoelig is aan bacterieziekte dan de drie laatst genoemde
rassen. Curling heeft de laagste ziekte-index met een waarde van 306, maar deze verschilt
niet significant met de andere rassen. Nestor (528) scoort significant minder goed dan
Curling, Keeper, Delmas en Pluston. Met alle overige rassen is er geen significant verschil.
40
Uit deze proef blijkt dat de winterrassen die gemiddeld genomen minder gevoelig zijn aan
bacteriële infectie Curling, Keeper, Delmas en Pluston zijn. Nestor is eerder een gevoelig
ras.
4.3 Bacteriofagentoepassing onder veldomstandigheden
4.3.1 Proefopzet en resultaten
De dataset van de gegevens worden weergegeven in bijlage 7. Tabel 16 geeft de
gemiddelde waarde weer van de aantasting per object voor iedere waarneming en de
bijhorende ziekte-index. De ziekte-index werd op dezelfde methode berekend als in
voorgaande proeven. In deze proef werd een behandeling met bacteriofagen uitgevoerd op
twee verschillende methoden. Er werd een dompelingbehandeling uitgevoerd (object 1 en 2)
en daarnaast werd ook een vernevelingsbehandeling uitgevoerd (object 3-6). Deze twee
behandelingen kunnen afzonderlijk worden beoordeeld.
Tabel 16: Percentage aantasting van de planten en bijhorende ziekte-index per object
Object
W1
W2 W3 W4 W5 W6 Ziekte-index
Object 1 Dompelbehandeling met fagen
Object 2 Dompelbehandeling met water
(controle)
Object 3 Faagbehandeling door bespuiting
Object 4 Inoculatie met bacterie
(negatieve controle)
Object 5 Inoculatie met bacterie en
faagbehandeling door bespuiting
Object 6 Controle
0
3
2
4
24
21
51
71
46
40
44
35
312
329
0
0
7
6
21
23
76
68
46
46
51
56
371
371
1
8
23
73
54
47
375
0
6
22
77
51
52
379
Uit de resultaten voor de ziekte-index is een tendens zichtbaar waarbij planten die
ondergedompeld werden (object 1 en 2) minder aantasting vertonen. Echter deze
behandeling is niet significant verschillend van de andere behandelingen.
In Figuur 16 werd de dompelbehandeling vergeleken met de controledompeling met water.
De lijnen vallen ongeveer samen met elkaar. Enkel bij de vierde waarneming (drie maanden
na behandeling) is een significant verschil (p<0,05) waarbij de behandeling een
aantastingsgraad van 51 % weergeeft tegenover de controle 71 %. Later op het seizoen is er
een sterkere daling bij de onbehandelde planten dan bij deze die een faagbehandeling
kregen. Deze tendens leidt tot een iets hogere aantasting bij de behandelde planten.
41
80
70
Percentage aantasting
60
50
40
Dompelbehandeling met
fagen
Controlebehandeling
30
20
10
0
Figuur 16: Percentage aantasting per beoordeling van dompelbehandeling met fagen en controle
4.3.2 Bespreking resultaten
Bij de ziekte-index van alle objecten is er een trend dat de dompelbehandeling minder
ziekteverschijnselen vertoont dan de behandelingen via verneveling. Ook de controlebehandeling bij het dompelen vertoont een lagere ziekte-index. Bij de laatste waarnemingen
is deze trend veel minder uitgesproken, waardoor het verschil van aantasting vooral in het
begin aantoonbaar was. Een mogelijke verklaring is dat de gedompelde planten een
optimalere groeistart hebben gehad bij het verplanten van de prei, zodat ze in het begin
minder gevoeliger waren. Een mogelijke bijkomende verklaring is dat in het begin van het
groeiseizoen de toegediende bacteriofagen de relatief lage druk van Pspo stammen onder
controle had terwijl bij toenemende druk in het seizoen de efficiëntie van de bacteriofagen
vermindert.
De vier behandelingen die uitgevoerd werden met een vernevelaar tonen bijna geen
verschillende waarden voor de ziekte-index. De controles, waarbij geen fagen werden
toegepast, vertonen niet meer ziektesymptomen. Bij de objecten waar een extra inoculatie
met bacteriën werd aangebracht (object 4), is ook geen hogere aantasting dan waar dit niet
werd aangebracht (object 6). Dit kan een aanwijzing zijn dat er een hoge graad van
natuurlijke druk van Pspo aanwezig is op het veld, wat niet uitgesloten is door de ideale
weersomstandigheden begin augustus en half september (zie punt 3.1.2). Op basis van dit
gegeven, is de kans reëel dat er andere stammen dan Pspo CFBP 1687 op het veld
aanwezig waren, waardoor het toegediende fagenprofiel niet werkte. Het feit dat de
vernevelingsbehandelingen niet veel effect vertonen, kan ook te wijten zijn aan een niet
opgaande competitie met de bacteriën, waarbij de bacteriën in te hoge concentratie
aanwezig waren in vergelijking met het toegediende aantal fagen.
42
4.4 Infectieproeven: infectie van preiplanten via verwonding
4.4.1 Proefopzet
Uit de literatuur blijkt dat de infectie door Pspo en P.fluorescens meestal via wondjes
plaatsvindt (Lamichhane et al., 2015). Welke parameters het belangrijkst zijn, dient nog
verder onderzocht te worden. Bij deze infectieproeven werden de parameters temperatuur
en relatieve vochtigheid (bladnatperiode) vergeleken. De ingezette bacteriesuspensies
hadden allemaal dezelfde concentratie (108 CFU/ml). Deze concentratie zou voldoende
moeten zijn als de infectie via wondjes gebeurd (Van Vaerenbergh, 2016). De onderzochte
incubatietemperaturen zijn -2°C, 8°C, 18°C en 28°C. Om het verschil in relatieve vochtigheid
te testen, werden de planten afgedekt met plastiek. Door de combinatie van een laagje water
in de bak te doen waar de potten in staan en het afdekken van de planten wordt een hoge
relatieve vochtigheid gecreëerd omdat het water niet kan verdwijnen uit het milieu. Bij de
eerste test werden er drie verschillende afdekperiodes gebruikt nl. 0, 24 en 48 u afdekking
direct na het infecteren. Later werden slechts twee afdekperiodes gebruikt (24 en 48 u). Als
hypothese wordt gesteld dat de infectie meer uitgesprokener zal zijn bij de planten die het
langst werden afgedekt.
Twee en drie weken na infectie werden alle plantjes gecontroleerd op de aanwezigheid van
symptomen veroorzaakt door de onderzochte bacteriestammen die via een knipje in het blad
van de plant werden binnengebracht. Bij het beëindigen van de proef na twee of drie weken
(afhankelijk van de incubatietemperatuur) werd het aantal plantjes geteld die de symptomen
vertonen. Indien er een duidelijke laesie aanwezig was, werd deze gemeten.
4.4.2 Resultaten
Incubatie van P.fluorescens bij -2°C
Uit de literatuur blijkt dat het aandeel P.fluorescens soorten hoger is dan de Pspo stammen
op zieke prei tijdens de winter. Of dit te maken heeft met de andere infectiewijze
(pectinolytische enzymen versus T3SS) is nog niet geweten. Het is tevens niet uitgesloten
dat bepaalde stammen uit het P.fluorescens complex een meer uitgesprokener INA activiteit
bezit. Of kunnen sommige P.fluorescens stammen gewoon sneller groeien bij temperaturen
onder het vriespunt vergeleken met Pspo stammen?
Bij deze infectieproef werden enkel de stammen van het P.fluorescens complex aangewend.
Figuur 17 geeft het aantal knipjes (in %) weer die een duidelijke infectie vertonen drie weken
na infectie. Enkel het verschil dat P.salmoni GBBC 1937 meer aantasting veroorzaakt dan
P.fluorescens GBBC 1198 (p=0,016) was statistisch aantoonbaar, verder waren er geen
significante verschillen.
43
Percentage aangetaste knipjes
35
30
25
20
24 u afgedekt
15
48 u afgedekt
10
5
0
Pm1475
Pf1198
Pf1171
Ps1937
controle
Bacteriestam
Figuur 17: Percentage aangetaste knipjes veroorzaakt door de verschillende stammen van het P.fluorescens
complex bij -2°C (Pm1475 staat voor P.marginalis GBBC 1475, Pf1198 staat voor P.fluorescens GBBC 1198,
Pf1171 staat voor P.fluorescens GBBC 1171 en Ps1937 staat voor P.salmoni GBBC 1937)
Het percentage aangetaste knipjes schommelt tussen 0 en 33 % over alle stammen heen.
Gemiddeld genomen worden door P.salmoni GBBC 1937 (33 % en 15 % bij respectievelijk
24 u en 48 u afdekking) meer aantastingen veroorzaakt. P.fluorescens GBBC 1198 vertoont
daarentegen een lager aandeel geïnfecteerde knipjes (7 % bij 24 u afdekking en 0 % bij 48
u afdekking). De controle die enkel met de bufferoplossing werd behandeld, vertoont een
aantal laesies (16 % en 9 %) die verklaart kunnen worden als rechtstreeks gevolg door de
verwonding. Er zijn geen significante verschillen tussen de 24 u afgedekte planten en de 48
u afgedekte planten.
Incubatie bij 8°C
Na drie weken werd geteld hoeveel knipjes er symptomen vertonen per object. Deze
tellingen zijn weergegeven in Figuur 18. P.fluorescens GBBC 1198 vertoont hier merkelijk
meer geïnfecteerde knipjes (43 %) dan alle andere bij 24 u afdekking. Daarna volgt Pspo
GBBC 1422 met een percentage aangetaste knipjes van 21 % voor beide afdekkingen. Als
er wordt rekening gehouden met de lengtes van de laesies, dan geeft dit dezelfde resultaten
weer. De laesielengtes veroorzaakt door P.fluorescens GBBC 1198 en Pspo GBBC 1422 zijn
significant verschillend van de controle. Verder is de laesielengte van P.fluorescens GBBC
1198 ook significant groter dan deze van P.salmoni GBBC 1937. De overige stammen
vertonen geen significante verschillen. Het aantal uren afdekking veroorzaakt eveneens
geen significante verschillen, er is ook geen trend te zien dat 48 u afdekking aanleiding geeft
tot hogere infecties.
44
45
Percentage aangetaste knipjes
40
35
30
25
20
24 u afgedekt
15
48 u afgedekt
10
5
0
Bacteriestam
Figuur 18: Aantal aangetaste knipjes (in %) van iedere stam na 24 u en 48 u afdekking drie weken na infectie bij
8°C
Incubatie bij 18°C
De infectieproef bij een incubatietemperatuur van 18°C werd in twee delen uitgevoerd. De
infectie met de P.fluorescens stammen werd uitgevoerd met drie verschillende afdekperiodes
(0 u, 24 u en 48 u) en de Pspo stammen werden slechts met twee verschillende periodes
afgedekt (24 u en 48 u).
60
Aantal aangetaste kinpjes (in %)
50
40
30
0 u afgedekt
20
24 u afgedekt
10
48 u afgedekt
0
Pspo1687
Pspo1908
Pspo1422
Ps1937
Pf1171
Pf1198
Pm1475
Controle
Bacteriestam
Figuur 19: Aantal knipjes die infectie vertonen (in %), twee weken na de infectie met 0, 24 en 48 uren afdekking
onder plastiek
45
Volgens Figuur 19 zouden de twee stammen van P.fluorescens (GBBC 1171 en GBBC
1198) en Pspo GBBC 1422 de meest infectieuze zijn. De boxplot in Figuur 20 bevestigt deze
stelling. Met uitzondering van de controle is op de grafiek geen duidelijk verband te zien
zoals gesteld in de hypothese dat afdekking zou leiden tot hogere infectie. In de helft van de
gevallen geeft de afdekking van 24 u de duidelijkste infecties weer.
Figuur 20: Boxplot van de laesielengte veroorzaakt door de bacteriestammen bij 18°C twee weken na infectie
Als alle afdekkingen in rekening worden gebracht, is de laesielengte van de controle
significant lager dan deze van Pspo GBBC 1422 (p=0,0015), P.fluorescens GBBC 1198
(p=0,006), P.fluorescens GBBC 1171 (p=0,0065) en Pspo LFBP 1687 (p=0,047). P.salmoni
GBBC 1937 heeft de significant laagste waarde voor de laesielengte (p=0,0115).
46
Incubatie van Pspo bij 28 °C
Figuur 21 geeft het percentage aangetaste knipjes weer twee weken na de infectie. Bij de
incubatie van preiplanten op een temperatuur van 28°C waren de symptomen niet geheel
duidelijk. Vanwege deze reden werd een onderscheid gemaakt in lichte aantasting en
symptomen op basis van een duidelijke laesie. De verschillen tussen de stammen zijn in
deze proef minimaal en niet significant. Niettegenstaande kunnen toch enkele trends worden
besproken. In Figuur 21 is er een tendens dat bij de objecten die 48 u werden afgedekt meer
duidelijke laesies verschijnen. Bij 48 u afdekking lijkt Pspo GFBP 1908 het meest infectieus.
Pspo GBBC 1422 vertoont een hoge graad van lichte aantasting, doch geen hoge graad van
duidelijke laesies. De stam Pspo LFBP 1687 vertoont net een omgekeerde trend. Hieruit kan
worden verondersteld dat Pspo LFBP 1687 agressiever is dan Pspo GBBC 1422 die trager
symptomen vertoont bij de planten.
Figuur 21: Aantal aangetaste blaadjes (in %) twee weken na infectie veroorzaakt door Pspo stammen bij 24 en 48
u afdekking op een temperatuur van 28°C
Uit Figuur 22 blijkt, rekening houdend met de laesielengte, Pspo LFBP 1687 het agressiefst
te reageren op de preiplantjes. Door een gepaarde Mann-Whitney U test uit te voeren is er
enkel een significant verschil tussen de controlebehandeling en de Pspo stam CFBP 1908
(p=0,0365).
47
Figuur 22: Boxplot van de laesielengte veroorzaakt door Pspo stammen bij 28 °C
4.4.3 Bespreking resultaten
Tabel 17 is een overzichtstabel waar de aantastingsgraad (in % aangetaste knipjes) vermeld
wordt in functie van de incubatietemperaturen en de bacteriestam voor iedere afdekking
(0/24 en 48 u).
Controle
LFBP 1687
Pspo
GFBP 1908
Pspo
GBBC 1422
Pspo
GBBC 1937
P.salmoni
GBBC 1171
P.fluorescens
GBBC 1198
P.fluorescens
GBBC 1475
P.marginalis
Tabel 17: Overzichtstabel van percentage aangetaste knipjes bij 0,24 en 48 u afdekking (0/24/48)
-2°C
-/21/17
-/7/0
-/0/21
/33/15
-
-
-
-/17/9
8°C
-/15/7
-/43/8
-/7/14
-/0/14
-/21/21
-/14/8
-/7/14
-/7/0
18°C
33/7/33
50/36/17
39/50/29
10/0/7
-/50/25
-/30/14
-/25/23
8/13/20
28°C
-
-
-
-
27/46/54
38/42/64
50/42/50
25/15/36
48
De controle bij de negatieve temperaturen heeft minder maar toch enige vorm van
aantasting. Een mogelijke verklaring voor dit verschijnsel is dat door de knipjes gevolgd door
vorsttemperaturen de cellen degraderen met als gevolg moeilijk onderscheidbare
symptomen. De resultaten dienen dan ook met de nodige voorzichtigheid en kritisch
beoordeeld te worden. Er is een trend dat P.salmoni GBBC 1937 het meeste infectie
vertoont bij temperaturen onder het vriespunt. Dit blijkt enkel bij deze temperaturen,
aangezien deze stam bij de andere incubatietemperaturen nagenoeg geen infectie vertoont.
Bij een temperatuur van 8°C zijn P.fluorescens GBBC 1198 en Pspo GBBC 1422 het meest
infectieus. Door de relatief lagere symptoomvorming bij P.fluorescens GBBC 1171 en
P.salmoni GBBC 1937 kan verondersteld worden dat deze stammen niet infectieus zijn op
jonge preiplanten bij 8°C. Het optreden van enige symptoomvorming kan te wijten zijn aan
de gevolgen van schade door het knippen.
Bij een temperatuur van 18°C zijn de vier meest infectieuze stammen P.fluorescens GBBC
1171, P.fluorescens GBBC 1198, Pspo GBBC 1422 en Pspo LFBP 1687. P.salmoni GBBC
1937 geeft bij deze temperatuur geen verschillen met de controle. P.fluorescens GBBC 1171
reageert verschillend bij temperaturen van 8°C en 18°C. Bij de koelere temperatuur zou de
bacterie geen infectie veroorzaken terwijl bij 18°C deze stam een van de meest infectieuze
blijkt te zijn.
Bij 28°C werden enkel de Pspo stammen in rekening gebracht. Hierbij is het moeilijk om een
verschil op te merken tussen de stammen onderling. Het is wel duidelijk dat naarmate de
temperatuur stijgt, de symptomen teweeggebracht door besmetting met Pspo meer
uitgesprokener is. Bij koelere temperaturen (8°C en 18°C) is het vooral stam GBBC 1422 van
de Pspo stammen die meest infectieus is, echter bij 28°C wordt dit verschil kleiner.
4.5 Infectieproeven: infectie van preiplanten via verneveling
4.5.1 Proefopzet
Meestal worden infectieproeven met bacteriën via verneveling toegepast.
Ook onder veldomstandigheden worden inoculaties uitgevoerd m.b.v.
een rugsproeier. De bacteriën worden zo op het blad gebracht en dienen
zelf de plant te penetreren zoals dat in de natuur voorkomt. Bij deze
wijze van infecteren worden de pathogenen niet rechtstreeks in de plant
gebracht en dient de concentratie dan ook wat hoger te zijn (concentratie
t.h.v. blad bedraagt 1010 CFU) vergeleken met de knipmethode. Er
werden per stam 12 preiplanten geïnfecteerd met een handsproeiertje
(zie Figuur 23). Een week en twee weken na de infectie werden de
plantjes gescoord op eventuele symptomen. De incubatietemperatuur
bedroeg 25°C en er werd één afdekperiode gehanteerd namelijk 24 u
Figuur 23:
afdekking.
Handsproeier waarmee
de bacteriesuspensie
werd verneveld op het
blad
49
4.5.2 Resultaten
Het aantal blaadjes die laesies vertoonden was verschillend naargelang de stam en het
waarnemingstijdstip. Onderstaande tabel geeft het aantal blaadjes weer per stam op de twee
observatiemomenten.
Tabel 18: Aantal zieke blaadjes een en twee weken na infectie bij 25°C na 24 u afdekking
Bacteriestam
Na 1 week
Na 2 weken
Pspo GBBC 1422
14
26
Pspo GFBP 1908
11
18
P. marginalis GBBC 1475
10
9
Pspo LFBP 1687
6
22
P.fluorescens GBBC 1198
6
11
P.salmoni GBBC 1937
4
9
Controle
2
8
P.fluorescens GBBC 1171
2
4
Deze tabel toont aan dat Pspo GBBC 1422, Pspo GFBP 1908, P. marginalis GBBC 1475 en
Pspo LFBP 1687 het meeste aangetaste blaadjes heeft. P.salmoni GBBC 1937,
P.fluorescens GBBC 1171 en de controle infecteren het minste blaadjes. Bij P. marginalis
GBBC 1475 is na twee weken geen infectie bijgekomen, terwijl bij Pspo LFBP 1687 na de
tweede week het aantal geïnfecteerde blaadjes bijna verviervoudigd is. Het fenomeen dat
Pspo stammen het meest agressief zijn bij warmere temperaturen wordt bij deze proef
bevestigd. P.salmoni en P.fluorescens GBBC 1171 zijn heel weinig infectieus.
50
900
Totale lesielengte (in mm)
800
700
600
500
400
necrose 1
300
chlorose1
200
100
0
PmGBBC1475
PfGBBC1937
Controle
PfGBBC1198
PsCFBP1908
PfGBBC1171
PsCFBP1687
PsGBBC 1422
Bacteriestam
Figuur 24: Totale laesielengte na verneveling met bacteriestam een week na infectie bij een incubatietemperatuur
van 25°C
Als er wordt rekening gehouden met de grootte van de laesies en het al of niet necrotisch
worden dan lijkt hier P.marginalis GBBC 1475 het agressiefst aangezien het aandeel
necrotische laesies bijna 90 % is. De totale laesielengte veroorzaakt door Pspo GBBC 1422
is na de eerste week het grootst met een aandeel necrotische laesies van 34 %. De controle,
P.fluorescens GBBC 1171 en Pspo CFBP hebben de kleinste laesies een week na de
infectie.
Totale lesielengte (in mm)
2500
2000
1500
1000
necrose 2
500
chlorose 2
0
PmGBBC1475
PfGBBC1937
Controle
PfGBBC1198
PsCFBP1908
PfGBBC1171
PsCFBP1687
PsGBBC 1422
Bacteriestam
Figuur 25: Totale laesielengte na verneveling per bacteriestam twee weken na infectie
incubatietemperatuur van 25°C
bij een
51
Als de totale laesielengte wordt bemonsterd twee weken na het infecteren, kunnen enkele
verschuivingen worden waargenomen. Pspo GBBC 1422 vertoont nog steeds de grootste
laesies in totaal, maar het aandeel necrose is nu van 34 % naar bijna 80 % geëvolueerd.
Opmerkelijk is dat Pspo CFBP 1687 na de tweede week 1870 mm laesies veroorzaakt
waarvan 90 % necrotisch is terwijl dit na een week slechts 160 mm bedroeg met necrose van
70 %. Het omgekeerde fenomeen komt voor bij de P.marginalis stam waar na twee weken,
vergeleken met de andere stammen, de totale laesielengte slechts op de vijfde plaats staat
terwijl dit na de eerste week nog de tweede plaats was.
Figuur 26: Boxplot van de totale laesielengte twee weken na infectie i.f.v de bacteriestam
In Figuur 26 is het duidelijk dat de Pspo stammen het meest infectieus zijn. De laesies
veroorzaakt door Pspo CFBP 1908 zijn minder dan de helft van de andere twee Pspo
stammen, doch dit is geen significant verschil. De Pspo stammen zijn significant meer
infectieus dan de andere stammen. P.fluorescens GBBC 1171 is niet infectieus op de
preiplantjes want deze stam is niet significant verschillend ten opzichte van de controle. De
vergelijkingstabel met de bijhorende p-waarden is weergegeven in bijlage 9.
52
4.5.3 Bespreking resultaten
De Pspo stammen zijn hier significant meer infectieus dan de andere stammen afkomstig
van het P.fluorescens complex. De proeven werden uitgevoerd met jonge preiplanten. Deze
bevinding bevestigd de literatuurstudie waar wordt aangehaald dat bacteriestammen uit het
fluorescens complex niet of minder infecteren bij jonge preiplanten, maar later in het
groeiseizoen, bij oudere prei dus, actief worden. De vaststelling dat de eerste week na
infectie vooral P.marginalis aantasting veroorzaakte en later na twee weken andere
stammen infectieuzer bleken, wijst in de richting dat P. marginalis heel snel de plant kan
infecteren om nadien stabiel te blijven. Het tegenovergestelde wordt waargenomen bij Pspo
CFBP 1687 waar na twee weken een heel groot aantal blaadjes werden aangetast.
53
5
Discussie
Rassenproeven die de gevoeligheid aan bacterieziekte veroorzaakt door Pspo onderzoeken,
werden eerder uitgevoerd in het PCG in Kruishoutem in 2012 en 2013. De vroege
herfstrassen die werden opgenomen in deze thesis en tegelijk ook in de rassenproeven bij
het PCG zijn Belton en Pluston in 2012 en Krypton, Duraton en Pluston in 2013. Er werden
bij deze rassenproeven ook geen significante verschillen waargenomen. Belton was bij een
eerste waarneming een van de meest aangetaste samen met nog twee andere rassen.
Echter dit verschil van aantasting verdween naar het einde van de proef. In deze thesis werd
met een ziekte-index gewerkt waarbij alle waarnemingen over het groeiseizoen in rekening
werden gebracht. Op basis van deze ziekte-index kan een goede vergelijking worden
gemaakt tussen de rassen onderling. Echter waren ook hier geen significante verschillen van
de ziekte-index voor de opgenomen rassen. Er is wel een significant verschil tussen het ras
met de hoogste ziekte-index (SG 1101) en de laagste ziekte-index (Rally) voor de herfstprei.
Bij de rassenproef late herfst-winterprei zijn meer rassen opgenomen die ook in het PCG
werden onderzocht. Bij deze rassenproef werden ook geen significante verschillen
waargenomen. Er kunnen wel enkele bevindingen worden gedaan. Zo vertoonde Curling,
Nestor en Aylton in 2012 iets minder symptomen van aantasting door Pspo dan de andere
rassen. Harston had bij de oogst iets meer aantasting vergeleken met de andere rassen. Het
ras Curling komt hier tevens ook bovenaan de lijst naar tolerantie tegen Pspo aantasting.
Nestor had hier een grotere ziekte-index wat niet wordt bevestigd door de proeven van 2012,
waar dit ras eerder meer tolerantie vertoonde vergeleken met de andere rassen.
Verder werd een veldproef uitgevoerd om de mogelijkheden voor bacteriofaagtherapie te
optimaliseren. Een eerste toediening van de bacteriofagen was door middel van een
dompelbehandeling. Dit werd op dezelfde manier uitgevoerd als bij Rombouts et al. (2016).
Bij de beoordeling drie maanden na de behandeling is het percentage aangetaste planten 51
% bij het behandelde object en 71 % bij de controle. Omdat een verschil op een welbepaald
moment niet veelzeggend is, werd hier terug een ziekte-index opgesteld waarbij de zes
observaties samen vervat zitten in één waarde. De ziekte-index voor de met bacteriofagen
behandelde prei en de controle bedraagt respectievelijk 312 en 329. Dit minimaal verschil is
niet significant. Bij de toediening van bacteriofagen via spuitmethode (verneveling) werden
geen significante verschillen waargenomen bij ieder observatiemoment en de ziekte-index.
Uit deze resultaten kan worden bevestigd dat faagtherapie onder veldomstandigheden wel
mogelijk is, maar afhankelijk is van heel wat factoren zoals bepaalde weersomstandigheden
(zonlicht, neerslag etc.). De moeilijkheid van faagtherapie is de toediening ervan en de nood
aan een hoge densiteit van de bacteriofagen om potentieel te kunnen concurreren met de
Pspo stammen aanwezig op dat moment. De vele milieufactoren in de fyllosfeer maakt
faagtherapie heel moeilijk om bladziekten zoals bacterieziekte bij prei te behandelen
(Rombouts et al., 2016).
De infectieproeven die zowel via de knipmethode als de vernevelingsmethode werden
uitgevoerd, bevestigen dat Pspo stammen meer infectieus zijn bij warmere temperaturen dan
54
de stammen afkomstig van het Pseudomonas fluorescens complex. Van de Pspo stammen
zou stam GBBC 1422 het meest infectieus zijn. Dit verschil is vooral het grootst bij koelere
temperaturen. Niettegenstaande geen significante verschillen voorkwamen, werd bij
vorsttemperatuur vooral schade veroorzaakt door P.salmoni GBBC 1937 vastgesteld.
Daarna volgde P.marginalis GBBC 1475.
De vernevelingsproef toont aan dat P.marginalis heel snel het blad kan infecteren vergeleken
met Pspo CFBP 1687 waarbij de symptomen later optreden. Dit kan een mogelijke verklaring
bieden voor het feit dat stammen uit het P.fluorescens complex meer schade verrichten bij
koude temperaturen dan Pspo stammen die meer infectie veroorzaken bij warme
temperaturen.
De parameter relatieve vochtigheid die werd gestuurd aan de hand van afdekking met
plastiek geeft geen eenduidige resultaten. Als hypothese werd gesteld dat hoe langer werd
afgedekt (langere relatieve vochtigheid), hoe hoger de kans op infectie. Deze hypothese
wordt slechts in redelijke mate gevolgd bij de infectie op 28°C. Bij de andere temperaturen
zijn geen significante verschillen tussen de periode van afdekken.
De symptomen bij het vernevelen waren duidelijker onderscheidbaar dan bij de infectie met
de knipmethode. Een mogelijke oorzaak kan zijn dat de concentratie van de bacteriën bij de
knipmethode lager was dan bij het vernevelen. Anderzijds kan de oorzaak ook te wijten zijn
aan een onderschatting van de besmetting via de knip, waarbij het gebruikte volume
bacteriesuspensie kleiner was dan deze gebruikt bij het vernevelen. Eventueel kan het
verschil ook te wijten zijn aan het stadium waarin de prei zich bevond bij het infecteren. Zo
was de prei bij de infectie d.m.v. de knipmethode iets jonger dan de prei die werd
geïnfecteerd door verneveling.
55
6
Algemene conclusie
Uit deze thesis blijkt dat rassenkeuze geen grote rol speelt in gevoeligheid aan bacteriële
infectie veroorzaakt door Pseudomonas syringae pv. porri en P.fluorescens. De
gezondheidstoestand en het fysiologisch stadium van de prei zijn meer bepalend voor
gevoeligheid aan infectie. Het onder controle houden van de bacterieziekte door middel van
bacteriofaagtoediening in gecontroleerde omstandigheden is vrijwel bewezen, maar het
gebruik onder veldomstandigheden geeft onduidelijke resultaten weer. Het dompelen van de
prei voor het uitplanten in een bacteriofaagoplossing lijkt hier een betere toedieningsmethode
te zijn dan het herhaaldelijk vernevelen van een bacteriofaagoplossing na het uitplanten
hoewel deze verschillen niet significant zijn. Faagtherapie onder veldomstandigheden dient
geoptimaliseerd te worden waarbij de bestendigheid van de bacteriofagen in de fyllosfeer
tegen verschillende omgevingsfactoren zoals uv-licht en uitdroging de grootste uitdagingen
zullen zijn.
De infectieproeven bevestigen dat P.syringae pv. porri stammen meer infectieus zijn bij
jonge preiplanten en warmere temperaturen vergeleken met stammen uit het P.fluorescens
complex. De infectiemethode via verwonding kan nog verbeterd worden aangezien deze
minder duidelijke symptomen van aantasting weergeeft vergeleken met de infectie via
verneveling.
56
7
Referentielijst
Alsohim, A. S., et al. (2014). The biosurfactant viscosin produced by Pseudomonas
fluorescens SBW25 aids spreading motility and plant growth promotion. Environmental
Microbiology, pp. 2267-2281.
Baker, C. J., et al. (2011). Detection of bacterial aggregation in tobacco cell suspensions
treated with pathogenic bacteria. Physiological and Molecular Plant Pathology, pp. 170-175.
Bashan, Y., & de Bashan, L.E. (2002). Reduction of bacterial speck (Pseudomonas syringae
pv. tomato) of tomato by combined treatments of plant growth-promoting bacterium,
Azospirillum brasilense, streptomycin sulfate, and chemo-thermal seed treatment. European
Journal of Plant Pathology, pp. 821-829.
Bender, C.L., Alarcon-Chaidez, F., & Gross, D.C. (1999). Pseudomonas syringae
phytotoxins: mode of action, regulation, and biosynthesis by peptide and polyketide
synthetases. Microbiology and Molecular Biology Reviews, pp. 266-292.
Block, E. (2010). Garlic and Other Alliums: The Lore and the Science. RSC Publishing, 480
blz.
Boch, J. en Bonas, U. (2010). Xanthomonas AvrBs3 family - type III effectors: discovery and
function. Annual Review of Phytopathology, pp. 419-436.
Buell, C.R., Joardar, V., Lindeberg, M., Selengut, J., Paulsen, I.T., Gwinn, M.L. et al. (2003).
The complete genome sequence of the Arabidopsis and tomato pathogen Pseudomonas
syringae pv. tomato DC3000. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA,
pp.10181-10186.
Cole, D.L. (1999). The efficacy of acibenzolar-S-methyl, an inducer of systemic acquired
resistance, against bacterial and fungal diseases of tobacco. Crop Protection, pp. 267-273.
Cornelissen, A., et al. (2012). Identification of EPS-degrading activity within the tail spikes of
the novel Pseudomonas putida phage AF. Virology 434(2), pp. 251-256.
Declercq, B. (2009). Integrated disease management based on the life cycle of Phytophthora
porri. Doctoraat, Gent, Universiteit Gent, Fac. Toegepaste bio-ingenieurswetenschappen:
landbouw, 2005-2009, 228 blz.
Denny, T.P. (1995). Involvement of bacterial polysaccharide in plant pathogenesis. Annual
Review of Phytopathology, pp. 173-197.
Eurostat. Geraadpleegd op 1 april 2016 via ec.europa.eu
Feil, H., Feil, W.S., Chain, P., Larimer, F., Dibartolo, G., Copeland, A. et al. (2005).
Comparison of the complete genome sequences of Pseudomonas syringae pv. syringae
B728a and pv. tomato DC3000. Proceedings of the National Academy of Sciences of the
USA, pp. 11064-11069.
57
Gardan, L., Shafik, H., Belouin, S., Broch, R., Grimont, F., & Grimont, P.A.D. (1999). DNA
relatedness among the pathovars of Pseudomonas syringae and description of
Pseudomonas tremae sp. nov. and Pseudomonas cannabina sp. nov. In Sutic en Dowson
(Eds.), International Journal of Systemic Bacteriology, pp. 469-478.
Glickmann, E., Gardan, L., Jacquet, S., Hussain, S., Elasri, M., Petit, A., & Dessaux, Y.
(1998). Auxin production is a common feature of most pathovars of Pseudomonas syringae.
Molecular Plant Microbe Interactions, pp. 156-162.
Goehre, V. & Robatzek, S. (2008). Breaking the barriers: Microbial effector molecules
subvert plant immunity. Annual Review of Phytopathology. pp.189-215.
Gross, M. & Rudolph, K. (1987). Demonstration of levan and alginate in bean plants
(Phaseolus vulgaris) infected by Pseudomonas syringae pv. phaseolicola. Journal of
Phytopathology, pp. 9-19.
Hall, B. H., et al. (2007). Leek diseases in Australia. Australasian Plant Pathology, pp. 383388.
Hernandez-Anguiano, A. M., et al. (2004). Biosurfactants produced by Pseudomonas
fluorescens and soft-rotting of harvested florets of broccoli and cauliflower. Plant Pathology,
pp. 596-601.
Hirano, S., & Upper, C.D. (2000). Bacteria in the leaf ecosystem with emphasis on
Pseudomonas syringae – a pathogen, ice nucleus, and epiphyte. Microbiology and Molecular
Biology Reviews, pp. 624-653.
Höfte, M. & Vos, P. (2006). Plant pathogenic Pseudomonas species. Plant-Associated
Bacteria, pp. 507-533. Dordrecht: Springer Netherlands.
Janse, J.D., Derks, J.H.J., Spit, B.E., 1 and Van Der Tuin, W.R. (1992). Classification of
fluorescent soft rot Pseudomonas bacteria, including P. marginalis strains, using whole cell
fatty acid analysis. Systematic and Applied Microbiology, pp. 538-553.
Ji, P., et al. (2006). Integrated biological control of bacterial speck and spot of tomato under
field conditions using foliar biological control agents and plant growth-promoting
rhizobacteria. Biological Control, pp. 358-367.
Jin, Q., Thilmony, R., Zwieser-Vollick, J., & He, S.H. (2003). Type III protein secretion in
Pseudomonas syringae. Microbes and Infection, pp. 301-310.
Jones, J.D.G en DangI, J.l. (2006). The plant immune system. Nature 444, pp. 323-329.
Kersters, K., Ludwig, W. Vancanneyt, M., De Vos, P., Gillis, M., & Schleifer, K.H. (1996).
Recent changes in the classification of the pseudomonads: an overview. Systematic and
Applied Microbiology, pp. 465-477.
58
Khedim, T., et al. (2013). Biosystematics and Plant Genetic Resources: Example from the
Genus Allium (Amaryllidaceae) of the Algerian Flora. International Symposium on Medicinal
and Aromatic Plants - Sipam 2012. M. Neffati and H. Khatteli, pp. 19-23.
Lamichhane, J. R., et al. (2015). Insights into epidemiology and control of diseases of annual
plants caused by the Pseudomonas syringae species complex. Journal of General Plant
Pathology, pp. 331-350.
Lantin, C. (2009). De toepassing van bacteriofagen in de beheersing van pathogenen in
eetwaren van dierlijke oorsprong. Masterproef, Gent, Universiteit Gent, Fac.
Dierengeneeskunde, 2008-2009, 19 blz.
Li, B., et al. (2009). First Report on Bacterial Heart Rot of Garlic Caused by Pseudomonas
fluorescens in China. Plant Pathology Journal, pp. 91-94.
Louws, F. J., et al. (2001). Field control of bacterial spot and bacterial speck of tomato using
a plant activator. Plant Disease, pp. 481-488.
Manoharan, B., et al. (2015). The Identification of Genes Important in Pseudomonas
syringae pv. phaseolicola Plant Colonisation Using In Vitro Screening of Transposon
Libraries. Plos One, pp. 19.
McManus, P.S., Stockwell, V.O., Sundin, G.W., & Jones, A.L. (2002). Antibiotic use in plant
agriculture. Annual Review of Phytopathology, pp. 443-465.
Melotto, M., et al. (2008). Role of stomata in plant innate immunity and foliar bacterial
diseases. Annual Review of Phytopathology, pp. 101-122.
Morris, C. E., et al. (2013). The Life History of Pseudomonas syringae: Linking Agriculture to
Earth System Processes. In N.K. Van Alfen (ed), Annual Review of Phytopathology, Vol 51,
pp. 85-104.
Noble, D. H., et al. (2006). Characterisation of Pseudomonas syringae strains associated
with a leaf disease of leek in Australia. European Journal of Plant Pathology, pp. 419-430.
Nomura, K., Melotto, M., & He, S.Y. (2005). Suppression of host defense in compatible plantPseudomonas syringae interactions. Current Opinion in Plant Biology, pp. 361-368.
Oguiza, J.A., & Asensio, A.C. (2005). The VirPphA/AvrPtoB family of type III effectors in
Pseudomonas syringae. Research in Microbiology, pp. 298-303.
Okon, J. (1990). Methods in agronomy to reduce bacterial diseases. In Z. Klement, K.
Rudolph, & D.C. Sands (Eds.), Methods in Phytobacteriology, pp. 301-306). Budapest:
Akadémiai Kiadó.
59
Palleroni, N.J., Kunisawa, R., Contopoulou, R., & Doudoroff, M. (1973). Nucleic acid
homologies in the genus Pseudomonas. International Journal of Systematic Bacteriology, pp.
333-339.
Perkins, L. B., Leger, E.A., Nowak, R.S. (2011). Invasion triangle: an organizational
framework for species invasion. Ecology and Evolution.
Rombouts, S., et al. (2015). Isolation and characterization of Pseudomonas syringae pv.
porri from leek in Flanders. European Journal of Plant Pathology, pp. 185-198.
Rombouts, S., et al. (2016). Isolation and characterization of Pseudomonas syringae pv.
porri from leek in Flanders. European Journal of Plant Pathology, pp. 185-198.
Romero, A. M., et al. (2001). Resistance to bacterial spot in bell pepper induced by
acibenzolar-S-methyl. Plant Disease, pp. 189-194.
Sarkar, S. F. & Guttman, D. S. (2004). Evolution of the core genome of Pseudomonas
syringae, a highly clonal, endemic plant pathogen. Applied and Environmental Microbiology,
pp. 1999-2012.
Sawada, H., et al. (1999). Phylogenetic analysis of Pseudomonas syringae pathovars
suggests the horizontal gene transfer of argK and the evolutionary stability of hrp, gene
cluster. Journal of Molecular Evolution, pp. 627-644.
Sherif, S., et al. (2015). Molecular Insights into Plant-Phytopathogenic Bacteria Interactions.
Plant Molecular Biology Reporter, pp. 1116-1130.
Skirvin, R.M., Kohler, E., Steiner, H., Ayers, D., Laughnan, A., Norton, M.A., & Warmund, M.
(2000). The use of genetically engineered bacteria to control frost on strawberries and
potatoes. Scientia Horticulturae, pp. 179-189.
Smith, I.M., Dunez, J., Lelliott, R.A., Phillips, D.H., & Arch, S.A. (Eds.) (1988). European
Handbook of Plant Diseases. Oxford, UK: Blackwell Scientific Publications.
Sun, W. X., et al. (2006). Within-species flagellin polymorphism in Xanthomonas campestris
pv campestris and its impact on elicitation of Arabidopsis flagellin sensing2-dependent
defenses. Plant Cell, pp. 764-779.
Syngenta. Geraadpleegd op 8 april 2016 via http://www.syngentacropprotection.com
/labels/p-644/actigard-50wg
Tack, A. (2013). Rol van Xanthomonas campestris pv. campestris in oppervlaktewater in de
epidemiologie van zwartnervigheid bij koolgewassen. Masterproef, Gent, Unversiteit Gent,
Fac. Bio-ingenieurswetenschappen, 2012-2013, 85 blz.
ten Berge, H. F. M., van Geel, W. C. A., Radersma, S., Meurs, E.J.J., Grashoff, C. (2010).
Feed the Crop or Feed the Soil? A Case Study in Leek (Allium porrum L.). Iv International
60
Symposium on Ecologically Sound Fertilization Strategies for Field Vegetable Production. R.
U. Larsen. pp. 85-95.
Thordal-Christensen H. (2003). Fresh insights into processes of nonhost resistance. Current
Opinion in Plant Biologie , pp. 351-357.
Vanheule, H. (2015). Exploratie van Fusarium spp. op prei in Vlaanderen. Masterproef,Gent,
Universiteit Gent, Fac. Toegepaste Bio-ingenieurswetenschappen, 2014-2015, 76 blz.
van Overbeek, L. S., et al. (2010). The role of crop waste and soil in Pseudomonas syringae
pathovar porri infection of leek (Allium porrum). Applied Soil Ecology, pp. 457-463.
Van Vaerenbergh J., 2016,mondelinge mededeling.
Vidaver, A.K. en P.A. Lambrecht. (2004). Bacteria as plant pathogens. The Plant Health
Instructor, pp. 10.
Warren, G., Corotto, L., & Wolber, P. (1986). Conserved repeats in diverged ice nucleation
structural genes from two species of Pseudomonas. Nucleic Acids Research, pp. 8047-8060.
Weingart, H., et al. (2001). The role of ethylene production in virulence of Pseudomonas
syringae pvs. glycinea and phaseolicola. Phytopathology, pp. 511-518.
Weingart, H., & Volksch, B. (1997). Ethylene production by Pseudomonas syringae
pathovars in vitro and in planta. Applied and Environmental Microbiology, pp. 156-161.
Whitehead, N. A., et al. (2001). Quorum-sensing in gram-negative bacteria. Fems
Microbiology Reviews. pp. 365-404.
Wiebe, H.J. (1994). Effects of temperature and daylength on bolting of leek (Allium porrum
L.). Scientia Horticulturae, pp. 177-185.
Xing, K., et al. (2015). Chitosan antimicrobial and eliciting properties for pest control in
agriculture: a review. Agronomy for Sustainable Development, pp. 569-588.
Young, J.M., Bull, C.T., De Boer, S.H., Firrao, G., Gardan, L., Saddler, G.E., Stead, D.E., &
Takikawa, Y. (2004). Names of Plant Pathogenic Bacteria Published Since 1995.
International Society of Plant Pathology.
61
8
Bijlagen
Bijlage 1: Efficiëntie van bacteriofagen tegen Pseudomonas syringae pv. porri:
dompelbehandeling (protocol Inagro)
Doel: Beschermde planten worden uitgeplant in een perceel dat aangetast is door Pspo
(piste dat Pspo in het veld aanwezig is). Als het perceel niet aangetast is, kan de grond voor
plant geïnfecteerd worden.
Eventuele infectie: De dichtheid van de suspensie bedraagt 108 cellen per ml (1 kolonie
oplossen in 1 ml). Voor het spuiten wordt de suspensie verdund tot 1:100. De suspensie
wordt over de proef verneveld met een proefveldspuit onder lichte druk (1,5 bar) en met 1000
l/ha water.
Objecten: minimum 25 planten per object, proef aanleggen in 4 herhalingen
- Onbehandeld (gelijk volume water!)
- Faagcoctail (107 PFU/plant)
Werkwijze:
1. Ga op zoek naar geïnfecteerde grond of infecteer de grond zelf: beschermde planten
worden nadien in besmette grond geplant
2. Faagtoepassing: dompelbehandeling
3. Plant
4. Beoordeling wekelijks: pest incidence (aantal aangetaste planten)
Infectie goed opvolgen om vroege verschillen op te merken (eens infectie er is zullen fagen
weinig verschil kunnen maken)
Benodigdheden:
-
Besmette grond of bacterieoplossing
-
Planten
-
Faagoplossing
o nodig: 107 PFU/plant
o uitgangsmateriaal: 109 PFU/ml
o gangbare toepassing: 200 liter voor 150 000 planten
o proeftoepassing: meer oplossing maken om goed te kunnen behandelen: 5
liter = 3750 planten (PCG zal maar 1280 planten behandelen met fagen maar
wel 5 liter oplossing maken)
o dus: 3750*107 PFU
o of: 37,5 ml 109 PFU/ml
o Uitgangsmateriaal voor 1 object in 4 herhalingen in de proef: 37,5 ml
62
Bijlage 2: Efficiëntie van bacteriofagen tegen Pseudomonas syringae pv. porri:
bespuitingen in het veld (protocol Inagro)
Doel: Na plant worden besmette Pspo planten behandeld met fagen (piste dat Pspo op de
planten zit).
Infectie: De dichtheid van de suspensie bedraagt 108 cellen per ml (1 kolonie oplossen in 1
ml). Voor het spuiten wordt de suspensie verdund tot 1:100. De suspensie wordt over de
proef verneveld met een proefveldspuit onder lichte druk (1,5 bar) en met 1000 l/ha water.
Objecten: minimum 25 planten per object, proef aanleggen in 4 herhalingen
-
Faagcocktail (108 PFU/plant); water
-
Bacteriesuspensie; water
-
Bacteriesuspensie; Faagcocktail (108 PFU/plant)
- Onbehandeld (gelijk volume water!)
Werkwijze:
1. Plant
2. Bacterie-infectie: liefst uitvoeren bij regenachtig weer, indien niet mogelijk: planten
nat zetten, inoculum vernevelen; Let op: niet volledige proef moet geïnfecteerd
worden, enkel objecten 2 en 3!
3. Faagbehandeling in het veld: liefst uitvoeren bij bewolkt weer of 's avonds (fagen
worden afgebroken door UV)
- 1 faagbehandeling voor infectie, 4 weken lang elke week behandelen na infectie
- infectie goed opvolgen om vroege verschillen op te merken (eens infectie er is
zullen fagen weinig verschil kunnen maken)
4. Beoordeling wekelijks: pest incidence (aantal aangetaste planten)
Benodigdheden:
-
Bacterieoplossing
Planten
Faagoplossing
o
o
o
o
o
o
nodig: 108 PFU/plant
plantdichtheid proef PCG: 100 000 planten/ha
dus: 100 000*108 PFU/ha
of: 10 000 ml 109 PFU/ml per ha
of: 10 liter 109 PFU/ml per ha
Uitgangsmateriaal voor twee objecten in 4 herhalingen in de proef: 218,2 ml
63
Bijlage 3: Resultaten rassenproef vroege herfstprei
Plotnr
Herhaling
W1 (%)
W2(%)
W3(%)
W4(%)
W5(%)
W6(%)
Ziekte-index
101
201
301
102
202
302
103
203
303
104
204
304
105
205
305
106
206
306
107
207
307
108
208
308
109
209
309
110
210
310
111
211
311
112
212
312
113
213
313
114
214
314
115
215
315
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
10
10
0
20
10
0
0
0
0
0
0
5
0
0
10
0
0
0
17
0
10
0
0
0
0
0
5
0
5
0
10
0
0
5
0
0
0
10
0
0
0
0
0
10
0
40
60
70
40
55
55
55
25
80
40
40
45
60
50
20
70
70
35
100
40
20
35
25
40
50
35
35
45
55
50
40
60
60
30
20
50
40
10
30
30
120
15
40
30
60
80
100
100
60
95
80
75
50
50
70
60
60
70
50
10
75
70
75
83
60
50
60
80
30
80
85
75
95
80
80
90
90
70
70
70
40
80
100
80
60
50
65
90
100
85
70
100
86
80
100
100
95
45
100
80
100
60
60
80
70
80
95
75
100
95
80
100
75
80
100
70
95
100
85
100
90
100
70
85
100
100
100
100
85
70
70
70
95
100
100
80
100
93
80
95
100
100
100
100
90
80
65
80
80
70
85
100
85
100
100
80
80
100
80
90
80
90
100
85
90
90
90
80
80
100
90
90
80
85
70
80
90
100
85
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
80
90
100
90
100
95
100
90
100
100
100
95
100
100
100
100
95
100
100
100
90
100
80
100
100
90
100
70
100
100
90
100
100
100
100
650
850
800
650
817
767
767
583
767
650
617
567
633
583
483
700
767
633
917
700
583
650
683
567
733
650
700
800
733
733
683
767
600
650
700
633
717
650
667
567
517
600
750
767
800
64
Bijlage 4: Output van Tuckey test vroege herfstprei
ziekteindex
Subset for alpha = 0.05
ras
Tukey HSD
a
N
1
Pluston
3
566,33
Rally
3
583,67
Belton
3
611,33
SV 3192
3
638,67
638,67
Gevaria
3
650,00
650,00
Volta
3
650,00
650,00
Cherokee
3
666,67
666,67
Longton
3
700,00
700,00
Duraton
3
705,67
705,67
SG 1101
3
705,67
705,67
Takrima
3
727,67
727,67
Copernic
3
744,33
744,33
Megaton
3
744,67
744,67
Krypton
3
766,67
766,67
SV 3274
3
Sig.
Tukey B
a
2
844,67
,152
,127
Pluston
3
566,33
Rally
3
583,67
Belton
3
611,33
SV 3192
3
638,67
638,67
Gevaria
3
650,00
650,00
Volta
3
650,00
650,00
Cherokee
3
666,67
666,67
Longton
3
700,00
700,00
Duraton
3
705,67
705,67
SG 1101
3
705,67
705,67
Takrima
3
727,67
727,67
Copernic
3
744,33
744,33
Megaton
3
744,67
744,67
Krypton
3
766,67
766,67
SV 3274
3
844,67
Means for groups in homogeneous subsets are displayed.
a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3,000.
65
Bijlage 5: Resultaten rassenproef late herfst en winterprei
Plotnr
Objectnr Herhaling W1 (%)
W2 (%)
W3 (%)
W4 (%)
W5 (%)
W6 (%)
101
201
301
102
202
302
103
203
303
104
204
304
105
205
305
106
206
306
107
207
307
108
208
308
109
209
309
110
210
310
111
211
311
112
212
312
113
213
313
114
214
314
115
215
315
1
1
1
2
2
2
3
3
3
4
4
4
5
5
5
6
6
6
7
7
7
8
8
8
9
9
9
10
10
10
11
11
11
12
12
12
13
13
13
14
14
14
15
15
15
25
35
25
15
30
35
20
35
25
30
35
55
30
40
25
30
20
10
30
40
20
45
35
35
30
25
10
20
30
20
15
20
25
25
35
20
20
25
35
30
20
20
35
30
40
30
25
30
50
35
35
25
20
5
20
35
20
40
50
40
50
40
70
50
25
65
55
45
30
20
25
20
50
40
35
45
35
20
20
5
20
30
25
30
30
55
45
20
50
65
50
55
50
40
55
45
65
30
35
60
35
45
70
60
60
90
50
40
45
60
60
40
50
55
60
35
30
65
85
85
35
30
30
50
50
35
50
40
65
60
45
75
60
75
75
50
50
55
50
45
50
50
50
10
65
45
30
65
40
65
30
50
20
70
55
90
55
70
60
45
65
35
60
70
40
35
25
35
30
30
45
40
45
70
40
75
70
75
60
90
60
75
65
45
50
65
65
70
55
90
60
50
55
50
60
80
60
60
65
65
95
95
45
100
65
35
60
65
60
75
70
40
45
65
50
70
75
45
40
90
65
65
70
65
100
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
1
2
3
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
10
0
0
0
10
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
5
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
5
0
0
0
0
0
0
Ziekteindex
367
433
400
350
383
417
400
350
250
450
400
350
450
400
450
467
367
333
450
433
567
517
433
500
383
350
267
467
483
450
367
267
283
333
300
333
367
333
433
417
467
483
450
483
650
66
Bijlage 6: Output van Tuckey test bij late herfst-winterprei
waarde
a,b
Tukey HSD
Subset
objectnummer
N
1
2
3
Curling
3
305,67
Keeper
3
322,00
322,00
Delmas
3
333,33
333,33
Pluston
3
333,33
333,33
Lucretius
3
377,67
377,67
377,67
Poulton
3
383,33
383,33
383,33
Belton
3
389,00
389,00
389,00
Aylton
3
400,00
400,00
400,00
Vitaton
3
400,00
400,00
400,00
Walton
3
433,33
433,33
433,33
Lancaster
3
455,67
455,67
455,67
Oberon
3
466,67
466,67
466,67
Harston
3
483,33
483,33
SV 3274 ZL
3
483,33
483,33
Nestor
3
Sig.
527,67
,073
,072
,122
Means for groups in homogeneous subsets are displayed.
Based on observed means.
The error term is Mean Square(Error) = 3110,789.
a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3,000.
b. Alpha = ,05.
67
Bijlage 7: Resultaten van de fagenproef
Plotnr
Objectnr Herhaling W1 (%)
W2 (%)
W3 (%)
W4 (%)
W5 (%)
W6 (%)
Ziekte-index
101
1
1
0
4
36
32
52
48
333
201
1
2
0
4
12
56
48
60
333
301
1
3
0
0
24
48
52
40
300
401
1
4
0
0
24
68
32
28
283
102
2
1
8
4
12
76
52
36
367
202
2
2
0
0
20
64
36
36
283
302
2
3
4
4
16
76
44
36
350
402
2
4
0
8
36
68
28
32
317
103
3
1
0
8
16
76
52
56
383
203
3
2
0
8
20
68
68
72
417
303
3
3
0
4
32
76
32
36
350
403
3
4
0
8
16
84
32
40
333
104
4
1
0
8
20
60
32
52
317
204
4
2
0
4
20
64
56
52
367
304
4
3
0
4
20
84
52
72
433
404
4
4
0
8
32
64
44
48
367
105
5
1
4
12
36
84
56
60
467
205
5
2
0
12
20
88
84
56
467
305
5
3
0
4
20
60
40
40
283
405
5
4
0
4
16
60
36
32
283
106
6
1
0
8
32
92
56
56
450
206
6
2
0
8
16
80
60
48
367
306
6
3
0
8
24
64
36
36
317
406
6
4
0
0
16
72
52
68
383
68
Bijlage 8: Output Tuckey test van de ziekte-index bij de verschillende objecten van
de fagenproef
index
a,b
Tukey HSD
Subset
object
N
1
1
4
312,25
2
4
329,25
3
4
370,75
4
4
371,00
5
4
375,00
6
4
379,25
Sig.
,548
Means for groups in homogeneous subsets are
displayed.
Based on observed means.
The error term is Mean Square(Error) = 3080,322.
a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 4,000.
b. Alpha = 0,05.
69
Bijlage 9: P-waarden van de paarsgewijze vergelijkingen tussen de stammen bij
infectie door verneveling d.m.v. Mann-Whitney U test (significante p-waarden zijn
gemarkeerd)
Pspo
GBBC
1422
Pspo
CFBP
1908
Pspo
CFBP
1687
Pm
GBBC
1475
Pf
GBBC
1937
Pf
GBBC
1198
Pf
GBBC
1171
Controle
Controle 0,001
0,031
0,004
0,788
0,801
0,402
0,222
-
Pspo
GBBC
1422
-
0,191
0,622
0,001
0,001
0,012
0,000
0,001
Pspo
CFBP
1908
-
-
0,442
0,058
0,057
0,199
0,001
0,031
Pspo
CFBP
1687
-
-
-
0,009
0,008
0,046
0,000
0,004
Pm
GBBC
1475
-
-
-
-
1,000
0,564
0,143
0,788
Pf
GBBC
1937
-
-
-
-
-
0,564
0,143
0,801
Pf
GBBC
1198
-
-
-
-
-
-
0,048
0,402
Pf
GBBC
1171
-
-
-
-
-
-
-
0,222
70